KR102268242B1

KR102268242B1 - 줄기세포의 기능강화용 조성물

Info

Publication number: KR102268242B1
Application number: KR1020200001466A
Authority: KR
Inventors: 송순욱; 김시나; 최별
Original assignee: 에스씨엠생명과학 주식회사
Priority date: 2020-01-06
Filing date: 2020-01-06
Publication date: 2021-06-23
Also published as: US20230045902A1; EP4089164A1; AU2020420368A1; EP4089164A4; JP7430010B2; JP2023510291A; WO2021141237A1; CN115210363A

Abstract

본 발명은 IL-1β 및 비타민 B6; 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 를 포함하는 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진용 조성물 및 이를 이용한 면역 조절 및 염증 조절능이 증진된 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명에 따른 IL-1β 및 비타민 B6; 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 를 줄기세포에 처리하면 IFN-γ 억제 증진, ICOSL (inducible costimulatory ligand) 발현 증가 및 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현 증가를 유도할 수 있으므로, 줄기세포를 이용한 각종 면역 질환 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

줄기세포의 기능강화용 조성물 {Composition for enhancing activity of stem cells}

본 발명은 IL-1β (Interleukin 1 beta) 및 비타민 B6 (vitamin B6); 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α (interferon alpha)를 포함하는 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진용 조성물 및 이를 이용한 면역 조절 및 염증 조절능이 증진된 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.

줄기세포는 미분화 세포로서, 자기 재생을 통해 오랫동안 분열할 수 있으며, 특정 환경 하에서는 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원이 되는 조직에 따라 배아줄기세포(Embryonic stem cell)와 성체줄기세포(Adult stem cell)로 나눌 수 있는데, 배아줄기세포를 이용한 치료실험이 윤리적인 면과 종양형성 가능성으로 어려운 점이 있는 반면, 성체줄기세포는 다양한 조직에서 손쉽게 얻을 수 있다는 장점이 있어 다양한 질환치료에 적용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

현재까지 많은 화합물 면역억제제 또는 항염증제가 개발되어 있고, 임상적으로 가장 흔히 사용되는 면역억제제로는 싸이클로스포린 (cyclosporine, Neoral, Cipol A), 아자치오프린(imuran), 프레드니솔론(일종의 스테로이드)이 있다. 상기 면역억제제는 항원자극에서 항체생성에 이르는 과정 중 대식세포에 의한 항원의 탐식, 림프구 등에 의한 항원 인식, 세포 분열, T세포와 B세포의 분열, 항체 생성 등 몇 가지 과정을 저해시킴으로써 면역 억제를 야기한다. 이러한 약물들은 대부분 항종양 활성을 동시에 가지고 있는데, 그 이유는 DNA 장애, DNA 합성 저지 등을 매개로 하여 세포 분열을 저지하기 때문이다. 그러나 이에 따른 대표적인 부작용으로 고혈압과 신독성(콩팥기능이 저하됨)이 있으며 이 부작용의 발생률이 높기 때문에 사용할 때 충분히 경과를 관찰해야 하는 등의 문제점이 있다. 그 외 부작용으로 드물게 떨림, 발작, 간염, 담액 저류, 혈중 뇨산증가, 근육기력 저하, 조모증 (hypertrichosis), 치은 비대(gingival hypertrophy)등이 있다. 흔히 쓰이는 억제제 중 아자치오프린은 백혈구수치의 감소, 빈혈, 혈소판 감소 등 골수 기능을 억제하기도 하며 췌장염, 간염, 담즙저류와 함께 드물게 탈모, 발열 등을 보이는 합병증이 있을 수 있다. 스테로이드 제제의 하나인 프레드니솔론은 면역 억제제 중 가장 먼저 사용되기 시작하였으나, 동맥 경화증을 촉진시킬 뿐 아니라 고혈압, 위궤양, 당뇨, 성장 저해, 골다공증, 백내장, 녹내장 등을 일으키므로 주의해야 할 약물이다. 따라서 안전한 면역억제제 또는 항염증제의 필요성이 대두되고 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여 최근 줄기세포를 이용한 치료법들이 염증 및 면역 질환 치료를 위해 시도되고 있다. 특히 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 염증을 억제시키거나 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg)의 생성을 유도하거나 또는 세포사멸에 관여하는 면역세포들의 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있어 이를 이용한 다양한 치료제의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.

그러나, 줄기세포를 이용한 다양한 임상 시험에서 효과의 지속성이나, 장기 추적결과 생체 내 생존 비율이 극히 낮다는 문제점이 보고되고 있어, 줄기세포 치료제를 개선하기 위한 다양한 시도들이 이루어지고 있다. 예컨대 치료 효과를 높이기 위하여 줄기세포에 특정 유전자를 삽입하거나, 줄기세포 기능을 부스팅할 수 있는 다양한 화학물, 펩타이드 등을 전처리하는 방법, 배양 시 저산소, 온도, 빛과 같은 자극 조건을 추가하는 방법들이 시도되거나, 줄기세포의 생존률을 높이기 위해 지지체와 함께 투여하는 방법들이 연구되고 있다. 줄기세포 기능 강화를 위한 다양한 연구들 중 유전자 조작을 이용한 기능 개선 방법은 효과적일 수 있으나, 도입되는 유전자의 안전성 등의 문제점이 지적된다.

따라서 줄기세포 자체에 유전자를 도입하여 기능을 강화하기 보다는 배양 중 다양한 프라이밍 요소 처리를 통해 줄기세포의 내재적 기능을 강화하기 위한 다양한 연구들이 시도되고 있다.

이에 본 발명자들은 줄기세포의 염증 조절 및 면역 조절능을 강화하기 위한 다양한 프라이밍 방법에 관하여 연구하던 중, IL-1β 및 비타민 B6; 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α를 처리하면 줄기세포의 기능을 효과적으로 강화시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, IL-1β 및 비타민 B6; 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 를 포함하는 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진용 조성물 및 이를 이용한 면역 조절 및 염증 조절능이 증진된 줄기세포의 제조방법, 이러한 방법으로 제조된 면역 조절 및 염증 조절능이 증진된 줄기세포를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IL-1β 및 비타민 B6 를 포함하는 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 1) IL-1β 및 비타민 B6 를 줄기세포에 처리하고 배양하는 단계; 를 포함하는, 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 1) IL-1β 및 비타민 B6 를 줄기세포에 처리하고 배양하는 단계; 를 포함하는, 면역 조절 및 염증 조절능이 증진된 줄기세포의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 면역 조절 및 염증 조절능이 증진된 줄기세포를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 면역 조절 및 염증 조절능이 증진된 줄기세포를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 IL-1β 및 비타민 B6; 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 를 줄기세포에 처리하면 IFN-γ 억제능 증진, ICOSL (inducible costimulatory ligand) 발현 증가 및 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현 증가를 유도할 수 있으므로, 줄기세포를 이용한 각종 면역 질환 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 IL-1β 및 비타민 B6 농도별 복합 처리에 따른 IDO 발현량 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (P value= *<0.1 ).
도 2는 IL-1β 및 IFN-α 농도별 복합 처리에 따른 IDO 발현량 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (P value= *<0.1 ).
도 3은 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 단일 또는 복합 처리에 따른 IFN-γ 억제능을 확인한 결과를 나타낸 도이다 (P value= ***<0.001, ****, ####, $$$$, &&&&<0.0001).
도 4는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 단일 또는 복합 처리에 따른 ICOSL 발현량 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (P value= *<0.1, **, ##<0.01, &&&<0.001).
도 5는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 단일 또는 복합 처리에 따른 IDO 발현량 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (P value= $<0.1, **<0.01, ***, ###, &&&<0.001).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 양태에 따르면, IL-1β 및 비타민 B6; 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 를 포함하는 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 IL-1β 및 비타민 B6; 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 는 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능을 강화하여 기능강화 줄기세포를 유도할 수 있다.

IL-1β 및 비타민 B6; 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 의 조합은 이들의 단일 성분을 줄기세포에 처리하는 것과 비교하여 시너지 효과를 나타내며, 낮은 처리 농도로도 목적하는 줄기세포의 기능 강화를 효과적으로 유도할 수 있다.

구체적으로 줄기세포의 기능 강화를 유도하기 위하여 IL-1β 및 비타민 B6 조합을 줄기세포에 처리한 후 배양할 수 있으며, IL-1β 및 비타민 B6은 1:1 내지 1:6,000 (w/v) 의 비율로 조성물에 포함될 수 있고, 바람직하게는 1: 60 내지 1:6,000 (w/v) 의 비율, 더욱 바람직하게는 1: 1,000 내지 6,000(w/v) 의 비율로 포함될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 IL-1β 20ng/ml, 비타민 B6 25 내지 100 ug/ml 를 복합 처리하였으며, 이를 통해 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절 기능이 강화되는 시너지 효과를 확인하였다.

또한 본 발명에서는 줄기세포의 기능 강화를 보다 현저하게 유도하기 위하여 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 의 조합을 줄기세포에 처리한 후 배양하였으며, IL-1β, IFN-α 및 비타민 B6 는 1:0.01 내지 5: 1 내지 6,000 (w/v) 의 비율로 포함될 수 있고, 더욱 바람직하게는 1:0.05 내지 2: 1,000 내지 6,000 (w/v) 의 비율로 포함될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 복합 처리를 위한 농도로 IL-1β 20ng/ml, IFN-α 20ng/ml, 비타민 B6 50ug/ml 를 선정하여 줄기세포에 처리하고 면역 조절 및 염증 조절 기능의 강화를 확인하였다. 특히 IL-1β, IFN-α 및 비타민 B6 조합을 처리하면 개별 물질들을 줄기세포에 처리한 결과와 비교하여 IFN-γ 억제 증진, ICOSL (inducible costimulatory ligand) 발현 증가 및 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현 증가와 같은 면역 조절 및 염증 조절 기능이 매우 현저하게 강화 될 수 있음을 확인하여, 이들의 조합이 줄기세포의 기능 강화에 최적의 조합임을 확인하였다.

본 발명에 있어, IL-1β 및 비타민 B6; 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 처리에 의하여 기능이 강화되는 줄기세포는 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 상기 줄기세포는 목적에 따라 적절히 제한 없이 선택될 수 있으며, 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 공지된 모든 조직, 세포 등의 성체 세포로부터 유래할 수 있으며, 예를 들어, 지방, 골수, 태반(또는 태반 조직세포), 또는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.

본 발명에 따라 IL-1β 및 비타민 B6; 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 를 줄기세포에 처리하고 배양하면 줄기세포의 기능이 강화될 수 있다. 본 발명에 있어 줄기세포의 기능 강화란, 줄기세포가 내재적으로 가지고 있는 염증 조절 및 면역 조절능을 부스팅하는 것을 의미하며, 이 때 IL-1β 및 비타민 B6; 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 는 줄기세포를 부스팅하기 위한 프라이밍 제제로 활용될 수 있다. 보다 구체적으로 상기 기능강화는 염증 조절 및 면역 조절능 강화로 IFN-γ 억제 증진, ICOSL (inducible costimulatory ligand) 발현 증가 및 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현 증가로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능을 증진을 의미할 수 있다.

본 발명에 있어, 면역 조절 및 염증 조절능을 더욱 증진시키기 위해서는 IL-1β 및 비타민 B6 에 추가적으로 IFN-α 를 함께 처리하는 것을 특징으로 할 수 있고, 동시에 또는 순차적으로 처리할 수 있다.

상기 방법은 in vitro, ex vivo 에서 수행되는 것을 포함할 수 있으며, 배양은 당 분야에 널리 공지된 줄기세포 배양에 필요한 성분을 포함하는 배지 또는 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있는 성분을 추가적으로 포함하는 배지에서 수행될 수 있다. 상기 본 발명의 줄기세포는 통상의 배지에서 생육 가능하며, 본 발명의 줄기세포를 배양하기 위하여 배양 대상 즉 배양체가 되는 세포가 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 예컨대 본 발명에서는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 또는 alpha-MEM 을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 그 외 온도, 배양시간 등의 배양 조건은 통상의 중간엽 줄기세포의 배양 조건을 따를 수 있다.

본 발명의 방법에 있어, 면역 조절 및 염증 조절능 증진용 조성물과 중복되는 내용은 명세서 기재의 복잡성을 피하기 위해 생략한다.

상기 줄기세포는 IL-1β 및 비타민 B6; 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 처리에 의하여 기능이 강화된 줄기세포로 미처리 줄기세포와 비교하여 면역 조절 및 염증 조절능이 증진된 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로 본 발명의 줄기세포는 미처리 줄기세포와 비교하여 IFN-γ 억제 증진능, ICOSL (inducible costimulatory ligand) 발현 증가능 및 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현 증가능으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능이 증진된 줄기세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 줄기세포는 면역 조절 및 염증 조절능이 증진되었으므로, 염증 관련 매커니즘, 면역 조절 매커니즘과 관련된 다양한 면역 질환 및 염증성 질환의 치료에 사용할 수 있고, 특히 면역 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 줄기세포를 포함하는, 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어, 면역 질환이란, 본 발명의 줄기세포에서 발현능이 강화된 IDO, ICOSL을 매개로 한 질환일 수 있으며, 면역 또는 염증 관련 매커니즘 상에서 IDO, ICOSL이 정상적으로 발현되지 않거나 이의 단백질이 분비되지 않음으로써 발생하는 질환일 수 있다.

보다 구체적으로 상기 면역 질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증, 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 줄기세포는 IL-1β 및 비타민 B6; 또는 IL-1β, 비타민 B6 및 IFN-α 처리에 의하여 염증 및 면역 조절능이 강화된 줄기세포이므로, 미처리 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역 질환 치료제와 비교하여 현저히 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다.

부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분 (corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스 (tragacanth), 젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴 (pectin)등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며 (예: 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 외용제일 수 있다. 본 발명의 외용제에는 시트제, 액상도포제, 분무제, 로션제, 크림제, 파프제, 분제, 침투 패드제, 분무제, 겔제, 파스타제, 리니멘트제, 연고제, 에어로졸, 분말제, 현탁액제, 경피흡수제 등의 통상적인 외용제의 형태가 포함될 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.

본 발명의 약학적 유효량은 환자의 상처 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 통상 본 발명의 약학 조성물의 일일 유효량을 환자에 적용시 0.00001 내지 10000 μg일 수 있다. 상기 1 일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.

그러나, 본 발명의 약학적 조성물의 상기 사용량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도, 상처 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 유효량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 면역반응 또는 염증 반응을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, "개체"란 소, 개, 돼지, 닭, 양, 말, 인간을 포함한 포유동물을 의미하나 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험예 1. 줄기세포 기능강화 실험군 선정 및 줄기세포 배양

37℃ 및 5% CO₂ 인큐베이터에서, 저장상태(LN2 tank 보관)의 중간엽 줄기세포를 해동하여 배양하고, 이 때 10% FBS 또는 4% hPL을 함유하는 배지(DMEM, alpha-MEM)에서 세포 컨플루언스가 80%정도로 증식될 때까지 배양하였다. 배양한 중간엽 줄기세포를 100mm dish에 seeding한 후, 중간엽 줄기세포 기능 강화를 위한 후보 물질을 선정하였다.

후보물질로는 IL-1β, IFN-α 및 비타민 B6을 선정하고, 기능강화를 위한 농도를 설정하였다. IL-1β 는 MSC 처리 시 TSG6, IDO 의 발현을 증가시킬 수 있는 최저 유효 농도가 20ng/ml 임을 확인하고 이를 기준으로 하였다.

선정된 20ng/m IL-1β 와 비타민 B6, IFN-α 를 농도를 달리하여 조합하고, 이에 따른 효과를 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현 변화로 확인하였다. IDO 는 T 세포 증식에 필수적인 트립토판을 카이누렌산(kynurenine) 으로 바꿈으로써, T 세포와 같은 면역 세포의 증식을 억제하는 면역조절인자로 알려져 있다. 줄기세포를 배양한 후 TRIzol (Invitrogen)을 이용하여 총 RNA를 분리한 후 PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)를 이용하여 총 RNA로 cDNA를 합성하여 qRT-PCR을 수행하였다. 이를 통해 IDO 의 발현 변화를 확인하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 비타민 B6를 25 내지 100ug/ml 으로 변화시키며 20ng/m IL-1β 와 함께 처리한 결과, 처리된 모든 실험군에서 IL-1β 단독 처리 대비 IDO 의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 특히 50ug/ml 내지 100ug/ml 처리군에서는 IL-1β 단독 처리 대비 약 2 배 이상의 IDO 발현 증가가 나타나 우수한 기능강화 효과를 확인하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, IFN-α 를 1 내지 40 ng/ml 로 복합 처리한 실험군에서도 IL-1β 단독 처리 대비 현저한 IDO 발현 증가를 확인하였다.

상기 결과를 토대로, IL-1β 와 조합하여 처리할 수 있는 기능강화 물질로 비타민 B6 50ug/ml 및 IFN-α 20ng/ml 를 선정하였으며, 이들을 조합하여 중간엽 줄기세포의 기능강화 효과를 이하 실험에서 확인하였다.

선정된 후보물질 및 이들의 농도 조합을 표 1에 나타내었으며, 이들을 24시간 동안 중간엽 줄기세포에 처리하고 기능강화 효과를 확인하였다.

실험군
1	IL-1β (20ng/ml)
2	IFN-α (20ng/ml)
3	비타민 B6 (50ug/ml)
4	IL-1β (20ng/ml)+IFN-α (20ng/ml)
5	IL-1β (20ng/ml)+비타민 B6 (50ug/ml)
6	IFN-α (20ng/ml)+비타민 B6 (50ug/ml)
7	IL-1β (20ng/ml)+IFN-α (20ng/ml)+비타민 B6 (50ug/ml)

실시예 1. 실험군 처리에 따른 중간엽 줄기세포 기능강화 확인

1.1 실험군 처리에 따른 IFN -γ 분비 확인

상기 표 1과 같은 실험군 처리에 따라 중간엽 줄기세포의 활성이 변화되었는지 확인하기 위하여, 면역 조절 활성 물질인 PHA (Phytohemagglutinin) 자극 조건에서 T-세포를 활성화시킨 후, 중간엽 줄기세포를 3일간 공동 배양하였다. 이 후 공동배양한 상층액을 수득하여 IFN-γELISA kit(BD Biosciences)를 통해 전염증성 사이토카인인 IFN-γ의 분비를 확인하여 중간엽 줄기세포의 면역 조절능 변화 여부를 확인하였다. 대조군으로는 실험물질을 처리하지 않은 중간엽 줄기세포를 이용하였다. 실험군 처리에 따른 IFN-γ의 분비를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, PHA 자극에 의하여 IFN-γ 분비량이 증가하였고, 이러한 IFN-γ 의 증가는 중간엽 줄기세포 처리에 의하여 감소하였다. 한편 IL-1β, IFN-α, 비타민 B6 단일 처리 실험군의 경우 미처리 대조군 대비 IFN-γ 분비량 변화가 유의하지 않은 것을 확인하였다. 그러나, IL-1β+IFN-α, IL-1β+비타민 B6, IFN-α+비타민 B6 처리군의 경우 단독 처리군과 대비하여 유의적으로 IFN-γ의 분비를 억제할 수 있음을 확인하였다. 또한 IL-1β, IFN-α 및 비타민 B6를 모두 처리한 실험군에서는 매우 현저한 IFN-γ 분비 억제 효과를 확인하였으며, 이는 2개 실험 물질을 조합한 실험군과 비교하여도 약 2배 이상 분비 억제능을 나타내는 것을 확인하였다.

1.2. 실험군 처리에 따른 염증, 면역조절인자 발현 비교

ICOSL (inducible costimulatory ligand) 은 조절 T 세포를 유도시켜 활성화된 T 세포를 억제하는 것으로 알려져 있다. 실시예 1.1 에서 실험군 처리에 따른 중간엽 줄기세포의 기능강화 효과를 확인하였으므로, 실험군 처리가 중간엽 줄기세포의 염증 및 면역 조절능력을 유도하는지 추가적으로 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 실험예 1과 같이 줄기세포를 배양한 후 TRIzol (Invitrogen)을 이용하여 총 RNA를 분리한 후 PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)를 이용하여 총 RNA로 cDNA를 합성하여 qRT-PCR을 수행하였다. 이를 통해 염증 및 면역 조절의 대표적 인자인 ICOSL 의 발현 변화를 확인하고, 그 결과를 도 4 에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, ICOSL의 발현은 IL-1β 단일 물질 처리군에서는 증가하였으나, IFN-α, 비타민 B6 단일 처리군에서는 뚜렷한 증가를 나타내지 않았다. 그러나 이들을 조합하여 처리한 실험군에서는 ICOSL 발현의 증가가 유도되었으며, 특히 IL-1β 를 비타민 B6 와 조합한 실험군 및 IL-1β, IFN-α, 비타민 B6 를 모두 조합한 실험군에서는 IL-1β 단일 처리군 대비 매우 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 이는 실시예 1.1 에서 확인된 IFN-γ 분비억제 결과와도 일치하는 결과이며, IL-1β 와 비타민 B6 조합 또는 IL-1β, IFN-α 및 비타민 B6 조합을 중간엽 줄기세포에 처리하는 경우, 중간엽 줄기세포의 면역 및 염증 조절기능을 효과적으로 강화할 수 있음을 나타내는 결과이다.

1.3 실험군 처리에 따른 IDO 발현 변화 확인

상기 실시예 1.2를 통해 IL-1β 와 비타민 B6 조합 또는 IL-1β, IFN-α 및 비타민 B6 조합이 면역 및 염증 조절을 위한 중간엽 줄기세포의 기능을 강화할 수 있음을 확인하였으므로, 가장 우수한 효과를 나타내는 IL-1β, IFN-α 및 비타민 B6 조합에 대하여 추가 실험을 수행하였다. IL-1β, IFN-α 및 비타민 B6 조합을 중간엽 줄기세포에 처리하고 상기 실시예 1.2와 동일한 실험방법으로 IDO 발현 변화 유도 효과를 확인하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, IDO 는 IL-1β 의 단독 처리 및 비타민 B6 의 단독 처리에 의해서는 뚜렷한 발현 변화를 나타내지 않았다. 그러나, IL-1β, IFN-α 및 비타민 B6 조합을 중간엽 줄기세포에 처리한 실험군에서는 개별 실험 물질을 처리한 중간엽 줄기세포와 비교하여 최대 약 135배 이상의 IDO 발현 증가 효과를 나타내었다.

상기와 같은 실험 결과를 조합하면, IL-1β 와 비타민 B6 조합 또는 IL-1β, IFN-α 및 비타민 B6 조합을 중간엽 줄기세포에 처리하면, 중간엽 줄기세포가 가지고 있는 면역 및 염증 조절 능력을 더욱 증진시킬 수 있음을 알 수 있다. 따라서 IL-1β 와 비타민 B6 조합 또는 IL-1β, IFN-α 및 비타민 B6 조합은 중간엽 줄기세포의 염증 조절 및 면역 조절 기능강화를 위한 프라이밍 인자로 활용될 수 있다.

이상, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

IL-1β 및 비타민 B6 를 포함하는 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진용 조성물.
제1항에 있어서, IFN-α 를 더 포함하는, 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 IL-1β 및 비타민 B6는 1:1 내지 1:6,000 (w/v) 비율로 포함되는 것인, 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 IL-1β, IFN-α 및 비타민 B6 는 1:0.01 내지 5: 1 내지 6,000 (w/v) 의 비율로 포함되는 것인, 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방, 골수, 태반 또는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인, 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IL-1β, 비타민 B6; 또는 IL-1β, IFN-α 및 비타민 B6; 는 IFN-γ 억제 증진, ICOSL (inducible costimulatory ligand) 발현 증가 및 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현 증가로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진을 유도하는 것인, 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진용 조성물.
1) IL-1β 및 비타민 B6 를 줄기세포에 처리하고 배양하는 단계; 를 포함하는, 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진 방법.
제7항에 있어서, 상기 1) 단계에서 IFN-α 를 함께 처리하는 것인, 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진 방법.
제7항에 있어서, 상기 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진은 IFN-γ 억제 증진, ICOSL (inducible costimulatory ligand) 발현 증가 및 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현 증가로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능 증진 방법.
1) IL-1β 및 비타민 B6 를 줄기세포에 처리하고 배양하는 단계; 를 포함하는, 면역 조절 및 염증 조절능이 증진된 줄기세포의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 1) 단계에서 IFN-α 를 함께 처리하는 것인 면역 조절 및 염증 조절능이 증진된 줄기세포의 제조방법.
제10항 또는 제11항의 방법으로 제조된 면역 조절 및 염증 조절능이 증진된 줄기세포.
제12항의 줄기세포를 포함하는, 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 면역질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증, 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.