KR101656511B1 - 육모 및 탈모방지능이 개선된 지방줄기세포 배양액 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

지방줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 지방줄기세포 배양단계: 상기 배양된 지방줄기세포와 단핵구 세포를 무혈청 배지에서 70 내지 150시간 동안 공배양하는 공배양 단계; 및 상기 공배양 세포 배양액으로부터 세포 및 부유물을 제거하고 배양물만을 수득하는 단계를 포함하는, 무혈청 세포배양액의 제조방법이 제공된다.

Description

육모 및 탈모방지능이 개선된 지방줄기세포 배양액 및 그의 제조방법{Conditioned culture medium cultivated with adipose-derived stem cells having improved hair growth and hair loss prevention activity and method for preparing the same}

본 발명은 지방줄기세포 배양액의 제조방법 및 그에 의해 생성된 지방줄기세포 배양액을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 육모 및 탈모방지능이 개선된 지방줄기세포 배양액의 제조방법 및 그에 의해 생성된 지방줄기세포 배양액을 포함하는 육모 및 탈모방지용 조성물에 관한 것이다.

모발(hair)은 상피세포가 그 속에 케라틴(keratin) 섬유를 만들면서 자라는데 계속 생장하는 것이 아니라, 각각의 수명이 있어서, 발모와 탈모가 반복된다. 이러한 모발은 생장하는 생장기, 생장이 정지되고 모근 하단이 상승하는 중간기, 및 모발이 인체에서 탈락하는 종기로 구분된다. 탈모(alopecia)는 정상적으로 모발이 있어야 할 곳에 모발이 결여되거나 그 수가 감소하면서 발생하는 상태를 말하고 임상적으로 모낭이 파괴되는 반흔성 탈모와 모발만 빠지는 비반흔성 탈모로 나뉠 수 있는데 이러한 탈모는 과거와는 달리 현대인에게 여러 가지 요인 즉, 공해, 스트레스, 계절의 변화, 질병 및 화학적인 시술 등 요인들에 의해 상태가 변화되고 있다. 현재 화장품, 의약품 및 식품 등 탈모 방지 및 발모 효능을 나타내는 많은 제품들이 개발되고 있으며 특히, 탈모의 치료나 상업화를 위해서 성체줄기세포(adult stem cell)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다. 성체줄기세포는 골, 근육, 지방 및 제대혈 등 많은 종류가 있지만 그 중 지방에서 추출되는 지방줄기세포(adipose-derived stem cell)에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 그러나 상기 세포의 임상적용 시 나타날 수 있는 면역거부반응, 유전학적 부작용, 종양성장촉진, 종양재발 및 전이촉진 등의 위험성을 최소화하기 위한 연구는 아직 부족한 실정이다.

대한민국 등록특허 제0995133호는 지방조직 유래 줄기세포 및 단핵구의 혼합배양으로부터 고농도의 성장인자가 함유된 조직재생 및 피부개선 조성물과 이의 생산방법을 개시하고 있다.

그러나, 상기 특허의 경우 자가유래 단핵구를 사용하기 때문에, 대량생산에 적합하지 않고, 육모 및 탈모방지 뿐만 아니라 염증유발 인자의 발현의 증가를 억제할 수 있는 최적의 배양 조건은 제공하지 못하고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 임상적용 시 나타날 수 있는 면역거부반응 등 부작용을 최소화하고 육모 및 탈모방지능이 개선된 지방줄기세포 배양액 및 그의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 지방줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 지방줄기세포 배양단계: 상기 배양된 지방줄기세포와 단핵구 세포를 무혈청 배지에서 70 내지 150시간 동안 공배양하는 공배양 단계; 및 상기 공배양 세포 배양액으로부터 세포 및 부유물을 제거하고 배양물만을 수득하는 단계를 포함하는, 무혈청 세포배양액의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 제조방법에 의해서 제조된 무혈청 세포배양액을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 및 육모용 조성물이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 지방줄기세포와 단핵구 세포와의 공배양을 통해 육모 및 탈모방지능의 개선 효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 지방줄기세포와 단핵구 세포주의 공배양한 배양액 내 성장인자와 유용 사이토카인의 함량을 증가시켜 육모 및 탈모를 방지에 효과적인 조성물 제조과정에 대한 모식도이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예 따라 제조한 배양액에 함유된 사이토카인의 유전자 발현 양상을 real-time PCR을 실시하여 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예 따라 제조한 배양액에 함유된 성장인자의 유전자 발현 양상을 real-time PCR을 실시하여 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예 따라 제조한 배양액에 함유된 단백질 농도를 ELISA kit를 사용하여 측정한 그래프이다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "성체줄기세포(adult stem cell)"는 수정란의 발생 초기에 얻게 되는 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 구별되는 세포로서 발생과정 후 발견되는 줄기세포를 말한다. 신체의 각 부분에 발생과정이 끝난 이후에도 다양한 형태의 재생능을 가진 세포를 말하며, 이들은 다양한 정도의 다중분화능(multi- potentiality)을 나타낸다. 따라서 단일한 종류의 줄기세포를 말하는 것이 아니고, 골수(bone marrow), 제대혈(umbilical cord blood), 피부, 지방조직, 신경조직, 간장, 췌담도 등에서 발견되는 줄기세포의 총괄적 집합체를 말한다.

본 문서에서 사용되는 "지방줄기세포(adipose-derived stem cells, ASCs)"는 골, 근육, 지방 및 제대혈 등 다양한 유래의 성체줄기세포 중에서 지방에서 추출되는 줄기세포를 말한다. 다분화능을 가진 지방줄기세포(ASC)는 지방세포, 골모세포, 연골모세포 및 근섬유모세포 등 대부분의 중간엽 세포로 분화할 수 있다.

본 문서에서 사용되는 "단핵구 세포주(monocytic cell line, THP-1)"는 포식작용을 할 수 있는 백혈구 세포로서 핵이 하나이고, 단핵구(monocyte)라고도 불리우며, 조직으로 이동해서 대식세포(macrophage)나 수지상 세포(dendrocyte)로 분화할 수 있다. 본 문서에서는 단핵구, 대식세포, 및 수지상 세포를 모두 포괄하는 의미로 사용된다.

발명의 상세한 설명:

본 발명의 일 관점에 따르면, 지방줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 지방줄기세포 배양단계: 상기 배양된 지방줄기세포와 단핵구 세포를 무혈청 배지에서 70 내지 150시간 동안 공배양하는 공배양 단계; 및 상기 공배양 세포 배양액으로부터 세포 및 부유물을 제거하고 배양물만을 수득하는 단계를 포함하는, 무혈청 세포배양액의 제조방법이 제공된다.

상기 제조방법에 있어서, 상기 공배양은 지방줄기세포와 단핵구 세포주의 혼합비율이 1:1 내지 1:6일 수 있고, 바람직하게는 1:2 내지 1:4일 수 있다. 상기 공배양시간은 70 내지 150시간, 75 내지 145시간, 80 내지 130 시간, 또는 95 내지 125시간일 수 있다.

상기 지방줄기세포(adipose-derived stem/stromal cells, ASC)는 ADSC(adipose tissuederived stromal cells), ADAS(adipose-derived adult stem cells) 또는 AdMSC(adipose mesenchymal stem cells)로 혼용될 수 있다. 또한 지방줄기세포는 지방제거수술 과정에서 파생된 지방 조직으로부터 얻어진 지방조직 유래 세포분획(stromal vascular fraction, SVF)에 대해 DMEM(Dulbecco's minimal essential medium), 10% 우태아혈청(fetal bovine serum) 및 항생물질(antibiotics)와 같은 통상의 기본 '혈청 배지'를 사용하여 용이하게 배양할 수 있으며, 분화 전의 세포 배양에는 추가 성장인자의 첨가가 필요 없다는 점은 당업자에게 자명하다(Rlan Freshney, Culture of Human Stem Cells, p305, Wiley-Liss, 2008; SG Dubois et al., Methods in Molecular Biology-Isolation human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction, 449:69-79, 2008). 따라서 본 발명에서 '혈청 배지'는 DMEM(Dulbecco's minimal essential medium), 10% 우혈청(fetal bovine serum) 및 항생물질(antibiotics)을 포함한 것이며, '무혈청 배지'는 상기 조성에서 우혈청을 첨가하지 않은 배지이다. 상기 무혈청 배지는 DMEM, Ham's F-12 등의 통상의 세포배양용 배지를 사용할 수 있으며, 당업자에 따라 용이하게 선택할 수 있다.

상기 단핵구는 말초혈액, 제대혈 또는 골수로부터 유래한 것일 수 있고, 이미 확립된 세포주인 것이 대량생산에 더 적합할 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 제조방법에 의해서 제조된 무혈청 세포배양액을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 및 육모용 조성물이 제공된다.

상기 조성물은 지방줄기세포 또는 단핵구 세포주를 각각 단독으로 배양했을 때보다 IL-1α(interleukin-1α), IL-10(interleukin-10), PDGFB(platelet-derived growth factor subunit B), VEGFA(vascular endothelial growth factor A), EGF(epidermal growth factor), HGF(hepatocyte growth factor) 및 Noggin(NOG)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 성장인자를 고농도로 함유할 수 있다(Kingston KL et al., J Biol Chem. 278(28), 2003; Miteva M et al., Expert Opin Pharmacother, 13(9), 2012; Ryoji Tsuboi, Korean J Invest Dermatol. 4(2), 1997; Wang JM et al., American J Animal and Vet Sci. 7(2), 2012; Yu M et al., Exp Dermatol. 17(1), 2008; Vanderford DA et al., Exp Dermatol. 19(6), 2010)

상기 조성물은 IL-1β(interleukin-1β), IL-6(interleukin-6), IL-8(interleukin-8), IL-12A(interleukin-12A) 및 IL-13(interleukin-13)과 같은 염증성 사이토카인의 함량은 낮으면서 유용 사이토카인의 함량은 높은 것을 특징으로 한다.

상기 탈모방지 및 육모용 조성물은 탈모 부위, 빈모 부위 또는 무모 부위에 모낭을 형성하여 표피에 털이 재건되도록 유도하여 탈모 치료 또는 무모증 치료의 효과를 나타낸다. 상기 조성물은 단독요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 발모 유도 약물요법 또는 수술요법 등과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하였을 경우 극대화된 효능을 나타낼 수 있다. 상기 조성물과 함께 이용될 수 있는 약학 제제는 피나스테라이드(Finasteride), 두타스테라이드, 싸이옥톨(Cyoctol) 및 RU58841를 포함하는 남성 호르몬 또는 DHT 유발 억제제, 부갑상선 호르몬(PTH) 억제제, 미녹시딜, 버셀린(Burserelin), 혈액순환 개선제 및 메소테라피에 응용되는 조성물 등을 들 수 있으며, 수술요법으로는 모발이식, 두피 피판술, 두피 축소술 등을 들 수 있다.

상기 배양물을 유효성분으로 함유된 조성물은 당업계에서 해당 분야의 전문가에 의해 시술할 수 있으며, 질환예방, 치료 및 조직 재건을 필요로 하는 신체 부위라면 어디나 적용할 수 있다. 투여 경로는 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여 등을 포함하는 비경구 투여가 바람직하고, 보다 바람직하게는 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있으며, 상처 부위, 조직재생 또는 발모 유도가 요구되는 부위에 직접 주입하는 방법으로 투여하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 조성물은 한 번 투여 후에 조직 내에 원활하게 정착하도록 일정기간 무처치로 조직을 방치하고, 그 후에 필요에 따라 조성물을 재투여할 수 있으며, 상기 투여 및 무처치의 과정을 1회 내지 그 이상으로 반복할 수 있으며, 이식 후 무처치로 유지하는 기간은 10일 내지 30일일 수 있으나, 피험자의 상태에 따라 당업자의 전문적인 지식에 의해 횟수와 기간은 조정될 수 있다.

본 발명의 조성물의 유효량은 환자의 환부의 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.

본 발명의 조성물은 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다.

부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명자들은 다양한 사이토카인 및 성장인자를 분비하는 지방줄기세포(ASC)와 단핵구 세포주(THP-1)를 공배양하여 상기 지방줄기세포로부터 배양액으로 분비되는 성장인자의 양을 현저히 증가시키고 특히, 염증성 사이토카인의 발현증가는 억제하면서도 모발성장이 촉진되는 유용 사이토카인의 함량은 높은 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다(도 1 참조).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 지방줄기세포(ASCs)의 배양

본 발명의 일 실시예에 따라 피하지방제거술에서 분리된 지방조직을 이용하여 지방줄기세포(ASC)를 배양하였다.

구체적으로, 지방줄기세포(1×10⁶ cells)에 지방줄기세포 기본 배양액(10% 우태아혈청; fetal bovine serum, 10,000,000 U/L penicillin, 10,000 mg/L streptomycin in Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM))을 10 mL 첨가하여 100 mm 배양접시(60 cm²)에 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 상기 배양세포가 80 ~ 90% confluency를 나타낼 때 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.2+0.1)로 세포의 단층을 씻어낸 후 0.25% trypsin-2.65 mM EDTA로 처리하여 계대 배양하고, 배지는 2일마다 교환해주었다. 배양한 지방줄기세포는 지방줄기세포의 배양물 제조와 지방줄기세포 및 단핵구 세포주의 공배양에 이용하였다.

실시예 2: 단핵구 세포주의 배양

본 발명에서 사용된 단핵구 세포주(THP-1)는 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (ATCC, Manassas, VA)으로부터 구매하였고 보관된 단핵구 세포주(5×10⁶ ~ 1×10⁷ cells)에 단핵구 세포주 기본 배양액(10% 우태아혈청;fetal bovine serum, 10,000,000 U/L penicillin, 10,000 mg/L streptomycin, 0.05 mM β-mercaptoethanol in Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640)을 10-15 mL 첨가하여 75 cm² 배양 플라스크에 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 상기 배양한 세포가 80 ~ 90% confluency를 나타낼 때 세포를 모아 원심분리 한 후, 상층액을 제거하고 PBS로 세포를 씻어 계대 배양하였다. 배양한 단핵구 세포주는 단핵구 세포주의 배양물 제조와 지방줄기세포 및 단핵구 세포주의 공배양에 이용하였다.

실시예 3: 지방줄기세포(ASC)의 배양물 제조

본 발명의 일 실시예에 따라 얻어진 지방줄기세포를 100 mm 배양접시(60 cm²)에 1.5×10⁶ cells/60 cm²의 농도로 기본 배양액에서 4 ~ 7일 동안 배양하였고, 95% confluency를 나타낼 때 지방줄기세포의 기본 배양액을 제거하고, PBS로 3회 세척한 후 항생제가 첨가되지 않은 DMEM을 주성분으로 하는 무혈청 배지를 5 mL 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 상기 배양기에서 72 시간 이상 배양 후, 배양액만을 수거하여 1500 rpm에서 5분간 원심분리하여, 배양액에 존재하는 세포 및 세포 잔여물을 제거하고, 0.22 ㎛ 필터로 여과한 후 최종 배양액을 수득하였으며 사용 전까지 ??80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.

실시예 4: 단핵구 세포주(THP-1)의 배양물 제조

본 발명의 일 실시예에 따라 얻어진 단핵구 세포주의 기본 배양액을 제거하고, PBS로 3회 세척하였다. 그 후 100 mm 배양접시(60 cm²)에 4 ~ 7일 배양 후 95% confluency를 나타내는 지방줄기세포의 약 3배 많은 6×10⁶ ~ 7.5×10⁶ cells/60 cm²의 농도로 항생제가 첨가되지 않은 DMEM을 주성분으로 하는 무혈청 배지를 5 mL 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 상기 배양기에서 72 시간 이상 배양한 후, 배양액을 수거하여 1500 rpm에서 5분간 원심분리하여, 배양액에 존재하는 세포 및 세포 잔여물을 제거하고, 0.22 ㎛ 필터로 여과한 후 최종 배양액을 수득하였으며 사용 전까지 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.

실시예 5: 지방줄기세포 및 단핵구의 공배양에 의한 배양액의 제조

본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 지방줄기세포 및 단핵구 세포주의 공배양에 의한 배양액을 제조하였다.

구체적으로, 실시예 1에서 1회 이상 계대 배양하여 얻어진 지방줄기세포를 100 mm 배양접시(60 cm²)에 1.5×10⁶ cells/60 cm²의 농도로 기본 배양액에서 4 ~ 7일 동안 배양하여 4 ~ 7일 경과 후, 95% confluency를 나타낼 때 지방줄기세포의 기본 배양액을 제거하고, PBS로 3회 세척하였다. 실시예 2에서 1회 이상 계대 배양하여 얻어진 단핵구 세포주의 기본 배양액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 후, 지방줄기세포의 약 3배 많은 6×10⁶ ~ 7.5×10⁶ cells/60 cm²의 단핵구 세포주를 95% confluency를 나타내는 지방줄기세포 배양접시에 항생제가 첨가되지 않은 DMEM을 주성분으로 하는 무혈청 배지 5 mL과 함께 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 공배양 하였다. 상기 배양기에서 72 시간 이상 배양한 후, 배양액을 수거하여 1500 rpm에서 5분간 원심분리하여, 배양액에 존재하는 세포 및 세포 잔여물을 제거하고, 0.22 ㎛ 필터로 여과한 후 최종 배양액을 수득하였으며 사용 전까지 ??80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.

실시예 6: mRNA 발현의 정량분석(quantitative analysis)

본 발명의 실시예 3, 4 및 5에 따라 제조한 세포로부터 다양한 사이토카인과 관련 성장인자의 유전자 발현 양상을 각 세포의 mRNA 수준에서 확인하였다.

구체적으로, 실험군은 각각 지방줄기세포(ASC), 단핵구 세포주(THP-1) 및 공배양(ASC+THP-1)으로 분류하여 배양하였고 배양 후 72시간, 96시간 및 120시간 경과시점에서 상기 실험군의 세포에 1 mL의 Trizol(Invitrogen) 용액을 첨가하여 세포를 수거하고, 0.2 mL의 클로로폼(chloroform; Sigma)을 혼합하여 상온에서 10분간 방치하였다. 이후 4℃, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층을 분리하고, 여기에 동량의 이소프로판올(Isopropanol, Merck)을 추가하여 상온에서 10분간 방치하여 이를 4℃, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리 한 후, 차가운 70% 에탄올로 세척하여 상온에서 건조시켰다. RNA 침전물은 diethylpyrocarbonate(DEPC, Bioneer)가 포함된 증류수 20 ~ 50 ㎕에 녹여 cDNA 합성을 위한 RNA를 추출하였다(Chomzynski P. Biotechniques, 15, 1993). cDNA 합성에 앞서 genomic DNA 제거를 위해 추출된 1μg의 RNA에 1㎕의 DNase I 반응 버퍼와 1㎕의 DNase I(Invitrogen)을 첨가하여 상온에서 15분 동안 활성화시킨 후, 1㎕의 25 mM 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA)를 첨가하고 65℃에서 10분 동안 가열하여 불활성화 함으로써 genomic DNA를 제거하였다. 상기 genomic DNA가 제거된 1μg의 RNA에 1㎕의 올리고[dT]와 1㎕의 10 mM dNTP를 혼합하여 65℃에서 5분 동안 반응하였다. 그 후, 2 ㎕의 10배 RTase 완충용액, 4 ㎕의 25 mM MgCl₂, 2 ㎕의 0.1 M DTT, 40 U RNase inhibitor, 200 U M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)를 첨가하여 50℃에서 50분, 85℃에서 5분 동안 반응하였다. 여기에 2 U의 RNase H를 처리하여 37℃에서 20분 동안 가수분해하여 cDNA를 합성하였다.

각 실험군은 25 ng의 cDNA에 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12A, IL-13, TNF-α, HGF, bFGF, PDGFB, VEGFA, EGF, TGF-β1 및 Noggin 프라이머를 각각 0.25 ~ 0.5 pM의 농도로 첨가하고, hot-start iTaq DNA polymeraes, dNTPs, MgCl₂, SYBR Green I이 포함된 iQ SYBR Green supermix(Bio-Rad)를 혼합하여 95℃에서 3분 동안 먼저 변성시킨 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 60초의 과정을 40회 반복하여 real-time PCR(Bio-Rad, CFX96)을 실시하였다. 이때 모든 유전자는 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 정량분석을 위한 내부 표준 유전자로 사용하였고, 시작 주기(Ct)값은 형광이 통계적 배경 이상으로 상승했을 때 주기 횟수를 나타내었다. Real-time PCR 후, 각 실험군의 정량 분석은 2-^ΔΔCt 방법을 수정하여 상대 정량을 실시하였다.

그 결과, 염증성 사이토카인인 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12A, IL-13 및 TNF-α는 지방줄기세포와 단핵구 세포주를 72시간 혹은 96시간 공배양시 상기 사이토카인의 발현의 두드러진 차이는 보이지 않았다. 그러나, 지방줄기세포의 120시간 단독 배양 시 상기 염증성 사이토카인의 발현 수준이 모두 증가되지만 공배양시 IL-1α 및 TNF-α를 제외하고 모든 염증성 사이토카인의 발현 수준이 현저히 감소하였다. TNF-α의 경우 단핵구 세포주 단독 배양시 두드러진 발현을 보이나 지방줄기세포와 공배양시 발현 수준이 감소하였다. 면역 억제 기능을 가지는 사이토카인인 IL-10은 염증성 사이토카인의 생성을 억제하고, 항원 제시 세포들의 항원제시기능을 억제하여 면역 억제능을 가진다고 알려져 있다(Jenkins JK et al., Lymphokine Cytokine Res, 13, 1994; Joyce DA et al., Eur J Immunol, 24, 1994; Romagnai S, J Clin Immunol, 15, 1995; De Waal Malefyt R et al., J Exp Med, 174, 1991a; De Waal Malefyt R et al., J Exp Med, 174, 1991). 이러한, IL-10은 지방줄기세포와 단핵구 세포주를 공배양하였을 때 72시간부터 IL-10의 발현 수준은 유의적으로 증가하였고 96시간까지 유지되며 120시간 배양 시 약 4배 이상 증가하였다(도 2).

또한, 상기 성장인자 HGF, VEGF 및 EGF의 경우 지방줄기세포와 단핵구세포주의 공배양은 72시간 배양시보다 96시간 배양시 발현이 현저하게 증가한 반면, 120시간 공배양시 HGF의 발현은 지방줄기세포 단독 배양시보다 감소되기는 하나 그 수준이 유지되며 VEGF는 전체적인 발현 수준이 낮아지나 지방줄기세포 단독 배양시보다 증가하였다. 특히, EGF는 96시간 공배양시보다 120시간 공배양시의 발현 수준이 대폭 증가하였고 또한, Noggin의 경우도 120시간 공배양시 유의적으로 증가하였다. 그러나, bFGF와 PDGFB의 경우에는 지방줄기세포 단독 배양시보다 단핵구 세포주와의 공배양시 오히려 감소하는 경향을 보인다. TGF-β1은 두드러진 변화를 보이지 않았다(도 3). 상기 qPCR에 사용된 프라이머 정보는 하기 표 1에 표시하였다.

유전자	위치	핵산서열(5'-> 3')		서열번호
GAPDH	NM_001256799	F	ccatggcaccgtcaaggct	1
		R	cctgcaaatgagccccagc	2
IL-1α	HUMIL1ALPH	F	tatggcccactccatgaaggc	3
		R	cagaaccttcccgttggttgc	4
IL-1β	HUMIL1BA	F	gctggttccctgcccacag	5
		R	gagtcccggagcgtgcagt	6
IL-6	NM_000600	F	cttctccctggggctgctc	7
		R	ctcagggctgagatgccgt	8
IL-8	NM_000584	F	catgacttccaagctggccg	9
		R	tgttggcgcagtgtggtcc	10
IL-10	HUMIL10	F	tgccccaagctgagaaccaa	11
		R	ttcacctgctccacggcct	12
IL-12A	NM_000882	F	tgccggctcagcatgtgtc	13
		R	tgacggccctcagcaggtt	14
IL-13	NM_002188	F	cacttgccttggcggcttt	15
		R	tcagggattccagggctgc	16
TNF-α	X02910	F	cgcatcgccgtctcctacc	17
		R	agcgctgagtcggtcaccc	18
Hepatocyte growth factor(HGF)	HUMHHGF	F	tgtcagcgctgggatcatca	19
		R	cagcgggtgtgagggtcaag	20
Vascular endothelial growth factor A(VEGFA)	NM_001025366	F	gggccggggaggaagagta	21
		R	ggcaaggctccaatgcacc	22
Epidermal growth factor(EGF)	NM_001178130	F	ggaggcaggagccccagtt	23
		R	gggcttctcgacaccccct	24
basic fibroblast growth factor(bFGF)	HUMFGFB	F	tggcagccgggagcatc	25
		R	ctcttctcccggaccccgt	26
Platelet-derived growth factor subunit B; PDGFB	NM_002608	F	cccggagaggaagatgggg	27
		R	acacctcggtgcgcgtctt	28
Transforming growth factor beta1(TGF-β1)	NM_000660	F	gggcccagcatctgcaaag	29
		R	tagcccttgggctcgtgga	30
Noggin	NM_005450	F	gcgctacgtgaaggtgggc	31
		R	gatgggaatccagccgcag	32

실시예 7: 세포 배양액 내 성장인자의 함량변화분석

본 발명의 일 실시예에 따라 수득한 공배양에 의한 배양액에 함유된 단백질 농도를 확인하기 위하여 ELISA kit(HGF, VEGF, IL-1β,TNF-α; R&D systems, IL-10, EGF; Abcam)를 사용하여 측정하였다.

구체적으로, 실험군은 각각 지방줄기세포(ASC), 단핵구 세포주(THP-1), 공배양(ASC+THP-1) 및 대조군(항생제가 첨가되지 않은 DMEM을 주성분으로 하는 무혈청 배지)으로 분류하여 배양하였고 배양 후 96시간 경과시점 및 120시간 경과시점에서 상기 실험군의 배양액을 수거하여 상기 실시예 6에서 mRNA의 발현이 두드러진 IL-10, EGF, HGF, VEGF, IL-1β 및 TNF-α의 농도를 측정하였다. 먼저, 상기 단백질이 함유된 배양액과 상기 단백질에 대한 표준용액을 항체가 코팅되어 있는 well에 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 2시간 반응하였다. well에 담겨있는 용액을 제거한 후, 이차 항체 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응하였다. 이차항체 반응이 종료하면, 각 well을 세척액으로 3회 세척하고 기질용액을 100 ~ 200 ㎕ 넣은 다음, 빛을 차단시킨 상태에서 15 ~ 25분간 반응한 후, 반응정지용액 50 ㎕를 각 well에 첨가하고, 450 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 지방줄기세포(ASC) 및 단핵구 세포주(THP-1)를 단독으로 배양했을 때보다, 상기 두 세포를 공배양하여 얻어진 배양액에서 IL-10, EGF, HGF 및 VEGF 사이토카인의 함량이 월등히 높게 나타난 반면에 염증성 사이토카인인 IL-1β 및 TNF-α의 함량은 지방줄기세포 또는 단핵구 세포주를 단독 배양했을 때 보다 낮게 나타났다. 한편, 96시간 경과 시와 120시간 경과 시를 비교할 경우, 전체적인 사이토카인의 발현양이 시간이 경과함에 따라 증가하였으나, 염증성 사이토카인의 발현 증가율은 다른 사이토카인의 발현 증가율에 비해 크지 않아, 120시간의 장기배양이 지방줄기세포 및 단핵구 세포주의 공배양에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 4). 따라서, mRNA 정량 분석과 ELISA 분석 결과를 종합하여 고려할 때, 120시간까지의 장시간 배양시 염증성 사이토카인의 발현증가는 억제하면서도 육모 및 탈모방지에 유용한 사이토카인의 분비증강효과가 두드러지기 때문에, 육모 및 탈모방지용 화장품 또는 의약의 제조에 매우 효율적임을 알 수 있다.

상기 결과를 종합해보면, 지방줄기세포와 단핵구 세포주를 70시간 이상 장기 공배양함으로써 염증성 사이토카인의 함량은 낮추면서 유용 사이토카인과 성장인자의 함량은 증가된 배양액을 처리하여 육모에 효과적이고 탈모를 방지하는 조성물로 사용이 가능하다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> HUGEL INC. <120> Conditioned culture medium cultivated with adipose-derived stem cells having improved hair growth and hair loss prevention activity and method for preparing the same <130> PD14-1323 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F <400> 1 ccatggcacc gtcaaggct 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R <400> 2 cctgcaaatg agccccagc 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 alpha F <400> 3 tatggcccac tccatgaagg c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 alpha R <400> 4 cagaaccttc ccgttggttg c 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta F <400> 5 gctggttccc tgcccacag 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta R <400> 6 gagtcccgga gcgtgcagt 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 F <400> 7 cttctccctg gggctgctc 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 R <400> 8 ctcagggctg agatgccgt 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8 F <400> 9 catgacttcc aagctggccg 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8 R <400> 10 tgttggcgca gtgtggtcc 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 F <400> 11 tgccccaagc tgagaaccaa 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 R <400> 12 ttcacctgct ccacggcct 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12A F <400> 13 tgccggctca gcatgtgtc 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12A R <400> 14 tgacggccct cagcaggtt 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 F <400> 15 cacttgcctt ggcggcttt 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 R <400> 16 tcagggattc cagggctgc 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha F <400> 17 cgcatcgccg tctcctacc 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha R <400> 18 agcgctgagt cggtcaccc 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF F <400> 19 tgtcagcgct gggatcatca 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF R <400> 20 cagcgggtgt gagggtcaag 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA F <400> 21 gggccgggga ggaagagta 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA R <400> 22 ggcaaggctc caatgcacc 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGF F <400> 23 ggaggcagga gccccagtt 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGF R <400> 24 gggcttctcg acaccccct 19 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bFGF F <400> 25 tggcagccgg gagcatc 17 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bFGF R <400> 26 ctcttctccc ggaccccgt 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFB F <400> 27 cccggagagg aagatgggg 19 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFB R <400> 28 acacctcggt gcgcgtctt 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta 1 F <400> 29 gggcccagca tctgcaaag 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta 1 R <400> 30 tagcccttgg gctcgtgga 19 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Noggin F <400> 31 gcgctacgtg aaggtgggc 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Noggin R <400> 32 gatgggaatc cagccgcag 19

Claims (8)

1. 지방줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 지방줄기세포 배양단계:
   상기 배양된 지방줄기세포와 확립된 단핵구 세포주를 무혈청 배지에서 80 내지 130시간 동안 공배양하는 공배양 단계; 및
   상기 공배양 세포 배양액으로부터 세포 및 부유물을 제거하고 배양물만을 수득하는 단계를 포함하는, 무혈청 세포배양액의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 공배양은 지방줄기세포와 확립된 단핵구 세포주의 혼합비율이 1:1 내지 1:6인 것을 특징으로 하는, 무혈청 세포배양액의 제조방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 공배양 시간은 95 내지 125시간인 것을 특징으로 하는, 무혈청 세포배양액의 제조방법.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해서 제조된 무혈청 세포배양액을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 및 육모용 조성물.
7. 삭제
8. 삭제

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