KR20230172252A - 기능강화 줄기세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

기능강화 줄기세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프라이밍된 기능강화 줄기세포를 포함하는 관절염 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 줄기세포 치료제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민으로 처리되어 프라이밍된 줄기세포는 상기와 같은 프라이밍 인자로 처리되지 않은 미처리 줄기세포와 비교하여 염증성 사이토카인을 감소시키고, 관절염 지수를 효과적으로 낮출 수 있으므로, 다양한 관절염에 대한 예방 또는 치료 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명의 기능 강화된 줄기세포는 다양한 관절염 예방, 개선 또는 치료 분야에서 널리 활용될 수 있다.

Description

기능강화 줄기세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating of arthritis comprising highly functionalized stem cells}
본 발명은 프라이밍된 기능강화 줄기세포를 포함하는 관절염 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 줄기세포 치료제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
줄기세포는 미분화 세포로서, 자기 재생을 통해 오랫동안 분열할 수 있으며, 특정 환경 하에서는 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원이 되는 조직에 따라 배아줄기세포(Embryonic stem cell)와 성체줄기세포(Adult stem cell)로 나눌 수 있는데, 배아줄기세포를 이용한 치료 실험이 윤리적인 면과 종양형성 가능성으로 어려운 점이 있는 반면, 성체줄기세포는 다양한 조직에서 손쉽게 얻을 수 있다는 장점이 있어 다양한 질환치료에 적용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
현재까지 많은 화합물 면역억제제 또는 항염증제가 개발되어 있고, 임상적으로 가장 흔히 사용되는 면역억제제로는 싸이클로스포린 (cyclosporine, Neoral, Cipol A), 아자치오프린(imuran), 프레드니솔론(일종의 스테로이드)이 있다. 상기 면역억제제는 항원자극에서 항체생성에 이르는 과정 중 대식세포에 의한 항원의 탐식, 림프구 등에 의한 항원 인식, 세포 분열, T세포와 B세포의 분열, 항체 생성 등 몇 가지 과정을 저해시킴으로써 면역 억제를 야기한다. 이러한 약물들은 대부분 항종양 활성을 동시에 가지고 있는데, 그 이유는 DNA 장애, DNA 합성 저지 등을 매개로 하여 세포 분열을 저지하기 때문이다. 그러나 이에 따른 대표적인 부작용으로 고혈압과 신독성 (콩팥기능이 저하됨)이 있으며 이 부작용의 발생률이 높기 때문에 사용할 때 충분히 경과를 관찰해야 하는 등의 문제점이 있다. 그 외 부작용으로 드물게 떨림, 발작, 간염, 담액 저류, 혈중 뇨산증가, 근육기력 저하, 조모증 (hypertrichosis), 치은 비대 (gingival hypertrophy)등이 있다. 흔히 쓰이는 억제제 중 아자치오프린은 백혈구수치의 감소, 빈혈, 혈소판 감소 등 골수 기능을 억제하기도 하며 췌장염, 간염, 담즙저류와 함께 드물게 탈모, 발열 등을 보이는 합병증이 있을 수 있다. 스테로이드 제제의 하나인 프레드니솔론은 면역 억제제 중 가장 먼저 사용되기 시작하였으나, 동맥 경화증을 촉진시킬 뿐 아니라 고혈압, 위궤양, 당뇨, 성장 저해, 골다공증, 백내장, 녹내장 등을 일으키므로 주의해야 할 약물이다. 따라서 안전한 면역억제제 또는 항염증제의 필요성이 대두되고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 최근 줄기세포를 이용한 치료법들이 염증 및 면역 질환 치료를 위해 시도되고 있다. 특히, 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC)는 염증을 억제시키거나 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg)의 생성을 유도하거나 또는 세포사멸에 관여하는 면역세포들의 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있어 이를 이용한 다양한 세포 치료제의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.
그러나, 줄기세포를 이용한 다양한 임상 시험에서 효과의 지속성이나, 장기 추적결과 생체 내 생존 비율이 극히 낮다는 문제점이 보고되고 있어, 줄기세포 치료제를 개선하기 위한 다양한 시도들이 이루어지고 있다. 예컨대 치료 효과를 높이기 위하여 줄기세포에 특정 유전자를 삽입하거나, 줄기세포 기능을 부스팅할 수 있는 다양한 화학물, 펩타이드 등을 전처리하는 방법, 배양 시 저산소, 온도, 빛과 같은 자극 조건을 추가하는 방법들이 시도되거나, 줄기세포의 생존률을 높이기 위해 지지체와 함께 투여하는 방법들이 연구되고 있다. 줄기세포 기능 강화를 위한 다양한 연구들 중 유전자 조작을 이용한 기능 개선 방법은 효과적일 수 있으나, 도입되는 유전자의 안전성 등의 문제점이 지적된다.
따라서 줄기세포 자체에 유전자를 도입하여 기능을 강화하기 보다는 배양 중 다양한 프라이밍 요소 처리를 통해 줄기세포의 내재적 기능을 강화하기 위한 다양한 연구들이 시도되고 있다.
그러나 아직까지 세포치료제, 특히 프라이밍을 통한 기능강화 줄기세포를 이용한 치료제에 대한 연구는 많이 보고되지 않았다.
본 발명자는 줄기세포 기능을 보다 강화하기 위하여 연구하던 중, TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민;을 처리하면 줄기세포의 관절염 예방 또는 치료 효과가 현저하게 증진될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민;으로 프라이밍된 줄기세포를 포함하는 관절염 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α로 처리된 줄기세포를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α; 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 줄기세포 치료제를 제공한다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 1) TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 를 줄기세포에 처리하고 배양하는 단계; 를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 1) TNF-α, IFN-γ, IFN-α; 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민;을 줄기세포에 처리하고 배양하는 단계; 를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민으로 처리되어 프라이밍된 줄기세포는 상기와 같은 프라이밍 인자로 처리되지 않은 미처리 줄기세포와 비교하여 염증성 사이토카인을 감소시키고, 관절염 지수를 효과적으로 낮출 수 있으므로, 다양한 관절염에 대한 예방 또는 치료 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명의 기능 강화된 줄기세포는 다양한 관절염 예방, 개선 또는 치료 분야에서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 TNF-α 처리 농도에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (***P<0.001, ****P<0.0001, compared to the control (0ng/ml)).
도 2는 IFN-γ 처리 농도에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.05, ****P<0.0001, compared to the control (0ng/ml)).
도 3는 IFN-α 처리 농도에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, compared to the control (0ng/ml)).
도 4는 표 1에 나타낸 조성물에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (****P<0.0001) (0: 무처리 대조군; 1: TNF-α (10ng/ml); 2: IFN-γ (10ng/ml); 3: IFN-α (20ng/ml); 4: TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ(10ng/ml); 5: TNF-α (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml); 6: IFN-γ(10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml); 7: TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ(10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml)).
도 5는 표 2에 나타낸 비타민 단독 처리에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (0: 무처리 대조군; 1: 비타민 A(10㎍/ml); 2: 비타민 B1(50㎍/ml); 3: 비타민 B2(5㎍/ml); 4: 비타민 B3(50㎍/ml); 5: 비타민 B5(50㎍/ml); 6: 비타민 B6(50㎍/ml); 7: 비타민 B12(50㎍/ml); 8: 비타민 D2(10㎍/ml); 9: 비타민 D3(10㎍/ml)).
도 6은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 에 비타민을 각각 추가한 표 3에 나타낸 조성물 처리에 따른 IDO와 TSG6의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, compared to group 1) (0: 무처리 대조군; 1: TNF-α + IFN-γ + IFN-α; 2: 실험군 1에 비타민 A 첨가; 3: 실험군 1에 비타민 B1 첨가; 4: 실험군 1에 비타민 B2 첨가; 5: 실험군 1에 비타민 B3 첨가; 6: 실험군 1에 비타민 B5 첨가; 7: 실험군 1에 비타민 B6 첨가; 8: 실험군 1에 비타민 B12 첨가; 9: 실험군 1에 비타민 D2 첨가, 10: 실험군 1에 비타민 D3 첨가).
도 7은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α에 비타민을 각각 추가한 표 3에 나타낸 조성물 처리에 따른 ICAM1과 VCAM의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, compared to group 1) (0: 무처리 대조군; 1: TNF-α + IFN-γ + IFN-α; 2: 실험군 1에 비타민 A 첨가; 3: 실험군 1에 비타민 B1 첨가; 4: 실험군 1에 비타민 B2 첨가; 5: 실험군 1에 비타민 B3 첨가; 6: 실험군 1에 비타민 B5 첨가; 7: 실험군 1에 비타민 B6 첨가; 8: 실험군 1에 비타민 B12 첨가; 9: 실험군 1에 비타민 D2 첨가, 10: 실험군 1에 비타민 D3 첨가).
도 8은 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B6 처리된 줄기세포(pcMSC2) 의 면역조절능력을 확인하기 위하여, PHA 자극 PBMC와 pcMSC2 또는 미처리 cMSC를 공배양하고, 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 항염증성 사이토카인 IL-10 를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (***P<0.001, ****P<0.0001, compared to cMSC, P1: PHA로 자극하지 않은, 음성대조군).
도 9 는 류마티스 관절염 동물 모델에서 pcMSC2 투여, Enbrel(양성대조물질) 투여 주기 및 시점, 용량에 관한 모식도를 나타낸 도이다.
도 10은 류마티스 관절염 동물 모델에서 pcMSC2, Enbrel(양성대조물질) 투여 후 관절염 지수를 나타낸 도이다.
도 11은 류마티스 관절염 동물 모델에서 pcMSC2, Enbrel(양성대조물질) 투여 후 염증성 사이토카인 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 류마티스 관절염 동물 모델에서 pcMSC2, Enbrel(양성대조물질)을 투여 후, 관절 연골 조직 손상 정도를 조직 및 조직화학적 스코어를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 류마티스 관절염 동물 모델에서 cMSC 투여, pcMSC2 투여, Enbrel(양성대조물질) 투여 주기 및 시점, 용량에 관한 모식도를 나타낸 도이다.
도 14는 류마티스 관절염 동물 모델에서 cMSC, pcMSC2 투여, Enbrel(양성대조물질) 투여에 따른 관절염 지수를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민;으로 처리된 줄기세포를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 줄기세포는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민;으로 처리되지 않은 줄기세포와 비교하여, 항염증 작용, 염증성 사이토카인 억제 및 관절염 지수 개선 효과가 우수하므로, 관절염의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에 있어, TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민으로 처리된 줄기세포는 "프라이밍된 줄기세포" 또는 "기능강화된 줄기세포”로 표시할 수 있으며, '프라이밍된 줄기세포'와 '기능강화된 줄기세포'는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 프라이밍된 줄기세포는 본 발명의 프라이밍 인자 처리에 의하여 줄기세포의 면역 조절 및 염증 조절능이 현저히 증가되어 우수한 관절염 치료 효과를 나타내는 줄기세포를 의미한다.
본 발명에 있어, “프라이밍 인자” 는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 조합 또는 상기 조합에 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민을 더 포함하는 조합을 의미할 수 있다.
상기 프라이밍 인자의 조합은 이들의 단일 성분을 줄기세포에 처리하는 것과 비교하여 시너지 효과를 나타낼 수 있으며, 낮은 처리 농도로도 목적하는 줄기세포의 기능 강화를 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명에 있어 “기능 강화” 는 프라이밍 인자 처리에 의하여 줄기세포가 가지고 있는 고유의 성질 및 효과가 증진된 것을 의미하고, 특히 바람직하게는 관절염 예방, 개선 또는 치료 효과가 개선된 것을 의미할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 프라이밍된 줄기세포는 TNF-α, IFN-γ및 IFN-α로 처리된 줄기세포일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 TNF-α, IFN-γ및 IFN-α 은 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것일 수 있고, 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1:1: 1 내지 3 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 1 내지 2.5 (w/v) 의 비율로 처리될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α를 10ng/ml, 10ng/ml 및 20ng/ml 의 농도 조합으로 줄기세포에 처리하고 배양하여 줄기세포의 관절염 치료 효과를 확인하였다.
또한 본 발명의 줄기세포는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 조합에 더하여 비타민으로 더 처리된 줄기세포일 수 있으며, 구체적으로 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민이 더 처리된 줄기세포일 수 있다. 비타민을 더 포함하는 프라이밍 인자 조합을 줄기세포에 처리하여 프라이밍하면, TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 처리를 통해 유도되는 줄기세포 기능 강화가 더욱 현저하게 증진될 수 있으며, 관절염 예방 또는 치료 효과도 현저하게 증진될 수 있다. 상기 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민은 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3: 100 내지 10,000 (w/v), 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 300 내지 6,000 (w/v) 의 비율로 줄기세포에 처리될 수 있다. 보다 구체적으로 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 에 비타민 B2가 추가되는 경우 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 300 내지 1,000 (w/v), 더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 300 내지 600 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 400 내지 550 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 2: 500 (w/v) 의 비율로 처리될 수 있으며, TNF-α, IFN-γ, IFN-α 에 비타민 B3, 비타민 B5 또는 비타민 B6 가 추가되는 경우, 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 1,000 내지 10,000(w/v), 바람직하게는 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 1,000 내지 6,000(w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 4,000 내지 6,000 (w/v), 더욱 구체적인 예로 1:1: 0.1 내지 3: 4,000 내지 5,500 (w/v) 의 비율, 더욱 바람직하게는 1:1: 2: 5,000 (w/v)의 비율로 처리될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 복합 처리를 위한 농도로 TNF-α 10ng/ml, IFN-γ 10ng/ml, IFN-α 20ng/ml를 선정하고, 비타민 B2 5㎍/ml, 비타민 B3 50㎍/ml, 비타민 B5 50㎍/ml 및 비타민 B6 50㎍/ml 를 선정하여 줄기세포에 처리하고 면역 조절 및 염증 조절 기능의 강화를 확인하였다. 그 결과, 비타민을 첨가한 실험군에서는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 처리와 비교하여 IDO 및 TSG6의 발현 증가뿐만 아니라 줄기세포 표면에 발현하는 부착인자인 ICAM1 (Intercellular adhesion molecule 1) 과 VCAM (Vascular cell adhesion molecule) 의 발현이 유의적으로 증가됨을 확인하였다.
특히, 본 발명의 일 구현예에서는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 B6 조합의 프라이밍 인자 처리에 의하여 관절염 치료 효과가 증대된 줄기세포가 제조될 수 있음을 확인하고, 이를 "pcMSC2 (Primed clonal Mesenchymal Stem Cell 2)"라고 명명하였다.
본 발명에 있어, '프라이밍 처리' 또는 '프라이밍 인자 처리' 는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 조합 또는 상기 조합에 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민을 더 포함하는 조합을 줄기세포에 12시간 내지 36시간, 바람직하게는 20시간 내지 25시간 동안 처리하고, 줄기세포를 배양하는 것을 의미할 수 있다. 상기 배양은 당 분야에 널리 알려진 줄기세포 배양 배지를 제한없이 이용할 수 있다.
본 발명에 있어, TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민 처리에 의하여 기능이 강화되는 프라이밍된 줄기세포는 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 상기 줄기세포는 목적에 따라 적절히 제한 없이 선택될 수 있으며, 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 공지된 모든 조직, 세포 등의 성체 세포로부터 유래할 수 있으며, 예를 들어, 지방, 골수, 태반(또는 태반 조직세포), 또는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 또한 상기 줄기세포는 클로날 줄기세포를 의미할 수 있다.
본 발명의 프라이밍된 줄기세포는 상기 프라이밍 인자 조합이 처리되지 않은 줄기세포와 비교하여 TSG6 (TNFα-stimulated gene-6) 발현, IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현, ICAM1 (Intercellular adhesion molecule 1) 발현 및 VCAM (Vascular cell adhesion molecule) 발현으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 증진된 줄기세포일 수 있으며, 염증성 사이토카인 감소 또는 관절염 지수 감소와 같은 관절염 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 관절염은　관절 부위에서 발생하는 모든 염증성 질환을 제한없이 포함할 수 있으나, 바람직하게는 염증성　관절염(inflammatory arthritis), 퇴행성　관절염(degenerative arthritis), 대사성　관절염(metabolic arthritis), 반응성　관절염(reactive arthritis) 및 감염성　관절염(infectious arthritis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 염증성 관절염인 경우 류마티스 관절염, 소아기 류마티스 관절염, 건선 관절염 및 강직성 척추염으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 상기 관절염이 퇴행성 관절염인 경우, 골 관절염일 수 있고, 대사성 관절염인 경우 통풍성 관절염(gouty arthritis)일 수 있다. 또한 상기 관절염이 반응성 및/또는 감염성 관절염인 경우 C형 간염(Hepatitis C), 클라미디아(Chlamydia), 임질(gonorrhoea), 살모넬라(salmonella) 또는 시겔라(shigella) 중 하나 이상의 감염에 의하여 발생하는 관절염일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다.
부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분 (corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스 (tragacanth), 젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴 (pectin)등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA]), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 외용제일 수 있다. 본 발명의 외용제에는 시트제, 액상도포제, 분무제, 로션제, 크림제, 파프제, 분제, 침투 패드제, 분무제, 겔제, 파스타제, 리니멘트제, 연고제, 에어로졸, 분말제, 현탁액제, 경피흡수제 등의 통상적인 외용제의 형태가 포함될 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science] 에 기술되어 있다.
본 발명의 약학적 유효량은 환자의 상처 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 통상 본 발명의 약학 조성물의 일일 유효량을 환자에 적용시 0.00001 내지 10000 μg일 수 있다. 상기 1 일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다. 본 발명의 줄기세포 치료제의 투여량은 목적하는 관절염 치료, 예방, 개선 효과를 나타내는 양을 적절히 선택하여 사용할 수 있으나, 예컨대 바람직하게는 1일 당 1 x 102~1 x 1012세포/kg 로 투여될 수 있다.
그러나, 본 발명의 약학적 조성물의 상기 사용량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도, 상처 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 유효량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민으로 처리된 줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 처리하는 단계;를 포함하는 관절염 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
상기 개체는 인간을 포함한 포유류인 것이 바람직하며, 관절염 치료를 필요로 하는 환자로 관절염 치료 중인 환자, 치료를 받은 적이 있는 환자, 관절염 치료를 받을 필요가 있는 환자를 모두 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민으로 처리된 줄기세포는 기존의 관절염 치료를 위한 약물 또는 치료방법과 병용하여 처리될 수 있다. 본 발명의 프라이밍된 줄기세포를 병용 처리하는 경우, 이는 관절염 치료를 위한 다른 약물 또는 치료방법과 동시에 또는 순차적으로 처리될 수 있다.
또한 본 발명은 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민으로 프라이밍된 줄기세포를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 줄기세포 치료제 및 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α로 처리된 줄기세포를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
상기 줄기세포 치료제 및 키트에는 앞서 설명된 약학적 조성물에 관한 설명을 동일하게 적용할 수 있다.
본 발명의 줄기세포 치료제는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있으며, 정맥내 주입, 피하 주입, 피내 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 줄기세포 치료제의 투여량은 목적하는 관절염 치료, 예방, 개선 효과를 나타내는 양을 적절히 선택하여 사용할 수 있으나, 예컨대 바람직하게는 1일 당 1 x 102~1 x 1012세포/kg 로 투여될 수 있다.
보다 구체적으로 상기 TNF-α, IFN-γ및 IFN-α 은 0.1-3: 0.1-3: 0.1-3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것일 수 있고, 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1:1: 1 내지 3 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 1 내지 2.5 (w/v) 의 비율로 처리될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α를 10ng/ml, 10ng/ml 및 20ng/ml 의 농도 조합으로 줄기세포에 처리하고 배양하여 줄기세포의 관절염 예방 또는 개선 효과를 확인하였다.
또한 본 발명의 줄기세포는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 조합에 더하여 비타민으로 더 처리된 줄기세포일 수 있으며, 구체적으로 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민이 더 처리된 줄기세포일 수 있다.
비타민을 더 포함하는 프라이밍 인자 조합을 줄기세포에 처리하여 프라이밍하면, TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 처리를 통해 유도되는 줄기세포 기능 강화가 더욱 현저하게 증진될 수 있으며, 관절염 예방 또는 개선 효과도 현저하게 증진될 수 있다. 상기 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민은 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3: 100 내지 10,000 (w/v), 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 300 내지 6,000 (w/v) 의 비율로 줄기세포에 처리될 수 있다. 보다 구체적으로 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 에 비타민 B2가 추가되는 경우 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 300 내지 1,000 (w/v), 더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 300 내지 600 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 400 내지 550 (w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 2: 500 (w/v) 의 비율로 처리될 수 있으며, TNF-α, IFN-γ, IFN-α 에 비타민 B3, 비타민 B5 또는 비타민 B6 가 추가되는 경우, 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 1,000 내지 10,000(w/v), 바람직하게는 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 0.1 내지 3: 1,000 내지 6,000(w/v), 더더욱 바람직하게는 1:1: 0.1 내지 3: 4,000 내지 6,000 (w/v), 더욱 구체적인 예로 1:1: 0.1 내지 3: 4,000 내지 5,500 (w/v) 의 비율, 더욱 바람직하게는 1:1: 2: 5,000 (w/v)의 비율로 처리될 수 있다.
또한 본 발명은 1) TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 를 줄기세포에 처리하고 배양하는 단계; 를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명의 제조방법은, 상기 1) 단계에서 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민을 함께 처리하는 것일 수 있고, 상기 비타민은 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민일 수 있다.
상기 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 은 1:1: 0.1 내지 3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것일 수 있고, TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민은 1:1: 0.1 내지 3: 100 내지 10,000 (w/v) 의 비율로 처리되는 것일 수 있으며, 약학적 조성물 및 줄기세포 치료제에서 설명된 비율과 동일한 비율로 처리될 수 있다.
또한 본 발명은 1) TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민;을 줄기세포에 처리하고 배양하는 단계; 를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법에 사용하기 위한 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α; 또는 TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민의 용도를 제공한다. 상기 비타민은 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민일 수 있고, 보다 바람직하게는 비타민 B6 일 수 있다.
상기 처리는 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 조합 또는 상기 조합에 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민을 더 포함하는 조합을 줄기세포에 12시간 내지 36시간, 바람직하게는 20시간 내지 25시간 동안 처리하고, 줄기세포를 배양하는 것을 의미할 수 있다. 상기 배양은 당 분야에 널리 알려진 줄기세포 배양 배지를 제한없이 이용할 수 있다.
본 발명의 프라이밍된 줄기세포인 pcMSC2는 관절염 지수 감소와 염증성 사이토카인을 감소시킴으로써 체내 염증 수치를 감소시키고, 면역 불균형을 해소하여 효과적인 관절염 예방, 치료 또는 개선 효과를 달성할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 줄기세포 배양 및 후보물질 선정
37℃및 5% CO2 인큐베이터에서, 저장상태 (LN2 tank 보관)의 중간엽 줄기세포를 해동하여 배양하고, 이 때 10% FBS 또는 4% hPL을 함유하는 배지 (DMEM, alpha-MEM)에서 세포 컨플루언스가 80%정도로 증식될 때까지 배양하였다. 배양한 중간엽 줄기세포를 100mm dish에 seeding한 후, 중간엽 줄기세포 기능 강화를 위한 후보 물질을 24시간 동안 처리한 후, 기능 강화를 위한 1차 후보 물질의 농도를 설정하였다.
1차 후보물질로는 TNF-α, IFN-γIFN-α를 선정하고, 기능 강화를 확인하기 위해 TSG6 (TNFα-stimulated gene-6)와 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현을 증가시킬 수 있는 최저 유효 농도를 확인하기 위하여, TNF-α 5, 10, 20ng/ml, IFN-γ 5, 10, 20 ng/ml, IFN-α 10, 20, 40 ng/ml를 각각 줄기세포에 처리하고, TSG6 및 IDO의 발현 변화를 확인하였다.
IDO는 T 세포 증식에 필수적인 트립토판을 카이누렌산(kynurenine)으로 바꿈으로써, T 세포와 같은 면역 세포의 증식을 억제하는 면역조절인자로 알려져 있으며, TSG6는 중간엽 줄기세포가 분비하는 항염증 조절 인자로 알려져 있다. 줄기세포를 배양한 후 TRIzol (Invitrogen)을 이용하여 총 RNA를 분리한 후 PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)를 이용하여 총 RNA로 cDNA를 합성하여 qRT-PCR을 수행하였다. 각 후보물질의 농도별 처리에 따른 TSG6 및 IDO 결과를 도 1, 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 1 내지 도 3에 나타낸 바와 같이, TSG6 및 IDO의 발현을 모두 현저하게 증가 유도할 수 있는 최저 유효농도로 TNF-α 10ng/ml, IFN-γ 10ng/ml 및 IFN-α 20ng/ml를 확인하고, 이후 실험에서 해당 농도를 기준으로 처리하였다.
실시예 2. 줄기세포 기능 강화를 위한 조합 선정
상기 실시예 1을 통해, 줄기세포의 기능강화를 유도하는 것으로 확인된 후보 물질 및 최저 유효농도를 기초로 더욱 강화된 기능강화 조성물을 탐색하기 위해 선정된 후보물질 및 이들의 농도 조합을 표 1 과 같이 설정하였다. 하기 표 1에 기재된 후보 조합을 24시간 동안 중간엽 줄기세포에 처리하고 실시예 1과 같이 줄기세포를 배양한 후 TRIzol (Invitrogen)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 이후 PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)를 이용하여 총 RNA로 cDNA를 합성하여 qRT-PCR을 수행하였다.
실험군
0 대조군 (무처리군)
1 TNF-α (10ng/ml)
2 IFN-γ (10ng/ml)
3 IFN-α (20ng/ml)
4 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml)
5 TNF-α (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml)
6 IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml)
7 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml)
이를 통해 면역 및 항염증 조절의 대표적 인자인 IDO, TSG6의 발현 변화를 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 무처리 대조군 그룹 0 과 비교하여, 모든 단일 후보물질 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 처리군 (실험군 1 내지 3)에서 IDO, TSG6의 발현 증가가 확인되었으나, 이들을 각각 조합한 실험군 4 내지 6에서 단일 후보물질 처리군 대비 더욱 현저한 발현 증가가 확인되었다. 특히, TNF-α에 IFN-γ 또는 IFN-α를 처리한 실험군 4, 5는 IFN-γ 및 IFN-α 만을 조합한 실험군 6 과 비교하여 우수한 효과를 나타내었고, 3가지 후보물질을 모두 조합한 처리군에서는 놀랍게도 2개 조합 대비 2배 이상 증가된 기능 강화 효과가 확인되었다.
따라서, 상기 결과를 통해 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) 조합을 줄기세포에 처리하면, 매우 현저한 줄기세포의 면역 및 항염증 기능 강화가 달성될 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 비타민 추가에 따른 줄기세포 기능 강화 효과 확인
3.1 비타민 단독 첨가에 따른 줄기세포 기능 강화 효과 확인
비타민은 줄기세포 배양과정 중에 첨가 시, 줄기세포의 증식 능력을 개선시키고, 줄기세포의 stemness를 유지시켜주는 것으로 알려져 있다. 따라서, 다양한 비타민을 줄기세포 배양과정에 처리하고, 비타민이 줄기세포의 항염증 및 면역 기능 강화 효과를 달성할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로 하기 표 2에 나타낸 다양한 비타민 종류를 실시예 1에 기재된 방법에 따라 줄기세포에 처리하였으며, 각 후보 물질 처리에 따른 IDO 및 TSG6 발현 변화를 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 비타민 처리군은 줄기세포의 항염증 및 면역 조절 기능에 관여하는 IDO 및 TSG6의 발현 변화에는 유의한 효과를 나타내지 않았다.
3.2 비타민과 TNF-α + IFN-γ + IFN-α 조합에 따른 줄기세포 기능 강화 효과 확인
상기와 같이 단일 물질로는 줄기세포 항염증 및 면역조절 기능 강화 효과가 나타나지 않는 비타민을 실시예 2에서 확인한 기능 강화 물질들의 조합에 첨가하는 경우 시너지 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 하기 표 3 과 같이 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) 에 각각의 비타민을 첨가하고 각 조합 처리에 따른 IDO 및 TSG6의 발현 변화를 확인하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
실험군
0 대조군 (무처치군)
1 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml)
2 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin A 10ug/ml
3 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin B1 50ug/ml
4 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin B2 5ug/ml
5 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin B3 50ug/ml
6 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin B5 50ug/ml
7 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin B6 50ug/ml
8 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin B12 50ug/ml
9 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin D2 10ug/ml
10 TNF-α (10ng/ml) + IFN-γ (10ng/ml) + IFN-α (20ng/ml) + vitamin D3 10ug/ml
도 6에 나타낸 바와 같이, 비타민 미처리 실험군 1 과 비교하여 실험군 2, 3, 8, 9에서는 IDO 및 TSG6 의 발현이 유의적으로 증가하지 않았고, 실험군 10은 TSG6 발현은 증가하였으나, IDO 에서는 대조군 대비 발현 증가가 확인되지 않았다. 반면 비타민 B2 (실험군 4), 비타민 B3 (실험군 5), 비타민 B5 (실험군 6), 비타민 B6 (실험군 7)의 경우에는 유의적으로 IDO와 TSG6의 발현이 모두 증가되는 것을 확인하였다. TSG6의 경우, TNF-α + IFN-γ + IFN-α 를 처리한 실험군 1과 비교하였을 때, 실험군 4, 5 6, 7에서 각각 49%, 30%, 35%, 45% 증가하였으며, IDO의 경우, 실험군 1과 비교하였을 때, 실험군 4, 5, 6, 7에서 각각 25%, 37%, 31%, 18% 증가됨을 확인하였다.
상기와 같은 결과는, 비타민을 단독으로 줄기세포에 처리하는 경우 줄기세포의 항염증 및 면역조절능을 향상시키지 못하지만, TNF-α + IFN-γ + IFN-α와 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 또는 비타민 B6 를 조합하여 처리하는 경우, TNF-α + IFN-γ + IFN-α 의 효과를 더욱 높일 수 있음을 보여주는 결과이다.
실시예 4. ICAM1 및 VCAM 발현 변화 확인
ICAM1 과 VCAM 은 T세포와 결합을 통해, T세포의 증식을 억제하고 사멸을 유도함으로써 과도한 면역과 염증 반응을 감소시켜 다양한 면역 및 염증 관련 질환에 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 실시예 3의 표 3 에 기재된 동일한 실험군으로 24시간 동안 중간엽 줄기세포에 처리하고 실시예 1과 같이 줄기세포를 배양한 후 TRIzol (Invitrogen)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 이후 PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)를 이용하여 총 RNA로 cDNA를 합성하여 qRT-PCR을 수행하였다.
줄기세포의 면역 질환 및 염증 질환 치료 효과 증진 여부를 확인하기 위하여, 줄기세포 표면에 발현하는 부착인자인 ICAM1 (Intercellular Adhesion Molecule 1) 과 VCAM (vascular cell adhesion molecule) 의 발현을 확인하였으며 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, ICAM1의 경우, TNF-α + IFN-γ + IFN-α 를 처리한 실험군 1과 비교하였을 때, 실험군 4, 5, 6, 7에서 각각 45%, 100%, 35%, 45% 증가하였으며, VACM의 경우, 실험군 1과 비교하였을 때, 실험군 4, 5, 6, 7에서 각각 52%, 69%, 52%, 69% 증가됨을 확인하였다.
따라서, TNF-α + IFN-γIFN-α 와 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 또는 비타민 B6의 조합을 줄기세포에 처리하는 경우, ICAM1 및 VCAM의 발현이 현저하게 증가하며, 이를 통해 줄기세포의 면역 조절능 및 항염증 효능이 촉진될 수 있다.
실시예 5. 염증 및 면역조절능력 확인
IDO, TSG6, ICAM-1, VCAM와 같은 면역 및 염증 조절인자를 강화시켰던 상기 실시예 4에서 확인한 프라이밍 처리 조건 조합이 실제 과도한 면역반응을 유발한 조건에서 염증 및 면역반응을 억제하며, 기능 강화되지 않은 cMSC 대비 더욱 우수한 효과를 나타내는지 확인하였다. 이하에서는 표 3 중 실험군 7인 TNF-α + IFN-γIFN-α와 비타민 B6 조합을 cMSC에 처리하였고, 상기 조합으로 프라이밍 처리된 MSC 를 'pcMSC2 (Primed clonal Mesenchymal Stem Cell 2)'로 명명하였다.
PHA (Phytochemagglutinin) 자극 림프구 배양실험은 림프구의 세포분열 촉진을 유도하는 PHA라는 시약을 이용하는 방법으로 과도한 면역활성을 유도하는 방법이다. PBMC (peripheral blood mononuclear cell, PBMC, 말초혈액세포)를 96well plate에 well당 2X105cells 분주하고, PHA 1㎍/ml로 자극하여 5X104cell의 cMSC 또는 pcMSC2와 4일간 공배양하였다. 배양이 완료된 후, 상등액을 모아 염증성 사이토카인인 IFN-gamma와 항염증성 사이토카인인 IL-10을 ELISA를 통해 확인하였고 그 결과를 도 8에 나타내었다. 음성 대조군으로는 PHA 로 자극되지 않은 그룹을 이용하였으며, P1으로 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, IFN-gamma는 PHA로 자극한 경우 16013pg/ml 와 같이 현저하게 증가하였나 cMSC와 공배양 한 경우, 5048pg/ml 감소하였고, pcMSC2와 공배양한 경우 1700pg/ml까지 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다. 또한 cMSC와 pcMSC2를 비교하였을 경우에는 기능 강화된 pcMSC2에서 cMSC보다 약 66%정도 IFN-gamma가 더 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 항염증성 사이토카인인 IL-10의 경우, cMSC와 pcMSC2 모두에서 IL-10의 증가를 확인할 수 있었으며, 특히 cMSC보다 기능강화된 pcMSC2와 공배양한 조건에서, 약 22% 많은 IL-10이 분비되는 것을 확인하였다.
실시예 6. 류마티스 관절염 동물모델에서 pMSC2의 치료 효과 확인
실시예 5에서 기능강화 효과가 확인된 pcMSC2 세포를 투여하여 류마티스 관절염 치료 효과를 확인하였다.
6.1 류마티스 관절염 동물 모델 제조 및 pcMSC2 투여 프로토콜
DBA1/J 수컷 마우스를 입수 후 34일간 (순화 8일, 관절염 유발기간 26) 시험을 실시하는 동물실 내에서 순화시키고, 매일 1회 이상 일반증상을 관찰하였다.
관절염 유발은 다음과 같은 방식으로 수행하였다. 먼저 Type Ⅱ collagen 2 mg/mL를 사용하여 동일한 양의 complete Freund's adjuvant (CFA)와 혼합한 후, 이 혼합액 0.1 mL을 마우스의 꼬리 기저부로부터 꼬리 쪽으로 1.5 cm 부위의 피내로 주입하여 1차 투여를 수행하였다. 투여부위 및 깊이는 모든 실험동물에 동일하게 실시하였다. 1차 투여 후 21일 차에 혼합액 (Type Ⅱ collagen + incomplete Freund's adjuvant) 0.1 mL을 꼬리 기저부로부터 꼬리 쪽으로 1.5 cm 부위의 피내로 2차 주입하여 부스팅하였다.
2차 투여 부스팅을 통한 관절염 유발 5일 후에 질환 유발이 확실한 동물을 필요한 수만큼 선택하고, 그 중 건강한 개체로 판정한 동물의 관절염 지수를 측정하였다. 측정한 동물의 지수를 순위화하고, 각 군의 평균 관절염 지수가 균일하게 분포하도록 시험군 구성과 같이 무작위 분배하였다.
음성대조물질 (vehicle) 및 시험물질 (pcMSC2)은 1주 간격으로 1회, 총 3회 미정맥 투여하였으며, 회당 투여액량은 200㎕/head 로 동일하게 하였다. 양성대조물질 (Enbrel)은 1주 간격으로 1회, 총 4회 주입하였다. pcMSC2는 회 당 5.0×105 cells/head, 총 1.5×106 cells/head 투여하였다.
본 발명의 류마티스 관절염 동물 모델 제조 및 투여 프로토콜을 도 9에 나타내었다.
6.2 관절염 지수 감소 확인
관절염 지수 (arthritis index)는 주 2회 관찰하고, 평가지표를 기준으로 개체별로 기록하였다. 평가지표는 하기 표 4와 같다.
0점 증상 없음
0.5점 발가락에서 발적이 관찰되나 붓기가 없는 상태
1점 한쪽 발에서 염증과 붓기 관찰
2점 한쪽 발 이상에서 염증과 붓기가 관찰되거나, 발 전체에 걸쳐 경도의 붓기가 관찰
3점 발 전체에 염증과 붓기가 관찰
4점 극심한 염증과 붓기 또는 관절 운동 장애 등이 관찰(이 경우 실험동물이 케이지의 상단 부분에 매달리는 것이 불가함)
관절염 유발 시점(D-0)부터 부검일(D-71)까지의 각 군의 개체 별 관절염 지수를 확인한 결과를 도 10 및 표 5에 나타내었다.
도 10 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 관절염 유발 15일차부터 pcMSC2, Enbrel 투여군에서 유사한 경향으로 음성대조군 대비 관절염 지수가 감소하는 것을 확인하였다. 이후 부검일까지 음성대조군 대비 pcMSC2, Enbrel 투여군에서 유의미한 수준으로 관절염 지수가 감소하였다.
6.3 염증성 사이토카인 감소 효과 확인
류마티스 관절염 유발 후 음성대조물질, pcMSC2, 양성대조물질을 투여한 실험동물로부터 혈청을 분리하여 염증성 사이토카인인 TNF-alpha, IFN-gamma 수치를 측정하였고 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, TNF-alpha의 경우 음성대조군 대비 pcMSC2 투여군에서 약 1.6배, Enbrel 투여군에서 약 2.4배 감소되는 것을 확인하였다. IFN-gamma는 통계적으로 유의미한 수준은 아니지만, 음성대조군 대비 pcMSC2 투여군에서 약 1.6배, Enbrel 투여군에서 약 1.3배 감소하는 경향을 확인하였다.
6.4 조직학적 분석을 통한 관절 연골 조직 손상 정도 평가
발목과 정강이 관절 연골조직을 채취하여 H&E, Safranin-O 염색 후 조직학적 분석을 통해 손상 정도를 평가하였으며, H&E, Safranin-O 으로 염색된 조직 및 조직화학적 스코어를 정량화한 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 관절염을 유발한 후 음성대조물질을 투여한 실험동물의 경우, 연골에서 심각한 수준의 손상이 확인되었다. 반면에 류마티스 관절염 치료제인 Enbrel을 투여한 군에서는 연골의 형태적 이상이 관찰되지 않거나(3/5마리), 경도의 관절염이 유발된 연골의 형태적 이상 소견이 관찰되어(2/5마리) 음성대조군 대비 약 2.3배 수준으로 관절염 지수가 낮아진 것으로 확인하였다.
한편 본 발명의 pcMSC2가 투여된 군에서는 3/5마리에서 형태적 이상이 관찰되지 않았고, 2/5마리에서 중간정도의 관절염이 유발되어 음성대조군 대비 약 2.5배 수준으로 관절염 지수가 감소함을 확인하였다. 특히 pcMSC2 투여군에서는 양성대조군 대비 병변의 정도가 유사 내지는 완화되어 우수한 치료효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 7. 류마티스 관절염 동물모델에서 pMSC2의 치료 효과 비교
실시예 5에서 기능강화 효과가 확인된 pcMSC2 세포를 투여하여 류마티스 관절염 치료 효과를 확인하고, 프라이밍 처리되지 않은 cMSC 세포 투여군과 류마티스 관절염 치료 효과를 비교하였다.
7.1 류마티스 관절염 동물 모델 제조 및 pcMSC2 투여 프로토콜
DBA1/J 수컷 마우스를 이용하여 입수 후 34일간 (순화 8일, 관절염 유발기간 26) 시험을 실시하는 동물실 내에서 순화시키고, 매일 1회 이상 일반증상을 관찰하였다.
관절염 유발은 다음과 같은 방법으로 수행하였다: Type Ⅱ collagen 2 mg/mL를 사용하여 동일한 양의 complete Freund's adjuvant (CFA)와 혼합하고, 이 혼합액 0.1 mL을 마우스의 꼬리 기저부로부터 꼬리 쪽으로 1.5 cm 부위의 피내로 주입하였다 (1차 투여). 투여부위 및 깊이는 모든 실험동물에 동일하게 실시하였다. 1차 투여 후 21일 차에 혼합액 (Type Ⅱ collagen + incomplete Freund's adjuvant) 0.1 mL을 꼬리 기저부로부터 꼬리 쪽으로 1.5 cm 부위의 피내로 주입하였다 (2차 투여, boosting). 관절염 유발 (2차 투여, boosting) 5일 후에 동물의 군분리는 질환 유발이 확실한 동물을 필요한 수만큼 선택하고, 그 중 건강한 개체로 판정한 동물의 관절염 지수를 측정하였다. 측정한 동물의 지수를 순위화하고, 각 군의 평균 관절염 지수가 균일하게 분포하도록 시험군 구성과 같이 무작위 분배하였다.
음성대조물질 및 시험물질 (cMSC, pcMSC2)은 1주 간격으로 1회, 총 3회 미정맥 투여하였으며, 양성대조물질 (Enbrel)은 1주 간격으로 1회, 총 4회 주입하였다. cMSC, pcMSC는 회 당 5.0×105 cells/head 총 1.5×106 cells/head 투여하였다. 본 실험의 프로토콜을 도 13에 나타내었다.
7.2 관절염 지수 감소 확인
관절염 지수 (arthritis index)는 주 2회 관찰하고, 평가지표를 기준으로 개체별로 기록하였다. 평가지표는 0점: 증상 없음, 0.5점: 발가락에서 발적이 관찰되나 붓기가 없는 상태, 1점: 한쪽 발에서 염증과 붓기 관찰, 2점: 한쪽 발 이상에서 염증과 붓기가 관찰되거나, 발 전체에 걸쳐 경도의 붓기가 관찰, 3점: 발 전체에 염증과 붓기가 관찰, 4점: 극심한 염증과 붓기 또는 관절 운동에 장애 등이 관찰(이 경우 실험동물이 케이지의 상단 부분에 매달리는 것이 불가함)등의 기준으로 점수를 부여하였다.
관절염 유발 시점부터 부검일까지의 각 군의 개체 별 관절염 지수를 확인한 결과를 도 14 및 표 6에 나타내었다.
관절염 유발 시점부터 부검일까지의 각 군의 개체 별 관절염 지수 확인 결과, 유발 5일부터 cMSC, pcMSC2, Enbrel 투여군에서 유사한 경향으로 음성대조군 대비 감소하는 경향을 보이다가 유발 34일차에는 pcMSC2와 Enbrel 투여군의 관절염 지수가 유사한 것으로 확인되었다. 이후 D-64까지 pcMSC2투여군이 Enbrel 투여군에 대비 관절염 지수가 감소하는 경향을 확인하였다. cMSC 투여군의 경우 초반에 감소하는 경향을 보이다가 유발 22일 이후로 pcMSC2, Enbrel 투여군 대비 지속적으로 증가하는 경향을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 pcMSC2 투여군이 양성 대조군뿐만 아니라, TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리되지 않은 cMSC 대비 우수한 관절염 치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
이상, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 은 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민으로 더 처리된 줄기세포인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민은 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3: 100 내지 10,000 (w/v) 의 비율로 처리되는 것인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방, 골수, 태반 또는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포는 TSG6 (TNFα-stimulated gene-6) 발현, IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) 발현, ICAM1 (Intercellular adhesion molecule 1) 발현 및 VCAM (Vascular cell adhesion molecule) 발현으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 증진된 것인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포는 염증성 사이토카인 감소 효과를 나타내는 것인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 관절염은 　염증성　관절염(inflammatory arthritis), 퇴행성　관절염(degenerative arthritis), 대사성　관절염(metabolic arthritis), 반응성　관절염(reactive arthritis) 및 감염성　관절염(infectious arthritis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 염증성 관절염은 류마티스 관절염, 소아기 류마티스 관절염, 건선 관절염 및 강직성 척추염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 퇴행성 관절염은 골 관절염인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 줄기세포 치료제.
  12. TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 로 처리된 줄기세포를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 키트.
  13. 1) TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 를 줄기세포에 처리하고 배양하는 단계; 를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 1) 단계에서 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5 및 비타민 B6 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비타민을 함께 처리하는 것인, 관절염 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 TNF-α, IFN-γ 및 IFN-α 은 1:1: 0.1 내지 3 (w/v) 의 비율로 처리되는 것인, 관절염 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법.
  16. 제14항에 있어서, TNF-α, IFN-γ, IFN-α 및 비타민은 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3 : 0.1 내지 3: 100 내지 10,000 (w/v) 의 비율로 처리되는 것인, 관절염 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법.
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