JP6611400B2

JP6611400B2 - 間葉系幹細胞又は培養上清を含むシノビオリン発現阻害剤

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Publication number: JP6611400B2
Application number: JP2018547809A
Authority: JP
Inventors: 直樹漆畑; 秀輝種村; 謙太郎高垣; 勝幸隠岐; 利博中島; 聡子荒谷
Original assignee: 株式会社バイオミメティクスシンパシーズ
Priority date: 2016-10-31
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2019-11-27
Anticipated expiration: 2037-10-27
Also published as: WO2018079753A1; EP3533801A1; JPWO2018079753A1; CN110022888A; EP3533801A4; US20190255117A1

Description

本発明は，間葉系幹細胞又は培養上清を含むシノビオリン発現阻害剤に関する。

国際公開２００２−５２００７号パンフレット（下記特許文献１）には，シノビオリン（Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ；ＳＹＶＮ１：滑膜アポトーシスインヒビター１）と，シノビオリンをコードする遺伝子が記載されている。

シノビオリンは，リウマチ患者由来の滑膜細胞で過剰発現している因子として同定されたタンパク質である（非特許文献１）。シノビオリンは，ユビキチン化のＥ３リガーゼとしての機能を有する。シノビオリンのＥ３リガーゼ活性に対する阻害剤はすでに発見されており，この阻害剤を用いることで，リウマチの症状が抑制される（非特許文献２）。
リウマチ以外にも，肺，肝臓などにおいてシノビオリンがコラーゲンの過剰な分泌を促し，結果として繊維化を引き起こすことも明らかとなっている（非特許文献３,４）。また，シノビオリンが抗がん遺伝子ｐ５３の分解に関わることから，シノビオリンが発がんを引き起こす可能性も示唆されている（非特許文献５）。

シノビオリンのヘテロノックアウトマウスでは，リウマチがほとんど起こらないこと（非特許文献１）や，リウマチ患者において末梢血中のシノビオリン発現量の上昇がみられること（非特許文献６）から，シノビオリンの活性阻害だけではなく，シノビオリンの量そのものをコントロールすることも，リウマチの病態を緩和するのに重要であると考えられる。現在までに，化合物によってシノビオリンの活性を制御する方法は知られているが，シノビオリンの発現量を制御する方法は知られていない。

国際公開２００２−５２００７号パンフレット

Amano, T., et al. （2003）. Genes & Development, 17（19）, 2436−49. Yagishita, N., et al. （2012）. International Journal of Molecular Medicine, 30（6）, 1281−6. Nakajima, F., et al. （2015）. International Journal of Molecular Medicine, 35（1）, 110−6. Hasegawa, D., et al. （2010）. PloS One, 5（10）, e13590. Yamasaki, S., et al. （2007）. The EMBO Journal, 26（1）, 113−22. Toh, M.−L., et al. （2006）. Arthritis and Rheumatism, 54（7）, 2109−18. Le Blanc, K., & Mougiakakos, D. （2012）. Nature Reviews Immunology, 12（5）, 383−396.

そこで，本発明は，シノビオリン遺伝子やシノビオリンタンパク質の発現を阻害するためのシノビオリン発現阻害剤を提供することを目的とする。

本発明は，間葉系幹細胞又は培養上清が，シノビオリン遺伝子やシノビオリンタンパク質の発現を効果的に阻害するという，実施例による知見に基づくものである。

本発明の第１の側面は，シノビオリン発現阻害剤に関する。シノビオリン発現阻害剤は，シノビオリン遺伝子やシノビオリンタンパク質の発現を阻害するための医薬である。本発明のシノビオリン発現阻害剤は，間葉系幹細胞又は培養上清を有効成分として，有効量含む。

本発明によれば，シノビオリン遺伝子やシノビオリンタンパク質の発現を阻害するためのシノビオリン発現阻害剤を提供することができる。

図１は，細胞数の測定結果を示す図面に替るグラフである。図２は，シノビオリン遺伝子の発現量を示す図面に替るグラフである。図３は，コラーゲン感作前の後肢の厚みを０として各測定時の厚みをプロットした図面に替るグラフである。図４は，様々な細胞株のシノビオリン遺伝子の発現量を示す図面に替るグラフである。

以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。

本発明の第１の側面は，シノビオリン発現阻害剤に関する。シノビオリン発現阻害剤は，シノビオリン遺伝子やシノビオリンタンパク質の発現を阻害するための医薬である。本発明のシノビオリン発現阻害剤は，間葉系幹細胞又は間葉系幹細胞の培養上清を有効成分として，有効量含む。培養上清は，間葉系幹細胞を，培地を用いて培養する際に得られる培養上清を意味し，間葉系幹細胞を含むものが好ましい。

間葉系幹細胞は，生体内の脂肪，骨髄，臍帯，羊膜，胎盤，及び歯髄などに存在する，多分化能を有する体性幹細胞である（非特許文献７）。間葉系幹細胞は種々の中胚葉細胞，例えば，骨芽細胞，軟骨細胞，脂肪細胞に分化することができる。間葉系幹細胞はその多分化能から，骨，関節，筋肉，肝臓，腎臓，心臓，中枢神経系及び膵臓などの再生医療への応用が期待されている。損傷組織の補填，代替以外にも，間葉系幹細胞は種々のサイトカインや細胞外マトリクスを産生することにより生体内で様々な有用な働きをする。なかでも間葉系幹細胞が持つ免疫抑制能は研究が進み，カナダとニュージーランドにおいては，骨髄から分離された同種間葉系幹細胞が移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対する治療薬として承認されている。

間葉系幹細胞は，例えば無血清培地を用いた無血清培養方法によって培養してもよい。間葉系幹細胞の無血清培養方法は，例えば，特開２０１２−１５７２６３号公報に開示されている。

先に説明したとおり，シノビオリンタンパク質の発現や機能を阻害することでリウマチの治療に寄与する。このため，本発明のシノビオリン発現阻害剤は，リウマチの治療剤又は予防剤として有効に利用されうる。さらには，本発明はシノビオリンの発現を抑制できるので，シノビオリンの発現を抑制できる機能性食品などをも提供できる。このような食品の例は，抗肥満食品である。この食品の例は，サプリメントや，食品添加物であってもよい。

特開２００９−１５５２０４号公報には，シノビオリンをコードする遺伝子の発現を抑制することで，ＩＬ−４の産生及びＩｇＥの産生を調節できること，及びアレルギー性疾患，感染症，自己免疫疾患又は白血病を予防及び治療に有効であることが開示されている。また，この文献には，シノビオリンをコードする遺伝子の例として，この文献中の配列番号１に示される塩基配列を含むものが開示されている。従って，本発明のシノビオリンの発現阻害剤は，ＩＬ−４の産生又はＩｇＥの産生の産生阻害剤や，アレルギー性疾患，感染症，自己免疫疾患又は白血病を予防又は治療剤としても利用されうる。

ＷＯ２００６／１３７５１４号パンフレットには，シノビオリンの発現もしくは機能阻害物質を有効成分とする癌治療剤が開示されている。したがって，本発明のシノビオリン発現阻害剤は，癌の治療剤として有効に利用されうる。

本発明で用いる培地は、ＤＭＥＭ，ＭＣＤＢ２０１，アルファ−ＭＥＭ，Ｆ１２のいずれか，またはそれらを混合したものを基本培地とし、ウシあるいはヒトなどの血清を１〜２０％混合したものを用いてもよい。あるいは、公知の無血清培地を用いてもよい。本発明の培地は，公知の培地における成分を適宜含んでもよい。また，例えば，特許第４３８５０７６号公報（特許文献１）及び特開２０１２−１５７２６３号公報（特許文献２）には動物細胞を無血清培養するための培地が開示されている。このように公知の文献に記載される要素を適宜本発明の培地に添加してもよい。

培地の調整方法は，公知であり，例えば先に説明した特許文献のほか，公知の培養学の書籍に記載された方法を適宜採用すればよい。

培地の具体的な例は，ＤＭＥＭ，ＭＣＤＢ２０１，アルファ−ＭＥＭ，Ｆ１２のいずれか，またはそれらを混合して基本培地とした無血清培地である。

細胞の培養方法は，公知の方法を適宜用いればよい。以下，間葉系幹細胞を得る例に基づいて，細胞の培養方法を説明する。まず，被験者から皮下脂肪組織を外科的に切除又は吸引することで取得する。このようにして得られた皮下脂肪組織から，間質細胞画分（ＳＶＦ）を抽出する。間質細胞画分を，組織分散酵素溶液を用いて間葉系幹細胞を得る。間質細胞画分（ＳＶＦ）及び組織分散酵素溶液の量は，以下に説明する実施例を参考にして適宜調整すればよい。反応温度は２５℃〜４０℃で，反応時間は１５分〜５時間の間で適宜調整すればよい。組織が分散していることを視認できた後に，例えば遠心分離することでペレットを回収する。回収したペレットを生理食塩水等に懸濁し，ろ過を行い，ろ液を再度遠心分離して２次ペレットとして，間葉系幹細胞を得る。

上記のようにして得られたペレットを用いて培養を行う。初代培養とそれ以降の代の培養とは同じ培地を用いてもよいし，異なる培地を用いてもよい。例えば，上記した本発明の培地を用いて，フラスコまたはシャーレといった容器を用いて，接着培養を行う。例えば，９０〜９５％コンフルエントになった時点で継代を繰り返し，必要に応じて継代の途中でもＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５などの幹細胞マーカーとＣＤ１０の発現を，フローサイトメーターや細胞の免疫染色法で確認する。継代は、培養上清を回収した後、剥離剤を用いて細胞を剥離し、遠心分離することで細胞のペレットを回収した後、ペレットを培地に懸濁しフラスコに播種することで行う。この過程で、培養上清を得ることができる。初代培養開始から約３週間以内に，１ｘ１０^８個オーダーの脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を得ることができる。その後，適宜，細胞製剤のエンドトキシン濃度，無菌性試験，特定ウイルス感染否定試験，マイコプラズマ否定試験，生存率などの必要な品質管理基準項目について試験を行ってもよい。

本発明の剤は，当業者に公知の方法で製造すればよい。本発明の剤は，経口用製剤および非経口用製剤として製造することができるが，好ましくは非経口用製剤である。このような非経口用製剤は，液剤（水性液剤，非水性液剤，懸濁性液剤，乳濁性液剤など）としてもよいし,固形剤（粉末充填製剤，凍結乾燥製剤など）としてもよい。また，本発明の剤は，徐放製剤としてもよい。

液剤を製造する方法は，公知の方法で製造することができる。例えば，間葉系幹細胞を薬学的に許容された溶媒に混合し，滅菌された液剤用の容器に充填することで製造することができる。薬学的に許容された溶媒の例は，注射用水，蒸留水，生理食塩水，電解質溶液剤であり，滅菌された溶媒を用いることが好ましい。滅菌された液剤用の容器の例は，アンプル，バイアル，及びバッグである。これら容器は，ガラス製やプラスチック製など公知の容器を用いることができる。具体的には，プラスチック製容器の例は，ポリ塩化ビニル，ポリエチレン，ポリプロピレン，エチレン・酢酸ビニル・コポリマーなどの材質を用いたものである。これら容器や溶剤の滅菌法の例は，加熱法（火炎法，乾燥法，高温蒸気法，流通蒸気法，煮沸法など），濾過法，照射法（放射線法，紫外線法，高周波法など），ガス法，及び薬液法である。このような滅菌法は，容器の材質，溶剤の性質に応じて，当業者であれば適宜選択して用いることができる。

固形剤を製造する方法として，例えば，凍結乾燥法，スプレードライ（噴霧乾燥）法，及び無菌再結晶法を用いることができる。

また，本発明は，本発明の間葉系幹細胞又は培養上清を含む剤と医療用具を組み合わせたキット製品として提供することも可能である。例えば，本発明の間葉系幹細胞を含む剤を注射筒等の医療用具にあらかじめ充填したもの，１つのソフトバックに離壁を介して一方に固形剤を，他方に溶剤を充填し，使用時に離壁を開通して混合できるようにしたものなどがあげられる。このようにすることで，使用時に医療従事者が調製する負担を軽減できるだけでなく，細菌汚染や異物混入などを防止することができ，好適に使用することができる。このような注射筒やソフトバックは公知であるので，医療従事者であれば適宜使用することができる。

本発明の間葉系幹細胞又は培養上清を含む剤は，静脈内投与，動脈内投与，筋肉内投与，皮下投与，腹腔内投与，鼻腔内投与などの公知の投与方法を用いて投与することができる。投与形態の好ましい例は，注射による投与であり，点滴によって本発明の剤を注入することも可能である。また，本発明の剤は，患部や対象部位に直接注射してもよく，また外科手術により患部を開口し本発明の剤を投与することも可能である。

本発明の剤は，有効成分としての間葉系幹細胞又は培養上清が，薬学的に許容される担体又は媒体とともに調整されてもよい。薬学的に許容される担体又は媒体は，例えば，賦形剤，安定化剤，溶解補助剤，乳化剤，懸濁化剤，緩衝剤，等張化剤，抗酸化剤，又は保存剤など薬学的に許容される物質があげられる。また，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子材料やシクロデキストリン等の抱合化防物を使用することもできる。賦形剤の例は，デンプンや乳糖などそれ自体が薬理作用を有さないものである。安定化剤の例は，アルブミン,ゼラチン，ソルビトール，マンニトール，乳糖，ショ糖，トレハロース，マルトース，及びグルコースである。これらのうちでは，ショ糖又はトレハロースが好ましい。溶解補助剤の例は，エタノール，グリセリン，プロピレングリコール，及びポリエチレングリコールである。乳化剤の例は，レシチン，ステアリン酸アルミニウム，またはセスキオレイン酸ソルビタンである。懸濁化剤の例は，マクロゴール，ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），またはカルメロース（ＣＭＣ）である。等張化剤の例は，塩化ナトリウム，及びグルコースである。緩衝剤の例は，クエン酸塩，酢酸塩，ホウ酸，及びリン酸塩である。抗酸化剤の例は，アスコルビン酸，亜硫酸水素ナトリウム，及びピロ亜硫酸ナトリウムである。保存剤の例は，フェノール，チメロサール，及び塩化ベンザルコニウムである。

本発明の剤の主成分である間葉系幹細胞は，本発明の剤に有効量含まれていればよい。投与量は，投与する対象，年齢，症状などによって変化する。一般的には，１日の投与量の例は，間葉系幹細胞の数で，個体１ｋｇあたり１×１０^４〜５×１０^７細胞であり，１×１０^５〜５×１０^６細胞でもよい。本発明の剤の１日分の投与量を２〜５回に分けて投与することが好ましい。また，本発明の剤を徐放製剤として，１日当たりの投与回数を減らすことも可能である。このような徐放製剤とするには，公知の方法を利用すればよい。分けて投与したり，徐放製剤としたりすることで，生体内の薬剤濃度を一定に保ちやすくなるので，持続した薬効が得やすくなり，さらに副作用が軽減されうるので，患者への負担を減らすことができる。

本発明は，各種疾患の予防剤又は治療剤を製造するための上記した本発明の間葉系幹細胞の使用をも提供する。すなわち，先に説明したように，間葉系幹細胞を得て，得られた間葉系幹細胞を用いて，上記した各種疾患の予防剤又は治療剤を製造することができる。

本発明は各種疾患の治療方法及び予防方法をも提供する。各種疾患の治療方法は，各種疾患に罹患した患者に上記のように製造された本発明の間葉系幹細胞を有効成分として含む剤を，有効量投与する工程を含む。各種疾患の予防方法は，各種疾患に罹患するおそれのある患者に，上記のように製造された本発明の間葉系幹細胞を有効成分として含む剤を，有効量投与する工程を含む。

本発明の培養上清は，間葉系幹細胞を含んでいてもよい。培養上清が間葉系幹細胞を含む場合，間葉系幹細胞の含有量の例は，先に説明した間葉系幹細胞を含む治療剤の１／１００以上１／１以下である。培養上清の例は，遠心分離により培養上清を固液分離して得られる処理物，凍結乾燥により培養上清から水分を除去して得られる処理物，エバポレーター等を用いて培養上清を減圧濃縮して得られる処理物，限外ろ過膜等を用いて培養上清を濃縮して得られる処理物，又はフィルターを用いて培養上澄みを固液分離して得られる処理物である。また，例えば，培養上澄みを遠心分離（例えば，３０００ｒｐｍ，１０分）した後，上清をシリンジフィルター（例えば，０．４５μｍ）で濾過し，濾液を硫安（例えば，６５％飽和硫安）で分画し，沈殿物を生理食塩水で透析して培養上清を得てもよい。採取した培養上清を，そのまま用いても，また凍結保存しておき使用時に解凍して用いることもできる。また薬剤学的に許容される担体を加えて，取り扱いやすい液量，例えば０．２ｍｌ又は０．５ｍｌ等となるように希釈してもよい。

この側面の好ましい利用態様は，培養上清を有効成分として有効量含む剤である。より詳細なこの側面の好ましい利用態様は，培養上清を有効成分として有効量含む剤であって，以下の疾患の治療剤又は予防剤である剤に関する。培養上清を有効成分として含む剤は，例えば，特許第５１３９２９４号及び特許第５５２６３２０号公報に開示されるとおり公知である。したがって，本発明の培養上清を含む剤を，公知の方法を用いて製造することができる。

本発明は，各種疾患の予防剤又は治療剤を製造するための上記した本発明の培養上清の使用をも提供する。すなわち，間葉系幹細胞培養上清を得て，得られた間葉系幹細胞培養上清を用いて，上記した各種疾患の予防剤又は治療剤を製造することができる。

本発明は各種疾患の治療方法及び予防方法をも提供する。各種疾患の治療方法は，各種疾患に罹患した患者に上記のように製造された本発明の培養上清を有効成分として含む剤を，有効量投与する工程を含む。各種疾患の予防方法は，各種疾患に罹患するおそれのある患者に，上記のように製造された本発明の培養上清を有効成分として含む剤を，有効量投与する工程を含む。

間葉系幹細胞上清が滑膜細胞の増殖に与える影響の検討
まず，脂肪由来の間葉系幹細胞を，バイオミメティクスシンパシ−ズ社製の間葉系幹細胞用無血清培地（ｓｆ−ＤＯＴ培地）で３日間培養し，培養上清を得た。

リウマチ患者より採取した滑膜細胞を，９６ウェル培養プレ−トに３ｘ１０^３／ｗｅｌｌで播種した。翌日，培地を間葉系幹細胞の培養上清に交換した。また，陰性対照として，間葉系幹細胞を培養していないｓｆ−ＤＯＴ培地でも培養を行った。培地交換後，３日目にＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８（同仁科学研究所）を用いて，細胞数の測定を行った。

その結果を図１に示す。図１は，細胞数の測定結果を示すグラフである。図１から，脂肪由来の間葉系幹細胞培養上清は，リウマチ患者由来の滑膜細胞が増殖することを抑制することが示された。

間葉系幹細胞上清が滑膜細胞のシノビオリン発現に与える影響の検討
本実施例では，脂肪由来，臍帯由来及び羊膜由来の間葉系幹細胞培養上清が，リウマチ患者に由来する滑膜細胞のシノビオリン発現を抑制する活性を測定した。まず，脂肪由来の間葉系幹細胞を，ｓｆ−ＤＯＴ培地で３日間培養し，培養上清を得た。リウマチ患者より採取した滑膜細胞を，６ウェル培養プレ−トに１ｘ１０^５／ｗｅｌｌで播種した。

翌日，培地を間葉系幹細胞の培養上清に交換した。陰性対照として，間葉系幹細胞を培養していないｓｆ−ＤＯＴ培地で培養した。培養３日目に細胞を回収し，ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し，定量ＰＣＲ法によってシノビオリンの遺伝子発現を測定した。内部標準として，ＲＰＬＰ０の発現を定量し，得られた値でシノビオリン遺伝子の発現量を補正した。

その結果を図２に示す。図２は，シノビオリン遺伝子の発現量を示すグラフである。図２に示されるとおり，脂肪由来の間葉系幹細胞培養上清は，リウマチ患者由来の滑膜細胞におけるシノビオリンの遺伝子発現を抑制することが示された。

間葉系幹細胞が関節炎モデルに与える影響の検討
ＤＢＡ／１マウス（体重は２５グラム程度）を用いたコラーゲン誘発関節炎モデルに対するヒト脂肪由来間葉系幹細胞の影響を調べた。ＤＢＡ／１マウスの尾根部皮内に，アジュバンドと混合したウシＩＩ型コラーゲンを投与し，感作を行った。初回コラーゲン感作２週間後に，再度のコラーゲン感作を行い，関節炎を作製した。間葉系幹細胞は，初回のコラーゲン感作を行う２週間前から，１週間に２回の頻度で継続的に９週間にわたって，１ｘ１０^６細胞を背部の皮内に投与した。観察期間中は，後肢の厚みをノギスで測定した。

間葉系幹細胞は，実施例１において培養されたものを用いた。

図３は，コラーゲン感作前の後肢の厚みを０として，各測定時の厚みをプロットしたグラフである。図３に示すように，間葉系幹細胞投与群では，コラーゲンにより誘導される関節炎が抑制された。

間葉系幹細胞上清が様々な細胞株のシノビオリン発現に与える影響の検討
本実施例では，脂肪由来，臍帯由来及び羊膜由来の間葉系幹細胞培養上清が，一般的に研究に使用される細胞株のシノビオリン発現を抑制する活性を測定した。まず，脂肪由来の間葉系幹細胞を，ｓｆ−ＤＯＴ培地で３日間培養し，培養上清を得た。Ａ５４９，ＨＥＫ２９３およびＨｅＬａ細胞を，６ウェル培養プレ−トに１ｘ１０^５／ｗｅｌｌで播種した。

その結果を図４に示す。図４は，シノビオリン遺伝子の発現量を示すグラフである。図４に示されるとおり，脂肪由来の間葉系幹細胞培養上清は，Ａ５４９，ＨＥＫ２９３およびＨｅＬａ細胞におけるシノビオリンの遺伝子発現を抑制することが示された。

シノビオリンは，様々な医薬への応用が検討されているため，本発明は医薬産業において利用されうる。特に，本発明は，シノビオリンの発現を阻害できる。このため，シノビオリンが関与する各種疾患の治療剤や各種食品を提供できる。

Claims

間葉系幹細胞又は間葉系幹細胞の培養上清を有効成分として含み，シノビオリン遺伝子の発現又はシノビオリンタンパク質の発現を阻害するシノビオリン発現阻害剤。
間葉系幹細胞を培養し，間葉系幹細胞又は間葉系幹細胞の培養上清を得る工程と，
前記工程で得られた間葉系幹細胞又は間葉系幹細胞の培養上清を用いて，シノビオリン遺伝子の発現又はシノビオリンタンパク質の発現を阻害するシノビオリン発現阻害剤を調整する工程と，
を含む，シノビオリン発現阻害剤の製造方法。