KR20190138244A - 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 혹은 치료용 조성물 - Google Patents
편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 혹은 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 유효 성분으로 포함하는 이식편대숙주 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 다양한 면역 조절인자를 포함하여 이식된 림프구의 이주 및 면역 반응을 억제함으로써 이식편대숙주 질환의 예방 및 치료에 우수한 효과를 가진다.
본 발명에 따른 조성물은 다양한 면역 조절인자를 포함하여 이식된 림프구의 이주 및 면역 반응을 억제함으로써 이식편대숙주 질환의 예방 및 치료에 우수한 효과를 가진다.
Description
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 유효성분으로 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
이식편대숙주 질환(graft-versus-host disease, GVHD)은 동종이식 때 주입되는 공여자의 말초 혈액이나 골수내의 T-림프구를 환자의 몸에서 남의 것으로 인식하여 면역 반응이 일어나는 질환을 말한다. 즉, 수혈된 살아있는 림프구에 의해 유발되며 면역 반응으로 인해 간 기능 이상, 피부 병변, 황달, 설사, 발열, 범혈구 감소증 등의 증상이 나타나는 질환으로 심한 경우 환자가 사망할 수 있다.
이식편대숙주 질환은 숙주의 부조직복합성 항원(minor histocompatibility (mH) antigen) 또는 자가 항원(auto-antigen)에 대한 동종 반응(alloreactivity) 후 생성된 병원성 공여 T 세포에 의해 매개되는 것으로 알려져 있으며, 이러한 T 세포는 직접적인 세포용해성 공격 외에 전염증성 및 섬유성 사이토카인의 분비 또는 자가항체 생산의 촉진 등을 통해 표적 조직을 위협한다. 그러나 부신피질호르몬(corticosteroids)의 전신성 전달, 스테로이드 제제의 처방 등을 제외하고는 이러한 이식편대숙주 질환의 치료에 대해 알려진 바가 없다.
한편, 줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다.
질병의 치료 방법으로서 최근 줄기세포 및 조직공학을 이용한 이식치료법이 개발되고 있다. 하지만, 이러한 이식 치료기법으로는 치료효과가 뛰어나고 인체의 면역반응을 일으키지 않는 안정한 세포 치료제를 개발하기 어렵다는 문제가 있다. 그 동안 여러 가지 줄기세포를 이용하여 세포 치료제로써 활용하기 위한 시도들이 진행되고 있지만, 면역 조절 능력에 대한 확인은 아직 부분적으로만 진행되고 있다.
T 림프구 (T 세포) 및 B 림프구 (B 세포)는 면역 시스템에서 적응성 부분 (adaptive arm)의 핵심 세포이다. 이들 둘 다 획득된 면역성에 관여하고 이들 세포의 복잡한 상호작용은 상기 면역 반응의 완전한 범위의 작용자(effector) 및 기억 세포(memory cell)의 발현에 요구된다. T 세포는 외부 항원에 대해 특이적이고 그들의 수는 특이적 숙주 방어에 대한 반응에 있어서 크게 증가해야 한다.
T 림프구 및 B 림프구의 반응은 다중 및 복잡한 상호의존적 사건(interdependent event)에 의존하고, 면역에 있어서 T 림프구 및 B 림프구의 핵심 역할 때문에, 그들의 조절은 강화된 또는 감소된 면역을 필요로 하거나 그로부터 이득을 얻는 다양한 질환, 예를 들어, 타입 I 당뇨병, 다발성 경화증, 천식, 관절염, 중증 근무력증(myasthenia gravis), 홍반성 낭창, 건선, 대장염(colitis)을 포함하는 자가면역 질환, 또는 이식된 장기의 거부, 또는 면역 결핍 질환, 및 암을 치료하는 및/또는 예방하기 위한 주요 표적이다. 따라서, 많은 면역 질환 및 질병을 치료하고 예방하는 목적으로 상기 복합적인 T 림프구 및 B 림프구의 반응을 조절할 수 있는 면역 억제성 약물의 개발이 진행되고 있다.
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 유효 성분으로 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 이식편대숙주 질환 (Graft versus Host Disease, GVHD)을 예방 또는 치료할 수 있는 줄기세포를 이용한 치료 방안을 연구하던 중, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지가 면역 조절 인자들을 높은 수준으로 함유하고 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 조성물은 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 포함하는 이식편대숙주 질환의 예방, 개선 또는 치료제이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 유효 성분으로 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 면역 조절 인자로 예컨대 PD-L1, IL-35, Osteoprotegerin, IL-1ra 및 TSG-6로부터 선택되는 어느 하나 이상의 면역 조절 인자를 포함한다. 바람직하게, PD-L1, IL-35, TSG-6 로부터 선택되는 어느 하나 이상의 면역 조절 인자를 포함하고, 보다 바람직하게 TSG-6(tumor necrosis factor-stimulated gene 6 protein)를 높은 함량으로 포함한다. 이에 따라, 면역 세포의 이동을 저해하고, 림프구의 면역 반응을 억제하여 이식편대 숙주 질환을 약화시킨다.
본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포란 목의 안쪽과 코의 뒷부분에 위치하여 외부에서 침입하는 세균 등의 물질로부터 일차적으로 우리 몸을 방어함과 동시에 림프상피 면역조직으로 작용을 수행하는 조직인 편도에서 유래된 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 가진 미분화된 줄기세포를 의미한다.
본 발명에 있어서, "편도 유래 중간엽 줄기세포 조정 배지"는 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양하여 수득된 배양액으로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포가 제거된 배양액 또는 상층액을 의미하며, "편도 유래 중간엽 줄기세포 배양 상층액", "편도 유래 중간엽 줄기세포 조건 배양액" 또는 "편도 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지"와 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지는 편도 유래 중간엽 줄기세포가 타 유래 줄기세포와 대비하여 기원 조직인 편도의 획득이 용이하며 수술 후 버려지는 편도 조직의 재활용이 가능하고 초기 수득율이 매우 높다는 점에서 주입해야 하는 조정 배지를 용이하게 얻을 수 있고 주입 가능한 양을 타유래 줄기세포 조정배지와 대비하여 자유롭게 조절할 수 있어 큰 장점을 가진다.
본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 조정 배지를 포함하며, 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로 사용되어 이식편대숙주 질환에 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지의 투여로 이식편대숙주 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지의 투여로 이식편대숙주 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 "개선"이란 본 발명의 조성물을 개체에 투여하거나 섭취시켜 이식편대숙주 질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 이식편대숙주 질환은 예컨대 수혈 또는 이식에 의한 것이다.
상기 수혈은 전혈, 농축 적혈구, 혈소판 제제, 신선 동결 혈장 제제, 동결 침전 제제, 혈장 분획 제제, 백혈구 제거 혈액 제제, 방사선 조사 혈액 제제 등을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 이식은 줄기세포 이식; 골수 이식; 또는 장기 이식; 예컨대 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식; 또는 피부이식 등을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포는 당업계에 알려진 방법에 따라 편도로부터 추출 가능하다. 예컨대, 대한민국특허 제10-1508413호 등에 기재된 방법에 따라 편도로부터 추출가능하다.
편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양하고 세포를 제거한 후, 수득된 배양액, 배양 상층액 또는 이의 농축물이거나 이의 동결건조물일 수 있다. 보다 바람직하게 무혈청 배지에서 배양된 배양액, 배양 상층액 또는 이의 농축물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 유래 중간엽 줄기 세포를 계대 배양한 후, 무혈청 배지에서 배양하여 수득될 수 있다.
편도 유래 중간엽 줄기세포는 줄기세포 배양용 배지를 사용하여 통상적으로 배양될 수 있다. 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 조직으로부터 수득된 편도 유래 중간엽 줄기세포를 계대배양한 후, 무혈청 배지에서 계대 배양하여 수득되고, 이를 그대로 사용하거나 또는 원심분리나 필터를 이용한 여과에 의해 줄기세포 및 거대분자를 제거한 후에 수득된 상층액을 사용할 수 있다. 또한, 수득된 상층액은 그대로 사용하거나 또는 농축하여 수득된 농축물로 사용할 수 있다.
편도 유래 중간엽 줄기세포의 배양을 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
필요에 따라, 항생제, 항진균제 및 마이코플라스마 억제제 등을 포함할 수 있으며, 이들은 배지의 총 중량에 대해 1 중량%일 수 있다. 항생제는 페니실린-스트렙토마이신 등 세포 배양에서 통상적으로 사용되는 항생제를 포함하고, 항진균제는 암포테리신-B(fungizone) 등을 포함하며, 마이코플라스마 억제제는 겐타마이신, 시프로플록사신, 타일로신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 무혈청 배지는 무혈청 DMEM 배지일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도로부터 단리된 편도 조직을 잘게 자른 후, 편도 조직을 배양 플레이트의 바닥에 부착시키고, DMEM 배지 중에서 37℃ 및 5% CO2 상태의 배양기에서 배양하는 단계, 세포의 밀도가 80%의 포화상태 (confluence)에 도달했을 때, 세포를 분리하고 계대 배양시키는 단계, 세포를 3 내지 4일간 배양한 후, 인산염 완충용액으로 세척하는 단계, 세척된 세포를 혈청 및 항생제를 포함하지 않는 DMEM 배지에서, 37℃ 및 5% CO2 상태의 배양기에서 배양하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액을 원심분리나 여과시켜 세포를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로션, 연고, 동결건조제 등 다양한 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 분야의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 약학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제, 주입제 등이 바람직하다. 또한, 상기 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 및 이를 투여받을 수혜자에 대해 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제로는 이에 한정되지 않으나, 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있다. 이외에도, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife®) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.
또한, 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 투여가 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 등 외과적 투여방법 모두 가능하다. 투여량은 농축 정도에 따라 그 투여량이 달라질 수 있으나 10 μl/kg 내지 1 ml/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 5 내지 90 중량%로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 이식편대숙주 질환의 예방 및/또는 개선을 목적으로, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지, 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 본 발명에 따른 식품 조성물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 이식편대숙주 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명에 "편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지", "이식편대숙주 질환", "투여" 등의 용어는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
상기 대상체는 동물을 말하며, 전형적으로 본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 이용한 치료로 유익한 효과를 나타낼 수 있는 포유동물일 수 있다. 이러한 대상체의 바람직한 예로 인간과 같은 영장류가 포함될 수 있다. 또한 이와 같은 대상체들에는 이식편대숙주 질환의 증상을 갖거나 이와 같은 증상을 가질 위험이 있는 대상체들이 모두 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 이식편대숙주 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 이식편대숙주 질환의 치료에 사용하기 위한 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 이식편대숙주 질환의 치료를 위한 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지의 용도를 제공한다.
본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 포함하는 조성물은 이식된 림프구의 이주 및 면역 반응을 억제하여 이식편대숙주 질환의 예방 및 치료에 우수한 효과를 가진다.
도 1은 골수 유래 줄기세포의 조정 배지(BM-MSC), 지방 유래 줄기세포의 조정 배지(AT-MSC) 및 편도 유래 줄기세포의 조정 배지(Tonsil-MSC) 내에 함유된 TSG-6의 함량을 웨스턴 블랏(Western blot)으로 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 편도 유래 줄기세포의 조정 배지(T-CM)를 처리하였을 때 CCL2에 의해 유발되는 비장 세포(Splenocytes) 와 림프절 세포(LN cells)의 이동 억제를 트랜스웰 이동 분석(transwell migration assay)으로 분석한 그래프를 나타내는 도이다.
도 3은 마우스 모델에서 이식편대숙주 질환에 대한 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 치료 효과 확인 실험의 스케쥴을 나타내는 도이다.
도 4는 이식편대숙주 질환 마우스 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 투여에 의한 생존율 및 체중 증가 효과를 나타내는 도이다.
도 5는 이식편대숙주 질환 마우스 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 투여에 의한 간, 소장, 대장, 피부 조직의 회복 효과를 나타내는 도이다 (7일차).
도 6은 이식편대숙주 질환 마우스 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 투여에 의한 간, 소장, 대장, 피부 조직의 회복 효과를 나타내는 도이다 (21일차)
도 7은 이식편대숙주 질환 마우스 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 투여에 의한 간, 소장, 대장, 피부 조직에 대한 조직학적 평가를 통한 회복 효과를 나타내는 도이다.
도 8은 이식편대숙주 질환 마우스 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 투여에 의한 간, 소장, 대장, 피부 조직 별 CD4 및 CD19 발현량 변화를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 편도 유래 줄기세포의 조정 배지(T-CM)를 처리하였을 때 CCL2에 의해 유발되는 비장 세포(Splenocytes) 와 림프절 세포(LN cells)의 이동 억제를 트랜스웰 이동 분석(transwell migration assay)으로 분석한 그래프를 나타내는 도이다.
도 3은 마우스 모델에서 이식편대숙주 질환에 대한 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 치료 효과 확인 실험의 스케쥴을 나타내는 도이다.
도 4는 이식편대숙주 질환 마우스 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 투여에 의한 생존율 및 체중 증가 효과를 나타내는 도이다.
도 5는 이식편대숙주 질환 마우스 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 투여에 의한 간, 소장, 대장, 피부 조직의 회복 효과를 나타내는 도이다 (7일차).
도 6은 이식편대숙주 질환 마우스 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 투여에 의한 간, 소장, 대장, 피부 조직의 회복 효과를 나타내는 도이다 (21일차)
도 7은 이식편대숙주 질환 마우스 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 투여에 의한 간, 소장, 대장, 피부 조직에 대한 조직학적 평가를 통한 회복 효과를 나타내는 도이다.
도 8은 이식편대숙주 질환 마우스 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 투여에 의한 간, 소장, 대장, 피부 조직 별 CD4 및 CD19 발현량 변화를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예, 제조예를 제시한다. 하기의 실시예, 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 편도, 골수 및 지방 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 (conditioned medium; CM) 제조
이대목동병원 이비인후-두경부외과에서 편도적출술을 시행하는 환자의 편도조직(4-20세의 저연령층 조직)으로부터 분리된 편도 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포(세브란스 병원 세포 치료 센터 제공), 지방 유래 중간엽 줄기세포(RNL bio 제공)을 Low glucose DMEM 로 배양하였다. 100mm culture tissue plate에 confluency 70-80% 가 되었을 때, 배지를 걷어내고 세포가 접시에 붙은 상태에서 PBS 로 네 번 세척 한 후 무혈청 배지 (Low glucose DMEM) 를 첨가하였다. 48시간 후, 배지를 걷어 1300 rpm 에서 5분간 원심분리 한 후 0.2 uM filter 로 상층액을 여과시켰다. 여과된 배지는 centrifugal filtration (cut-off of 3K, Amicon Ultra-15, Millipore) 으로 20배 농축하여 실험에 이용하거나 -80°C에서 보관하였다.
<실시예 2> 조정 배지의 TSG-6의 분비량 측정
실시예 1에서 제조된 골수 중간엽 줄기세포의 조정 배지(BM-CM), 지방 중갑엽 줄기세포의 조정 배지(AT-CM) 및 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 면역 조절 적합성을 평가하기 위해, 웨스턴 블럿(Western blot)을 이용하여 각각의 조정 배지 내에 함유된 TSG-6의 분비량을 확인하였다.
TSG-6(TNFα-stimulated gene-6)은 약 30kDa의 면역 조절 단백질로, 다양한 케모카인과 결합하여 그 활성을 저해하거나, 항원 제시 세포의 활성을 억제하는 항 염증성 물질이다. 즉, 조정 배지에 TSG-6의 함량이 높은 것은 면역 조절 및 항염증 효과가 우수하다는 것을 의미할 수 있다.
상기 실시예 2에서 제조된 BM-CM, AT-CM 및 T-CM를 각각 25 μl를 10% SDS PAGE 에서 전기영동하여 단백질을 분리하고, PVDF membrane (Millipore) 에 전이시켰다.
전이된 membrane은 5% 탈지분유액에 1시간 동안 블로킹 한 후에 TBST 용액으로 3번 세척하였다. 4°C에서 16 시간 동안 일차 항체인 anti-TSG-6 antibody (D-4, mouse monoclonal, Santacruz Biotechnology)와 반응한 후, TBST 용액으로 3번 세척하고, 상온에서 1 시간 동안 2차 항체인 anti-mouse antibody와 반응시켰다.
TBS-T 로 세 번 세척한 뒤 ECL kit (Thermo scientific) 로 발색시켜 ImageQuant LAS 3000 (Fujifilm) 로 확인하였다(도 1).
그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인되는 바와 같이 T-CM가 가장 많은 양이 TSG-6를 분비하고 있음을 확인할 수 있었으며, 골수 유래, 지방 유래 중간엽 줄기세포의 경우 TSG-6을 거의 분비하지 않거나 매우 작은 양으로 발현하는 것을 확인하였다.
<실시예 3> in vitro에서 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정 배지의 화학 주성 평가
편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 면역 세포에 대한 화학 주성 억제능을 평가하기 위해, 트랜스웰 이동 분석 (transwell migration assay)를 실시하였다.
8주령의 수컷 C57BL/6 마우스에서 비장 및 림프절 세포를 분리하였다.
적헐구가 제거된 비장 세포(Splenocytes) 및 림프절 세포(LN cells)를 RPMI1640 배지(1% fatty acid-free bovine serum albumin, 2mM glutamine, and 20mM HEPES)에 부유시킨 후, 2X106 cells/100ul/well 씩 24 transwell (5uM pore; Costar)의 upper chamber 에 정치시키고, lower chamber 에는 rmCCL2 (0, 50, 100, 200 ng/ml; Peprotech)가 함유된 RPMI1640 배지 600ul를 넣었다.
편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM) 를 각 농도의 CCL2(chemokine (C-C motif) ligand 2) 와 함께 넣어주었다.
4시간 후, lower chamber 의 배지를 모아 hematoxylin 으로 염색한 후, hematocytometer 로 이주된 세포 수(Number of migrated cells)를 측정하였다(도 2).
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 확인되는 바와 같이, CCL2의 농도가 증가함에 따라 이동하는 비장 세포 및 림프절 세포수가 증가하였으나, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)를 첨가한 경우 CCL2에 의해 유도된 세포 이동이 통계적으로 유의하게 감소됨을 확인하였다(*P<0.05).
이로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포가 화학 주성 억제에 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
<실시예 4> 이식편대숙주 질환 동물 모델 제작
이식편대숙주 질환의 동물 모델의 제조를 도 3에 기재된 바와 같이 수행하였다.
8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 OrientBio(Eumsung, Korea)에서 구입하였으며, 8주령의 C57BL/6 마우스를 RIKEN BRC (BRC No, C57BL/6-Tg (CAG-EGFP) C14-Y01-FM131Osb)에서 구입하였다. 마우스를 무병균 환경에서 12 시간 Light/Dark 주기로 키웠다. 물과 음식은 자유식(ad libitum)으로 하였으며, 모든 과정은 이화여자대학교 동물관련 실험 위원회의 승인 하에 실시하였다.
BALB/c 마우스의 골수를 제거하기 위해, 복강내 주사로 하루에 1 회씩, 4 일간 부설판 (busulfan, 20mg/kg/day)를 투여하고 2 일간 하루에 1회씩 싸이클로포스파마이드 (cyclophosphamide, 100mg/kg/day)을 투여하였다.
골수 세포(BMC, 1X107 개)는 C57BL 마우스의 대퇴골과 경골에서 추출하여 단일 세포 서스펜션(suspension)으로 준비하고, 비장 세포(SPC, 1.5X107 개)는 C57BL 마우스의 비장을 분쇄하여 단일 세포 서스펜션(suspension)으로 준비하였다.
골수가 제거된 BALB/c 마우스를 3개의 실험군으로 분류하고, 준비된 골수 세포, 비장 세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)를 각각의 실험군에 투여하였다.
골수 세포(BMC)를 꼬리 정맥에 이식한 BALB/c 마우스를 정상 대조군 (Control)으로 분류하고, 골수 세포(BMC) 및 비장 세포(SPC)를 혼합하여 꼬리 정맥에 이식한 BALB/c 마우스를 GVHD 군으로 분류하고, 골수 세포, 비장세포 및 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM) 200 μl를 혼합하여 꼬리 정맥에 이식한 BALB/c 마우스를 GVHD+T-CM 군으로 분류하였다.
<실시예 5> in vivo에서 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정 배지의 이식편대숙주병 치료 효과
1. 몸무게 및 생존율 변화
이식편대숙주 질환에 대한 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 영향을 평가하기 위해, 상기 실시예 4에서 설계된 실험을 진행하는 21일 동안 각 실험군의 몸무게와 생존율을 매일 추적하였다(도 4)
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 이식편대숙주 질환이 유발된 GVHD 군의 생존율은 40% 정도였으나, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)를 추가 이식한 GVHD+T-CM 군의 생존율이 80%까지 향상되었다.
또한, 이식편대숙주 질환 유발 후 21일간의 몸무게 추적 결과, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 추가 이식한 GVHD+T-CM 군은 GVHD 군보다 몸무게를 빠르게 회복하였다.
상기 결과는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지에 의해 이식편대숙주 질환에 의해 치사되는 마우스의 수가 현저히 감소되고, 건강을 회복하는 것을 확인할 수 있다.
2. 조직병리학적 분석
이식편대숙주 질환에 대한 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 영향을 조직학적으로 분석하기 위해, 상기 실시예 4에서 설계된 실험을 진행한 후 7일과 21일째에 각 실험군의 간, 소장, 대장, 피부 조직을 적출하였다. 적출된 각 조직은 5 μm 두께의 파라핀 절편을 제작하고, 헤마톡실린과 에오신 (hematoxylin & eosin, H&E) 염색을 수행하였다.
또한 염색된 각 조직의 파라핀 절편은 하기 표 1에 기재된 평가 항목 및 기준으로 점수를 평가하였다.
[표 1]
그 결과를 도 5 내지 7에 나타내었다.
도 5 및 도 6은 각각 7일 또는 21일 차에 헤마톡실린과 에오신 (hematoxylin & eosin, H&E) 염색을 수행한 결과를 나타낸다. 이들 도면에서 확인되는 바와 같이 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지의 투여는 각 조직들의 염증 수준을 크게 억제하는 것을 보였다.
특히 이들을 수치화한 도 7에서 확인되는 바와 같이, 21 일이 지난 시점에서 이식편대숙주 질환이 유발된 GVHD 군에 비해, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)를 추가 이식한 GVHD+T-CM 군의 조직 점수가 20점 이상 크게 향상되어, 우수한 치료 효과를 확인하였다.
3. 림프구 유전자 발현
이식편대숙주 질환에 대한 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)의 영향을 유전학적으로 분석하기 위해, Quantitative real time PCR 을 이용하여 각 실험군의 는 CD4 및 CD19의 유전자 발현 수준을 측정하였다.
상기 실시예 4에서 설계된 실험 종료 후, 간, 소장, 대장, 피부 조직을 적출하고, Trizol reagent (Invitrogen) 를 사용하여 전체 RNA 를 분리하였다.
분리한 RNA 1ug에 5X Reverse transcription premix (ELPIS BIOTECH) 를 첨가하여 42°C에서 1시간동안 반응시켜 cDNA 를 합성하고, 하기 표 2의 프라이머를 이용하여 각 합성된 cDNA를 StepOnePlus real-time PCR system (Applied biosystems)에서 증폭시켜 발현량을 평가하였다.
각 발현량은 housekeeping 유전자인 gapdh의 발현량으로 normalization 하고, 발현량 차이는 2-ΔΔCT 방법을 이용하여 산출하였다.
[표 2]
그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 확인되는 바와 같이, 이식편대숙주 질환이 유발된 GVHD 군에 비해, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지(T-CM)를 추가 이식한 GVHD+T-CM 군의 각 조직(간, 소장, 대장)에서 CD4 및 CD19의 발현량이 현저하게 감소하였다(*p<0.05).
본 발명에 의하면 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정 배지는 조정 배지 내다양한 면역 조절 인자들을 포함하여 이식편대숙주질환에 있어서 생존율을 증가시켰다. 이는 림프구 면역반응을 억제하고, 화학 주성을 억제하며, 염증 반응을 조절하면서 예방, 치료 또는 개선 효과를 나타내는 것임을 확인하였다.
상기 결과들로부터 본원 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지가 이식편대숙주 질환의 예방 및 치료에 우수한 효과가 있음을 확인하였고, 골수 이식뿐 아니라 타 장기 이식에 의하 발병되는 부작용을 개선하기 위한 면역 억제제로 응용할 수 있음을 확인하였다.
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Claims (12)
- 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 유효 성분으로 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 이식편대숙주 질환은 수혈 또는 이식에 의해 유발된 것인 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 이식은 골수 이식, 줄기세포 이식 및 장기 이식으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 것인 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지는 무혈청 배지에서 배양된 배양액, 배양상층액 또는 이의 농축물인 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지는 PD-L1, IL-35, Osteoprotegerin, IL-1ra 및 TSG-6로부터 선택되는 어느 하나 이상의 면역 조절 인자를 포함하는 것인 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지는 TSG-6을 포함하는 것인 이식편대숙주 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 이식편대숙주 질환은 수혈 또는 이식에 의해 유발된 것인 이식편대숙주 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 이식은 골수 이식, 줄기세포 이식 및 장기 이식으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 것인 이식편대숙주 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지는 무혈청 배지에서 배양된 배양액, 배양상층액 또는 이의 농축물인 이식편대숙주 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지는 PD-L1, IL-35, Osteoprotegerin, IL-1ra 및 TSG-6로부터 선택되는 어느 하나 이상의 면역 조절 인자를 포함하는 것인 이식편대숙주 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지는 TSG-6을 포함하는 것인 이식편대숙주 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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