KR20170083786A

KR20170083786A - 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지를 포함하는 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20170083786A
Application number: KR1020160003094A
Authority: KR
Inventors: 조경아; 우소연; 유경하; 김유희; 박민화
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2016-01-11
Filing date: 2016-01-11
Publication date: 2017-07-19
Also published as: KR101775262B1

Abstract

본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포, 이의 조정 배지 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 PD-L1의 높은 발현 및 분비를 통해 우수한 면역 조절능을 보여 피부 염증 질환에 있어 염증 반응들을 조절함으로써 피부 염증, 특히 건선에 대한 현저한 예방 및 치료 효과를 보인다.

Description

편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지를 포함하는 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물 {A COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF SKIN INFLAMMATION DISEASE COMPRISING TONSIL-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELL OR CONDITIONED MEDIUM THEREOF}

본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지를 유효성분으로 포함하는 피부 염증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

건선(psoriasis)은 흔한 만성 면역 질환 중 하나로 대개 피부와 관절에 발현되며, 인구의 약 2%에서 나타난다. 건선의 주요 증상은 피부의 만성 병변이다. 주로 외양이 흉하게 변하고, 각질이 일어나고, 홍반성 플라크(erythematous plaques)가 생겨서 고통을 수반하거나 종종 심한 가려움증을 일으키고, 심각한 삶의 질 문제를 일으킬 수 있다. 건선은 환자의 일생 동안 심해지기도 했다가 완화되기도 하는 만성 질병으로, 치료 개시 및 중단에 의해 완화되고, 자연적 소멸은 거의 없는 질병이다. 더 심한 국소 부위 건선으로는 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 손톱 건선 및 골부착부위염(enthesitis) 등이 있다.

건선은 면역 기능 조절장애를 갖는 복합성 유전 질병이나, 유전의 메커니즘은 완전히 알려지지 않았다. 또한, 피부 외상 (Koebner's phenomenon), 감염, 및 스트레스 등을 비롯한 많은 환경적 요소들이 건선의 발병에 있어서 중요한 역할을 한다.

한편, 줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다.

치료 방법으로서 최근 줄기세포 및 조직공학을 이용한 이식치료법이 개발되고 있다. 하지만, 이러한 이식 치료 기법으로는 치료효과가 뛰어나고 인체의 면역반응을 일으키지 않는 안정한 세포 치료제를 개발하기 어렵다는 문제가 있다. 그 동안 여러 가지 줄기세포를 이용하여 세포 치료제로써 활용하기 위한 시도들이 진행되고 있지만, 면역 조절 능력에 대한 확인은 아직 부분적으로만 진행되고 있다. 또한, 최근에는 줄기세포를 직접 손상된 조직에 이식하는 방법 이외에 줄기세포의 배양액에 포함된 매개성 물질의 탁월한 측분비 효과가 생체내 또는 생체외 실험에서 입증되고 있다. 줄기세포는 인체 내에서 일생 동안 세포의 성장과 재생에 관련된 다양한 성장인자와 사이토카인 등을 분비하고, 줄기세포 배양액에는 이러한 단백질 성분들이 함유되어 있으며, 세포이식 시의 부작용인 면역거부반응을 회피할 수 있으므로, 줄기세포 배양액은 치료제로 개발하기에 유리한 장점을 가지기 때문에 관련 연구개발이 진행되고 있다.

상기와 같은 줄기세포 관련 연구를 진행하기 위해서는 줄기세포의 원활한 수급이 필요하다. 그러나, 중간엽 줄기세포 중에서도 몇몇 줄기세포는 그 이용에 있어서 세포를 얻는데 큰 제한이 있기 때문에 그 이용이 어렵다. 예를 들어, 제대혈, 지방조직으로부터 유래한 중간엽 줄기세포는 침습적인 방법을 이용해 얻어야만 한다. 가장 비침습적인 방법을 이용해 얻을 수 있는 세포는 골수채취를 통한 중간엽 줄기세포이지만, 골수채취는 마취가 필요하고 고통을 유발하여, 그 이용에 제한이 있다. 이에 대한 대안으로 환자 맞춤형 줄기세포를 분리하기 위해 말초혈액을 이용한 세포획득법 등이 요구되고 있으나 말초혈액만으로는 성인에서 분리할 수 있는 중간엽 줄기세포의 수가 너무 적고 분리방법이 경제적이지 못하며, 분리해낸다고 해도 세포치료에 사용가능한 양만큼 증식이 원활하지 않은 경우가 대부분이기에 좀 더 실용성을 높일 수 있는 대체 방안이 필요하다. 또한, 고령인 환자에서 얻는 성체 줄기세포는 낮은 연령에게서 얻는 세포들에 비해 세포능이 현저히 떨어지며 각종 인자들의 분비 및 줄기세포의 이동 능력 등이 떨어지기 때문에, 저연령의 환자로부터 자연스럽게 분리될 수 있거나 버려지는 조직으로부터 세포를 얻을 필요성이 있다. 또한, 이렇게 얻어진 세포는 실험에 용이한 양적 확보가 가능하고 세포의 계대 배양 시에 분화능이 잘 유지될 필요성이 있다.

또한, 줄기세포들은 그 유래에 따라 그 특성이 상이하다.

따라서 특정 질환에 대한 치료를 위해 질환에 따라 치료에 적합한 특성을 가지는 줄기세포를 선택하고 이의 특성을 이용하여 특정 질환에 대한 치료 방법을 개발할 필요가 있다.

대한민국 공개특허공보 제10-2014-0135263호 대한민국 공개특허공보 제10-2010-0033471호

본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 또는 이들 모두를 유효 성분으로 포함하는 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 피부 염증 질환, 특히 건선 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 적합한 종류의 줄기세포를 확인하던 중, 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 또는 이들 모두가 면역 세포의 활성을 조절하는 면역 조절 단백질인 Programmed death-ligand 1 (PD-L1)을 높게 발현할 뿐만 아니라 세포 표면 발현 형태 및 분비 형태의 발현을 보여 우수한 면역 조절능을 나타냄을 확인하고, 이로부터 피부 염증 질환, 특히 건선 관련 질환의 치료에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포란 목의 안쪽과 코의 뒷부분에 위치하여 외부에서 침입하는 세균 등의 물질로부터 일차적으로 우리 몸을 방어함과 동시에 림프상피 면역조직으로 작용을 수행하는 조직인 편도에서 유래된 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 가진 미분화된 줄기세포를 의미한다.

본 발명에 있어서, "편도 유래 중간엽 줄기세포 조정 배지"는 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양하여 수득된 배양액 자체, 또는 그로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포가 제거된 배양 상층액을 의미하며, "편도 유래 중간엽 줄기세포 배양 상층액", "편도 유래 중간엽 줄기세포 조건 배양액" 또는 "편도 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지"와 호환적으로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 피부 염증 질환이란 피부의 포괄적 염증을 의미한다. 피부 염증 질환은 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 건선 등을 포함하며, 바람직하게 건선 및 이의 관련 질환이다.

상기 건선은 면역 시스템 이상으로 발생하는 피부 또는 관절에 발생하는 염증 질환으로, 외양이 흉하게 변하고, 각질이 일어나고, 홍반성 플라크(erythematous plaques)가 생기며, 고통을 수반하는 등의 문제점을 야기한다. 위 건선은 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 손톱 건선 및 골부착부위염(enthesitis) 등의 자가 면역 질환들을 포함한다.

본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지 또는 이들 모두는 타 유래 중간엽 줄기세포와 대비하여 면역 조절 단백질, 특히 PD-L1을 높게 발현하며 높은 IFN-β 분비를 보이고 높은 Th17 세포 분화 억제 활성을 보임으로써 피부 염증 관련 인자들의 발현을 억제하고 적절한 면역 반응을 유도하여 피부 염증 질환, 특히 건선 관련 질환의 예방 및 치료에 현저한 효과를 보인다.

또한, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포는 타 유래 줄기세포와 대비하여 기원 조직인 편도의 획득이 용이하며 수술 후 버려지는 편도 조직의 재활용이 가능하고 초기 수득율이 매우 높다는 점에서 주입해야 하는 세포, 조정 배지 및 이들 모두의 양을 자유롭게 조절할 수 있다.

본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 또는 이들 모두는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포, 조직, 이의 조정 배지 및 이들 모두를 포함하며, 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로 사용되어 피부 염증 질환에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서 피부 염증 질환은 상기 언급된 바와 같다.

본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포는 당업계에 알려진 방법에 따라 편도로부터 추출 가능하다. 예컨대, 대한민국특허 제10-1508413호 등에 기재된 방법에 따라 편도로부터 추출가능하다.

편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양하고, 세포를 제거한 후 수득된 배양액, 배양 상층액 또는 이의 농축물이거나 이의 동결건조물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 유래 중간엽 줄기 세포를 혈청 배지에서 계대 배양한 후, 무혈청 배지에서 배양하여 수득될 수 있다.

편도 유래 중간엽 줄기세포는 줄기세포 배양용 배지를 사용하여 통상적으로 배양될 수 있다. 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 조직으로부터 수득된 편도 유래 중간엽 줄기세포를 혈청 배지에서 계대배양한 후, 무혈청 배지에서 계대 배양하여 수득되고, 이를 그대로 사용하거나 또는 원심분리나 필터를 이용한 여과에 의해 줄기세포 및 거대분자를 제거한 후에 수득된 상층액을 사용할 수 있다. 또한, 수득된 상층액은 그대로 사용하거나 또는 농축하여 수득된 농축물로 사용할 수 있다.

편도 유래 중간엽 줄기세포의 배양을 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.

상기 혈청 배지는 편도 유래 중간엽 줄기세포와 동일한 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 배지로서, 혈청이 보충된 DMEM 배지일 수 있다. 혈청은 우태아혈청(FBS)일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 혈청 배지의 총 중량에 대해 1 내지 10 중량%일 수 있다. 필요에 따라, 항생제, 항진균제 및 마이코플라스마 억제제 등을 포함할 수 있으며, 이들은 배지의 총 중량에 대해 1 중량%일 수 있다. 항생제는 페니실린-스트렙토마이신 등 세포 배양에서 통상적으로 사용되는 항생제를 포함하고, 항진균제는 암포테리신-B(fungizone) 등을 포함하며, 마이코플라스마 억제제는 겐타마이신, 시프로플록사신, 타일로신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 무혈청 배지 중에서의 배양은 혈청 배지에서의 배양액을 제거하고, 세포를 인산염 완충용액으로 세척한 후에 수행될 수 있다.

바람직하게, 상기 혈청 배지는 5 내지 12% 우태아혈청 및 1%의 항생제가 보충된 DMEM 배지일 수 있다.

바람직하게, 상기 무혈청 배지는 DMEM 배지일 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도로부터 단리된 편도 조직을 잘게 자른 후, 편도 조직을 배양 플레이트의 바닥에 부착시키고, 10% 우태혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지 중에서 37℃ 및 5% CO₂ 상태의 배양기에서 배양하는 단계, 세포의 밀도가 80%의 포화상태 (confluence)에 도달했을 때, 세포를 분리하고 계대 배양시키는 단계, 세포를 3 내지 4일간 배양한 후, 인산염 완충용액으로 세척하는 단계, 세척된 세포를 혈청 및 항생제를 포함하지 않는 DMEM 배지에서, 37℃ 및 5% CO₂ 상태의 배양기에서 배양하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액을 원심분리나 여과시켜 세포를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

본 발명에서 예방은 상기 조성물의 투여로 피부 염증 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 치료는 상기 조성물의 투여로 피부 염증 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 조성물은 1 ml 당 5.0×10⁶개 내지 1.0×10⁷개의 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로션, 연고, 동결건조제 등 다양한 제형으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적 분야의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 약학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제, 주입제 등이 바람직하다. 또한, 상기 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 편도 유래 중간엽 줄기세포, 이의 조정 배지 및 이를 이식받을 수혜자에 대해 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제로는 이에 한정되지 않으나, 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있다. 이외에도, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife®) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.

또한, 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하다. 투여량은 줄기세포의 경우 10⁵ 내지 10⁹세포/kg 체중, 바람직하게는 5X10⁵내지 10⁸세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 조정 배지의 경우 농축 정도에 따라 그 투여량이 달라질 수 있으나 10 μl/kg 내지 1 ml/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 PD-L1의 높은 발현 및 분비를 통해 우수한 면역 조절능을 보여 피부 염증 질환에 있어 염증 반응들을 조절함으로써 피부 염증, 특히 건선에 대한 현저한 예방 및 치료 효과를 보인다.

도 1은 편도, 지방 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포에서의 PD-L1 및 PD-L2의 세포 표면 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 편도, 지방 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포의 PD-L1 및 PD-L2 분비를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 PD-L1 자극에 따른 Th17 세포 분화 억제 활성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 PD-L1 자극에 따른 STAT3 인산화 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지 처리에 따른 미접촉 CD4+ T 세포(naive CD4+ T cells)의 분화 억제를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 편도, 지방 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포의 IFN-β 분비를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지에 의해 Th 17 분화가 억제되는 동안 T 세포에서 PD-1 발현이 증가됨을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 이미퀴모드 유도 피부 염증 모델에서의 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따른 피부 염증 억제를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 이미퀴모드 유도 피부 염증 모델에서의 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따른 피부 염증의 심각도 점수를 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 이미퀴모드 유도 피부 염증 모델에서의 비장 세포 크기 및 이의 세포 수를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 이미퀴모드 유도 피부 염증 모델에서의 건선 관련 유전자들의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 이미퀴모드 유도 피부 염증 모델의 국소 치료에 의한 비장 Th17의 비율 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 이미퀴모드 유도 피부 염증 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따른 혈액, 비장 및 dLN 세포에서의 IL-17 경감을 확인한 결과를 나타낸다.

본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예, 제조예를 제시한다. 하기의 실시예, 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 지방 세포, 골수 세포 및 편도 유래 중간엽 줄기세포의 제조

편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil-derived mesenchymal stem cell, T-MSC) 는 이대목동병원 이비인후-두경부외과에서 편도적출술을 시행하는 환자로부터 적출된 편도조직(4-20세의 저연령층 조직, 임상윤리위원회 심의 통과: ECT 11-53-02)으로부터 얻었다. 이는 대한민국 등록 특허 제10-1508413호와 같이 제조되었으며, 편도 유래 중간엽 줄기세포 (7~8 passage)는 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 하에 배양되었다.

지방 유래 중간엽 줄기세포(AT-MSC)는 RNL Bio에서 제공되는 동일 계대의 세포를 사용하였으며, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 하에 배양되었다.

골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)는 세브란스 병원 세포 치료 센터에서 제공되는 것을 구매하여 동일 계대의 세포를 사용하였으며, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM (Low-glucose) 하에 배양되었다.

< 실시예 2> 편도 유래 중간엽 줄기세포의 PD-L1 과발현 확인

편도 유래 중간엽 줄기세포의 특성을 확인하기 위하여 편도, 지방 및 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 PD-L1 및 PD-L2의 표면 발현을 유세포 분석을 통해 확인하였다.

3개의 다른 조직(골수, 지방 조직 및 편도)으로부터 유래된 중간엽 줄기세포에 대한 PD-L1 (CD274) 및 PD-L2 (CD273)의 표면 발현이 PE-conjugated 항-인간 CD274 (29E.2A3) 및 Alexa Fluor 647 conjugated 항-인간 CD273 (24F.10C12)로 각각 측정되었다. 모든 항체는 Biolegend로부터 구매되고, 각각의 시료는 FACSCalibur system (BD Bioscience)를 이용하여 FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR, USA)하에 분석되었다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 확인되는 바와 같이, 편도 유래 중간엽 줄기세포만이 PD-L1의 발현이 높게 나타나는 것이 확인되었다.

또한, PD-L1 및 PD-L2의 분비형을 확인하기 위해 위 세포 배양 조정 배지의 상층액을 모아, 이를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

편도, 골수 및 지방 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 제조하기 위해서 편도 유래 중간엽 줄기세포(7~8계대)는 100 mm 조직 배양 플레이트에 80 내지 90 % confluence로 배양되었다. 그리고 나서, 세포는 2회 PBS로 워싱되고, 배지는 조정 배지를 제조하기 위해 무혈청 DMEM 배지로 대체되었다. 배지는 48시간 배양 후에 취합되었고, 5분 간 1300 rpm에서 원심분리 후 0.2 μm 필터를 통해 여과하였다. 배양 배지는 centrifugal filter (cut-off of 3K, Amicon Ultra-15, Millipore)에 의해 원래 농도의 20배로 농축되었다. 농축된 조건 배지는 -80 ℃에 저장되었다. 음성 대조군은 상기 언급된 무혈청 배양배지를 동일 과정으로 제조하여 사용하였다.

골수, 지방 및 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 조정 배지의 동일 양으로 웨스턴 블랏을 수행하였다. 1차 항체로 PD-L1 (sc-50298, Santa Cruz Biotechnology) 및 PD-L2 (H-67, Santa Cruz Biotechnology)가 밤새 처리되었다. 1차 항체 처리가 완료된 후 2차 항체를 처리하고 발광 시약을 처리하여 단백질 발현을 확인하였다.

위 웨스턴 블랏의 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, 편도 유래 중간엽 줄기세포만이 높은 PD-L1 분비를 보이는 것이 확인되었다.

상기 도 1 및 도 2의 결과로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포가 세포 표면 및 분비의 두가지 형태로 모두 높은 PD-L1 발현을 보이는 것이 확인되었다.

< 실시예 3> PD-L1 발현에 따른 Th17 분화 억제 활성 확인

미접촉 CD4+ T 세포는 magnetic isolation (Miltenyi Biotec, GmbH, Gladbach, Germany)을 통해 마우스의 비장 및 림프절의 draining으로부터 정제되었다. 미접촉 CD4+ T 세포의 단일 세포 현탁액은 2Χ10⁵개로 96-웰 플레이트에 첨가되고 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액, 2mM L-글루타민 및 50 uM 2-머캅토에탄올을 포함하는 RPMI 배지로 배양되었다. Th17 세포로 분화를 위해 anti-CD3 antibody (2.5ug/ml), anti-CD28 antibody (5ug/ml), IL-6 (50ng/ml, Biolegend), IL-23 (20ng/ml, Biolegend), TGF-β (5ng/ml, Biolegend), 및 anti-IFN-γ blocking antibody (100ng/ml, Biolegend)로 5일간 자극되었다.

Th17 세포 분화에 있어 PD-L1이 직접적으로 분화에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 100ng/ml의 PD-L1 (Peprotech)이 분화 기간의 첫째날 및 셋째날에 첨가되었다.

anti-CD3 및 anti-CD28 항체로 자극된 T 세포는 음성 대조군과 대비되기 위해 함께 시험에 사용되었다.

상기 분화가 수행된 세포에 대한 유세포 분석 및 웨스턴 블랏이 실시예 2와 같이 수행되었다.

도 3은 Th17 분화에 대한 PD-L1의 작용을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 분화 자극에 따라 Th17 세포로 분화가 이루어졌지만(Th17 diff.), 이는 PL-L1의 처리(Th17 diff. + PD-L1)에 의해 억제되는 것이 확인되었다.

또한, 도 4는 p-STAT3의 발현 변화를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸다. 1 차 항체는 p-STAT3 (B-7, Santa Cruz Biotechnology) 및 β-actin (Sigma aldrich)이 사용되었다.

도 4의 A는 웨스턴 블랏 결과를 나타내며, B는 이를 정량화한 결과를 나타낸다. 도 4에서 확인되는 바와 같이, PD-L1의 처리(PD-L1)는 STAT3의 인산화를 직접적으로 억제한 반면, 이를 처리하지 않은 실험군(No Tx)에서는 STAT3 인산화의 억제 효과가 낮은 것으로 확인되었다.

상기 도 3 및 도 4의 결과로부터 PD-L1의 발현이 Th17 분화 억제에 효과가 있음이 확인되었다.

< 실시예 4> PD-L1을 분비하는 편도 유래중간엽 줄기세포에 의한 미접촉 CD4+ T 세포(nai ve CD4+ T cells)의 분화 억제 확인

PD-L1을 분비하는 편도 유래 중간엽 줄기세포에 의한 미접촉 CD4+ T 세포(naive CD4+ T cells)의 분화 억제를 확인하고자 유세포 분석이 수행되었다.

편도 유래 중간엽 줄기세포를 처리한 그룹의 경우, 편도 유래 중간엽 줄기세포는 2Χ10⁴개 세포로 96-웰 플레이트에 T 세포 처리 6 시간 전 처리되었다. 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정 배지 처리 그룹의 경우 상기 실시예 2에서 제조된 20 μl 조정 배지가 Th17 세포 skewing 배지에 첨가되었다. 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지로부터 PL-L1의 영향을 확인하기 위해 항-PD-L1 차단 항체(10ug/ml, 29E.2A3, Biolegend) 또는 아이소타입 항체(10ug/ml,MPC-11, Biolegend)가 각각 실험 그룹에 처리되었다.

위 실험 그룹에 대하여 CD4+IL17+ 세포 및 IFN-γ-IL17+세포의 %를 유세포 분석을 통해 확인하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5의 A는 Th17 유도를 겪은 CD4+ T 세포의 IL17을 분비하는 비율이 편도 유래 중간엽 줄기세포 처리에 따라 상당히 감소함을 보여주며, 도 5의 B는 IFN-γ의 분비가 편도 유래 중간엽 줄기세포 처리에 따라 상당히 감소함을 보여준다.

위 결과로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포가 PD-L1 분비에 의해 Th17 세포로 미접촉 CD4+ T 세포의 분화를 억제함을 확인하였다.

< 실시예 5> 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지에 의해 Th 17 분화가 억제되는 동안 T 세포에서 PD-1 발현이 증가됨을 확인

실시예 2에서 얻은 골수 및 지방 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지의 상층액 동일 양으로 웨스턴 블랏을 수행하였다. 1차 항체로 IFN-β (FL-187, Santa Cruz Biotechnology사 1차 항체 사용)가 밤새 처리되었다. 1차 항체 처리가 완료된 후 2차 항체를 처리하고 발광 시약을 처리하여 단백질 발현을 확인하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 확인되는 바와 같이, 편도 유래 중간엽 줄기세포에서만 IFN-β가 높은 비율로 분비되는 것이 확인되었다.

또한, 실시예 3과 유사하게 anti-CD3 및 anti-CD28 항체로 자극된 CD4+ T 세포에 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 처리하여 PD-L1의 세포 표면 발현을 유세포 분석을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 확인되는 바와 같이, IFN-β로 자극되는 바와 유사하게 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 처리하는 경우 PD-1 양성 세포들의 비율이 크게 증가하는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 배지 처리는 T 세포에서 PD-1의 발현을 증가시키는 것이 확인되었다.

< 실시예 6> 이미퀴모드 유도 피부 염증 모델에서의 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따른 질환 억제 효과 확인

이미퀴모드(IMQ) 유도 피부 염증 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따른 피부 염증 억제 효과를 확인하였다.

8주령 암컷 C57BL/6는 OrientBio (Emsung, Korea)로부터 구매되었다. 모든 동물은 자유식으로 12시간 주간/야간 주기로 pathogen-free 환경에서 유지되었다. 모든 절차는 이화여자대학교 동물 실험 관리 위원회의 승인 하에 수행되었다. 피부 염증을 유발하기 위하여 이미퀴모드 크림(5%, Aldara; Dong-Ah Pharmaceutical, Seoul, Korea)은 6일 동안 83 mg으로 매일 마우스에 국소 투여되었다. 활성성분의 4.15 mg이 6일간 매일 등털이 제거된 마우스에 투여되었다. 정상대조군은 대조군 비히클 크림(Vaseline Lanette cream, Fargon, The Netherlands)이 동일하게 처리되었다. 편도 유래 중간엽 줄기세포의 면역 억제 치료 요법은 이미퀴모드 처리 1일 및 3일에 꼬리 정맥을 통해 10⁶개 세포가 투여되어 테스트되었다. 대조군 마우스는 동일한 때에 동일 부피의 PBS가 정맥 투여되었다.

마우스의 등 피부 표본은 4 % 포름알데히드로 고정되었고 파라핀에 포매되었다. 5 μm 두께의 조직이 H&E 염색을 통한 분석에 사용되었다.

파라핀으로 포매된 등피부 조직은 항-마우스 케라틴 16 (RayBiotech)에 대한 항체로 4 ℃에서 밤새 처리되었다. 면역 반응성은 마우스 및 토끼 IgG (DakoCytomation, Glostrup, Denmark)에 대한 peroxidase-conjugated 이차 항체로 측정되었고 후에 헤마톡실린으로 대조 염색되었다.

그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 확인되는 바와 같이, 편도 유래 중간엽 줄기세포 처리에 따라 이미퀴모드 투여에 의한 피부 염증이 현저히 감소되었다. 즉 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따라 홍반이 감소되고, 스케일링이 감소되고, 케라틴 16(K16)이 감소되고 피부 두께가 감소됨이 확인되었다.

또한, 피부 염증의 심각도 점수가 측정되었다. 피부 염증의 심각도 점수는 임상 건선 중증도 지수에 기초하여 대상체의 피부 염증의 심각도가 측정되었다. 홍반, 스케일링, 두께가 각각 0 내지 4(0 없음, 1 약간, 2 보통, 3 상당히, 4 매우 상당히)로 측정되었다. 누적 점수는 염증의 심각도의 측정을 위해 제공되었다.

그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 확인되는 바와 같이, 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따라 피부 염증의 심각도 점수가 현저히 떨어져, 피부 염증에 대한 치료 효과가 있음이 확인되었다.

또한, 마우스를 희생하여 비장의 크기 및 이의 세포 수를 측정하여 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10의 A에서 확인되는 바와 같이 편도래 중간엽 줄기세포 처리에 따라 비장의 크기가 감소되었으며, 도 10의 B에서 확인되는 바와 같이 이의 세포수가 감소되는 것이 확인되었다. 위 결과로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따른 염증 반응 억제에 관한 효과가 확인되었다.

상기 이미퀴모드 투여에 따른 피부 염증 모델에서의 치료 효과로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지가 피부 염증, 특히 건선의 예방 및 치료에 효과가 있음이 확인되었다.

< 실시예 7> 이미퀴모드 유도 피부 염증 모델에서의 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따른 건선 관련 유전자 발현 억제 효과 확인

상기 실시예 6의 피부 염증 모델로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따른 건선 관련 유전자 발현 억제 효과를 확인하였다.

마우스 피부 조직 분석을 위해, 등 피부 조직은 TRIzol (Invitrogen)로 균질화되었다. cDNA는 제조사의 매뉴얼에 따라 First strand cDNA synthesis kit (TOYOBO)을 이용하여 제조되었고, RT-PCR이 SYBR green (TOYOBO)를 사용하여 StepOnePlus (Applied Biosystems)에서 수행되었다. 모든 유전자 발현 값은 GAPDH로 표준화되었고, 하기 서열들이 사용되었다.

그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에서 확인되는 바와 같이, 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따라 염증 관련 유전자, 특히 건선 관련 유전자들의 발현이 크게 감소되는 것이 확인되었다.

< 실시예 8> 이미퀴모드 유도 피부 염증 모델의 국소 치료에 의한 비장 Th17의 비율 증가 확인

이미퀴모드 유도 피부 염증 모델의 국소 치료에 의한 비장 Th17의 비율 증가를 확인하기 위해 유세포 분석을 수행하였다.

실시예 6에서 분리된 비장 세포를 in vitro에서 4시간 동안 PMA/Ionomycin로 자극하고, 유세포 분석을 통해 IL-17A, IFN-γ, IL-4 발현을 확인하였다.

그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에서 확인되는 바와 같이, 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따라 CD4+ IL-17+ 세포, CD4+IFN-γ+ 세포 및 CD4+IL-4+ 세포의 비율이 감소되는 것, 즉 IL-17, IFN-γ 및 IL-4를 발현하는 CD4+ 세포의 감소가 확인되었다.

< 실시예 9> 이미퀴모드 유도 피부 염증 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따른 혈액, 비장 및 dLN 세포에서의 IL-17 경감 확인

이미퀴모드 유도 피부 염증 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포 투여에 따른 혈액, 비장 및 dLN 세포에서의 IL-17 경감 확인을 위해 ELISA를 수행하였다.

이미퀴모드 처리로부터 7일째 되는 날 모든 마우스는 희생되고 혈액 시료가 circulating IL-17을 측정하기 위해 회수되었다.

또한 비장 세포 및 림프절 Draining(dLN 세포)으로부터 IL-17 분비를 측정하기 위해, 비장 세포 및 림프절 Draining은 분리되고 48시간 동안 anti CD-3 antibody (2.5ug/ml) and anti-CD28 antibody (5ug/ml)로 재자극되었다.

별도로 세포는 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조건 배지, 항-PD-L1 차단 항체 및 아이소타입 대조군 항체의 존재 또는 부재 하에 재자극되었다.

세포 상층액은 수득되었고, IL-17의 분비는 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA 키트 (436204, Biolegend)로 측정되었다.

상기 실험 결과를 도 13의 A 내지 C에 나타내었다.

도 13의 A는 혈액에서의 IL-17 분비를 확인한 결과를 나타내며, B는 비장 및 림프절 Draining(dLN 세포)에서의 IL-17 분비를 확인한 결과를 나타낸다. 이들 결과에서 확인되는 바와 같이, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 투여는 IL-17의 분비를 억제하였다.

또한 도 13의 C는 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조건 배지, 항-PD-L1 차단 항체 및 아이소타입 대조군 항체의 존재 또눈 부재 하에 재자극을 통한 실험 결과를 나타낸다. 편도 유래 중간엽 줄기세포의 투여는 IL-17의 분비를 억제하였으며, 이는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 PD-L1의 발현에 따른 것임이 확인되었다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> A COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF SKIN INFLAMMATION DISEASE COMPRISING TONSIL-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELL OR CONDITIONED MEDIUM THEREOF <130> P15-182-EWHA <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IL-17A Forward Primer <400> 1 tttaactccc ttggcgcaaa a 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IL-17A Reverse Primer <400> 2 ctttccctcc gcattgacac 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IL-22 Forward Primer <400> 3 atgagttttt cccttatggg gac 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IL-22 Reverse Primer <400> 4 gctggaagtt ggacacctca a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IL-23 Forward Primer <400> 5 atgctggatt gcagagcagt a 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IL-23 Reverse Primer <400> 6 acggggcaca ttatttttag tct 23 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TNF-a Forward Primer <400> 7 cctgtagccc acgtcgtag 19 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TNF-a Reverse Primer <400> 8 gggagtagac aaggtacaac cc 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IFN-gamma Foward Primer <400> 9 atgaacgcta cacactgcat c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IFN-gamma Reverse Primer <400> 10 ccatcctttt gccagttcct c 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse keratin 6 Forward Primer <400> 11 tggagctggt agtggctttg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse keratin 6 Reverse Primer <400> 12 aggttcaggg gtgtgaggag 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse keratin 16 Forward Primer <400> 13 ggtggcctct aacagtgatc t 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse keratin 16 Reverse Primer <400> 14 tgcatacagt atctgccttt gg 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse CCL20 Forward Primer <400> 15 gcctctcgta catacagacg c 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse CCL20 Reverse Primer <400> 16 ccagttctgc tttggatcag c 21 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse gapdh Forward Primer <400> 17 ggtaaagtgg atattgttgc catcaatg 28 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse gapdh Reverse Primer <400> 18 ggagggatct cgctcctgga agatggtg 28

Claims

편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 또는 이들 모두를 유효 성분으로 포함하는 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 피부 염증 질환은 아토피성 피부염, 접촉성 피부염 또는 건선으로부터 선택되는 어느 하나인 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 피부 염증 질환은 건선인 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 건선은 건선성 관절염, 손톱건선 또는 골부착부위염으로부터 선택되는 어느 하나인 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유효 성분은 편도 유래 중간엽 줄기세포인 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지는 무혈청 배지에서 배양된 배양액, 배양상층액 또는 이의 농축물인 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포는 PD-L1을 과발현하는 것인 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 염증 질환 예방 또는 치료는 인터페론-β 및 PD-L1의 분비에 의한 것인 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 염증 질환 예방 또는 치료는 Th17 세포 분화 억제에 의한 것인 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물