KR20220068148A

KR20220068148A - 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220068148A
Application number: KR1020210145898A
Authority: KR
Inventors: 이미연; 나득채; 김경운
Original assignee: 주식회사 온코인사이트
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2022-05-25
Also published as: WO2022108165A1

Abstract

역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따르면 상기 엑소좀은 T_h0 및 T_h17 세포에서 염증성 사이토카인인 IL-2, IL-17, IFN-γ의 생성을 유의하게 억제시키고, 염증억제성 사이토카인인 IL-10의 생성을 유의하게 증가시키며, 면역조절 T세포 (T_reg)의 활성에는 영향을 미치지 않기 때문에 자가면역 질환의 치료에 매우 우수한 효과를 나타낸다.

Description

역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀의 제조방법 및 이의 용도 {Method for manufacturing exosomes isolated from induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell and use thereof}

역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포 (mesenchymal stromal cell)는 성체조직인 골수, 흡입된 지방조직, 제대혈, 탯줄 등에서 얻을 수 있으며 섬유모세포의 형태를 갖는다. 상기 줄기세포는 시험관에서 무한정 증식이 가능하며, 혈액줄기세포와 달리 지방, 골세포, 연골세포, 심근세포, 신경세포 등 다양한 종류의 중요한 세포계열로 분화할 수 있어 조직공학과 재생의학의 영역에서 많은 연구가 이루어지고 있다.

한편,　자가면역 질환은 세균, 바이러스, 이물질 등 외부 침입자로부터 인체를 방어하는 면역세포가 스스로를 공격하는 질환이다. 자가면역 질환은 인체의 모든 장기와 조직에 나타날 수 있기 때문에, 전신의 모든 세포가 공격 대상이 되기도 하고, 특정 장기의 세포만 파괴하기도 한다. 또한, 자가면역 질환은 류마티스 관절염처럼 특정 장기 또는 전신을 선택적으로 공격하기도 한다.

자가면역 질환의 종류와 증상이 다양한 만큼 자가면역 질환은 그 치료 방법도 다양하다. 자가면역 질환의 치료 목표는 증상 완화, 기능 보존 또는 병의 발생 기전 차단이다. 이를 위한 약물은 스테로이드, 비스테로이드성 소염제, 면역 억제제 등이 있으나, 이들 약물을 장기로 복용할 경우 심각한 부작용이 유발되는 경우가 많다.

이러한 기술적 배경 하에서, 상술한 자가면역 질환 예방 및 치료에 관한 문제를 해결하기 위한 연구가 지속적으로 있어 왔으나 (대한민국 등록특허공보 제10-2111836호(2020.05.15)), 아직 이를 해결하기에는 미비한 실정이다.

일 양상은 생물학적 시료로부터 세포를 분리하는 단계; 분리된 세포로부터 역분화 줄기세포를 제조하는 단계; 제조된 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 유도하는 단계; 및 유도된 중간엽 줄기세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는 엑소좀의 제조방법을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 엑소좀의 제조방법에 의해 제조된 엑소좀을 포함하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

일 양상은 생물학적 시료로부터 세포를 분리하는 단계; 분리된 세포로부터 역분화 줄기세포를 제조하는 단계; 제조된 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 유도하는 단계; 및 유도된 중간엽 줄기세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는 엑소좀의 제조방법을 제공한다.

상기 "생물학적 시료"는 생물로부터 유래된 시료를 의미한다. 상기 생물은 인간을 포함하는 포유동물일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 신체의 조직 또는 체액으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 체액은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 혈액은 말초 혈액으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 혈액은 혈구를 포함할 수 있다. 상기 혈구는 적혈구, 백혈구 및 혈소판 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 백혈구는 호산성 백혈구, 호염기성 백혈구, 호중성 백혈구, 림프구, 단핵세포, 대식세포 등을 포함할 수 있다. 상기 생물학적 세포로부터 분리된 세포는 단핵 세포일 수 있다.

상기　"역분화 줄기세포 (induced Pluripotent Stem Cell: iPSC)"는 유도만능 줄기세포로도 지칭되며, 분화된 세포 (예를 들어, 체세포)로부터　역분화되어 얻어진 만능분화능 (pluripotency)을 갖는 세포를 의미한다. 상기 역분화 줄기세포는 각종 장기 세포로 분화할 수 있다. 상기 역분화 줄기세포는　역분화　유도인자들에 의해 분화된 세포를 재프로그램화 (reprogramming)하여 수득될 수 있다.

상기 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell: MSC)"는 수정란이 분열하여 생긴 중배엽에서 분화된 연골, 골조직, 지방조직, 골수의 기질(stroma) 등에 존재하는 줄기세포를 의미한다. 상기 중간엽 줄기세포는 시험관 내에서 뼈모세포, 지방세포, 연골세포 등으로 분화할 수 있으며, CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 c-kit, CD11b, CD19, CD14, CD34, CD45, CD14, CD79 및 HLA-DR을 발현하지 않는 것일 수 있다.

상기 "엑소좀 (exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중 인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 (대략 30 내지 200 nm) 크기의 소포체를 의미한다. 상기 엑소좀은　엑소좀　카고 (cargo)라고 불리는 단백질, 핵산 (mRNA, miRNA 등) 등을 포함할 수 있다.　상기 엑소좀　카고는 광범위한 신호전달 요소 (signaling factors)를 포함할 수 있으며, 상기 신호전달 요소는 세포 타입에 특이적이고 분비 세포의 환경에 따라 상이하게 조절될 수 있다.　상기 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 아폽토시스 (apoptosis), 괴사 (necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절할 수 있다. 상기 엑소좀은 중간엽 줄기세포로부터 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클이거나 또는 상기　엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클 (예를 들어,　엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 "유도하는 단계"는 하기 단계를 포함할 수 있다:

(a) 제조된 역분화 줄기세포를 콜라게나아제 용액과 반응시키는 단계;

(b) 상기 반응시킨 역분화 줄기세포를 원심분리하는 단계;

(c) 상기 원심분리한 역분화 줄기세포를 배지에서 현탁하는 단계; 및

(d) 상기 현탁된 역분화 줄기세포를 b-FGF로 자극하는 단계.

상기 "유도하는 단계" 상기 (a) 단계 전에 역분화 줄기세포를 PBS로 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 콜라게나아제 (collagenase)는 경단백질의 일종인 콜라겐이나 젤라틴을 가수분해할 수 있는 효소를 의미한다. 상기 콜라게나아제는 타입 1, 2, 3 및 4 중 어느 하나일 수 있다. 상기 콜라게나아제 용액은 콜라게나아제를 0.5 내지 2 mg/mL의 농도로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 콜라게나아제 용액은 콜라게나아제 타입 4 (type　IV　Collagenase)를 1 mg/mL의 농도로 포함할 수 있다. 상기 (a) 단계는 5 내지 15 분 동안 반응시키는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 (a) 단계는 제조된 역분화 줄기세포를 콜라게나아제 타입 4 용액과 10 분 동안 반응시키는 것일 수 있다.

상기 (b) 단계는 1000 내지 1200 rpm으로 원심분리하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 1100 rpm으로 원심분리하는 것일 수 있다. 상기 (b) 단계는 2 내지 4 분 동안 원심분리되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 (b) 단계는 역분화 줄기세포를 3 분 동안 원심분리하는 것일 수 있다.

상기 b-FGF (basic fibroblast growth factor)는 FGF2 또는 FGF-β로도 알려져 있으며, FGF2 유전자로 코딩되어 있는 성장인자를 의미한다. 상기 (d) 단계에서 상기 b-FGF는 0.5 내지 1.5 ng/mL로 자극하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 (d) 단계는 상기 현탁된 역분화 줄기세포를 1 ng/mL의 b-FGF로 자극하는 것일 수 있다.

상기 "유도하는 단계"는 b-FGF로 자극하는 단계 후 재조합 인간 (recombinant human) TGF-β로 자극하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 인간 TGF-β는 rh TGF-β라고도 지칭하며, rh TGF-β1, rh TGF-β2 또는 rh TGF-β3일 수 있다.

상기 "엑소좀을 분리하는 단계"는 하기 단계를 포함하는 것일 수 있다:

(a) 유도된 중간엽 줄기세포를 배지에서 36 내지 60 시간 동안 배양하는 단계;

(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포 배양액을 0 내지 5℃에서 200 내지 400 g로 5 내지 15 분 동안 원심분리하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 원심분리된 배양액의 상층액을 0 내지 5℃에서 1500 내지 2500 g로 15 내지 30 분 동안 원심분리하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 원심분리된 배양액의 상층액을 0 내지 5℃에서 8,000 내지 12,000 g로 20 내지 40 분 동안 원심분리하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계에서 원심분리된 배양액의 상층액을 여과지로 필터링하는 단계; 및

(f) 상기 (e) 단계에서 필터링된 배양액을 80,000 내지 120,000 g에서 100 내지 140 분 동안 원심분리하는 단계.

상기 (a) 단계는 48 시간 동안 배양되는 것일 수 있다.

상기 "배지"는 시험관 내 (in vitro)에서 세포의 성장과 생존 및 증식에 필요한 필수성분을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium), Knockout DMEM, E8 (Essential 8 Medium), SF-DMEM (serum free-Dulbecco Modified Eagle Medium) 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배지는 α-Minimum Eagle’s Medium일 수 있다. 상기 α-Minimum Eagle’s Medium은 α-MEM이라고도 하며, MEM의 성분에 아미노산 비타민 등이 추가로 첨가되어 있는 배지를 의미한다. 구체적으로, 상기 α-MEM은 비필수 아미노산, 글루타민, 2-머캡토에탄올을 포함할 수 있다. 또한, 상기 α-MEM은 페니실린, 스트렙토마이신 등의 항생제를 포함할 수 있다. 상기 비필수 아미노산은 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 히스티틴 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 의미하는 것일 수 있다.

상기 "원심분리"는 당업계에 알려진 바에 따라 목적에 맞게 임의의 속도 및 온도로 임의의 시간 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 원심분리는 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g, 700 g, 800 g, 900 g, 1000 g, 2000 g, 3000 g, 4000 g, 5000 g, 6000 g, 7000 g, 8000 g, 9000 g, 10000 g, 20000 g, 30000 g, 40000 g, 50000 g, 60000 g, 70000 g, 80000 g, 90000 g, 100000 g, 200 내지 400 g, 250 내지 350 g, 1500 내지 2500 g, 1800 내지 2200 g, 1900 g 내지 2100 g, 8,000 내지 12,000 g, 9,000 내지 11,000 g, 또는 80,000 내지 120,000 g, 90,000 내지 110,000 g의 속도로 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 원심분리는 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 60 분, 120 분, 180 분, 240 분, 1 내지 5 분, 5 내지 10 분, 1 내지 10 분, 5 내지 15 분, 10 내지 20 분, 15 내지 20 분, 15 내지 30 분, 20 내지 30 분, 20 내지 40 분, 25분 내지 35 분, 20 내지 60 분, 20 내지 80 분, 20 내지 100 분, 80 내지 160 분, 100 내지 140 분, 110 내지 130 분 동안 수행될 수 있다. 상기 원심분리는 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 40℃, 50℃, 0 내지 5℃, 0 내지 10℃, 0 내지 20℃ 또는 0 내지 30℃에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 여과지는 0.22 ㎛의 포어 사이즈를 가질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

다른 양상은 상기 제조방법에 의해 제조된 엑소좀을 포함하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 용어 엑소좀 등에 대해서는 상술한 바와 같다.

상기 "예방"은 상기 비만 또는 자가면역 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 상기 "치료"는 상기 자가면역 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

상기 "자가면역　질환 (autoimmune disease)"은 면역 기능에 이상이 발생하여, 면역세포들이 신체의 장기나 조직을 공격하여 발생하는　질환을 말한다. 상기 자가면역　질환은 장기 특이적 자가항체와 관련된　질환과 장기 비특이적 (전신적)　질환으로 구별될 수 있다. 상기 자가면역　질환은 혈구탐식성 림프조직구증 (Hemophagocytic lymphohistiocytosis), 전신 홍반 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 기쿠치 (Kikuchi) 병, 혈관염 (vasculitis), 성인 스틸 병 (Adult onset Still's disease), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis),　염증성　근육염 (Inflammatory Myositis), 베체트 병 (Behcet disease), IgG4-연관성　질환, 쇼그렌 증후군 (Sjogren syndrome), 거대세포 동맥염 (Giant cell arteritis), 측두 동맥염 (Temporal arteritis), 제1형 당뇨병, 아토피 피부염, 크론병 (Crohn's disease), 전신성 경화증 (systemic sclerosis), 건선, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 및 그레이브스 갑상선 항진증 (Graves hyperthyroidism)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 임의의 제제로 개체에 제공될 수 있다. 상기 제제는 경구용 또는 비경구용 제제일 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구 투여를 위한 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제일 수 있다. 상기 고형 제제는 부형제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 또는 젤라틴일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 마그네슘 스테아레이트, 또는 탈크와 같은 윤활제를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 또는 시럽제일 수 있다. 상기 액상 제제는 물, 또는 리퀴드 파라핀을 포함할 수 있다. 상기 액상 제제는 습윤제, 감미제, 방향제, 또는 보존제를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 또는 좌제일 수 있다. 비수성용제 또는 현탁제는 식물성 기름 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 식물성 기름은 예를 들면, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 또는 올리브 오일일 수 있다. 에스테르는 예를 들면 에틸올레이트이다. 좌제의 기제는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 또는 글리세로젤라틴일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 상기 엑소좀을 약학적으로 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 유효한 양은 상기 약학적 조성물이 상기 엑소좀을 약 1 ㎍ 이상, 약 2 ㎍ 이상, 약 5 ㎍ 이상, 약 10 ㎍ 이상, 약 20 ㎍ 이상, 약 50 ㎍ 이상, 약 100 ㎍ 이상, 약 200 ㎍ 이상, 약 400 ㎍ 이상, 약 1 mg 이상, 약 2 mg 이상, 약 4 mg 이상, 약 10 mg 이상, 약 20 mg 이상, 약 40 mg 이상, 약 100 mg 이상, 약 1 ㎍ 내지 1 mg, 약 10 ㎍ 내지 1 mg, 약 1 내지 100 ㎍, 약 10 내지 100 ㎍, 약 10 내지 200 ㎍, 또는 약 10 내지 500 ㎍으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 유효한 양은 상기 엑소좀이 상기 약학적 조성물 0.01 mL, 0.1 mL, 1 mL, 10 mL 또는 100 mL 당 포함되어 있는 양을 의미하는 것일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 예를 들어 피하, 정맥내 또는 근육내로 주사제 제형으로 투여될 수 있다. 또한 상기 약학적 조성물은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있고, 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 함께 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 5 ㎎/kg, 약 1 ㎎/kg 내지 약 5 ㎎/kg, 또는 약 1 ㎎/kg 내지 약 3 ㎎/kg의 범위내일 수 있다. 상기 투여는 1 일 1 회, 1 일 2 회, 1 일 3 회, 1 일 4 회, 1 주일에 1 회, 2 주일에 1 회, 3 주일에 1 회, 4 주일에 1 회, 1 달에 1 회, 3 달에 1회 또는 1 년에 1 회 투여될 수 있다.

일 양상에 따른 제조방법에 따라 제조된 엑소좀을 포함하는 약학적 조성물은 T_h0 및 T_h17 세포에서 염증성 사이토카인인 IL-2, IL-17, IFN-γ의 생성을 유의하게 억제시키고, 염증억제성 사이토카인인 IL-10의 생성을 유의하게 증가시키며, 면역조절 T세포 (T_reg)의 활성에는 영향을 미치지 않기 때문에 자가면역 질환의 치료에 매우 우수한 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 모양 및 마커를 분석한 도면이다. (a)는 면역형광(Immunofluorescence)에 의해 확인된 역분화줄기세포 (iPSC)의 마커인 NANOG, SSEA-4, TRA-181발현을 보여주고, (b)는 역분화줄기세포 (iPSC) 유래 중간엽 줄기세포 (iPSC-iMSC)의 분화단계별 세포 형태를 관찰한 결과를 보여주며, (c)는 역분화줄기세포 (iPSC) 유래 중간엽 줄기세포 (hiPSC-MSCs)에서 MSC의 마커로 보고되어 있는 CD34, CD31, CD19, CD11, HALDR (Negative marker), CD44, CD73, CD105, CD90 (Positive marker)의 발현을 확인한 결과를 보여준다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포으로부터 분리된 엑소좀의 물리적 특성 및 마커를 분석한 도면이다. (a)는 역분화줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀 (iPSC-iMSC-Exo)의 분리후 NANOSIGHT 기기를 이용하여 측정된 엑소좀의 크기 분포를 보여주고, (b)는 투과전자현미경 (Transmission electron microscopy, TEM)을 이용하여 확인된 역분화줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀(iPSC-iMSC-Exo)의 형태를 보여주며, (c)는 역분화줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀(iPSC-iMSC-Exo)에서 웨스턴 블롯팅에 의해 확인된 엑소좀의 마커로 보고되어 있는 TGS101, CD9, CD63 (Positive marker)의 발현을 보여준다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀의 T_h0 세포에 대한 면역 조절능을 확인한 결과를 보여준다. (a)는 Th0 세포 분화 조건에서 배양된 단핵구 세포를 역분화줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀 (iPSC-iMSC-Exo)과 공배양한 후 Th0 세포에서 생성되는 IL-17, IFN-g 및 면역조절T세포 (Treg)에서 생성되는 마커인 CD25+Foxp3+ 발현을 FACS로 분석한 결과이고, (b)는 FACS 결과를 도시한 그래프이며, (c)는 ELISA로 확인된 배양액 중 IL-17, IFN-g 및 IL-10을 보여준다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀(iPSC-iMSC-Exo)의 T_h17 세포에 대한 면역 조절능을 확인한 결과를 보여준다. (a)는 Th17 세포 분화 조건에서 배양된 단핵구 세포를 역분화줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀 (iPSC-iMSC-Exo)과 공배양한 후 Th17세포에서 생성되는 IL-17, IFN-g 및 면역조절T세포 (Treg)에서 생성되는 마커인 CD25+Foxp3+ 발현을 FACS로 분석한 결과이고, (b)는 FACS 결과를 도시한 그래프이며, (c)는 ELISA로 확인된 배양액 중 IL-17, IL-10, 및 IL-2를 보여준다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀과 중간엽 줄기세포 엑소좀의 관절염 동물 모델에서 질환 제어 효능을 비교한 결과를 보여준다. (a) 류마티스 관절염 동물 모델의 유도에서 각각 역분화줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀(iPSC-iMSC-Exo) 및 중간엽 줄기세포 엑소좀(MSC-Exo)을 투여한 그룹의 관절염 평가 지수를 보여주고, (b)는 FACS에 의해 확인된 류마티스 관절염 동물 모델의 비장세포 내 CD4+T 세포내 사이토카인 (CD4+IL-17A+, CD4+IL-10 등)의 변화를 보여주며, (c)는 류마티스 관절염 동물 모델의 H&E, 톨루이딘 블루, 및 사프라닌 O 염색에 의한 조직학적 평가 결과를 보여주고, (d)는 각 그룹에서 계산된 염증지수 (inflammation score) 및 연골 미란 점수 (Cartilage damage score)를 통해 보여준다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀의 농도에 따른 관절염 동물모델에서 질환 제어 효능을 확인한 결과를 보여준다. (a)는 류마티스 관절염 동물 모델의 유도에서 각각 역분화줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀(iPSC-iMSC-Exo)을 농도별로 투여한 그룹의 관절염 평가 지수를 보여주고, (b) FACS에 의해 확인된 류마티스 관절염 동물 모델의 비장세포 내 CD4+T 세포내 사이토카인 (CD4+IL-17A+, CD4+IL-10 등)의 변화를 보여주며, (c)는 류마티스 관절염 동물 모델의 H&E, 톨루이딘 블루, 및 사프라닌 O 염색에 의한 조직학적 평가 결과를 보여주고, (d)는 각 그룹에서 계산된 염증지수 및 연골 미란 점수를 통해 보여준다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 정상인의 말초혈액 단핵세포로부터 역분화 줄기세포 (induced Pluripotent Stem Cells: iPSC) 제조

기관 IRB를 승인받아 질환이 없는 정상인 기부자로부터 혈액을 수득하여 사용하였다. 단핵 세포를 분리하기 위하여 혈액을 2,000 rpm으로 30 분간 Ficoll Paque-PLUS (GE Healthcare)를 사용하여 원심분리하였다. 분리된 단핵 세포를 StemSpan cc110이 보충된 StemSpan-ACF (Stem Cell Technologies)에서 4일 동안 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 배양시켰다. 그 후, 비트로넥틴 (vitronectin) (Life Technologies, Invitrogen)이 코팅된 24-웰 플레이트에 배양된 단핵 세포를 접종하고, 제조사의 설명서에 따라 CytoTune®-iPS 2.0 Reprogramming 키트(Life Technologies, Invitrogen)의 센다이 바이러스 (Sendai virus)를 이용하여 역분화 줄기세포 (iPSC)를 제조하였다. 구체적으로, 형질 도입 후 3 일부터 21 일까지 세포를 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 배양하고, 12일 차에 신생 iPSC 콜로니를 개별적으로 골라 특성화(characterization)를 위해 확장시켰다. iPSC 콜로니가 형성될 때까지 배지를 매일 교체하였다. 수동으로 iPSC 콜로니를 피킹한 후, 비트로넥틴으로 코팅된 플레이트 중 TeSR-E8 배지 (Stem Cell Technologies)에서 배양하였다. 배양된 세포를 역분화줄기세포(iPSC)의 마커인 NANOG, SSEA-4, 및 TRA-181 발현에 대해 유동세포분석법(flow cytometry)으로 분석하여 역분화줄기세포로 확인하였다.

실시예 2. 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell) (iPSC-iMSC)의 제조 및 확인

2-1. 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 제조

실시예 1에서 제조된 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 유도하기 위해, 플레이트에서 90% 합류(90% confluency)까지 배양된 역분화 줄기세포를 PBS(1 x Phosphate buffered saline)로 1회 세척하였다. 그 후, 플레이트에 1 mg/mL　type　IV　Collagenase 용액을 3 mL 넣고 10분 동안 반응시켰다. TeSR-E8 배지 (Stem Cell Technologies)를 6 mL 첨가한 후 1100 rpm으로 3분 동안 원심분리하였다. 6-웰 ultra　low　attachment　디쉬(직경 100 mm)에 1 디쉬 당 2 웰 3 mL 배양액 20 % α-Minimum Eagle’s Medium (0.1 mM 비필수 아미노산 (100x) gibco, 1 mM L-글루타민, 0.1 mM 2-머캡토에탄올, 1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신)으로 세포를 현탁한 후 b-FGF 1 ng/mL의 존재 하에 4일간 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 배양하여 분화를 유도하였다.

분화 4 일 후, 배아체 (embryoid body: EB) 증식 (outgrowth)을 위해 1 % 젤라틴이 코팅된 100 mm 디쉬에 재조합 인간 (recombinant human: rh) TGF-β1로 자극하였다. 동일한 방법으로 격일마다 배양액을 교체하면서 젤라틴이 코팅된 100 mm 디쉬에서 90% 합류(90% confluency)까지 iPSC-MSC를 배양하였다.

2-2. 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 마커 확인

실시예 2-1에서 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPSC-MSC)가 제조되었는지 마커를 통해 확인하였다.

구체적으로, 역분화 줄기세포의 마커인 NANOG, SSEA-4 및 TRA-181 발현을 면역형광 방법으로 확인하고, 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 분화 단계별로 세포 모양을 확인하였다. 또한, iPSC-MSC에 대해 MSC 마커로 알려져 있는 CD34, CD31, CD19, CD11 및 HALDR (음성 마커), 및 CD44, CD73, CD105 및 CD90 (양성 마커)의 발현 여부를 조사하였다. iPSC-MSC를 4주 정도 배양한 후 passage 5 이상인 세포에서 유세포 분석기로 확인하였다.

그 결과, 도 1의 (a)에 나타낸 바와 같이, 실시예 2-1에서 사용된 역분화 줄기세포는 NANOG, SSEA-4 및 TRA-181을 발현함을 확인하였고, 도 1의 (b)에 표시된 바와 같이, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로 분화되는 것을 세포 모양을 통해 확인하였다.

도 1의 (c)는 유세포 분석기로 확인된 iPSC-MSC에 의한 MSC 마커의 발현을 보여준다. 실시예 2-1에서 제조된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 MSC의 음성 마커인 CD34, CD31, CD19, CD11 및 HALDR을 동형 대조군 (isotype control)과 유사한 양으로 발현하였으나, 양성 마커인 CD44, CD73, CD105 및 CD90는 모두 동형 대조군 대비 유의하게 많은 양을 발현하여, 실시예 2-1에서 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포가 형성되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 중간엽 줄기세포 엑소좀 (MSC-Exo) 및 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 엑소좀 (iPSC-MSC-Exo) 분리 및 확인

3-1. 중간엽 줄기세포 엑소좀 및 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포으로부터 엑소좀 분리

제대혈 유래 MSC 및 iPSC-MSC를 각각 100 mm 디쉬에서 100% 합류까지 배양한 상태로 SF-DMEM (serum free-Dulbecco Modified Eagle Medium) 5 mL를 첨가하여 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양액을 4℃ 및 300 g 조건으로 10분 동안 원심분리하였다. 수득된 상층액을 다시 4℃ 및 2000 g 조건으로 20분 동안 원심분리하였다. 수득된 상층액을 고속 원심분리기 (Hitachi KoKi #S306352A, Japan)로 10,000 g 조건에서 30 분 동안 원심분리시켜 세포 파쇄물 (cell debris)을 제거하였다. 상층액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시킨 후 초고속 원심분리기 (Thermo Scientific Fiberlite F50L-8x39 Rotor, Thermo Fisher Scientific)에서 100,000 g 조건으로 120분 동안 원심분리하였다. 원심분리기로부터 튜브를 꺼내면서 엑소좀이 있는 위치인 펠렛 부분을 미리 표시한 후, 펠렛을 제외한 나머지를 반대편으로 모두 제거하고, 남은 펠렛을 PBS로 현탁하여 사용하기 전까지 -80℃로 보관하였다.

3-2. 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀 (iPSC-iMSC-Exo)의 특성 및 마커 확인

분리된 엑소좀의 크기 및 균일한 입자 분포 여부를 확인하기 위해, 실시예 3-1에 의해 분리된 엑소좀을 PBS에 희석하여 NanoSight (Malvern instruments Ltd, Malvern, UK) 기기로 6 회 연속 측정하였다. 또한, 분리된 엑소좀을 투과 전자 현미경 (TEM)으로 촬영하였다. 이어서, 분리된 것이 엑소좀이 맞는지 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 방법을 이용하여 엑소좀 마커로 알려진 TSG101 (Santa Cruz Biotechnology), CD9 (Santa Cruz Biotechnology) 및 CD63 (Santa Cruz Biotechnology)를 확인하였다.

그 결과, 도 2의 (a)에 나타낸 바와 같이, 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 물질의 크기가 NanoSight에 의해 엑소좀의 크기로 알려진 100 내지 200 nm임을 확인하여, 상기 물질이 엑소좀 (iPSC-iMSC-Exo)임을 알 수 있었다. 도 2의 (b)는 투과 전자 현미경을 이용하여 엑소좀을 확인한 결과를 보여준다.

또한, 도 2의 (c)는 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포에서 분리된 엑소좀 (hiPSC-MSCs-Exo)이 대조군(Control: SF-DMEM 배지) 및 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 그 자체 (hiPSC-MSC)보다 엑소좀의 마커로 알려진 TSG101, CD9 및 CD63를 유의하게 많이 발현한다는 것을 확인한 것이다. 이를 통해 실시예 3-1에서 분리된 물질이 엑소좀 (iPSC-iMSC-Exo)임을 알 수 있었다.

실시예 4. T _h 0 세포에서 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 (iPSC-MSC-Exo)의 면역 조절능 확인

실시예 3에서 수득된 iPSC-MSC-Exo의 면역 조절능을 각각 확인하였다.

정상인의 말초혈액으로부터 수득된 단핵 세포를 하기와 같이 T_h0 세포로 분화시켰다. 구체적으로, T_h0 세포로 분화시킬 단핵 세포를 10% 소 태아 혈청 (fetal calf serum: FCS), 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지에 접종하고, 항-CD3 (1 ㎍/mL; BD Biosciences) 및 항-CD28 (1 ㎍/mL; BD Biosciences)로 처리하고 실시예 3에서 제조된 iPSC-iMSC-Exo(0, 0.1, 1, 및 10 ㎍)와 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 48 시간 동안 공배양시켰다. 그 후, FACS를 이용하여 T_h0 세포에서 생성되는 염증유도성 사이토카인인 IL-17 및 IFN-γ, 및 면역조절 T 세포 (T_reg)의 마커인 CD25+Foxp3+ 발현을 조사하였다. 또한, 각 배양액에서 염증유도성 사이토카인 IL-17 및 염증억제성 사이토카인 IL-10의 함량을 분석하였다. 구체적으로, FACS 및 샌드위치 (sandwich) ELISA를 이용하여 사이토카인 함량 및 마커 발현을 분석하였다.

FACS를 위해 단일 클론 항체 항-CD4-PE/Cy7 (RPA-T4, IgG1, BioLegend, San Diego, CA, USA) 및 항-CD25-APC (M-A251, IgG1, κ 이소형, BD Biosciences)를 이용하고, 세포 내 염색법으로 세포를 세척한 다음, 투과성으로 만들고 단일 클론 항체 항-IL-17-PE (eBio64dec17, IgG1, κ; eBioscience, San Diego, CA, USA), 항-IFN-γ-FITC (4S.B3, IgG1, κ; eBioscience), 항-IL-10-APC (JES3-19F1, IgG2a, κ; Biolegend), 및 항-Foxp3-FITC (PCH101, IgG2a, κ; eBioscience) 항체와 함께 암실 상태로 4℃에서 30분간 인큐베이션시켰다. 또한, 대조군은 같은 종류의 형광이 표지되고 항원 특이성이 없는 동종의 면역글로불린을 동형 항체로 염색하였다. 유세포 분석기(FACS Calibur; Becton Dickinson, San Diego, CA)로 세포 내 사이토카인을 분석하였다.

또한, 샌드위치 ELISA를 위해 먼저 샌드위치 ELISA용 96 웰 플레이트 (NUNC, Denmark)에 단일 클론성 IL-17, IFN-γ, IL-10 및 IL-2 항체(R&D systems, USA)를 각각 4 ㎍/mL로 웰당 50 ㎕ 넣고 4℃에서 밤새 반응시킨 다음, 차단 용액 (1% (w/v) BSA/PBS (Phosphate-Buffered Saline) 및 0.05% (v/v) tween 20/PBS)을 웰당 200 ㎕ 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 대조군으로는 재조합 IL-17, IFN-γ, IL-10 및 IL-2 (R&D, USA)를 이용하여 각각 78 pg/mL, 156 pg/mL, 312 pg/mL, 625 pg/mL, 1250 pg/mL, 2500 pg/mL, 5000 pg/mL 농도를 측정하였다.

표준 시료와 함께 측정할 엑소좀과 공배양하여 수득된 T_h0 세포 배양액을 웰당 50 ㎕ 첨가하고 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 용기를 세척용액 (0.05% (v/v) Tween 20/PBS)으로 4 회 세척하고 비오티닐화된 (biotinylated) IL-17, IFN-γ, IL-10 및 IL-2 항체를 200 ng/mL로 희석하여 웰당 50 ㎕ 첨가한 후, 실온에서 2 시간 동안 반응시키고 세척 용액으로 4 회 세척하였다.

마지막으로, 엑스트라비딘-알칼라인 포스파타아제 컨쥬게이트 (Extravidin-Alkaline phosphatase conjugate) (SIGMA, USA, #E2636)를 1：2,000으로 희석하여 웰당 50 ㎕ 첨가하고 실온에서 2 시간 반응시킨 후 세척하고, 포스페이트 디소듐염 헥사하이드레이트 (phosphate disodium salt hexahydrate) (PNPP, Fluka)/디에탄올아민 (Diethanolamine) 용액 (DEA, 97 mL, NaN₃ 0.2 g, MgCl_2ㆍH₂O 0.1 g, 1차 증류수 800 mL)을 1 mg/mL 농도로 용해하여 웰당 50 ㎕ 첨가하고 30 분 후, 0.2 M NaOH로 반응을 멈춘 뒤 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과가 도 3에 도시된다. 도 3의 (a) 및 (b)는 각각 T_h0 세포에서 생성된 IL-17 및 IFN-γ의 양과 면역조절 T 세포(Treg)에서 생성되는 CD25+Foxp3+ 발현을 FACS로 분석한 결과를 나타내고, 도 3의 (c)는 배양액 중 IL-17, IFN-γ 및 IL-10을 ELISA로 측정한 결과를 나타낸다. 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀 (iPSC-iMSC-Exo)은 염증성 사이토카인인 IL-17 및 IFN-γ의 생성을 억제하는 반면 면역조절 T세포 (T_reg)의 활성에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 또한, iPSC-iMSC-Exo는 세포 배양액에서 염증유도성 사이토카인인 IL-17 및 IFN-γ의 생성을 억제시키는 반면 염증억제성 사이토카인인 IL-10의 생성을 더욱 증가시킴을 확인하였다.

실시예 5. T _h 17 세포에서 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 (iPSC-iMSC-Exo)의 면역 조절능 확인

실시예 3에서 수득된 iPSC-iMSC-Exo 및 MSC-Exo의 면역 조절능을 각각 확인하였다. 구체적으로, 정상인의 말초혈액으로부터 수득된 단핵 세포를 T_h17 세포로 분화시키기 위해, 항-CD3 (1 ㎍/mL; BD Biosciences), 항-CD28 (1 ㎍/mL; BD Biosciences), IL-1β (20 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), IL-6 (20 ng/mL; R&D Systems), IL-23 (20 ng/mL; R&D Systems), IFN-γ에 대한 중화 항체 (IFN-γ; 2 ㎍/mL; R&D Systems) 및 IL-4에 대한 중화항체 (2 ㎍/mL; R&D Systems)로 처리하고, T_h0 세포 대신 T_h17를 이용한 것 외에는 실시예 4와 동일하게 실험을 수행하였다.

그 결과가 도 4에 도시된다. 도 4의 (a) 및 (b)는 각각 Th17 세포에서 생성된 IL-17 및 면역조절 T 세포(Treg)에서 생성되는 CD25+Foxp3+ 발현을 FACS로 분석한 결과를 나타내고, 도 4의 (c)는 배양액 중 IL-17, IL-10, 및 IL-2를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸다. 역분화줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀 (iPSC-iMSC-Exo)은 염증유도성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하는 반면, 면역조절 T세포 (T_reg)의 활성에는 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다. 또한, iPSC-iMSC-Exo는 세포 배양액에서 염증유도성 사이토카인인 IL-17 및 IL-2의 생성을 감소시키고 염증억제성 사이토카인인 IL-10의 생성을 더욱 증가시킴을 알 수 있었다.

실시예 6. 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 (iPSC-iMSC-Exo)과 중간엽 줄기세포 엑소좀 (MSC-Exo)의 류마티스 관절염 동물 모델 질환 제어 효과 비교

6-1. 평균 관절 지수를 통한 류마티스 관절염 치료 효과 확인

실시예 3에서 수득된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀(iPSC-iMSC-Exo)이 류마티스 관절염에 효과를 나타내는지 확인하기 위해 동물 모델 실험을 수행하였다.

구체적으로, 류마티스 관절염 동물 모델(Collagen induced arthritis: CIA)을 제조하기 위해, 6 내지 7 주령인 수컷 DBA/1J 마우스에 CII(type II collagen) 100 ㎍을 CFA(Complete Freund's Adjuvant)와 1:1 비율로 혼합하여 꼬리에 피하주사하였다(1차 부스팅). 2주 후 CII 100 ㎍을 IFA(Incomplete Freund's Adjuvant)와 1:1 비율로 혼합하여 뒷다리 족근골에 피하주사하여(2차 부스팅) 류마티스 관절염을 유도하였다. 류마티스 관절염 동물 모델을 4개의 그룹, CIA 대조군(n=4), iPSC-iMSC-Exo(50 ㎍)(n=4), iPSC-iMSC-Exo(100 ㎍)(n=4) 및 MSC-Exo(100 ㎍)(n=4)로 나누고, 그룹별로 iPSC-iMSC-Exo 또는 MSC-Exo를 1차 부스팅 1일 전 및 2차 부스팅 일에 투여하여 총 2회 투여하고, 그룹별 질환 발달 차이를 확인하였다. 질환 발달의 정도는 하기의 류마티스 관절염 평가를 통해 확인하였다.

류마티스 관절염 평가는 Rosoliniec 등에 의한 평균 관절 점수 (mean arthritic score) (Coligan JE, Kruisbeek AM, Matqulies DH, Shevach EM, Strober W: Collagen-induced arthritis. Current protocols in immunology vol 3;15.5.1-19, 1996)에 기초하였다. 구체적으로, 각 마우스에 대해 아래의 척도에 따라 매긴 점수(Arthritis score)를 합하여 3으로 나눈 평균치를 얻고, 다시 각 마우스에서 3 명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용한다.

<평가 기준>

0점: 부종이나 종창이 없음.

1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경미한 부종과 발적이 있음

2점: 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경미한 부종과 발적이 있음

3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적이 있음

4점: 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있음

도 5의 (a) 및 도 6의 (a)에 도시된 바와 같이, 엑소좀을 투여하지 않은 대조군(CIA control) 및 iPSC-iMSC-Exo 투여군에서 MSC-Exo 투여군과 비교하여 마우스 관절염 평가 지수가 모두 감소되었고, iPSC-iMSC-Exo (50㎍)과 iPSC-iMSC-Exo (100㎍) 투여군을 비교하여 농도의존적으로 평균 관절지수가 유의하게 낮아짐을 확인하였다. 즉, iPSC-MSC-Exo는 류마티스 관절염 동물 모델에서 류마티스 관절염을 치료하는 데 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.

6-2. 면역학적 평가를 통한 류마티스 관절염 치료 효과 확인

실시예 6-1의 류마티스 관절염 동물 모델을 이용하여, 질환의 추가적인 평가를 위해 마우스의 비장세포 내 사이토카인 (IL-17, TNF-a, IL-1b, IL-10, IL-4 등)의 변화를 실시예 4에 기재된 바와 같이 ELISA를 이용해 확인하였다.

도 5의 (b) 및 도 6의 (b)는 FACS를 통해 측정된 류마티스 관절염 동물 모델 마우스의 비장세포 내 CD4+T 세포내 사이토카인 (CD4+IL-17A+, CD4+IL-10 등)의 변화를 보여준다. CIA 그룹과 iPSC-iMSC-Exo, MSC-Exo 투여 그룹 간에는 유의성 있는 차이가 없었으나, iPSC-iMSC-Exo 100㎍ 투여 그룹과 iPSC-iMSC-Exo 50㎍ 투여 그룹 간에는 염증성 T세포인 CD4+IL-17A+ (%) 세포가 iPSC-iMSC-Exo 100㎍ 투여 그룹에서 의미있게 감소하였다.

류마티스 관절염 동물 모델에서의 결과는 iPSC-iMSC-Exo 투여 그룹이 MSC-Exo 투여 그룹과 비교하여 염증유도성 사이토카인(CD4+IL-17+)의 생성을 억제하고, 염증억제성 사이토카인(CD4+IL-10+)의 생성을 유지한다는 것을 보여주었고, iPSC-iMSC-Exo 50㎍, iPSC-iMSC-Exo 100㎍ 두 그룹을 비교한 경우에도, 통계적으로 유의하게 염증유도성 사이토카인 (CD4+IL-17+)의 생성을 억제하고, 염증억제성 사이토카인 (CD4+IL-10+)의 생성을 유지한다는 것을 확인할 수 있었다.

6-3. 관절 조직 슬라이드를 이용한 류마티스 관절염 동물모델에 대한 효능 평가

실시예 6-1의 류마티스 관절염 동물 모델을 이용하여, 질환의 추가적인 평가를 위해 마우스를 2차 부스팅 5주 후에 희생시키고 각각의 마우스의 다리 관절을 적출하여 10% 포르말린에 6일 동안 고정하고, Calci-clear rapid 용액에서 7시간 동안 탈회를 진행하였다. 10% 포르말린에서 2일 동안 또는 10% 포르말린에 6일 고정 후 Calci-clear rapid에 7시간 탈회된 조직은 아래와 같은 순서로 탈수, 투명화 및 파라핀을 침투시켜 조직 처리하였다.

No.	용기(Jar)	시간
1	흐르는 물(tap water)	1 시간
2	70% EtOH	1 시간
3	80% EtOH	1 시간
4	90% EtOH	1 시간
5	95% EtOH # 1	1 시간
6	95% EtOH # 2	1 시간
7	100% EtOH # 1	1 시간
8	100% EtOH # 2	1 시간
9	크실렌 # 1	1 시간
10	크실렌 # 2	1 시간
11	파라핀 # 1	2 시간
12	파라핀 # 2	2 시간

전술된 조직 처리가 끝난 조직은 파라핀에 포매하여 블록으로 제작하였다. 관절조직 염색을 수행하기 위하여 조직을 마이크로톰(microtome)을 이용하여 4㎛으로 절편하였다. 각 슬라이드는 1장의 슬라이드 당 한 마리의 조직 1개가 되도록 제작하였다.

헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin) 염색을 위해 파라핀으로 고정된 조직 슬라이드를 65℃ 오븐에 넣어 1시간 동안 파라핀을 녹인 후 조직의 탈파라핀화와 수화를 위해 NeoClear 용액과 각기 다른 농도의 에탄올에 5분씩 순차적으로 침지하였다. 헤마톡실린 염색을 10초 진행 후, 슬라이드에 직접 닿지 않도록 흐르는 물(tap water)에 10분간 담궈 염색에 사용한 헤마톡실린 잔여물을 제거했다. Eosin 채널에 슬라이드를 침지하여 10분간 염색을 진행했다. 탈수를 위해 각기 다른 농도의 에탄올과 NeoClear 용액에 순차적으로 침지 후 마운팅(mounting)을 수행하고 하루　이상　서늘한　곳에서　건조시킨　후,　광학현미경을　통하여 조직을　확인하였다.

사프라닌 O(Safranin O) 염색을 위해 바이게르트 철 헤마톡실린 용액(Weigert's iron hematoxylin working solution)에 10분 염색 후, 슬라이드에 직접 닿지 않도록 흐르는 물에 10분간 담궈 염색에 사용한 헤마톡실린 잔여물을 제거하였다. 0.05% Fast green (FCF) 용액 채널에 슬라이드를 침지하여 10분간 염색을 진행했다. 1% 아세트산 용액 채널에 슬라이드를 10초간 침지하였다. 1% 사프라닌 O 용액을 분주하여, 슬라이드를 10분간 염색시켰다. 탈수를 위해 각기 다른 농도의 에탄올과 NeoClear 용액에 순차적으로 침지하였다. 마운팅을 수행하고 하루　이상　서늘한　곳에서　건조시킨　후,　광학현미경을　통하여 조직을　확인하였다.

톨루이딘 블루(Toluidine blue) 염색을 위해 0.1% 톨루이딘 블루 용액을 슬라이드에 분주하고 10분간 염색하였다. 탈수를 위해 각기 다른 농도의 에탄올과 NeoClear 용액에 순차적으로 침지하였다. 마운팅을 수행하고 하루　이상　서늘한　곳에서　건조시킨　후,　광학현미경을　통하여 조직을　확인하였다.

류마티스 관절염 동물 모델의 조직학적 평가는 아래 평가 기준에 따라 실시하였다.

<염증 평가 기준 점수; Inflammation score>

0점: 염증 없음

1점: 내층의 약간의 두꺼워짐 또는 하층의 일부 침윤성 세포가 있음.

2점: 내층의 약간의 두꺼워짐과 하층의 일부 침윤성 세포 있음.

3점: 안감층(sublininig layer)이 두꺼워짐, 안감층으로 세포의 유입 및 활막강에 세포가 존재함.

4점: 많은 염증 세포가 침윤된 활막에 존재함

<연골 미란 점수; Cartilage erosion score>

0점: 파괴 없음

1점: 제한되는 최소 침식이 있음.

2점: 제한된 지역에서 약간에서 중간 정도의 침식이 있음.

3점: 더 확장된 침식이 있음.

4점: 대부분의 연골 파괴가 보임.

도 5의 (c) 및 (d)는 CIA, iPSC-iMSC-Exo 및 MSC-Exo의 조직학적 평가 결과를 나타낸다. 관절 조직에서 염증 지수(inflammation score)와 연골 미란 점수 (Cartilage damage score)를 통해 iPSC-iMSC-Exo 투여 그룹이 MSC-Exo 투여 그룹이나 CIA 그룹과 비교하여 관절조직에서 평균 관절지수가 유의하게 낮다는 것을 확인하였다.

도 6의 (c) 및 (d)는 CIA, iPSC-iMSC-Exo 50㎍ 및 100㎍ 투여 그룹의 조직학적 평가 결과를 나타낸다. iPSC-iMSC-Exo 50㎍와 iPSC-iMSC-Exo 100 ㎍ 투여 그룹을 비교한 경우에도, iPSC-iMSC-Exo 농도 의존적으로 염증 평균 지수와 연골 미란 점수가 낮음을 확인하였다. 즉, iPSC-iMSC-Exo는 동물 모델에서 류마티스 관절염을 치료하는 데 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.

Claims

생물학적 시료로부터 세포를 분리하는 단계;
분리된 세포로부터 역분화 줄기세포를 제조하는 단계;
제조된 역분화 줄기세포를 b-FGF의 존재 하에 배양하여 중간엽 줄기세포를 유도하는 단계; 및
유도된 중간엽 줄기세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는 엑소좀의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 분리된 세포는 단핵 세포인 것인 엑소좀의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 유도하는 단계는 하기를 포함하는 것인 엑소좀의 제조방법:
(a) 제조된 역분화 줄기세포를 콜라게나아제 용액과 반응시키는 단계;
(b) 상기 반응시킨 역분화 줄기세포를 원심분리하는 단계;
(c) 상기 원심분리한 역분화 줄기세포를 배지에서 현탁하는 단계; 및
(d) 상기 현탁된 역분화 줄기세포를 b-FGF로 자극하는 단계.
청구항 3에 있어서, 상기 단계 (a)의 콜라게나아제는 콜라게나아제 타입 4 (type　IV　Collagenase)인 것인 엑소좀의 제조방법.
청구항 3에 있어서, 상기 단계 (c)의 배지는 αMEM(α-Minimum Eagle’s Medium)인 것인 엑소좀의 제조방법.
청구항 3에 있어서, 단계 (d) 후 재조합 인간 (recombinant human) TGF-β로 자극하는 단계를 추가로 포함하는 것인 엑소좀의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 엑소좀을 분리하는 단계는 하기 단계를 포함하는 것인 엑소좀의 제조방법:
(a) 유도된 중간엽 줄기세포를 배지에서 36 내지 60 시간 동안 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 중간엽 줄기세포 배양액을 0 내지 5℃에서 200 내지 400 g로 5 내지 15 분 동안 원심분리하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 원심분리된 배양액의 상층액을 0 내지 5℃에서 1500 내지 2500 g로 15 내지 30 분 동안 원심분리하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 원심분리된 배양액의 상층액을 0 내지 5℃에서 8,000 내지 12,000 g로 20 내지 40 분 동안 원심분리하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 원심분리된 배양액의 상층액을 여과지로 필터링하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 필터링된 배양액을 0 내지 5℃에서 80,000 내지 120,000 g에서 100 내지 140 분 동안 원심분리하는 단계.
청구항 7에 있어서, 상기 (a) 단계의 배지는 SF-DMEM (serum free-Dulbecco Modified Eagle Medium)인 것인 엑소좀의 제조방법.
청구항 1에 의해 제조된 엑소좀을 포함하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 9에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염인 것인 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.