CN117004562A - 一种自噬激活的间充质干细胞外泌体、其制备方法及应用 - Google Patents
一种自噬激活的间充质干细胞外泌体、其制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，公开了一种自噬激活的间充质干细胞外泌体、其制备方法及应用。本发明的自噬激活的间充质干细胞外泌体采用雷帕霉素培养激活。本发明直制备的自噬激活的间充质干细胞外泌体具有更强的免疫抑制功能，优于未诱导自噬激活的外泌体，将所述自噬激活的间充质干细胞外泌体在制备治疗和/或预防系统性红斑狼疮药物中应用，能够显著降低狼疮血清抗dsDNA抗体、ANA水平，降低尿蛋白水平，改善狼疮肾脏病理，减少肾脏免疫复合物沉积。为干细胞外泌体应用于系统性红斑狼疮的临床治疗提供了有力工具。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种自噬激活的间充质干细胞外泌体、其制备方法及应用。
背景技术
系统性红斑狼疮是一种全身性自身免疫性疾病，具有多个器官和系统损伤。其特征在于免疫细胞异常活化，致病性自身抗体大量产生和免疫复合物沉积。近年来间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)在治疗系统性红斑狼疮中的应用逐渐被重视。研究显示移植到体内且定向分化的MSCs并不能弥补组织器官损伤所丢失的功能细胞，其对组织器官的免疫调控作用主要归因于强大的分泌功能，其可通过分泌多种细胞因子(如：IDO、TGF-β等)及细胞间信息物质调控细胞的增殖、分化和代谢等功能。然而，静息状态的MSCs免疫调节功能很弱，疗效欠佳。目前，现有技术中已经提出包括改进培养方式(如3D培养和共培养方法等)、生长因子或细胞因子刺激、缺氧诱导和基因改造等多种策略来增强MSCs的免疫调节和抗炎特性。因此，如何通过体外预处理或修饰以维持MSCs活性、保护其免受氧化应激，进而增强其免疫抑制功能是一种有前途的策略。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种自噬激活的间充质干细胞外泌体、其制备方法及应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种自噬激活的间充质干细胞外泌体，所述自噬激活采用雷帕霉素培养激活。
本发明的自噬激活的间充质干细胞外泌体具有更强的免疫抑制功能，优于未诱导自噬激活的外泌体，能够显著降低狼疮血清抗dsDNA抗体、ANA水平，降低尿蛋白水平，改善狼疮肾脏病理，减少肾脏免疫复合物沉积。为干细胞外泌体应用于系统性红斑狼疮的临床治疗提供了有力工具。
作为本发明所述自噬激活的间充质干细胞外泌体的优选实施方式，所述雷帕霉素的浓度为100nM～10μM。
作为本发明所述自噬激活的间充质干细胞外泌体的优选实施方式，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
第二方面，本发明提供了一种所述自噬激活的间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
S1：自噬激活并培养间充质干细胞，得自噬激活间充质干细胞；
S2：收集所述自噬激活间充质干细胞的培养上清，超速离心后，滤膜过滤弃滤液，即得自噬激活的间充质干细胞外泌体。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤S1具体为：将间充质干细胞按适宜密度均匀接种在含10％ FBS、1％双抗的α-MEM培养基中，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养；当细胞融合度达到60％～70％时，吸弃旧培养基，PBS洗2～3次，更换含雷帕霉素、10％无外泌体血清、1％双抗的α-MEM培养基，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养48h～60h。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤S2中所述超速离心具体为：4℃、300g，离心10min～15min，收集上清；4℃、2000g，离心20min～25min，收集上清；4℃、10000g，离心60min～65min，收集上清；4℃、100000g，离心90min～95min，弃上清。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤S2中所述过滤具体为：PBS重悬后采用0.22μm滤膜过滤；再4℃、100000g，离心90min～95min，弃上清，PBS重悬。
第三方面，本发明将所述自噬激活的间充质干细胞外泌体在制备治疗和/或预防系统性红斑狼疮药物中应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物采用静脉注射的方法注射。
进一步的，所述注射时，所述自噬激活的间充质干细胞外泌体的浓度为1μg/μL～2μg/μL。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明利用雷帕霉素诱导HucMSCs自噬，而后制备自噬激活的人脐带间充质干细胞外泌体，通过体内实验比较自噬激活的外泌体与未诱导自噬激活的外泌体对狼疮小鼠治疗效果。本发明所制备的自噬激活的间充质干细胞外泌体具有更强的免疫抑制功能，显著优于未诱导自噬激活的外泌体，可显著降低狼疮小鼠尿蛋白水平，改善其肾脏病理，减少肾脏免疫复合物沉积，降低其血清Anti-dsDNA IgG、ANA水平等。本发明为干细胞外泌体应用于系统性红斑狼疮的临床治疗提供了有力工具。
附图说明
图1为间充质干细胞自噬状态。图中，图1A为Western Blot检测Huc-MSCs自噬相关蛋白p-mTOR、LC3B、p62表达情况；图1B为透射电镜观察Huc-MSCs自噬小体。
图2为间充质干细胞外泌体鉴定。图中，图2A为Exocontrol及Exorapa在电镜下形态结构(分别为80000×、200000×)；图2B为Exocontrol及Exorapa粒径浓度结果；图2C为Exocontrol及Exorapa蛋白标志物CD9、CD63、TSG101和Calnexin表达情况。
图3为自噬激活的间充质干细胞外泌体改善狼疮小鼠脾脏增生。图中，图3A为脾脏形态大小：与Exocontrol组相比，Exorapa组脾脏形态明显缩小；图3B为脾重/体重比值：与Exocontrol组相比，Exorapa组脾重/体重比值明显降低，且有统计学意义；图3C为脾脏病理染色：与Exocontrol组相比，Exorapa组白髓占比减少，炎症细胞增殖减少。(注：*表示P<0.05。)
图4为自噬激活的间充质干细胞外泌体抑制狼疮小鼠自身反应。图中，图4A为外周血浆细胞流式代表图：与Exocontrol组相比，Exorapa组外周血CD138+CD19-浆细胞比例减少；图4B为外周血浆细胞比例统计图：与Exocontrol组相比，Exorapa组外周血CD138+、CD19-浆细胞比例明显减少，差异有统计学意义；图4C、D分别为血清ANA、Anti-dsDNA IgG水平：与Exocontrol组相比，Exorapa组血清ANA、Anti-dsDNA IgG水平明显降低。(注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。)
图5为自噬激活的间充质干细胞外泌体抑制狼疮小鼠炎症反应。图中，图5A-C分别为血清细胞因子IL-17、IL-12及TNF-α水平：与Exocontrol组相比，Exorapa组血清细胞因子IL-17、IL-12及TNF-α水平均有降低趋势。(注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。)
图6为自噬激活的间充质干细胞外泌体改善狼疮小鼠肾脏功能。图中，图6A-C分别为血清肌酐、尿素氮水平及第16周24h尿蛋白水平：与Exocontrol组相比，Exorapa组血清肌酐、尿素氮水平及第16周24h尿蛋白水平明显降低，且差异有统计学意义；图6D为肾脏病理H&E、PAS、MASSON染色代表图：Exorapa组肾小球系膜细胞和基质增生减少，新月体形成减少，肾小管刷状缘脱落改善、管型减少，间质纤维化改善，整体肾脏病理评分明显改善；图6E为肾脏组织病理学评分统计图；图6F为肾脏纤维化面积占比统计图。(注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，****表示P<0.0001。)
图7为自噬激活的间充质干细胞外泌体减少狼疮小鼠肾脏免疫复合物沉积。图中，图7A为肾脏免疫复合物沉积电镜图；图7B为肾脏IgG、C3及IgM免疫荧光代表图；图6C-E分别为肾脏IgG、C3及IgM沉积面积占比统计图：Exorapa组肾脏IgG、C3及IgM免疫沉积明显减少，且有统计学意义。(注：**表示P<0.01，***表示P<0.001。)
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：Huc-MSCs的制备、培养和鉴定
Huc-MSCs由湖南源品生物和广东医科大学附属医院干细胞中心提供。Huc-MSCs按适宜密度重悬在含10％FBS、1％双抗的α-MEM培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。按照实验室常规方法，对细胞进行形态学观察、表面分子特征检测、体外成骨与成脂分化鉴定，证实所获得细胞符合Huc-MSCs特点。
实施例2：Huc-MSCs的自噬激活及自噬水平鉴定
细胞自噬(Autophagy)是一种溶酶体依赖的细胞降解途径。
(1)Huc-MSCs按适宜密度均匀接种在含10％ FBS、1％双抗的α-MEM培养基中，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养。当细胞融合度达到60-70％时，吸弃旧培养基，PBS洗2次，更换含雷帕霉素、10％无外泌体血清、1％双抗的α-MEM培养基，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养48h。100nM、1μM、5μM和10μM雷帕霉素均可增强Huc-MSCs自噬，且具有剂量效应。其中以5μM雷帕霉素的条件培养基诱导Huc-MSCs自噬最为明显，设为优化条件培养基。
(2)优化条件培养基处理48h，收集Huc-MSCs细胞并提蛋白，Western Blot检测自噬相关蛋白p-mTOR、LC3B、p62表达情况、透射电镜观察自噬小体。
Huc-MSCs自噬状态如图1所示。图1A为Western Blot检测Huc-MSCs自噬相关蛋白p-mTOR、LC3B、p62表达情况；图1B为透射电镜观察Huc-MSCs自噬小体。
实施例3：制备自噬激活的间充质干细胞外泌体
(1)Huc-MSCs经优化条件培养基培养48h，收集细胞培养上清，4℃、300g，离心10min，收集上清；4℃、2000g，离心20min，收集上清；4℃、10,000g，离心60min，收集上清；4℃、100,000g，离心90min，弃上清，PBS重悬；0.22μm滤膜过滤；4℃、100,000g，离心90min,弃上清，PBS重悬后即获得自噬激活的间充质干细胞外泌体。
(2)超速离心后收集自噬激活的间充质干细胞外泌体，透射电镜观察外泌体形态，NTA检测外泌体粒径浓度，Western Blot检测外泌体蛋白标志物CD9、CD63、TSG101、Calnexin表达情况。
间充质干细胞外泌体鉴定如图2所示。图2A为Exocontrol及Exorapa在电镜下形态结构(分别为80000×、200000×)；图2B为Exocontrol及Exorapa粒径浓度结果；图2C为Exocontrol及Exorapa蛋白标志物CD9、CD63、TSG101和Calnexin表达情况。
实施例4：体内实验验证自噬激活的间充质干细胞外泌体对狼疮小鼠治疗效果
按照实施例3的方法分别收集自噬激活的间充质干细胞外泌体及未诱导自噬激活的外泌体。以MRL/MpJ小鼠为健康对照，MRL/lpr小鼠为系统性红斑狼疮疾病模型。分组：①MRL/MpJ组：等体积PBS；②MRL/lpr组：等体积PBS；③Exocontrol组：未诱导自噬激活的外泌体(Exocontrol)；④Exorapa组：自噬激活的间充质干细胞外泌体(Exorapa)。在第12、14周龄时尾静脉注射100μg/100μL外泌体或等体积PBS。每周监测体重，隔周收集一次24h尿。在第18周时处死、取材。按实验室常规方法进行外周血B细胞流式检测，肾脏脾脏等组织病理染色，ELISA检测血清自身抗体水平及血清炎症细胞因子水平等.
自噬激活的间充质干细胞外泌体改善狼疮小鼠脾脏增生如图3所示。图3A为脾脏形态大小：与Exocontrol组相比，Exorapa组脾脏形态明显缩小；图3B为脾重/体重比值：与Exocontrol组相比，Exorapa组脾重/体重比值明显降低，且有统计学意义；图3C为脾脏病理染色：与Exocontrol组相比，Exorapa组白髓占比减少，炎症细胞增殖减少。
自噬激活的间充质干细胞外泌体抑制狼疮小鼠自身反应如图4所示。图4A为外周血浆细胞流式代表图：与Exocontrol组相比，Exorapa组外周血CD138+CD19-浆细胞比例减少；图4B为外周血浆细胞比例统计图：与Exocontrol组相比，Exorapa组外周血CD138+、CD19-浆细胞比例明显减少，差异有统计学意义；图4C、D分别为血清ANA、Anti-dsDNA IgG水平：与Exocontrol组相比，Exorapa组血清ANA、Anti-dsDNA IgG水平明显降低。
自噬激活的间充质干细胞外泌体抑制狼疮小鼠炎症反应如图5所示。图5A-C分别为血清细胞因子IL-17、IL-12及TNF-α水平：与Exocontrol组相比，Exorapa组血清细胞因子IL-17、IL-12及TNF-α水平均有降低趋势。
自噬激活的间充质干细胞外泌体改善狼疮小鼠肾脏功能如图6所示。图6A-C分别为血清肌酐、尿素氮水平及第16周24h尿蛋白水平：与Exocontrol组相比，Exorapa组血清肌酐、尿素氮水平及第16周24h尿蛋白水平明显降低，且差异有统计学意义；图6D为肾脏病理H&E、PAS、MASSON染色代表图：Exorapa组肾小球系膜细胞和基质增生减少，新月体形成减少，肾小管刷状缘脱落改善、管型减少，间质纤维化改善，整体肾脏病理评分明显改善；图6E为肾脏组织病理学评分统计图；图6F为肾脏纤维化面积占比统计图。
自噬激活的间充质干细胞外泌体减少狼疮小鼠肾脏免疫复合物沉积如图7所示。图7A为肾脏免疫复合物沉积电镜图；图7B为肾脏IgG、C3及IgM免疫荧光代表图；图6C-E分别为肾脏IgG、C3及IgM沉积面积占比统计图：Exorapa组肾脏IgG、C3及IgM免疫沉积明显减少，且有统计学意义。
综上，本发明提供一种自噬激活的间充质干细胞外泌体的制备方法及所制备的外泌体在治疗系统性红斑狼疮的应用。本发明利用雷帕霉素诱导HucMSCs自噬，而后制备自噬激活的人脐带间充质干细胞外泌体，具有更强的免疫抑制功能，通过体内实验比较雷帕霉素激活自噬的外泌体改善狼疮效应最为明显，其效果明显优于未诱导自噬激活的外泌体，可显著降低狼疮小鼠尿蛋白水平，改善其肾脏病理，减少肾脏免疫复合物沉积，降低其血清抗dsDNA抗体、ANA水平等。本发明为干细胞外泌体应用于系统性红斑狼疮的临床治疗提供了有力工具。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种自噬激活的间充质干细胞外泌体，其特征在于，所述自噬激活采用雷帕霉素培养激活。
2.根据权利要求1所述的自噬激活的间充质干细胞外泌体，其特征在于，所述雷帕霉素的浓度为100nM～10μM。
3.根据权利要求1所述的自噬激活的间充质干细胞外泌体，其特征在于，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
4.一种权利要求1～3任一项所述自噬激活的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：自噬激活并培养间充质干细胞，得自噬激活间充质干细胞；
S2：收集所述自噬激活间充质干细胞的培养上清，超速离心后，滤膜过滤弃滤液，即得自噬激活的间充质干细胞外泌体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S1具体为：将间充质干细胞按适宜密度均匀接种在含10％FBS、1％双抗的α-MEM培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；当细胞融合度达到60％～70％时，吸弃旧培养基，PBS洗2～3次，更换含雷帕霉素、10％无外泌体血清、1％双抗的α-MEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h～60h。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述超速离心具体为：4℃、300g，离心10min～15min，收集上清；4℃、2000g，离心20min～25min，收集上清；4℃、10000g，离心60min～65min，收集上清；4℃、100000g，离心90min～95min，弃上清。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述过滤具体为：PBS重悬后采用0.22μm滤膜过滤；再4℃、100000g，离心90min～95min，弃上清，PBS重悬。
8.权利要求1～3任一项所述自噬激活的间充质干细胞外泌体在制备治疗和/或预防系统性红斑狼疮药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物采用静脉注射的方法注射。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述注射时，所述自噬激活的间充质干细胞外泌体的浓度为1μg/μL～2μg/μL。
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