KR20160030387A - 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 독성을 나타내지 않으면서 항-dsDNA 항체, 단백뇨 및 총 IgG 생성을 억제시키고, T 세포 및 B 세포의 증식을 억제하며, T 세포의 사이토카인 발현을 억제시킴으로써 자가면역질환에 대해 예방 또는 치료 효능을 나타낸다. 루푸스는 자가 항체와 면역복합체에 의하여 신장에 염증이 발생하게 되며, 면역세포의 침윤이 증가하게 되는데 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 투여한 경우, 신장으로의 면역세포 침윤을 감소시킴으로써 루푸스에 대하여 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.

Description

인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating Autoimmune Diseases Comprising Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Bone-Marrow}

본 발명은 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

자가 면역 질환은 우리 몸의 면역 기능이 자신을 공격함으로써 일어나는 질병으로 오랜 기간에 걸쳐 형성되고 증상이 만성적으로 지속되며 대체로 장기의 영구손상을 초래하는 것이 일반 적인 예이며, 완치할 수 있는 방법이 거의 없는 것이 현실이다. 과거 20-30년간 자가면역질환에 대한 지식은 많이 발전하였지만 아직도 정확한 생성 기작, 자가항원의 정체, 조절 유전인자 등은 여전히 불명확하다. 자가면역 질환은 장기특이(organ-specific) 질환과 전신성(systemic) 질환으로 크게 구분할 수 있다.

장기 특이 자가면역 질환은 장기특이항원에 대한 면역반응이 일어남으로서 생기며 우리 몸의 거의 모든 장기에서 발생할 수 있다. 전신성 자가면역 질환은 어떤 특정 세포에 대한 면역반응이 일어나는 것이 아니라 전신에 걸쳐 발현되는 항원에 대한 면역반응에 의해 야기된다. 이런 전신성 자가면역 질환도 특이한 장기에 선택적으로 질병을 일으킬 수 있다.

자가면역성 질환의 예로는 ⅰ) 면역계가 각종 관절의 조직을 공격하는 류마티스관절염(Rheumatoid Arthritis), ⅱ) T 세포에 의하여 유도되는 중추신경계의 자가면역증으로 대부분은 비교적 정상적인 생활이 가능하나, 심한 경우 실명, 마비, 조기사망(premature death)으로 이어질 수 있는 다발성 신경염(MS, Multiple Sclerosis), ⅲ) 췌장의 인슐린 생산 세포를 면역세포가 파괴하여 생기며 MHC 유전자가 중요한 면역매개 또는 타입 I 당뇨병(Immune-Mediated or Type 1 Diabetes Mellitus), ⅳ) 면역계가 장을 공격하여 나타는 질환인 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Diseases), ⅴ) 피부나 혈관의 경화(thickening)를 유도하는 피부경화증(Scleroderma), ⅵ) 전신성 자가면역증으로 깊은 피로감, 발진, 관절통 등의 증세를 수반하며, 심한 경우 면역계가 신장, 뇌, 폐 등에 손상을 끼칠 수 있는 전신성 홍반성 낭창(Systemic Lupus Erythematosus, SLE) 등이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 자가면역질환을 효과적으로 치료할 수 있으며 인체에 안전하게 적용이 가능한 줄기세포를 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 인간 골수로부터 수득한 중간엽 줄기세포가 자가면역질환을 예방 또는 치료하는 데 매우 유효하다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 (i) CD105, CD29, CD44, CD73 및 CD90으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및 (ii) CD34, CD45 및 HLA-DR로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 음성의 면역학적 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 자가면역질환을 효과적으로 치료할 수 있으며 인체에 안전하게 적용이 가능한 줄기세포를 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 인간 골수로부터 수득한 중간엽 줄기세포가 자가면역질환을 예방 또는 치료하는 데 매우 유효하다는 것을 규명하였다.

본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 줄기세포 표지 표현 항원인 CD105, CD29, CD44, CD73 및 CD90으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종, 바람직하게는 최소 2종, 보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 4종, 가장 바람직하게는 5종의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타낸다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 줄기세포 표지 표면 항원인 CD105, CD29, CD44, CD73 및 CD90을 70-100% 발현하며, 보다 바람직하게는 80-100% 발현하고, 보다 더 바람직하게는 90-99% 발현한다.

한편, 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 조혈모줄기세포 표지 표면 항원인 CD34, CD45 및 HLA-DR에는 음성의 면역학적 특성을 나타낸다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 조혈모줄기세포 표지 표면 항원인 CD34, CD45 및 HLA-DR을 0-10% 발현하며, 보다 바람직하게는 0.1-7% 발현하고, 가장 바람직하게는 0.1-5% 발현한다.

상기 표면항원의 발현율을 언급하면서 사용되는 단위 “%”는 분석 대상의 세포들에서 표면항원을 발현하는 세포의 비율을 의미한다. 예를 들어, CD29 표면항원의 발현율이 95%라는 것은 분석 대상의 세포 시료에서 95% 세포가 CD29 표면항원을 발현한다는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료가 가능한 자가면역질환은 루푸스(전신 홍반성 낭창), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 전신성 경피증(Progressive systemic sclerosis, Scleroderma), 아토피 피부염, 원형탈모증(alopecia areata), 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 건선, 천포창, 천식, 아프타구내염, 만성 갑상선염, 염증성 장염, 베체씨병(Behcet’s disease), 크론씨병, 피부근염(dermatomyositis), 다발성 근염(polymyositis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 그레이브씨 갑상선 항진증(Grave’s disease), 결절성 다발성 동맥염(Polyarteritis nodosa), 강직성 척추염(Ankylosing spondylitis), 섬유조직염(Fibromyalgia syndrome) 또는 측두동맥염(Temporal arteritis)이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료가 가능한 자가면역질환은 루푸스, 류머티스성 관절염, 다발성 경화증 또는 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병이다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료가 가능한 자가면역질환은 루푸스이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 TGFβ(transforming growth factor beta)-1을 세포에서 발현/분비한다.

TGF-β는 사람에게서 TGF-β1, 2, 3의 3가지 아형(subtype)이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 면역반응의 강도를 낮추는 강력한 규제물질로 알려져 있다. 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 면역반응의 강도를 낮추는 TGF-β1을 발현/분비함으로써 자가면역반응을 감소시킨다.

본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 증가된 COX-2, HO-1, IFN-γ, IL-4 및 IL-10의 발현정도를 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현” 또는 “증가된 발현”은 조사 대상의 시료(예컨대, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포)에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 일반 시료(예컨대, 일반세포)와 비교하여 높은 경우(바람직하게는, 1.2배 이상)를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 항-dsDNA 항체의 생성을 억제시킨다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 단백뇨의 생성을 억제시킨다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 IgG의 생성을 억제시킨다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 면역세포 침윤을 감소시킨다. 자가면역질환이 발생하는 부위 또는 기관에 면역세포이 침윤되는데(예컨대, 루푸스의 경우 면역세포가 신장에 침윤됨) 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 이러한 면역세포 침윤을 감소시킴으로써 자가면역 반응을 억제시킨다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 면역반응에 관여하는 T 세포 또는 B 세포의 증식을 억제시킨다.

본 발명에 따르면, 상기 T 세포의 증식억제는 수용성 매개자(soluble mediator) 또는 세포-세포 접촉(cell-cell contact)에 의한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 T 세포의 사이토카인 발현을 억제시킨다. 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포에 의해 발현이 억제되는 T 세포의 사이토카인은 IL-2, IFN-g, IL-4, IL-5이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 자가면역질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 비경구 투여용, 특히 혈관 내 투여용 조성물이며, 상기 조성물을 혈관 내에 투여하는 경우 투여된 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 독성을 나타내지 않으면서 항-dsDNA 항체, 단백뇨 및 총 IgG 생성을 억제시키고, T 세포 및 B 세포의 증식을 억제하며, T 세포의 사이토카인 발현을 억제시킴으로써 자가면역질환에 대해 예방 또는 치료 효능을 나타낸다.

본 발명의 조성물은 (a) 상술한 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 치료 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 약제학적으로 허용되는 담체에 세포를 현탁하여 바이알, 비닐백, 또는 주사기 등에 충진하여 사용된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 투여, 국소(협측, 설하, 피부 또는 안구) 투여, 경피성 투여 또는 비경구(피하, 피내, 근육 내, 혈관 내 또는 관절 내) 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식, 보다 바람직하게는 혈관 내 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 10²-10¹⁰ 세포이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 독성을 나타내지 않으면서 항-dsDNA 항체, 단백뇨 및 총 IgG 생성을 억제시키고, T 세포 및 B 세포의 증식을 억제하며, T 세포의 사이토카인 발현을 억제시킴으로써 자가면역질환에 대해 예방 또는 치료 효능을 나타낸다.

(ⅲ) 루푸스는 자가 항체와 면역복합체에 의하여 신장에 염증이 발생하게 되며, 면역세포의 침윤이 증가하게 되는데 본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 투여한 경우, 신장으로의 면역세포 침윤을 감소시킴으로써 루푸스에 대하여 예방 또는 치료 효과를 갖는다.

도 1a-c는 세포배양 플라스크에서 인간 골수유래 중간엽줄기세포를 2번째부터 9번째 계대배양을 하는 동안 세포의 모양이 변하지 않고 있음을 나타내는 이미지이며 도 1a는 건강한 공여자1의 골수유래 중간엽줄기세포의 이미지이며, 도 1b는 공여자2, 도 1c는 공여자3의 이미지이다.
도 2a-c는 건강한 인간 골수유래 중간엽줄기세포의 배양기간에 따른 증식율을 나타낸 그래프이다. 도 2a는 공여자1, 도 2b는 공여자2 그리고 도 2c는 공여자3의 골수유래 중간엽줄기세포의 배양기간에 따른 증식율을 나타낸 그래프이다.
도 3-5는 유세포분석기(FACs)를 이용하여 3번째, 5번째, 7번째, 9번째 계대배양하는 동안 중간엽 줄기세포의 표면항원들을 분석한 그래프이다. 도 3은 공여자1의 중간엽 줄기세포의 배양기간 동안 표면항원을 분석한 결과이며 도 3-5의 A는 3번째 계대배양 시 표면항원 분석한 그래프이며, B는 5번째 계대배양 시 세포, C는 7번째 계대배양 시 세포, 그리고 D는 9번째 계대배양 시 회수한 세포의 표면항원 분석결과 그래프이다. 도 4는 공여자2의 중간엽 줄기세포의 분석 결과이며 도 5는 공여자3의 분석결과이다.
도 6은 건강한 공여자의 골수유래 중간엽 줄기세포의 계대배양 기간 동안 핵형분석을 통한 세포배양의 안정성을 확인한 이미지이다. 도 6a는 공여자1의 골수 유래 중간엽 줄기세포의 계대배양 기간 동안 핵형의 변화 없이 안정성을 나타낸 이미지이며 도 6b는 공여자2의 결과를 도 6c는 공여자3의 결과를 나타낸 이미지이다. 각각의 도의 A는 3번째 계대배양한 세포이며 B는 5번째, C는 7번째, 그리고 D는 9번째 계대배양하여 회수된 세포에서 핵형분석을 확인한 이미지이다.
도 7은 인간 골수유래 중간엽 줄기세포에서 TGF-β, COX-2, HO-1의 유전자 발현 정도를 RT-PCR을 통해 측정한 결과이다.
도 8은 인간 골수유래 중간엽 줄기세포에서 CCL2, IFN-g, IL-10, IL-4, TGF-β의 유전자 발현 정도를 RT-PCR을 통해 측정한 결과이다.
도 9는 공여자 3명의 골수유래 중간엽 줄기세포의 4번째 계대배양 시 세포배양액에서 세포가 분비하는 분비단백질 중 TGF-β1의 발현양을 확인한 그래프이다.
도 10은 골수유래 중간엽줄기세포의 지방세포로의 분화능을 측정한 결과이다.
도 11은 골수유래 중간엽줄기세포의 면역원성 여부를 측정한 결과이다.
도 12는 골수유래 중간엽줄기세포의 면역반응 억제 효과를 측정한 결과이다.
도 13은 MRL/lpr 마우스 기관의 세포군 변화를 측정한 결과이다. 마우스 기관 세포의 표현형 발현을 유세포 분석을 통해 측정함. 기관 세포는 B220-APC, CD4-APC, CD11c-APC, CD3-PE, CD8-PE, CD11b-PE, CD138-APC + IgG-PE, CD4-FITC + Foxp3-PE 및 B220-APC + CD3-PE와 같은 단일클론 항체를 이용하여 염색함.
도 14는 MRL/lpr 마우스 비장 세포에서 사이토카인 발현 정도를 측정한 결과이다. 총 RNA를 마우스 비장의 면역 세포로부터 분리함. IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10, TNF-α, IL-1β, IL-12 및 IL-6의 유전자 발현 레벨은 RT-PCR을 통해 분석함. PCR 산물은 아가로스겔에 전기영동한 다음 에티듐 브로마이드로 염색함.
도 15는 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 반복 투여에 따른 생존율(a), 몸무게(b), 항-dsDNA 양(c), IgG 양(d) 및 단백뇨 양(e)을 측정한 결과이다. 마우스는 3개군으로 나눔. 10주령부터 20주령까지 2주에 한 번씩 대조군의 각 마우스에 200 μl의 비클(vehicle)을 정맥주사하였고, 10주령부터 20주령까지 2주에 한 번씩 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 처리군의 각 마우스에 1 x 10⁶ 인간 골수유래 중간엽 줄기세포를 정맥주사하였으며, 10주령부터 20주령까지 2주에 한 번씩 CPM 처리군의 각 마우스에 50 mg/kg의 cyclophosphamide을 정맥주사함. 28주령까지 생존율을 조사함(a). 28주령까지 마우스의 몸무게를 측정하여 독성을 평가함(b). 2주마다 항-dsDNA 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(c). 2주마다 IgG 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(d). 2주마다 단백뇨 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(e). 유의성은 대조군에 대한 스튜던트 t 검정을 이용하여 결정함(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 16은 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 단일 투여에 따른 항-dsDNA 양(a), IgG 양(b) 및 단백뇨 양(c)을 측정한 결과이다. 마우스는 3개군으로 나눔. 9주령의 대조군 각 마우스에 200 μl의 비클(vehicle)을 정맥주사하였고, 9주령의 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 처리군의 각 마우스에 1 x 10⁶ 인간 골수유래 중간엽 줄기세포를 정맥주사하였으며, 9주령의 cyclophosphamide 처리군 각 마우스에 50 mg/kg의 CPM을 정맥주사함. 2주마다 항-dsDNA 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(a). 2주마다 IgG 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(b). 2주마다 단백뇨 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(c). 유의성은 대조군에 대한 스튜던트 t 검정을 이용하여 결정함(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 17은 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 단일 투여에 따른 항-dsDNA 양(a), IgG 양(b) 및 단백뇨 양(c)을 측정한 결과이다. 마우스는 3개군으로 나눔. 12주령의 대조군 각 마우스에 200 μl의 비클(vehicle)을 정맥주사하였고, 12주령의 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 처리군의 각 마우스에 1 x 10⁶ 인간 골수유래 중간엽 줄기세포를 정맥주사하였으며, 12주령의 cyclophosphamide 처리군 각 마우스에 50 mg/kg의 CPM을 정맥주사함. 2주마다 항-dsDNA 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(a). 2주마다 IgG 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(b). 2주마다 단백뇨 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(c). 유의성은 대조군에 대한 스튜던트 t 검정을 이용하여 결정함(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 18은 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 반복 투여에 따른 항-dsDNA 양(a), IgG 양(b) 및 단백뇨 양(c)을 측정한 결과이다. 마우스는 3개군으로 나눔. 12주령부터 20주령까지 3주에 한 번씩 대조군의 각 마우스에 200 μl의 비클(vehicle)을 정맥주사하였고, 12주령부터 20주령까지 3주에 한 번씩 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 처리군의 각 마우스에 1 x 10⁶ 인간 골수유래 중간엽 줄기세포를 정맥주사하였으며, 12주령부터 20주령까지 2주에 한 번씩 CPM 처리군의 각 마우스에 50 mg/kg의 cyclophosphamide을 정맥주사함. 2주마다 항-dsDNA 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(a). 2주마다 IgG 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(b). 2주마다 단백뇨 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(c). 유의성은 대조군에 대한 스튜던트 t 검정을 이용하여 결정함(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 19는 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 처리 후 MRL/lpr 마우스 기관의 세포군 변화를 측정한 결과이다. 마우스 기관 세포에서 표현형의 발현은 유세포 분석을 통해 측정하였음. 기관 세포는 B220-APC, CD4-APC, CD11c-APC, CD3-PE, CD8-PE, CD11b-PE, CD138-APC + IgG-PE, CD4-FITC + Foxp3-PE 및 B220-APC + CD3-PE와 같은 마우스 단일클론 항체를 이용하여 염색함. 유의성은 대조군에 대한 스튜던트 t 검정을 이용하여 결정함(*p<0.05).
도 20은 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 처리 후 MRL/lpr 마우스 비장 세포에서 사이토카인 발현 정도를 측정한 결과이다. 총 RNA는 비장 세포의 면역 세포로부터 분리함. IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10, TNF-α, IL-1β, IL-12 및 IL-6의 유전자 발현 레벨을 RT-PCR을 이용하여 분석함. PCR 산물은 아가로스겔에 전기영동한 다음 에티듐 브로마이드로 염색함.
도 21은 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 투여 후 MRL/lpr 마우스 신장에서 조직학적 변화를 측정한 결과이다. MRL/lpr 마우스 신장은 HE-염색 절편으로 평가함. MRL/lpr 마우스 5주령(a), 비클-투여 MRL/lpr 마우스 25주령(b), 인간 골수유래 중간엽 줄기세포-투여 MRL/lpr 마우스 25주령(c), CPM-투여 MRL/lpr 마우스 25주령(d). x 400배.
도 22는 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 반복 투여에 따른 생존율(a), 몸무게(b)를 측정한 결과이다. 마우스는 3개군으로 나눔. 12주령에 한 번 대조군의 각 마우스에 200 μl의 비클(vehicle)을 정맥주사하였고, 12주령에 한 번 인간 BM-MSC 처리군의 각 마우스에 4 x 10⁴, 4 x 10⁵, 4 x 10⁶ 인간 골수유래 중간엽 줄기세포를 정맥주사하였으며, 12주령에 한 번 CPM 처리군의 각 마우스에 50 mg/kg의 cyclophosphamide을 정맥주사함.
도 23은 2주마다 항-dsDNA 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(a). 2주마다 IgG 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(b). 2주마다 단백뇨 농도를 ELISA를 이용하여 측정함(c). 유의성은 대조군에 대한 스튜던트 t 검정을 이용하여 결정함(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 24는 인간 골수유래 중간엽줄기세포 투여에 따른 신장 내 조직학적 변화를 관찰한 결과이다.
도 25는 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 면역제어를 나타내는 모식도이다.
도 26은 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 표현형을 측정한 결과이다. 마우스 골수세포는 마우스 단일클론 항체(CD34-PE, CD45-PE, CD103-PE, CD73-PE, CD90-PE, CD105-PE, CD44-FITC 및 Sca-1-FITC)를 이용하여 염색함(a). 20일간 배양한 마우스 BM-MSC는 마우스 단일클론 항체(CD34-PE, CD45-PE, CD103-PE, CD73-PE, CD90-PE, CD105-PE, CD44-FITC 및 Sca-1-FITC)를 이용하여 염색함(b).
도 27은 B/T 세포 증식에 있어서 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 효과를 측정한 결과이다. 비장 세포는 96웰 플레이트에서 방사능 처리된 인간 골수유래 중간엽 줄기세포가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 LPS 및 ConA로 활성화시킴. 세포 증식은 [³H]-티미딘 혼성으로 평가함. BM-MSC는 Balb/c 유래-B/T 세포와 공동 배양함(a). 인간 골수유래 중간엽 줄기세포는 C57BL/6 유래-B/T 세포와 공동 배양함(b). 인간 골수유래 중간엽 줄기세포는 MRL/lpr 유래-B/T 세포와 공동 배양함(c). 유의성은 대조군에 대한 스튜던트 t 검정을 이용하여 결정함(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 28은 T 세포 사이토카인 생성에 있어서 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 효과를 측정한 결과이다. 총 RNA는 T 세포로부터 분리함. IL-2, IFN-γ, IL-4, 및 IL-5의 유전자 발현 레벨은 RT-PCR을 이용하여 분석함. PCR 산물은 아가로스겔에 전기영동한 다음 에티듐 브로마이드로 염색함(a). 면역 세포 상등액에서 IFN-γ 및 IL-2 레벨은 ELISA를 이용하여 측정함(b).
도 29는 B/T 세포 증식에 대한 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 직간접적인 효과를 측정한 결과이다. B/T 세포는 트랜스웰 시스템을 이용하여 인간 골수유래 중간엽 줄기세포와 공동배양함. 세포 증식은 [³H]-티미딘 혼성을 이용하여 평가함. MRL/lpr 마우스의 비장 세포는 96웰 플레이트에서 방사능 처리된 MSC가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 LPS로 활성화시킴(a). MRL/lpr 마우스의 비장 세포는 96웰 플레이트에서 방사능 처리된 MSC가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 ConA로 활성화시킴(b).
도 30은 인간 골수유래 중간엽 줄기세포에서 수용성 요소의 발현 정도를 측정한 결과이다. 20일째에 인간 골수유래 중간엽 줄기세포를 회수함. 수용성 요소의 유전자 발현 레벨은 RT-PCR을 이용하여 분석함(a). 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 상등액에서 수용성 요소의 레벨은 ELISA를 이용하여 측정함(b). 유의성은 골수 세포군에 대한 스튜던트 t 검정을 이용하여 결정함(***p<0.001).
도 31은 BM-MSC에서 IDO의 발현을 측정한 결과이다. 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 상등액에서 IDO 레벨은 ELISA를 이용하여 측정함(a). 인간 골수유래 중간엽 줄기세포-매개 T 세포 면역 억제 메카니즘(b).
도 32는 인간 골수유래 중간엽 줄기세포에 의한 T 세포의 운동 행동을 측정한 결과이다. 인간 골수유래 중간엽 줄기세포는 CMTMR 염색약(적색)으로 37℃에서 15분간 염색함. T 세포는 CFSE 염색약(녹색)으로 37℃에서 15분간 염색함. 2차원 세포 추적은 Imaris 소프트웨어를 이용하여 실시함. 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 및 T 세포간 상호작용의 스냅샷 이미지.
도 33은 인간 골수유래 중간엽 줄기세포에 의한 T 세포의 이동을 측정한 결과이다. 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 농도에 따른 T 세포의 이동은 배양 1.5 시간 후 하부 챔버에 위치하는 세포 수를 계수하여 측정함. 유의성은 대조군에 대한 스튜던트 t 검정을 이용하여 결정함(***p<0.001).
도 34는 인간 골수유래 중간엽 줄기세포에서 케모카인의 발현 정도를 측정한 결과이다. 인간 골수유래 중간엽 줄기세포는 20일째에 회수함. 케모카인의 유전자 발현 레벨은 RT-PCR을 이용하여 분석함(a). 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 상등액에서 CCL2, CCL5 및 CXCL12 레벨은 ELISA를 이용하여 측정함(b). 유의성은 골수 세포군에 대한 스튜던트 t 검정을 이용하여 결정함(***p<0.001).
도 35는 siRNA를 이용하여 CCL2 및 CXCL12 유전자를 각각 녹다운 시킨 다음, 케모카인의 발현을 측정한 결과이다.
도 36은 인간 골수유래 중간엽줄기세포의 이동에 관여하는 T 세포를 분석한 결과이다.
도 37은 인간 골수유래 중간엽줄기세포와 T 세포의 접촉양상과 접촉시간을 분석한 결과이다.
도 38은 마우스 MSC와 T 세포의 접촉에 있어서 T 세포가 발현하는 CCR2의 역할을 분석한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 건강한 공여자의 골수에서 골수유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 체외증식 배양

환자의 상후장골극부위(posterior superior iliac spine, PSIS)에서 잼쉬디 주사(Jamshidi needle)를 이용하여 약 30-50 mL의 골수를 채취한 후, 헤파린튜브에 옮겼다. 골수가 담긴 헤파린튜브를 무균실로 이동시킨 다음 이후 과정을 수행하였다. 골수가 담긴 헤파린튜브를 무균튜브에 옮긴 후 기본배지(CSBM, CORESTEM Inc., 대한민국)와 1:3으로 희석하여 이 희석액을 미리 준비된 Ficoll(Fiocoll-Paque^TM PREMIUM, 농도 1.077 g/mL, GE Healthcare) 층 위에 층 점적하고, 400×g에서 30분간 원심분리하였다. 단핵구 세포(mononuclear cell) 세척과정은 다음과 같이 단핵구 세포층 분리 후 단핵구 세포에 기본배지를 첨가하여 400×g에서 10분간 원심분리하여 단핵구 세포를 수확하였고, 수확한 단핵구 세포를 다시 한 번 기본배지첨가 후 100×g, 10분간 원심분리하였다. 세척한 단핵구 세포를 1% 페니실린-스트렙토마이신(Biochrmone, 독일), L-알라닐-L-글루타민(Biochrome, 독일), 10%(v/v) 우태아혈청(FBS; Gibco, 미국)이 함유된 기본배지가 담긴 T175 세포배양 플라스크(Nunc, 미국)에 접종 후 37℃, 7% CO₂ 조건에서 11일간 배양하였다. 배양 후 3 또는 4일 간격으로 2회 배지교환하여 세포배양 플라스크 바닥에 붙지 않은 세포들을 제거하였다. 계대배양 시 세포배양 플라스크 바닥에 70-80% 이상 붙은 부착성 세포를 트립신 처리(0.125% 트립신-EDTA; Gibco, 미국)하여 수확하였다.

실시예 2: 골수유래 중간엽 줄기세포의 동결보존 및 해동

세포를 T175 세포배양 플라스크(Nunc. 미국)에 플라스크 당 1.5 x 10⁵ - 2 x 10⁵개의 세포로 접종한 후 37℃, 7% CO₂ 조건에서 7일간 배양하였다. 세포배양 시 배지의 교환은 3일 또는 4일 간격으로 시행하였다.

70-80% 이상 증식한 세포를 트립신 처리(0.125% 트립신-EDTA)하여 수확하였다. 이 수확한 세포는 20% 우태아혈청과 10% DMSO(dimethylsulfoxide, Sigma, 미국)가 첨가된 CSBM으로 구성된 동결보존용 배지 800 ㎕에 1 x 10⁶ 세포/바이알(vial)의 밀도로 존재하도록 세포를 현탁한 다음 세포동결 보존튜브 바이알(cryotube vial; Nunc, 미국)에 분주하였다. 상기 바이알에 분주된 세포현탁액은 이소프로필 알코올이 담긴 동결보존용 용기(Nalgene, 미국)에 넣어 -80℃ 초저온냉장고에 24시간동안 저장한 다음, 다음날 세포가 담긴 바이알을 액체질소저장탱크에 옮겨 보관하였다

1 x 10⁶ 세포/바이알 밀도의 세포가 담긴 바이알을 액체 질소 저장탱크로부터 실온상태에 옮겨 액체질소를 제거한 다음 신속히 37℃ 수조로 이동하였다. 바이알 안에 해동된 세포 현탁액은 멸균 상태 하에서 세포배양 배지가 담긴 세포배양 플라스크에 접종하였다. 접종한 세포의 밀도는 T175 플라스크 당 1.5 x 10⁵ - 2 x 10⁵개의 세포가 존재하도록 하였다. 세포배양배지 교환은 3일 또는 4일 간격으로 시행하였으며, 세포의 성상 및 증식 여부는 광학현미경(Nikon, 일본)으로 관찰하였다. 계대2(P2)부터 계대9(P9)의 세포성상을 관찰하였으며, 도 1에서 보는 바와 같이, 섬유아세포와 같은 방추 형태로 균일하게 증식하는 것을 확인할 수 있었다(도 1a-c).

실시예 3: 공여자의 골수유래 중간엽 줄기세포의 증식률 분석

분리한 세포의 계대수(passage number) 증가에 따른 줄기세포의 증식률을 측정하였다. 세포배가(population doubling, PD)는 세포의 증식률을 나타내는 지수로서 세포배가(population doubling, PD) = 로그(최종 수확한 세포수/초기 접종 세포수)/로그 2의 식으로 나타낼 수 있다. 초기접종 세포수는 각 계대수(passage number)마다 T175 플라스크에 1.5 x 10⁵개의 세포로 결정하였고, 배양 후 획득되는 세포의 수를 측정하여 증식률을 결정하였다. 골수유래 중간엽 줄기세포를 상기와 같은 분리방법을 거쳐 얻은 후 계대 배양하였다. 성장 곡선 그래프를 통해 약 40일간(P2-P11)세포의 증식률을 확인한 결과, 세포수의 배가시간(population doubling time. PDT)이 약 75.14 시간임을 확인할 수 있었다(도 2).

실시예 4: 공여자의 골수유래 중간엽 줄기세포의 표면항원 발현분석

세포의 줄기세포 표지 표면항원 발현특성을 확인하고자 형광 활성화 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting: FACS)을 이용하였다. 골수로부터 분리한 중간엽 줄기세포를 계대배양 기간 중 계대3(P3), 계대5(P5), 계대7(P7), 그리고 계대9(P9) 때 2 x 10⁶개의 세포로 2% 우태아혈청이 첨가된 DPBS(Gibco, 미국)로 3회 세척하고, 1 x 10⁵ 세포/100 ㎕의 농도로 현탁한 후 시험관에 분주하여 FACS 칼리버(Calibur; Becton Dickinson, NJ, 미국)로 분석하였다. 항체는 중간엽 줄기세포 표지인자인 PE-CD29, PE-CD90, PE-CD44, PE-CD73 및 PE-CD105와 조혈모 세포 표지인자인 PE-CD34 및 PE-CD45를 이용하였고, 조직적합항원 표지인자인 PE-HLA-DR (MHC class Ⅱ), 그리고 음성대조군 항체인 PE-면역글로불린 아이소타입 IgG1(immunoglobulin isotype IgG1)를 이용하였으며, 모든 항체는 미국의 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)사의 제품을 사용하였다. 이용한 항체는 얼음 위에서 30분간 암조건에서 세포와 반응시키고, 여분의 항체를 DPBS(Gibco, 미국)로 세척한 후 유세포분석을 하였다.

80% 이상의 세포가 줄기세포 표지 표면항원인 CD29, CD44, CD49C, CD73 및 CD105에 대해 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내었고, 조혈줄기세포 표지 표면항원 CD34 및 CD45에 대해서는 모두 5% 미만의 음성 면역학적 특성을 나타내었다. 결과적으로, 분리한 세포는 줄기세포의 특성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키는 조직적합항원 HLA-DR(MHC class II)이 발현되지 않는 세포이므로, 기존의 세포나 조직의 이식수술 시 문제가 되는 거부반응 등의 면역반응을 유발하지 않으므로 타가유래의 세포로 사용 가능함을 확인 할 수 있었다(도 3-5).

실시예 5: 공여자의 골수유래 중간엽 줄기세포의 핵형분석

세포의 분리 및 배양과정 중 정상적인 염색체의 형태 및 염색체의 수를 유지하고 있는지 확인하기 위해 분석을 시행하였다. 분리한 골수유래 중간엽 줄기세포를 계대별(P3, P5, P7, P9)로 T75 플라스크에 1.75 x 10⁵개의 세포로 접종한 후 37℃, 7% CO₂ 조건에서 75% 밀도까지 증식된 세포를 트립신 처리(0.125% 트립신-EDTA)하여 수확하였으며, 수확한 세포의 유사 분열의 중기(metaphase) 25개를 GTG-밴딩 하였다. 결과적으로, 염색체의 수적 및 구조적 이상을 발견할 수 없었으며, 중간엽 줄기세포의 연속적인 배양과정에서도 핵형의 변화가 일어나지 않고 정상 염색체를 유지하고 있는 것을 확인하였다(도 6a-c).

실시예 6: 공여자의 골수유래 중간엽 줄기세포의 분비 인자들에 대한 발현분석

인간 MSC에서 분비하는 인자들을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 이를 위해, 먼저 인간 MSC를 배양 플라스크에서 회수 한 후 회수한 세포에 trizol 200 ㎕로 실온에서 5분 반응시켰다. 동일 튜브에 클로로포름 200 ml를 넣고 볼텍싱하여 실온에서 5분 반응시킨 후 4℃, 12,000 rpm에서 15분 간 원심분리 하였다. 상층액 500 ml를 새 튜브로 옮기고 동량의 이소프로파놀을 넣어 상온에서 10분 반응시킨 뒤 4℃, 12,000 rpm에서 15분 간 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고 RNA 펠렛에 75% EtOH 1 ml을 넣어 세척하고 4℃, 12,000 rpm에서 15분 간 원심분리하여 RNA 펠렛을 얻었다. 얻어진 RAN에 RNase free water 50 ml를 넣어 RNA 펠렛을 상온에서 10분간 녹인 후 Nano-drop을 이용하여 RNA의 농도 및 순도를 측정했다. 각 RNA 1 mg의 농도로 cDNA를 합성하였다.

cDNA 합성은 Maxime RT premix kit 방법에 준하여 진행했다. 역전사 반응은 핵산증폭기(PCR machine)에서 45℃로 60 분간 반응시키고, 역전사 효소의 불활성화를 위해 95℃에서 5 분간 반응시켰다. 합성된 cDNA에 대해 PCR을 진행하였다.

Real-time PCR machine은 Rotor-Gene Q5 Plex를 사용하였다. 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 진행하였으며, 시험에 사용되는 용액은 Rotor-Gene SYBR green PCR kit 10 μl, 10 pmole의F/R 프라이머 0.6 μl, 1 μg의 주형cDNA 2.0 μl, Rnase free water를 7.4 μl를 넣어 총 볼륨이 20 μl가 되게 PCR 튜브를 만들고 다음과 같은 조건으로 PCR을 한다; 전-변성: 95℃ 10 분, 변성: 95℃ 15 초, 어닐링 & 연장: 60℃ 1 분. 이 과정을 40번 반복한다.

RT-PCR 방법을 통해 인간 MSC의 TGF-β, COX-2, HO-1의 유전자 발현을 확인하였다(도 7A). TGF-β는 면역조절 능력이 있는 사이토카인으로 특히 조절성 T 세포의 분화를 유도하는 것으로 알려져 있어 자가면역질환 조절에 중요한 인자이다. COX-2는 프로스타글란딘(prostaglandin)을 생성하는 효소이다. MSC에서 COX-2가 활성화 되면 프로스타글란딘이 생성되고 이 물질에 의해 증식된 세포 반응이 억제된다고 알려져 있다. HO-1도 MSC가 면역세포를 조절하는데 관여하는 중요한 인자이다.

인간 MSC에 IFN-g를 처리하면 TGF-β, COX-2, HO-1과 더불어 IDO의 발현이 증가함을 확인하였다. IDO는 MSC가 면역반응을 억제하는데 중요한 역할을 하는 인자로 대식세포, B 세포 등의 활성을 억제할 때 강력하게 관여하는 단백질이다(도 7B). 유전자 발현과 더불어 인간 MSC는 TGF-β와 프로스타글란딘 E(PGE₂)의 단백질을 발현하고 있음을 확인하였다.

도 8을 통해 인간 MSC에서 CCL2, IFN-γ, IL-10, IL-4, TGF-β 의 유전자가 높게 발현됨을 확인하였다. MSC에서 분비하는 CCL2는 면역세포인 T 세포와 접촉 시 중요하게 작용하는 케모카인이다. MSC가 CCL2를 발현하면 T 세포는 MSC가 있는 곳으로 이동하게 되며, 이를 통해 MSC가 T 세포를 억제하는데 용이하게 될 것이다. IFN-γ는 MSC의 B7-H1의 발현을 증가시켜 T 세포와의 접촉을 자극하여 MSC에 의한 면역억제 반응이 효과적으로 일어나도록 유도한다. IL-4는 T 세포를 Th2 세포로 분화시키는 사이토카인이며, M2 대식세포(항염증작용)를 활성화시켜 M1 대식세포(염증작용)의 활성을 억제하고 염증반응을 조절한다. MSC에서 분비하는 IL-10은 비정상적으로 활성화 된 면역반응을 조절하는 대표적인 항염증 사이토카인이다. 이상의 결과를 통해, MSC는 다양한 케모카인과 사이토카인 발현을 조절하여 효과적으로 면역반응을 억제할 것이라 사료된다.

실시예 7: 공여자의 골수유래 중간엽 줄기세포의 분비인자 발현확인분석

루푸스는 자가면역질환의 하나로 정상적인 면역조절시스템의 붕괴로 인한 질환으로서 중간엽 줄기세포 자체에서 분비하는 면역조절 인자들의 발현 정도를 확인하고자 하였다.

골수 중간엽 줄기세포 자체에서 발현하는 여러 인자들 중 미경험 T 세포에 영향을 주어 직간접적으로 조절 T 세포로의 분화를 유도하는 인자 중 TGFβ(transforming growth factor beta)-1 발현은 골수유래 중간엽 줄기세포를 루푸스 환자에게 투여 시 항염증 유도와 과하게 자기항원에 대해 활성이 증가되어 있는 면역을 조절하는 효과를 유도할 수 있으므로 본 공여자로부터 분리한 골수유래 중간엽 줄기세포의 계대4(P4) 일 때 세포배양액 50 μl를 TGF-β ELISA 키트(Quantikine, R&D Systems)를 이용하여 키트의 매뉴얼에 따라 실험을 실시하였다. 그 결과, 공여자 3명의 골수유래 중간엽 줄기세포의 계대4(P4) 일 때 세포 10,000 개당 TGFβ-1을 평균 36 pg 정도 분비하는 세포들이며 최소 20 pg 이상 분비하는 특성을 지님을 확인하였다(도 9).

실시예 8: 공여자의 골수유래 중간엽 줄기세포의 분화능 및 면역조절능력 분석

골수유래 중간엽줄기세포의 분화능

MSC는 연골세포, 근세포, 지방세포, 및 골모세포 등 다양한 중간엽조직의 성숙한 세포로 분화 가능한 다중분화능을 가지고 있다. 따라서 인간 MSC가 인 비트로에서 여러 종류의 세포계로 분화 가능한지 확인하였다.

지방세포 분화능을 분석하기 위해 세포를 지방세포분화배지에 14일 동안 배양하였다. 분화된 지방세포의 형태적 변화는 오일 레드 O 염색으로 확인하였다. 분화된 지방세포는 작은 물방울(droplet)이 축적되어, 오일 레드 O 염색 시 붉은 색으로 나타났다. 이를 통해 지방세포로의 분화가 확인되었다(도 10B).

골세포 분화능을 분석하기 위해 세포를 골세포분화배지에 21일 동안 배양하였다. 분화 확인 방법으로 알리자린 레드 염색법을 사용하였으며, 이는 칼슘에 부착하여 붉은색을 나타낸다. 도 10C의 음성대조군에서는 알리자린 레드에 의한 염색이 관찰되지 않았다. 반면에 분화된 세포는 알리자린 레드에 의해 붉은색으로 염색되어, 칼슘이 형성되었음을 확인하였다(도 10D).

연골세포 분화능을 분석하기 위해 연골세포분화배지에서 28일 동안 펠렛 배양하였다. 분화된 연골세포의 특성분석은 면역학적 염색(Aggrecan 염색방법)을 수행하였다. 분석에 이용한 Aggrecan은 연골에 존재하는 단백 다당이다. 도 10에서 볼 수 있듯이, 분화된 연골세포에서 aggrecan 단백이 발현되고 연골소강형성이 관찰되었다(도 10E-G).

골수유래 중간엽줄기세포의 면역조절능력

동종 면역세포에 대한 인간 MSC의 면역원성과 면역반응 조절 능력을 평가하였다. HLA type이 다른 정상인의 혈액으로부터 PBMC를 분리하고 다른 세 명의 인간 MSC와의 공동 배양을 통해 면역원성을 측정하였다. 인간 MSC는 동종 PBMC의 증식과 IFN-γ 생성을 유도하지 않아 면역원성이 없음을 알 수 있었다(도 11).

림프구 증식 유도 물질인 PHA에 의해 증식이 유발된 PBMC와 인간 MSC를 공동 배양하여 인간 MSC의 면역 반응 억제 효과를 확인하였다. PHA에 의해 PBMC의 증식이 유도되었고, 인간 MSC에 의해 증식반응이 억제되고 IFN-γ 생성이 저해되었다(도 12).

실시예 9: MSC의 루푸스 치료효과 규명 실험 방법

인간 MSC

코아스템에서 동물실험에 사용할 인간 MSC를 제공하였다.

루푸스 동물실험

자연발생 루푸스 동물모델로 널리 알려진 MRL/lpr 마우스를 사용하였다. 인간 MSC를 1ｘ10⁶ 세포/마우스의 농도로 마우스에 정맥주사하였다. 양성대조군으로는 면역억제제인 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide, 이하 CPM)를 사용하였고, 50 mg/kg의 농도로 마우스에 정맥주사하였다.

마우스 MSC 배양

Balb/c 마우스를 경추탈골법으로 희생시킨 후, 10 ㎖ 주사기를 이용하여 대퇴골과 경골안에 있는 골수를 분리하여 단일세포를 얻었다. 0.7 μm 여과기를 이용하여 불순물을 걸러내고 세포를 1,200 rpm에서 3분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 ACK 용해 버퍼로 1분간 처리하여 적혈구를 제거하였다. 최종 분리된 세포를 1 ｘ 10⁷ 세포/㎖의 세포수로 α-MEM 배지에 희석하고 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양 5일간에 매일 새 배지 1 ㎖을 첨가하였다. 배양 6일째 α-MEM 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 새 배지 1 ㎖을 첨가하였다. 배양 20일째 된 세포를 실험에 사용하였다.

세포 표현형 분석

세포 표면 분석은 유세포 측정기를 이용하였다. 회수한 세포(1 x 10⁶ 세포/㎖)를 0.5% BSA/PBS로 세척하였다. 상층액을 제거하고 단일클론 항체가 들어간 50 ㎕의 0.5% BSA/PBS를 넣고 4℃에서 20분간 염색하였다. 500 ㎕의 PBS/BSA로 다시 세척한 후 500 ㎕의 PBS/BSA를 넣고 현탁시켰다. 단일클론 항체는 PE-결합 CD3, CD8, CD34, CD45, CD73, CD90, CD103, CD105, CD11c, CD11b, IgG, Foxp3, FITC-결합 CD44, Sac-1, CD11c, CD4, APC-결합 B220, CD138 및 CD4를 사용하였다. 데이터 분석은 WinMDI 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)

TRIZOL 시약을 이용하여 조직과 세포에서 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA 0.3 을 이용하여 cDNA를 42 ℃에서 60분, 94 ℃에서 5분간 합성하였다. 만들어진 cDNA 3 ㎕와 10 pM의 프라이머를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)를 수행하였다. PCR의 기본 조건은 전-변성 단계, 94℃, 5분을 시작으로 변성 단계, 94℃ 30초 30 사이클, 어닐링 단계,　72℃ 1분을 수행하고 후-연장 단계를 72℃에서 5분 조건으로 실시하였다. 프라이머마다 어닐링 온도를 54-56℃ 사이로 달리 수행하였다. 만들어진 PCR 생성물은 1% 아가로오스 겔에 8 ㎕씩 로딩 후 50 V로 전기 영동하였다.

HE 염색법

MRL/lpr 마우스에서 적출한 신장을 10 % 파라포름알데히드에 18시간 동안 고정시킨 후 4 ㎛의 파라핀절편을 만들었다. 자일렌을 이용하여 조직슬라이드에서 파라핀을 제거하고 에탄올을 이용하여 함수시킨 뒤 흐르는 물에 10분 동안 세척하였다. 헤마톡실린 용액을 이용하여 1분간 염색한 뒤, 흐르는 물에 1분 동안 두어 잔여 염색용액을 제거하였다. 그 뒤 에오신 용액을 이용하여 1분간 염색하였다. 염색된 슬라이드를 알코올과 자일렌을 이용하여 탈수과정을 거친 뒤 광학현미경으로 관찰 및 사진 촬영하였다.

세포이동 측정법

MSC에 대한 T 세포의 이동능력을 트랜스웰을 이용하여 측정하였다. 1 ｘ 10⁵의 T 세포를 상부 챔버에 넣고, 하부 챔버에는 0.3 ｘ 10⁴, 1 ｘ 10⁴, 3 ｘ 10⁴의 MSC를 넣은 후 37 ℃ 배양기에서 1.5시간 반응시켰다. 그 후 하부 챔버로 이동된 세포수를 유세포 분석기를 이용하여 측정하였다.

세포증식 측정법

MRL/lpr 마우스의 비장으로부터 분리한 세포를 이용하여 티미틴 흡수를 실시한다. 비장세포를 1 x 10⁶ 세포/㎖의 세포수로 RPMI 완전 배지 조성에 희석하여 분주한다. 비장세포에 1 ㎍/㎖ 농도의 LPS와 ConA를 처리하고 MSC를 세포농도별로 처리한 후 37℃ 배양기에서 배양하였다. 54시간 후에 티미딘을 1 μCi/웰의 농도로 처리하고 18시간 배양 후에 세포 수확기를 이용하여 유리 섬유 필터에 모은 다음 2시간 동안 건조시켰다. 건조시킨 유리 섬유 필터를 샘플 백에 넣어준 후 섬광 칵테일(scintillation cocktail)로 필터를 충분히 적셔주고 밀봉하였다. 마지막으로 유리 섬유 필터를 베타 카운터를 이용하여 세포의 DNA 내로 유입된 방사능의 양을 측정하였다.

효소면역 측정법(ELISA)

마우스의 혈청과 오줌을 얻고 항-dsDNA ELISA 키트, IgG ELISA 키트, 단백뇨 ELISA 키트를 사용하였다. 또한 MSC의 상층액을 얻어 TGF-β ELISA 키트, PGE2 ELISA 키트, IDO ELISA 키트를 이용하였고, 각각의 키트에 기재되어 있는 실험 절차대로 진행하였다.

세포영상 측정법

세포 영상은 세포배양 현미경을 사용하여 측정하였다. MSC는 5 μM CMTMR 염색약을 처리하여 37℃에서 15분 동안 염색하였고, T 세포는 5 μM CFSE 염색약을 처리하여 37℃에서 15분 동안 염색하였다. 35 ㎜ 배양 접시에 5 x 10⁴ 세포의 T 세포와 5 x 10³ 세포의 MSC를 넣어준 후 세포영상을 측정하였다. 세포 영상은 2분 간격으로 6시간을 측정하였으며, 데이터 분석은 Imaris 소프트웨어를 이용하였다.

조직병리

마우스에서 분리한 신장 조직을 10 % 포름알데하이드 용액에 3일 동안 고정하고 파라핀 블록을 만들어 4 mm로 잘라 슬라이드를 제작했다. 조직학적인 변화를 관찰하기 위해서 H&E(hematoxylin-eosin) 염색이나 PAS(periodicacid-Schiff) 염색했다. 면역조직염색법(Immuno-histochemistry)은 먼저 슬라이드를 0.01 M 구연산염(citrate) 용액에 넣고, 열을 가하여 항원을 표출시켰다. 그리고 메탄올에 3%로 H₂O₂를 넣은 용액에 슬라이드를 넣고, 내생성의(endogenous) 페록시다아제(peroxidase) 활성을 차단했다. 슬라이드를 CD3,B220, F4/80, Foxp3, CD209b 항체를 희석하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. Vectastain ABC kit 를 사용하여 3,3’-diaminobenzidine(DAB) 염색이 잘되도록 했다. 면역조직염색이 끝나면 헤마톡실린을 대조로 염색했다.

실시예 10: 인간 MSC의 루푸스 치료효과 규명

인간 MSC의 치료효과를 검증하고자 자연발생 루푸스 동물모델로 널리 알려진 MRL/lpr을 채택하였다. MRL/lpr은 항-ssDNA 항체, 항-dsDNA 항체, 류마티스인자 등 자가항체들이 높게 나타나고 면역글로불린의 농도가 높아 결과적으로 면역복합체의 양이 증가한다. 이러한 과도한 표현형은 림프증식(lymphoproliferation; lpr)이라 불리는 상염색체 열성 돌연변이에 의한 것이다. 19번 염색체에 위치하는 lpr 돌연변이는 Fas 수용체의 전사를 변형시킨다. 결과적으로 Fas 신호전달의 결핍은 세포자멸사를 억제하여 루푸스 증상을 발생시킨다. 루푸스 동물모델에서 고전적으로 사용하는 NZB/W F1과의 차이점은 마우스가 급격히 사망하며 암컷과 수컷에 루푸스 증상에 모두 나타난다.

MRL/lpr 마우스 종류 중 하나로 MRL/MpJ-Fas^lpr/J 마우스를 구입하여 발병 전과 후의 특성을 분석하였다. 앞서 설명했듯 이 마우스는 Fas 수용체가 돌연변이되므로, 림프 증식이 되어 면역복합체의 생성되며 그 시점은 약 12주령이며, 암컷은 평균적으로 약 17주령, 수컷은 약 22주령에 죽기 시작한다. 우선 루푸스 발병 전인 6주령의 마우스와 발병이 최고조로 이른 25주령의 마우스 장기를 적출하여 비교분석 하였다. 발병 후 마우스 장기의 무게와 세포수가 발병 전보다 증가함을 알 수 있었다(표 1). 각각의 장기에서 얻은 세포의 표현형 변화를 관찰하고자 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. MRL/lpr 마우스가 발병 후에 가장 눈에 띄는 변화는 거의 모든 조직에서 림프종의 표현형인 B220⁺CD3⁺의 비율이 증가하였다. 또한 면역억제반응을 담당하는 Treg 세포의 표현형인 CD4⁺Foxp3⁺의 비율이 발병 후에 감소하였다(도 13). MRL/lpr 마우스가 발병이 진행함에 따른 사이토카인 발현을 분석하고자 마우스의 비장세포에서 RNA를 분리한 후 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 발병이 진행된 마우스의 염증성 사이토카인의 발현이 발병 전보다 증가함을 확인하였다(도 14).

MSC는 이식편대숙주반응을 일으키는 주된 요인인 HLA-DR의 발현이 적고 CD40, CD80, CD86의 표현형이 거의 나타나지 않기 때문에 이식이 수월하다고 보고 되고 있다(Ryan JM, Barry FP, Murphy JM, Mahon BP., J Inflamm(Lond). Jul 26;2:8(2005)).

MRL/lpr 마우스를 이용하여, 인간 MSC의 루푸스 개선효과를 측정하였다. MSC를 1ｘ10⁶ 세포/마우스의 농도로 마우스에 정맥주사 하였으며, 투여 시기는 마우스의 발병이 시작하는 10주령부터 시작하여 2주 간격으로 총 6번 주사하였다. 동물실험의 측정지표로는 매주 마우스의 생존률과 몸무게를 확인하였고, 2주 간격으로 항-dsDNA, 단백뇨, IgG를 측정하였다. 양성대조물질로 시클로포스파미드(cyclophosphamide)를 사용하였다.

MRL/lpr 마우스는 13주령부터 사망하기 시작하였으며, 22주령 경에는 90%의 마우스가 사망하였다. 인간 MSC는 마우스의 생존율을 증가시켰으며, 28주령까지 90%의 마우스가 생존하였다(도 15a). 인간 MSC는 MRL/lpr 마우스의 몸무게에 영향을 주지 않았으며, 이로 부터 인간 MSC는 마우스에 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다(도 15b). MRL/lpr 마우스의 혈중 항-dsDNA Ab의 농도는 10주령부터 증가하였으며, 20주령에 최고치를 나타내었다. 인간 MSC는 혈중 항-dsDNA Ab의 농도를 감소시키는 효과가 있었다(도 15c). MRL/lpr 마우스의 혈중 총 IgG의 농도는 8주령부터 증가하여, 20주령에는 최고치를 나타내었으며, 인간 MSC는 혈중 총 IgG의 농도증가를 억제하였다(도 15d). MRL/lpr 마우스의 단백뇨 수치는 20주령부터 꾸준히 증가하였으며, 인간 MSC는 단백뇨 농도를 감소시켰다(도 15e).

요약하면, 인간 MSC는 MRL/lpr의 항-dsDNA Ab, 단백뇨, 총 IgG 생성을 억제하였으며, 마우스의 생존율을 증가시켰다. 현재 임상에서 사용 중인 시클로포스파미드의 치료효과와 비슷하였다. 그러나 몸무게를 감소시키는 시클로포스파미드는 독성을 보인 반면에, 인간 MSC는 독성을 나타내지 않았다(도 15).

다음 동물실험으로 MRL/lpr 마우스에 1 x 10⁶ 세포/마우스의 인간 MSC를 루푸스 발병 전인 9주령에 1회만 정맥주사 하여 루푸스 개선효과를 확인하였다. 인간 MSC는 MRL/lpr 마우스 혈중의 항-dsDNA, IgG 생성을 억제하였으며, 단백뇨 생성도 억제하였다. 그러나 투여 후 3주 동안은 효과가 강하게 관찰되었으나, 4주 이후에는 치료효과가 약해지는 경향을 보였다(도 16).

MRL/lpr 마우스에 1 x 10⁶ 세포/마우스의 인간 MSC를 루푸스 발병 시작점인 12주령에 1회만 정맥주사 하여 루푸스 개선 효과를 확인하였다. 인간 MSC는 MRL/lpr 마우스 혈중의 항-dsDNA, IgG 생성을 억제하였으며, 단백뇨 생성도 억제하였다. 그러나 투여 후 3주 동안은 억제효과가 관찰되었으나, 4주 이후에는 치료효과가 약해지는 경향을 보였다(도 17). 상기의 동물실험을 통하여, 인간 MSC를 MRL/lpr 마우스에 투여할 경우에는, 투여횟수에 따라서 효과가 다양해짐을 알 수 있었다. 단회 투여 후 3주 동안은 효과가 지속되지만, 4-5주 이후에는 효과가 약해짐을 확인하였다.

다음 동물실험으로 MRL/lpr 마우스에 인간 MSC를 12주째부터 3주 간격으로 총 3번을 1 x 10⁶ 세포/마우스 농도로 정맥주사 하였다. 인간 MSC는 MRL/lpr 마우스 혈중의 항-dsDNA, IgG 생성을 억제하였으며, 단백뇨 생성도 억제하였다(도 18).

마우스를 부검하여 장기무게, 면역세포 표현형, 사이토카인 발현량, 신장의 세포침윤도를 분석하였다. 마우스의 장기무게를 측정한 결과, 인간 MSC를 투여한 군이 대조군에 비하여 장기무게의 차이가 현저하게 나진 않았으나, 세포수 측면에서 보았을 때 흉선세포를 제외하고 실험군이 대조군에 비하여 모든 장기의 세포수를 감소시켰다(표 2).

마우스 장기 안에 있는 면역세포 표현형을 유세포 분석기를 통하여 측정해본 결과 인간 MSC를 투여한 군이 대조군에 비하여 혈장 세포 표현형인 CD138⁺IgG와 림프종 표현형인 B220⁺CD3⁺의 비율이 감소하였고, Treg 세포 표현형인 CD4⁺Foxp3⁺의 비율이 증가하였다(도 19). 비장세포의 RNA를 분리하여 사이토카인 발현량을 RT-PCR을 통하여 분석한 결과, MSC를 투여한 군의 염증성 사이토카인 발현량이 대조군에 비하여 현저하게 감소하였다(도 20).

루푸스 질병은 자가 항체와 면역복합체에 의하여 신장에 염증이 발생하게 되며, 면역세포의 침윤이 증가하게 된다. 마우스 신장을 분리하고 HE 염색법을 통하여 세포의 침윤도의 확인하였다. 인간 MSC는 신장으로의 면역세포 침윤을 감소키고 있음을 확인하였다(도 21).

MRL/lpr 마우스에서 인간 MSC가 유효성을 나타내는 최소농도, 투여횟수, 투여경로를 결정하기 위해 인간 MSC를 4x10⁴, 4x10⁵, 4x10⁶ 세포/head로 12주령에 단회 정맥 투여하였다. 매주 생존율과 무게를 측정하였으며, 격주로 혈청을 분리하여 항-dsDNA 항체 및 IgG의 농도를 측정하였고, 뇨를 분리하여 단백질 농도를 측정하였다. 21주령에 관찰을 종료하며 신장을 적출하여 조직분석을 실시하였다.

인간 MSC는 MRL/lpr 마우스 생존율을 증가시키며 최저 유효농도는 4x10⁴ 세포/40 g이였고 단회 정맥 투여로 치료효과가 있었다(도 22). 인간 MSC는 농도 의존적으로 항-dsDNA 항체, IgG, 및 단백뇨생성을 유의하게 억제하였으나, 투여 농도가 높을수록 투여효과는 우수하였다(도 23). 조직병리 검사 결과, 대조군의 신장에는 염증반응에 의한 T세포, B 세포, 호중구, 대식세포, 수지상세포의 면역세포 침윤이 증가되었고, 인간 MSC 투여에 의해 모두 감소하였다. 반면에 조절성 T 세포의 비율은 인간 MSC 투여에 의해 증가되었다(도 24).

실시예 11: MSC의 면역억제 작용기전 규명 연구

MSC는 선천 면역(innate immunity)과 양자 면역(adoptive immunity)을 억제하며, 세포와 세포간의 직접적인 접촉과 용해성 인자를 억제한다고 알려졌다. MSC가 분비하는 용해성 인자로는 NO, IDO, TGF-β, IL-10, PGE₂ 등이 있다. 이런 용해성 인자는 T 세포, B 세포, NK 세포 그리고 수지상세포의 활성과 기능을 억제하는 것으로 보고되고 있다(도 25).

마우스 골수유래 MSC를 기전연구에 사용하였다. 마우스 골수에서 제작한 MSC의 표현형을 확인하기 위하여 유세포 분석기를 이용하였다. 마우스의 골수에서 유래한 MSC의 세포 표현형은 마우스의 골수세포와 비하여 조혈모세포 표현형인 CD34, CD45, CD103의 발현이 줄어들었고, MSC 표현형인 CD73, CD90, CD105, CD44, Sca-1의 발현이 증가하였다(도 26).

MSC에 의한 마우스 T 및 B 세포의 증식 억제

MSC가 마우스 T 및 B 세포의 증식을 억제하는지를 미토겐 분석법을 통하여 확인하였다. MSC는 Balb/c 마우스의 골수세포를 이용하여 제작하였으며, T 세포의 Balb/c(syngenic), C57BL6(allogenic), MRL/lpr(allogenic) 마우스의 비장세포에서 분리하여 사용하였다. MSC와 T 세포를 0.001-0.1 : 1의 비율로 혼합하였으며, ConA를 처리하여 T 세포의 증식을 유도하였다. 실험결과 MSC는 ConA-유도 T 세포 증식을 억제하고 있음을 확인하였다(도 27). MSC와 B 세포를 0.001-0.1 : 1의 비율로 혼합하였으며, LPS를 처리하여 B 세포의 증식을 유도하였다. 실험결과 MSC는 LPS-유도 B 세포 증식을 억제하고 있음을 확인하였다(도 27).

MSC에 의한 마우스 T 세포의 사이토카인 발현 억제

MSC가 마우스 T 세포의 사이토카인 발현을 억제하는지를 RT-PCR과 ELISA를 이용하여 확인하였다. MSC는 Balb/c 마우스의 골수세포를 이용하여 제작하였으며, T 세포는 MRL/lpr(allogenic) 마우스의 비장세포에서 분리하여 사용하였다. MSC와 T 세포는 0.1 : 1의 비율로 혼합하였으며, ConA를 처리하여 T 세포의 사이토카인 발현을 유도하였다. 실험결과 MSC는 T 세포의 IL-2, IFN-g, IL-4, IL-5의 발현을 억제하고 있음을 확인하였다(도 28).

세포접촉 여부에 따른 MSC 면역억제효과

MSC 면역억제효과가 세포접촉에 의한 것인지 아니면 수용성 매개자에 의한 것인지를 확인하기 위하여 트랜스웰 분석법을 시행하였다. Balb/C 유래 MSC와 MRL/lpr 마우스 유래 B/T 세포를 1:10의 비율로 실험하였다.

MSC와 B 세포를 하층 웰에 혼합하여 첨가하였을 때, MSC는 접촉 또는 수용성 매개자를 분비하여 B 세포의 증식을 억제할 수 있으며, MSC는 상층 웰에, B 세포를 하층 웰에 첨가할 경우에는 MSC는 수용성 매개자만을 통하여 B 세포의 증식을 억제할 수 있다.

도 29a에서 알 수 있듯이, MSC를 상층 웰 및 하층 웰에 첨가할 경우, B 세포의 증식을 억제하였으나, MSC를 상층 웰에 첨가할 경우에는 억제효과가 감소하였다. 이는 MSC가 수용성 매개자 뿐 만 아니라, 세포-세포 상호작용에 의해서도 B 세포의 기능을 억제함을 의미한다. 도 29b를 통하여, MSC는 수용성 매개자 및 세포-세포 접촉에 의해서 T 세포의 증식을 억제하고 있음을 알 수 있었다.

MSC가 분비하는 용해성 인자

MSC가 분비하는 용해성 인자를 분석하기 위하여 RT-PCR과 ELISA를 수행하였다. MSC는 대조군에 비하여 NO, TGF-β, PGE2를 많이 발현하고 있었다(도 30). MSC 자체는 억제성 물질인 IDO를 발현하지 않으나(도 30), T 세포와 공동배양 시 MSC의 IDO 발현량이 증가함을 확인하였다(도 31).

MSC와 T 세포 간 상호작용 관찰

MSC와 T 세포 간에 상호작용을 직접 관찰하고자 실시간 현미경을 사용하여 세포의 움직임을 측정하였다. 영상분석을 통하여 T 세포의 움직임이 3 종류로 구분됨을 확인하였다. 첫 번째 종류의 T 세포는 MSC와 어떤 접촉도 없이 자유롭게 이동하였고 약 5 ㎛/분의 속도로 움직였다(도 32a). 두 번째 종류의 T 세포는 MSC와 연속적으로 접촉하였으며, 속도는 1.5 ㎛/분으로 감소하였다(도 32b). 세 번째 종류의 T 세포는 이동 중간에 MSC와 접촉하는 세포로, 이동 초기에는 약 5 ㎛/분의 속도를 보였으나 MSC와 접촉한 이후로는 약 1 ㎛/분의 속도로 감소하였다(도 32c).

두 세포를 공동배양할 경우, MSC 주변으로 T 세포가 모여서 무리를 형성함을 확인하였다(도 32d). 다음으로 T 세포가 MSC 주변으로 모여서 무리를 형성하는 기전에 대하여 연구하였다. 트랜스웰의 하층 웰에 MSC를 첨가하고, 상층 웰에 T 세포를 첨가하였다. 90분 후에 하층 웰로 이동한 T 세포의 수를 측정하여, MSC로 향하는 T 세포의 이동을 측정하였다. 하층 웰의 MSC의 농도가 증가할수록, T 세포 이동이 증가하고 있음을 확인하였다(도 33). 다음으로 T 세포 이동을 유도하는 물질을 규명하고자 하였다. 이동을 유발하는 대표물질인 케모카인의 발현도를 RT-PCR과 ELISA를 이용하여 분석하였다. 도 34와 같이, MSC는 대조군에 비하여 CCL2, CXCL12를 높게 발현하고 있음을 확인하였다.

마우스 MSC와 T 세포가 접촉할 때 관여하는 케모카인 분석

마우스 MSC와 T 세포가 접촉할 때 관여하는 케모카인을 확인하기 위해 MSC 가 높게 발현하고 있는 CCL2와 CXCL12의 siRNA를 처리하여 각 유전자를 녹다운시켰다. 각 유전자 siRNA에 의해 발현이 저하된 MSC를 CCL2-KD MSC와 CXCL12-KD MSC라 명명한다. 마우스 MSC에 CCL2 siRNA(도 35A)와 CXCL12 siRNA(도 35B)를 각 각 처리한 결과, 각 케모카인 유전자 발현과 단백질 생성량이 저해되었다.

트렌스 웰의 하층 웰에 MSC를 첨가하고 상층 웰에 T 세포를 참가하였다. 이때 MSC는 아무것도 처리하지 않은 대조군 MSC와 CCL2-KD MSC 및 CXCL12-KD MSC를 사용하였다. 하층웰로 이동한 T 세포의 수를 측정하여 MSC로 향하는 T 세포의 이동을 측정하였다. 그 결과 T 세포가 CCL2-KD MSC로 이동하는 것이 감소하였다(도 35C). CXCL12-KD MSC는 대조군 MSC와 같은 결과로 MSC의 농도 의존적으로 상층 웰의 T 세포가 하층 웰로 이동하였다. 이미지 상의 관찰에서도 T 세포가 CCL2-KD MSC가 있는 방향으로 움직이는 것이 관찰 되지 않았다(도 35D).

MSC의 움직임에 대한 분석

MSC와 T 세포의 접촉을 확인하고 그 움직임에 대한 분석을 실시하였다. MSC와 접촉하는 것을 기준으로 하여 MSC와 접촉하지 않는 T 세포를 wandering T cell이라고 하고 MSC와의 접촉을 시도하는 T 세포를 searching T 세포라고 하며 MSC와 접촉한 T 세포를 contacting T 세포라고 명명하였다(도 36A).

CCL2-KD MSC와 CXCL12-KD MSC는 T 세포와의 접촉에서 어떠한 변화를 보이는지 분석하였다. CXCL12-KD MSC는 대조군 MSC와 T 세포 접촉 양상에 큰 차이가 없었다. 그러나 CCL2-KD MSC는 대조군 MSC에 비해 wandering T 세포 비율은 증가하고 contacting T 세포의 비율이 감소함을 확인하였다(도 36B).

Wandering T 세포와 searching T 세포는 특정한 방향 없이 자유롭게 움직였으며 MSC와 접촉한 contacting T 세포는 움직임이 거의 없이 한 곳에 정체해 있음을 확인하였다(도 36C). 이러한 움직임은 MSC의 조건에 상관없이 같은 양상으로 나타났다. Wandering T 세포와 searching T 세포에 비해 contacting T 세포의 속도가 낮게 측정되었으며, 이는 대조군 MSC, CCL2-KD MSC, CXCL12-KD MSC와의 차이는 없었다(도 36D).

MSC와 T 세포의 접촉시간 분석

MSC와 T 세포를 공동배양하고 6시간 동안 관찰되는 현상을 분석하였다. MSC와 T 세포가 접촉한 접촉시간(contact timing)을 빨간색 화살표로 표시하였다. 도 37A를 보면 MSC와 T 세포의 접촉시간은 일정하지 않고 다양하게 관찰된다. 그러나 CCL2-KD MSC의 경우 대조군 MSC와 CXCL12-KD MSC에 비해 접촉시간이 짧게 측정되었다.

6시간 관찰한 대조군 MSC, CXCL12-KD MSC 및 CCL2-KD MSC와 T 세포가 접촉한 수는 각 각 11.4, 10.6, 10.2번으로 큰 차이가 없었다(도 37B). 그러나 접촉한 시간을 보면 CCL2-KD MSC와 T 세포와의 접촉 시간은 현저히 낮음을 알 수 있었다. 대조군 MSC, CXCL12-KD MSC, CCL2-KD MSC와 T 세포와의 접촉 시간은 각 각 107, 97, 34분으로 측정되었다(도 37C). 결과적으로 MSC와 T 세포가 접촉할 때는 MSC가 발현하는 케모카인 CCL2가 중요하게 작용함을 알 수 있었다.

마우스 MSC와 T 세포의 접촉에 있어서 T 세포가 발현하는 CCR2의 역할

마우스 MSC와 T 세포가 접촉 할 때 CCL2가 중요하다는 결과를 보충하기 위해 CCR2 길항제를 이용하여 시험을 진행하였다. CCR2는 CCL2의 수용체로 T 세포에서 발현하고 있는 케모카인 수용체이다. CCR2 길항체를 T 세포에 농도 별로 처리 한 결과 100 μg/ml 이상에서는 세포 독성이 있음을 알 수 있었다(도 38A).

CCR2 길항제를 3, 10, 30 μg/ml의 농도로 처리한 T 세포를 트렌스 웰의 상층 웰에 접종하였다. 그리고 하층 웰에 MSC를 접종하고 T 세포의 이동을 측정하였다. CCR2 길항제의 농도가 증가할수록 MSC로 이동하는 T 세포의 이동수가 감소함을 알 수 있었다(도 38B).

CCR2 길항제 30 μg/ml을 T 세포에 처리하고 트랜스 웰의 상층 웰에 접종하였다. 하층 웰에 MSC를 농도 별로 처리하고 T 세포의 이동을 관찰하였다. CCR2 길항제가 처리되지 않은 T 세포는 MSC의 농도 의존적으로 MSC로의 이동이 증가함을 알 수 있었다. 그러나 CCR2 길항제가 처리된 T 세포는 MSC로의 이동이 저해되었다(도 38C). 따라서 MSC의 CCL2와 T 세포의 CCR2간의 상호작용을 통해 세포 간의 접촉이 일어남을 증명하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

1. 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 (i) CD105, CD29, CD44, CD73 및 CD90으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및 (ii) CD34, CD45 및 HLA-DR로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 음성의 면역학적 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물로서 상기 자가면역질환은 루푸스(전신 홍반성 낭창), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 전신성 경피증(Progressive systemic sclerosis, Scleroderma), 아토피 피부염, 원형탈모증(alopecia areata), 건선, 천포창, 천식, 아프타구내염, 만성 갑상선염, 염증성 장염, 베체씨병(Behcet’s disease), 크론씨병, 피부근염(dermatomyositis), 다발성 근염(polymyositis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 그레이브씨 갑상선 항진증(Grave’s disease), 결절성 다발성 동맥염(Polyarteritis nodosa), 강직성 척추염(Ankylosing spondylitis), 섬유조직염(Fibromyalgia syndrome) 및 측두동맥염(Temporal arteritis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 TGF-β(transforming growth factor beta)-1, COX-2, HO-1, IFN-γ, IL-4 및 IL-10의 발현정도가 증가된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 항-dsDNA 항체의 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 단백뇨의 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 IgG의 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 신장으로의 면역세포 침윤을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 T 세포 또는 B 세포의 증식을 억제시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 T 세포 증식 억제는 수용성 매개자(soluble mediator) 또는 세포-세포 접촉(cell-cell contact)에 의한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
9. 제 1 항에 있어서, 상기 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 T 세포의 사이토카인 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
10. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 혈관 내 투여용인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 혈관 내 투여는 정맥주사인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

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