KR20130111448A

KR20130111448A - 간엽줄기세포를 포함하는 자가면역질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20130111448A
Application number: KR1020130034471A
Authority: KR
Inventors: 조미라; 박민정; 이성희
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-03-29
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2013-10-10

Abstract

본 발명은 간엽줄기세포를 포함하는 자가면역질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 면역조절 B 세포의 생성을 촉진 또는 면역조절 B세포의 활성을 증가시키거나 항체 생산 B 세포의 생성을 저해 또는 항체 생산 B 세포의 활성을 감소시킴으로써 자가면역 질환의 치료 효과를 나타내는 것을 자가면역질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 간엽줄기세포를 이용한 자가면역질환 치료용 조성물을 제공하여 종래 자가면역질환 치료용 조성물로 사용하던 면역억제제의 부작용인 신체 면역력 약화를 개선하고, 스테로이드 제제의 부작용인 피부질환 유발의 위험성을 감소시킬 수 있어, 안전한 자가면역 질환 치료제로서 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

Description

간엽줄기세포를 포함하는 자가면역질환 치료용 조성물{Composition for treating immune disorders comprising Mesenchymal Stem Cells}

본 발명은 간엽줄기세포를 포함하는 자가면역질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 면역조절 B 세포의 생성을 촉진 또는 면역조절 B세포의 활성을 증가시키거나 항체 생산 B 세포의 생성을 저해 또는 항체 생산 B 세포의 활성을 감소시킴으로써 자가면역 질환의 치료 효과를 나타내는 것을 자가면역질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

면역체계는 해로운 외부물질인 항원으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다. 이러한 항원의 종류로는 박테리아, 바이러스, 독소, 암세포, 다른 사람 혹은 동물의 혈액과 조직이 이에 해당된다. 면역체계는 이러한 해로운 물질에 반응하여 이를 제거하기 위하여 항체를 생산한다. 그러나 자가 면역에 이상이 생긴 경우, 면역체계는 자신의 건강한 신체 장기와 해로운 항원을 구분하지 못하여, 정상적인 조직을 파괴하게 되며, 이러한 반응으로 인해 야기되는 자가 면역 질환(autoimmune disease)이 발생하게 된다. 자가 면역에 이상이 생긴 경우에는 신체의 정상적인 조직을 대상으로 반응이 일어나게 된다. 자가면역 이상의 원인은 확실치 않으나, 박테리아와 같은 미생물 또는 약물이 자가 면역 질환에 걸리기 쉬운 유전자를 가지고 태어난 사람들에게 병을 유발하는 것이라는 가설이 있다.

자가면역 치료를 위해 다수의 화학적 및 생물학적 면역치료 방법이 개발되었다. 전형적 치료방법은 스테로이드 같은 화학제 또는 항-면역 세포항체를 이용하여 신체의 면역반응을 전체적으로 약화시키는 것이다. 예를 들어 CD22, CD20, CD19, CD74 또는 HLA-DR 항원에 결합하는 항체를 투여하여, B 세포의 정상기능을 포함한 신체의 전체적 면역반응을 약화시키는 것이다.

대한민국 공개특허공보 제2008-0109705호는 면역억제능이 증가된 간엽줄기세포-매개 자가유래 수지상세포에 관한 것으로, T-세포 억제능이 향상된 수지상 세포 및 이의 자가면역질환 용도를 개시한다.

미국특허 제 7,074,403호는 B 세포를 표적으로 하는 항체를 이용한 자가면역 질환의 치료법에 관한 것으로, B-세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 개시한다.

미국특허 제7,473,592호는 다른 대상체 유래의 세포를 사용한 면역질환 치료용 세포 조성물에 관한 것으로, 항-CD3, 항-CD28 항체로 코팅된 T 세포 조성물을 개시한다.

종래 자가 면역질환 치료는 크게 스테로이드 제제와 면역억제제 두 가지로 이루어져 있다. 그러나 이러한 치료 방법은 장기간 사용시 신체의 전반적 면역시스템을 약화시키는 것으로, 외부의 침입에 대응할 수 있는 신체의 면역기능을 전반적으로 떨어뜨려 다른 질환에 걸리게 하는 부작용을 초래하였다. 또한 스테로이드 제제로 인한 전신성 피부질환 등의 부작용을 초래하기도 하였다.

따라서 상기 문제점을 극복할 수 있는 새로운 기전에 근거한 세포 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

1. 대한민국 공개특허공보 제2008-0109705호 2. 미국특허 제7,074,403호 3. 미국특허 제7,473,592호

상기한 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 간엽줄기세포가 면역조절 B 세포의 생성 촉진과 병적 자가항체 생산 B 세포 활성 억제를 할 수 있음을 발견하여 완성되었다.

따라서, 본 발명은 면역억제제로 인한 신체 면역력 약화 또는 스테로이드 제제로 인한 피부질환 등의 부작용이 없는 자가면역질환 치료용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 간엽줄기 세포를 포함하는 자가면역 질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 면역조절 B 세포의 생성을 촉진 또는 면역조절 B세포의 활성을 증가시키거나 항체 생산 B 세포의 생성을 저해 또는 항체 생산 B 세포의 활성을 감소시킴으로써 자가면역 질환의 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 면역조절 B 세포는 B reg 또는 B 10 세포일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 B reg 세포는 CD19+CD1d+CD5+ B 세포 또는 가장자리 구역 B 세포(marginal zone B cell)일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 면역조절 B세포는 인터루킨 10의 생산을 증가시켜 자가면역 질환의 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 리포폴리사카라이드(LPS)로 처리된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 자가유래인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 인간지방조직 유래인 것을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 Th1 또는 Th17 세포의 생성을 저해하고 T reg 세포의 생성을 촉진시키며, Tfh 세포의 생성을 저해킴으로써 자가면역 질환의 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 자가면역질환은 루푸스일 수 있다.

본 발명은 간엽줄기세포를 이용한 자가면역질환 치료용 조성물을 제공하여 종래 자가면역질환 치료용 조성물로 사용하던 면역억제제의 부작용인 신체 면역력 약화를 개선하고, 스테로이드 제제의 부작용인 피부질환 유발의 위험성을 감소시킬 수 있어, 안전한 자가면역 질환 치료제로서 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

도 1은 골수 유래 간엽줄기세포를 분화시킨 후, CD 마커를 이용하여 줄기 세포 특성을 조사한 유세포 분석 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 비장세포와 골수 유래 간엽줄기세포를 공조배양 한 경우(A) 및 LPS 처리한 경우(B), B 10 세포과 B reg 세포 내 IL-10 발현양 변화를 조사한 유세포 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 비장세포와 골수 유래 간엽줄기세포를 공조배양한 경우 배양액의 IgG, IgG1, IgG2a의 농도를 측정한 ELISA 결과이다.
도 4는 루푸스 마우스 모델에서 간엽줄기세포 주입시 조직 내 면역세포 침투 감소(A), 항체 분비 세포 감소(B), 항체 분비 감소(C), 자가항체인 dsDNA 양 감소(D)를 관찰한 면역조직화학법 및 ELISA 결과이다.
도 5는 루푸스 마우스 모델에서 간엽줄기세포 주입시 Th1, Th17의 감소 및 Foxp3+ Treg의 증가(A), Tfh의 감소(B), B reg의 증가(C), 소포성 B 세포의 감소, 가장자리 구역 B 세포의 증가, 플라스마 세포의 감소(D)를 관찰한 유세포 분석 결과이다.

본 발명은 간엽줄기세포를 포함하는 자가면역 질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 면역조절 B 세포의 생성을 촉진 또는 면역조절 B세포의 활성을 증가시키거나 항체 생산 B 세포의 생성을 저해 또는 항체 생산 B 세포의 활성을 감소시킴으로써 자가면역 질환의 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

B 세포는 주로 자가항체의 분비 기능을 가지고 있기 때문에 자가면역 질환과 관련하여 병인세포로 인식되어 왔으나, 최근 마우스에서 면역 반응을 억제하는 B 세포의 발견과 이들 B 세포를 제거하였을 때 자가면역 반응이 악화되는 것이 확인되었으며, 이들 B 세포에는 CD19+CD1d+CD5+ B 세포 또는 가장자리 구역 B 세포(marginal zone B cell) 등이 있는 것으로 보고되고 있다.

따라서 본 발명자들은 간엽줄기세포를 포함하는 자가면역질환 치료용 조성물에 있어서 면역조절 B 세포를 통한 자가면역질환 치료 기전에 대해 관심을 가지고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 치료적 유효량의 간엽줄기세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 자가면역질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 간엽줄기세포는 자가유래(autologous) 또는 동종이계 (allogenic) 이다. 가장 바람직하게는 자가유래의 것으로 수용자로부터 유래한 것이기 때문에 약제학적 조성물의 투여 시 면역 반응의 문제가 없고 안전하다는 이점이 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “치료”란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 본 용어가 적용되는 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "간엽줄기세포"는 골수(bone marrow), 혈액, 진피 및 골막에서 분리되는 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포, 연골세포 및 뼈세포 등으로 분화할 수 있는 전능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다. 상기 간엽줄기세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 간엽줄기세포일 수 있으며, 본 발명의 일실시예에 따르면 마우스의 간엽줄기세포이다.

간엽줄기세포는 골수 등에 매우 적은 양으로 존재하지만, 이를 분리 및 배양하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 미국특허 제5,486,359호에 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 또한, 상기 간엽줄기세포는 공지된 방법에 따라 골수의 조혈모세포로부터 부착특성에 의해분리한 후 분화능력을 잃지 않은 상태에서 증식시켜 얻을 수 있다.

간엽줄기세포를 얻는 과정을 일 실시예에 따라 설명하면 다음과 같다:

인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는, 인간의 간엽줄기세포

소스, 예컨대, 혈액 또는 골수로부터 간엽줄기세포를 분리한다. 상기 골수는 경골,대퇴골, 척수 또는 장골로부터 추출할 수 있다. 이어, 골수로부터 세포를 얻고, 이들 세포를 적합한 배지에서 배양한다. 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된(established) 간엽줄기세포를 수득한다. 상기 과정에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modifA ation of Eagle's medium, Dulbecco, R.et al., VirProcy 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mo, h's MB752/1 (Waymo, h, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol.Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다. 배지 및 배양에 대한 일반적인 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

간엽줄기세포의 확인은, 예컨대, 유세포 분석을 통하여 할 수 있다. 이러한 유세포 분석은, 간엽줄기세포의 특이한 표면 마커를 이용하여 실시된다. 예컨대, 간엽줄기세포는 CD44, CD29 및/또는 MHC 클래스 I에 대하여 양성 반응을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 간엽줄기세포는 표면 마커 CD44, CD29 및 MHC 클래스 I에 대하여 양성 반응을 나타내며, CD14, CD34, CD45, CD54, MHC 클래스 Ⅱ 및 CD11b에 대해서는 음성 반응을 나타낸다. 줄기세포와 표면 마커를 언급하면서 사용되는 용어“양성 반응”은 표면 마커에 대한 항체를 줄기세포에 처리하는 경우, 줄기세포의 표면 항원과 특이적으로 결합하는 양상을 의미한다.

본 발명의 간엽줄기세포는 자가면역질환을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 치료 또는 이식거부반응의 억제에 효과적으로 사용될 수 있다. 자가면역질환 또는 염증성 질환은 자가면역성 간염, 만성 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 궤양성 대장염, 크론병, 다발성 경화증, 자가면역성 심근염, 피부경화증, 중증근육무력증, 다발성 근육염/피부 근육염, 하시모토병, 자가면역 혈구감소증, 쇼그렌 증후군, 루푸스, 혈관염 증후군 및 전신홍반루푸스 대사비만 질환 및 이식거부 반응을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 “면역질환”은 포유류 면역계의 구성 성분에 의해 야기, 또는 매개된 포유류의 병리상태이다. 면역 반응의 자극 또는 중단으로 인한 질환을 포함할 수 있는데, 본원은 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환 예를 들면, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection) 반응을 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 “자가면역질환”이란 자기관용의 유도 또는 계속적 유지에 문제가 발생하여, 자기항원에 대한 면역반응이 일어나고, 이로 인해 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 “염증성 질환”이란 염증유발인자 또는 방사선 조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-(tumor necrosis factor-), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증 유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

또한 본원은 이식거부반응의 억제에도 사용될 수 있는데, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 또는 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다.

특히 본원에서 자가면역질환의 예는 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, Churg-Strauss 증후군, 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성복합한냉글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결정성 다발동맥염, 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마글로불린혈증, 일차성 담증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 자가면역질환은 류마티스 관절염, 타입 I 당뇨병, 다발성 경화증, 전신성 홍반 루푸스 및 아토피를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 자가면역 질환의 치료 또는 이식된 조직, 기관 또는 세포에 대해 면역 거부 반응을 억제하는 데 유용하다. 또한 본 발명의 조성물은 수용자의 상태를 악화 또는 심화시키는 것을 예방하는데 효과적이다. 예를 들어, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 즉 타입 I 당뇨병은 인슐린을 분비하는 랑게르한스 샘의 베타 세포에 대한 자가면역 반응으로부터의 결과인 것으로 믿어지는 자가 면역 질환이다. 랑게르한스 샘의 베타 세포의 완전한 파괴 전에 IDDM의 초기 단계로 고통받는 수용자의 치료는 잔존하는 인슐린 분비베타 세포의 추가의 파괴를 예방하거나 또는 억제하기 때문에, 질병이 더욱 진전하는 것을 예방하는데 유용하다.

본 발명에서 사용되는 용어“수용체”란 면역 질환으로부터 고통받거나 또는 이식된 조직 또는 기관의 면역거부 위험이 있는 동물을 의미하며, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류 동물을 의미하며, 가장 바람직하게는 인간이다. 표준 임상 시험 및 실험실 시험 및 방법에 근거하여, 당업자로서 참석한 진단 전문 의사는 면역반응 억제의 치료 또는 예방이 필요한 수용자를 쉽게 판정할 수 있다.

본 발명의 조성물은 면역조절 B 세포의 생성을 촉진하고, 항체 생산 B 세포의 활성을 억제하여, 그 효과를 달성한다. 본 발명의 조성물에 의해 생성이 촉진된 면역조절 B 세포는 조절성 사이토카인인 IL-10 및 TGF-베타의 생성을 통해, 또는 직접 병적 T 세포와 상호작용을 통해 해로운 면역반응을 억제할 수 있다.

종전에는 주로 T세포 활성의 억제를 통해 면역반응을 조절하였으나, 본 발명은 이와는 달리 간엽줄기세포를 이용하여 면역조절 B 세포의 생성을 촉진하고, 항체 생산 B 세포의 활성을 억제한다는 점에서 기존과 비교하여 획기적인 방법이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구로 투여된다. 비경구로 투여되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다. 예컨대 타입 I 당뇨병에 적용되는 경우, 복강투여가 가장 바람직하고, 이는 투여된 수지상세포가 희석되지 않고 효과적으로 췌장으로 이동할 수 있기 때문이다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물이 관절염 환자에 적용되는 경우에는 정맥내 주사로 투여될 수 있지만, 가장 바람직하게는 국부적으로 관절내 주입으로 투여된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 1 x 10³ - 1 x 10¹² 세포/kg 이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

이하 본원을 하기 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 본원은 어떤 이유로든 이로 제한되지 않는다.

< 실시예 1>

간엽줄기세포 ( Mesenchymal Stem Cell , MSC ) 분화 및 마커 분석

간엽줄기세포를 분화시키기 위해 마우스의 대퇴골과 경골에서 얻어낸 골수를 10% 소태아혈청(FBS), 25mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 2g/L NaHCO₃(Sodium Bicarbonate), 1mM Sodium Pyruvate, MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X)이 포함된 배지 (Dulbecco's Modified Eagles Medium, DMEM)를 이용하여 5% CO₂ 및 37℃에서 배양하고, 이어 5-7일 후 세포가 완전히 포화된 상태가 되면 계대배양 하고 배양 중 일정간격으로 세포의 형태학적 변화를 현미경을 통하여 관찰하였다. 계대가 10 이상이 되면, 분리해낸 간엽줄기세포가 줄기세포의 특성을 나타내는 세포표면 항원을 표현하고 있는지 조사하였으며, 이를 위해 형광이 라벨된 CD 마커를 세포와 반응시킨 후 유세포 분석(FACS Calibur, BD Biosciences)을 제조자의 제시 방법대로 수행하였다.

그 결과, 도 1에 기재된 바와 같이 배양된 세포는 중간엽 세포의 표면 항원인 CD29, CD44, Sca-1에 대한 양성반응과 조혈모세포의 표면 항원인 CD34와 CD45에 대한 음성반응을 나타냄을 확인할 수 있었고, 이를 통하여 분리된 간엽줄기세포가 줄기세포의 특성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2>

간엽줄기세포에 의한 IL -10 생산 B 세포 유도조건 확립

인간지방조직 유래 간엽줄기세포를 이용하여 IL-10 생산 B (B10) 세포가 증가되는 조건을 관찰하기 위해 간엽줄기세포(MSC)와 Balb/c 마우스의 비장세포를 48시간 동안 공조배양하였다. 이때 IL-10 생산을 증가시키기 위하여 LPS(Lipopolysaccharide)를 10㎍/ml 추가하여 IL-10 생산 B 세포를 활성화 시켰다. 세포 배양 후, 형광 표지된 CD19, CD1d, CD5 항체를 세포와 반응시켜 세포를 염색한 뒤, 비특이적 반응을 제거하기 위하여 FACS 버퍼를 이용하여 세척하였다. 그 후, 세포 내 구멍을 내어 세포 내 IL-10 양을 형광 항체로 표지하여 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. IL-10을 생산하는 B세포 (B10)의 증가를 관찰하고, 특히 조절 B 세포 (Regulatory B Cell, Breg)의 마커를 갖는 CD1d⁺CD5⁺CD19⁺ B 세포의 집단에서 IL-10 생산이 증가되는지 관찰하였다.

그 결과, 공조배양시 간엽줄기세포(MSC)의 비율이 증가될수록 B10 세포 내 IL-10의 생산이 5% 정도(약 6배) 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, 조절 B(Breg) 세포 내 IL-10의 생산 또한 45% 까지(약 5배) 증가되는 것을 확인할 수 있었다. (도 2A).

한편, LPS(10㎍/ml)로 자극 한 경우, 간엽줄기세포(MSC)와의 공조 배양에 의해 B10 세포와 조절 B(Breg) 세포 모두에서 IL-10의 생산이 더욱 현저하게 증가되었음을 확인할 수 있었다(도 2B).

< 실시예 3>

간엽줄기세포와 공조배양된 조절 B 세포의 IgG 수치 변화

간엽줄기세포(MSC)에 의해 IL-10의 생산이 증가된 조절 B(Breg) 세포 배양조건에서 anti-IgG, IgG1,IgG2a 항체를 이용하여 ELISA를 통해 IgG, IgG1, IgG2a의 농도를 측정해 보았다.

그 결과, 이들 간엽줄기세포(MSC)에 의해 IgG,IgG2a 생산이 의미있게 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(도 3). 반면에 Th2 면역반응을 나타내는 IgG1의 발현은 간엽줄기세포(MSC)에 의해 의미있게 증가되는 것을 관찰할 수 있었는데, 이는 간엽줄기세포(MSC)를 포함하는 조성물이 Th1을 매개로 하는 자가면역질환 및 염증 반응 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 결과이다.

< 실시예 4>

간엽줄기세포 ( MSC ) 주입에 의한 루푸스 ( Lupus ) 치료 효과 규명

로퀸(Roquin) 유전자가 돌연변이된 마우스 모델은 ICOS(inducible costimulator) 과발현으로 인한 Tfh 세포의 활성 유도와 배 중심(Germinal center response) 반응이 증가되어 자가항체가 과분비되어 루푸스와 유사한 증상을 나타내는 마우스 모델이다. 이러한 마우스 모델을 이용하여 간엽줄기세포(MSC)에 의한 in vivo 질병치료효과를 관찰하기 위해, 간엽줄기세포(MSC) 주입 후 질병의 활성도를 측정해보았다.

이를 위하여 마우스 모델의 비장 및 신장 조직을 절편으로 분리한 후 헤마톡실린/에오신(hematoxylin/eosin) 염색을 수행하였다.

그 결과, 간엽줄기세포(MSC) 주입마우스는 대조군 마우스에 비해 배 중심(Germinal center) 및 조직 내 면역세포(immune cell)의 침투(infiltration)가 감소되어 있음을 확인할 수 있었다(도 4A) 한편, 간엽줄기세포(MSC) 주입 마우스는 항체분비세포인 플라스마 세포(plasma cell)의 빈도도 감소되어 있음을 확인할 수 있었다(도 4B). 또한 간엽줄기세포(MSC)를 주입한 마우스 모델에서는 혈청 내 IgG, IgG1, IgE, IgM등의 항체분비와 자가항체인 dsDNA 양 또한 의미있게 감소되어 있음을 확인할 수 있었다(도 4C, 4D).

< 실시예 5>

간엽줄기세포 ( MSC ) 주입에 의한 루푸스 치료 기전 조사

상기 실시예 4에서 루푸스 마우스 모델에서 간엽줄기세포(MSC) 주입에 의한 루푸스 치료효과와 관련하여, 항체조절기전을 조사하기 위해 마우스 내 면역세포(immune cell)의 활성정도를 유세포 분석을 통해 조사해보았다.

그 결과, 간엽줄기세포(MSC)가 주입된 마우스 모델에서는 병인세포인 Th1,Th17가 감소된 반면, Foxp3+ Treg은 의미있게 증가되어 있음을 확인할 수 있었으며(도 5A), 로퀸(Roquin) 유전자가 돌연변이된 마우스 모델 내에서 활성화되어 있는 Tfh 세포 또한 의미 있게 감소됨을 확인할 수 있었다(도 5B). 뿐만 아니라 간엽줄기세포(MSC) 주입에 의해 CD5⁺CD1d⁺ Breg의 수적 증가와 이들 세포 내 IL-10 레벨도 의미 있게 증가되어 있음을 확인하였다(도 5C). 한편, 본 발명자들은 간엽줄기세포(MSC) 주입에 의한 항체조절은 항체 분비세포인 소포성 B 세포(Follicular B cell)의 감소와 조절 B세포인 가장자리 구역 B 세포(Marginla zone B cell)의 증가 및 플라스마 세포(Plasma cell)의 감소를 확인할 수 있었다(도 5D).

이제까지 본 발명에 대하여 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

간엽줄기세포를 포함하는 자가면역 질환 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 면역조절 B 세포의 생성을 촉진 또는 활성을 증가시키거나 항체 생산 B 세포의 생성을 저해 또는 활성을 감소시켜 자가면역 질환의 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 치료용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 면역조절 B 세포는 B reg 또는 B 10 세포인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 치료용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 B reg 세포는 CD19+CD1d+CD5+ B 세포 또는 가장자리 구역 B 세포(marginal zone B cell)인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 치료용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 면역조절 B세포는 인터루킨 10의 생산을 증가시켜 자가면역 질환의 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 간엽줄기세포는 리포폴리사카라이드(LPS)로 처리된 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 간엽줄기세포는 자가유래인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 간엽줄기세포는 인간지방조직 유래인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 Th1 또는 Th17 세포의 생성을 저해하고 T reg 세포의 생성을 촉진시키며, Tfh(Follicular B helper T cell) 세포의 생성을 저해킴으로써 자가면역 질환의 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 자가면역질환 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 자가면역질환은 루푸스인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 치료용 조성물.