KR20200053992A

KR20200053992A - 단백질 키나아제 c 활성화제로 처리된 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20200053992A
Application number: KR1020180137578A
Authority: KR
Inventors: 김경숙; 이태용
Original assignee: 코아스템(주)
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2020-05-19
Also published as: EP3878458A1; JP2022512987A; KR102180111B1; US20220062345A1; EP3878458A4; WO2020096340A1; JP7277582B2

Abstract

본 발명은 단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)로 처리된 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 B 세포의 기능을 억제할 수 있어 자가면역질환의 예방 또는 치료 효과가 우수한, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

단백질 키나아제 C 활성화제로 처리된 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING STEM CELLS TREATED WITH PROTEIN KINASE C ACTIVATOR OR CULTURE THEREOF FOR PREVENTION AND TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES}

줄기세포(stem cell)란 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하여 일컫는 말이며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

이러한 줄기세포의 다분화성은 인간의 발생과정의 연구를 위한 좋은 실험 모델(in vitro model)을 제공한다. 줄기세포로부터 얻은 균질한 사람의 조직이나, 세포를 대상으로 약물검사, 독성검사를 수행하면 신약개발이 용이해 질 수 있다. 나아가 훼손된 조직을 대체할 수 있는 세포나 조직을 다량으로 얻을 수 있게 되어 난치성 질병의 치료에 이용할 수 있다.

중간엽줄기세포는 줄기세포능(stemness)과 자기재생능(self renewal)을 유지하고 다양한 간엽조직으로 분화할 수 있는 능력 (plasticity)이 있는 세포이다. 골수(bone marrow), 지방조직(adipose tissue), 재대혈(umbilical cord blood), 활막(synovial membrane), 골조직(trabecular bone), 슬개건하 지방(infrapatellar fat pad) 등에서 추출할 수 있다. 중간엽줄기세포는 T 림프구, B 림프구의 활성, 증식을 억제하며, 자연살해세포(natural killer cell, NK cell)의 활성을 억제하고, 수지상세포(dendritic cell)와 대식세포(macrophage)의 기능을 조절하는 면역조절 능력을 가지고 있으므로 동종이식(allotransplantation)과 이종이식(xenotransplantation)이 가능한 세포이다. 또한 중간엽줄기세포는 연골, 골조직, 인대, 골수기질 등 다양한 결합조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진다. 특히 지방조직에서 유래한 지방유래 중간엽줄기세포는 ASC(adipose-derived stem/stromal cell)이나 ADAS(adipose-derived adult stem cell) 등의 이름으로 세분화되며 외상이나, 종양 제거 수술, 화상 등에 의해 생긴 연부조직결손을 치료할 생체 재료 생산에 응용될 수 있다.

한편 루푸스는 비정상적인 면역반응으로는 자가항원에 의하여 수지상세포, T 세포 그리고 B 세포를 활성화시킨다. 그러므로 자가항체가 생성되고, 자기항원과 면역 복합체를 형성하여 다양한 장기를 침범하여 증상이 나타난다. 이러한 루푸스 질병을 치료하고자 다양하게 치료제가 개발되고 있으며, 특히 면역조절작용을 갖고 있는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)가 유망한 치료제로 연구되고 있다. MSC는 T 세포의 기능을 억제한다고 보고되었으나, B 세포의 기능을 억제할 수 있는 MSC 대한 연구는 부족한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2015-0144679호

본 발명은, 단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)로 처리된 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 줄기세포에 단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 면역억제제의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)로 처리된 줄기세포 또는 그 배양물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 피험체의 면역반응을 억제하는 방법을 제공한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은, 단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)로 처리된 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 단백질 키나아제 C 활성화제는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate), 인게놀 3-안젤레이트(Ingenol 3-Angelate) 브리오스타틴-1(Bryostatin-1), 포르볼-12,13-다이부티레이트(phorbol-12,13-dibutyrate), 프로스타틴(Prostratin), N-(6-페닐헥실)-5-클로로-1-나프탈렌술폰아미드(SC-9) 및 5-클로로-N-헵틸나프탈렌-1-술폰아미드(SC-10)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다

상기 줄기세포는 성체줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells) 또는 배아줄기세포일 수 있다.

상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell) 또는 다분화능 줄기세포일 수 있다.

상기 단백질 키나아제 C 활성화제는 줄기세포의 CXCL10의 발현을 증가시킬 수 있다.

상기 단백질 키나아제 C 활성화제는 줄기세포의 PD-L1(programmed death-ligand 1) 발현을 증가시킴으로써 B 세포의 세포사멸을 증가시킬 수 있다.

상기 자가면역질환은 루푸스(전신 홍반성 낭창), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 전신성 경피증(Progressive systemic sclerosis,Scleroderma), 아토피 피부염, 원형탈모증(alopecia areata), 건선, 천포창, 천식, 아프타구내염, 만성 갑상선염, 염증성 장염, 베체씨병(Behcet's disease), 크론씨병, 피부근염(dermatomyositis), 다발성 근염(polymyositis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 그레이브씨 갑상선 항진증(Grave's disease), 결절성 다발성 동맥염(Polyarteritis nodosa), 강직성 척추염(Ankylosing spondylitis), 섬유조직염(Fibromyalgia syndrome) 및 측두동맥염(Temporal arteritis)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

또한 본 발명은, 상기 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에 따른 줄기세포 또는 이의 배양물은 자가면역질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)로 처리된 줄기세포 또는 이의 배양물은 B 세포의 기능을 억제할 수 있는 바, 자가면역질환의 예방 또는 치료 효과가 우수하다.

도 1은 PMA-처리된(treated) MSC가 B 세포 기능에 미치는 영향을 분석한 것이다. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 [일원 분산분석(one-way ANOVA), Tukey's 시험]
도 2는 PMA-처리된 MSC가 B 세포 이동에 미치는 영향을 분석한 것이다. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 [일원 분산분석(one-way ANOVA), Tukey's 시험]
도 3은 PMA-처리된 MSC가 B 세포 접촉에 미치는 영향을 분석한 것이다. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 [일원 분산분석(one-way ANOVA), Tukey's 시험]
도 4는 PMA-처리된 MSC에서 발현하는 PDL1이 B 세포 기능에 미치는 영향을 분석한 것이다. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 [일원 분산분석(one-way ANOVA), Tukey's 시험]
도 5는 PMA-처리된 MSC에서 발현하는 PDL1이 B 세포 세포사멸에 미치는 영향을 분석한 것이다. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 [일원 분산분석(one-way ANOVA), Tukey's 시험]
도 6은 PMA-처리된 hMSC 투여에 의한 MRL/lpr 마우스의 치료효과를 확인한 것이다. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 [일원 분산분석(one-way ANOVA), Tukey's 시험]
도 7은 PMA-처리된 hMSC 투여에 의한 MRL/lpr 마우스의 신장(kidney) 내 면역세포를 분석한 것이다. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 [일원 분산분석(one-way ANOVA), Tukey's 시험]

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)로 처리된 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "줄기세포"는 다양한 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 '미분화세포'일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 성체줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells) 또는 배아줄기세포일 수 있다.

상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 조직으로부터 유래된 것일 수 있다. 또한 상기 성체줄기세포는 중간엽줄기세포, 중간엽기질세포(mesenchymal stromal cell) 또는 다분화능 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽줄기세포일 수 있다. 각 조직에서 줄기세포를 얻는 방법은 종래 당업계에 공지된 방법에 의할 수 있으며, 본 발명의 실시예의 방법에 한정되지 않는다.

본 발명에서 "배양물"은 줄기세포를 포함한 세포 배양액, 세포 배양액으로부터 줄기세포를 제거한 배양상등액, 및 이들의 희석액을 모두 포함할 수 있다. 상기 배양물의 조성은 통상의 줄기세포 배양에 필요한 성분뿐만 아니라, 줄기세포 증식에 상승적으로 작용을 하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.

상기 줄기세포의 배양에 사용되는 배지로서는 당업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 알려져 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있는데, 예를 들면 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 또는 Keratinocyte-SFM(Keratinocyte serum free medium)을 사용할 수 있다.

상기 줄기세포 배지는 첨가제로 보충될 수 있다. 일반적으로, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 단백질 키나아제 C 활성화제는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA), 인게놀 3-안젤레이트(Ingenol 3-Angelate, I3A), 브리오스타틴-1(Bryostatin-1), 포르볼-12,13-다이부티레이트(phorbol-12,13-dibutyrate, PDBu), 프로스타틴(Prostratin), SC-9 (N-(6-Phenylhexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulfonamide, CAS No. 102649-78-5) 및 SC-10 (5-Chloro-N-heptylnaphthalene-1-sulfonamide, CAS No. 102649-79-6)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 단백질 키나아제 C 활성화제의 처리 농도는 1~20μg/ml일 수 있다. 상기 단백질 키나아제 C 활성화제의 처리 시간은 1~120시간일 수 있다.

상기 단백질 키나아제 C 활성화제는 줄기세포의 CXCL10의 발현을 증가시켜 B 세포 이동을 증가시킴으로써 접촉-의존성 억제(contact-dependent inhibition) 효과를 증가시킬 수 있다. 또한 상기 단백질 키나아제 C 활성화제는 줄기세포의 PD-L1(programmed death-ligand 1) 발현을 증가시켜 B 세포의 세포사멸(apoptosis)를 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따라, 단백질 키나아제 C(protein kinase C) 활성화제로 처리된 중간엽줄기세포는 B 세포의 기능을 억제할 수 있는 바, 본 발명에 따른 줄기세포 및 그 배양물은 자가면역질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 "예방"은 상기 조성물의 투여로 자가면역질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여로 자가면역질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 줄기세포 또는 이의 배양물은 1㎖ 당 1.0×10⁵개 내지 1.0×10⁹개, 바람직하게는 1.0×10⁶ 개 내지 1.0×10⁸개, 보다 바람직하게는 1.0×10⁷개의 세포를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 줄기세포 또는 이의 배양물은 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife) 세포 동결 배지(Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다.

본 발명의 용어 "개체"란 자가면역질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 줄기세포 또는 이의 배양물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터 (Baxter), 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 메드셉 (Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠 (National Hospital Products) 또는 테루모(Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.

상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

이렇게 제조된 본 발명에 따른 줄기세포, 이의 배양물 또는 약학적 제제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 바람직하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 조혈계 줄기세포 이식의 일반적 방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.

상기 줄기세포의 1일 투여량은 1.0×10⁴내지 1.0×10¹⁰세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0×10⁵ 내지 1.0×10⁹세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)로 처리된 줄기세포 및 그 배양물을 투여함으로써 자가면역반응을 억제할 수 있는바, 본 발명은 단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)로 처리된 줄기세포 또는 그 배양물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 피험체의 면역반응을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 "피험체"란 소, 개, 돼지, 닭, 양, 말, 인간을 포함한 포유동물을 의미하나 이에 제한되는 것은 아니다. 아울러, 바람직하게는 단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)가 첨가된 줄기세포 또는 그 배양물의 투여는 복강 또는 혈관 내 투여, 병변으로의 직접 투여 또는 관절의 활강(Synovial cavity) 내 투여 등일 수 있다.

상기 면역반응의 억제는 면역질환의 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 줄기세포에 단백질 키나아제 C 활성화제를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 면역억제제의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 "면역억제제"란 상기에서 설명한 바와 같이, 줄기세포에 단백질 키나아제 C 활성화제를 처리하여 수득한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 제제로 면역반응을 억제하여 자가면역질환을 치료할 수 있는 제제를 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.

루푸스는 비정상적인 면역반응으로는 자가항원에 의하여 수지상세포, T 세포 그리고 B 세포를 활성화시킨다. 이에 따라 자가항체가 생성되고, 자기항원과 면역 복합체를 형성하여 다양한 장기를 침범하여 증상이 나타난다. 이런 루푸스 질병을 치료하고자 다양하게 치료제가 개발되고 있고 면역조절작용을 갖고 있는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)가 유망한 치료제로 연구되고 있다. MSC는 T 세포의 기능을 억제한다고 보고되었다. 그러나 MSC가 B 세포의 기능을 억제하는지 여부는 명확히 확인된 바 없다. 이에 본 발명자들은 하기 실시예를 통하여 human MSC가 human B세포의 기능을 억제하는지에 대하여 확인하였다.

본 발명자들은 예비실험을 통하여 인간(human) MSC가 인간 B 세포의 IgM 생성을 억제하지 못하고 약하게 증가시키고 있음을 확인하였다. 본 발명자들은 인간 B 세포 기능을 억제시키는 인간 MSC를 제조하기 위하여 20여종의 케미칼(chemical)을 인간 MSC에 처리하였다. 스크리닝을 통하여 단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)인 프르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA)가 인간 MSC를 활성화시키고 궁극적으로 인간 B 세포 기능을 억제하는 것을 확인하였고, 단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)가 인간 MSC를 활성화시키는 작용기전을 규명하였다.

<실시예>

재료 및 실험방법

재료

MRL/lpr 마우스는 미국 Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA)에서 구입하였다. 마우스는 12 시간의 명암주기(12 h light/dark cycle) 하에서 21 ~ 24 ℃ 및 40 ~ 60 % 상대 습도 조건의 특정 병원균이 없는 상태로 보관되었다.

Human MSC(mesenchymal stem cell)는 인간의 경골(tibiae) 및 대퇴골(femurs)의 BM(Bone marrow) 세포에서 수득하였다. BM 세포는 10 % 소태아혈청(FBS,fetal bovine serum), 2 mM L-글루타민(L-glutamine) 및 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 포함하는 α-MEM 배지에서 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 비부착성 세포(non-adherent cells)를 1일차에 제거하고 부착 세포를 3일마다 배지를 보충(medium replenishment)하여 배양한 후 17 일에서 20일 사이에 사용하였다.

CXCL10, CXCL12, CCL2-녹다운(knockdown) hMSC는 siRNA(small interfering RNA)(Bioneer에서 제작, Korea)라 불리는 12-21 mer의 dsRNA에 의해서 서열 특이적으로 유전자 발현이 억제되는 현상을 이용하여, 48시간 동안 배양하여 녹다운(knockdown) 반응을 유도하였다.

hMSC를 전처리조건에 사용된 물질로서, PMA(10ng/㎖, 24시간 처리, sigma), I3A(10㎍/㎖, 24시간 처리 sigma), IFN-γ(10ng/㎖, 7일 처리, sigma)를 사용하였다.

ELISA

IFN-γ측정은 R&D(#DY285-05)에서 제공된 시험방법에 따라 진행하였으며, IgM은 IgM ELISA kit(ebioscience, Vienna, Austria)를 이용하여 측정하였다. ELISA 용 96 웰(well)에 포획 항체(capture antibody)와 코팅 버퍼(coating buffer)를 1:250 비율로 희석하여 4 ℃에서 18시간 코팅하였다. 200 ㎕의 세척 용액(wash solution)을 이용하여 2번 세척하고 블로킹 버퍼(blocking buffer) 250 ㎕를 웰(well)에 넣은 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후 200 ㎕의 세척 용액을 이용하여 2번 세척하고, 시료를 어세이 버퍼(assay buffer)(1X)에 희석하여 샘플을 준비하였다. 각 웰(well)에 어세이 버퍼 (1x) 90 ㎕, detection-antibody 50 ㎕ 및 standard 또는 sample 10 ㎕을 넣고 실온에서 3시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 세척 용액을 이용하여 세척하였다. 기질용액(Substrate solution) 100 ㎕을 각 웰(well)에 넣은 후 5분 반응시키고 stop solution 100 ㎕을 넣어 반응을 중지시켰다. 마지막으로 450nm ~ 570nm로 값을 측정하였다.

웨스턴블랏(western blot)

세포 용해 버퍼(Cell lysis buffer; Cell signaling technology, Danvers, MA, USA)를 이용하여 세포를 얼음(ice)에 놓은 상태로 용해하였다. 4 ℃에서 12000 rpm으로 15분 동안 원심분리하여 단백질을 얻었다. 브래드포드(Bradford) 시약을 이용하여 단백질을 정량하여 20 ㎍의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)을 이용하여 75Ⅴ로 전기영동을 실시하였다. SDS-폴리아크릴아미드 겔을 95Ⅴ에서 90분간 PVDF 멤브레인(membrane)으로 옮긴 후 0.5% Tween 20이 포함된 TBS(TTBS)에 5% 탈지 분유(nonfat dry milk)를 첨가하여 1시간 블로킹(blocking)하였다. 블로킹(Blocking) 후, 1차 항체가 포함된 5% BSA/TTBS에 멤브레인(membrane)을 넣고 4℃에서 하루 동안 쉐이킹(shaking) 해주었다. 다음날 TTBS로 멤브레인을 세척한 후, 2차 항체가 들어있는 5% BSA/TTBS에 멤브레인을 넣어 상온에서 90분 동안 2차 항체를 붙여주었다. TTBS로 멤브레인을 세척하고 ECL(Enhanced Chemiluminescence, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)과 membrane을 반응시킨 후, Chemi Doc^TMXRS⁺machine(Bio-Rad,CA,USA)을 이용하여 단백질 발현 정도를 측정하였다.

트리졸 방법(Trizol method)를 이용한 RNA 분리

Cell이 70~80%의 컨플루언시(confluency)가 된 시점에서 Trypsin-EDTA(Gibco) 0.125%로 처리한 후 5% CO₂, 37 ℃ 조건 하에 배양하였다. 물질 처리 24시간 후, 세포를 회수하여 TRIZOL reagent(Invitrogen, MD, USA)를 이용하여 총(total) RNA를 세포(cell)로부터 분리하였고, 260 nm에서 흡광도 측정을 통해 총 RNA(total RNA)를 정량하였다.

역전사 효소(Reverse transcriptase)-PCR

총(total) RNA 0.3 ㎍의 농도를 이용하였으며, 42 ℃에서 1시간, 95 ℃에서 5분간 합성하였다. 합성된 cDNA 3 ㎕와 프라이머(primer) 10 pM를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이 반응의 기본 과정은 pre-denaturing phase 단계를 94 ℃ 5분 수행하고, denaturing phase, 94 ℃ 30초, annealing phase, 56 ℃ 30초, elongation phase, 72 ℃ 1분을 수행하고 post-elongation phase를 72 ℃에서 5분 조건으로 실시하였다. 1% 아가로스 겔(agarose gel)을 만들어 전기영동을 실시하였다.

RT-PCR

FasL, PD-L1, PD-L2, ICAM1, VCAM1, β-actin, IFN-γ, TNF-α, IL-12, COX-2, iNOS, IDO, TGF-β ,CCL2, CCL3, CXCL10, CXCL12에 대한 mRNA의 발현 수준을 qPCR(quantitative real-time PCR)을 통하여 분석하였다. 각 샘플의 상대적 mRNA 양은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 β-actin의 Ct(threshold cycle)와 비교한 임계주기(threshold cycle, Ct)를 기준으로 계산되었다.

아넥신 V 염색(annexin V staining)

차가운 PBS로 두 번 세로를 세척 후에 바인딩 버퍼(Binding buffer)에 1x10⁶ cell/ml농도로 세포를 풀어주었다. 그 후에 5ml 컬처 튜브(culture tube)에 100 ㎕의 양을 옮긴후 5 ㎕양의 Annexin Ⅴ Apoptosis Detection Kit(BD Pharmingen, USA)를 이용하여 25℃, 상온, 어두운 조건에서 15분간 인큐베이션(incubation) 과정을 거쳐서 세포를 염색하였다. 그 후 400 ㎕ 바인딩 버퍼(Binding Buffer) 용액을 첨가한 후에 flow cytometry(CantoⅡ, BD Bioscience)를 이용하여 측정하였다.

프라이머 서열정보

사용된 프라이머 정보는 다음과 같다. CCL2 forward primer 5-'ATG AAA GTC TCT GCC GCC CTT CTG T-3', CCL2 reverse primer 5-'AGT CTT CGG AGT TTG GGT TTG CTT G-3', CCL3 forward primer 5'-ATG CAG GTC TCC ACT GCT GCC CTT-3', CCL3 reverse primer 5'-GCA CTC AGC TCC AGG TCG CTG ACA T-3', CXCL10 forward primer 5'-CCT GCT TCA AAT ATT TCC CT-3', CXCL10 reverse primer 5'-CCT TCC TGT ATG TGT TTG GA-3', CXCL12 forward primer 5'-ATG AAC GCC AAG GTC GTG GTC G-3', CXCL12 reverse primer 5'-TGT TGT TGT TCT TCA GCC G-3', COX-2 forward primer 5'-TCC TTG CTG TTC CCA CCC AT-3', COX-2 reverse primer 5'-CAT CAT CAG ACC AGG CAC CA-3', iNOS forward primer 5'-ACG TGC GTT ACT CCA CCA AC-3', iNOS reverse primer 5'-CAT AGC GGA TGA GCT GAG CA-3', IDO forward primer 5'-AGCC TGA TCT CAT AGA GTC TG-3', IDO reverse primer 5'-TTA CTG CAG TCT CCA TCA CG-3', TGF-β forward primer 5'-CAG ATC CTG TCC AAG CTG-3', TGF-β reverse primer 5'-TCG GAG CTC TGA TGT GTT-3', FasL forward primer 5'-GGA TTG GGC CTG GGG ATG TTT CA-3', FasL reverse primer 5'-TTG TGG CTC AGG GGC AGG TTG TTG-3', PD-L1 forward primer 5'-TTG GGA AAT GGA GGA TAA GA-3', PD-L1 reverse primer 5'-GGA TGT GCC AGA GGT AGT TCT-3', PD-L2 forward primer 5'-ACA CCG TGA AAG AGC C-3', PD-L2 reverse primer 5'-AAT GTG AAG CAG CCA AG-3', ICAM1 forward primer 5'-CGT GCC GCA CTG AAC TGG AC-3', ICAM1 reverse primer 5'-CCT CAC ACT TCA CTG TCA CCT-3', VCAM1 forward primer 5'-ATG ACA TGC TTG AGC CAG G-3', VCAM1 reverse primer 5'-GTG TCT CCT TCT TTG ACA CT-3', β-actin forward primer 5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3', β-actin reverse primer 5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GA-3'. 사용된 마우스 프라이머는 INF-γ forward primer 5'-AGC GGC TGA CTG AAC TCA GAT TGT AG-3', INF-γ reverse primer 5'-GTC ACA GTT TTC AGC TGT ATA GGG-3', TNF-α forward primer 5'-AGG TTC TGT CCC TTT CAC TCA CTG -3', TNF-α reverse primer 5'-AGA GAA CCT GGG AGT CAA GGT A-3', IL-12 forward primer 5'-AGA GGT GGA CTG GAC TCC CGA -3', IL-12 reverse primer 5'-TTT GGT GCT TCA CAC TTC AG-3', β-actin forward primer 5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C -3', β-actin reverse primer 5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAACAG TCC G-3'이다.

타임-랩스 이미징(Time-lapse imaging)

세포이동 확인을 위한 이미지 촬영을 위해 Culture-insert m-dish^35mm (ibidi GmbH, Martinsried, Germany)를 이용하여, 왼쪽에는 MSC(70 ㎖, 0.3x10⁶ cells/㎖)를 seeding하고, 오른쪽은 B 세포70 ㎖, 3x10⁶ cells/㎖)를 seeding하였다. 세포가 안정화되면 insert를 제거한 후 Biostation IM-Q(Nikon, Toyko,Japan)를 이용하여 촬영하였다. 이 실험은 3시간 ~ 6시간 동안 2분 간격으로 촬영을 실시하며 데이터 분석은 Imaris 7.2 software(Bitplane Inc, South Windor, CT USA)를 이용하였다.

케모탁시스 어세이(Chemotaxis assay)

B 세포의 이동은 5 ㎛ insert upper well이 있는 24-transwell plates(Costar, Corning, NY, USA)를 이용하였다. PBMC에서 분리한 B 세포(1x10⁵ cells/well, upper chamber)와 I3A-treated hMSC(1x10³ cells/well, lower chamber)를 ODN과 함께 72시간 동안 트랜스웰(transwell)을 이용하여 공동배양을 실시하였다. 상층액 안에 있는 IgM의 수준을 ELISA를 통하여 측정하였다.

통계 분석

실험 데이터 통계분석은 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA, USA)소프트웨어를 이용하여 분석을 실시하였다.

실시예 1. PMA-처리된(treated) MSC가 B 세포 기능에 미치는 영향 분석

PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)에서 분리한 B 세포 (1 × 10⁵cells/well)와 PMA-처리된(treated) hMSC (1 × 10³cells/well)를 CpG ODN (oligodeoxynucleotides, 5 ㎍/㎖)와 함께 72시간 동안 공동배양을 실시한 후, 상층액 안에 있는 IgM의 수준을 ELISA를 통하여 측정하였다(도 1의 A). PBMC에서 분리한 T 세포 (1 × 10⁵cells/well)와 PMA-처리된 hMSC (1 × 10³cells/well)를 PHA(phytohemagglutinin, 5 ug/ml)와 함께 72시간 동안 공동배양을 하고, 상층액 안에 있는 IFN-γ의 수준을 ELISA를 통하여 측정하였다(도 1의 B). PBMC에서 분리한 B 세포 (1 × 10⁵cells/well)와 IFN-γ 처리된 hMSC (1 × 10³cells/well)를 ODN과 함께 72시간 동안 공동배양한 후, 상층액 안에 있는 IgM의 수준을 ELISA를 통하여 측정하였다(도 1의 C). PBMC에서 분리한 B 세포 (1 × 10⁵cells/well)와 I3A-처리된(treated) hMSC (1 × 10³cells/well)를 ODN과 함께 72시간 동안 공동배양을 실시하고, 상층액 안에 있는 IgM의 수준을 ELISA를 통하여 측정하였다(도 1의D). PBMC에서 분리한 B 세포 (1 × 10⁵cells/well)와 PMA-처리된 hMSC (1 × 10³cells/well)를 ODN과 함께 72시간 동안 트랜스웰(transwell)을 이용하여 공동배양을 실시하고, 상층액 안에 있는 IgM의 수준을 ELISA를 통하여 측정하였다(도 1의 E).

나이브(naive) MSC는 B cell의 IgM 생성을 억제하지 못하였지만, PMA-처리된 MSC는 B 세포의 IgM 생성을 억제하였다(도 1의 A). MSC는 T 세포의 IFN-γ 생성을 약 50% 억제하였고, PMA-처리 MSC는 T 세포의 IFN-γ 생성을 77% 억제하였다(도 1의 B). IFN-γ는 MSC의 면역억제능을 강화시킨다는 보고가 있는 바 10 ng/ml의 IFN-γ를 7일간 처리하고 실험을 진행하였다. 실험 결과, IFN-γ-처리된 MSC는 B 세포의 IgM 생성은 오히려 증가시키는 것으로 확인되었다(도 1의 C). 또 다른 PKC 활성화제(activator)인 I3A (Ingenol 3-Angelate, 10 ug/ml)를 24시간 동안 처리하여 실험을 진행하였다. I3A-처리된 MSC는 B 세포의 IgM 생성을 억제하는 것으로 확인되었다(도 1의 D). 또한 PMA-처리된 MSC가 세포-세포 접촉(cell-cell contact)과 가용성 인자(soluble factor) 중에 어떤 방법으로 B 세포의 IgM을 억제하였는지 알아보고자 트랜스웰(transwell)을 사용하여 분석하였다. PMA-처리된 MSC는 B 세포의 IgM 생성을 억제하였지만, 트랜스웰(transwell)을 이용하여 B 세포와 PMA-처리된 MSC의 접촉(contact)을 방지하였을 때, B 세포의 IgM 생성을 억제하지 못하는 것으로 확인되었다(도 1의 E). 즉, MSC는 B 세포의 IgM 생성을 유도하나, PMA-처리된 MSC는 세포-세포 접촉(cell-cell contact)의존적으로 B 세포의 IgM 생성을 억제하는 것으로 확인되었다.

실시예 2. PMA-처리된 MSC가 B 세포 이동에 미치는 영향 분석

MSC의 케모카인을 mRNA 수준과 단백질 수준으로 각각 RT-PCR (도 2의 A)과 ELISA (도 2의 B)를 통하여 분석하였다. MSC의 CCL2, CXCL10, CXCL12를 siRNA를 이용하여 녹다운(knockdown, KD)시킨 후, mRNA 수준으로 RT-PCR을 통하여 확인하였다. 트랜스웰(Transwell)을 이용하여 MSC에 대한 B 세포의 이동(migration)을 측정하였고, 하부 웰(lower well)에는 MSC를, 상부 웰(upper well)에는 B 세포를 시딩(seeding)하고 1.5 시간 후, FACS(fluorescence activated cell sorter)를 이용하여 세포수를 카운팅(counting)하였다(도 2의 C). Culture-insert m-Dish^35mm를 이용하여 왼쪽에는 MSC (70 ml of 0.3 × 10⁶cells/ml)를 첨가하고 오른쪽은 B 세포 (70 ml of 3 × 10⁶ cells/ml)를 첨가하였고 타임-랩스 이미징(Time-lapse imaging)을 이용하여 6시간 동안 촬영한 후 대표적인 B 세포의 움직임을 그린 트랙(green track)으로 표시하였다(도 2의 D). 촬영한 무비를 시간대 별로 스냅샷(snapshot)을 찍어서 B 세포 이동을 관찰하였다(도 2의 E). 스냅샵(snapshot)의 흰 박스 안에 있는 T 세포의 수를 그래프로 표시하였다(도 2의 F).

PMA-처리 MSC는 세포-세포 접촉(cell-cell contact)으로 B 세포의 IgM을 억제하였는 바, 두 세포사이의 이동(migration) 및 접촉 동역학(contact dynamics)을 연구하였으며, 세포의 이동에 중요한 케모카인 시그널링(chemokine signaling)에 관하여 연구를 우선적으로 진행하였다. MSC가 CCL2와 CXCL12를 발현하는 것을 확인하였고, PMA를 처리하면 CXCL10의 발현이 증가하였다(도 2의 A 및 B). PMA-처리된 MSC에서 분비하는 CXCL10의 발현을 녹다운(knockdown, KD)시키면 PMA-처리된 MSC 쪽으로 B 세포가 이동하지 못함을 확인하였다(도 2의 C). 이를 다시 한번 확인하고자 이미지촬영을 진행하였다. 대조군 PMA-처리된 MSC 쪽으로 B 세포가 이동하였지만 CXCL10이 녹다운된 PMA-처리된 MSC 쪽으로는 B 세포가 이동하지 않는 것으로 확인되었다(도 2의 D 및 E). 캡쳐한 이미지의 박스에 있는 B 세포의 수를 카운팅(counting)한 결과, PMA-처리된 CXCL10-KD MSC(PMA-treated and CXCL10-KD MSC)와 같이 공동배양을 실시한 B 세포의 수가 대조군보다 적은 것으로 확인되었다(도 2의 F).

실시예 3. PMA-처리된 MSC가 B 세포 접촉에 미치는 영향 분석

Culture-Dish^35mm를 이용하여 MSC (0.2 × 10⁶cells/ml와 B 세포 (2 × 10⁶ cells/ml)를 첨가하고 타임-랩스 이미징(Time-lapse imaging)을 이용하여 3시간 동안 촬영한 후 대표적인 B 세포의 움직임을 그린 트랙(green track)으로 표시하였다(도 3의 A). 촬영한 무비를 시간대 별로 스냅샷(snapshot)을 찍어서 B 세포와 MSC의 접촉을 녹색 화살표(green arrow)로 표시하였다(도 3의 B). 시간대별로 MSC에 접촉하는 B 세포의 수를 분석하였다(도 3의 C). MSC와 접촉하지 않은 B 세포의 속도와 MSC와 접촉한 B 세포의 속도를 그래프로 표시하였다(도 3의 D). 한 개의 MSC에 접촉하는 B 세포의 수와 MSC와 B 세포가 접촉할 때의 접촉시간을 분석하였다(도 3의 E).

PMA-처리된 MSC와 B 세포의 접촉을 단일 세포(single cell) 수준에서 확인하고자 두 세포를 직접 섞어서 분석하였다. PMA-처리된 MSC를 B 세포와 섞은 후, 2분 간격으로 6시간 동안 촬영을 실시하였고, 대조군 PMA-처리된 MSC에 비하여 CXCL10이 녹다운(KD)된 PMA-처리된 MSC에 대한 B 세포가 접촉이 감소하는 것으로 확인되었다(도 3의 A). 시간대별로 보았을 때도, 대조군 PMA-처리된 MSC에 비하여, CXCL10이 녹다운된 PMA-처리된 MSC와 B 세포의 접촉은 증가되지 않았다(도 3의 B 및 C). PMA-처리된 MSC의 종류와 상관없이, PMA-처리된 MSC에 접촉하지 않은 B 세포는 약 6-7 μm/min의 속도를 보였고, 접촉하는 B 세포는 약 2-3 μm/min의 속도를 보였다(도 3의 D). 대조군인 PMA-처리된 MSC는 3시간 동안에 평균적으로 B 세포와 4번 접촉하였으며, 한번 접촉할 때마다 80분간 접촉하였다. 반면 CXCL10이 녹다운되고 PMA-처리된 MSC(CXCL10-KD PMA-treated MSC)는 3시간 동안에 평균적으로 B 세포와 2번 접촉하였으며, 한번 접촉할 때마다 89분의 시간이 소요됨을 확인하였다(도 3의 E). 즉, PMA-처리된 MSC에서 분비하는 CXCL10은 B 세포와 접촉을 조절하는 것으로 확인되었다.

실시예 4. PMA-처리된 MSC에서 발현하는 PD-L1이 B 세포 기능에 미치는 영향 분석

MSC에 PMA를 처리하고 24시간 후, 단백질을 얻고 웨스턴 블랏(western blot)을 통하여 시그널링(signaling)을 분석하였다(도 4의 A). MSC에 PKC 억제제 (Go6983, 1 ug/ml)를 1시간 전처리하고 PMA를 처리한 후, 24시간 후 단백질을 얻고 웨스턴 블랏(western blot)을 통하여 시그널링(signaling)을 분석하였다(도 4의 B). MSC에 PKC 억제제 (Go6983, 1 ug/ml)를 1시간 전처리하고 PMA를 처리한 후, PBMC에서 분리한 B 세포 (1 × 10⁵cells/well)와 PMA-처리된 MSC (1 × 10³cells/well)를 ODN과 함께 72시간 동안 공동배양을 실시한 다음, 상층액 안에 있는 IgM의 수준을 ELISA를 통하여 측정하였다(도 4의 C). PMA-처리된 MSC의 표면 분자(surface molecule)의 mRNA 수준을 RT-PCR을 통하여 분석하였다(도 4의 D). PMA-처리된 MSC의 PD-L1과 B 세포의 PD1의 발현을 FACS를 통하여 분석하였다(도 4의 E). MSC에 FasL blocking Ab (10 ug/ml)(F)와 PD-L1 blocking Ab (10 ug/ml)(G)를 각각 처리하고 PMA를 넣어준 다음, MSC와 B 세포를 ODN과 함께 72시간 동안 배양한 후, 상층액에 있는 IgM 수준을 ELISA를 통하여 측정하였다. PMA-처리된 MSC를 siRNA를 처리하여 PD-L1을 mRNA 수준으로 RT-PCR을 통하여 확인하였다. PD-L1이 녹다운된 PMA-처리된 MSC와 B 세포를 ODN과 함께 72시간 동안 배양한 후, 상층액에 있는 IgM 수준을 ELISA를 통하여 측정하였다(도 4의 H). MSC에 PMA를 처리하고 24시간 후, 총 RNA(total RNA)를 얻고 RT-PCR을 통하여 가용성 인자(soluble factor)를 분석하였다(도 4의 I).

PMA는 PKC 활성화제(activator)로 세포질내 PKC를 활성화시켜 플라즈마 막(plasma membrane)으로 이동시킨다. MSC에 PMA를 처리한 경우, 세포질내 PKC-α, δ를 세포막으로 이동시키고 ERK의 인산화를 증가시키는 것으로 확인되었다(도 4의 A). MSC에 PKC 저해제를 전처리 하였을 때, PMA로 인한 PKC-α, δ의 세포막 이동이 저해되는 것으로 확인되었고(도 4의 B), B 세포의 IgM 생성을 억제하지 못하는 것으로 확인되었다(도 4의 C). MSC에 PMA를 처리하였을 때, PD-L1, PD-L2, FasL가 발현되는 것이 확인되었다(도 4의D 및 E). PMA-처리된 MSC에 FasL blocking Ab를 처리하였을 때, B 세포의 IgM 생성을 억제하였지만(도 4의 F), PD-L1 blocking Ab를 처리하였을 때, B 세포의 IgM 생성을 억제하지 못하였다(도 4의 G). 또한 PMA-처리된 MSC에서 PD-L1 발현을 녹다운(KD)시킨 경우, B 세포의 IgM 생성을 억제하지 못하였다(도 4의 H). MSC에 PMA를 처리한 경우, 세포내 TGF-β, COX-2, iNOS, IDO 발현에는 영향이 없었다(도 4의 I). 즉, PMA는 MSC의 PD-L1 발현을 유도하여 B 세포의 IgM 생성을 억제하는 것으로 확인되었다.

실시예 5. PMA-처리된 MSC에서 발현하는 PDL1이 B 세포 세포사멸에 미치는 영향 분석

PMA-처리된 MSC에 PDL1 siRNA를 처리한 후, 24시간 동안 공동배양하고, 세포를 아넥신(annexin) V-APC와 PI-PE를 이용하여 염색한 후 FACS를 통하여 분석하였다(도 5의 A). PMA-처리된 MSC에 PDL1 siRNA를 처리한 후, 24시간 동안 공동배양한 후, 카스파제 Ab(Caspase Ab)를 첨가하고 1시간 후 FACS를 통하여 분석하였다(도 5의 B).

PD-L1은 PD1을 발현하는 세포의 사멸을 유도한다. 본 실험에서는, PMA-처리된 MSC의 PD-L1이 B 세포 표면의 PD1에 결합하여 B 세포의 사멸을 유도하는지 검증하였다. PD-L1이 PD1에 결합하면 B 세포내 카스파제(caspase)가 활성화되고 세포사멸(apoptosis)이 유도된다. 세포사멸(apoptosis)이 진행되면, 세포막 안쪽에 있는 PS(phosphatidic serin)가 세포막 바깥쪽으로 노출되고 이를 아넥신 V(Annexin V)가 결합하여 세포사멸을 측정할 수 있다. PMA-처리된 MSC는 B 세포에 카스파제(caspase) 발현을 강하게 증가시켰으며(도 5의 B), annexin V 염색을 증가시켰다(도 5의 A). 그러나 PD-L1 siRNA 형질감염된(transfected) MSC는 B cell의 카스파제 활성화(caspase activation)와 아넥신(annexin) V 염색을 증가시키지 못하였다(도 5의 A 및 B). 이상의 결과로부터 PMA는 MSC의 PD-L1의 발현을 증가시키고, B 세포의 PD1에 결합하여 B 세포의 세포사멸(B cell apoptosis)를 증가시킴을 알 수 있다.

실시예 6. PMA-처리된 hMSC 투여에 의한 MRL/lpr 마우스의 치료효과 확인.

PMA-처리된 MSC에 대한 치료 효과 실험을 진행하기 위하여 자연발생 루푸스 동물모델인 MRL/lpr 마우스를 통하여 치료효과를 검증하였다. MSC를 4×10⁴ cells/mouse의 농도로 마우스에 정맥주사 하였으며, 투여 시기는 마우스의 발병이 시작하는 12주령부터 1번 주사하였다(MRL/lpr 마우스 12주령에 대조군(희석액), MSC 4 × 10⁴ cells/injection를 투여함). 동물실험의 측정지표로는 매주 마우스의 생존률과 몸무게를 확인하였고, 2주 간격으로 anti-dsDNA, IgG를 측정하였다. 생존율(도 6의 A)과 몸무게(도 6의 B)를 매주 측정하였고, 3주 간격으로 혈청을 분리하여 anti-dsDNA Ab (도 6의 C), 총(total) IgG (도 6의 D)를 측정하였다. 24주령의 MRL/lpr 마우스에서 비장(spleen)을 분리하여 세포를 획득하고, 항체를 이용하여 세포를 염색한 뒤 FACS로 세포표현형을 측정하였다(도 6의 E). 이후, 세포의 총(total) RNA을 얻은 후 RT-PCR을 통하여 염증성 사이토카인(cytokine)의 발현을 측정하였다(도 6의 F).

PMA-처리된 MSC를 투여군의 마우스는 30주령까지 100% 생존하였지만, IFN-γ-처리된 MSC과 MSC를 투여군의 마우스는 각각 0%, 33% 만 생존하였다(도 6의 A). MSC는 MRL/lpr 마우스의 몸무게에 영향을 주지 않았으며, 이로 부터 MSC는 마우스에 독성을 나타내지 않음을 알 수 있다(도 6의 B). PMA-처리된 MSC와 IFN-γ-처리된 MSC는 대조군에 비하여 혈중 anti-dsDNA Ab, total IgG의 농도를 억제하였으나, MSC는 anti-dsDNA Ab, total IgG의 농도를 억제하지 못하였다(도 6의 C 및 D). PMA-처리된 MSC는 대조군에 비하여 T 세포표형현인 CD3의 비율과, 플라즈마(plasma) 세포표현형인 CD138+IgG+의 비율율 감소시켰고, Treg 세포표현형인 CD4+Foxp3+의 비율을 증가시켰다(도 6의 E). 또한 사이토카인 발현량을 RT-PCR을 통하여 분석한 결과, PMA-처리된 MSC는 대조군에 비하여 염증성 사이토카인(cytokine)의 발현량을 감소시키는 것으로 확인되었다(도 6의 F).

실시예 7. PMA-처리된 hMSC 투여에 의한 MRL/lpr 마우스의 신장(kidney) 내 면역세포 분석

MRL/lpr 마우스에 대조군(희석액), MSC (4 × 10⁴ cells/injection)를 12주령에 투여한 후, 24주령의 MRL/lpr 마우스에서 신장(kidney)을 분리하여 포르말린으로 고정하였고, 면역세포 침윤도를 DAB 염색을 이용하여 측정하였다.

루푸스 질병은 자가 항체와 면역복합체에 의하여 신장(kidney)에 염증이 발생하게 되며, 면역세포의 침윤이 증가하게 된다. 그래서 마우스의 신장을 분리하고 DAB 염색법을 통하여 세포의 침윤도의 확인하였다. PMA-처리된 MSC는 대조군에 비하여 T 세포, B 세포, 대식세포, 수지상세포의 신장 침윤을 감소시켰으며, Treg의 침윤을 증가시켰다(도 7의 A, B). 결론적으로 PMA-처리된 MSC는 루푸스 질병의 치료효과를 보였으며, 기존의 MSC보다 더 뛰어난 치료효과를 나타내었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> CoreStem CO.,LTD. <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING STEM CELLS TREATED WITH PROTEIN KINASE C ACTIVATOR OR CULTURE THEREOF FOR PREVENTION AND TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES <130> 1064852 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL2_F primer <400> 1 atgaaagtct ctgccgccct tctgt 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL2_R primer <400> 2 agtcttcgga gtttgggttt gcttg 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL3_F primer <400> 3 atgcaggtct ccactgctgc cctt 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL3_R primer <400> 4 gcactcagct ccaggtcgct gacat 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL10_F primer <400> 5 cctgcttcaa atatttccct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL10_R primer <400> 6 ccttcctgta tgtgtttgga 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL12_F primer <400> 7 atgaacgcca aggtcgtggt cg 22 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL12_R primer <400> 8 tgttgttgtt cttcagccg 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2_F primer <400> 9 tccttgctgt tcccacccat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2_R primer <400> 10 catcatcaga ccaggcacca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS_F primer <400> 11 acgtgcgtta ctccaccaac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS_R primer <400> 12 catagcggat gagctgagca 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDO_F primer <400> 13 agcctgatct catagagtct g 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDO_R primer <400> 14 ttactgcagt ctccatcacg 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta_F primer <400> 15 cagatcctgt ccaagctg 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta_R primer <400> 16 tcggagctct gatgtgtt 18 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FasL_F primer <400> 17 ggattgggcc tggggatgtt tca 23 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FasL_R primer <400> 18 ttgtggctca ggggcaggtt gttg 24 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-L1_F primer <400> 19 ttgggaaatg gaggataaga 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-L1_R primer <400> 20 ggatgtgcca gaggtagttc t 21 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-L2_F primer <400> 21 acaccgtgaa agagcc 16 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-L2_R primer <400> 22 aatgtgaagc agccaag 17 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ICAM1_F primer <400> 23 cgtgccgcac tgaactggac 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ICAM1_R primer <400> 24 cctcacactt cactgtcacc t 21 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCAM1_F primer <400> 25 atgacatgct tgagccagg 19 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCAM1_R primer <400> 26 gtgtctcctt ctttgacact 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin_F primer <400> 27 gtggggcgcc ccaggcacca 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin_R primer <400> 28 ctccttaatg tcacgcacga 20 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INF-gamma_F primer <400> 29 agcggctgac tgaactcaga ttgtag 26 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INF-gamma_R primer <400> 30 gtcacagttt tcagctgtat aggg 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INF-alpha_F primer <400> 31 aggttctgtc cctttcactc actg 24 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INF-alpha_R primer <400> 32 agagaacctg ggagtcaagg ta 22 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12_F primer <400> 33 agaggtggac tggactcccg a 21 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12_R primer <400> 34 ttggtgcttc acacttcag 19 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin_F primer <400> 35 tggaatcctg tggcatccat gaaac 25 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin_R primer <400> 36 taaaacgcag ctcagtaaca gtccg 25

Claims

단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)로 처리된 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 단백질 키나아제 C 활성화제는 포르볼 미리스테이트 아세테이트, 인게놀 3-안젤레이트, 브리오스타틴-1, 포르볼-12,13-다이부티레이트, 프로스타틴, N-(6-페닐헥실)-5-클로로-1-나프탈렌술폰아미드 및 5-클로로-N-헵틸나프탈렌-1-술폰아미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 줄기세포는 성체줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells) 또는 배아줄기세포인 것을 특징으로 하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 성체줄기세포는 중간엽줄기세포, 중간엽기질세포(mesenchymal stromal cell) 또는 다분화능 줄기세포인 것을 특징으로 하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 단백질 키나아제 C 활성화제는 줄기세포의 CXCL10의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 단백질 키나아제 C 활성화제는 줄기세포의 PD-L1(programmed death-ligand 1) 발현을 증가시킴으로써 B 세포의 세포사멸을 증가시키는 것을 특징으로 하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 자가면역질환은 루푸스(전신 홍반성 낭창), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 전신성 경피증(Progressive systemic sclerosis,Scleroderma), 아토피 피부염, 원형탈모증(alopecia areata), 건선, 천포창, 천식, 아프타구내염, 만성 갑상선염, 염증성 장염, 베체씨병(Behcet's disease), 크론씨병, 피부근염(dermatomyositis), 다발성 근염(polymyositis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 그레이브씨 갑상선 항진증(Grave's disease), 결절성 다발성 동맥염(Polyarteritis nodosa), 강직성 척추염(Ankylosing spondylitis), 섬유조직염(Fibromyalgia syndrome) 및 측두동맥염(Temporal arteritis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역질환 예방 또는 치료방법.
줄기세포에 단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 면역억제제의 제조방법.
단백질 키나아제 C 활성화제(protein kinase C activator)로 처리된 줄기세포 또는 그 배양물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 피험체의 면역반응을 억제하는 방법.