JP2022512987A - タンパク質キナーゼｃ活性化剤で処理された幹細胞またはその培養物を含む自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を含む自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物に関し、より詳細には、Ｂ細胞の機能を抑制することができて、自己免疫疾患の予防または治療効果に優れた、自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。【選択図】図５
Description
本出願は、２０１８年１１月９日に出願された韓国特許出願第１０－２０１８－０１３７５７８号を優先権として主張し、前記明細書の全体は本出願の参考文献である。
本発明は、タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を含む自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物に関し、より詳細には、Ｂ細胞の機能を抑制することができて、自己免疫疾患の予防または治療効果に優れた、自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。
幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とは、組織を構成する各細胞に分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）する前段階の未分化細胞を総称して言う言葉であり、特定の分化刺激（環境）によって特定の細胞への分化が進行される。幹細胞は、細胞分裂が停止した分化した細胞とは異なって、細胞分裂により自分と同じ細胞を生産（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）することができて、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）する特性があり、また、分化刺激が加えられると、特定の細胞に分化するが、他の環境または他の分化刺激により他の細胞にも分化することができて、分化に柔軟性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有していることが特徴である。
このような幹細胞の多分化性は、ヒトの発生過程の研究のための良い実験モデル（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ）を提供する。幹細胞から得られた均質なヒトの組織や、細胞を対象に薬物検査、毒性検査を行うと、新薬の開発が容易になりえる。ひいては、損傷された組織を代替できる細胞や組織を多量で得ることができるようになって、難治性疾病の治療に利用することができる。
間葉系幹細胞は、幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）と自己再生能（ｓｅｌｆ ｒｅｎｅｗａｌ）を維持し、多様な間葉組織に分化できる能力（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有する細胞である。骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）、脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、骨組織（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）、膝蓋下脂肪体（ｉｎｆｒａｐａｔｅｌｌａｒ ｆａｔ ｐａｄ）等から抽出することができる。間葉系幹細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球の活性、増殖を抑制し、ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ，ＮＫ ｃｅｌｌ）の活性を抑制し、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）とマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の機能を調節する免疫調節能力を有しているので、同種移植（ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）と異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）が可能な細胞である。また、間葉系幹細胞は、軟骨、骨組織、靭帯、骨髄基質など多様な結合組織に分化できる能力を有する。特に脂肪組織に由来する脂肪由来の間葉系幹細胞は、ＡＳＣ（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ／ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）やＡＤＡＳ（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等の名前で細分化され、外傷や、腫瘍除去手術、火傷などによってできた軟部組織欠損を治療する生体材料の生産に応用され得る。
一方、ループスは、免疫異常反応で自己抗原により樹状細胞、Ｔ細胞そしてＢ細胞を活性化させる。したがって、自己抗体が生成され、自己抗原と免疫複合体を形成して多様な臓器を侵して症状が現れる。このようなループス疾病を治療するために多様に治療剤が開発されており、特に免疫調節作用を有している間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）が有望な治療剤として研究されている。ＭＳＣは、Ｔ細胞の機能を抑制することが報告されたが、Ｂ細胞の機能を抑制できるＭＳＣに関する研究が不十分な現状である。
本発明は、タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を含む自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記組成物をヒトを除いた個体に投与する段階を含む自己免疫疾患の予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、幹細胞にタンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を添加して培養する段階を含む、免疫抑制剤の製造方法を提供する。
また、本発明は、タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を被験体に投与する段階を含む、ヒトを除いた被験体の免疫反応を抑制する方法を提供する。
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
本発明は、タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を含む自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
前記タンパク質キナーゼＣ活性化剤は、ホルボールミリステートアセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ）、インゲノール３－アンゲレート（Ｉｎｇｅｎｏｌ ３－Ａｎｇｅｌａｔｅ）、ブリオスタチン－１（Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ－１）、ホルボール－１２，１３－ジブチラート（ｐｈｏｒｂｏｌ－１２，１３－ｄｉｂｕｔｙｒａｔｅ）、プロストラチン（Ｐｒｏｓｔｒａｔｉｎ）、Ｎ－（６－フェニルヘキシル）－５－クロロ－１－ナフタレンスルホンアミド（ＳＣ－９）および５－クロロ－Ｎ－ヘプチルナフタレン－１－スルホンアミド（ＳＣ－１０）よりなる群から選ばれる１つ以上を含むことができる。
前記幹細胞は、成体幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）または胚性幹細胞でありうる。
前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞、間葉系ストローマ細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）または多分化能幹細胞でありうる。
前記タンパク質キナーゼＣ活性化剤は、幹細胞のＣＸＣＬ１０の発現を増加させることができる。
前記タンパク質キナーゼＣ活性化剤は、幹細胞のＰＤ－Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）発現を増加させることによって、Ｂ細胞の細胞死を増加させることができる。
前記自己免疫疾患は、ループス（全身性紅斑性狼瘡）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、全身性強皮症（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、アトピー皮膚炎、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ）、乾癬、天疱瘡、喘息、アフタ性口内炎、慢性甲状腺炎、炎症性腸炎、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、自己免疫性溶血性貧血（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、結節性多発動脈炎（Ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）、強直性脊椎炎（Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、線維筋痛症候群（Ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）および側頭動脈炎（Ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｒｔｅｒｉｔｉｓ）よりなる群から選択され得る。
また、本発明は、前記組成物をヒトを除いた個体に投与する段階を含む、自己免疫疾患の予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、幹細胞にタンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を添加して培養する段階を含む、免疫抑制剤の製造方法を提供する。
また、本発明は、タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を被験体に投与する段階を含む、ヒトを除いた被験体の免疫反応を抑制する方法を提供する。
また、本発明は、タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を含む薬学的組成物を個体に投与または服用させる段階を含む自己免疫疾患の予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を含む薬学的組成物の自己免疫疾患の予防または治療用途を提供する。
本発明による幹細胞またはその培養物は、自己免疫疾患の予防または治療に有用に使用され得る。より具体的に、タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物は、Ｂ細胞の機能を抑制することができるところ、自己免疫疾患の予防または治療効果に優れている。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を含む自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明において「幹細胞」は、多様な組織に分化できる能力を有する細胞、すなわち「未分化細胞」でありうる。
本発明において、前記幹細胞は、成体幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）または胚性幹細胞でありうる。
前記成体幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜および胎盤よりなる群から選択される組織に由来するものでありうる。また、前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞、間葉系ストローマ細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）または多分化能幹細胞であり得、好ましくは、間葉系幹細胞でありうる。各組織において幹細胞を得る方法は、従来当業界に公知となった方法によることができ、本発明の実施例の方法に限定されない。
本発明において「培養物」は、幹細胞を含む細胞培養液、細胞培養液から幹細胞を除去した培養上澄み液、およびこれらの希釈液を全部含むことができる。前記培養物の組成は、通常の幹細胞の培養に必要な成分だけでなく、幹細胞の増殖に上昇的に作用をする成分を追加で含むことができ、これによる組成は、当業界における通常の技術を有する者により容易に選択され得る。
前記幹細胞の培養に使用される培地としては、当業界において幹細胞の培養に適していることが知られている通常の培地を使用することができるが、例えばＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）またはＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ－ＳＦＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）を使用することができる。
前記幹細胞培地は、添加剤で補充され得る。一般的に、等張液中の中性緩衝剤（例えばリン酸塩および／または高濃度重炭酸塩）およびタンパク質栄養分（例えば血清、例えばＦＢＳ、血清代替物、アルブミン、または必須アミノ酸および非必須アミノ酸、例えばグルタミン）を含有することができる。ひいては、脂質（脂肪酸、コレステロール、血清のＨＤＬまたはＬＤＬ抽出物）およびこのような種類の多くの保存液培地で発見されるその他成分（例えばインスリンまたはトランスフェリン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、ピルビン酸塩、任意のイオン化形態または塩である糖原、例えばグルコース、セレニウム、グルココルチコイド、例えばヒドロコルチゾンおよび／または還元剤、例えばβ－メルカプトエタノール）を含有することができる。
本発明の組成物において、タンパク質キナーゼＣ活性化剤は、ホルボールミリステートアセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ，ＰＭＡ）、インゲノール３－アンゲレート（Ｉｎｇｅｎｏｌ ３－Ａｎｇｅｌａｔｅ，Ｉ３Ａ）、ブリオスタチン－１（Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ－１）、ホルボール－１２，１３－ジブチラート（ｐｈｏｒｂｏｌ－１２，１３－ｄｉｂｕｔｙｒａｔｅ，ＰＤＢｕ）、プロストラチン（Ｐｒｏｓｔｒａｔｉｎ）、ＳＣ－９（Ｎ－（６－Ｐｈｅｎｙｌｈｅｘｙｌ）－５－ｃｈｌｏｒｏ－１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ，ＣＡＳ Ｎｏ．１０２６４９－７８－５）およびＳＣ－１０（５－Ｃｈｌｏｒｏ－Ｎ－ｈｅｐｔｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－１－ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ，ＣＡＳ Ｎｏ．１０２６４９－７９－６）よりなる群から選ばれる１つ以上を含むことができる。
前記タンパク質キナーゼＣ活性化剤の処理濃度は、１～２０μｇ／ｍｌでありうる。前記タンパク質キナーゼＣ活性化剤の処理時間は、１～１２０時間でありうる。
前記タンパク質キナーゼＣ活性化剤は、幹細胞のＣＸＣＬ１０の発現を増加させてＢ細胞の移動を増加させることによって、接触－依存性抑制（ｃｏｎｔａｃｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）効果を増加させることができる。また、前記タンパク質キナーゼＣ活性化剤は、幹細胞のＰＤ－Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）の発現を増加させてＢ細胞の細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を増加させることができる。
本発明によって、タンパク質キナーゼＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ）活性化剤で処理された間葉系幹細胞は、Ｂ細胞の機能を抑制できるところ、本発明による幹細胞およびその培養物は、自己免疫疾患の予防および治療に有用に使用され得る。
前記自己免疫疾患は、ループス（全身性紅斑性狼瘡）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、全身性強皮症（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、アトピー皮膚炎、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ）、乾癬、天疱瘡、喘息、アフタ性口内炎、慢性甲状腺炎、炎症性腸炎、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、自己免疫性溶血性貧血（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、結節性多発動脈炎（Ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）、強直性脊椎炎（Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、線維筋痛症候群（Ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）および側頭動脈炎（Ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｒｔｅｒｉｔｉｓ）よりなる群から選ばれ得る。
本発明において「予防」は、前記組成物の投与により自己免疫疾患の発病を抑制または遅延させるすべての行為を意味し、「治療」は、前記組成物の投与により自己免疫疾患の症状が好転したり有利になるすべての行為を意味する。
また、本発明による幹細胞またはその培養物は、１ｍｌ当たり１．０×１０５個～１．０×１０９個、好ましくは、１．０×１０６個～１．０×１０８個、より好ましくは、１．０×１０７個の細胞を含むことができる。
本発明による幹細胞またはその培養物は、凍結しないまま使用されたり、以後に使用のために凍結することができる。凍結しなければならない場合、標準冷凍保存剤（例えばＤＭＳＯ、グリセロール、エピライフ（Ｅｐｉｌｉｆｅ）細胞凍結培地（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ））が凍結前に細胞集団に添加され得る。
さらに他の様態として、本発明は、前記組成物を個体に投与する段階を含む自己免疫疾患の予防または治療方法を提供する。
本発明の用語「投与」とは、適切な方法で個体に所定の物質を導入することを意味する。
本発明の用語「個体」とは、自己免疫疾患が発病したか、または発病しうるヒトを含むラット、マウス、家畜などのすべての動物を意味する。具体的な例として、ヒトを含む哺乳動物でありうる。
また、本発明による幹細胞またはその培養物は、薬学的分野において通常の方法によって患者の身体内投与に適合した単位投与型の製剤で剤形化させて投与することができ、前記製剤は、１回または数回の投与によって効果的な投与量を含む。このような目的に適合した剤形としては、非経口投与製剤として注射用アンプルのような注射剤、注入バッグのような注入剤、およびエアゾール製剤のような噴霧剤などが好ましい。前記注射用アンプルは、使用直前に注射液と混合調製することができ、注射液としては、生理食塩水、葡萄糖、マンニトール、リンゲル液などを使用することができる。また、注入バッグは、塩化ポリビニルまたはポリエチレン材質のものを使用することができ、バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、メドセップ（Ｍｅｄｃｅｐ）、ナショナルホスピタルプロダクツ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）またはテルモ（Ｔｅｒｕｍｏ）社の注入バッグを例示することができる。
前記薬学的製剤には、前記有効成分の他に１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な通常の不活性担体、例えば、注射剤の場合には、保存剤、無痛化剤、可溶化剤または安定化剤などを、局所投与用の製剤の場合には、基剤（ｂａｓｅ）、賦形剤、潤滑剤または保存剤などを追加で含むことができる。
このように製造された本発明による幹細胞、その培養物または薬学的製剤は、当業界において通常的に使用する投与方法を利用して移植およびその他の用途に使用される他の幹細胞とともにまたはそのような幹細胞との混合物の形態で投与され得、好ましくは、治療が必要な患者の疾患部位に直接生着または移植したり、腹腔に直接移植または注入することが可能であるが、これに限定されない。また、前記投与は、カテーテルを利用した非外科的投与および疾患部位の切開後に注入または移植など外科的投与方法が全部可能であるが、カテーテルを利用した非外科的投与方法がより好ましい。また、通常の方法によって非経口的に、例えば直接病変に投与することの他に、造血系幹細胞移植の一般的方法である血管内注入による移植も可能である。
前記幹細胞の１日投与量は、１．０×１０４～１．０×１０１０細胞／ｋｇ体重、好ましくは、１．０×１０５～１．０×１０９細胞／ｋｇ体重を１回または数回に分けて投与することができる。しかしながら、有効成分の実際投与量は、治療しようとする疾患、疾患の重症度、投与経路、患者の体重、年齢および性別などの様々な関連因子に照らして決定されなければならないものと理解されるべきであり、したがって、前記投与量は、いかなる点においても本発明の範囲を限定するものではない。
さらに他の様態として、本発明によるタンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞およびその培養物を投与することによって、自己免疫反応を抑制することができるところ、本発明は、タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を被験体に投与する段階を含む被験体の免疫反応を抑制する方法を提供する。
本発明で「被験体」とは、牛、犬、豚、鶏、羊、馬、ヒトを含む哺乳動物を意味するが、これに制限されるものではない。また、好ましくは、タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）が添加された幹細胞またはその培養物の投与は、腹腔または血管内投与、病変への直接投与または関節の滑液腔（Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｃａｖｉｔｙ）内投与などでありうる。
前記免疫反応の抑制は、免疫疾患を予防または治療することを特徴とすることができる。
さらに他の様態として、本発明は、幹細胞にタンパク質キナーゼＣ活性化剤を添加して培養する段階を含む、免疫抑制剤の製造方法を提供する。
本発明で「免疫抑制剤」とは、上記で説明したように、幹細胞にタンパク質キナーゼＣ活性化剤を処理して収得した幹細胞またはその培養物を含む製剤であり、免疫反応を抑制して自己免疫疾患を治療できる製剤を意味する。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。本発明の目的、特徴、長所は、以下の実施例を通じて容易に理解されるだろう。本発明は、ここで説明する実施例に限定されず、他の形態で具体化されることもできる。ここで紹介される実施例は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者に本発明の思想が十分に伝達され得るようにするために提供されるものである。したがって、以下の実施例によって本発明が制限されてはならない。
ループスは、免疫異常反応で自己抗原により樹状細胞、Ｔ細胞そしてＢ細胞を活性化させる。これにより、自己抗体が生成され、自己抗原と免疫複合体を形成して多様な臓器を侵して症状が現れる。このようなループス疾病を治療するために多様に治療剤が開発されており、免疫調節作用を有している間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）が有望な治療剤として研究されている。ＭＳＣは、Ｔ細胞の機能を抑制することが報告された。しかしながら、ＭＳＣがＢ細胞の機能を抑制するか否かは明確に確認されたことがない。これより、本発明者らは、下記実施例を通じてｈｕｍａｎ ＭＳＣがｈｕｍａｎ Ｂ細胞の機能を抑制するかについて確認した。
本発明者らは、予備実験を通じてヒト（ｈｕｍａｎ）ＭＳＣがヒトＢ細胞のＩｇＭ生成を抑制せず、弱く増加させていることを確認した。本発明者らは、ヒトＢ細胞の機能を抑制させるヒトＭＳＣを製造するために、２０種余りのケミカル（ｃｈｅｍｉｃａｌ）をヒトＭＳＣに処理した。スクリーニングを通じてタンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）であるホルボールミリステートアセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ，ＰＭＡ）がヒトＭＳＣを活性化させ、究極的にヒトＢ細胞の機能を抑制することを確認し、タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）がヒトＭＳＣを活性化させる作用機序を解明した。
＜材料および実験方法＞
（材料）
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、米国Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）から購入した。マウスは、１２時間の明暗周期（１２ｈ ｌｉｇｈｔ／ｄａｒｋ ｃｙｃｌｅ）下で２１～２４℃および４０～６０％相対湿度の条件の特定病原菌がない状態で保管された。
（材料）
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、米国Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）から購入した。マウスは、１２時間の明暗周期（１２ｈ ｌｉｇｈｔ／ｄａｒｋ ｃｙｃｌｅ）下で２１～２４℃および４０～６０％相対湿度の条件の特定病原菌がない状態で保管された。
Ｈｕｍａｎ ＭＳＣ（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、ヒトの脛骨（ｔｉｂｉａｅ）および大腿骨（ｆｅｍｕｒｓ）のＢＭ（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）細胞から収得した。ＢＭ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含むα－ＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。非付着細胞（ｎｏｎ－ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）を１日目に除去し、付着細胞を３日ごとに培地を補充（ｍｅｄｉｕｍ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｍｅｎｔ）して培養した後、１７日から２０日の間に使用した。
ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２－ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）ｈＭＳＣは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）（Ｂｉｏｎｅｅｒで製作、Ｋｏｒｅａ）と呼ばれる１２－２１ｍｅｒのｄｓＲＮＡにより配列特異的に遺伝子発現が抑制される現象を利用して、４８時間の間培養してノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）反応を誘導した。
ｈＭＳＣの前処理条件に使用された物質として、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ、２４時間処理、ｓｉｇｍａ）、Ｉ３Ａ（１０μｇ／ｍｌ、２４時間処理ｓｉｇｍａ）、ＩＦＮ－γ（１０ｎｇ／ｍｌ、７日処理、ｓｉｇｍａ）を使用した。
（ＥＬＩＳＡ）
ＩＦＮ－γの測定は、Ｒ＆Ｄ（＃ＤＹ２８５－０５）で提供された試験方法によって進め、ＩｇＭは、ＩｇＭ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を利用して測定した。ＥＬＩＳＡ用の９６ウェル（ｗｅｌｌ）に捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とコーティングバッファー（ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を１：２５０の割合で希釈して４℃で１８時間コーティングした。２００μｌの洗浄溶液（ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を利用して２回洗浄し、ブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）２５０μｌをウェル（ｗｅｌｌ）に入れた後、室温で２時間反応させた。その後、２００μｌの洗浄溶液を利用して２回洗浄し、試料をアッセイバッファー（ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ）（１Ｘ）に希釈してサンプルを準備した。各ウェル（ｗｅｌｌ）にアッセイバッファー（１ｘ）９０μｌ、検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ）５０μｌおよびスタンダード（ｓｔａｎｄａｒｄ）またはサンプル（ｓａｍｐｌｅ）１０μｌを入れて室温で３時間反応させた。反応が終わると、洗浄溶液を利用して洗浄した。基質溶液（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００μｌを各ウェル（ｗｅｌｌ）に入れた後、５分間反応させ、停止液（ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００μｌを入れて反応を中止させた。最後に、４５０ｎｍ～５７０ｎｍで値を測定した。
ＩＦＮ－γの測定は、Ｒ＆Ｄ（＃ＤＹ２８５－０５）で提供された試験方法によって進め、ＩｇＭは、ＩｇＭ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を利用して測定した。ＥＬＩＳＡ用の９６ウェル（ｗｅｌｌ）に捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とコーティングバッファー（ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を１：２５０の割合で希釈して４℃で１８時間コーティングした。２００μｌの洗浄溶液（ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を利用して２回洗浄し、ブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）２５０μｌをウェル（ｗｅｌｌ）に入れた後、室温で２時間反応させた。その後、２００μｌの洗浄溶液を利用して２回洗浄し、試料をアッセイバッファー（ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ）（１Ｘ）に希釈してサンプルを準備した。各ウェル（ｗｅｌｌ）にアッセイバッファー（１ｘ）９０μｌ、検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ）５０μｌおよびスタンダード（ｓｔａｎｄａｒｄ）またはサンプル（ｓａｍｐｌｅ）１０μｌを入れて室温で３時間反応させた。反応が終わると、洗浄溶液を利用して洗浄した。基質溶液（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００μｌを各ウェル（ｗｅｌｌ）に入れた後、５分間反応させ、停止液（ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００μｌを入れて反応を中止させた。最後に、４５０ｎｍ～５７０ｎｍで値を測定した。
（ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ））
細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ；Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）を利用して細胞を氷（ｉｃｅ）に載置した状態で溶解した。４℃で１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してタンパク質を得た。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）試薬を利用してタンパク質を定量して２０μｇのタンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）を利用して７５Ｖで電気泳動を実施した。ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルを９５Ｖで９０分間ＰＶＤＦメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移した後、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０が含まれたＴＢＳ（ＴＴＢＳ）に５％脱脂粉乳（ｎｏｎｆａｔ ｄｒｙ ｍｉｌｋ）を添加して１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。ブロッキング（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）後、１次抗体が含まれた５％ＢＳＡ／ＴＴＢＳにメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）を入れ、４℃で１日間シェイキング（ｓｈａｋｉｎｇ）した。翌日、ＴＴＢＳでメンブレンを洗浄した後、２次抗体が入っている５％ＢＳＡ／ＴＴＢＳにメンブレンを入れて、常温で９０分間２次抗体を付着した。ＴＴＢＳでメンブレンを洗浄し、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）とｍｅｍｂｒａｎｅを反応させた後、Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｃ ＸＲＳ＋ｍａｃｈｉｎｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用してタンパク質発現程度を測定した。
細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ；Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）を利用して細胞を氷（ｉｃｅ）に載置した状態で溶解した。４℃で１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してタンパク質を得た。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）試薬を利用してタンパク質を定量して２０μｇのタンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）を利用して７５Ｖで電気泳動を実施した。ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルを９５Ｖで９０分間ＰＶＤＦメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移した後、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０が含まれたＴＢＳ（ＴＴＢＳ）に５％脱脂粉乳（ｎｏｎｆａｔ ｄｒｙ ｍｉｌｋ）を添加して１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。ブロッキング（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）後、１次抗体が含まれた５％ＢＳＡ／ＴＴＢＳにメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）を入れ、４℃で１日間シェイキング（ｓｈａｋｉｎｇ）した。翌日、ＴＴＢＳでメンブレンを洗浄した後、２次抗体が入っている５％ＢＳＡ／ＴＴＢＳにメンブレンを入れて、常温で９０分間２次抗体を付着した。ＴＴＢＳでメンブレンを洗浄し、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）とｍｅｍｂｒａｎｅを反応させた後、Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｃ ＸＲＳ＋ｍａｃｈｉｎｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用してタンパク質発現程度を測定した。
（トリゾール方法（Ｔｒｉｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ）を利用したＲＮＡ分離）
細胞（Ｃｅｌｌ）が７０～８０％のコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）となった時点でＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）０．１２５％で処理した後、５％ＣＯ２、３７℃の条件下に培養した。物質処理２４時間後、細胞を回収してＴＲＩＺＯＬ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を利用してトータル（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡを細胞（ｃｅｌｌ）から分離し、２６０ｎｍで吸光度の測定を通じてトータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を定量した。
細胞（Ｃｅｌｌ）が７０～８０％のコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）となった時点でＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）０．１２５％で処理した後、５％ＣＯ２、３７℃の条件下に培養した。物質処理２４時間後、細胞を回収してＴＲＩＺＯＬ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を利用してトータル（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡを細胞（ｃｅｌｌ）から分離し、２６０ｎｍで吸光度の測定を通じてトータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を定量した。
（逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）－ＰＣＲ）
トータル（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡ ０．３μｇの濃度を利用し、４２℃で１時間、９５℃で５分間合成した。合成されたｃＤＮＡ ３μｌとプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）１０ｐＭを利用してポリメラーゼ連鎖反応を行った。この反応の基本過程は、ｐｒｅ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｐｈａｓｅ段階を９４℃で５分を行い、ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｐｈａｓｅ、９４℃で３０秒、ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｐｈａｓｅ、５６℃で３０秒、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ、７２℃で１分を行い、ｐｏｓｔ－ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅを７２℃で５分の条件で実施した。１％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）を作って電気泳動を実施した。
トータル（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡ ０．３μｇの濃度を利用し、４２℃で１時間、９５℃で５分間合成した。合成されたｃＤＮＡ ３μｌとプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）１０ｐＭを利用してポリメラーゼ連鎖反応を行った。この反応の基本過程は、ｐｒｅ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｐｈａｓｅ段階を９４℃で５分を行い、ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｐｈａｓｅ、９４℃で３０秒、ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｐｈａｓｅ、５６℃で３０秒、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ、７２℃で１分を行い、ｐｏｓｔ－ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅを７２℃で５分の条件で実施した。１％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）を作って電気泳動を実施した。
（ＲＴ－ＰＣＲ）
ＦａｓＬ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１、β－ａｃｔｉｎ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、ＣＯＸ－２、ｉＮＯＳ、ＩＤＯ、ＴＧＦ－β、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２に対するｍＲＮＡの発現水準をｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を通じて分析した。各サンプルの相対的ｍＲＮＡ量は、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）であるβ－ａｃｔｉｎのＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）と比較した臨界周期（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ，Ｃｔ）を基準として計算された。
ＦａｓＬ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１、β－ａｃｔｉｎ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、ＣＯＸ－２、ｉＮＯＳ、ＩＤＯ、ＴＧＦ－β、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２に対するｍＲＮＡの発現水準をｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を通じて分析した。各サンプルの相対的ｍＲＮＡ量は、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）であるβ－ａｃｔｉｎのＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）と比較した臨界周期（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ，Ｃｔ）を基準として計算された。
（アネキシンＶ染色（ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ｓｔａｉｎｉｎｇ））
冷たいＰＢＳで２回細胞を洗浄後にバインディングバッファー（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）に１×１０６ ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で細胞を溶解した。その後、５ｍｌカルチャーチューブ（ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｕｂｅ）に１００μｌの量を移した後、５μｌの量のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＵＳＡ）を利用して２５℃、常温、暗い条件で１５分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）過程を経て細胞を染色した。その後、４００μｌバインディングバッファー（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）溶液を添加した後に、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＣａｎｔｏＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を利用して測定した。
冷たいＰＢＳで２回細胞を洗浄後にバインディングバッファー（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）に１×１０６ ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で細胞を溶解した。その後、５ｍｌカルチャーチューブ（ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｕｂｅ）に１００μｌの量を移した後、５μｌの量のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＵＳＡ）を利用して２５℃、常温、暗い条件で１５分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）過程を経て細胞を染色した。その後、４００μｌバインディングバッファー（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）溶液を添加した後に、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＣａｎｔｏＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を利用して測定した。
（プライマー配列情報）
使用されたタプライマー情報は、次の通りである。ＣＣＬ２ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＴＧ ＡＡＡ ＧＴＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＣＴＧ Ｔ－３’、ＣＣＬ２ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＴ ＣＴＴ ＣＧＧ ＡＧＴ ＴＴＧ ＧＧＴ ＴＴＧ ＣＴＴ Ｇ－３’、ＣＣＬ３ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＣＣ ＡＣＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＣＴＴ－３’、ＣＣＬ３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＣＡ ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＡＧＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＡＣＡ Ｔ－３’、ＣＸＣＬ１０ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＴＣＣ ＣＴ－３’、ＣＸＣＬ１０ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＣＴ ＴＣＣ ＴＧＴ ＡＴＧ ＴＧＴ ＴＴＧ ＧＡ－３’、ＣＸＣＬ１２ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＴＧ ＡＡＣ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＴＣ Ｇ－３’、ＣＸＣＬ１２ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＧＴ ＴＧＴ ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＣＡ ＧＣＣ Ｇ－３’、ＣＯＸ－２ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＣＣ ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＣＡ ＣＣＣＡＴ－３’、ＣＯＸ－２ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＧ ＡＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡ－３’、ｉＮＯＳ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＣＧ ＴＧＣ ＧＴＴ ＡＣＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＡＣ－３’、ｉＮＯＳ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＡＴ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＣＡ－３’、ＩＤＯ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＣＣ ＴＧＡ ＴＣＴ ＣＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＧ－３’、ＩＤＯ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＴＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＴＣＡ ＣＧ－３’、ＴＧＦ－β ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＡＧ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ－３’、ＴＧＦ－β ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＣＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＧＡ ＴＧＴ ＧＴＴ－３’、ＦａｓＬ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＡＴＧ ＴＴＴ ＣＡ－３’、ＦａｓＬ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＴＧ ＴＧＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＡＧＧ ＴＴＧ ＴＴＧ－３’、ＰＤ－Ｌ１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＴＧ ＧＧＡ ＡＡＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＴＡＡ ＧＡ－３’、ＰＤ－Ｌ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＧＡ ＴＧＴ ＧＣＣ ＡＧＡ ＧＧＴ ＡＧＴ ＴＣＴ－３’、ＰＤ－Ｌ２ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＣＡ ＣＣＧ ＴＧＡ ＡＡＧ ＡＧＣ Ｃ－３’、ＰＤ－Ｌ２ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＡＴ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＧ－３’、ＩＣＡＭ１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＧＴ ＧＣＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＣ－３’、ＩＣＡＭ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＣＴ ＣＡＣ ＡＣＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＴＣＡ ＣＣＴ－３’、ＶＣＡＭ１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＴＧ ＡＣＡ ＴＧＣ ＴＴＧ ＡＧＣ ＣＡＧ Ｇ－３’、ＶＣＡＭ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＴＧ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＴＧ ＡＣＡ ＣＴ－３’、β－ａｃｔｉｎ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＴＧ ＧＧＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡ－３’、β－ａｃｔｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＴＣ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＣ ＡＣＧ ＣＡＣ ＧＡ－３’。使用されたマウスプライマーは、ＩＮＦ－γ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＣ ＧＧＣ ＴＧＡ ＣＴＧ ＡＡＣ ＴＣＡ ＧＡＴ ＴＧＴ ＡＧ－３’、ＩＮＦ－γ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＴＣ ＡＣＡ ＧＴＴ ＴＴＣ ＡＧＣ ＴＧＴ ＡＴＡ ＧＧＧ－３’、ＴＮＦ－αｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＧ ＴＴＣ ＴＧＴ ＣＣＣ ＴＴＴ ＣＡＣ ＴＣＡ ＣＴＧ －３’、ＴＮＦ－α ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＡ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＧＧ ＡＧＴ ＣＡＡ ＧＧＴ Ａ－３’、ＩＬ－１２ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＧＡＣ ＴＣＣ ＣＧＡ －３’、ＩＬ－１２ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＴＴ ＧＧＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＡＣ ＴＴＣ ＡＧ－３’、β－ａｃｔｉｎ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＧＧ ＡＡＴ ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＡＡ Ｃ －３’、β－ａｃｔｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＡＡ ＡＡＣ ＧＣＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＴＡＡＣＡＧ ＴＣＣ Ｇ－３’である。
使用されたタプライマー情報は、次の通りである。ＣＣＬ２ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＴＧ ＡＡＡ ＧＴＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＣＴＧ Ｔ－３’、ＣＣＬ２ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＴ ＣＴＴ ＣＧＧ ＡＧＴ ＴＴＧ ＧＧＴ ＴＴＧ ＣＴＴ Ｇ－３’、ＣＣＬ３ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＣＣ ＡＣＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＣＴＴ－３’、ＣＣＬ３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＣＡ ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＡＧＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＡＣＡ Ｔ－３’、ＣＸＣＬ１０ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＴＣＣ ＣＴ－３’、ＣＸＣＬ１０ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＣＴ ＴＣＣ ＴＧＴ ＡＴＧ ＴＧＴ ＴＴＧ ＧＡ－３’、ＣＸＣＬ１２ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＴＧ ＡＡＣ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＴＣ Ｇ－３’、ＣＸＣＬ１２ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＧＴ ＴＧＴ ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＣＡ ＧＣＣ Ｇ－３’、ＣＯＸ－２ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＣＣ ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＣＡ ＣＣＣＡＴ－３’、ＣＯＸ－２ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＧ ＡＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡ－３’、ｉＮＯＳ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＣＧ ＴＧＣ ＧＴＴ ＡＣＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＡＣ－３’、ｉＮＯＳ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＡＴ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＣＡ－３’、ＩＤＯ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＣＣ ＴＧＡ ＴＣＴ ＣＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＧ－３’、ＩＤＯ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＴＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＴＣＡ ＣＧ－３’、ＴＧＦ－β ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＡＧ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ－３’、ＴＧＦ－β ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＣＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＧＡ ＴＧＴ ＧＴＴ－３’、ＦａｓＬ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＡＴＧ ＴＴＴ ＣＡ－３’、ＦａｓＬ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＴＧ ＴＧＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＡＧＧ ＴＴＧ ＴＴＧ－３’、ＰＤ－Ｌ１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＴＧ ＧＧＡ ＡＡＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＴＡＡ ＧＡ－３’、ＰＤ－Ｌ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＧＡ ＴＧＴ ＧＣＣ ＡＧＡ ＧＧＴ ＡＧＴ ＴＣＴ－３’、ＰＤ－Ｌ２ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＣＡ ＣＣＧ ＴＧＡ ＡＡＧ ＡＧＣ Ｃ－３’、ＰＤ－Ｌ２ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＡＴ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＧ－３’、ＩＣＡＭ１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＧＴ ＧＣＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＣ－３’、ＩＣＡＭ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＣＴ ＣＡＣ ＡＣＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＴＣＡ ＣＣＴ－３’、ＶＣＡＭ１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＴＧ ＡＣＡ ＴＧＣ ＴＴＧ ＡＧＣ ＣＡＧ Ｇ－３’、ＶＣＡＭ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＴＧ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＴＧ ＡＣＡ ＣＴ－３’、β－ａｃｔｉｎ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＴＧ ＧＧＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡ－３’、β－ａｃｔｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＴＣ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＣ ＡＣＧ ＣＡＣ ＧＡ－３’。使用されたマウスプライマーは、ＩＮＦ－γ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＣ ＧＧＣ ＴＧＡ ＣＴＧ ＡＡＣ ＴＣＡ ＧＡＴ ＴＧＴ ＡＧ－３’、ＩＮＦ－γ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＴＣ ＡＣＡ ＧＴＴ ＴＴＣ ＡＧＣ ＴＧＴ ＡＴＡ ＧＧＧ－３’、ＴＮＦ－αｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＧ ＴＴＣ ＴＧＴ ＣＣＣ ＴＴＴ ＣＡＣ ＴＣＡ ＣＴＧ －３’、ＴＮＦ－α ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＡ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＧＧ ＡＧＴ ＣＡＡ ＧＧＴ Ａ－３’、ＩＬ－１２ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＧＡＣ ＴＣＣ ＣＧＡ －３’、ＩＬ－１２ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＴＴ ＧＧＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＡＣ ＴＴＣ ＡＧ－３’、β－ａｃｔｉｎ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＧＧ ＡＡＴ ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＡＡ Ｃ －３’、β－ａｃｔｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＡＡ ＡＡＣ ＧＣＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＴＡＡＣＡＧ ＴＣＣ Ｇ－３’である。
（タイム－ラプスイメージング（Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｉｍａｇｉｎｇ））
細胞移動確認のためのイメージ撮影のためにＣｕｌｔｕｒｅ－ｉｎｓｅｒｔ ｍ－ｄｉｓｈ３５ｍｍ（ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して、左側にＭＳＣ（７０ｍｌ、０．３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、右側にＢ細胞７０ｍｌ、３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。細胞が安定化すると、ｉｎｓｅｒｔを除去した後、Ｂｉｏｓｔａｔｉｏｎ ＩＭ－Ｑ（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｙｋｏ，Ｊａｐａｎ）を利用して撮影した。この実験は、３時間～６時間の間２分間隔で撮影を実施し、データ分析は、Ｉｍａｒｉｓ ７．２ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ Ｉｎｃ，Ｓｏｕｔｈ Ｗｉｎｄｏｒ，ＣＴ ＵＳＡ）を利用した。
細胞移動確認のためのイメージ撮影のためにＣｕｌｔｕｒｅ－ｉｎｓｅｒｔ ｍ－ｄｉｓｈ３５ｍｍ（ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して、左側にＭＳＣ（７０ｍｌ、０．３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、右側にＢ細胞７０ｍｌ、３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。細胞が安定化すると、ｉｎｓｅｒｔを除去した後、Ｂｉｏｓｔａｔｉｏｎ ＩＭ－Ｑ（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｙｋｏ，Ｊａｐａｎ）を利用して撮影した。この実験は、３時間～６時間の間２分間隔で撮影を実施し、データ分析は、Ｉｍａｒｉｓ ７．２ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ Ｉｎｃ，Ｓｏｕｔｈ Ｗｉｎｄｏｒ，ＣＴ ＵＳＡ）を利用した。
（ケモタキシスアッセイ（Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ａｓｓａｙ））
Ｂ細胞の移動は、５μｍ ｉｎｓｅｒｔ ｕｐｐｅｒ ｗｅｌｌを有する２４－ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を利用した。ＰＢＭＣから分離したＢ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ，ｕｐｐｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）とＩ３Ａ－ｔｒｅａｔｅｄ ｈＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ，ｌｏｗｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）をＯＤＮと共に７２時間の間トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）を利用して共培養を実施した。上澄み液中にあるＩｇＭの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した。
Ｂ細胞の移動は、５μｍ ｉｎｓｅｒｔ ｕｐｐｅｒ ｗｅｌｌを有する２４－ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を利用した。ＰＢＭＣから分離したＢ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ，ｕｐｐｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）とＩ３Ａ－ｔｒｅａｔｅｄ ｈＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ，ｌｏｗｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）をＯＤＮと共に７２時間の間トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）を利用して共培養を実施した。上澄み液中にあるＩｇＭの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した。
（統計分析）
実験データ統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）ソフトウェアを利用して分析を実施した。
実験データ統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）ソフトウェアを利用して分析を実施した。
（実施例１．ＰＭＡ－処理された（ｔｒｅａｔｅｄ）ＭＳＣがＢ細胞の機能に及ぼす影響分析）
ＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）から分離したＢ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＰＭＡ－処理された（ｔｒｅａｔｅｄ）ｈＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＣｐＧ ＯＤＮ（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、５μｇ／ｍｌ）と共に７２時間の間共培養を実施した後、上澄み液中にあるＩｇＭの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図１のＡ）。ＰＢＭＣから分離したＴ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＰＭＡ－処理されたｈＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、５μｇ／ｍｌ）と一緒７２時間の間共培養をし、上澄み液中にあるＩＦＮ－γの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図１のＢ）。ＰＢＭＣから分離したＢ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＩＦＮ－γ処理されたｈＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＯＤＮと共に７２時間の間共培養した後、上澄み液中にあるＩｇＭの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図１のＣ）。ＰＢＭＣから分離したＢ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＩ３Ａ－処理された（ｔｒｅａｔｅｄ）ｈＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＯＤＮと共に７２時間の間共培養を実施し、上澄み液中にあるＩｇＭの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図１のＤ）。ＰＢＭＣから分離したＢ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＰＭＡ－処理されたｈＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＯＤＮと共に７２時間の間トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）を利用して共培養を実施し、上澄み液中にあるＩｇＭの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図１のＥ）。
ＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）から分離したＢ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＰＭＡ－処理された（ｔｒｅａｔｅｄ）ｈＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＣｐＧ ＯＤＮ（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、５μｇ／ｍｌ）と共に７２時間の間共培養を実施した後、上澄み液中にあるＩｇＭの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図１のＡ）。ＰＢＭＣから分離したＴ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＰＭＡ－処理されたｈＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、５μｇ／ｍｌ）と一緒７２時間の間共培養をし、上澄み液中にあるＩＦＮ－γの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図１のＢ）。ＰＢＭＣから分離したＢ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＩＦＮ－γ処理されたｈＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＯＤＮと共に７２時間の間共培養した後、上澄み液中にあるＩｇＭの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図１のＣ）。ＰＢＭＣから分離したＢ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＩ３Ａ－処理された（ｔｒｅａｔｅｄ）ｈＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＯＤＮと共に７２時間の間共培養を実施し、上澄み液中にあるＩｇＭの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図１のＤ）。ＰＢＭＣから分離したＢ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＰＭＡ－処理されたｈＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＯＤＮと共に７２時間の間トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）を利用して共培養を実施し、上澄み液中にあるＩｇＭの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図１のＥ）。
ナイーブ（ｎａｉｖｅ）ＭＳＣは、Ｂ ｃｅｌｌのＩｇＭ生成を抑制しなかったが、ＰＭＡ－処理されたＭＳＣは、Ｂ細胞のＩｇＭ生成を抑制した（図１のＡ）。ＭＳＣは、Ｔ細胞のＩＦＮ－γ生成を約５０％抑制し、ＰＭＡ－処理ＭＳＣは、Ｔ細胞のＩＦＮ－γ生成を７７％抑制した（図１のＢ）。ＩＦＮ－γは、ＭＳＣの免疫抑制能を強化させるという報告があるところ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γを７日間処理し、実験を進めた。実験結果、ＩＦＮ－γ－処理されたＭＳＣは、Ｂ細胞のＩｇＭ生成は、かえって増加させることが確認された（図１のＣ）。他のＰＫＣ活性化剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）であるＩ３Ａ（Ｉｎｇｅｎｏｌ ３－Ａｎｇｅｌａｔｅ、１０μｇ／ｍｌ）を２４時間の間処理して実験を進めた。Ｉ３Ａ－処理されたＭＳＣは、Ｂ細胞のＩｇＭ生成を抑制することが確認された（図１のＤ）。また、ＰＭＡ－処理されたＭＳＣが細胞－細胞接触（ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｃｏｎｔａｃｔ）と可溶性因子（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ）のうちどんな方法でＢ細胞のＩｇＭを抑制したかを調べてみるために、トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）を使用して分析した。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣは、Ｂ細胞のＩｇＭ生成を抑制したが、トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）を利用してＢ細胞とＰＭＡ－処理されたＭＳＣの接触（ｃｏｎｔａｃｔ）を防止したとき、Ｂ細胞のＩｇＭ生成を抑制しないことが確認された（図１のＥ）。すなわち、ＭＳＣは、Ｂ細胞のＩｇＭ生成を誘導するが、ＰＭＡ－処理されたＭＳＣは、細胞－細胞接触（ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｃｏｎｔａｃｔ）依存的にＢ細胞のＩｇＭ生成を抑制することが確認された。
（実施例２．ＰＭＡ－処理されたＭＳＣがＢ細胞の移動に及ぼす影響分析）
ＭＳＣのケモカインをｍＲＮＡ水準とタンパク質水準でそれぞれＲＴ－ＰＣＲ（図２のＡ）とＥＬＩＳＡ（図２のＢ）を通じて分析した。ＭＳＣのＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２をｓｉＲＮＡを利用してノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ，ＫＤ）させた後、ｍＲＮＡ水準でＲＴ－ＰＣＲを通じて確認した。トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）を利用してＭＳＣに対するＢ細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を測定し、下部ウェル（ｌｏｗｅｒ ｗｅｌｌ）にはＭＳＣを、上部ウェル（ｕｐｐｅｒ ｗｅｌｌ）にはＢ細胞をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、１．５時間後、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）を利用して細胞数をカウント（ｃｏｕｎｔｉｎｇ）した（図２のＣ）。Ｃｕｌｔｕｒｅ－ｉｎｓｅｒｔ ｍ－Ｄｉｓｈ３５ｍｍを利用して左側にＭＳＣ（７０ｍｌ ｏｆ ０．３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を添加し、右側にＢ細胞（７０ｍｌ ｏｆ ３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を添加し、タイム－ラプスイメージング（Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｉｍａｇｉｎｇ）を利用して６時間の間撮影した後、代表的なＢ細胞の動きをグリーントラック（ｇｒｅｅｎ ｔｒａｃｋ）で表示した（図２のＤ）。撮影したムービを時間帯別にスナップショット（ｓｎａｐｓｈｏｔ）をとってＢ細胞の移動を観察した（図２のＥ）。スナップショット（ｓｎａｐｓｈｏｔ）の白色ボックス内にあるＴ細胞の数をグラフで表示した（図２のＦ）。
ＭＳＣのケモカインをｍＲＮＡ水準とタンパク質水準でそれぞれＲＴ－ＰＣＲ（図２のＡ）とＥＬＩＳＡ（図２のＢ）を通じて分析した。ＭＳＣのＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２をｓｉＲＮＡを利用してノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ，ＫＤ）させた後、ｍＲＮＡ水準でＲＴ－ＰＣＲを通じて確認した。トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）を利用してＭＳＣに対するＢ細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を測定し、下部ウェル（ｌｏｗｅｒ ｗｅｌｌ）にはＭＳＣを、上部ウェル（ｕｐｐｅｒ ｗｅｌｌ）にはＢ細胞をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、１．５時間後、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）を利用して細胞数をカウント（ｃｏｕｎｔｉｎｇ）した（図２のＣ）。Ｃｕｌｔｕｒｅ－ｉｎｓｅｒｔ ｍ－Ｄｉｓｈ３５ｍｍを利用して左側にＭＳＣ（７０ｍｌ ｏｆ ０．３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を添加し、右側にＢ細胞（７０ｍｌ ｏｆ ３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を添加し、タイム－ラプスイメージング（Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｉｍａｇｉｎｇ）を利用して６時間の間撮影した後、代表的なＢ細胞の動きをグリーントラック（ｇｒｅｅｎ ｔｒａｃｋ）で表示した（図２のＤ）。撮影したムービを時間帯別にスナップショット（ｓｎａｐｓｈｏｔ）をとってＢ細胞の移動を観察した（図２のＥ）。スナップショット（ｓｎａｐｓｈｏｔ）の白色ボックス内にあるＴ細胞の数をグラフで表示した（図２のＦ）。
ＰＭＡ－処理ＭＳＣは、細胞－細胞接触（ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｃｏｎｔａｃｔ）によりＢ細胞のＩｇＭを抑制したところ、２つの細胞間の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）および接触動力学（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｙｎａｍｉｃｓ）を研究し、細胞の移動に重要なケモカインシグナリング（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に関して研究を優先的に進めた。ＭＳＣがＣＣＬ２とＣＸＣＬ１２を発現することを確認し、ＰＭＡを処理すると、ＣＸＣＬ１０の発現が増加した（図２のＡおよびＢ）。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣで分泌するＣＸＣＬ１０の発現をノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ，ＫＤ）させると、ＰＭＡ－処理されたＭＳＣ側にＢ細胞が移動しないことを確認した（図２のＣ）。これをもう一度確認するために、イメージ撮影を進めた。対照群ＰＭＡ－処理されたＭＳＣ側にＢ細胞が移動したが、ＣＸＣＬ１０がノックダウンされたＰＭＡ－処理されたＭＳＣ側にはＢ細胞が移動しないことが確認された（図２のＤおよびＥ）。キャプチャーしたイメージのボックスにあるＢ細胞の数をカウント（ｃｏｕｎｔｉｎｇ）した結果、ＰＭＡ－処理されたＣＸＣＬ１０－ＫＤ ＭＳＣ（ＰＭＡ－ｔｒｅａｔｅｄ ａｎｄ ＣＸＣＬ１０－ＫＤ ＭＳＣ）と共に共培養を実施したＢ細胞の数が対照群より少ないことが確認された（図２のＦ）。
（実施例３．ＰＭＡ－処理されたＭＳＣがＢ細胞の接触に及ぼす影響分析）
Ｃｕｌｔｕｒｅ－Ｄｉｓｈ３５ｍｍを利用してＭＳＣ（０．２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとＢ細胞（２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を添加し、タイム－ラプスイメージング（Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｉｍａｇｉｎｇ）を利用して３時間の間撮影した後、代表的なＢ細胞の動きをグリーントラック（ｇｒｅｅｎ ｔｒａｃｋ）で表示した（図３のＡ）。撮影したムービを時間帯別にスナップショット（ｓｎａｐｓｈｏｔ）をとってＢ細胞とＭＳＣの接触を緑色矢印（ｇｒｅｅｎ ａｒｒｏｗ）で表示した（図３のＢ）。時間帯別にＭＳＣに接触するＢ細胞の数を分析した（図３のＣ）。ＭＳＣと接触しないＢ細胞の速度とＭＳＣと接触したＢ細胞の速度をグラフで表示した（図３のＤ）。１つのＭＳＣに接触するＢ細胞の数とＭＳＣとＢ細胞が接触するときの接触時間を分析した（図３のＥ）。
Ｃｕｌｔｕｒｅ－Ｄｉｓｈ３５ｍｍを利用してＭＳＣ（０．２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとＢ細胞（２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を添加し、タイム－ラプスイメージング（Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｉｍａｇｉｎｇ）を利用して３時間の間撮影した後、代表的なＢ細胞の動きをグリーントラック（ｇｒｅｅｎ ｔｒａｃｋ）で表示した（図３のＡ）。撮影したムービを時間帯別にスナップショット（ｓｎａｐｓｈｏｔ）をとってＢ細胞とＭＳＣの接触を緑色矢印（ｇｒｅｅｎ ａｒｒｏｗ）で表示した（図３のＢ）。時間帯別にＭＳＣに接触するＢ細胞の数を分析した（図３のＣ）。ＭＳＣと接触しないＢ細胞の速度とＭＳＣと接触したＢ細胞の速度をグラフで表示した（図３のＤ）。１つのＭＳＣに接触するＢ細胞の数とＭＳＣとＢ細胞が接触するときの接触時間を分析した（図３のＥ）。
ＰＭＡ－処理されたＭＳＣとＢ細胞の接触を単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）水準で確認するために、２つの細胞を直接混ぜて分析した。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣをＢ細胞と混ぜた後、２分間隔で６時間の間撮影を実施し、対照群ＰＭＡ－処理されたＭＳＣに比べてＣＸＣＬ１０がノックダウン（ＫＤ）されたＰＭＡ－処理されたＭＳＣとＢ細胞の接触が減少することが確認された（図３のＡ）。時間帯別に見たときにも、対照群ＰＭＡ－処理されたＭＳＣに比べて、ＣＸＣＬ１０がノックダウンされたＰＭＡ－処理されたＭＳＣとＢ細胞の接触は増加しなかった（図３のＢおよびＣ）。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣの種類と関係なく、ＰＭＡ－処理されたＭＳＣに接触しないＢ細胞は、約６～７μｍ／ｍｉｎの速度を示し、接触するＢ細胞は、約２～３μｍ／ｍｉｎの速度を示した（図３のＤ）。対照群であるＰＭＡ－処理されたＭＳＣは、３時間の間に平均的にＢ細胞と４回接触し、１回接触するたびに８０分間接触した。反面、ＣＸＣＬ１０がノックダウンされ、ＰＭＡ－処理されたＭＳＣ（ＣＸＣＬ１０－ＫＤ ＰＭＡ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＳＣ）は、３時間の間に平均的にＢ細胞と２回接触し、１回接触するたびに８９分の時間がかかることを確認した（図３のＥ）。すなわち、ＰＭＡ－処理されたＭＳＣから分泌するＣＸＣＬ１０は、Ｂ細胞と接触を調節することが確認された。
（実施例４．ＰＭＡ－処理されたＭＳＣで発現するＰＤ－Ｌ１がＢ細胞の機能に及ぼす影響分析）
ＭＳＣにＰＭＡを処理して２４時間後、タンパク質を得、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を通じてシグナリング（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を分析した（図４のＡ）。ＭＳＣにＰＫＣ阻害剤（Ｇｏ６９８３，１μｇ／ｍｌ）を１時間前処理し、ＰＭＡを処理した後、２４時間後、タンパク質を得、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を通じてシグナリング（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を分析した（図４のＢ）。ＭＳＣにＰＫＣ阻害剤（Ｇｏ６９８３、１μｇ／ｍｌ）を１時間前処理し、ＰＭＡを処理した後、ＰＢＭＣから分離したＢ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＰＭＡ－処理されたＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＯＤＮと共に７２時間の間共培養を実施した後、上澄み液中にあるＩｇＭの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図４のＣ）。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣの表面分子（ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）のｍＲＮＡ水準をＲＴ－ＰＣＲを通じて分析した（図４のＤ）。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣのＰＤ－Ｌ１とＢ細胞のＰＤ１の発現をＦＡＣＳを通じて分析した（図４のＥ）。ＭＳＣにＦａｓＬ ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）（Ｆ）とＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）（Ｇ）をそれぞれ処理し、ＰＭＡを入れた後、ＭＳＣとＢ細胞をＯＤＮと共に７２時間の間培養した後、上澄み液にあるＩｇＭ水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣをｓｉＲＮＡを処理してＰＤ－Ｌ１をｍＲＮＡ水準でＲＴ－ＰＣＲを通じて確認した。ＰＤ－Ｌ１がノックダウンされたＰＭＡ－処理されたＭＳＣとＢ細胞をＯＤＮと共に７２時間の間培養した後、上澄み液にあるＩｇＭ水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図４のＨ）。ＭＳＣにＰＭＡを処理して２４時間後、トータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を得、ＲＴ－ＰＣＲを通じて可溶性因子（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ）を分析した（図４のＩ）。
ＭＳＣにＰＭＡを処理して２４時間後、タンパク質を得、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を通じてシグナリング（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を分析した（図４のＡ）。ＭＳＣにＰＫＣ阻害剤（Ｇｏ６９８３，１μｇ／ｍｌ）を１時間前処理し、ＰＭＡを処理した後、２４時間後、タンパク質を得、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を通じてシグナリング（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を分析した（図４のＢ）。ＭＳＣにＰＫＣ阻害剤（Ｇｏ６９８３、１μｇ／ｍｌ）を１時間前処理し、ＰＭＡを処理した後、ＰＢＭＣから分離したＢ細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とＰＭＡ－処理されたＭＳＣ（１×１０３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＯＤＮと共に７２時間の間共培養を実施した後、上澄み液中にあるＩｇＭの水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図４のＣ）。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣの表面分子（ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）のｍＲＮＡ水準をＲＴ－ＰＣＲを通じて分析した（図４のＤ）。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣのＰＤ－Ｌ１とＢ細胞のＰＤ１の発現をＦＡＣＳを通じて分析した（図４のＥ）。ＭＳＣにＦａｓＬ ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）（Ｆ）とＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）（Ｇ）をそれぞれ処理し、ＰＭＡを入れた後、ＭＳＣとＢ細胞をＯＤＮと共に７２時間の間培養した後、上澄み液にあるＩｇＭ水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣをｓｉＲＮＡを処理してＰＤ－Ｌ１をｍＲＮＡ水準でＲＴ－ＰＣＲを通じて確認した。ＰＤ－Ｌ１がノックダウンされたＰＭＡ－処理されたＭＳＣとＢ細胞をＯＤＮと共に７２時間の間培養した後、上澄み液にあるＩｇＭ水準をＥＬＩＳＡを通じて測定した（図４のＨ）。ＭＳＣにＰＭＡを処理して２４時間後、トータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を得、ＲＴ－ＰＣＲを通じて可溶性因子（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ）を分析した（図４のＩ）。
ＰＭＡは、ＰＫＣ活性化剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で細胞質内ＰＫＣを活性化させてプラズマ膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移動させる。ＭＳＣにＰＭＡを処理した場合、細胞質内ＰＫＣ－α、δを細胞膜に移動させ、ＥＲＫのリン酸化を増加させることが確認された（図４のＡ）。ＭＳＣにＰＫＣ阻害剤を前処理したとき、ＰＭＡによるＰＫＣ－α、δの細胞膜移動が阻害されることが確認され（図４のＢ）、Ｂ細胞のＩｇＭ生成を抑制しないことが確認された（図４のＣ）。ＭＳＣにＰＭＡを処理したとき、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＦａｓＬが発現することが確認された（図４のＤおよびＥ）。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣにＦａｓＬ ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｂを処理したとき、Ｂ細胞のＩｇＭ生成を抑制したが（図４のＦ）、ＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｂを処理したとき、Ｂ細胞のＩｇＭ生成を抑制しなかった（図４のＧ）。また、ＰＭＡ－処理されたＭＳＣでＰＤ－Ｌ１発現をノックダウン（ＫＤ）させた場合、Ｂ細胞のＩｇＭ生成を抑制しなかった（図４のＨ）。ＭＳＣにＰＭＡを処理した場合、細胞内ＴＧＦ－β、ＣＯＸ－２、ｉＮＯＳ、ＩＤＯ発現には、影響がなかった（図４のＩ）。すなわち、ＰＭＡは、ＭＳＣのＰＤ－Ｌ１発現を誘導してＢ細胞のＩｇＭ生成を抑制することが確認された。
（実施例５．ＰＭＡ－処理されたＭＳＣで発現するＰＤＬ１がＢ細胞の細胞死に及ぼす影響分析）
ＰＭＡ－処理されたＭＳＣにＰＤＬ１ ｓｉＲＮＡを処理した後、２４時間の間共培養し、細胞をアネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ－ＡＰＣとＰＩ－ＰＥを利用して染色した後、ＦＡＣＳを通じて分析した（図５のＡ）。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣにＰＤＬ１ ｓｉＲＮＡを処理した後、２４時間の間共培養した後、カスパーゼＡｂ（Ｃａｓｐａｓｅ Ａｂ）を添加し、１時間後、ＦＡＣＳを通じて分析した（図５のＢ）。
ＰＭＡ－処理されたＭＳＣにＰＤＬ１ ｓｉＲＮＡを処理した後、２４時間の間共培養し、細胞をアネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ－ＡＰＣとＰＩ－ＰＥを利用して染色した後、ＦＡＣＳを通じて分析した（図５のＡ）。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣにＰＤＬ１ ｓｉＲＮＡを処理した後、２４時間の間共培養した後、カスパーゼＡｂ（Ｃａｓｐａｓｅ Ａｂ）を添加し、１時間後、ＦＡＣＳを通じて分析した（図５のＢ）。
ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ１を発現する細胞の細胞死を誘導する。本実験では、ＰＭＡ－処理されたＭＳＣのＰＤ－Ｌ１がＢ細胞表面のＰＤ１に結合してＢ細胞の細胞死を誘導するかを検証した。ＰＤ－Ｌ１がＰＤ１に結合すると、Ｂ細胞内カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）が活性化し、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が誘導される。細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が進行されると、細胞膜の内側にあるＰＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ｓｅｒｉｎ）が細胞膜の外側に露出し、これにアネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）が結合して細胞死を測定することができる。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣは、Ｂ細胞にカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）の発現を強く増加させ（図５のＢ）、ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色を増加させた（図５のＡ）。しかしながら、ＰＤ－Ｌ１ ｓｉＲＮＡ形質感染された（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）ＭＳＣは、Ｂ ｃｅｌｌのカスパーゼ活性化（ｃａｓｐａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）とアネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ染色を増加させなかった（図５のＡおよびＢ）。以上の結果から、ＰＭＡは、ＭＳＣのＰＤ－Ｌ１の発現を増加させ、Ｂ細胞のＰＤ１に結合してＢ細胞の細胞死（Ｂ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を増加させることが分かる。
（実施例６．ＰＭＡ－処理されたｈＭＳＣ投与によるＭＲＬ／ｌｐｒマウスの治療効果確認）
ＰＭＡ－処理されたＭＳＣに対する治療効果実験を進めるために、自然発生ループス動物モデルであるＭＲＬ／ｌｐｒマウスを通じて治療効果を検証した。ＭＳＣを４×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅの濃度でマウスに静脈注射し、投与時期は、マウスの発病が始める１２週齢から１回注射した（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス１２週齢に対照群（希釈液）、ＭＳＣ ４×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎを投与する）。動物実験の測定指標としては、毎週マウスの生存率と体重を確認し、２週間隔でａｎｔｉ－ｄｓＤＮＡ、ＩｇＧを測定した。生存率（図６のＡ）と体重（図６のＢ）を毎週測定し、３週間隔で血清を分離してａｎｔｉ－ｄｓＤＮＡ Ａｂ（図６のＣ）、トータル（ｔｏｔａｌ）ＩｇＧ（図６のＤ）を測定した。２４週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスから脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）を分離して、細胞を獲得し、抗体を利用して細胞を染色した後、ＦＡＣＳで細胞表現型を測定した（図６のＥ）。その後、細胞のトータル（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡを得た後、ＲＴ－ＰＣＲを通じて炎症性サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の発現を測定した（図６のＦ）。
ＰＭＡ－処理されたＭＳＣに対する治療効果実験を進めるために、自然発生ループス動物モデルであるＭＲＬ／ｌｐｒマウスを通じて治療効果を検証した。ＭＳＣを４×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅの濃度でマウスに静脈注射し、投与時期は、マウスの発病が始める１２週齢から１回注射した（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス１２週齢に対照群（希釈液）、ＭＳＣ ４×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎを投与する）。動物実験の測定指標としては、毎週マウスの生存率と体重を確認し、２週間隔でａｎｔｉ－ｄｓＤＮＡ、ＩｇＧを測定した。生存率（図６のＡ）と体重（図６のＢ）を毎週測定し、３週間隔で血清を分離してａｎｔｉ－ｄｓＤＮＡ Ａｂ（図６のＣ）、トータル（ｔｏｔａｌ）ＩｇＧ（図６のＤ）を測定した。２４週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスから脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）を分離して、細胞を獲得し、抗体を利用して細胞を染色した後、ＦＡＣＳで細胞表現型を測定した（図６のＥ）。その後、細胞のトータル（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡを得た後、ＲＴ－ＰＣＲを通じて炎症性サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の発現を測定した（図６のＦ）。
ＰＭＡ－処理されたＭＳＣを投与群のマウスは、３０週齢まで１００％生存したが、ＩＦＮ－γ－処理されたＭＳＣとＭＳＣを投与群のマウスは、それぞれ０％、３３％のみが生存した（図６のＡ）。ＭＳＣは、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの体重に影響を与えなく、これからＭＳＣは、マウスに毒性を示さないことが分かる（図６のＢ）。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣとＩＦＮ－γ－処理されたＭＳＣは、対照群に比べて血中ａｎｔｉ－ｄｓＤＮＡ Ａｂ、ｔｏｔａｌ ＩｇＧの濃度を抑制したが、ＭＳＣは、ａｎｔｉ－ｄｓＤＮＡ Ａｂ、ｔｏｔａｌ ＩｇＧの濃度を抑制しなかった（図６のＣおよびＤ）。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣは、対照群に比べてＴ細胞表現型であるＣＤ３の割合と、プラズマ（ｐｌａｓｍａ）細胞表現型であるＣＤ１３８＋ＩｇＧ＋の割合を減少させ、Ｔｒｅｇ細胞表現型であるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋の割合を増加させた（図６のＥ）。また、サイトカイン発現量をＲＴ－ＰＣＲを通じて分析した結果、ＰＭＡ－処理されたＭＳＣは、対照群に比べて炎症性サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の発現量を減少させることが確認された（図６のＦ）。
（実施例７．ＰＭＡ－処理されたｈＭＳＣ投与によるＭＲＬ／ｌｐｒマウスの腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）内免疫細胞分析）
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに対照群（希釈液）、ＭＳＣ（４×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を１２週齢に投与した後、２４週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスから腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）を分離してホルマリンで固定し、免疫細胞の浸潤性をＤＡＢ染色を利用して測定した。
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに対照群（希釈液）、ＭＳＣ（４×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を１２週齢に投与した後、２４週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスから腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）を分離してホルマリンで固定し、免疫細胞の浸潤性をＤＡＢ染色を利用して測定した。
ループス疾病は、自己抗体と免疫複合体により腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）に炎症が発生し、免疫細胞の浸潤が増加する。それで、マウスの腎臓を分離し、ＤＡＢ染色法を通じて細胞の浸潤度を確認した。ＰＭＡ－処理されたＭＳＣは、対照群に比べてＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞の腎臓浸潤を減少させ、Ｔｒｅｇの浸潤を増加させた（図７のＡ、Ｂ）。結論的に、ＰＭＡ－処理されたＭＳＣは、ループス疾病の治療効果を示し、従前のＭＳＣより優れた治療効果を示した。
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
Claims (12)
- タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を含む自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記タンパク質キナーゼＣ活性化剤は、ホルボールミリステートアセテート、インゲノール３－アンゲレート、ブリオスタチン－１、ホルボール－１２，１３－ジブチラート、プロストラチン、Ｎ－（６－フェニルヘキシル）－５－クロロ－１－ナフタレンスルホンアミドおよび５－クロロ－Ｎ－ヘプチルナフタレン－１－スルホンアミドよりなる群から選ばれる１つ以上を含むことを特徴とする請求項１に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記幹細胞は、成体幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）または胚性幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞、間葉系ストローマ細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）または多分化能幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記タンパク質キナーゼＣ活性化剤は、幹細胞のＣＸＣＬ１０の発現を増加させることを特徴とする請求項１に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記タンパク質キナーゼＣ活性化剤は、幹細胞のＰＤ－Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）の発現を増加させることによってＢ細胞の細胞死を増加させることを特徴とする請求項１に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記自己免疫疾患は、ループス（全身性紅斑性狼瘡）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、全身性強皮症（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、アトピー皮膚炎、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ）、乾癬、天疱瘡、喘息、アフタ性口内炎、慢性甲状腺炎、炎症性腸炎、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、自己免疫性溶血性貧血（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、結節性多発動脈炎（Ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）、強直性脊椎炎（Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、線維筋痛症候群（Ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）および側頭動脈炎（Ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｒｔｅｒｉｔｉｓ）よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 請求項１に記載の組成物をヒトを除いた個体に投与する段階を含む、自己免疫疾患の予防または治療方法。
- 幹細胞にタンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を添加して培養する段階を含む、免疫抑制剤の製造方法。
- タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を被験体に投与する段階を含む、ヒトを除いた被験体の免疫反応を抑制する方法。
- タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を含む薬学的組成物を個体に投与または服用させる段階を含む自己免疫疾患の予防または治療方法。
- タンパク質キナーゼＣ活性化剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で処理された幹細胞またはその培養物を含む薬学的組成物の自己免疫疾患の予防または治療用途。
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