MXPA05001992A - Expansion ex-vivo de poblaciones de celulas de tallo, hematopoyeticas, en cultivos de celulas mononucleares. - Google Patents

Expansion ex-vivo de poblaciones de celulas de tallo, hematopoyeticas, en cultivos de celulas mononucleares.

Info

Publication number
MXPA05001992A
MXPA05001992A MXPA05001992A MXPA05001992A MXPA05001992A MX PA05001992 A MXPA05001992 A MX PA05001992A MX PA05001992 A MXPA05001992 A MX PA05001992A MX PA05001992 A MXPA05001992 A MX PA05001992A MX PA05001992 A MXPA05001992 A MX PA05001992A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
cells
hematopoietic
mononuclear cells
nicotinamide
stem cells
Prior art date
Application number
MXPA05001992A
Other languages
English (en)
Inventor
Oren Rosen
Original Assignee
Gamida Cell Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from IL15290402A external-priority patent/IL152904A0/xx
Priority claimed from PCT/IL2003/000062 external-priority patent/WO2003062404A1/en
Application filed by Gamida Cell Ltd filed Critical Gamida Cell Ltd
Publication of MXPA05001992A publication Critical patent/MXPA05001992A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70567—Nuclear receptors, e.g. retinoic acid receptor [RAR], RXR, nuclear orphan receptors

Abstract

Se divulgan metodos ex-vivo de expansion de celulas de tallo hematopoyeticas de celulas mononucleares hematopoyeticas que comprenden una fraccion principal de celulas comprometidas hematopoyeticas, y una fraccion menos de celulas progenitoras de tallo hematopoyeticas, poblaciones expandidas de celulas de tallo hematopoyeticas asi obtenidas y sus usos.

Description

EXPANSION EX-VIVO DE POBLACIONES DE CELULAS DE TALLO, HEMATOPOYE ICAS, EN CULTIVOS DE CELULAS MONONUCLEARES CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCION La presente invención se relaciona a métodos de expansión ex-vivo (auto-renovación) de células de tallo o células madre hematopoyéticas presentes en la fracción de células mononucleares hematopoyéticas de una muestra de sangre y a poblaciones expandidas (auto-renovadas) de células de tallo hematopoyéticas obtenidas de esta manera. La presente invención además se relaciona a aplicaciones terapéuticas en las cuales se utilizan estos métodos y/o las poblaciones de células de tallo hematopoyéticas expandidas obtenidas de esta manera. Una necesidad incrementada para cultivos ex-vivo de células de tallo hematopoyéticas ha surgido, en particular para propósitos tal como la expansión de células de tallo y la transducción del gen de mediación retroviral. Los métodos para generar cultivos ex-vivo de células de tallo, sin embargo, típicamente resultan en una declinación rápida en la actividad de la población de células dé tallo, dando por resultado adicionalmente un potencial de auto-renovación notablemente deteriorado y capacidad de transplante disminuida de las poblaciones de células cultivadas. La necesidad para mejorar tales métodos es ampliamente reconocida. Adicionalmente, las aplicaciones en la terapia génica usando vectores retrovirales necesitan el uso de células de tallo hematopoyéticas proliferantes, pero requieren que estas células permanezcan no .diferenciadas mientras que están en cultivo, con el fin de mantener la expresión a largo plazo del gen transducido. Asi, la habilidad para mantener los cultivos ex-vivo de poblaciones de células de tallo hematopoyéticas con capacidad de auto-renovación a largo plazo es de importancia critica para un amplio arreglo de aplicaciones terapéuticas médicas. Actualmente, la expansión de las células de tallo renovables se ha obtenido ya sea al cultivar las células de tallo sobre una capa alimentadora de células de fibroblasto o al cultivar las células en la presencia de la trombopoyetina de citoquinas de acción temprana (TPO) , interleucina-6 (IL-6) , un ligando FLT-3 y el factor de célula de tall'o (SCF) (Madlambayan GJ y colaboradores (2001) J Hematother Stem Cell Res 10:481, Punzel M y colaboradores (1999) Leukemia 13:92, y Lange W y colaboradores (1996) Leukemia 10:943) . Mientras que la expansión de las células de tallo sobre una capa alimentadora resulta en una vasta expansión de células sustancialmente interminable, la expansión de las células de tallo sin una capa alimentadora, en la presencia de la citoquinas de acción temprana listadas en lo anterior, resulta en un grado elevado de diferenciación (ver los controles descritos en la sección de Ejemplos y Leslie NR y colaboradores (Blood (1998) 92:4798), Petzer AL y colaboradores (1996) J Exp Med Jun 183-2551, Kawa Y y colaboradores (2000) Pigment Cell Res 8:73). Por consiguiente, la auto-renovación (expansión) de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas tanto in-vivo como in-vitro, está limitada por la diferenciación celular. La diferenciación en el sistema hematopoyético implica, entre otros cambios, expresión alterada de los antigenos de superficie (Sieff C, Bicknell D, Caine G, Robinson J, Lam G, Greaves MF (1982) , Changes in cell surface antigen expresión during hematopoietic differentiation. Blood 60:703). En el humano normal, la mayoría de las células de tallo pluripotentes hematopoyéticas y las células progenitoras comprometidas de linaje son CD34+. La mayoría de las células son CD34+CD38+, con una minoría de células (<10%) que es CD34+CD38-. El fenotipo CD34+CD38- aparece para identificar las células hematopoyéticas más inmaduras, que son incapaces de la auto-renovación y la diferenciación de multi-linaj e . La fracción de células CD34+CD38- contiene más células de iniciación de cultivo a largo plazo (LTC-IC) pre-CFU y exhibe mantenimiento más largo de su fenotipo y respuesta proliferativa retardada a la citoquinas como es comparado con las células CD34+CD38+. Las células CD34+CD38- pueden dar origen a células linfoides y mieloides in-vitro y tienen una capacidad incrementada para repoblar a los ratones SCID (Bhatia M. Wang JCY, Kapp U, Bonnet D. Dick JE (1997) Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. Proc. Natl Acad Sci usa 94:5320). Además, en ' pacientes quienes recibieron transplante de células de sangre autólogo, el número de células CD34+CD38- infusionadas se correlaciona positivamente con la velocidad de recuperación hematopoyética. En linea con estas características funcionales, las células CD34+CD38- se han mostrado que tienen niveles detectables de telomerasa. Los trabajos actualmente publicados sobre la expansión ex-vivo de células de tallo y progenitoras he atopoyéticas implican inóculos de partida de células, que son altamente enriquecidos con células progenitoras que expresan CD34 o, aun más temprano, antígenos AC133 [Dexter, T.M., T.D. Alien y L.G. Lajtha, Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in-vitro. J. Cell Physiol, 1977. 91(3): p. 335-44; Muench, M.O., J.G. Schneider y M.A. Moore, Interactions among colony-stimulating factors, IL-1 beta, IL-6 and kit-ligand in the regulation of primitive murine hematopoietic cells. Exp. Hematol, 1992. 20(3): p. 339-49; Verfaillie, C.M., Direct contact between human primitive hepatopoietic progenitors and bone marrow stroma is not required for long-term in vitro hematopoyesis. Blood, 1992. 79(11): p. 2821-26; Migliaccio, G., A.R. Migliaccio, M.L. Druzin, P.J. Giardina, K.M. Zsebo y J.W. Adamson, Long-term generation of colony-forming cells in liquid culture of CD34+ cord blood cells in the presence of recombinant human stem cell factor. Blood, 1992. 79(10): p.2620-27; Purdy, M.H., C.J. Hogan, L. Hami, I. McNiece, W. Franklin, R.B. Jones, S.I. Bearman, R.J. Berenson, .P.J. Cagnoni y S. Heimfeld, Large volume ex-vivo expansión of CD34-positive hematopoietic progenitor cells for transplantation. J. Hematother., 1995. 4(6): p. 515-25; McMiece, I., R. Andrews, M. Stewart, S. Clark, T. Boone y P. Quesenberry, Action of interleukin-3, G-CSF, and GM-CSF on highly enriched human hematopoietic progenitor cells: synergistic interaction of GM-CSF plus G-CSF. Blood, 1989. 74(1): p. 110-14; Colter, M. , M. Jones y S. Heimfeld, CD34+ progenitor cell selection: clinical transplantation, tumor cell purging, gene therapy, ex-vivo expansión, and cord blood processing J Hematother, 1996, 5(2): pl79-84; Kohler, T . , R. Plettig, W. Wetzstein, B. Schaffer, R. Ordemann, H.O. Nagels, G. Ehninger y M. Bornhauser, defining optimum conditions for the ex-vivo expansión of human umbilical cord blood cells. Influences of progenitor enrichment, interference with feeder layers, early-acting cytokines and agitation of culture vessels. Stem Cells, 1999. 17(1): p. 19-24]. Como se mostró que la iniciación de los cultivos ex-vivo con la fracción de células mononucleares (MNC) completa en la presencia de citoquinas condujo a la expansión de CFUc durante las primeras semanas de cultivo, seguido por un deterioro rápido de los cultivos, se ha aceptado ampliamente hasta ahora que la purificación de células CD34+ (o AC 133) es un prerrequisito para obtener la expansión ex-vivo exitosa de células de tallo hematopoyéticas [Briddell, R., Karen, B.P., Zilm, K.L., y colaboradores, Purification of CD34+ cell is essential for optimal ex-vivo expansión of umbilical cord blood cells, J. Hematother. 6:145, 1997; Ian K McNiece, Gregory G. Stoney, Brent P. Karen y Robert A. Briddell CD34+ cell selection from frozen cord blood products using Isolex 300i and cliniMACS™ selection device. Journal of hematotherapy 7:457-461 (1998)], asi como células que forman colonias de cultivo a largo plazo (LTC-CFUc) . O 99/40783, O 00/18885 y Peled y colaboradores, Brit . J. Haematol . 116:655 2002, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia como si se expusieran completamente en la presente, enseñan el efecto del cobre libre presente en las células sobre la modulación del balance entre la auto-renovación y la diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas. Estas referencias enseñan que la adición de agentes que son capaces de reducir el contenido de cobre de la célula, junto con las citoquinas de acción temprana, a los cultivos de células CD34+ resulta en la expansión de células CD34+ a largo plazo ex-vivo en cultivo. De acuerdo con las enseñanzas de estas referencias, tales agentes de preferencia incluyen agentes quelantes de metal de transición que son capaces de enlazar cobre, tales como, por e emplo, poliaminas lineales (por ejemplo tetraetilenpentamina, TEPA) . Por consiguiente, se muestra en estas referencias que la adición de 5-10 uM TEPA a los cultivos de células CD34+ en la presencia de citoquinas de acción temprana redujo el contenido de cobre de la célula por 30% (como es medido mediante la absorción atómica) y extendió la duración de los cultivos a largo plazo en términos del CFU a largo plazo y en la expansión de células CD34+. Sin embargo, los métodos divulgados en estas referencias también implican- la purificación de células de tallo o progenitoras antes de su expansión en cultivos. Asi, usando la tecnología de hoy en día, las células de tallo o células madre no pueden ser expandidas a menos que primero se enriquezcan sustancialmente o se aislen hasta la homogeneidad y por lo tanto los métodos actualmente conocidos de expansión ex-vivo de poblaciones de células de tallo están limitados por el proceso laborioso y costoso del enriquecimiento de células de tallo antes de la iniciación de los cultivos. Así, hay una necesidad ampliamente reconocida por, y sería altamente ventajoso tener, métodos de expansión exvivo de células de tallo hematopoyéticas sin el enriquecimiento previo de células de tallo.
BREVE DESCRIPCION DE IA INVENCION La presente invención divulga el uso de varios agentes en la expansión de células de tallo hematopoyéticas presentes en la fracción de células mononucleares hematopoyéticas de una muestra de sangre, sin el uso de un procedimiento de enriquecimiento de células de tallo previo, a poblaciones expandidas (auto-renovadas) de células de tallo hematopoyéticas obtenidas de esta manera y a sus usos . De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un método de expansión ex-vivo de una población de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, se inhibe sustancialmente la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo. En una modalidad, el método comprende proporcionar células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación de células ex-vivo y, al mismo tiempo, para reducir una expresión y/o actividad de CD38, para de esta expandir una población de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas exvivo. En otra modalidad el método comprende proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación de células ex-vivo y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoides y/o Vitamina D, para de esta manera expandir la población de las células de tallo hematopoyéticas mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo ex-vivo. En todavía otra modalidad , el método comprende proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación de células ex-vivo y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización que implican el receptor de ácido retinoico, receptor de retinoide X y/o receptor de Vitamina D, para de esta manera expandir la población de las células de tallo hematopoyéticas mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas exvivo. En todavía otra modalidad el método comprende proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación de células ex-vivo y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización que implican PI 3-quinasa, para de esta manera expandir la población de las células de tallo hematopoyéticas mientras que al mismo tiempo, ' sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo. En todavía otra modalidad, el método comprende proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación de células ex-vivo y, al mismo tiempo, con nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida, para de esta manera expandir la población de las células de tallo hematopoyéticas mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas exvivo. En todavía otra modalidad, el método comprende proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación de células ex-vivo y, al mismo tiempo, con un inhibidor de PI 3-quinasa, para de esta manera expandir la población de las células de tallo hematopoyéticas mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo. En todavía otra modalidad, el método comprende proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación de células ex-vivo y, al mismo tiempo con uno o más agente (s) quelante(s) de cobre o quelato(s) de cobre, para de esta manera expandir la población de las células de tallo hematopoyéticas mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo. Además de acuerdo con la presente invención, se proporcionan poblaciones expandidas ex-vivo de células de tallo hematopoyéticas, obtenidas por los métodos descritos antes en la presente. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método de transplante o implante de células hematopoyéticas . En una modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un donador; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación de células y, al mismo tiempo, para reducir una expresión y/o actividad de CD38, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo y (c) transplantar o implantar las células de tallo hematopoyéticas a un recipiente o recibido . En otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un donador; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación de células y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoide y/o Vitamina D, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo, y (c) transplantar o implantar las células de tallo hematopoyéticas a un recipiente. En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un donador; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación de células y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización que implican el receptor de ácido retinoico, el receptor de retinoide X y el receptor de Vitamina D, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo; y (c) transplantar o implantar las células de tallo hematopoyéticas a un recipiente. En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un donador; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación de células y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a rutas de señalización que implican PI quinasa, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo; y (c) transplantar o implantar las células de tallo hematopoyéticas a un recipiente. En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un donador; (b) proporcionar las células mononücl.eares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y con nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o análogo de nicotinamida, para . de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo; y (c) transplantar o implantar las células de tallo hematopoyéticas a un recipiente. En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un donador; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vívo para la proliferación celular y con un inhibidor de PI 3-quinasa, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo; y (c) transplantar o implantar las células de tallo hematopoyéticas a un recipiente. En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un donador; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo reducir la expresión y/o actividad de PI 3-quinasa, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo; y (c) transplantar o implantar las células de tallo hematopoyéticas a un recipiente. En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un donador; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y con uno o más agente (s) quelante(s) o quelato(s) de cobre, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialiciente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo; y (c) transplantar o implantar las células de tallo hematopoyéticas a un recipiente. El donador y el recipiente en los métodos anteriores pueden ser un solo individuo o diferentes individuos, por ejemplo, individuos alogeneicos o xenogeneicos . De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención se proporcionan preparaciones de células hematopoyéticas transplantables . En una modalidad, una preparación de células hematopoyéticas transplantable de la presente invención comprende una población expandida de células de tallo hematopoyéticas propagadas ex-vivo a partir de células mononucleares hematopoyéticas que comprenden, antes de la expansión, una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, en la presencia de una cantidad efectiva de un agente para reducir una expresión y/o actividad de CD38, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas, y un portador farmacéuticamente aceptable . En otra modalidad, una preparación de células hematopoyéticas transplantable de la presente invención comprende una población expandida de células de tallo hematopoyéticas propagadas ex-vivo a partir de células mononucleares, hematopoyéticas que comprenden, antes de la expansión, una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, en la presencia de una cantidad efectiva de un agente para reducir una expresión y/o actividad de PI 3-quinasa, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas, y un portador f rmacéuticamente aceptable . En todavía otra modalidad, una preparación de células hematopoyéticas transplantable de la presente invención comprende una población expandida de células de tallo hematopoyéticas propagadas ex-vivo a partir de células mononucleares hematopoyéticas que comprenden, antes de la expansión, una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, en la presencia de una cantidad efectiva de un agente, el agente que reduce una capacidad de la célula mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoides y/o Vitamina D, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas, y un portador farmacéuticamente aceptable. En todavía otra modalidad, una preparación de células hematopoyéticas transplantable de la presente invención comprende una población expandida de células de tallo hematopoyéticas propagadas ex-vivo a partir de células mononucleares hematopoyéticas que comprenden, antes de la expansión, una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, en la presencia de una cantidad efectiva de un agente, el agente que reduce una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a la señalización del receptor de ácido retinoico, receptor de retinoide X y receptor de Vitamina D, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células · de tallo hematopoyéticas, y un portador farmacéuticamente aceptable. En todavía otra modalidad, una preparación de células hematopoyéticas transplantable de la presente invención comprende una población expandida de células de tallo hematopoyéticas propagadas ex-vivo a partir de células mononucleares hematopoyéticas que comprenden, antes de la expansión, una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, en la presencia de una cantidad efectiva de un agente, el agente que reduce una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a la señalización de PI 3-quinasa, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas, y un portador farmacéu icamente aceptable . En todavía otra modalidad, una preparación de células hematopoyéticas transplantable de la presente invención comprende una población expandida de células de tallo hematopoyéticas propagadas ex-vivo a partir de células mononucleares hematopoyéticas que comprenden, antes de la expansión, una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, en la presencia de una cantidad efectiva de un agente seleccionado del grupo que consiste de nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida y un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas, y un portador farmacéuticamente aceptable. En todavía otra modalidad, una preparación de células hematopoyéticas transplantable de la presente invención comprende una población expandida de células de tallo hematopoyéticas propagadas ex-vivo a partir de células mononucleares hematopoyéticas que comprenden, antes de la expansión, una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, en la presencia de una cantidad efectiva de un inhibidor de PI 3-quinasa, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas, y un portador farmacéuticamente aceptable. En todavía otra modalidad, una preparación de células hematopoyéticas transplantable de la presente invención comprende una población expandida de células de tallo hematopoyéticas propagadas ex-vivo a partir de células mononucleares hematopoyéticas que comprenden, antes de la expansión, una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, en la presencia de una cantidad efectiva de uno o más agente (s) quelante(s) de cobre o quelato(s) de cobre, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas, y un portador farmacéuticamente aceptable . De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método de inmunoterapia adoptiva. En una modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitores hematopoyéticas a partir de un recipiente; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, para reducir una expresión y/o actividad de CD38, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se' inhibe la diferenciación dé las células de tallo hematopoyéticas; y c) transplantar las células de tallo hematopoyéticas al recipiente. En otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un recipiente; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoides y/o Vitamina D, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas; y c) transplantar las células de tallo hematopoyéticas al recipiente. En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un recipiente; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a rutas de señalización que implican el receptor de ácido retinoico y/o receptor de retinoide X y/o el receptor de Vitamina D, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas; y c) transplantar las células de tallo hematopoyéticas al recipiente. En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un recipiente; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a rutas de señalización que' implican PI 3-quinasa, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas; y c) transplantar las células de tallo hematopoyéticas al recipiente. En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un recipiente; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y con nicotinamida, una análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida, o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas; y c) transplantar las células de tallo hematopoyéticas al recipiente o recibidor. En todavía otra modalidad, el método que comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un recipiente; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones .de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y con un inhibidor de PI 3-quinasa, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas; y c) transplantar las células de tallo hematopoyéticas al recipiente. En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un recipiente; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y con un o más agente (s) quelante(s) de cobre o quelato(s), para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas; y c) transplantar las células de tallo hematopoyéticas al recipiente. Además, de acuerdo con un aspecto' de la presente invención, se proporciona un método para modificar genéticamente las células de tallo con un exógeno. En una modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, para reducir una expresión y/o actividad de CD38, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas exvivo; y c) modificar genéticamente las células de tallo hematopoyéticas con el exógeno. En otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, para reducir una expresión y/o actividad de.PI 3-quinasa, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo; y c) modificar genéticamente las células de tallo hematopoyéticas con el exógeno. En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo exvivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de la células mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoides y/o Vitamina D, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo; y c) modificar genéticamente las células de tallo hematopoyéticas con el exógeno . En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo exvivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a rutas de señalización que implican el receptor de ácido retinoico y/o el receptor de retinoide X y/o receptor de Vitamina D, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo; y c) modificar genéticamente las células de tallo hematopoyéticas con el exógeno. En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo exvivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización que implican PI 3-quinasa, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas exvivo; y c) modificar genéticamente las células de tallo hematopoyéticas con el exógeno . En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo exvivo para la proliferación celular y con nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas exvivo; y c) modificar genéticamente las células de tallo hematopoyéticas con el exógeno. En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo exvivo para la proliferación celular y como un inhibidor de PI 3-quinasa, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo; y c) modificar genéticamente las células de tallo ematopoyéticas con el exógeno . En todavía otra modalidad, el método comprende (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas; (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo exvivo para la proliferación celular y con uno o más- agente (s) quelante(s) de cobre o quelato(s) para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo; y c) modificar genéticamente las células de tallo hematopoyéticas con el exógeno. En una modalidad preferida, la modificación genética de la célula se efectúa mediante un vector que comprende el exógeno, este vector es, por ejemplo, un vector viral o un vector de ácido nucleico. De acuerdo con todavía un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una bolsa de recolección/cultivo de células de tallo hematopoyéticas complementado con una cantidad efectiva de un antagonista del receptor de ácido retinoico, un antagonista del receptor de retinoide X y/o un antagonista del receptor de Vitamina D, con una cantidad efectiva de nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de • nicotinamida y un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida, con una cantidad efectiva de un inhibidor de PI 3-quinasa, o con una cantidad efectiva de un agente quelante de cobre o quelato, cada uno de los cuales sustancialmente inhibe la diferenciación celular de una fracción de células de tallo hematopoyéticas de células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un ensayo para determinar si un agente/molécula es un agente de expansión de células de tallo hematopoyéticas efectivo. El ensayo comprende cultivar células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo progenitoras hematopoyéticas en la presencia de un agente/molécula probado y la inspección de la expansión de las células de tallo hematopoyéticas, en donde si ocurre la expansión incrementada y diferenciación disminuida de las células de tallo hematopoyéticas, como es comparado con las células mononucleares hematopoyéticas no tratadas, el agente/molécula probado es un agente de expansión de células de tallo hematopoyéticas efectivo. El agente/molécula puede ser un antagonista del receptor de ácido retinoico, un antagonista del receptor de retinoide X, una antagonista del receptor de Vitamina D, nicotinamida y un análogo, un derivado y un metabolito de la misma, un inhibidor de PI 3-quinasa, un agente quelante de cobre y un quelato de cobre. De acuerdo con características adicionales en modalidades preferidas de la invención descritas enseguida, la reducción de la expresión y/o actividad de CD38 se efectúa mediante un agente que regula hacia abajo la expresión de CD38. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, el agente que regula hacia abajo la expresión de CD38 se selecciona del grupo que consiste de un antagonista del receptor de ácido retinoico, un antagonista de receptor de retinoide X y un antagonista del receptor de vitamina D. Alternativamente, este agente es un antagonista para reducir una capacidad de las células de tallo en responder el ácido retinoico, retinoide y/o Vitamina D. Además, alternativamente, el agente que regula hacia abajo la expresión de CD38 en un inhibidor de PI 3-quinasa. - De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, el agente que regula hacia abajo la expresión de CD38 es un polinucleótido.
De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el polinucleótido codifica un anti CD38, un anti receptor de ácido retinoico, un anti receptor de retinoide X, un anti receptor de Vitamina D o un anti anticuerpo de PI 3-quinasa o anticuerpo intracelular . De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, el polinucleótido es una molécula de polinucleótido de interferencia pequeña dirigida a causar la degradación de mR A de CD38 intracelular, receptor de ácido retinoico, receptor de retinoide X, receptor de Vitamina D o PI 3-quinasa. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, la molécula de polinucleótido de interferencia pequeña se selecciona del grupo que consiste de una molécula RNAi, una molécula de antisentido, una molécula de ribozima y una molécula de DNAzima. De acuerdo con características adicionales en modalidades preferidas de la invención descritas enseguida, la reducción de la expresión y/o actividad de CD38 se efectúa mediante un agente que inhibe la actividad de CD38. El agente puede ser, por ejemplo, nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida. El análogo de nicotinamida de preferencia se selecciona del grupo que consiste de benzamida, nicotinatioamida, ácido nicotinico y ácido -amino-3-indolpropiónico . De acuerdo con características adicionales en modalidades preferidas de la invención descritas enseguida, la reducción de la expresión y/o actividad de CD38 se efectúa mediante un agente que inhibe la actividad de PI 3-quinsa. De acuerdo con características adicionales en modalidades preferidas de la invención descritas enseguida, la provisión de las células de tallo, con las condiciones para la proliferación de células ex-vivo comprende proporcionar las células con nutrientes y con citoquinas. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, las citoquinas son citoquinas de acción temprana, tales como, pero no limitadas a, factor de célula de tallo, ligando FLT73, interleucina-1, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-6, interleucina-10, interleucina-12, factor-a de necrosis tumoral y trombopoyetina . De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, las citoquinas son citoquinas de acción tardía, tales como, pero no limitadas a, factor de estimulación de colonia de granulocitos, factor de estimulación de colonia de granulocitos/macrófagos, eritoproyetina, FGF, EGF, NGF, VEGF, LIF, factor de crecimiento de Hepatocito y factor de estimulación de colonia de macrófagos . De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, las células mononucleares hematopoyéticas son derivadas de una fuente seleccionada del grupo que consiste de médula ósea, sangre periférica, sangre de cordón' umbilical neonatal. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, la reducción de la capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización es irreversible, por ejemplo, inherentemente reversible. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, la reducción de la capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a los antagonistas anteriores y/o rutas de señalización de los receptores anteriores es al cultivar exvivo las células mononucleares hematopoyéticas en la presencia de una cantidad efectiva de por lo menos un antagonista del receptor de ácido retinoico, por lo menos un antagonista del receptor de retinoide X y por lo menos un antagonista del receptor de Vitamina D, de preferencia, durante un período de tiempo de 0.1-50%, de preferencia 0.1-25%, más de preferencia, 0.1-15% de un período de cultivo ex- vivo completo de las células mononucleares hematopoyéticas . De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, el antagonista del receptor de ácido retinoico se selecciona del grupo gue consiste de: AGN 194310; AGN 193109; ácido 3- (4-metoxi-fenilsulfañil) -3- metil-butírico; 6-Metoxi-2, 2-dimetil-tiocroman-4-ona, 2,2- Dimetil-4-oxo-tiocroman-6-iltrifluorometano-sulfonato; 4- ( (2, 2-dimetil-oxo-tiocroman-6-il) etinil) -benzoato de etilo; 4- ( (2, 2-dimetil-l-4-trifluorometanosulfoniloxi- (2H) - tiocromen-6-il) etinil) -benzoato de etilo (41); Tiocromen-6- il] -etinil] -benzoato (ilo) ; l'l' -dióxido de ácido (p-[(E)-2- [3' 4f -Dihidro-4.4' dimetil-7' - (heptiloxi) -2 ' H-l-benzotiopiran- 6' il]propenil] benzoico; ácido 2E, 4E, 6E- [7- (3, 5-Di-t-butil-4- n-butoxifenil] -3-metil-octa-2, 4, 6-trienoico; ácido 2E,4E,6E- [7- (3, 5-Di-t-butil-4-n-propoxifenil] -3-metil-octa-2, 4, 6-¦ trienoico; ácido' 2E, E, 6E- [7- (3, 5-Di-t-butil-4-n- pentoxifenil] -3-metil-octa-2, 4, 6-trienoico; ácido 2E,4E,6E- [7- (3, 5-Di-t-butil-4-n-hexoxifenil] -3-metil] -octa-2, , 6- trienoico; ácido 2E, 4E, 6E- [7- (3, 5-Di-t-butil-4-n- heptoxifenil] -3-metil] -octa-2, 4, 6-trienoico; ácido 2E,4E,6E- [7- (3, 5-Di-t-butil-4-n-octoxifenil] -3-metil] -octa-2, 4, 6- trienoico; ácido 2E, 4E, 6E- [7- [3-t-butil-5- ( 1-fenil-vinil) - fenil] -3-metil-octa-2, 4, 6-trienoico; ácido 2E, E, 6E- [7- (3, 5- Di-t-butil-4-{ [4,5-. sup.3H. sub.2] -n-pentoxi } fenil ) -3-metil] -octa-2 , 4 , 6-trienoico; éster etílico de ácido (2E,4E) (1RS, 2RS) -5- [2- (3, 5-di-ter .butil-2-etoxi-fenil) -ciclopropil] -3-metil-penta-2, 4-dienoico; ácido (2E, 4E) - (1RS, 2RS) -5- [2 (3, 5-di-ter .butil-2-etoxi-fenil) -ciclopropil] -3-metil-penta-2, 4-dienoico; ácido (2E, 4E) - (1RS, 2RS) -5- [2- (3, 5-di-ter.butil 2-butoxi-fenil) -ciclopropil] -3-metil-penta-2, 4-dienoico; ácido (2E, 4E, 6Z) -7- [3, 5-di-ter .butil] -2-etoxifenil] 3-metil 2, 4, 6-octatrienoico; ácido (2E, 4E, 6Z) -7- [3, 5-di-ter .butil-2 butiloxifenil] 3-metil-2, 4, 6-octatrienoico; ácido 4- (5, 6, 7, 8 tetrahidro-5, 5, 8, 8-tetrametil-2-naftalen-carboxamido) benzoico; ácido (2E, 4E) -3-metil-5- [ (1S, 2S) -2- (5, 5, 8, 8 tetrametil-5, 6, 7, 8-tetra idro-naftalen-2-il) ciclopropil] -penta-2, 4-dienoico; ácido p- [ (E) -2- [3' , 4' -Dihidro-4' , 4' dimetil-7 ' - (heptiloxi) -2'H-l-benzotriopiran-6' -il]propenil] -benzoico; ácido 1' , 1' -dióxido, 4- (7, 7, 10, 10-Tetrametil-l piridin-3-ilmetil-4, 5, 7, 8, 9, 10-hexahidro-lH-nafto [2, 3-g] indol-3-il) benzoico; ácido (2E, 4E, 6Z) -7- [3, 5-di-ter-butil 2-metoxifenil] -3-metil-2, 4, 6-octatrienoico; ácido (2E,4E,6Z) 7- [3, 5-di-ter-butil-2-etoxifenil] -3-metil-2, 4,6-octatrienoico; ácido (2E, 4E, 6Z) -7- [3, 5-di-ter .butil-2 hexiloxifenil] -3-metil-2, 4, 6-octatrienoico; ácido (2E,4E,6Z) 7- [3, 5-di-ter.butil-2-octiloxifenil] -3-metil-2, 4, 6-octatrienoico; y ácido (2E, 4E) - (1RS, 2RS) -5- [2- (3, 5-di-ter butil-2-butoxi-fenil) -ciclopropil] -3-metil-penta-2, 4-dienoico; ácido (2E, E, 6Z) -7- [3, n-propoxi-5, 6, 7, 8-tetrahidro 5, 5, 8, 8-tetrametilnaftalen-2-il) -3-metilocta-2/ 4, 6-trienoico, ácido 4- (5H-2, 3 (2, 5-dimetil-2, 5- exano) -5-n-propildiben-zo [b, e] [1, 4] diazepin-ll-il) benzoico, ácido 4- (5H-2, 3- (2, 5-dimetil-2, 5-hexano) -5-metil-8-nitrodibenzo [b, e] [1, 4] diazepin-11-ilbenzoico, ácido 4- { [4- (4-Etilfenil) 2, 2-dimetil- (2H) -tiocromen-6-il] etinil }benzoico, ácido 4- [4-2-metil-l, 2-dicarba-closo-dodecaboran-l-il-fenilcarbamoil] benzoico, ácido 4- [4, 5, 7, 8, 9, 10-hexahidro-7, 7, 10, 10-tetrametil-l- (3-piridilmetil) -antra [1, 2-b]pirrol-3-il) enzoico, ácido (3-piridilmetil) -] 5-tiaantra [2, 1-b] irrol-3-il) benzoico, y ácido 3-piridilmetil) -antra [2ml-d] irazol-3-il] benzoico . De acuerdo con 'todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, el antagonista del receptor de retinoide X es seleccionado del grupo que consiste de: LGN100572, LGN100574, 1- (3-hidroxi-5, 6, 7, 8-tetrahidro- 5,5,8, 8-tetrametilnaftalen-2-il) etanona, 1- (3-propoxi- 5,6,1, 8-tetrahidro-5, 5, 8, 8-tretrametilnaftalen-2-il) etanona, 3- (3-propoxi-5, 6, 7, 8-tetrahidro-5, 5, 8, 8-tetrametilnaftalen-2-il) but-2-enonitrilo, 3- (3-propoxi-5, 6, 7, 8-tetrahidro-5, 5, 8, 8-tetrametilnaftalen-2-il)but-2-enal, ácido (2E, 4E, 6E) -7-3 [-propoxi-5, 6, 7, 8-tetrahidro 5,5,8, 8-tetrametil-2-naftaleno-2-il) -3-metilocta-2, 4, 5-trienoico, ácido 4- [3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) carbonil] benzoico, ácido 4- [1- (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) eten.il] benzoico, ácido 4- [1- (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) ciclopropil] enzoico, 4- [1- (3,5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) etenil] -benceneto trazol, ácido 2- [1- (5, 5, 8, 8-tetrametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) etenil]piridina-5-carboxilico, ácido 2-[1- (3,5,5,8, 8-pentametil-5, 6,7, 8-tetrahidro-2-naftil) etil] -piridina-5-carboxilico, etil-2- [1- (3,5,5,8, 8-pentametil- 5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) etenil] piridina-5-carboxilato de etilo, ácido 5- [1-3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) etenil] piridina-2-carboxilico, ácido 2- [1- (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetra idro-2-naftil) ciclopropil] piridina-5-carboxílico, 2- [1- (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) ciclopropil] piridina-5-carboxilato de metilo, 4-[l- (3,5,5,8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrah.idro-2-naftil) etenil] -N- (4-hidroxifenil) benzamida, ácido 2- [1- (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2~naftil) etenil]piridina-5-carboxilico, ácido 2- [1- (3, 5,5,8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) ciclopropil]piridina-5-carboxilico, butiloxima de ácido 4- [ (3,5,5,8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) carbonil] benzoico, propiloxima de ácido 4- [ (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) carbonil] enzoico, cianoimina de ácido 4- [ (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) carbonil] benzoico, aliloxima de ácido 4- [ (3, 5,5,8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) carbonil] -benzoico, 4- (ácido 3-metilbut-2-enoico) oxima de ácido 4- [(3,5,5,8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) carbonil] -benzoico, y 1-aminoetiloxima de ácido 4- [ (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) carbonil] benzoico, ácido (2E, 4E, 6Z) -7- (3-n-propoxi-5, 6, 7 , 8-tetrahidro-5, 5,8,8-tetrametilnaftalen-2-il) -3-metilocta-2, , 6-trienoico y ácido 4- (5H-2, 3 (2, 5-dimetil-2, 5-hexano) -5-n-propildibenzo [b, e] - [1, 4] diazepin-ll-il) benzoico, y ácido 4- (5H-2, 3- (2, 5-dimetil-2, 5-hexano) -5metil-8-nitrodibenzo [b, e] [1, 4] diazepin-ll-il) benzoico. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, el antagonista del receptor de retinoide X se selecciona del grupo que consiste de: 1 alfa, 25- (OH) -D3-26, 23' lactona; 1 alfa, 25-dihidroxivitamina D(3); el éster 25-carboxílico ZK159222 (23S) -25-dehidro-l alfa-OH-D (3) ; (23R) -25-dehidro-l- alfa-OH-D(3); 1 beta, 25 (OH)2 D3; 1 beta, 25 (OH) 2-3-epi-D3; (23S) 25-dehidro-l- alfa (OH) D3-26, 23-lactona; (23R) 25-dehidro-l-alfa (OH) D3-26, 23-lactona y Butil- (5Z, 7E, 22E- (1S, 7E, 22E- (1S, 3R, 24R) -1, 3, 24-trihidroxi-26, 27-ciclo-9, 10-secocolesta-5, 7, 10 (19) ,22-tetraeno-25-carboxilato) . De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, el inhibidor de PI 3-quinasa se selecciona del grupo que consiste de' wortmanina y LY294002. El (los) quelato(s) o agente (s) quelante(s) de cobre en los diversos aspectos de la presente invención descritos anteriormente en la presente, de preferencia comprende un agente quelante de poliamina. De acuerdo con características adicionales en , modalidades preferidas de la invención descritas enseguida, el agente quelante de poliamina es capaz de formar un complejo organometálico con un metal de transición diferente al cobre. El metal de transición puede ser, por ejemplo, zinc, cobalto, níquel, hierro, paladio, platino, rodio y rutenio . De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, el agente quelante de poliamina, es una poliamina lineal. De preferencia, la poliamina lineal tiene una fórmula general I : HX-Am- (YaBi) i · · · (YnBn) n-ZH Fórmula I en donde m es un número entero de 1 a 10; n es un número entero de 0 a 20; X y Z son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre y un grupo -NH; Yi y Yn son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, y un grupo -NH; A es una cadena de alquileno que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono sustituidos y/o no sustituidos; y ? y Bn son cada uno independientemente una cadena de alquileno que tiene entre 1 y 20 átomos de carbono sustituidos y/o no sustituidos, con la condición de que por lo menos uno del X, Z, Yi y Yn sea un grupo · - H y/o por lo menos uno de los átomos de carbono en las cadenas de alquileno sea sustituido por un grupo amina. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, A es una cadena de alquileno que tiene una fórmula general II: — CiH-C2H CgH- Fórmula ? en donde g es un número entero que es igual a 0 o 3-10; y cada uno de Ri, R2 y Rg es independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, heteroalicíclico, heteroarilo, halo, amino, alquilamino, arilamino, cicloalquilamino, amino heteroalicíclico, heteroarilamino, hidroxi, alcoxi, ariloxi, azo, C-amido, N-amido, amonio, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfonilo, sulfinilo, N-sulfonamida, S-sulfonamida, fosfonilo, fosfinilo, fosfonio, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, C-tiocarboxi, O-tiocarboxi, N-carbamato, O-carbamato, N-tiocarbamato, O-tiocarbamato, urea, tiourea, borato, borano, boroaza, sililo, siloxi, silaza, acuo, alcohol, peroxo, amina óxido, hidrazina, alquil hidrazina, aril hidrazina, óxido nítrico, cianato, tiocianato, isocianato, isotiocianato, ciano, alquilnitrilo, aril nitrilo, alquil isonitrilo, aril isonitrilo, nitrato, nitrito, azido, ácido alquil sulfónico, ácido aril sulfónico, sulfóxido de alquilo, sulfóxido de arilo, sulfóxido de alquil arilo, ácido alquil sulfénico, ácido aril sulfénico, ácido alquil sulfínico, ácido aril sulfínico, ácido alquil tiolcarboxílico, ácido aril tiolcarboxilico, ácido alquil tiol tiocarboxílico, ácido aril tiol tiocarboxílico, ácido carboxílico, ácido alquil carboxílico, ácido aril carboxílico, sulfato, sulfito, bisulfito, tiosulfato, tiosulfito, alquil fosfina, aril fosfina, alquil fosfina óxido, aril fosfina óxido, alquil aril fosfina óxido, alquil fosfina sulfuro, aril fosfina sulfuro, alquil aril fosfina sulfuro, ácido alquil fosfónico, ácido aril fosfónico, ácido alquil fosfínico, ácido aril fosfínico, fosfato, tiofosfato, fosfito, pirofosfito, trifosfato, hidrógeno fosfato, dihidrógeno fosfato, guanidino, S-ditiocarbamato, N-ditiocarbamato, bicarbonato, carbonato, perclorato, clorato, clorito, hipoclorito, perbrornato, brornato, bromito, hipobromito, tetrahalomanganato, tetrafluoborato, hexafluoroantimoniato, hipofosfito, yodato, peryodato, metaborato, tetraarilborato, tetraalquil borato, tartarato, salicilato, succinato, citrato, ascorbato, sacarirato, aminoácido, ácido hidroxámico y tiotosilato. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, cada uno de Bl y Bn es independientemente una cadena de alquileno que tiene una fórmula general III: Rp R(P+1) Rq —Cp-C(p+l)H CqH- H Fórmula ?? en donde p es un número entero que es igual a 0 o g+l; q es un número entero de g+2 a g+20; y cada uno de Rp, Rp+1 y Rq es independientemente seleccionado del grupo que consiste de los sustituyentes descritos en lo anterior con respecto a Ri, R2 y Rg. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, por lo menos uno de Ci, C2 y Cg y/o por lo menos uno de Cp,. Cp+1 y Cq es un átomo de carbono quiral . Una poliamina lineal preferida de acuerdo con la presente invención es tetraetilenpentamina . De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, el agente quelante de poliamina es una poliamina cíclica, tal como ciclam. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, la poliamina cíclica tiene una fórmula general IV: X Am (?,?,),—(YnBn)n—Z F<5rmula IV en donde m es un número entero de 1 a 10; n es un número entero de 0 a 20; X y Z son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de un átomo de oxigeno, un átomo de azufre y un grupo -NH; Yi y Yn son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de un átomo de oxigeno, un átomo de azufre y un grupo -NH; A es una cadena de alquileno que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono sustituidos y/o no sustituidos; ?? y Bn son cada uno independientemente una cadena de alquileno que tiene entre 1 y 20 átomos de carbono sustituidos y/o no sustituidos; y D es un grupo de puente que tiene una fórmula general V: U-W-V Fórmula V mientras que U y V son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de una cadena de hidrocarburo sustituida y una cadena de' hidrocarburo no sustituida; y W es seleccionada del grupo que consiste de amida, éter, éster, disulfuro, tioéter, tioéster, imina y alqueno, con la condición de que por lo menos uno de X, Z, Yi y Yn sea un grupo -NH y/o por lo menos uno de los átomos de carbono en las cadenas de alquileno está sustituido por un grupo amina . De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, A y cada uno de Bl y Bn en la Fórmula IV son cadenas de alquileno que tienen las fórmulas generales II y III, como es descrito anteriormente en la presente. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, la poliamina cíclica tiene una fórmula general seleccionado del grupo que consiste de : X G°1 ¦Am (?,??)!" - -(YnBn)n— ZH Fórmula VI D HX- ¦Am (YiBi)r " -(YnBn)n— Z Fórmula VII •D— -T i X ¦Am (?,?,),- -(YnBn)n— ZH Fórmula VIH I HX— Am (Y,B,)j--- (YnBn)n— Z Fórmula IX Fórmula X en donde m es un número entero de 1 a 10; n es un número entero de 0 a 20; X y Z son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de un átomo de oxigeno, un átomo de azufre y un grupo -NH; Yi y Yn son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de un átomo de oxigeno, un átomo de azufre y un grupo —NH; A es una cadena de alquileno que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono sustituidos y/o no sustituidos; Bl y Bn son cada uno independientemente una cadena de alquileno que tiene entre 1 y 20 átomos de carbono sustituidos y/o no sustituidos; y D es un grupo de fuente que tiene una fórmula general V, como es descrito anteriormente en la presente, y además en donde si el D está unido a un extremo de A (Fórmulas VI, VII y X) , el U o el V están unidos a un átomo de carbono en la cadena de alquileno y si el D está unido a un extremo de Bl o Bn (Fórmulas VIII, IX y X) , el .U o el V están unidos a un átomo de carbono en la cadena de alquileno, con la condición de que por lo menos uno de X, Z, Yi y Yn sea un grupo -NH y/o por lo menos uno de los átomos de carbono en las cadenas de alquileno está sustituido por un grupo amino . Las cadenas de alquileno A, Bl y Bn de preferencia son como se describen anteriormente en la presente. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, el agente quelante de poliamina incluye por lo menos una poliamina lineal y por lo menos una poliamina cíclica. Tal agente quelante de poliamina de preferencia tiene una fórmula general XI: {(EO Q GOgBh-KEíMC GzMh {(En)r[Q„-(G„)o]}, Fórmula XI en donde n es un número entero mayor que 1; cada uno de f, g, h, i, j, k, 1 o y t es independientemente un número entero de 0 a 10; cada uno de ??, E2 y En es independientemente una poliamina lineal como es descrito anteriormente en la presente, cada uno de ¾, G2 y Gn es independientemente una poliamina cíclica como es descrito anteriormente en la presente; y cada uno de Qi, Q2 y Qn es independientemente un agente enlazador que enlaza entre dos de las poliaminas, con la condición de que por lo menos uno de Qi, Q2 y Qn sea un grupo amina y/o por lo menos uno de la poliamina lineal y la poliamina cíclica tenga por lo menos un grupo amino libre. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, cada uno de Qi, Q2 y Qn son independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquileno, alquenileno, alquinileno, arileno, cicloalquileno, heteroarileno, amina, azo, amida, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, fosfonilo, fosfinilo, fosfonio, cetoéster, carbonilo, tiocarbonilo, áster, éter, tioéter, carbamato, tiocarbamato, urea, tiourea, borato, borano, boroaza, sililo, siloxi y silaza. De acuerdo con todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas, el agente quelante de poliamina se selecciona del grupo que consiste de etilendiamina, dietilentriamina, trietilentetramina, trietilendiamina, tetraetilenpentamina, aminoetiletanolamina, aminoetilpiperazina, pentaetilenhexamina, captopril, penicilamina, ?,?'-bis (3-aminopropil) -1, 3-propanodiamina, ?,?' -Bis- (2-aminoetil) -1, 3-propanodiamina, 1, 7-dioxa-4, 10-diazaciclododecano, 1, 4, 8 , 11-tetraaza ciclotetradecano-5, 7-diona, 1, 4, 7-tríazaciclononano, l-oxa-4, 7, 10-triazaciclo-dodecano, 1, 4, 8, 12-tetraazaciclopentadecano y 1,4,7,10-tetraazaciclododecano . La presente invención exitosamente se dirige a las desventajas de las configuraciones actualmente conocidas al proporcionar métodos para expandir células de tallo hematopoyéticas sin primero enriquecer las células mononucleares hematopoyéticas para las células de tallo. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden ser utilizados en la práctica o la prueba de la presente invención, métodos y materiales adecuados se describen enseguida. En caso de conflicto, la especificación de patente, incluyendo las definiciones, lo resolverá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solamente y no se proponen para ser limitativos. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La invención se describe en la presente, a manera de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos acompañantes. Con referencia especifica ahora a los dibujos en detalle, se acentúa que los detalles particulares mostrados son a manera de ejemplo y para propósitos de discusión ilustrativa de las modalidades preferidas de la presente invención únicamente, y se presentan con el fin el de proporcionar lo que se cree que es la descripción más útil y fácilmente entendida de los principios y aspectos conceptuales de la invención. A este respecto, no se hace intento para mostrar detalles estructurales de la invención en más detalle que lo necesario para un entendimiento fundamental de la invención, la descripción tomada con los dibujos que hace evidente para aquellos expertos en la técnica en como las diversas formas de la invención pueden ser englobadas en la práctica. En los dibujos: Las FIGs. la-b ilustran el efecto del agente quelante de TEPA en la expansión de las células de tallo hematopoyéticas CD34+ en un cultivo de células mononucleares hematopoyéticas . Células mononucleares de sangre de cordón (M Cs) se sembraron en bolsas o sacos de cultivo en la presencia de citoquinas, y ya sea que se complementaron con el agente quelante de TEPA (M C-TEPA) , o no se complementaron con el agente quelante de TEPA (control MNC) . Por comparación, células CD34+ purificadas se sembraron de manera similar en bolsas de cultivo en la presencia de citoquinas sin complementación del agente quelante de TEPA (cultivo CD35+) . Todos los cultivos se incubaron durante 12 semanas y en intervalos de cada semana, las células CD34+ se purificaron de los cultivos usando columnas miniMacs y se enumeraron; La FIG. 2 ilustra el .análisis FACS de la densidad de células CD34+CD38- en las MNCs no tratadas, MNCs tratadas con TEPA y los cultivos de células CD34+ descritos en lo anterior, y La FIG. 3 presenta los números comparativos de células formadoras de colonia (CFUs) medidos de las MNCs no tratadas, MNCs tratadas con TEPA y cultivos de células CD34+ descritas en lo anterior, en intervalos de cada semana. DESCRIPCION DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención se relaciona a métodos de expansión ex-vivo de una población de células de tallo o células madre hematopoyéticas presentes, como una fracción menor, en células mononucleares hematopoyéticas, sin primero enriquecer las células de tallo, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas. La presente invención se puede usar para proporcionar eficientemente poblaciones expandidas e -vivo de células de tallo hematopoyéticas, usando células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de las células de tallo y progenitoras hematopoyéticas como una fuente de células de tallo, sin el enriquecimiento previo de las células mononucleares hematopoyéticas para las células de tallo. Las poblaciones expandidas de células de tallo hematopoyéticas de la presente invención se pueden usar en, por ejemplo, transplante de células hematopoyéticas, en la qeneración de células de tallo adecuadas para las manipulaciones genéticas para la terapia génica celular, asi como en aplicaciones adicionales tales como, pero no limitadas a, a la inmunoterapia adoptiva, implantación de células de tallo en una instalación de cis-diferenciación y trans-diferenciación in-vivo asi como la ingeniería de tejido ex-vivo en una instalación de cis-diferenciación y trans-diferenciación. Los métodos de la presente invención utilizan varias moléculas (también referidas en la presente como agentes) , que interfieren con la expresión de CD38 y/o actividad y/o con el contenido de cobre intracelular, para inducir la expansión ex-vivo de poblaciones de células de tallo hematopoyéticas descritas en lo anterior, para proporcionar de esta manera una tecnología eficiente, simplificada y todavía versátil para la expansión ex-vivo de células de tallo hematopoyéticas. Los principios y la operación de la presente invención se pueden entender mejor con referencia a los dibujos y las descripciones y ejemplos acompañantes. Antes de explicar por lo menos una modalidad de la invención en detalle, se va a entender que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles de construcción y el arreglo de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en la sección de ejemplos. La invención es capaz de otras modalidades o de ser practicada o llevada a cabo de varias maneras. También, se va a entender que la fraseología y terminología empleadas en la presente es con el propósito de descripción y no se debe considerar como limitativas . Como es discutido anteriormente en la presente, WO 99/40783, WO 00/18885 y Peled y colaboradores, Brit. J. Haematol . 116:655 2002 enseñan que el cobre celular está implicado en modular el balance entre la auto-renovación y la diferenciación de la células progenitoras hematopoyéticas. De acuerdo con las enseñanzas de estas referencias, la adición de agentes quelantes de metal de transición que son capaces de enlazar al cobre tal como, por ejemplo, la poliamina tetraetilenpentamina lineal, a cultivos de células CD34+ en la presencia de citoquinas de acción temprana redujo el contenido de cobre de la célula por 30% y extendió la duración de los cultivos a largo plazo en términos de la expansión de CFU a largo plazo y la célula CD34+. Estas referencias por consiguiente enseñan métodos de expansión de poblaciones de células de tallo, ex-vivo en la presencia de agentes quelantes de metal de transición, agentes quelantes de cobre particular, y además enseñan el uso de las poblaciones de células de tallo expandidas, obtenidas, en varias aplicaciones. PCT/IL03/00062 describe que los quelatos de cobre, específicamente, agentes quelantes de cobre que se forman en complejo con un ion de cobre, también promueven la proliferación e inhiben la diferenciación de las células de tallo y progenitoras cuando se adicionan al medio de cultivo de tales células. De acuerdo con las enseñanzas de PCT/IL03/00062, este descubrimiento sugiere que este efecto de los quelatos de cobre en la proliferación y diferenciación de las células de tallo progenitoras no está asociado solamente con el contenido de cobre celular, sino más bien con las rutas reguladoras adicionales.
PCT/IL03/00064 y la solicitud de patente provisional norteamericana No. 60/452,545, que son incorporadas en la presente por referencia como si se expusieran completamente en la presente, describen que una serie de moléculas que son capaces de interferir con la expresión y/o actividad de CD38, reprimen el proceso de diferenciación de la célula de tallo y estimula y prolonga, por hasta 16-18 semanas, la fase de proliferación y expansión (renovación) de células activas ex-vivo, de una manera reversible. Por consiguiente, estas referencias enseñan métodos de expansión de poblaciones de células de tallo exvivo, que implican la adición de agentes que ya sea que regulan hacia abajo la expresión de CD38 e inhiben la actividad de células CD38 al medio de cultivo de las células de tallo. Los métodos descritos en PCT/IL03/00064 y la solicitud de patente provisional norteamericana No. 60/452,545, por lo tanto utilizan moléculas tales como los antagonistas del receptor de ácido retinoico de las superfamilias RAR y RXR, antagonistas del receptor de Vitamina D, polinucleótidos que codifican anticuerpos tal como anti CD38, anti receptor de ácido retinoico, anti receptor de retinoide X, anti receptor de Vitamina D, polinucleótidos que se dirigen a ocasionar la degradación de los polinucleótidos endógenos que codifican para estos receptores, moléculas que son capaces de interferir con la expresión y/o actividad de PI 3-quinasa e inhibidores de CD38 tal como nicotinamida y sus compuestos relacionados . Por consiguiente, WO 99/40783, WO 00/18885, PCT/IL03/00064 y la solicitud de patente provisional norteamericana No. 60/452,545 todos enseñan el uso de varias moléculas que modulan, por la via de rutas y/o mecanismos diversos, el balance entre la auto-renovación y diferenciación de las células de tallo, células de tallo hematopoyéticas en particular, en métodos para expandir exvivo poblaciones de células de tallo. Sin embargo, a menos que se indique de otra manera, la regulación de la población y diferenciación de las células de tallo por estas moléculas es obtenida de acuerdo con las enseñanzas de estas referencias, cuando las células cultivadas primero se enriquecen para las células de tallo y/o progenitoras y por consiguiente, en linea con otras tecnologías actuales en este campo, requieren el enriquecimiento de células de tallo preliminar. Mientras que se lleva a cabo la presente invención a la práctica, fue sorprendente e inesperadamente encontrado que las moléculas tales como agentes quelantes de cobre, quelatos de cobre y antagonista del receptor de ácido retinoico (RAE.) reprime la diferenciación y estimula y prolonga la proliferación de células de tallo hematopoyéticas cuando la fuente de células incluye la fracción completa de células de sangre mononucleares, específicamente células de tallo no enriquecidas. Como es descrito en la sección de Antecedentes anteriormente, aunque es altamente ventajoso, actualmente no hay una tecnología descrita mediante la cual expandir células de tallo no enriquecidas. Por lo tanto, la tecnología presentada y ejemplificada en la presente, que implica métodos de expansión ex-vivo de poblaciones de células de tallo hematopoyéticas libre del enriquecimiento de células de tallo previo, proporciona métodos eficientes, simplificados y efectivos en costo para obtener poblaciones de células de tallo hematopoyéticas expandidas ex-vivo. Las poblaciones de células de tallo hematopoyéticas expandidas obtenidas por la tecnología presentada en la presente se puede usar en varias aplicaciones, lo siguiente lista unas cuantas: Transplante de células hematopoyéticas: El transplante de células hematopoyéticas ha llegado a ser el tratamiento de elección para una variedad de enfermedades heredadas o malignas. Mientras que los procedimientos de transplante temprano utilizaron la población de médula ósea (BM) completa, recientemente, poblaciones más definidas, enriquecidas para células de tallo (células CD34+) se han usado (Van Epps DE y colaboradores . Harvesting, characterization, and culture of CD34+ cells from human bone marrow, peripheral blood, and cord blood. Blood Cells 20:411. 1994) . Además de la medula, tales células podrían ser derivadas de otras fuentes tal como la sangre periférica (PB) y la sangre del cordón umbilical neonatal (CB) (Emerson SG. Ex-vivo expansión of hematopoietic precursors, progenitors, and stem cells: The next generation of cellular therapeutics . Blood 87:3082, 1996). Comparado con BM, el transplante con células PB acorta el período de pancitopenia y reduce los riesgos de infección y sangrado (Brugger W, y colaboradores. Reconstitution of hematopoyesis after high-dose chematotherapy by autologous progenitor cells generated in-vivo. N Engl J Med 333:283, 1995; Williams SF, y colaboradores. Selection and expansión of peripheral blood CD34+ cells in autologous stem cell transplantation for breast cáncer. Blood 87:1687, 1996; Zimmerman RM, y colaboradores. Large-Scale selection of CD34+ peripheral blood progenitors and expansión of neutrophil precursors for clinical applications . J. Heametotherapy 5:247, 1996). Una ventaja adicional de usar PB para el transplante es su accesibilidad. El factor limitativo para el transplante PB es el bajo número de células de tallo/progenitoras pluripotentes en circulación. Para obtener bastantes células de tallo derivadas de PB para el transplante, estas células se "recolectan" mediante leucoforesis repetida después de su movilización de la médula en la circulación mediante tratamiento con quimioterapia y citoquinas (Brugger W, y colaboradores. Reconstitution of hematopoiesis alter high-dose chematot erapy by autologous progenitor cells generated in-vivo, N Engl J Med 333:283, 1995; Williams SF, y colaboradores. Selection and expansión of peripheral blood CD34+ cells in autologous stem cell transplantation for breast cáncer. Blood 87:1687, 1996). Tal tratamiento es obviamente no adecuado para donadores normales . El uso de células de tallo expandidas ex-vivo para el transplante tiene las siguientes ventajas (Koller MR, Emerson SG, Palsson BO. Large-scale expansión of human stem and progenitor cells from bone marrow mononuclear cells in continuous perfusión cultures. Blood 82:378, 1993; Lebkowski JS, y colaboradores. Rapid isolation and serum-free expansión of human CD34+ cells. Blood Cells 20:404, 1994): Reduce el volumen de sangre requerido para la reconstitución de un sistema hematopoyético adulto y puede evitar la necesidad para la movilización y leucoforesis (Brugger W. y colaboradores, N Engl J Med 333:283, 1995) . Permite el almacenamiento de un número pequeño de células de tallo PB o CB para el uso futuro potencial. En el caso del transplante autólogo de recipientes con malignidades, las células de tumor contaminante en infusión antologa frecuentemente contribuyen a la recurrencia de la enfermedad (Brugger W, y colaboradores N Engl J Med 333:283, 1995). La selección y la expansión de las células de tallo CD34+ reducirá la carga de células de tumor en el transplante final. Los cultivos proporcionan un agotamiento significante de linfocitos T, que puede ser útil en la instalación de transplante alogeneico para reducir la enfermedad de injerto-contra-huésped. Estudios clínicos indican que el transplante de células expandidas ex-vivo derivadas de un número pequeño de células PB CD34+ puede restaurar la hematopoyesis y recipientes tratados con altas dosis de quimioterapia, aunque los resultados todavía no permiten conclusiones firmes acerca de las capacidades hematopoyéticas in-vivo a largo plazo de estas células cultivadas (Brugger W, y colaboradores N Engl J Med 333:2832, 1995; Williams SF, y colaboradores Blood 87:1687, 1996) . Para el transplante exitoso, el acortamiento de la duración de la fase citopénica, así como, el injerto a largo plazo, es crucial. La inclusión de células progenitoras intermediarias y tardías en el transplante podría acelerar la producción de células maduras derivadas de donador acortando de esta manera la fase citopénica. Por lo tanto, es importante que las células expandidas ex-vivo incluyen, además de las células de tallo, más células progenitoras diferenciadas con el fin de optimizar la recuperación a corto plazo y la restauración a largo plazo en la hematopoyesis. La expansión de células progenitoras intermediarias y tardías, especialmente aquellas comprometidas con los linajes neutrofílicos y megacariocíticos, concomitantes con la expansión de células de tallo, debe servir para este propósito (Sandstrom CE, y colaboradors . Effects of CD34+ cell selection and perfusión on ex-vivo expansión of peripheral blood mononuclear cells. Blood 86:958, 1995). Tales cultivos pueden ser útiles en restaurar la hematopoyesis en recipientes con médula ósea completamente extirpada, así como en proporcionar una medida de soporte para acortar la recuperación de la médula ósea del recipiente después de las radio- o quimioterapias convencionales . Diagnosis prenatal de defectos genéticos en células escasas: La diagnosis prenatal implica la recolección de células embriónicas a partir de una mujer embarazada, en útero, y el análisis de las mismas para defectos genéticos. Un medio preferido, no invasivo de recolección de células embriónicas implica la separación de los precursores de glóbulos rojos nucleados embriónicos que se han infiltrado en la circulación maternal periférica. Sin embargo, puesto que las cantidades de estas células son muy escasas, una aplicación adicional de la presente invención sería la expansión de tales células de acuerdo con los métodos descritos en la presente, antes del análisis. La presente invención, por lo tanto, ofrece un medio para expandir células embriónicas para aplicaciones en diagnosis prenatal. Terapia Génica: Para la terapia génica a largo plazo exitosa, una alta frecuencia de células de tallo genéticamente modificadas con transgenes establemente integrados dentro de su genoma, es un requerimiento obligatorio. En el tejido BN, mientras que la mayoría de células son progenitoras y precursoras cicladas, las células de tallo constituyen solamente una pequeña fracción de la población de células y la mayoría de éstas están en un estado no ciclado, quiescente. Los vectores de base viral (por ejemplo, retroviral) requieren la división celular activa para la integración del transgen en el genoma del huésped. Por lo tanto, la transferencia génica en células de tallo BM frescas es altamente ineficiente. La habilidad para expandir una población purificada de células de tallo y regular su división celular ex-vivo proporcionaría una probabilidad incrementada de su modificación genética (Palmiter RD. Regulation of metallothionein genes by heavy metáis appears to be mediated by a zinc-sensitive inhibitor t at interacts with a constitutively active transcription factor, MTF-1. Proc Nati Acad Sci USA 91(4) : 1219-1223, 1994) . Inmunoterapia adoptiva: Subproblaciones linfoides definidas, expandidas ex-vivo se han estudiado y usado para la inmunoterapia adoptiva de varias malignidades, inmunodeficiencia, enfermedades virales y genéticas (Freedman AR, y colaboradores, Generation of T limphocytes from bone marrow CD34+ cells in vitro. Nature Medicine 2:46, 1996; Heslop HE, y colaboradores. Long term restoration of initimunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T limphocytes. Nature Medicine 2:551, 1996; Protti MP. Y colaboradores. Particulate naturally processed peptides prime a citotoxic response against human melanoma in vitro Cáncer Res 56:1210, 1996) . El tratamiento incrementa la respuesta immune requerida o reemplaza las funciones deficientes. Este procedimiento fue promovido clínicamente por Rosenberg y colaboradores (Rosenberg SA, y colaboradores. Prospective randomized trial of high-dose interleukin-2 alone or in conjunction with limphokine-activated killer cells for the treatment of patients with advanced cáncer. J. Nati Cáncer Inst 85:622, 1993) usando un gran número de células T exterminadoras no específicas expandidas ex-vivo antologas, y subsecuentemente linfocitos que infiltran el tumor específicos expandidos ex-vivo. Las células que presentan antígeno, funcionalmente activas pueden ser cultivadas a partir de una población de partida de células CD34+ PB en cultivos soportados de citoquina, también. Estas células pueden presentar antígenos de proteína solubles a las células T antologas in-vltro y, de esta manera, ofrecer nuevas perspectivas para proporcionar nuevas inmunoterapia de la enfermedad residual mínima después de la quimioterapia de alta dosis. La expansión ex-vivo de células -dendríticas que presentan antígenos se ha estudiado también, y es una aplicación prometedora adicional de la tecnología actualmente propuesta (Bernhard H, y colaboradores. Generation of immunostimulatory dendritic cells from human CD34+ hematopoietic progenitor cells of the bone marrow and peripheral blood. Cáncer Res. 10:99, 1995; Fisch P, y colaboradores. Generation of antigen-presenting cells for soluble protein antigens ex-vivo from peripheral blood CD34+ hematopoietic progenitor cells in cáncer patients. Eur J. Immunol 26_595, 1996; Siena S, y colaboradores, Massive ex-vivo generation of functional dendritic cells from mobilizaed CD34+ blood progenitors for anticancer therapy. Expt Hematol 23:1463, 1996) . Como es discutido en breve anteriormente en la presente y además es detallado en WO 99/40783, WO 00/18885, PCT/IL03/00064 y la solicitud de patente provisional norteamericana No. 60/452,545, los agentes quelantes de cobre, quelatos de cobre y antagonistas de receptor de retinoide, cada uno mostró la auto-renovación de las células de tallo por medio de una ruta diferente, efectuando diferentes eventos celulares que conducen a la diferenciación reducida y proliferación extendida de las células de tallo. Estas moléculas por lo tanto representan una variedad de moléculas que son capaces de inducir el efecto de expandir una población de células de tallo hematopoyéticas que está presente en una población de células hematopoyéticas mezcladas . Por consiguiente, de acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un método de expansión exvivo de una población de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo ex-vivo. El método de acuerdo con este aspecto de la presente invención se efectúa al proporcionar células mononucleares hematopoyéticas que contienen una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, con condiciones de cultivo para la proliferación celular ex-vivo y, al mismo tiempo, para reducir una expresión y/o actividad de CD38, para de esta manera expandir una población de células de tallo, hematopoyéticas mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo. Como se utiliza en la presente, la frase "células mononucleares hematopoyéticas" se refiere al repertorio completo de glóbulos blancos presentes en una muestra de sangre. En un ser humano sano, los glóbulos blancos comprenden una mezcla de linajes hematopoyéticos comprometidos y células diferenciadas (típicamente arriba de 99% de las células mononucleares son células comprometidas de linaje) incluyendo, por ejemplo: células progenitoras comprometidas de linaje CD34+CD33+ (células comprometidas mieloides) , CD34+CD3+ (células comprometidas linfoides) CD34+CD41+ (células comprometidas megacariocíticas y células diferenciadas-CD34~CD33+ (mieloides, tal como granulocitos y monocitos), CD34~CD3+, CD34~CD19+ (células T y B, respectivamente), CD34~CD41+ (megacariocitos) , células de tallo hematopoyéticas y progenitoras tempranas tal como CD34+ de Linaje negativo (Lin~) , CD34-Linaje negativo CD34+CD38" (típicamente menos de 1%) . La frase "células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas" se utiliza en la presente para describir cualquier porción de la fracción de glóbulos blancos, en la cual la mayoría de las células son células comprometidas hematopoyéticas, mientras que la minoría de las células son células de tallo progenitoras hematopoyéticas, como estos términos se definen adicionalmente enseguida en la presente . Las células mononucleares hematopoyéticas típicamente se obtienen a partir de una muestra de sangre al aplicar la muestra de sangre sobre una capa Ficoll-Hypaque y al recolectar, después de la centrifugación de densidad, la capa de interfase presente entre la Ficoll-Hypaque y el suero de sangre, la capa de interfase que esencialmente consiste completamente de los glóbulos blancos presentes en la muestra de sangre. Como se utiliza en la presente, la frase "células comprometidas hematopoyéticas" se refiere a células hematopoyéticas diferenciadas que están comprometidas a un cierto linaje de células hematopoyéticas y por consiguiente pueden desarrollarse bajo condiciones fisiológicas sustancialmente solo a este linaje hematopoyético especifico. Como se utiliza en la presente, la frase "células de tallo hematopoyéticas" se refiere a células hematopoyéticas pluripotentes que dadas las condiciones de crecimiento, pueden desarrollarse a cualquier linaje de células presente en la sangre. Esta frase, como se utiliza en la presente, se refiere a las poblaciones de células hematopoyéticas renovables más tempranas responsables para generar masa celular en la sangre (CD34"/AC133+, CD34VAC133" /Linaje", células CD34+/AC133+) y las células progenitoras hematopoyéticas muy tempranas, que son un poco más diferenciadas, pero no son comprometidas y pueden fácilmente revertirse para llegar a ser una parte de la población de células hematopoyéticas renovables más tempranas (por ejemplo, células CD34+, especialmente células CD34+CD38~) . En el humano normal, la mayoría de las células de tallo pluripotentes hematopoyéticas y las células progenitoras comprometidas de linaje son CD34+. La mayoría de las células son CD34+CD38+, con una minoría de células (<10%) que es CD34+CD38~. La fracción de células de tallo CD34+CD38~ identifica las células hematopoyéticas más inmaduras, que son capaces de la auto-renovación y la diferenciación de multi-linaje. Esta fracción contiene más células de iniciación de cultivo a largo plazo (LTC-IC) pre-CFU y muestra mantenimiento más largo de las células de tallo y respuesta proliferativa retardada a la citoquina como es comparado con la fracción de células CD34+CD38+. Actualmente, las células de tallo hematopoyéticas se obtienen mediante el enriquecimiento adicional de las células mononucleares hematopoyéticas obtenidas mediante la centrifugación de densidad diferencial como es descrito en lo anterior. Este proceso de enriquecimiento adicional típicamente se realiza mediante la inmunoseparación tal como la separación inmunomagnética FACS y resulta en una fracción de células que está enriquecida por células de tallo hematopoyéticas . Por consiguiente, usando células mononucleares hematopoyéticas como una fuente directa para obtener la población expandida de células de tallo hematopoyéticas directa a la necesidad para el enriquecimiento de células de tallo antes de la expansión, para de esta manera sustancialmente simplificar el proceso en términos de tanto deficiencia y en costo. Como se utiliza en la presente, el término "inhibición" se refiere a hacer lento, disminuir, retardar, impedir o anular. Como se utiliza en la presente, el término "diferenciación" se refiere a cambios relativamente generalizados especializados durante el desarrollo. La diferenciación celular de varios linajes es un proceso bien documentado y no requiere descripción adicional en la presente. Como se utiliza en la presente, el término diferenciación es distinto de la maduración que es proceso, aunque algunas veces asociado con la división celular, en el cual una célula especifica de tipo maduro funciona y luego muere, por ejemplo, por medio de la muerte celular programada. La frase "expansión célular" se utiliza en la presente para describir un proceso para la proliferación celular sustancialmente libre de diferenciación celular. Las células que se someten a la expansión por consiguiente mantienen sus propiedades de anulación de células y frecuentemente son referidas en la presente como células renovables, por ejemplo, células de tallo renovables. La expansión de células de tallo hematopoyéticas usando células mononucleares hematopoyéticas como una fuente para las células de tallo hematopoyéticas, como es enseñado por la presente invención, por lo tanto da por resultado la conversión de la fracción menor (de menos de 1%) de las células de tallo y progenitoras hematopoyéticas presentes en las células mononucleares en por lo menos lo principal, si no es que toda la población de células hematopoyéticas y únicas después de la expansión, mediante lo cual en el curso de la expansión de las células de tallo, las células comprometidas son ya sea sustancialmente diluidas y/o muertas. Como se utiliza en la presente, el término "exvivo" se refiere a un proceso en el cual las células se remueven en un organismo vivo y se propaga fuera del organismo (por ejemplo, en un tubo de prueba) . Como se utiliza en la presente, el término "ex-vivo", sin embargo, no se refiere a un proceso mediante el cual las células se conoce que se propagan solamente in vitro, tales como varias lineas de células (por ejemplo, HL-60, MEL, HeLa, etc.) son cultivadas. En otras palabras, las células expandidas ex-vivo de acuerdo con la presente invención no se transforman en lineas de células en que eventualmente se someten a la diferenciación .
La provisión de las células cultivadas ex-vivo con condiciones para la proliferación de células ex-vivo incluye proporcionar las células con nutrientes y de preferencia con una o más citoquinas, como es detallado adicionalmente enseguida en la presente. Como se mencionó en lo anterior, concomitante con el tratamiento de las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones que permiten que las células proliferen exvivo, las células se tratan a corto plazo o se tratan a largo plazo para reducir la expresión y/o actividad de CD38. En una modalidad de la presente invención, la reducción de la actividad de CD38 se efectúa al proporcionar las células con un agente que inhibe la actividad de CD38 (es decir, un inhibidor de CD38) . Como se utiliza en la presente un "inhibidor de CD38" se refiere a un agente que es capaz de regular hacia abajo o suprimir la actividad de CD38 en las células de tallo . Un inhibidor de CD38 de acuerdo con este aspecto de la presente invención puede ser un "inhibidor directo" que inhibe la actividad intrínseca CD38 o un "inhibidor indirecto" que inhibe la actividad o expresión de los componentes de señalización de CD38 (por ejemplo, el cADPR y las rutas de señalización de rianodina) u otras rutas de señalización que son efectuadas por la actividad de CD38.
De acuerdo con las modalidades actualmente conocidas de este aspecto de la presente invención, la nicotinamida es un posible inhibidor de CD38. Por consiguiente, en una modalidad, el método de acuerdo con este aspecto de la presente invención se efectúa al proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas ya sea con nicotinamida misma, o por un análogo de nicotinamida, o un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o análogo de nicotinamida. Como se utiliza en la presente, la frase "análogo de nicotinamida" se refiere a cualquier molécula que es conocida que actúa de manera similar a la nicotinamida. Ejemplos representativos de análogos de nicotinamida incluyen, sin limitación, benzamida, nicotinatioamida (el análogo de tiol de nicotinamida) , ácido nicotinico y ácido a-amino-3-indolpropiónico . La frase "un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida" se refiere a cualquier derivado estructural de nicotinamida misma o de un análogo de nicotinamida. Ejemplos de tales derivados incluyen, sin limitación, benzamidas sustituidas, nicotinamidas sustituidas y nicotinatioamidas y nicotinamidas N-sustituidas y nicotintiomidas . La frase "un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida" se refiere a productos que son derivados de nicotinamida o de análogos de la misma tales, por e emplo, NAD, NADH y NADPH. Alternativamente, un inhibidor de CD38 de acuerdo con este aspecto de la presente invención puede ser un anticuerpo neutralizante de actividad que enlaza, por ejemplo, el dominio catalítico de CD38, para de esta manera inhibir la actividad catalítica de CD38. Será apreciado, que puesto que CD38 es una proteína intracelular se · toman mediciones para usar un inhibidor que pueden ser suministrados a través de la- membrana de plasma. A este respecto un anticuerpo fragmentado tal como fragmento Fab (descrito después en la presente) es de preferencia utilizado . El término "anticuerpo" como se usa en esta invención, incluye moléculas intactas así como fragmentos funcionales de las mismas, tales como Fab, F(ab')2r y Fv que son capaces de enlazar macrófagos . Estos fragmentos de anticuerpo funcionales se definen como sigue: Fab, el fragmento que contiene un fragmento de enlace de antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo, puede ser producido mediante la digestión del anticuerpo completo con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada; Fab' , el fragmento de una molécula de anticuerpo que puede ser obtenido al tratar el anticuerpo completo con pepsina, seguido por la reducción, para producir una cadena ligera intacta de una porción de la cadena pesada; dos fragmentos Fab' se obtienen por molécula de anticuerpo; (Fab')2, el fragmento de anticuerpo que se puede obtener al tratar el anticuerpo completo con la enzima pepsina sin reducción subsecuente; F(ab' )2 es un dimero de dos fragmentos Fab' mantenidos conjuntamente por dos enlaces de disulfuro; Fv, definido como un fragmento genéticamente diseñado que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresada como dos cadenas; y Anticuerpo de cadena individual ("SCA") , una molécula genéticamente diseñada que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, enlaza por un enlazador de polipéptido adecuado como una molécula de cadena individual genéticamente fusionada. Métodos para hacer estos fragmentos son conocidos en la técnica. (Ver, por ejemplo, Harlow and Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Cork, 1988, incorporado en la presente por referencia) . Los fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante la expresión en células de E. coli o de mamífero (por ejemplo, cultivo de célula de ovario de hámster Chino u otros sistemas de expresión de proteína) de DNA que codifica el fragmento. Los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener mediante la digestión de pepsina o papaína de anticuerpos completos por métodos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden producir mediante la segmentación enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denotado F(ab')2. Este fragmento se puede segmentar adicionalmente usando un agente reductor de tiol, y opcionalmente un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de la segmentación de los enlaces de disulfuro, para producir los fragmentos monovalentes 3.5S Fab' . Alternativamente, una segmentación enzimática usando pepsina produce los fragmentos Fab' monovalentes y un fragmento Fe directamente. Estos métodos son descritos, por ejemplo, por Goldenber, en las patentes norteamericanas Nos. 4,036,945 y 4,331,647, y las referencias comprendidas en las mismas, estas patentes son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Ver también Porter, R.R., Biochem. J., 73:119-126, 11959. Otros métodos para segmentar anticuerpos, tal como la separación de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes, además segmentación de fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas también pueden ser utilizadas, mientras que los fraqmentos se enlacen al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. Los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas VH y VL. Esta asociación puede ser no covalente, como es descrito en Invar y colaboradores, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62, 1972. Alternativamente, las cadenas variables pueden ser enlazadas por un enlace de disulfuro intermolecular o reticuladas por sustancias químicas tal como glutaraldehído . De preferencia, los fragmentos Fv comprenden las cadenas VH y VL conectadas por un enlazador de péptido. Estas proteínas que enlazan antígeno de cadena individual (sFv) se preparan al construir un gen estructural que comprende secuencias de DNA que codifican los dominios VH y VL conectados por un oligonucleótido . El gen estructural se inserta en un factor de expresión, que es subsecuentemente introducido en una célula hospedera tal como ?. coli . Las células hospederas recombinantes sintetizan una cadena de polipéptido individual con un péptido enlazador que forma en puente los dos dominios V. Los métodos para producir sFvs son descritos, por ejemplo, por Whitlow y Filpula, Methods, 2:97-105, 1991; Bird y colaboradores, Science 242:423-426, 1988; Pack y colaboradores, Bio/Technology 11:1271-77, 1993; y Ladner y colaboradores, patente norteamericana No. 4,946,778, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.
Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica para una sola región de determinación de complementariedad individual (CDR) . Los péptidos CDR ("unidades de reconocimiento mínimas") se pueden obtener al construir ¦ genes que codifican el CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, al usar la reacción en cadena de polimerasa para sintetizar la región variable de RNA de las células que producen anticuerpo. Ver, por ejemplo, Larrick y Fry, Methods, 2:1106-10, 1991. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, laurino) son moléculas quiméricas de inmunoglobulinas, cadenas inmunoglobulina o fragmentos de los mismos (tales como Fv, FAB, Fab' , F(ab')? u otras subsecuencias que enlazan antígeno de anticuerpo) que contienen secuencias mínimas de derivado de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen el anticuerpo recipiente de inmunoglobulinas humanas en el cual los residuos forman una región de determinación complementaria (CDR) del recipiente son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la estructura Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden- comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del recipiente ni en las secuencias de CDR importados o de estructura. En general, en anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todo sustancialmente o todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia consensual de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente de aquella de una inmunoglobulina humana [Jones y colaboradores, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature,.332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596 (1992)]. Métodos para inmunizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en éste a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humanos son frecuentemente referidos como residuos de importación, que típicamente se toman de un dominio variable de importación. La humanización esencialmente se puede realizar siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones y colaboradores, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen y colaboradores, Sciende, 239:1534-1536 (1988)], al sustituir las secuencias de CDRs o CDR de roedor para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (patente norteamericana No. 4,816,567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto sea sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos CDRs y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. Los anticuerpos humanos también se pueden producir usando varias técnicas conocidas en el arte, incluyendo bibliotecas de exhibición de fago (Googenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y colaboradores, J. Mol. Biol. 222:581 (1991)), Las técnicas de Colé y colaboradores y Boerner y colaboradores también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé y colaboradores, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner y colaboradores, J. Immunol, 147(1): 86-95 (1991)]. De manera similar, se pueden hacer humanos mediante la introducción de sitios de inmunoglobulina humano en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado parcial o completamente. En la simulación, se observa la producción de anticuerpo humano, que estrechamente se asemeja a aquella observada en los humanos en todos los aspectos, incluyendo el rearreglo de gen, ensamble y repertorio de anticuerpos. Este procedimiento es descrito, por ejemplo, en las patentes norteamericanas Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y colaboradores, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lomberg y colaboradores, Nature 368 856-859 (1994) ; Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild y colaboradores, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996) ; Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996) ; Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995). Alte nativamente, el método de acuerdo con este aspecto de la presente invención se puede efectuar al proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas cultivadas ex-vivo con un agente que regula hacia abajo la expresión CD38. ün agente que regula hacia abajo la expresión CD38 se refiere a cualquier agente que afecta la síntesis de CD38 (desacelera) o la degradación (acelera) ya sea al nivel del mRNA o al nivel de la proteina. Por ejemplo, una molécula de polinucleótido de interferencia pequeña que es diseñada para regular hacia abajo la expresión de CD38 se puede usar de acuerdo con este aspecto de la presente invención.
Un ejemplo para una molécula de polinucleótido de interferencia pequeña que puede regular hacia abajo la expresión de CD38 es un RNA de interferencia pequeña o siRNA, tal como, por ejemplo, los oligonucleótidos de antisentido morfolino descritos en Munshi y colaboradores (Munshi CV, Fraeff R, Lee HC, J. Biol Chem 2002 Dec 20; 277 (51) : 49453-8) , que incluye oligonucleótidos dúplex que dirigen la expresión especifica de secuencia del mRNA a través del mecanismo previamente descrito de interferencia de RNA (RNAi) (Hutvagner and Zamora (2002) Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232) . Como se utiliza en la presente, la frase "oligonucleótido dúplex" se refiere a una estructura de oligonucleótido o mimética de la misma, que es formada ya sea por una sola hebra de ácido nucleico autocomplementaria o por lo menos dos hebras de ácido nucleico complementarias. El "oligonucleótido dúplex" de la presente invención puede estar compuesto de RNA de doble hebra (dsRNA) , un híbrido de DNA-RNA, RNA de una sola hebra (ssRNA) , RNA aislado (es decir, RNA parcialmente purificado, RNA esencialmente puro) , RNA sintético y RNA producido recombinantemente . De preferencia, el oligonucleótido dúplex de interferencia pequeña específico de la presente invención es un oligorribonucleótido compuesto principalmente de ácido ribonucleico.
Las instrucciones para la generación de oligonucleótidos dúplex capaces de mediar la interferencia de RNA se proporcionan en }!^?. ^^ ??.'..99??· Por consiguiente, la molécula de polinucleótido de interferencia pequeña de acuerdo con la presente invención puede ser una molécula RNAi (molécula de interf rencia de RNA) . Alternativamente, una molécula de polinucleótido de interferencia pequeña puede ser un oligonucleótido tal como una molécula de antisentido especifica de CD38 o una molécula de ribozima, descrita adicionalmente enseguida en la presente . Los oligonucleótidos diseñados de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención se pueden generar de acuerdo con cualquier método de síntesis de oligonucleótido conocida en la técnica tal como la síntesis enzimática o la síntesis en fase sólida. El equipo y los reactivos para ejecutar la síntesis en fase sólida son comercialmente disponibles de, por ejemplo Applied Biosystems. Cualquier otro medio para tales síntesis también puede ser empleado; la síntesis actual de los oligonucleótidos está bien dentro de las capacidades de un experto en la técnica. Los oligonucleótidos usados de acuerdo con esta modalidad de la presente invención son aquellos que tienen una longitud seleccionada de un intervalo de 10 a aproximadamente 200 bases, de preferencia 15-150 bases, más de preferencia 20-100 bases, mucho más de preferencia 20-50 bases . Los oligonucleotidos de la presente invención pueden comprender nucleósidos heterociclicos que consisten de purinas y las bases de pirimidinas, enlazadas a un enlace de fosfodiéster 3' a 5', De preferencia los oligonucleotidos usados son aquellos modificados en ya sea la cadena principal, los enlaces de internucleósido o bases, como es descrito ampliamente enseguida en la presente. Tales modificaciones pueden facilitar frecuentemente la captación de oligonucleótido y la resistividad a las condiciones intracelulares . Ejemplos específicos de oligonucleotidos preferidos útiles de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen oligonucleotidos que confieren cadenas principales modificadas o enlaces de internucleósidos no naturales. Los oligonucleotidos que tienen cadenas principales modificadas incluyen aquellas que requieren un átomo de fósforo en la cadena principal, como es descrito en las patentes norteamericanas Nos. 4,687,808, 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5, 453 , 496 ; 5, 455,233; 5, 466, 677; 5,476,925; 5,519,126; ,536,821; 5,541,306/ 5, 550, 111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; y 5, 625, 050. Las cadenas principales de oligonucleótido modificadas preferidas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquil fosfotriésteres, fosfonatos de metilo y de otros alquilo, incluyendo fosfonatos de 3'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosfora-midatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3f-5' normales, análogos enlazados 2 '-5' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida en donde los pares adyacentes de unidades de nucleósidos están enlazados 3' -5' a 5' -3' o 2' -5' a 5' -2'. También se pueden utilizar varias sales, sales mezcladas y formas de ácido libre. Alternativamente, las cadenas principales de oligonucleótido modificado que no incluyen un átomo de fósforo en la misma tienen cadenas principales que son formadas por enlaces de internucleósido de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, heteroátomo mezclado y enlaces de internucleósidos de alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces de internucleósidos heteroatómicos, heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces de morfolino (formados en parte de la porción de azúcar de un nucleósido) ; cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfota; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de mutilen formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metileneimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otras que tienen partes componentes de N, 0, S y CH2 mezcladas, como es descrito en las patentes norteamericanas Nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466, 677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5, 602,240; 5, 610,289; 5, 602,240; 5, 608, 046; 5, 610,289; 5, 618,704; 5, 623,070; 5,663,312; 5, 633,360; 5, 677,437 Y 5, 677, 439. Otros oligonucleótidos que se pueden usar de acuerdo con la presente invención, son aquellos modificados en tanto el azúcar y el enlace de internucleósido, es decir, la cadena principal, de las unidades de nucleótidos son reemplazadas con grupos novedosos. Las unidades de bases se mantienen para la complementación con el objetivo de polinucleótido apropiado. Un ejemplo para tal mimecito de oligonucleótido, incluye el ácido nucleico del péptido (PNA) . Un oligonucleótido de PNA se refiere a un oligonucleótido donde el azúcar-cadena principal es reemplazado con una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglisina . Las bases son retenidas y son unidad directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la porción de amida de la cadena principal . Las patentes norteamericanas que enseñan la separación de compuestos PNA incluyen, pero no están limitados a, las patentes norteamericanas Nos. 5,539,082/ 5,714,331, y 5,719,262, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. Otras modificaciones de la cadena principal, que se pueden usar en la presente invención se describe en la-patente norteamericana No. 6,303,374. Los oligonucleótidos de la presente invención también pueden incluir modificaciones o sustituciones de bases. Como se utiliza en la presente, bases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G) , y las bases de pirimidina timina (T) , citosina (C) y uracilo (U) . Las bases modificadas incluyen pero no están limitadas a otras bases sintéticas y naturales tales como 5-metil citosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros alquilos de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros alquilo de adenina y guanina, 3-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinilo uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos 5-sustituidos y citosinas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-metilguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Bases adicionales incluyen aquellas descritas en la patente norteamericana No. 3,687,808, aquellas descritas en la Concise Enciclopedia Of Polyitier Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellas descritas por Englisch y colaboradores, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, y aquellas descritas por Sanghvi, Y.S., Chaptér 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Croque, S.T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Tales bases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de enlace de los compuestos oligoméricos de la invención. Estos incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas N-2, N-6 y 0-6, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Las sustituciones de 5-metilcitosina se han mostrado que incrementan la estabilidad del ácido nucleico dúplex por 0.6-1.2°C [Sanghvi YS y colaboradores (1993) Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón 276-278] y son actualmente las sustituciones de base preferidas, aun más particularmente cuando se combinan con modificaciones de 2'-O-metoxietil azúcar. Otra modificación de los' oligonucleótidos de la invención implica enlazar químicamente al oligonucleótido una o más porciones o conjugados, que incrementan la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Tales porciones incluyen, pero no están limitadas a las porciones de lípido tal como una porción de colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-S-trititiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, dodecandiol o residuos de undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1, 2-di-Ohexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adantamino acético, una porción de palmitilo, o una porción de octadecilamina o hexilamino-cabonil-oxicolesterol, como es descrito en la patente norteamericana No. 6,303,374. No es necesario para todas las posiciones en una molécula de oligonucleótido dada que sea uniformemente modificada; y de hecho, más de una de las modificaciones mencionadas en lo anterior puede ser incorporada en un solo compuesto o aun en un solo nucleósido dentro de un oligonucleótido . Como es descrito anteriormente en la presente, los oligonucleótidos de la presente invención de preferencia son moléculas antisen ido, que son moléculas quiméricas. "Moléculas antisentido quiméricas" son oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una constituida de por lo menos un nucleótido. Estos oligonucleótidos típicamente contienen por lo menos una región en donde el oligonucleótido es modificado en cuanto a conferir en el. oligonucleótido resistencia incrementada a la degradación de nucleasa, captación de celular incrementada y/o afinidad de enlace incrementada para el polinucleótido objetivo. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como un sustrato de enzimas capaces de segmentar RNA:DNA o híbridos de RA:RNA. Un ejemplo para tal incluye RNasa H, que es una endonucleasa celular que segmenta la hebra de RNA de un RNA:DNA dúplex. La actividad de RNasa H, por lo tanto, resulta en la segmentación de KNA objetivo, para incrementar de esta manera grandemente la eficiencia de inhibición del oligonucleótido de la expresión de gen. Consecuentemente, resultados comparables frecuentemente se pueden obtener con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, comparado con fosforotioato desoxioligonucleótidos que hibridan a la misma región objetivo. La segmentación del RNA objetivo se puede detectar rutinariamente mediante la electroforesis en gel y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácido nucleico asociado conocidos en la técnica.
Las moléculas antisentido quiméricas de la presente invención se pueden formar con estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, como es descrito en lo anterior. Las patentes norteamericanas representativas que enseñan la preparación de tales estructuras híbridas incluyen, pero no están limitadas a, las patentes norteamericanas Nos. 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356 y 5,700,922, cada una de las cuales es incorporada completamente en la presente por referencia. Los oligonucleótidos de la presente invención además pueden comprender una secuencia de ribozima. Las ribozimas están siendo utilizadas cada vez más para la inhibición específica de secuencia mediante la expresión de gen de la segmentación de itiRNs . Varias secuencias de ribosita pueden ser fusionadas a los oligonucleótidos de la presente invención. Estas secuencias incluyen, pero no están limitadas a A GIOZYME que específicamente inhibe la formación del VEGF-R (receptor del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular) , un componente clave en la ruta de angiogénesis, y HEPTAZYME, una ribosita diseñada para destruir selectivamente el RNA de virus de Hepatitis C (HCV) , (Rybozime Pharmaceuticals, Incorporated-WEB home page) . Además alternativamente, una molécula de polinucleótido de interferencia pequeña, de acuerdo con la invención puede ser üna DNAzima. Las DNAzimas son moléculas de ácido nucleico catalíticas de una sola hebra, ün modelo general (el modelo ??10-23") para la DNAzima se ha propuesto. Las DNAzimas "10-23" tienen un dominio catalítico de 15 desoxirribonucleótidos flanqueados por dos dominios de reconocimiento de sustrato de siete a nueve desoxirribonucleótidos cada uno. Este tipo de DNAzima puede segmentar efectivamente su RNA de sustrato en uniones de purina:pirimidina (Santero, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 199; para la revisión de DNAzimas ver Khachigian, LM Curr Opin Mol Ther 2002/ 4:119-21) . Ejemplos de la construcción y amplificación de DNAzimas diseñadas, sintéticas que reconocen los sitios de segmentación objetivo de una sola doble hebra han sido descritos en la patente norteamericana No. 6,326,174 de Joyce y colaboradores. Las DNAzimas de diseño similar dirigidos contra el receptor de Uroquinasa humana fueron recientemente observados para inhibir la expresión del receptor de Uroquinasa y exitosamente inhiben la metástasis de la célula de cáncer de colon in-vivo (Itoh y col'abordores, 2002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther ^^· ^^·?~3) · ^n otra aplicación, las DNAzimas complementarias a los oncogenes bcr-abl fueron exitosas en inhibir la expresión de oncogenes en células de leucemia, y en disminuir las proporciones de recaída en el transplante de médula ósea autóloga en casos de CML y ALL. Alternativamente, como es mencionado antes en la presente y es además detallado en PCT/IL03/00064 y la solicitud de patente provisional norteamericana No . 60/452,545, los inhibidores de la superfamilia del receptor de retinoides (por ejemplo, antagonistas, moléculas siRNA, moléculas antisentido, anticuerpos, etc.) que regulan hacia abajo o suprimen la actividad del receptor retinoide y/o la expresión se pueden usar para regular hacia abajo la expresión de CD38. Brevemente, los receptores de retinoide tal como el receptor de ácido retinoico (RAR) , receptor de retinoide X (RXR) y receptor de Vitamina D (VDR) se han reportado que están implicados en la regulación de las rutas de expresión de gen asociadas con la proliferación y diferenciación celular y en particular en la regulación de la expresión de CD38 [ apil M., Teresa M., Taghi M. , Michael A., Steven C, Maher A., Involvement of retinoic acid receptor mediated signaling pathway in induction of CD38 cell surface antigen, Blood. 1997/ 89-3607-3614/ Ueno H, Kizaki M, Matsushita H, Muto A, Yamato K, Nishihara T, Hida T, Yoshimura H, J] oeffler HP, Ikeda Y. A novel retinoic acid receptor (RAR) -selective antagonist inhibits differentiation and apoptosis of HL-60 cells: implications of RAR alpha-mediated signáis in myeloid leukemic cells. Leuk Res. 1998; 22:517-25]. Por consiguiente, los agentes preferidos que regulan hacia abajo la expresión de CD38 de acuerdo con la presente invención incluyen antagonistas de RAR, antagonistas de RXR y antagonistas de VDR o, alternativamente, antagonistas para reducir la capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoide y/ Vitamina D. Como se utiliza en la presente, el término "antagonista" se refiere a un agente que contrarresta o anula los efectos de un agonista o un ligando natural de un receptor. Características adicionales relacionadas con tales antagonistas son detalladas enseguida en la presente. Además · alternativamente, como es descrito en detalle en la solicitud de patente provisional norteamericana No. 60/452,545, la regulación hacia abajo de la expresión CD38 se puede obtener a regular hacia abajo la expresión y/o actividad de fosfatidil inositol 3-quinasa, que también es referido en la presente como PI 3-quinasa. Brevemente, se ha reportado que PI-3quinasa desempeña una función crítica en la activación de los receptores nucleares tal como la familia de receptores de retinoide y el receptor de Vitamina D, como un factor obligatorio para las rutas de señalización de receptor apropiado y pro consiguiente está implicado en la diferenciación celular.
Por consiguiente, los agentes que interfieren con la expresión y/o actividad de PI 3-quinasa también son agentes preferidos para lograr hacia abajo CD38 de acuerdo con la presente invención. Ejemplos representativos de agentes que inhiben la actividad de PI 3-quinasa incluyen pero no están limitados a, los inhibidores de PI 3-quinasa conocidos wortmanina y LY294002 y análogos, derivados y metabolitos de los mismos. Ejemplos adicionales de inhibidores de PI 3-quinasa son descritos en la patente norteamericana No. 5,378, 725, la cual es incorporada en la presente por referencia como si se expusiera completamente en la presente. Ejemplos representativos de agentes que regulan hacia abajo la expresión de PI 3-quinasa de acuerdo con la presente invención, incluyen, pero no están limitados a, polinucleótidos, tales como moléculas de RNA de interferencia pequeña, ribositas antisentido y DNAzimas, asi como anticuerpos intracelulares, usando las metodologías descritas anteriormente en la presente con respecto a la regulación hacia debajo de la expresión de CD38. Cada uno de los agentes descritos anteriormente en la presente puede reducir la expresión o actividad de CD38 individualmente. Sin embargo, los objetivos de la presente invención también comprenden el uso de cualquier subcombinación de estos agentes. Será apreciado que los agentes de proteína (por ejemplo, anticuerpos) de la presente invención se pueden expresar a partir de un polinucleótido que modifica a los mismos y proporcionado a las células mononucleares hematopoyéticos cultivadas ex-vivo empleando un vehículo/método de suministro de gen apropiado y una construcción de ácido nucleico como es descrito adicionalmente enseguida en la presente. Ejemplos de construcciones adecuadas, incluyen, pero no están limitadas a pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pGL3, PzeoSV2 (+/-) , pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto cada una de las cuales es comercialmente disponible de Invitrogen Co. (w r. nyi,trogen , com) . Ejemplos de vectores retrovirales y sistemas de empaquetamiento son aquellos vendidos por Clontech, San Diego, Calif., incluyendo los vectores retro-X, pLNCS y pLXSN, que permiten la clonación en sitios múltiples de clonación y el transgen es transcrito al partir del promotor CMV. Vectores derivados de Mo-MuLV también son incluidos tal como pBabe, donde el transgen será transcrito a partir del promotor 5'LTR. Como el método ex-vivo de una población de células de tallo ematopoyéticas, de acuerdo con este aspecto de la presente invención, se efectúa al modular la expresión y/o actividad de CD38, ya sea al nivel de proteina, usando los antagonistas BAR, RXR o VDR, un inhibidor de PI-3 quinasa o un inhibidor de CD38 tal nicotinamida y análogos de la misma, o en el nivel de expresión por medio de técnicas de ingeniería genética, como es detallado anteriormente en la presente, además son proporcionados de acuerdo con la presente invención, varios métodos preferidos de expansión ex-vivo de una población de células de tallo hematopoyéticas de células mononucleares hematopoyéticas. En un detalle particular, un método de expansión ex-vivo de una población de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas exvivo se efectúa al proporcionar células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo progenitoras hematopoyéticas, con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular ex-vivo y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoide y/o Vitamina ?, para expandir una población de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo. La reducción de la capacidad de las células en responder al ácido retinoico, retinoides y/o Vitamina D, o a la señalización de receptor de ácido retinoico, retinoide X y/o Vitamina D se puede efectuar, por ejemplo, mediante la administración de inhibidores químicos, incluyendo antagonistas de receptores. En otro detalle particular, el método de expansión ex-vivo de una población de células de tallo, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo ex-vivo se efectúa al proporcionar células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas o una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, con condiciones de cultivo in-vivo para la proliferación celular ex-vivo y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización que implican el receptor de ácido retinoico, receptor de retinoide X y/o receptor de vitamina D, para de esta manera expandir una población de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo. La reducción de la capacidad de las células al responder a los eventos de la señalización de ácido retinoico, retinoide X y/o Vitamina D, incluye tratar las células con antagonistas suministrados continuamente o durante un período de impulsos cortos, y se efectúa mediante una disminución o anulación de las rutas de señalización celulares a través de sus receptores cognados respectivos.
Como es descrito y ejemplificado en PCT/IL01/00064, la reducción de la capacidad de células hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización descritas es reversible, por ejemplo, inherentemente reversibles. En otras palabras, las células expandidas usando los protocolos de la presente invención no se transforman en líneas de células . Por consiguiente, al exponer las células después de las suficiente expansión a la condición de crecimiento mediante las cuales la diferenciación es inducida, sería capaz de dirigir las diferenciaciones ex-vivo de las células a la dirección deseada, incluyendo la cis- y trans-diferenciación ex-vivo e in-vivo. Como se utiliza en la presente ""cis-diferenciación" se refiere a la diferenciación de células de tallo adultas en un tejido a partir del cual son derivadas. Por ejemplo, la diferenciación de las células hematopoyéticas CD34+ a diferentes células de la sangre comprometidas/maduras constituye una cis-diferenciación. Como se utiliza en la presente "trans-diferenciación" se refiere a la diferenciación de las células de tallo adultas en un tejido a partir del cual son derivadas. Por ejemplo, la diferenciación de las células hematopoyéticas CD34+ a células de diferente origen de tejido, por ejemplo, miocitos, constituye la transdiferenciación.
La reducción de la capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a los antagonistas anteriores y/o rutas de señalización de los receptores anteriores y quinasas se efectúa al cultivar ex-vivo células mononucleares hematopoyéticas en la presencia de una cantidad efectiva de por lo menos un antagonista del receptor de ácido retinoico, por lo menos un antagonista del receptor de retinoide X de por lo menos un antagonista del receptor de Vitamina D, de preferencia, durante un periodo de tiempo 0.1-50%, de preferencia 0.1-25%, más de preferencia 0.1-15%, de un periodo de cultivo ex-vivo completo de las células mononucleares hematopoyéticas o durante el periodo completo. A este respecto, no fue cubierto de manera sorprendente que la exposición de impulsos a iniciar a un antagonista es suficiente para ejercer la expansión de la célula por largo tiempo después de que el antagonista se retiró de la instalación de cultivo. Las concentraciones finales de los antagonistas pueden ser, dependiendo de la aplicación especifica, en los intervalos micromolares o milimolares. Por ejemplo, dentro de aproximadamente 0.1 uM a aproximadamente 100 iriM, de preferencia dentro de aproximadamente 4 uM a aproximadamente 50 mM, más de preferencia dentro de aproximadamente 5uM a aproximadamente 40 mM. Muchos antagonistas a RAR, RXR y VDR, que son utilizables en esto y otros aspectos en modalidades de la presente invención, son actualmente conocidos. Ejemplos representativos de tal antagonista del receptor de ácido retinoico incluyen, sin limitación, AGN 194310; AGN 109; ácido 3- (4-metoxi-fenilsulfanil) -3-metil-butirico; 6-Metoxi-2, 2-dimetil-tiocroman-4-ona, 2, 2-Dimetil-4-oxo-tiocroman-6-iltrifluorometano-sulfonato; 4- ( (2,2-dime-til-4-oxo-tiocroman-6-il) etinil) -benzoato de etilo; 4-((2,2-dimetil 1-4-trifluorometanosulfoniloxi- (2H) -tiocroman-6-il) etilnil) -benzoato de etilo (41); Tiocromen-6-il] -etinil] -benzoato (ilo) ; l'l' -dióxido de ácido (p- [ (E) -2- [3' 4' -Dihidro- .4' dimetil-7' - (heptiloxi) -2'H-l-benzotiopiran-6' iljprope-nil] benzoico; ácido 2E, 4E, 6E- [7- (3, 5-Di-t-butil-4-n-butoxifenil] -3-metil-octa-2 , 4, 6-trienoico; ácido 2E,4E,6E-[7- (3, 5-Di-t-butil-4-n-propoxifenil] -3-metil-octa-2 , , 6-trienoico; ácido 2E, 4E, 6E- [7- (3, 5-Di-t-butil-4-n-pentoxifenil] -3-metil-octa-2, 4, 6-trienoico; ácido 2E, E, 6E- [7- f3, 5-Di-t-butil-4-n-hexoxifenil] -3-metil-octa-2, 4, 6-trienoico; ácido 2E, 4E, 6E- [7- (3, 5-Di-t-butil-4-n- eptoxifenil] -3-metil-octa-2, 4, 6-trienoico; ácido 2E,4E,6E- [7- (3, 5-Di-t-butil-4-n-octoxifenil] -3-metil-octa-2, 4, 6-trienoico; ácido 2E, 4E, 6E- [7- [3-t-butil-5- (1-fenil-vinil) -fenil] -3-metil-octa-2, 4, 6-trienoico; ácido 2E, E, 6E- [7- (3, 5-Di-t-butil-4-{ [4, 5-.sup.3H.sub.2]-n-pentoxi}fenil) -3-metil]-octa-2, 4, 6-trienoico; éster etílico de ácido (2E,4E)- (1RS, 2RS) -5- [2- (3, 5-di-ter .butil-2-etoxi-fenil) -ciclopropil] - 3-metil-penta-2, 4-dienoico; ácido (2E, 4E) - (1RS, 2RS) -5- [2-(3, 5-di-ter .butil-2-etoxi-fenil) -ciclopropil] -3-metil-penta-2, 4-dienoico; ácido (2E, 4E) - (1RS, 2RS) -5- [2- (3, 5-di-ter-butil-2-etoxi-fenil ) -ciclopropil] -S-metil-penta^, 4-dienoico; ácido (2E, 4E) - (1RS, 2RS) -5- [2- (3, 5-di-ter-butil-2-butoxi-fenil) -ciclopropil] -3-metil-penta-2, 4-dienoico; ácido (2E, 4E, 6Z) -7-[3, 5-di-ter .butil] -2-etoxifenil] 3-metil-2, 4, 6-octatrienoico; ácido (2E, 4E, 6Z) -7- [3, 5-di-ter-butil] -2-oxifenil] 3-metil-2, 4, 6-octatrienoico; ácido 4- (5, 6, 7, 8-tetrahidro-5, 5, 8, 8-tetrametil-2-naftalen-carboxamido) benzoico; ácido (2E,4E)-3-metil-5- [ (1S, 2S) -2- (5, 5, 8, 8-tetrametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-naftalen-2-il ) ciclopropil] -penta-2, 4-dienoico; ácido p-[E)-2 [3' , 4'-Dihidro-4' , 4' -dimetil-7' - (heptiloxi) -2?-1-benzotriopiran-6' -il]propenil] enzoico; ácido 1' , 1' -dióxido, 4- (7, 7, 10, 10-Tetrametil-l-piridin-3-ilmetil-4, 5, 7, 8, 9, 10-hexahidro-lH-nafto [ 2 , 3-glindol-3-il ) benzoico ; ácido (2E, 4E, 6Z) -7- [3, 5-di-ter-butil-2-metoxifenil] -3-metil-2, 4, 6-octatrienoico; ácido (2E, 4E, 6Z) -7- [3, 5-di-ter-butil-2-etoxifenil] -3-metil-2, 4, 6-octatrienoico; ácido (2E, 4E, 6Z) -7- [3, 5-di-ter .butil-2-hexiloxifenil] -3-metil-2, 4, 6-octatrienoico; ácido (2E, 4E, 6Z) -7- [3, 5-di-ter . butil-2-octiloxifenil] -3-metil-2, , 6-octatrienoico; y ácido (2E,4E)- ( (1RS, 2RS) -5- [2-butoxi-fenil) -ciclopropil] -3-metil-penta-2, 4-dienoico; ácido (2E, 4E, 6Z) -7- [3,n-propoxi-5, 6, 7, 8-tetrahidro -5, 5, 8, 8-tetrametilnaftaleno-2-il) -3-metilocta-2, 4, 6-trienoi-co, ácido 4-5H-2.3 (2, 5-dimetil-2, 5-hexano) -5-n-propildi-benzo [b, e] [1, 4] diacepin-ll-il)benzoico, ácido 4- (5H-2, 3- (2, 5-dimetil-2, 5-hexano) -5metil-8~nitrodibenzo [b, e] [1,4] diacepin-11-ilbenzoico, ácido 4-{ [4- (4-Etilfenil) 2, 2-dimetil- (2H) -tiocrom.en-6-il] etinil jbenzoico, ácido 4- [4-2-metil-l, 2-dicarba-closo-dodecaboran-l-il-fenilcarbamoil] benzoico, ácido 4- [4, 5,7,8,9, 10-hexahidro-7, 7, 10, 10-tetrametil-l- (3-piridil-metil) -antra [1, 2-b]pirrol-3-il) benzoico, ácido (3-piridilmetil) -] 5-tiaantra[2, 1-b] pirrol-3-il) benzoico, y ácido 3-piridilmetil) -antra [2ml-d] irazol-3-il]benzoico . Ejemplos representativos de tales antagonistas del receptor de retinoide X incluyen sin limitación, LGN100572, 1- (3-hidroxi-5, 6, 7, 8-tetrahidro-5, 5, 8, 8-tetrametilnaftalen-2-il)etanona, 1- (3-propoxi-5, 6, 7, 8-tetrahidro-5, 5, 8, 8-tretra-metilnaftaleno-2-il) etanona, 3- (3-propoxi-5, 6, 7, 8-tetrahidro-5,5,8, 8-tetrametilhaftaleno-2-il) etanona, 3- (3-propoxi- 5,6,7, 8-tetrahidro-5, 5, 8, 8-tetrametilnaftaleno-2-il) but-2-enenitrilo, 3- (3-propoxi-5, 6, 7, 8-tetrahidro-5, 5, 8, 8-tetrametilnaftaleno-2-il)but-2-enal, ácido (2E, 4E, 6E) -7-3 [-propoxi-5, 6, 7, 8-tetrahidro 5,5,8, 8-tetrametil-2-naftaleno-2-il) -3-metilocta-2, 4, 5-trienoico, ácido 4- [3, 5, 5, 8 , 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) carbonil] benzoico, ácido 4- [1- (3,5,5,8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) etenil] benzoico, ácido 4- [1- (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) ciclopropil] benzoico, ácido 4-[l- (3,5,5,8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) etenil] -benceneto trazol, ácido 2- [1- (5, 5, 8, 8-tetrametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) etenil] iridina-5-carboxílico, ácido 2- [1- (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) etil] -piridina-5-carboxílico, etil-2- [1- (3, 5, 5, 8, 8-pentametil- 5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) etenil] piridin-5-carbóxilato, ácido 5- [1-3, 5,5,8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) etenil] piridin-5-carboxilico, ácido 2- [1- (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) ciclopropil] piridin-5-carboxílico, 2- [1- (3,5,5,8, 8-pentametil-5, 6,7, 8-tetrahidro-2-naftil) ciclopropil]piridin-5-carboxilato de metilo, 4-[l- (3,5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) etenil] -N- (4-hidroxifenil) benzamida, ácido 2- [1- (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5,6,7, 8-tetrahidro-2-naftil) etenil] piridina-5-carboxilico, ácido 2- [1- (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) ciclopropil] piridina-5-carboxilico, butiloxima de ácido 4- [ (3,5,5,8, 8-pentametil-5, 6,7, 8-tetrahidro-2-naftil) carbonil] benzoico, propiloxima de ácido 4- [ (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) carboniljbenzoico, cianoimi'na de ácido 4- [ (3, 5, 5, 8 , 8-pentametil-5, 6, 7 , 8-tetrahidro-2-naftil) carbonil] benzoico, aliloxima de ácido 4- [ (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) carbonil] -benzoico, 4- (ácido 3-metilbut-2-enoico) oxima, y ácido 4- [ (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftil) carbonil] -benzoico, y l-aminoetiloxima de ácido 4- [ (3, 5, 5, 8, 8-pentametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-2iiaftil) carbonil] benzoico, ácido (2E, 4E, 6Z) -7- (3-n-propoxi-5, 6, 7, 8-tetrahidro-5, 5, 8, 8-tetrametilnaftaleno-2-il) -3-metilocta-2, 4, 6-trienoico, y ácido 4- (5H-2, 3 (2, 5-dimetil-2, 5-hexano) -5-n-propildibenzo- [b, e] [1, 4] diazepin-ll-il) benzoico, y 4- (5H-2, 3- (2, 5-dimetil-2, 5-hexano) -5m. Ejemplos representativos de tales antagonistas del receptor de Vitamina D incluyen, sin limitación: 1 alfa, 25- (OH) -D3-26, 23 lactona; 1 alfa, 25-dihidroxivitamina D(3); el éster 25-carboxilico ZK159222 (23S) -25-dehidro-l alfa-OH-D(3); (23R) -25-dehidro-l-alfa-OH-D (3) ; 1 beta, 25 (OH)2 D3; 1 beta, 25 (0H)2-3-epi-D3; (23S) 25-dehidro-l-alfa (OH) D3-26, 23-lactona; (23R) 25-dehidro-l alfa (OH) D3-26, 23-lactona y Butil- (5Z,7E,22E- (1S, 7E,22E- (1S, 3R, 24R) -1, 3, 24-trihidroxi-26, 27-ciclo-9, 10-secocolesta-5, 7, 10 (19) , 22-tetraeno-25-carboxilato) . Los antagonistas listados en lo anterior son conocidos por su alta afinidad hacia sus receptores cognados respectivos. Sin embargo, puede ser posible para estas moléculas que sean activas hacia otros receptores. Por consiguiente, en otro aspecto particular, el método de expansión ex-vivo de una población de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo se efectúa al proporcionar células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo progenitoras hematopoyéticas, con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular ex-vivo y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización que implican PI 3-quinasa, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas exvivo. En otro aspecto particular, el método de expansión ex-vivo de una población de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas exvivo se efectúa al proporcionar células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas de una fracción menor de células de tallo progenitoras hematopoyéticas, con condiciones de cultivo para la proliferación celular ex-vivo y con nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida, para de esta manera expandir una población de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo. En todavía otro detalle particular, el método de expansión ex-vivo de una población de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo se efectúa al proporcionar células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular ex-vivo y con un inhibidor de PI 3-quinasa, para de esta manera expandir una población de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo. Las concentraciones finales de la nicotinamida o los análogos, derivados o metabolitos de la misma y del inhibidor de PI 3-quinasa de preferencia están, dependiendo de la aplicación específica, en las gamas milimolares. Por ejemplo, dentro de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 20 mM, de preferencia dentro de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM, más de preferencia dentro de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM. Como es descrito anteriormente en la presente y además es e emplificado en la sección de ejemplos que sigue, la expansión de la población de células de tallo hematopoyéticas presente en células mononucleares hematopoyéticas también se puede efectuar en la presencia de agentes quelantes o quelatos de cobre. Como es discutido en detalle en WO 00/18885 y en PCT/IL03/00062, la adición de agentes quelantes de cobre o quelatos de cobre al medio de cultivo de células afecta la concentración de cobre celular, que a su vez, afecta las rutas de señalización asociadas con la diferenciación de las células. De acuerdo con las enseñanzas de WO 00/18885 y PCT/IL03/00062, la adición de un quelato de cobre al medio de cultivo de células mantienen la concentración de cobre libre de las células sustancialmente sin cambio durante la expansión celular, mientras que la adición de un agente quelante de cobre al medio de cultivo de células reduce la capacidad de las células en la utilización de cobre. Como se utiliza en la presente, la frase agente quelante de cobre" se refiere a un ligando que tiene por lo menos dos átomos capaces de coordinación con cobre o un ión cobre, para formar un anillo..Un agente quelante de cobre está libre de, es decir, no está formado en complejo con, el ión cobre. Características adicionales relacionadas con los efectos quelantes son. descritas, por ejemplo, en PCT/IL03/00062. Como se utiliza por toda la presente, la frase "quelato de cobre" se refiere a un agente quelante de cobre, como se define anteriormente en la presente, que se forma en complejo con un ión de cobre. Por consiguiente, de acuerdo con la presente invención se proporciona otro método de expansión ex-vivo de una población de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo. El método, de acuerdo con este aspecto de la presente invención se efectúa al proporcionar células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular ex-vivo y con uno o más agente (s) quelante (s) de cobre o quelato(s) de cobre, para de esta manera expandir una población de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo. El quelato o agentes quelatos de cobre de la presente invención es f ecuentemente capaz de formar un complejo organometálico con un metal de transición diferente al cobre. Como los metales diferentes al cobre están típicamente presentes en las células (por ejemplo, zinc) o se puede administrar a células durante la terapia (por ejemplo, platino) , se encontró que los quelatos o agentes quelantes de cobre que también pueden interactuar con otros metales son altamente efectivos. Ejemplos representativos de tales metales de transición incluyen, sin limitación, zinc, cobalto, níquel, hierro, paladio, platino, rodio y rutenio. Los quelatos de cobre de la presente invención comprenden un ión de cobre (por ejemplo Cu+1, Cu+2) y uno o más agentes quelantes de cobre. Los agentes quelantes de cobre preferidos de acuerdo con la presente invención incluyen moléculas de poliamina, que pueden formar un complejo cíclico con el ión de cobre por la vía de dos o más grupos de amina presentes en la poliamina. Por consiguiente, el quelato o agente quelante de cobre usado en el contexto de los diferentes aspectos y modalidades de la presente invención, de preferencia incluye un agente quelante de poliamina, específicamente una cadena polimérica que esta sustituida y/o interrumpida con 1-10 porciones de amina, de preferencia 2-8 porciones de amina, más de preferencia 4-6 porciones de amina y mucho más de preferencia 4 porciones de amina. Las frases "porción de amina", "grupo amina" y simplemente "amina" se usan en la presente para describir un grupo -NR'R" o grupo - R'-, dependiendo de su ubicación dentro de la molécula, donde R' y R" son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heterocíclico, como estos términos se definen enseguida en la presente. El agente quelante de poliamina puede ser una poliamina lineal, una poliamina cíclica o una combinación de las mismas. Una poliamina lineal, de acuerdo con la presente invención, puede ser una poliamina que tiene una fórmula general I . HX-Am- (Y1B1) ¦··· (YnBn) n-ZH Fórmula I en donde m es un número entero de 1 a 10; n es un número entero de 0 a 20; X y Z son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre y un grupo -NH; Yi y Yn son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre y un grupo -NH; A es una cadena de alquileno que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono sustituidos y/o no sustituidos; y Bi y Bn son cada uno independientemente una cadena de alquileno que tiene entre 1 y 20 átomos de carbono sustituidos y/o no sustituidos, con la condición de que por lo menos uno de X, Z, Yi y Yn sea un grupo —NH y/o por lo menos uno de los átomos de carbono en las cadenas de alquileno esté sustituido por un grupo amina . Por consiguiente, la poliamina lineal de acuerdo con la presente invención, está de preferencia comprendida de una o más unidades de alquileno (Am, Bi—Bn, en la Fórmula I), está interrumpida por uno o más heteroátomos tales como S, O y N (Yi—Yn en la Fórmula I) , y termina con dos de tales heteroátomos (X y Z en Fórmula I) . La cadena de alquileno A, como es descrita anteriormente en la presente, incluye 1-10 átomos de carbono sustituidos o no sustituidos y está conectada, por lo menos en un extremo de la misma, a un heteroátomo (por ejemplo, X en la Fórmula I) . Cada vez que hay menos de una cadena de alquileno A (en caso donde m es mayor que uno) , solamente la primera cadena de alquileno A está conectada a X. Sin embargo, m es de preferencia 1 y por consiguiente la poliamina lineal representada en la Fórmula I de preferencia incluye solamente una cadena de alquileno A. La cadena de alquileno B, como es descrito anteriormente en la presente, incluye entre 1 y 20 átomos de carbono sustituidos o no sustituidos. La cadena de alquileno B está conectada en sus dos extremos a un heteroátomo (??····?? y Z en la Fórmula I) . La poliamina lineal preferida delineada en la Fórmula I comprende entre 1 y 20 cadenas de alquileno B, denotadas como ??···-??, donde "??"·-??" se utiliza en la presente para describir una pluralidad de cadenas de alquileno B, específicamente, Bi, B2/ B3/ ¦·¦·, Bn-1 y Bn, donde n es igual a 0-20. Estas cadenas de alquileno pueden ser las mismas o diferentes . Cada una de Bx—Bn está conectada al heteroátomo respectivo ??···-??, y la última cadena de alquileno en la estructura, Bn, también está conectada al heteroátomo . Se debe observar que por toda la presente, cada vez que un número entero es igual a 0 o cada vez que un componente de la fórmula es seguido por el dígito 0, este componente está ausente de la estructura. Por ejemplo, si n en la Fórmula I es igual a 0, no hay cadena de alquileno B y ningún heteroátomo Y se propone para estar en la estructura. De preferencia, n es igual a 2-10, más de preferencia 2-8 y mucho más de preferencia 3-5. Por consiguiente, la poliamida lineal representada en la Fórmula I de preferencia incluye entre 3 y 5 cadenas de alquileno B, cada una conectada a 3-5 heteroátomos Y. La poliamida lineal representada en la Fórmula I debe incluir por lo menos un grupo amina, como este término es definido anteriormente en la presente, de preferencia por lo menos dos grupos amino y más de preferencia por lo menos 4 grupos amina. El grupo amina puede estar presente en la estructura como los heteroátoraos X, Z ó ??—Yn, tal que por lo menos una de X, Z y ??-^-?? es un grupo -NH-, o como un sustituyente de uno o más de los átomos de carbono sustituidos en las cadenas de alquileno A y Bi—Bn. La presencia de estos grupos amina es requerida con el fin de formar un quelato estable con el ión de cobre, como es discutido anteriormente en la presente. La cadena de alquileno A de preferencia tiene una Fórmula general II: Fórmula II . en donde g es un número entero que es igual a 0 o 3-10. Por consiguiente, la cadena de alquileno A está comprendida de una pluralidad de átomos de carbono Ci, C2, C3""r Cg-1 y Cg, sustituidos por los grupos respectivos Ri, 2, R3"", Rg-1 y Rg. De preferencia, la cadena de alquileno A incluye 2-10 átomos de carbono, más de preferencia, 2-6 y mucho más de preferencia 2-4 átomos de carbono. Como es definido anteriormente en la presente, en casos donde g es igual a 0, el componente CgH (Rg) está ausente de la estructura y por consiguiente la cadena de alquileno A comprende solamente 2 átomos de carbono. Ri, R2 y Rg son cada uno un sustituyente unido a los átomos de carbono en A. Cada uno de Ri, ¾ y Rg puede ser independientemente un sustituyente tal como, pero no limitado a, hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, heteroaliciclico, heteroarilo, halo, amino, alquilamino, arilamino, cialquilamino, heteroaliciclico amino, heteroarilamino, hidroxi, alcoxi, ariloxi, azo, C-amido, N-amido, amonio, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, sulfonilo, sulfinilo, N-sulfonamida, S-sulfonamida, fosfonilo, fosfinilo, fosfonio, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, C-tiocarboxi, O-tiocarboxi, N-carbamato, O-carbamato, N-tiocarbamato, O-tiocarbamato, urea, tiourea, borato, borano, boroaza, sililo, siloxi, silaza, acuo, alcohol, peroxo, amina óxido, hidrazina, alquil hidrazina, aril hidrazina, óxido nítrico, cianato, tiocianato, isocianato, isotiocianato, ciano, alquilnitrilo, aril nitrilo, alquil isonitrilo, aril isonitrilo, nitrato, nitrito, azido, ácido alquil sulfónico, ácido aril sulfónico, sulfóxido de alquilo, sulfóxido de arilo, sulfóxido de alquil arilo, ácido alquil sulfénico, ácido aril sulfénico, ácido alquil sulfínico, ácido aril sulfínico, ácido alquil tiol carboxílico, ácido aril tiol carboxílico, ácido alquil tiol tiocarboxílico, ácido aril tiol tiocarboxílico, ácido carboxílico, ácido alquil carboxílico, ácido aril carboxílico, sulfato, sulfito, bisulfito, tiosulfato, tiosulfito, alquil fosfina, aril fosfina, alquil fosfina óxido, aril fosfina óxido, alquil aril fosfina óxido, alquil fosfina sulfuro, aril fosfina sulfuro, alquil aril fosfina sulfuro, ácido alquil fosfónico, ácido aril fosfónico, ácido alquil fosfinico, ácido aril fosfinico, fosfato, tiofosfato, fosfito, pirofosfito, trifosfato, hidrógeno fosfato, dihidrógeno fosfato, guanidino, S-ditiocarbamato, N-ditiocarbamato, bicarbonato, carbonato, perclorato, clorato, clorito, hipoclorito, perbromato, bromato, bromito, hipobromito, tetrahalomanganato, tetrafluoroborato, hexafluoroantimoniato, hipofosfito, yodato, peryodato, metaborato, tetraarilborato, tetraalquil borato, tartarato, salicilato, succinato, c trato, ascorbato, sacarirato, aminoácido, ácido hidroxámico y tiotosilato. Cada vez que Ri, R2 ó Rg es hidrógeno, su átomo de carbono respectivo es un átomo de carbono no sustituido. Como se utiliza en la presente, el término "alquilo" es un hidrocarburo alifático saturado que incluye grupos de cadena recta y cadena ramificada. De preferencia, el grupo alquilo tiene de 1 a 20 átomos de carbono. Más de preferencia, es un alquilo de tamaño mediano que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Mucho más de preferencia, es un alquilo inferior que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. El grupo alquilo puede ser sustituido o no sustituido. Cuando es sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroaliciclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, ciano, halo, carbonilo, tiocarbonilo, O-carbamato, N-carbamato, O-tiocarbamato, N-tiocarbamato, C-amido, N-amido, C-carboxy, O-carboxy, nitro, sulfonamida, sililo, guanidina, urea o amino, como estos términos se definen enseguida en la presente. El término "alquenilo" describe un grupo alquilo que consiste de por lo menos dos átomos de carbono y por lo menos un enlace doble de carbono-carbono. El término "alquinilo" describe un grupo alquilo que consiste de por lo menos dos átomos de carbono y por lo menos un enlace triple de carbono-carbono. El término "cicloalquilo" describe un anillo monociclico o fusionado todo de carbono (es decir, anillos que comparten un par adyacente de átomos de carbono) grupo en donde uno o más de los anillos no tiene un sistema de electrón pi completamente conjugado. Ejemplos, sin limitación, de grupos cicloalquilo son ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexadieno, cicloheptano, cicloheptatrieno y adamantano. Un grupo cicloalquilo puede ser sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, alquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, ciano, halo, carbonilo, triocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, O-carbamato, N-carbamato, C-amido, N-amido, nitro, o amino, como estos términos se definen anteriormente en la presente o enseguida en la presente. El término "arilo" describe grupos policíclicos de anillo monocíclico o fusionado todo de carbono (es decir, anillos que comparten pares adyacentes de átomos de carbono) que tienen un sistema de electrón pi completamente conjugado. Ejemplos, sin limitación, de grupos arilo son fenilo, naftalenilo y antracenilo. El grupo arilo puede ser sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, halo, triñalometilo, alquilo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, O-carbamato, N-carbamato, O-tiocarbamato, N-tiocarbamato, C-amido, N-amido, sulfinilo, sulfonilo o amino, como éstos términos se definen anteriormente en la presente o enseguida. El término "heteroarilo" describe un grupo de anillo monocíclico o fusionado (es decir, anillos que comparten un par adyacente de átomos) que tienen en el (los) anillo (s) uno o más átomos, tales como, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y azufre y, además, que tienen un sistema de electrón pi completamente conjugado. Ejemplos, sin limitación, de grupos heteroarilo incluyen pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina y purina. El grupo heteroarilo puede ser sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, alquilo, cicloalquilo, halo, tialometilo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tiocarbonilo, sulfonamida, C-carboxi, O-carboxi, sulfinilo, sulfonilo, O-carbamato, N-carbamato, O-tiocarbamato, N-triocarbamato, C-amido, N-amido o amino, como estos términos se definen anteriormente en la presente o enseguida . El término "heteroaliciclico" describe un grupo de anillo monociclico fusionado que tiene en el (los) anillo (s) uno o más átomos tales como nitrógeno, oxigeno y azufre. Los anillos también pueden tener uno o más enlaces dobles. Sin embargo, los anillos no tienen un sistema de electrón pi completamente conjugado. El heteroaliciclico puede ser sustituido o no sustituido. Cuando está sustituido, el grupo sustituyente puede ser, por ejemplo, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, halo, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi, tioariloxi, ciano, nitro, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxi, O-carboxi, O-carbamato, N-carbamato, O-tiocarbamato, N-tiocarbamato, sulfinilo, sulfonilo, C-amido, N-amido o amino, como estos términos se definen anteriormente en la presente o enseguida. El término "halo" describe un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo. El término "amino", como se define anteriormente en la presente con respecto a una "amina" o un "grupo amino", se utiliza en la presente para describir un -NR'R", en donde R' y R" son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heterocíclico, como estos términos se definen anteriormente en la presente. Por consiguiente, los términos "alquilamino", "arilamino", "cicloalquilamino", "amino heteroalicíclico" y "heteroarilamino" describen un grupo amino, como se define anteriormente en la presente, en donde por lo menos un R' y R" del mismo es alquilo, arilo, cicloalquilo, heterocíclico y heteroarilo, respectivamente. El término "hidroxi" describe un grupo -OH. Un "alcoxi" describe tanto un grupo -O-alquilo y un grupo -O-cicloalquilo, como es definido en la presente. Un "ariloxi" describe tanto un grupo -O-arilo y un grupo -O-heteroarilo, como es definido en la presente. El término "azo" describe un grupo -N=N. Un "C-amido" describe un grupo -C (=0) - R' R", donde R' y R" son como se definen anteriormente en la presente. Un "N-amido" describe un grupo R' C (=0) -NR"-, donde R' y R" son como se definen anteriormente en la presente. Un "amonio" describe un grupo -N+ R'R", donde R' y R" son como se definen anteriormente en la presente. El término "tiohidroxi" describe un grupo -SH. El término "tioalcoxi" describe tanto un grupo -S-alquilo y un grupo -S-cicloalquilo, como es definido anteriormente en la presente. El término "tioariloxi" describe tanto un grupo -S-arilo y un grupo -S-heteroarilo, como es definido anteriormente en la presente. Un "sulfinilo" describe un grupo -S (=0) -R, donde R puede ser, sin limitación, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo como éstos términos se definen anteriormente en la presente. Un "sulfonilo" describe un grupo -S (=0) z-'R, donde R es como se define anteriormente en la presente. Un "S-sulfonamido" es un grupo -S (=0) 2-NR' R", con R' y R" como se define anteriormente en la presente. Un "N-sulfonamido" es un grupo R' (S=0) 2-NR"-, con R' y R" como se define anteriormente en la presente. Un "fosfonilo" es un grupo -0-P (=0) (OR')-R", con R' y R" como se define anteriormente en la presente. Un "fosfinilo" es un grupo -PR'R", con R' y R" como se define anteriormente en la presente. Un "fosfonio" es un -P+R'R"R"r, donde R' y R" como se definen anteriormente en la presente y R"' se define como ya sea R' o R" . El término "carbonilo" describe un grupo -C(=0)-R, donde R es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo (unido a través de- un carbono del anillo) o heterociclico (unido a través de un carbono del anillo) como es definido anteriormente en la presente. Un "tiocarbonilo" describe un grupo -C(=S)-R, donde R es como se define anteriormente en la presente con respecto al término "carbonilo" . Un grupo "C-carboxi" describe un grupo -C (=0) -0-R, donde R es como define anteriormente en la presente con respecto al término "carbonilo". Un grupo "0-carboxi" se refiere a un grupo RC(=0)-0-, donde R es como se define anteriormente en la presente como respecto al término "carbonilo". Un "ácido carboxilico" es un grupo C-carboxi en el cual R es hidrógeno . Un "C-tiocarboxi" es un grupo -C(=S)-0-R, donde R es como . se define anteriormente en la presente con respecto al término "carbonilo". Un grupo "0-tiocarboxi" se refiere a un grupo R-C(=S)-0-, donde R es como se define anteriormente en la presente con respecto al término "carbonilo". El término "O-carbamato" describe un grupo -0C(=0)-NR'R", con R y R" como se definen anteriormente en la presente. Un "N-carbamato" describe un grupo R' -0-C (=0) -NR", con R' y R" como se definen anteriormente en la presente. Un "O-tiocarbamato" describe un grupo -0-C(=S)-NR'R", con R y R" como se definen anteriormente en la presente. Un "N-tiocarbamato" describe un grupo R'OC (=S) NR", con R' y R" como se definen anteriormente en la presente. El término "urea" describe un grupo -NR'-C(=0)-NR'R", con R , R" y R'" como se definen anteriormente en la presente . El término "tiourea" describe un grupo -NR'C(=S)-NR'R", con R' , R" y R"' como se definen anteriormente en la presente . El término "borato" describe un grupo -0-B-(OR)2/ con R como se define anteriormente en la presente. El término "borano" describe un grupo -B-R'R", con R' y R" como se definen anteriormente en la presente. El término "boraza" describe un grupo -B (R' ) (NR"R"' ) , con R' , R" y R"' como se definen anteriormente en la presente . El término "sililo" describe un -SiR'R"R"', con R' , R" y R'" como se definen anteriormente en la presente. El término "siloxi" es un -Si- (OR) 3, con R como se define anteriormente en la presente. El término "silaza" describe un -Si- (NR'R") 3f con R' y R" como se definen en la presente. El término "acuo" describe un grupo H20. El término "alcohol" describe un grupo ROH, con R como se define anteriormente en la presente.
El término "peroxo" describe un grupo -00R, con R como se define anteriormente en la presente. Como se utiliza en la presente, un "amina óxido" es un grupo - (=0) R' R"R"' , con R',R" y R'" como se define anteriormente en la presente. Una "hidrazina" es un grupo -NR' -NR"R"' , con R' , R" y R"' como se define en la presente. Por consiguiente, "alquil hidrazina" y "aril hidrazina" describe una hidrazina donde R' es un alquilo o un arilo, respectivamente, y R" y R"' son como se define anteriormente en la presente. El término "óxido nítrico" es un grupo -N=0. El término "ciano" es un grupo -C=N. Un "cianato" es un grupo -0-C=N. Un "tiocianato es un grupo -S-C=N. Un "isocianato" es un grupo -N=C=0. Un "isotiocianato" es un grupo -N-C=S . Los términos "alquil nitrilo" y "aril nitrilo" describen un grupo -R-C=N, donde R es un alquilo o un arilo, respectivamente . Los términos "alquil isonitrilo" y "aril isonitrilo" describen un grupo R-N=C-, donde R es un alquilo o arilo, respectivamente. Un "nitrato" o "nitro" es un grupo -N02. Un "nitrito" es un grupo -0-N=0.
Un "azido" es un grupo N3+. Un "ácido alquil sulfónico" y un "ácido aril sulfónico" describe un qrupo -R-S02-OH, con R que es un alquilo o un arilo, respectivamente. Un "sulfóxido de alquilo", un "sulfóxido de arilo" y un "sulfóxido de alquil arilo" describe un grupo -R'S(=0)R", donde R' y R" son cada uno un alquilo, R' y R" son cada uno un arilo y donde R' es un alquilo y R" es un arilo, respectivamente. Un "ácido alquil sulfónico" y "ácido aril sulfónico" describe un grupo -R-S-OH, donde R es un alquilo o un arilo, respectivamente. Un "ácido alquil sulfinico" y "ácido aril sulfinico" describe un grupo -R-S(=0)-OH, donde R es un alquilo o un arilo, respectivamente. Como se utiliza en la presente, los términos "ácido alquil carboxilico" y "ácido aril carboxilico" describe un grupo -R-C (=0) -OH, donde R es un alquilo o un arilo, respectivamente . Un "ácido alquil tiol carboxilico" y un "ácido aril tiol carboxilico" describe un grupo -R-C (=0) -SH, donde R es un alquilo o un arilo, respectivamente. Un "ácido alquil tiol tiocarboxilico" y un "ácido aril tiol tiocarboxilico" describe un grupo -R-C(=S)-SH, donde R es un alquilo o un arilo, respectivamente.
Un "sulfato" es un grupo -0-S02-OR' , con R' como se define anteriormente en la presente. Un grupo "sulfito" es un grupo -0-S (=0) -0R' , con R' como se define anteriormente en la presente. Un "bisulfito" es un grupo sulfito, donde R' es hidrógeno . Un "tiosulfato" es un grupo -0-S02-SR' , con R' como se define anteriormente en la presente. Un grupo "tiosulfito" es un grupo -0-S (=0) -SRf , con R' como se define anteriormente en la presente. Los términos "alquil/aril fosfina" describen un grupo -R-PH2, con R que es un alquilo o un arilo, respectivamente, como se define anteriormente. Los términos "alquil y/o aril fosfina óxido" describen un grupo -R' -PR"2 (=0) , con R' y R" que es un alquilo y/o un arilo, como se define anteriormente en la presente . Los términos "sulfuro de alquil y/o aril fosfina" describen un grupo -R' -PR"2 (—S) , con R y R' que es un alquilo y/o un arilo, como se define anteriormente en la presente. Los términos "ácido alquil/aril fosfónico" describen un grupo -R' -P ( (=0) (0H)2, con R' que es un- alquilo o un arilo como se define anteriormente. Los términos "ácido alquil/aril fosfinico" describen un grupo -R'-P(0H)2, con R' que es un alquilo o un arilo como se define anteriormente. Un "fosfato" es un grupo -0-P (=0) (OR' ) (OR") , con R' y R" como se define anteriormente en la presente. Un "hidrógeno fosfato" es un grupo fosfato, donde R' es hidrógeno. Un "dihidrógeno fosfato" es un grupo fosfato, donde R' y R" son ambos hidrógeno . Un "tiofosfato" es un grupo -S-P (=0) (OR' ) 21 con R' como se define anteriormente en la presente. Un "fosfato" es un grupo -0-P(0R' )2, con R' como se define anteriormente en la presente. Un "pirofosfito" es un grupo -0-P- (OR' ) -0-P (OR") 2, con R' y R" como se define anteriormente en la presente. Un "tiofosfato" describe un -0P (=0) (0Rr ) -0-P (=0) (OR") -0-P (=0) (OR"' ) 2, con R' , R" y R"' son como se define anteriormente en la presente. Como se utiliza en la presente, el término "guanidina" describe un grupo -R' NC (=N) -NR"R"' , con R' , R" y R"' como se definen en la presente. El término "S-ditiocarbamato" describe un grupo -SC (=S) -NR'R", con R' y R" como se definen anteriormente en la presente. El término "N-ditiocarbamato" describe un grupo R' SC (=S ) -NR", con R' y R" como se definen anteriormente en la presente.
Un "bicarbonato" es grupo -0-C(=0)-0~. Un "carbonato" es un grupo -0-C (=0) -OH. Un "perclorato" es un grupo -0-Cl(=0)3. Un "clorato" es un grupo -0-Cl(=0)2- Un "clorito" es un grupo -0-Cl(=0) . Un "hipoclorito" es un grupo —0C1- . Un "perbromato" es un grupo -0-Br(=0)3. Un "bromato" es un grupo -0-Br(=0)2. Un "bromito" es un grupo -0-Br(=0) . Un " ipodromito" es un grupo -OBr. Un "peryodato" es un grupo -0-I(=0)3. Un yodato" es un grupo -0-I(=0)2. El término "tetrahalomanganato" describe MnCl MnBr y Mn±4. El término "tetrafluoroborato" describe un grupo -BF4. Un "tetrafluoroantimoniato" es un grupo SbF6. Un " ipofosfito" es un grupo -P(0H)2. El término "metaborato" describe el grupo en donde R' , R" y R"' son como se define anteriormente en la presente . Los términos "tetraalquil/tetraaril borato" describen un grupo R'B", con R' que es un alquilo o un arilo, respectivamente, como es definido anteriormente. Un "tartarato" es un grupo -0C (=0) -CH (OH) -CH (OH) - C (=0) OH. Un "salicilato" es el grupo 00- .OH Un "succinato" es un grupo -0-C (=0) - (CH2) 2-C00H. Un "citrato" es un grupo -0-C (=0) -CH2-CH (OH) (COOH) CH2-C00H. Un "ascorbato" es el grupo Un "sacarirato" es un sacárido oxidado que tiene dos grupos de ácido carboxilico. El término "aminoácido" como se utiliza en la presente incluye aminoácidos naturales y modificados y por consiguiente incluye los 21 aminoácidos que surgen de manera natural; aquellos aminoácidos frecuentemente modificados post-traduccionalmente in-vivo incluyendo, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos no usuales incluyendo, pero no limitados a, ácido 2-aminoadipico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina y ornitina. Además, el término "aminoácido" incluye ambos D- y L-aminoácidos que están enlazados por medio de un enlace de péptido o un análogo de enlace de péptido a por lo menos un aminoácido de adición como este término se define en la presente. Un "ácido hidroxámico" es un grupo -C (=0) -NH-OH. Un "tiotosilato" es el grupo De manera similar, cada una de las cadenas de alquileno Bi""Bn independientemente tienen una fórmula general III: Rp R(P+l) q —Cp-C(p+1)H CqH- H Fórmula III en donde p es un número entero que es igual a 0 ó g+1 y q es un número entero de g+2 a.g+20. Por consiguiente, cada una de las cadenas de alquileno ??···-?? está comprendido de una pluralidad de átomos de carbono Cp, Cp+1, Cp+2 — , Cq-1 y Cq, sustituido por los grupos Rp, Rp+1, Rp+2 — , Rq-1 y Rq. De preferencia, cada una de las cadenas de alquileno ?—Bn incluye 2-20 átomos de carbono, más de preferencia 2-10, y mucho más de preferencia 2-6 átomos de carbono.
Como se define anteriormente en la presente, en casos donde p es igual a 0, el componente -CpH(Rp)- está ausente de la estructura. En casos donde p es igual a g+1, este puede ser ya sea 1 o 4-11. El número entero q puede ser ya sea 2 o 5-20. Cada uno de los sustituyentes Rp, Rp+1 — Rn puede ser cualquiera de los sustituyentes descritos anteriormente en la presente con respecto a R , R2 y Rg. Por consiguiente, una poliamina lineal preferida de acuerdo con la presente invención incluye dos o más cadenas de alquileno. Las cadenas de alquileno están interrumpidas entre las mismas por un heteroátomo y cada una está conectada a un heteroátomo en un extremo de la misma. De preferencia, cada una de las cadenas de alquileno incluye por lo menos dos átomos de carbono, para permitir la formación de un quelato estable entre los heteroátomos y el ión de cobre. La poliamina lineal delineada en la Fórmula I de preferencia incluye por lo menos un átomo de carbono quiral . Por consiguiente, por lo menos uno de Ci, C2 y Cg en la cadena de alquileno A y/o por lo menos uno de Cp, Cp+1 y Cq en la cadena de alquileno B es quiral. Una poliamina lineal preferida de acuerdo con la presente invención es tetraetilenpentamina . Otros ejemplos representativos de poliaminas lineales preferidas utilizables en el contexto de la presente invención incluye, sin limitación, etilendiamina, dietilentriamina, trietilen-tetramina, trietilendiamina, aminoetiletanolamina, pentaetilenhexamina, trietilentetramina, ?,?' -bis (3-aminopropil) -1, 3-propanodiamina y ?,?'-Bis (2-aminoetil) -1, 3 propanodiamina . En casos donde el agente quelante de poliamina es una poliamina cíclica, la poliamina puede tener una fórmula general IV: Fórmula IV en donde m es un número entero de 1 a 10; n es un número entero de 0 a 20; X y Z son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre y un grupo -NH; ?? y Yn son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de un átomo de oxígeno, un átomo de azufre y un grupo -NH; A es una cadena de alquileno que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono sustituidos y/o no sustituidos; Bi y Bn son cada uno independientemente una cadena de alquileno que tiene entre 1 y 20 átomos de carbono sustituidos y/o no sustituidos; y D es un grupo de puente que tiene una fórmula general V: u- -v Fórmula V mientras que U y V son cada una independientemente. seleccionados del grupo que consiste de cadena de hidrocarburo sustituida y cadena de hidrocarburo no sustituida; y W es seleccionada del grupo que consiste de amida, éter, éster, disulfuro, tioéter, tioéster, imina y alqueno, con la condición de que por lo menos uno de X, Z , Yi y Yn sea un grupo -NH y por lo menos uno de los átomos de carbono en las cadenas de alquileno esté sustituido por un grupo amina . Opcionalmente, la poliamina cíclica tiene una de las fórmulas generales VI-X: X Am (Y,B,)i— (YnBn)n—ZH Fórmula VI -(Y,B,),— (YnBn)n Fórmula VII X Am (YiB,)," -(YnBn)n— ZH Fórmula VHI ; T"D~1 HX — Am (Y,B,),- -(YnBn)n~Z Fórmula IX HX — Am (Y,B,)f - -(YnBn)n— -ZH Fórmula X en donde m, n, X, Ylf Yn, Z, ?, B y D son como se describe en lo anterior y además en donde si el grupo de puente D está unido a un extremo a A (Fórmulas VI, VII y X) ; U ó V están unidos a un átomo de carbono en la cadena de alquileno y si D está unido en un extremo a Bl o Bn (Fórmulas VIII, IX y X) , U o V están unidos a un átomo de carbono en la cadena de alquileno . Por consiguiente, como una poliamina cíclica preferida de acuerdo con la presente invención incluye dos o más cadenas de alquileno, A, Bi""Bn, como es detallada anteriormente en la presente con respecto a la poliamina lineal. Las cadenas de alquileno pueden formar una estructura cíclica al ser conectadas, por medio del grupo de puente D, entre los extremos de las mismas, específicamente entre los heteroátomos X y Z (Fórmula IV) . Opcionalmente, las cadenas de alquileno pueden formar una estructura cíclica conformacionalmente restringida al ser conectada, por la vía del grupo de puente D, entre las mismas (Fórmula X) . Además, opcionalmente una estructura cíclica conformacionalmente restringida puede ser formada al conectar una cadena de alquileno a un heteroátomo terminal (X o Z, Fórmulas VI-IX) . Como es descrito anteriormente en la presente, en casos donde la estructura cíclica está formada por la conexión de una cadena de alquileno a un heteroátomo terminal, como es representado en las Fórmulas VI-IX, el grupo de puente D conecta un heteroátomo terminal, específicamente X o Z, y un átomo de carbono en las cadenas de alquileno A y Bi""Bn. Este átomo de carbono puede ser cualquiera de Ci, C2, Cg, Cp, Cp+1 y Cq descrito anteriormente en la presente. Como es descrito adicionalmente antes en la presente, la estructura cíclica se forma por el grupo de puente D, que conecta dos componentes en la estructura. El grupo de puente D tiene una fórmula general U-W-V, donde cada uno de U y V es una cadena de hidrocarburos sustituida o no sustituida. Como se utiliza en la presente, la frase "cadena de hidrocarburo" describe una pluralidad de átomos de carbono que están covalentemente unidos entre sí y están sustituidos, inter alia, por dos átomos de hidrógeno . La cadena de hidrocarburo puede ser saturada, insaturada, ramificada o no ramificada y por lo tanto puede incluir uno o más grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo y arilo y combinaciones de los mismos. La longitud de las cadenas de hidrocarburo, específicamente el número de átomos de carbono en las cadenas, de preferencia se determina por la estructura de la poliamina cíclica, tal que por una parte, la tensión de anillo de la estructura cíclica formada sería minimizada y por otra parte, una quelación eficiente con el ión cobre seria alcanzada. Cuando la cadena de hidrocarburo está sustituida, los sustituyentes pueden ser cualquiera o combinaciones de los sustituyentes descritos anteriormente en la presente con respecto a ¾, R2 y Rg en la poliamina lineal. Las dos cadenas de hidrocarburo están conectadas entre las mismas por el grupo W, que puede ser amida, éter, éster, disulfuro, tioéter, tioéster, imina y alqueno. Como se utiliza en la presente, el término "éter" es un grupo -0-. El término "éster" es un grupo -C(=0)-0-. Un "disulfuro" es un grupo -S-S-. Un "tioéter" es un grupo -S-. Un "tioéster" es un grupo -C(=0)-S-. Una "imina" es un grupo -C(=NH)-. Un "alqueno" es un grupo -CH=CH-. El grupo de puente D típicamente se forma al conectar derivados reactivos de las cadenas de hidrocarburo U y V, para producir un enlace entre las mismas ( ) , por la vía de técnicas bien conocidas, como es descrito, por ejemplo, en la patente norteamericana No. 5,811,392. Como se describe anteriormente con respecto a la poliamina lineal, la poliamina cíclica debe incluir por lo menos un grupo amina, de preferencia por lo menos dos grupos •amina y más de preferencia por lo menos cuatro grupos amina, para formar un quelato de cobre estable. Una poliamina cíclica preferida de acuerdo con la presente invención es ciclam (1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano) . Como es descrito anteriormente en la presente, el agente quelante de poliamina de la presente invención además puede incluir una combinación multimérica de una o más poliaminas lineales y una o más poliamidas cíclicas. Tal agente quelante de poliamina por lo tanto puede estar comprendido de cualquiera de las combinaciones de las poliaminas lineales y cíclicas descritas anteriormente en la presente . De preferencia, tal agente quelante de poliamina tiene una fórmula general XI : {(E.HQ G gtth-ÍCEzHQa-CGzMK Fórmula XI en donde n es un número entero mayor que 1; cada uno de f, g, h, i, j, k, 1, o y t es independientemente un número entero de 0 a 10; cada uno de Ei, E2 y En es independientemente una poliamina lineal, como es descrito anteriormente en la presente; cada uno de ¾, G2 y Gn es independientemente una poliamina cíclica como es descrito anteriormente en la presente; y cada uno de Qi, Qz y Qn es independientemente un enlazador que enlaza entre dos de las poliaminas, con la condición de que por lo menos uno del Qír Q2 y Qn sea un grupo amina y por lo menos uno de la poliamina lineal y la poliamina cíclica tenga por lo menos un grupo de amina libre. Cada uno de Ei, E2 y En en la Fórmula XI representa una poliamina lineal como es descrito en detalle anteriormente en la presente, mientras que cada uno de Gi, G2 y Gn representa una poliamina cíclica como es descrito en detalle anteriormente en la presente. La poliamina descrita en la Fórmula XI puede incluir una o más poliaminas lineales, cada una conectada a otra poliamina lineal o una poliamina cíclica. Cada una de las poliaminas lineales o cíclicas en la Fórmula XI está conectada a otra poliamina por la vía de uno o más enlazadores, representados por Qi, Q2 y Qn en la Fórmula XI. Cada uno de los enlazadores Q±, Q2 y Qn puede ser, por ejemplo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arileno, cicloalquileno, heteroarileno, amina, azo, amida, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, fosfonilo, fosfinilo, fosfonio, cetoéster, carbonilo, tiocarbonilo, éster, éter, tioéter, carbamato, tiocarbamato, urea, tiourea, borato, borano, boroaza, sililo, siloxi y silaza. Como se utiliza en la presente, el término "alquenileno" describe un grupo alquilo que consiste de por lo menos dos átomos de carbono y por lo menos un enlace doble de carbono-carbono .
El término ""alquinileno" describe un grupo alquilo que consiste de por lo menos dos átomos de carbono y por lo menos un enlace triple de carbono-carbono. El término "cicloalquileno" describe un grupo de anillo monociclico o fusionado todo de carbono (es decir, anillos que comparten un par de adyacentes átomos de carbono) en donde uno o más de los anillos no tiene un sistema de electrón pi completamente conjugado. Ejemplos, sin limitación, de grupos cicloalquilo son ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexadieno, cicloheptano, cicloheptatrieno y adamantano. El término "amileno" describe un grupo policiclico de anillo fusionado o monociclico todo de carbono (es decir, anillos que comparten pares adyacentes de átomos de carbono) que tiene un sistema de electrón pi completamente conjugado. Ejemplos, sin limitación, de grupos arilo son fenilo, naftalenilo y antracenilo. El grupo arilo puede ser sustituido o no sustituido. El término "heteroarileno" describe un grupo de anillo monociclico o fusionado (es decir, anillos ' que comparten un par adyacente de átomos) que tiene en el (los) anillo (s) uno o más átomos, tales como, por ejemplo, nitrógeno, oxigeno y azufre y, además, que tienen un sistema de electrón pi ' completamente conjugado. Ejemplos, sin limitación, de grupos heteroarilo incluyen pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina y purina. El grupo heteroarilo puede ser sustituido o no sustituido. Como se usa en el contexto del enlazador de la presente invención, el término "amina" describe un -NR'-, en donde R' puede ser hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heterociclico, como estos términos se definen anteriormente en la presente. Como se usa adicionalmente en el contexto del · enlazador de la presente invención, el término "azo" describe un grupo -N=N-. El término "amida" describe un grupo -C(=0)-NR'-, donde R' es como se define anteriormente en la presente. El término "amonio" describe un grupo -N+HR'-, donde R' es como se define anteriormente en la presente. El término "sulfinilo" describe un grupo -S(=0)-. El término "sulfonilo" describe un grupo -S(=0)2-. El término "sulfonamido" describe un grupo -S (=0) 2_NR' -, con R' es como se define anteriormente en la presente. El término "fosfonilo" describe un grupo -0-P(=0) (0R')-, con R' como se define anteriormente en la presente . El término "fosfinilo" describe un grupo -PR'-, con R' , como se define anteriormente en la presente.
El término "fosfonio" es un -P+R'R", donde R' y R" son como se define anteriormente en la presente. El término "cetoéster" describe un grupo -C (=0) -C (=0) -0-. El término "carbonilo" describe un grupo -C(=0)-. El término "tiocarbonilo" describe un grupo -C(=S)-. El término "carbamato" describe un grupo -OC (=0) -NR' , con R' como se define anteriormente en la presente. El término "tiocarbamato" describe un grupo -0C(=S)-NR-, con R' como se define anteriormente en la presente . El término "urea" describe un grupo -NR' -C (=0) -NR"-, con R y R" como se define anteriormente en la presente. El término "tiourea" describe un grupo -NR' -C (=S) -NR' , con R' y R" como se define anteriormente en la presente. El término "borato" describe un grupo -0-B-(0R)-, con R como se define anteriormente en la presente. El término "borano" describe un grupo -B-R-'-, con R como se define anteriormente en la presente. El término "boraza" describe un grupo -B(NR'R")-, con R' y R" como se define anteriormente en la presente.
El término "sililo" describe un -SiR'R"-, con R' y R" como se definen anteriormente en la presente. El término "siloxi" es un -Si-(OR)2-/ con R como se define anteriormente en la presente. El término "silaza" describe un -Si- (NR' R") 2-, con R' y R", como se define en la presente. Se debe observar que todos los términos descritos anteriormente en la presente en el contexto del enlazador de la presente invención son los mismos como se describe en lo anterior con respecto a los sustituyentes . Sin embargo, en distinción de los grupos sustituyentes, que son conectados a un componente en un extremo del mismo, los grupos enlazadores están conectados a dos componentes en dos sitios de los mismos y por consiguiente, estos términos se han redefinido con respecto al enlazador. Como se ha mencionado anteriormente en la presente, de acuerdo con la modalidad actualmente más preferida de la presente invención, el agente quelante de poliamina es tetraetilenpentamina (????) . Sin embargo, otros agentes quelantes de poliamina preferidos incluye, sin limitación, etilendiamina, dietilentriamina, trietilentetramina, trietilendiamina, aminoetiletanolamina, aminoetilpiperazina, pentaetilenhexamina, trietilentetramina, captopril, penicilamina, ?,?' -bis (3-aminopropil) -1, 3-propanodiamina, ?,?' -Bis (2-aminoetil) -1, 3-propanodiamina, 1, 7-dioxa-4, 10-diazaciclododecano, 1,4,8, ll-tetraazaciclotetradecano-5, 7-diona, 1, 4, 7-triazaciclononano, l-oxa-4, 7, 10-triazaciclo-dodecano, 1, 4, 8, 12-tetraazaciclopentadecano y 1,4,7,10-tetraazaciclododecano . Los agentes quelantes preferidos, listados en lo anterior, son conocidos en su alta afinidad hacia los iones de cobre. Sin embargo, estos agentes quelantes además se caracterizan benéficamente pues su afinidad sustancial también hacia otros metales de transición, como es descrito por Ross y Frant [Ross JW and Frant MS. Chelometric indicators, titration ith the solid-state cupric ion selective electrode. Analytical Chemistry 41:1900, 1969], que es incorporada por referencia como si se expusiera completamente en la presente. Todos los agentes quelantes de poliamina descritos en lo anterior pueden ser ya sea comercialmente obtenidos o se pueden sintetizar usando procedimientos conocidos tal como es descrito, por ejemplo, en: T.W. Greene (ed.), 1999 ("Protective Groups in Organic Synthesis" 3a Edición, John Wiley & Sons, Inc., New York 779 pp) ; o en: R.C. Larock and V.C.H. Wioley, "Comprehensive Organic Transformations - A Guide to Functional Group Preparations", (1999) 2a Edición. Un procedimiento preferido para preparar el quelato de tetraetilenpentamina-cobre (TEPA-Cu) es descrito en PCT/IL03/00062.
El quelato o agente quelante de cobre puede ser proporcionado al · medio de ¦ cultivo de células. Las concentraciones finales de quelato de cobre pueden ser, dependiendo de la aplicación especifica, en las gamas micromolares o milimolares, por ejemplo, dentro de aproximadamente 0.1 uM a aproximadamente 100 mM, de preferencia dentro de aproximadamente 4 uM a aproximadamente 50 mM, más de preferencia dentro de aproximadamente 5 uM a aproximadamente 40 mM. Los métodos descritos en lo anterior para la expansión ex-???? de células de poblaciones de células de tallo hematopoyéticas dan por resultado, inter alia, en una población expandida de células de tallo hematopoyéticas. Asi, además de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan poblaciones expandidas ex-vivo de células de tallo hematopoyéticas, obtenidas mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente en la presente. Las poblaciones expandidas de células de tallo hematopoyéticas de acuerdo con la presente invención comprende una pluralidad de células caracterizadas por 3-20% de las células que son células CD34+ reseleccionables, de los cuales por lo menos 40% de las células son CD34+dim, es decir, caen por debajo de la intensidad media en un análisis FACS, en donde, en las células CD34+ reseleccionables, una mayor parte de las células que son Lin" también son células CD34+dini. En una modalidad, la población de células de tallo hematopoyéticas tiene un solo antecedente genético. En otra modalidad, la población expandida ex-vivo de células de tallo hematopoyéticas comprende por lo menos células N derivadas de un solo donador, en donde N es igual a el número promedio de células CD34+ derivadas de una muestra de células mononucleares hematopoyéticas, multiplicado por 1, 000. La expresión de superficie de la célula de los marcadores CD34 y/o Lin puede ser determinado, por ejemplo, por medio del análisis FACS o las técnicas de manchado inmunohistoquimico . Un potencial de auto renovación de las células de tallo hematopoyéticas se puede determinar in-vitro mediante la formación de colonia a largo plazo (LTC-CFUc) , como se explica adicionalmente en la sección de Ejemplos que sigue . Como se discute en detalle anteriormente en la presente, la expansión ex-vivo de células de tallo hematopoyéticas se puede utilizar venta osamente en varias aplicaciones tales como, por ejemplo, transplante o implante de células hematopoyéticas, inmunoterapia adoptiva y terapia génica. La habilidad para practicar la expansión ex-vivo de células de tallo hematopoyéticas con células mononucleares hematopoyéticas como la fuente de células sustancialmente facilita la utilización de los métodos descritos en lo anterior en estas aplicaciones. Por consiguiente, de acuerdo con otros aspectos de la presente invención se proporciona un método de transplante o implante de células hematopoyéticas . El método de acuerdo con este aspecto de la presente invención se efectúa al (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un donador, (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex~vxvo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, para reducir una expresión y/o actividad de CD38, para expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo, y (c) transplantar o implantar las células de tallo hematopoyéticas asi obtenidas a un recipiente . Como es descrito anteriormente en la presente, se pueden utilizar varios agentes en el contexto de los diferentes aspectos de la presente invención para reducir una expresión y/o actividad de CD38. Asi, en una modalidad particular de este aspecto de la presente invención, el método se efectúa al proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoides y/o Vitamina D, como es descrito anteriormente en la presente. En otra modalidad particular, el método se efectúa al proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización que implican el receptor de ácido retinoico, al receptor de retinoide X y/o el receptor de Vitamina D, como es descrito anteriormente en la presente. En otra modalidad particular de este aspecto de la presente invención, el método se efectúa al proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, para reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización que implican PI 3-quinasa, como, es descrito anteriormente en la presente. En todavía otra modalidad particular de este aspecto de la presente invención, el método se efectúa al proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y con nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o metabolito de análogo de nicotinamida, como es descrito anteriormente en la presente. En otra modalidad particular de este aspecto de la presente invención, el método se efectúa al proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y con un inhibidor de PI 3-quinasa, como és descrito anteriormente en la presente. En otro aspecto de la presente invención, el método de transplante o implante de células hematopoyéticas descrito en lo anterior se efectúa al proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y con uno o más de (los) agente , quelante(s) o quelato(s) de cobre descritos anteriormente en la presente. En cualquiera de los métodos de este aspecto de la presente invención, el donador y el recipiente puede ser un solo _ individuo o diferentes individuos, por ejemplo, individuos alogeneicos o xenogeneicos . Cuando se practica el transplante alogeneico, los regímenes para reducir el rechazo de implante y/o la enfermedad de injerto contra huésped, como es bien conocido en la técnica, deben ser llevados a cabo.
Tales regímenes son actualmente practicados en la terapia humana. La mayoría de regímenes avanzados fueron descritos en las publicaciones por Slavin S. y colaboradores, por ejemplo, J Clin Immunol (2002) 22:64, y J. Hematother Stem Cell Res (2002) 11:265), Gur H. y colaboradores, (Blood (2002) 99:4174), y Martelli MF y colaboradores, (Semin Hematol (2002) 39:48), que son incorporadas en la presente por referencia . Los métodos descritos anteriormente en la presente se pueden utilizar para producir preparaciones de células hematopoyéticas transplantables, tal que de acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona una preparación de células hematopoyéticas transplantables, que comprende una población expandida de células de tallo hematopoyéticas propagadas ex-vivo a partir de células mononucleares hematopoyéticas que comprenden, antes de la expansión, una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, en la presencia de una cantidad efectiva de un agente para reducir la expresión y/o actividad de CD38, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas y un portador farmacéuticamente aceptable. Como es descrito anteriormente en la presente, se encontraron varios agentes para reducir la expresión y/o la actividad de CD38, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas bajo estas condiciones. Por consiguiente, una modalidad particular de este aspecto de la presente invención, el agente descrito en lo anterior es un agente que reduce una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoides y/o Vitamina D, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas. En otra modalidad particular de este aspecto de la presente invención, el agente descrito en lo anterior es un agente que reduce una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a la señalización del receptor de ácido retinoico, receptor de retinoide X y/o receptor de Vitamina D, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo. En todavía otra modalidad particular del este aspecto de la presente invención, el agente descrito en lo anterior es un agente que reduce una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a la señalización de PI 3-quinasa, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo . En todavía otra modalidad particular de este aspecto de la presente invención, el agente descrito en lo anterior comprende una cantidad efectiva de un agente seleccionado del grupo que consiste de nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida y un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida. En todavía otra modalidad particular de este aspecto de la presente invención, el agente descrito en lo anterior comprende una cantidad efectiva de un inhibidor de PI 3-quinasa. De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona una preparación de células hematopoyéticas transplantables, que comprende una población expandida de células de tallo, hematopoyéticas preparadas ex-vivo a partir de células mononucleares hematopoyéticas que comprenden, antes de la expansión, una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, en la presencia de por lo menos un quelato o agente quelante de cobre, como es definido anteriormente en la presente, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas y un portador farmacéuticamente aceptable. Como es discutido adicionalmente antes en la presente, la expansión ex-vivo de células de tallo hematopoyéticas de la presente invención se puede utilizar en la inmunoterapia adoptiva. De manera similar a los métodos de transplante e implementación ematopoyéticos de la presente invención, un método de terapia adoptiva de acuerdo con la presente invención se efectúa al (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas a partir de un recipiente, (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación celular y, al mismo tiempo, con cada uno de los agentes quelantes o quelatos de cobre descritos anteriormente en la presente y/o cada uno de los agentes para reducir la expresión y/o actividad de CD38 descritos anteriormente en la presente, para expandir la población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas, como es detallado anteriormente en la presente; y (c) transplantar las células de tallo hematopoyéticas asi obtenidas al recipiente. Como se detalla adicionalmente enseguida, las células de tallo en general y las células de tallo hematopoyéticas en particular pueden servir para ejercer la terapia génica celular.
La terapia génica como se utiliza en la presente se refiere a la transferencia de material genético (por ejemplo, DNA o R A) de interés a un huésped para tratar o prevenir una enfermedad genética o adquirida o condición o fenotipo. El material genético de interés codifica un producto (por ejemplo, una proteina, polipéptido, péptido, RNA funcional, antisentido) cuya producción in-vivo es deseado. Por ejemplo, el material genético de interés puede codificar una hormona, un receptor, enzima, polipéptido o péptido del valor terapéutico. Para una revisión ver, en general, el texto "Gene Therapy" (Advanced in Pharmacology 40, Academia Press, 1997) . Dos procedimientos básicos para la terapia génica han implicado: (i) la terapia génica ex-vivo o celular; y (ii) la terapia génica in-vivo. Las células de terapia génica ex-vivo se remueven de un paciente, y mientras que son cultivadas son tratadas in-vitro. Generalmente, un gen · de reemplazo funcional se introduce en las células por medio de un vehículo/método de suministro de gen apropiado (transfección, transducción, recombinación homologa, etc.) y un sistema de expresión, como sea necesario y luego las células modificadas se expanden en el cultivo y se regresan al huésped/paciente. Estas células genéticamente reimplantadas se han mostrado que expresan un material genético transfectado in situ.
Por consiguiente, además de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para modificar genéticamente células de tallo con un exógeno. El método, de acuerdo con este aspecto de la presente invención, se efectúa al (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas, (b) proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para la proliferación -celular y, al mismo tiempo, con cada uno de los agentes quelantes o quelatos de cobre descritos anteriormente en la presente y/o cada uno de los agentes para reducir la expresión y/o actividad de CD38 descritos anteriormente en la ¦ presente, para expandir la población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas, como es detallado anteriormente en la presente, y (c) modificar genéticamente las células de tallo hematopoyéticas con el exógeno. En una modalidad preferida, la modificación genética de las células se efectúa mediante un vector, que comprende el exógeno o transgen, este vector que es, por ejemplo, un vector viral o un vector de ácido nucleico. Muchos vectores virales adecuados para el uso en la terapia génica celular son conocidos, ejemplos se proporcionan en seguida en lá presente. De manera similar, una gama de vectores de ácido nucleico se puede usar para transformar genéticamente las células expandidas de la invención, como es descrito adicionalmente enseguida. Por consiguiente, las células expandidas de la presente invención se pueden modificar para expresar un producto génico. Como se utiliza en la presente, la frase "producto génico" se refiere a proteínas, péptidos y moléculas de RNA funcionales. Generalmente, el producto de gen codificado por la molécula de ácido nucleico es el producto de gen deseado para ser suministrado a un sujeto. Ejemplos de tales productos génicos incluyen proteínas, péptidos, glicoproteínas y lipoproteínas normalmente producidos por un órgano del sujeto recipiente. Por ejemplo, los productos génicos que pueden ser suministrados por medio del reemplazo de gen a órganos defectuosos en el páncreas incluyen insulina, amilasa, proteasa, lipasa, tripsinógeno, quimotripsinogeno, carboxipeptidasa, ribonucleasa, desoxiribonucleasa, triacliglicerol lipasa, fosfolipasa A2, elastasa y amilasa; productos génicos normalmente producidos por el hígado incluyen factores de coagulación de la sangre tal como el Factor VIII de coagulación de la sangre y el Factor IX, UDP glucuronil transferasa, ornitina transcarbanoilasa, y las enzimas de citocromo p450, y adenosina desaminasa, para el procesamiento de la adenosina de suero o la endocitosis de lipoproteinas de baja densidad; productos génicos producidos por el .timo incluyen el factor timico de suero, factor humoral timico, trimopoyetina y timosina al; productos génicos producidos por la célula del tracto digestivo incluyen gastrina, secretina, colecistoquinina, somatostatina, serotonina y sustancia P. Alternativamente, el producto génico codificado es uno, que induce la expresión del producto génico deseado por la célula (por ejemplo, el material genético introducido codifica un factor de trascripción, que induce la trascripción del producto génico para ser suministrado al sujeto) . En todavía otra modalidad, el gen recombinante puede proporcionar una proteína heteróloga, por ejemplo, no nativa a la célula en la cual es expresado. Por ejemplo, varios componentes MHC humanos pueden ser proporcionados a células no humanas · para soportar el injerto en un recipiente humano. Alternativamente, el transgen es uno, que inhibe la expresión o acción de un producto génico MHC donador. Una molécula de ácido nucleico introducida en una célula está en una forma adecuada para la expresión en una célula de producto génico codificado por el ácido nucleico. Por consiguiente, la molécula de ácido nucleico incluye las secuencias de codificaciones reguladoras requeridas para la trascripción de un gen (o porción del mismo) y, cuando el producto génico es una proteina o péptido, la traducción de la molécula de ácido génico incluye promotores, promotores y señales de poliadenilación, así como secuencias necesarias para el transporte de una proteína o péptido codificado, por ejemplo, secuencias de señal N-terminal para el transporte de proteínas o péptidos a la superficie de la célula o secreción . Las secuencias de nucleótidos que regulan la expresión de un producto génico (por ejemplo, secuencias de promotor y de incrementador) se seleccionan basados en el tipo de célula en el cual el producto génico va a ser expresado y el nivel deseado de expresión del producto génico. Por ejemplo, un promotor conocido para conferir la expresión específica del tipo de célula de un gen enlazado al promotor puede ser utilizado. Un promotor específico para la expresión de gen de mioblasto puede ser enlazado a un gen de interés para conferir la expresión específica de músculo de ese producto génico. Los elementos reguladores específicos de músculo, que son conocidos en la técnica, incluyen las regiones corriente arriba del gen distrofina (Klamut y colaboradores, (1989) Mol. Cel'l Biol. 9:2396), el gen creatina quinasa (Buskin and Hauschka, (1989) Mol. Cell Biol. 9:2627) y el gen troponina (Mar and Ordahl, (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 85:6404). Los elementos reguladores específicos para otros tipos de células son conocidos en la técnica (por ejemplo, el incrementador de albúmina para la expresión específica de hígado; elementos reguladores de insulina para la expresión específica de célula de isletas pancreáticas, varios elementos reguladores específicos de célula neural, incluyendo distrofina neural, enolasa neural y promotores amieloides A4) . Alternativamente, un elemento regulador, que puede dirigir la expresión constitutiva de un gen en una variedad de diferentes tipos de células, tal como un elemento regulador viral, puede ser utilizado. Ejemplos de promotores virales comúnmente usados para inducir la expresión del gen incluyen aquellos derivados del virus polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus de Simios 40, y LTRs retrovirales . Alternativamente, un elemento regulador, que proporciona expresión inducible de un gen enlazado al mismo, puede ser utilizado. El uso de un elemento regulador inducible (por ejemplo, un promotor inducible) permite la modulación de la producción del producto génico en la célula. Ejemplos de sistemas reguladores inducibles potencialmente útiles para el uso en células eucarióticas incluyen elementos regulados por hormonas (por ejemplo, ver Mader, S. y White, J.H. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5603-5607), elementos regulados por ligandos sintéticos (ver, por ejemplo, Spencer, D.M. y colaboradores, 1993) Science 262:1019-1024) y elementos regulados por radiación ionizante (por ejemplo, ver Manóme, Y. y colaboradores, (1993) Biochemistry 32:10607-10613; Datta, R. y colaboradores, (1992) Pxoc. Nati. Acad. Sci . USA 89:1014-10153). Los sistemas reguladores específicos o inducibles de tejido adicionales, que pueden ser desarrollados, también pueden ser utilizados de acuerdo con la invención. Existe un número de técnicas conocidas en el arte para introducir material genético en una célula que puede ser aplicado para modificar una célula de la invención. En una modalidad, el ácido nucleico está en la forma de una molécula de ácido nucleico desnuda. En esta situación, la molécula de ácido nucleico introducida a una célula a ser modificada consiste solamente del ácido nucleico que codifica el producto génico y los elementos reguladores necesarios . Alternativamente, el ácido nucleico que codifica el producto génico (incluyendo los elementos reguladores necesarios) está contenido dentro de un vector de plásmido. Ejemplos de vectores de expresión de plásmido incluyen CDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman y colaboradores, (1987) EMBO J. 6:187-195). En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico a ser introducida en una célula está contenida dentro de un vector viral. En esta situación, el ácido nucleico que codifica el producto génico se inserta en el genoma viral (o genoma viral parcial) . Los elementos reguladores que dirigen la expresión del producto génico pueden ser incluidos con el ácido nucleico insertado en el genoma viral (es decir, enlazado al gen insertado en el genoma viral) o se pueden proporcionar por el genoma viral mismo. Los ácidos nucleicos simples pueden ser introducidos en células usando la transfeccion mediada por fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, electroporación, transfeccion mediada por liposoma, inyección directa y captación mediada por receptor. El ácido nucleico simple, por ejemplo, DNA, puede ser introducido en las células al formar un precipitado que contiene el ácido nucleico y fosfato de calcio. Por ejemplo, una solución salina regulada con HEPES se puede mezclar con una solución que contiene cloruro de calcio y ácido nucleico para formar un precipitado y el precipitado luego se incuba con las células. Una etapa de choque de glicerol o sulfóxido dimetilo se puede adicionar para incrementar la cantidad de ácido nucleico captado por ciertas células. La transfeccion mediada por CaPO/j- se puede usar para transfectar establemente (o transientemente) las células y no es aplicable a la modificación in-vitro de las células. Los protocolos para la transfeccion mediada por CaP04- se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. y colaboradores, (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sección 9.1 y en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Sambrook y colaboradores. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), Secciones 16.32-16.40 u otros manuales de laboratorio estándares. El ácido nucleico simple se puede introducir en las células al formar una mezcla del ácido nucleico y DEAE-dextrano y al incubar la mezcla con las células. Una etapa de choque de dimetilsulfóxido o cloroquina se puede adicionar para incrementar la cantidad de captación de ácido nucleico. La transfeccion por DEAE-dextrano es solamente aplicable a la modificación in-vitro de las células y se puede usar para introducir DNA transíentemente en las células pero no es preferido para crear . células establemente transíectadas . Así, este método se puede usar para la producción a corto plazo de un producto génico pero no es un método de elección para la producción a largo plazo de un producto génico. Los protocolos para la transfeccion mediada por DEAE-dextrano se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. y colaboradores, (eds.) Greene Publishing Associates (1989), Sección 9.2 y en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Sambrook y colaboradores. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), Secciones 16.41-16.46 u otros manuales de laboratorio estándares.
El ácido nucleico simple también puede ser introducido en células al incubar las células y el ácido nucleico conjuntamente en una solución reguladora apropiada y al someter las células a un impulso eléctrico de alto voltaje. La eficiencia con el cual el ácido nucleico es introducido en las células mediante electroporación es influenciada por la resistencia del campo aplicado, la longitud del impulso eléctrico, la temperatura, la conformación y la concentración del DNA y la composición iónica del medio. La electroporación se puede usar para transfectar establemente (o transientemente) una amplia variedad de tipos de células y si solamente aplicable a la modificación in-vitro de células. Los protocolos para electroporar células se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M. y colaboradores, (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sección 9.3 y en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Sambrook y colaboradores, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) , Secciones 16.54-16.55 u otros manuales de laboratorio estándares. Otro método mediante el cual el ácido nucleico simple se puede introducir en las células incluye la transfección mediada por liposomas (lipofección) . El ácido nucleico se mezcla con una suspensión de liposomas que contienen lípidos catiónicos. El complejo de DNA/liposoma luego se incuba con las células. La transfección mediada por liposoma se puede usar para transfectar establemente (o transientemente) células en cultivo in-vitro. Los protocolos se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Bioloby, Ausubel F.M. y colaboradores, (eds.) Greene Publis ing Associates, (1989), Sección 9.4 y otros manuales de laboratorio estándares. Adicionalmente, el suministro génico in-vivo se ha realizado usando liposoraas. Ver, por ejemplo Nicolau y colaboradores, (1987) Meth. Enz. 149:157-176; Wang and Huang (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7851-7855; Brigham y colaboradores, (1989) Am. -J. Med. Sci. 298:278; y Gould-Fogerite y colaboradores, (1989) Gene 84:429-438. El ácido nucleico simple también se puede introducir en las células al inyectar directamente en ácido nucleico en las células. Para un cultivo de células in-vitro, el DNA puede ser introducido mediante microinyección. Puesto que cada célula es microinyectada individualmente, este procedimiento es muy intensivo de trabajo cuando se modifica grandes números de células. Sin embargo, una situación en donde la microinyección es un método de elección está en la producción de animales transgénicos, discutido en mayor detalle enseguida. En esta situación, el DNA es establemente introducido en un oocito fertilizado y luego se deja desarrollar en un animal. El animal resultante contiene células que llevan el DNA introducido en el oocito. La inyección directa también se ha usado para introducir DNA simple en células in-vivo (ver, por ejemplo, Acsadi y colaboradores, (1991) Nature 332:815-818/ Wolff y colaboradores, (1990) Science 247:1465-1468). Un aparato de suministro (por ejemplo, una "pistola génica") para inyectar DNA en las células in-vivo puede ser utilizado. Tal aparato es comercialmente disponible (por ejemplo de BioRad) . El ácido nucleico simple se puede formar en complejo con un catión, tal como polilisina, que se acopla a un ligando para el receptor de la superficie de la célula que es captado por endocitosis mediada por el receptor (ver, por ejemplo, u, G. y Wu, C.H. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson y colaboradores, (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; y la patente norteamericana No. 5,166,320). En enlace del complejo de ácido nucleico, ligando al receptor facilita la captación del DNA por endocitosis mediada por receptor. Los receptores a los cuales un complejo de DNA-ligando se han dirigido incluye el receptor de transferrina y el receptor asialoglicoproteina. Un complejo de DNA-ligando enlazado a cápsidas de adenovirus que naturalmente rompen los endosomas, para de esta manera liberar el material en el citoplasma se puede usar para evitar la degradación del complejo por los lisosomas intracelulares (ver, por ejemplo Curiel y colaboradores, (1991) Pxoc. Nati. Acad. Sci. USA. 88:8850; Cristiano y colaboradores, (1993) Proc. Nati. Acad. Sel. USA 90:2122-2126) . La captación de DNA mediada por el receptor se puede usar para introducir el DNA en las células ya sea ln-vltro o in-vlvo y, adicionalmente, tiene la característica adicional de que el DNA se puede dirigir selectivamente a un tipo de célula particular mediante el uso de un ligando que enlaza a un receptor selectivamente expresado sobre una célula objetivo de interés. Generalmente, cuando el DNA simple se introduce en las células en cultivo (por ejemplo, mediante una de las técnicas de transfección descritas anteriormente (solamente una pequeña fracción de célula (aproximadamente 1 de cada 105) típicamente integra el DNA transfectado en sus genomas (es decir, el DNA es mantenido en la célula episornaluiente) . Así, con el fin de identificar células, que han captado DNA exógeno, es ventajoso transfectar el ácido nucleico que codifica el marcador seleccionable en la célula junto con el (los) ácido (s) nucleico de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos, que confieren resistencia a fármacos tal como G418, higromicina y metotrexato . Los marcadores seleccionables se pueden introducir en el mismo plásmido como el (los) gen (es) de interés o se pueden introducir en un plásmido separado. Un procedimiento preferido para introducir ácido nucleico que codifica un producto génico en una célula es mediante el uso de un vector viral que contiene ácido nucleico, por ejemplo un cDNA, que codifica el producto génico. La infección de células con un vector viral tiene la ventaja de que una proporción grande de células reciben el ácido nucleico que puede evitar la necesidad para la selección de las células que han recibido el ácido nucleico. Adicionalmente, ' las moléculas codificadas dentro del vector viral, por ejemplo, un cDNA contenido en el vector viral, son expresadas eficientemente en células que han captado el ácido nucleico de vector viral y los sistemas de vector viral pueden ser usados ya sea in-vitro o in-vivo. Los retrovirus defectivos son bien caracterizados para el uso en la transferencia génica para propósitos de terapia génica (para revisión ver Millar, A.D. (1990) Blood 76:271) . Un retrovirus recombinante se puede construir usando un ácido nucleico que codifica un producto génico de interés insertado en el genoma retroviral . Adicionalmente, porciones del genoma retroviral se pueden remover para transformar la replicación de virus defectivo. El retrovirus defectivo de replicación luego se empaca en viriones, que pueden ser usados para infectar una célula objetivo a través del uso de un virus ayudante mediante técnicas estándares. Los protocolos para producir retrovirus recombinante y para infectar células in-vitro o in-vivo con tales virus se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. y colaboradores (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio estándares. Ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLJ, ZIP, pWE y PEM, que son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Ejemplos de lineas de virus de empaque adecuados incluyen ¾.crip, ¥crip, ?2 y Tam. Los retrovirus se han usado para introducir una variedad de genes en muchos tipos diferentes de células, incluyendo células epiteliales, células endoteliales, linfocitos, mioblastos, hepatocitos, células de médula ósea, in-vitro y/o in-vivo (ver, por ejemplo Eglitis y colaboradores (1985) Science 230; 1495-1398; Danosand Mulligan (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:3014-3018); Armentano y colaboradores (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber y colaboradores (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Feri y colaboradores (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury y colaboradores (1991) Sciende 254:1802-1805; van Beusechem y colaboradores (1992) Proc. Nati. Acad. Sci USA 89:7640-7644; Kay y colaboradores (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai y colaboradores (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu y colaboradores (1993) J. Immunol . 150:4104:4115; patente norteamericana No. 4,868,116; patente norteamericana No. 4,980,286; solicitud de PCR WO 89/07136; solicitud de PCR WO 89/02468; solicitud de PCT O 89/05345; y la solicitud de PCR WO 92/07573). Los vectores retrovirales requieren división de la célula objetivo en orden para el genoma retroviral (y el ácido nucleico extraño insertado en éste) para ser integrado en el genoma del huésped para introducir establemente ácido nucleico en la célula. Asi, puede ser necesario estimular la replicacion de la célula objetivo. El genoma de un adenovirus puede ser manipulado de tal manera que codifica y expresa un producto génico de interés parece inactivado en términos de su habilidad para replicarse en un ciclo de vida viral litico normal. Ver por ejemplo, Berkner y colaboradores (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld y colaboradores (1991) Science 252:431-434; y Rosenfeld y colaboradores (1992) Cell 68:143-155. Los vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 di324 u otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7 etc.) son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Los adenovirus recombinantes son ventajosos en que no requieren dividir las células para ser vehículos de suministro de genes efectivos y se pueden usar para infectar una amplia variedad de tipos de células, incluyendo el epitelio de las vías aéreas (Rosenfeld y colaboradores (1992) cited supra) , células endoteliales (Lemarchand y colaboradores (1992) Proc. Nati. Acad. Sel. USA 89:6482-6486), hepatocitos (Herz and Gerard (1993) Proc.
Nati. Acad. Sci. USA 90:2812-2816) y células de músculo (Quantin y colaboradores (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:2581-2584) . Adicionalmente, el DNA adenoviral introducido (el DNA está contenido en el mismo) no es integrado en el genoma de una célula hospedera sino permanece episomal, evitando de esta manera los problemas potenciales que pueden ocurrir como un resultado de la mutagénesis insercional en situaciones donde el DNA introducido llegar a ser integrado en el genoma del huésped (por e emplo, DNA retro iral) . Además, la capacidad portadora del genoma adenoviral para el DNA extraño más grande (hasta 8 kilobases) con relación a los otros vectores de suministro de gen (Berkner y colaboradores, cited supra; Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Viril 57:267). La mayoría de los vectores adenovirales defectivos de replicación actualmente en uso son suprimidos para todas o partes de los genes virales El y E3 pero retienen tanto como 80% del material genético adenoviral. El virus adeno-asociado (AAV) es un virus defectivo que surge de manera natural que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un virus herpes, o como un virus ayudante para la replicación eficiente y un círculo de vida productivo. (Para una revisión verMuziczka y colaoradores Curr. Tropics In Micro. And Immunol. (1992) 158:97-129). Este también es uno de los cuantos virus que pueden integrar sus DNA en células no divisorias, y exhiben alta frecuencia de integración estables (ver, por ejemplo Flotte y colaboradores (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski y colaboradores (1989) J. Virol. 63:3822-3828; y McLaughlin y colaboradores 81989) J. Virol. 7:349-356; Samulski y colaboradores (1989) J. Virol. 63 : 3822-3828 ; ' y McLaughlin y colaboradores (1989) J. Virol. 62:1963-1973) . Los vectores que contienen tan pocas como 300 pares de bases de AAV pueden ser empacados y pueden integrarse. El espacio para el DNA exógeno está limitado a aproximadamente 4.5 kb. Un vector AAV tal como aquel descrito en Tratschin y colaboradores (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 se puede usar para introducir DNA en las células. Una variedad de ácidos nucleicos se han introducidos en diferentes tipos de células usando vectores AAV (ver por ejemplo Hermonat y colaboradores (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin y colaboradores (1985) Mol. Cell Biol. 4:2072-2081; Wondisford y colaboradores 81988) Mol. Endocrinol 2:32-39: Tratschin y colaboradores (1984) J. Virol. 51:611-619; y Flotte y colaboradores (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790) . La eficacia de un sistema de vector de expresión particular y método para introducir ácido nucleico en unas células se puede estimar mediante los procedimientos estándares usados rutinariamente en la técnica. Por ejemplo, el DNA introducido en una célula puede ser detectado mediante una técnica de hibridación de filtro (por ejemplo manchado de Southern) y el RNA producido mediante la transcripción del DNA introducido puede ser detectado, por ejemplo, mediante el manchado de Northern, protección de RNasa o la reacción en cadena de transcriptasa-polimerasa inversa (RT-PCR) . El producto génico puede ser detectado mediante un ensayo apropiado, por ejemplo, mediante la detección inmunológica de una proteina producida, tal como con un anticuerpo especifico, o mediante un. ensayo funcional para detectar una actividad funcional del producto génico, tal como un ensayo enzimático. Si el producto génico de interés, va a ser expresado por una célula que no es fácilmente analizable, un sistema de expresión primero puede ser optimizado usando un gen reportador enlazado a los elementos reguladores y el vector puede ser utilizado. El gen reportador codifica un producto génico, que es fácilmente detectable y, asi, se puede usar para evaluar la eficacia del sistema. Los genes reportadores estándares usados en la técnica incluyen genes que codifican ß-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, luciferasa y hormona de crecimiento humana. Cuando el método usado para introducir ácido nucleico en una población de células resulta en la modificación de una proporción grande de las células y expresión eficiente en el producto génico por las células (por ejemplo, como es frecuentemente el caso cuando se usa un vector de expresión viral), la población modificada de células se puede usar sin aislamiento o subclonación adicional de células individuales dentro de la población. Esto es, puede haber suficiente producción del producto génico mediante la población de células tal que no se necesita el aislamiento de células adicional. Alternativamente, puede ser deseable cultivar una población homogénea de células idénticamente modificadas a partir de una sola célula modificada para aislar células, que eficientemente expresan el producto génico. Tal población de células uniformes puede ser preparada al aislar una sola célula modificada al limitar la clonación de dilución seguido por la expansión de la célula individual en el cultivo de una población clonal de células mediante técnicas estándares. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, en cada uno de los métodos descritos anteriormente en la presente, la provisión de las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones para la proliferación de células ex-vivo se efectúa al proporcionar las células con nutrientes y con citoquinas. De preferencia, las citoquinas son citoquinas de acción temprana, tales como, pero no limitadas a, factor de célula de tallo, ligando FLT3, interleucina-1, interleucina-2, interleucina-3, interleucina- 6, interleucina-10, interleucina-12, factor de necrosis tumoral y trombopoyetina. Será apreciado que en este respecto que citoquinas novedosas son descubiertas continuamente, algunas de las cuales pueden encontrar usos en los métodos de expansión celular de la presente invención. También se pueden utilizar citoquinas de acción tardia. Estas incluyen, por ejemplo, el factor de estimulación de colonia de granulocitos, factor de estimulación de colonia de granulocitos/iacrófagos, eritropoyetina, FGF, EGF, NGF, VEGF, LIF, factor de crecimiento de Hepatocito y factor de estimulación de la colonia de macrófago. La habilidad de los agentes de la presente invención para inhibir la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas presentes en células mononucleares hematopoyéticas se puede utilizar adicionalmente en aplicaciones técnicas tal como la recolección de células y el cultivo de células. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una bolsa de recolección/cultivo de células de tallo hematopoyéticas. La bolsa de recolección/cultivo de células de la presente invención es complementada con una cantidad efectiva de un antagonista del receptor de ácido retinoico, un. antagonista al receptor de retinoide X y/o un antagonista de receptor de Vitamina D,, que sustancialmente inhibe la diferenciación celular de una fracción de células de tallo hematopoyéticas de células mononucleares hematopoyéticas que comprende una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitores hematopoyéticas. Alternativamente, la bolsa de recolección/cultivo de células de tallo hematopoyéticas de la presente invención se complementa con una cantidad efectiva de nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida. Todavía alternativamente, la bolsa de recolección/cultivo de células de tallo hematopoyéticas de la presente invención es complementada con una cantidad efectiva de un' inhibidor de PI 3-quinasa. Además alternativamente, la bolsa de recolección/cultivo de células de tallo hematopoyéticas de la presente invención es complementada con una cantidad efectiva de uno o más agentes quelantes o quelatos de cobre. De. acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un ensayo para determinar si una molécula/agente especifico, por ejemplo, un antagonista del receptor de ácido retinoico, un antagonista del receptor de retinoide X, un antagonista del receptor de Vitamina D, un inhibidor de CD38, un inhibidor de PI 3-quinasa, un agente quelante de cobre o un quelato de cobre, es un agente efectivo para expandir una población de células de tallo hematopoyéticas que están presentes en una fracción de células mononucleares hematopoyéticas .
El ensayo, de acuerdo con este aspecto de la presente invención, se realiza al cultivar células mononucleares ematopoyéticas que comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas en la presencia del agente/molécula probada y la inspección de la expansión de las células de tallo hematopoyéticas a través del tiempo, por ejemplo, unas cuantas semanas a unos cuantos meses . Si ocurre la expansión incrementada y diferenciación disminuida, como es comparado con las células no tratadas, el agente/molécula probada es un agente de expansión de células de tallo hematopoyéticas efectivo . De preferencia, el cultivo de las células mononucleares hematopoyéticas que realiza en la presencia de una- cantidad efectiva de citoquina, de preferencia, una citoquina de acción temprana o una combinación de tales citoquinas, por ejemplo, trombopoyetina (TPO) , interleuquina-6 (IL-6) , un ligando FLT-3 y un factor de células de tallo (SCF) . Este ensayo se puede utilizar, por un experto ordinario en la técnica, para determinar, por ejemplo, cual de los antagonistas, inhibidores o agentes quelantes o quelatos de cobre listados en lo anterior es más eficiente para el propósito de ' implementar los diversos métodos de preparaciones de la presente invención descritos anteriormente en la presente. El ensayo se puede utilizar adicionalmente para determinar las concentraciones más efectivas y el tiempo de exposición para obtener resultados óptimos con células mononucleares hematopoyéticas de diferentes orígenes. En cada uno de los aspectos de la presente invención descritos anteriormente en la presente, las células mononucleares hematopoyéticas se pueden obtener a partir de cualquier organismo multicelular incluyendo tanto animales como plantas. De preferencia, las células mononucleares hematopoyéticas se obtienen de la médula ósea (Ro ley SD y colabordores (1998) Bone Marrow Transplant 21:1253), la sangre periférica (Koizumi K, (2000) Bone Marrow Transplant 26:787), el. hígado (Petersen Be y colaboradores (1998) Hepatology 27:433) y la sangre del cordón umbilical neonatal. Objetos adicionales, ventajas y características novedosas de la presente invención llegarán a ser evidentes para un experto ordinario en la técnica en el examen de los siguientes ejemplos, que no se proponen para ser limitativos. Adicionalmente, cada una de las diversas modalidades y aspectos de la presente invención, como son delineados anteriormente en la presente y como es reivindicado en la sección de reivindicaciones enseguida encuentra soporte experimental en los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS La referencia ahora se hace en los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención en un aspecto no limitativo. EJEMPLO 1 EL EFECTO DE UN AGENTE QELANTE DE COBBE SOBRE LA EXPANSION EX-VIVO DE CELULAS DE TALLO EMATOPOYETICAS DE UN CULTIVO DE CÉLULAS MONONUCLEAKES Procedimientos Experimentales Recolección y procesamiento de la muestra: Se obtuvieron muestras de la sangre del cordón umbilical después de un suministro de plazo completo normal y se congelaron dentro de 24 horas de postparto. Las células de la sangre se congelaron en solución reguladora de Dextrano y se incubaron durante 15 horas en MEM (Biological Industries, Israel) complementado con suero de ternero fetal al 10% (FCS; Biological Industries) . Las células luego se colocaron en capas sobre Ficoll-Hypaque (densidad 1.077 gramos/mi; Sigma) y se centrifugaron a 400 g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células mononucleares en la capa interfacial luego se recolectaron, se lavaron tres veces en solución salina regulada con fosfato (PBS; Biological Industries), y se resuspendieron en PBS que contiene albúmina de suero humano al 0.5% (HSA) . Las células luego se dividieron en dos fracciones, la primera que es la fracción de células mononucleares (M C) y la segunda fracción se usó para purificar las células CD34* mediante separación inmuno-magnética usando el ' "kit de aislamiento de células progenitoras CD34+ MiniMACS") de acuerdo con la recomendaciones del fabricante. La pureza de la célula CD34+ obtenidas varió entre 95% y 98%, basado en la evaluación de Citometria de Flujo. Expansión ex-vivo de células de tallo hematopoyéticas: Las células Mononucleares (MNC) obtenidas como es descrito anteriormente en la presente, se colocaron en agrupaciones de células Costar de 24 cavidades (Corning Inc., Corning, NY) o se sembraron en Bolsas de Cultivo (American Fluoroseal Corp.), con el medio esencial alfa mimino (a-MEM) complementado con suero de bovino fetal al 10% (FBS, Biological Industries) , a una concentración de aproximadamente 106 células/ml. Las células CD34+ purificadas se colocaron de manera similar o e sembraron en las Bolsas de Cultivo, a una concentración de aproximadamente 104 células/ml. Los medios se complementaron con el agente quelante de tetraetilpentamina (TEPA) (obtenido de Sigma) y/o con las siguientes citoquinas recombinantes humanas (todas obtenidas de Perpo Tech, Inc., Rocky Hill, NH) ; Trombopoyetina (TPO) , 50 ng/ml; interleucina 6 (IL-6) , 50 ng/ml; ligando FLT-3, 50 ng/ml y un factor de células de tallo SCF 50 ng/ml; ocasionalmente SCF se reemplazó por IL-3, 20 ng/ml. Todos Los cultivos se incubaron a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5% en aire con humedad extra. En intervalos de cada semana, los cultivos de células se semidespoblaron y se complementaron con el medio fresco que contiene citoquinas . Después de diferentes periodos de incubación," las células se recolectaron, se mancharon con azul de tripano y se enumeraron. Estimación morfológica: La caracterización morfológica de las poblaciones de cultivos resultante se realizaron sobre alícuotas de células depositadas en platinas de vidrio por medio de cistopina (Citocentrifuge, Shandon, Runcorn, UK) . Las células de fijaron, se mancharon con la mancha May-Grunwald/Giemsa y se examinaron microscópicamente. Análisis del antígeno de superficie: Las células se recolectaron, se lavaron con una solución de PBS que contiene albúmina de suero bovino al 1% (BSA) y azida de sodio al 0.1% (Sigma) , y se mancharon a 4°C durante 60 minutos con isotiocianato de fluoresceína o anticuerpos conjugados con ficoeritrina (todos de Immunoquality products, The Netherlands) . Las células luego se lavaron con la misma solución reguladora y se analizaron mediante el calibre FACS o los citómetros de flujo Facstarplus. Las células se pasaron a una porción de 1000 células/segundo, usando solución salina como el fluido protector. Un haz de láser de argón de 488 nm sirvió como la fuente de luz para la excitación. La emisión de diez mil células se midió usando la amplificación logarítmica y se analizó usando el software CellQuest. Determinación de células CD34+ y subconjuntos : La expresión de superficie de CD34+ sobre cultivos a corto y largo plazo inició ya sea con células CD34+ purificadas o la fracción MNC completa se determinó como sigue: las células CD34+ se reseleccionaron positivamente (kit Miltenyi) y se contaron. La pureza se confirmó mediante el FACS subsecuente y el análisis de morfología de células, como es descrito anteriormente en la presente. Subconjuntos de células CD34+ reseleccionadas se mancharon para la siguiente combinación de antígenos : CD34PE/CD38FITC y CD34PE/38-, 33-, 14-, 15-, 3, 4, 61, 19 (Lin) FITC. Cálculos de población de células: Los resultados del análisis FACS se dan como valores de porcentaje de células. Números absolutos de subconjuntos se calculan a partir del número absoluto de células CD34+. La determinación de los niveles de línea de base de las células CD34+/CD38- y CD34+/Lin~ se condujo como sigue: Las células CD34+ se purificaron a partir de 3 unidades de sangre de cordón descongeladas y se mancharon para los marcadores anteriores. El promedio de estos experimentos se consideró como el valor de línea de base.
Los conteos de células totales, números de células CD34+ y subconjuntos, y números CFU se presentan como números acumulativos, con la suposición de que los cultivos no se han pasado; es decir, el número de células por mi se multiplicó por el número de pasajes realizados. Análisis de la habilidad de la Unidad de Formación de Colonias (CFU) . Las células se clonaron en el medio que contiene metilcelulosa, semisólido complementado con 2 IU/ml de eritoproyetina (Eprex, Cilag AG Int., Switzerland) , el factor de célula de tallo e IL-3, ambos a 20 ng/ml, y G-CSF y GM-CSF, ambos a 10 ng/ml (todos de Perpo Tech) . Los cultivos se incubaron durante 14 días a 37 °C, CC½ al 5% en una atmósfera humidificada. Determinación de los valores de LTC-CFUc: La habilidad de los cultivos para mantener auto-renovación se midió mediante la determinación del contenido de células de unidad de formación de colonia en los cultivos a . largo y largo plazo es prolongado (LTC-CFUc) como es descrito en las referencias anteriormente en la presente. Resultados Experimentales Células mononucleares (MNC) se sembraron en bolsas de cultivo y se proporcionaron con nutrientes y citoquinas (50 ng/ml FLt3, 11-6, TPO y SCF) como es descrito en lo anterior. Los cultivos de MNC ya sea que se trataron o no se trataron (controles no tratados) con varias concentraciones (5-10 uM) de agente quelante de TEPA. Los cultivos de M C tratados se complementaron con TEPA por solamente las primeras tres semanas y desde la semana tres hacia delante se cubrieron con el medio libre de agente quelante. Los cultivos de CE34+ prepurificado no se complementaron con TPA y sirvieron como controles positivos. Los cultivos se analizaron cada semana durante un periodo de 12 semanas para el número de células, células CFUc, CD34+ y CD34+CD38-. Con el fin de determinar precisamente el contenido de células CD34+, las células CD34+ se reseleccionaron cada semana y se enumeraron a partir de cada uno de los grupos experimentales (cultivos de MNC tratados y no tratados) y el control positivo (cultivos de CD34+) . Los resultados, ilustrados en las Figuras la—b, 2 y 3, muestran que la adición del agente quelante de TEPA a los cultivos de MNC no purificados, sustancialmente y progresivamente incrementó el número de células CD34+, células formadoras de colonia CD34+ y células CD34+CD38~, durante un periodo de 12 semanas. Asi, en los cultivos de MNC tratados con TEPA, el número acumulativo de células CD34+ se incrementó desde un nivel no detectable por arriba de 8x107 células/ml, después de 2 y 12 semanas, respectivamente (Figuras 2a-b) ; el número acumulativo de células CD34+CD38~ se incrementó desde un nivel no detectable a 2.5xl07 células/ml, después de 2 y 12 semanas, respectivamente (Figura 2) ; y el número de CFUs de CD34+ se incrementó de un nivel no detectable a 3.2 xlO7 células/ml después de 2 y 10 semanas, respectivamente (Figura 3) . Por otra parte, cuando no se adicionó ???? a los cultivos de MNC (controles no tratados) nada de expansión significante de las células de tallo y progenitoras se midió por todo el periodo de 12 semanas. Además, las densidades de células de tallo progenitoras en los cultivos de MNC tratados con TEPA, ya sea que igualaron o sobrepasaron las densidad de las células de tallo y progenitoras en los cultivos de células CD34+ prepurificados (no tratados con TEPA, controles positivos) . El análisis morfológico en las células derivadas de cultivos MNC a largo plazo y tratados con TEPA, reveló una alta proporción de células no diferenciadas, mientras que la mayoría de las células derivadas de los cultivos a largo plazo y MNC no tratados con TPA, fueron completamente diferenciadas . Los resultados descritos en este Ejemplo claramente muestran que las células hematopoyéticas de tallo y progenitoras pueden ser sustancialmente expandidas ex-vivo, continuamente durante un período de por lo menos 12 semanas, en un cultivo de células de sangre mezcladas (fracción mononuclear) , sin purificación media de las células CD34+. Los datos también muestran que este efecto resultó de complementar el medio de cultivo de células con el agente quelante de TPA, solamente durante las primeras tres semanas de cultivo . Estos resultados indican que los cultivos de células MNC a corto plazo complementados con TEPA además de las citoquinas, permitió la expansión tremenda de las células CD34+ y las células progenítoras de tallo/tempranas (CD34+38~) como es comparado con la expansión mínima de estas células obtenidas en cultivo MNC tratado solamente con citoquinas . Los experimentos de comparación demostraron que la expansión de las células CD34+ y su ' subconjunto de células CD34+CD38-continúan ocurriendo en los cultivos a largo plazo prolongados y es mucho más alto, como es comparado con aquella obtenida de cultivos iniciados con células CD34+ altamente purificadas. Por lo tanto, los resultados pueden sugerir que el tratamiento a corto plazo de MNC con TEPA aumentan en potencia los cultivos de MNC y una manera que permite la expansión más alta de células con el potencial de auto-renovación prolongado. Los resultados también pueden sugerir que además del efecto regulador sobre las células CD34+ y sus conjuntos tempranos, el agente quelante también puede permitir la expansión ex-vivo de un subconjunto pequeño de células que no son copurificadas con la fracción de células CD34+. Este subconjunto de células, que es probablemente de naturaleza CD34-, puede soportar la expansión superior de las células CD34+ y sus subconj untos durante los cultivos a largo plazo prolongado . Por consiguiente, este Ejemplo ilustra una expansión ex-vivo sustancial de células de tallo y progenitoras en un cultivo de células mononucleares mezcladas. Este procedimiento novedoso evita la necesidad del enriquecimiento laborioso y costoso de células de tallo antes del inicio de los cultivos, que es actualmente usado en la técnica. Por consiguiente, el uso de un agente quelanté de cobre tal como TEPA, puede sustancialmente simplificar, reducir el costo y mejorar la eficiencia de los procedimientos para una expansión ex-vivo de células de tallo y/o progenitoras. EJEMPLO 2 EL EFECTO DE UN QUELATO DE COBRE SOBRE LA EXPANSION EX-VIVO DE CELULAS DE TALLO HEMATOPOYETICAS DE UN CULTIVO DE CELULAS MONONUCLEARES. El quelato de cobre-TEPA se preparó como es descrito, por ejemplo, en PCT/IL03/00062. Células mononucleares (MNC) se sembraron en bolsas de cultivo y se proporcionaron con nutrientes citoquinas como es descrito en el Ejemplo 1 anterior. Los cultivos de células mononucleares ya sea que estuvieron sin tratar (control) o tratadas con el quelato de Cu-TEPA. Los cultivos de MNC tratados se complementaron con el quelato de cobre-TPA por las primeras tres semanas y desde la semana tres hacia delante se cubrieron con el medio libre de agente quelante. Todos los cultivos se analizaron ocho semanas después de un periodo de 8 semanas. Los resultados, presentados en la Tabla 1 enseguida, muestran que la adición del quelato de Cobre-TEPA a los cultivos MNC marcaron incrementadamente el número de células CD34+, la proporción de células CD34+ y el número de células CD34+CD38-, después de un periodo de incubación de ocho semanas. Asi, el número acumulativo de células CD34+ por bolsa de cultivo después de la inoculación fue de 2.56xl06, 12.37xl06 o 32.85xl06, en los cultivos no tratados (citoquinas solamente) tratado con 50 uM de Cobre-TEPA y cultivos tratados con 100 uM de Cobre-TEPA, respectivamente. El número acumulativo de células CD34+CD38- se incrementó de 2.1xl05 en el cultivo de control no tratado (citoquinas solamente) a 6.1xl05 en el cultivo tratado con Cobre-TEPA (100 uM) . Tabla 1 Tratamiento Número de Porción de Número de células CD34+ células CD34+ células (xlO4) (%) CD34/38- (xlO4) Control 256.0 0.2 21 Quelato de Cu- 1237.3 1.4 - TEPA 50 uM Quelato Cu- 3285.3 1.2 61 Los resultados descritos en este ejemplo demuestran que las células de tallo hematopoyéticas pueden ser sustancialmente expandidas ex-vivo, durante por lo menos un periodo de ocho semanas, en un cultivo de células de sangre mononucleares, sin purificación previa de las células de CD34+, en la presencia de un quelato de cobre tal como Cobre- TEPA. EJEMPLO 3 EL EFECTO DE UN ANTAGONISTA RAR SOBRE LA EXPANSION EX-VIVO DE LAS CELULAS DE TALLO HEMATOPOYETICAS DE UN CULTIVO DE CELULAS MONONUCLEARES Materiales y Métodos Experimentales El antagonista del receptor de ácido retinoico (RAR) de alta afinidad, ácido 4- [ [4- (4-etilfenil) -2, 2- dimetil- (2H) -tiocomen-6-il) ]benzoico, (AGN 194310) se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito en PCT/IL03/00064. La fracción de células mononucleares se recolectó y se purificó como es descrito en lo anterior en el Ejemplo 1. Los cultivos de M C se prepararon y se mantuvieron como es descrito en lo anterior. El antagonista RAR AGN 194310 se adicionó a los cultivos probados a concentraciones que varían de lxlO3 - lxl0_11M [o 410 ig/l a 4.1xl0"5 g/l] . El antagonista se adicionó durante un período limitado, predeterminado por hasta tres semanas o continuamente durante el periodo de cultivo completo. Los resultados, presentados en la Tabla 2, muestran que las fracciones de células mononucleares cultivadas en la presencia de antagonistas RAR y citoquinas reveló un incremento significante . en el número de las células CD34+Lin- (78%, 24%) como es cuantificado mediante el análisis FACS a partir de una fracción de células CD34+ altamente purificada, reseleccionada, como es comparado con las fracciones de MNC no tratadas de control, 2 y 5 semanas (respectivamente) , después del sembrado inicial. Las células MNC respondieron a los antagonistas RAR y expandieron una población no diferenciada, sin purificación previa de la población de CD34+. El tratamiento con el antagonista RAR fue suficiente para estimular la expansión especifica del compartimiento de células de tallo/progenitoras en 5 semanas después del sembrado. Mientras que las MNCs no tratadas de control no tuvieron población de CD34+ detectable, los cultivos tratados con antagonistas RAR revelaron números significantes de células de CD34+, y aquellas que tuvieron marcador de linaje deficiente. Asi, cualquiera de los factores elaborados por las células de cultivo MNCs que suprime la supervivencia de las células CD34+ en las muestras de control son insuficientes para remontar la señal proporcionada por el antagonista RAR para elaborar este compartimiento.
Tabla 2 apreciado que ciertas características invención, que son, por claridad, descritas en el contexto de modalidades separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una sola modalidad. A la inversa, varias características de la invención, que son, por brevedad, descritas en el contexto de una sola modalidad, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Aunque la invención se ha descrito en conjunción con modalidades especificas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Por consiguiente, se propone comprender todas de tales alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del espíritu y amplio alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente en su totalidad por referencia en la especificación, al mismo grado como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada en la presente por referencia. Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no debe ser considerada como una admisión de que tal referencia está disponible como la técnica previa para la presente invención. El alcance de la presente invención y de las reivindicaciones adjuntas no se va a considerar como restringido o limitado mediante, o a cualquier teoría explicita o específica presentada en la presente.

Claims (43)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método de expansión de una población ex-vivo de células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo, el método caracterizado porque comprende: proporcionar células mononucleares hematopoyéticas; cultivar las células mononucleares ex-vivo bajo condiciones que permiten la proliferación celular y, al mismo tiempo, cultivar las células bajo condiciones seleccionadas del grupo que consiste de: condiciones que reducen la expresión y/o actividad de CD38 en las células mononucleares; condiciones que reducen la capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoides y/o Vitamina D en las células mononucleares; condiciones que reducen la capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización que implican el receptor de ácido retinoico, el receptor de retinoide X y/o el receptor de Vitamina D en las células mononucleares; cultivar las células mononucleares en la presencia de nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida en las células mononucleares; condiciones que reducen una expresión y/o actividad de PI 3-quinasa en las células mononucleares; y cultivar las células mononucleares en la presencia de por lo menos un agente quelante o quelato de cobre; para expandir de esta manera una población de las células de tallo hematopoyéticas mientras que al mismo tiempo sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo.
  2. 2. Un método para transplantar o implantar células hematopoyéticas, el método caracterizado porque comprende: (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas; (b) cultivar las células mononucleares ex-vivo para la proliferación celular, en donde el cultivo se realiza en una condición seleccionada del grupo que consiste de: reducir la expresión y/o actividad de CD38; reducir una capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoides y/o Vitamina D; reducir la capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización que implican el receptor de ácido retinoico, el receptor de retinoide X y/o el receptor de Vitamina D; la presencia de nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida; reducir una expresión y/o actividad de PI 3-quinasa; o la presencia de por lo menos un agente quelante o quelato de cobre; para expandir de esta manera una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo; y (c) transplantar o implantar las células de tallo hematopoyéticas a un recipiente o recibidor.
  3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el donador y el recipiente son un solo individuo.
  4. 4. Un método para modificar genéticamente células de tallo hematopoyéticas con un exógeno, caracterizado porque comprende : (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas; (b) cultivar las células mononucleares ex-vivo para la proliferación celular, en donde el cultivo se realiza en una condición seleccionada del grupo que consiste de: condiciones que reducen la expresión y/o actividad de CD38 en las células mononucleares; condiciones que reducen la capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoides y/o Vitamina D en las células mononucleares; condiciones que reducen la capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización que implican el receptor de ácido retinoico, el receptor de retinoide X y/o el receptor de Vitamina D en las células mononucleares; cultivar las células mononucleares en la presencia de nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida en las células mononucleares; condiciones que reducen una expresión y/o actividad de PI 3-quinasa en las células mononucleares; y cultivar las células mononucleares en la presencia de por lo menos un agente quelante o quelato de cobre, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas ex-vivo; y (c) modificar genéticamente las células de tallo hematopoyéticas con el exógeno .
  5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la modificación genética se efectúa mediante un vector que comprende el exógeno.
  6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el vector es un vector viral o un vector de ácido nucleico.
  7. 7. Un método de inmunoterapia adoptiva, caracterizado porque comprende: (a) obtener células mononucleares hematopoyéticas a partir de un recipiente; (b) cultivar las células mononucleares ex-vivo para la proliferación celular, en donde el cultivo se realiza en una condición seleccionada del grupo que consiste de: condiciones que reducen la expresión y/o actividad de CD38 en las células mononucleares; condiciones que reducen la capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoides y/o Vitamina D en las células mononucleares; condiciones que reducen la capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización que implican el receptor de ácido retinoico, el receptor de retinoide X y/o el receptor de Vitamina D en las células mononucleares; cultivar las células mononucleares en la presencia de nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida en las células mononucleares ; condiciones que reducen una expresión y/o actividad de PI 3-quinasa en las células mononucleares; .y cultivar las células mononucleares en la presencia de por lo menos un agente quelante o quelato de cobre, para de esta manera expandir una población de las células de tallo hematopoyéticas, mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas; y (c) transplantar las células de tallo hematopoyéticas al recipiente.
  8. 8. Una preparación de células hematopoyéticas transplantable, caracterizada porque comprende una población expandida de células de tallo hematopoyéticas propagadas ex-vivo a partir de células mononucleares hematopoyéticas en la presencia de una cantidad de efectiva de un agente, en donde el agente una actividad seleccionada del grupo que consiste de: reducir la expresión y/o actividad de CD38 en las células mononucleares, reducir la capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoides y/o Vitamina D en las células mononucleares, reducir la capacidad de las células mononucleares hematopoyéticas en responder a las rutas de señalización que implican el receptor de ácido retinoico, el receptor de retinoide X y/o el receptor de Vitamina D en las células mononucleares; y reducir una expresión y/o actividad de PI 3-quinasa en las células mononucleares; o en donde el agente es un agente quelante o quelato de cobre, o nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida en las células mononucleares; mientras que al mismo tiempo, sustancialmente se inhibe la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas; y un portador farmacéuticamente aceptable.
  9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células mononucleares hematopoyéticas se derivan de una fuente seleccionada del grupo que consiste de médula ósea, sangre periférica y sangre del cordón umbilical neonatal .
  10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la provisión de las células mononucleares hematopoyéticas con las condiciones para la proliferación celular ex-vivo comprende proporcionar las células mononucleares hematopoyéticas con nutrientes y con citoquinas .
  11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque las citoquinas son citoquinas de acción temprana.
  12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las citoquinas de acción temprana se seleccionan del grupo que consiste de factor de célula de tallo, ligando FLT3, interleucina-1, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-6, interleucina-10, interleucina-12 , factor-a de necrosis tumoral y trombopoyetina.
  13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque las citoquinas son citoquinas de acción tardía.
  14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque las citoquinas de acción tardía se seleccionan del grupo que consiste de factor de estimulación de colonia de granulocitos, factor de estimulación de colonia de granulocitos/macrófagos, eritropoyetina, FGF, EGF, NGF, VEGF, LIF, factor de crecimiento de Hepatocitos y factor de estimulación de colonia de macrofagos.
  15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la provisión de las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para reducir la expresión y/o actividad de CD38 es mediante la provisión de las células mononucleares hematopoyéticas con un agente que regula hacia abajo la expresión de CD38.
  16. 16. La preparación de células hematopoyéticas transplantable de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el agente es un agente que regula hacia abajo la expresión de CD38.
  17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el agente que regula hacia abajo la expresión de CD38 se selecciona del grupo que consiste de un antagonista del receptor de ácido retinoico, un antagonista del receptor de retinoide X y un antagonista del receptor de Vitamina D.
  18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el agente que regula hacia abajo la expresión de CD38 es un antagonista para reducir una capacidad de las células mononucleares hematcpoyéticas en responder al ácido retinoico, retinoide y/o Vitamina D.
  19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el agente que regula hacia abajo la expresión de CD38 es un polinucleótido .
  20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el polinucleótido codifica un anti CD38, un anti receptor de ácido retinoico, un anti receptor de retinoide X o un anticuerpo intracelular anti receptor de Vitamina 'D.
  21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el polinucleótido codifica un anti CD38, un anti receptor de ácido retinoico, un anti receptor de retinoide X o un anticuerpo anti receptor de Vitamina D.
  22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el polinucleótido es una molécula de polinucleótido de interferencia pequeña dirigida a ocasionar degradación de mRNA de CD38 intracelular, receptor de ácido retinoico, receptor de retinoide X o receptor de Vitamina D.
  23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la molécula de polinucleótido de interferencia pequeña se selecciona del grupo que consiste de una molécula RNAi, una molécula anti-sentido, una molécula de ribozima y una molécula de DNAzima.
  24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el agente que regula hacia abajo la expresión de CD38 es un agente que regula hacia abajo la expresión de PI 3-quinasa.
  25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el agente que regula hacia abajo la expresión de PI 3-quinasa es un polinucleótido.
  26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el agente que regula hacia abajo la expresión de PI 3-quinasa es un anticuerpo intracelular.
  27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polinucleótido es una molécula de polinucleótido de interferencia pequeña dirigida a ocasionar degradación" de mRNA o génica de PI 3-quinasa intracelular .
  28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la molécula de polinucleótido de interferencia pequeña se selecciona del grupo que consiste de una molécula R Ai, una molécula anti-sentido, una molécula de ribozima y una molécula de DNAzima.
  29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el agente que regula hacia abajo la expresión de CD38 es un agente que inhibe la actividad de PI 3-quinasa .
  30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el agente que inhibe la actividad de PI 3-quinasa se selecciona del grupo que consiste de wortmanina y LY294002.
  31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la provisión de las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para reducir la expresión y/o actividad de CD38 es mediante la provisión de las células mononucleares hematopoyéticas con un agente que inhibe la actividad de CD38.
  32. 32. La preparación de células hematopoyéticas transplantable de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el agente es un agente que inhibe la actividad de CD38.
  33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el agente que inhibe la actividad de CD38 es nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida.
  34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el análogo de nicotinamida se selecciona del grupo que consiste de benzamida, nicotinatioamida, ácido nicotinico y ácido a-amino-3-indolpropiónico .
  35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la provisión de las células mononucleares hematopoyéticas con condiciones de cultivo ex-vivo para reducir la expresión y/o actividad de CD38 es mediante la provisión de las células mononucleares hematopoyéticas con un agente que inhibe la actividad de PI 3-quinasa .
  36. 36. La preparación de células hematopoyéticas transplantable de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el agente es un agente que inhibe la actividad de PI 3-quinasa.
  37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el agente que inhibe la actividad de PI 3-quinasa se selecciona del grupo que consiste de wortmanina y LY294002.
  38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células mononucleares hematopoyéticas no son enriquecidas antes del cultivo ex-vivo bajo condiciones que permiten la proliferación celular.
  39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células hematopoyéticas comprenden una fracción principal de células comprometidas hematopoyéticas y una fracción menor de células de tallo y progenitoras hematopoyéticas .
  40. 40. Un ensayo para determinar si un quelato o agente quelante de metal de transición causa la inhibición o inducción sustancial de la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas, el ensayo caracterizado porque comprende : cultivar células mononucleares hematopoyéticas en la presencia del quelato o agente quelante de metal de transición e inspeccionar la diferenciación de las células de tallo hematopoyéticas, en donde si se incrementa la diferenciación como es comparada con las células mononucleares hematopoyéticas no tratadas, el quelato de metal de transición induce diferenciación, mientras que si la diferenciación es disminuida como es comparado con las células mononucleares hematopoyéticas no tratadas, o si la diferenciación está ausente conjuntamente, el quelato de metal de transición inhibe la diferenciación.
  41. 41. Un ensayo para identificar un agente de expansión de células de tallo hematopoyéticas efectivo, el ensayo caracterizado porque comprende cultivar células mononucleares hematopoyéticas en la presencia de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de: un antagonista del receptor de ácido retinoico; un antagonista del receptor de retinoide X; un antagonista del receptor de vitamina D; un agente que inhibe la actividad de PI 3-quinasa; Y un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida, e inspeccionar la expansión de las células de tallo hematopoyéticas, en donde si la expansión incrementada y la diferenciación disminuida de las células de tallo hematopoyéticas ocurre, como es comparado con las células mononucleares hematopoyéticas no tratadas, el compuesto es un agente de expansión de células de tallo hematopoyéticas efectivo .
  42. 42. Una bolsa de recolección/cultivo de células de tallo hematopoyéticas, caracterizada porque es complementada con una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de: un antagonista del receptor de ácido retinoico, un antagonista del receptor de retinoide X y/o un antagonista del receptor de vitamina D, nicotinamida, un análogo de nicotinamida, un derivado de nicotinamida o de análogo de nicotinamida o un metabolito de nicotinamida o de análogo de nicotinamida; o un agente que inhibe la actividad de PI 3-quinasa, que sustancialmente inhibe la diferenciación celular de una fracción de células de tallo hematopoyéticas de las células mononucleares hematopoyéticas.
  43. 43. Una población expandida ex-vivo de células de tallo hematopoyéticas, caracterizada porque se obtiene mediante el método de la reivindicación 1.
MXPA05001992A 2002-08-19 2003-08-17 Expansion ex-vivo de poblaciones de celulas de tallo, hematopoyeticas, en cultivos de celulas mononucleares. MXPA05001992A (es)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40414502P 2002-08-19 2002-08-19
US40413702P 2002-08-19 2002-08-19
IL15290402A IL152904A0 (en) 2002-01-24 2002-11-17 Utilization of retinoid and vitamin d receptor antagonists for expansion of renewable stem cell populations
PCT/IL2003/000062 WO2003062404A1 (en) 2002-01-25 2003-01-23 Methods of expanding stem and progenitor cells and expanded cell populations obtained thereby
PCT/IL2003/000064 WO2003062369A2 (en) 2002-01-24 2003-01-26 Expansion of renewable stem cell populations
US45254503P 2003-03-07 2003-03-07
PCT/IL2003/000681 WO2004016731A2 (en) 2002-08-19 2003-08-17 Ex-vivo expansion of hematopoietic stem cell populations in mononuclear cell cultures

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MXPA05001992A true MXPA05001992A (es) 2005-08-03

Family

ID=56290470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA05001992A MXPA05001992A (es) 2002-08-19 2003-08-17 Expansion ex-vivo de poblaciones de celulas de tallo, hematopoyeticas, en cultivos de celulas mononucleares.

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1534820A4 (es)
JP (1) JP2006508692A (es)
AU (1) AU2003250519A1 (es)
BR (1) BR0314402A (es)
CA (1) CA2495824A1 (es)
MX (1) MXPA05001992A (es)
WO (1) WO2004016731A2 (es)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU770896C (en) 1998-09-29 2006-09-07 Gamida Cell Ltd. Methods of controlling proliferation and differentiation of stem and progenitor cells
IL152904A0 (en) * 2002-01-24 2003-06-24 Gamida Cell Ltd Utilization of retinoid and vitamin d receptor antagonists for expansion of renewable stem cell populations
WO2003062404A1 (en) 2002-01-25 2003-07-31 Gamida-Cell Ltd. Methods of expanding stem and progenitor cells and expanded cell populations obtained thereby
CA2517959A1 (en) * 2003-03-07 2004-09-16 Gamida-Cell Ltd. Expansion of renewable stem cell populations using modulators of pi 3-kinase
US8361976B2 (en) 2004-07-09 2013-01-29 University Of Massachusetts Therapeutic alteration of transplantable tissues through in situ or ex vivo exposure to RNA interference molecules
US8846393B2 (en) 2005-11-29 2014-09-30 Gamida-Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
EP1974012B1 (en) * 2005-11-29 2013-02-27 Gamida Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
WO2008133904A1 (en) 2007-04-23 2008-11-06 Stowers Institute For Medical Research Methods and compositions for stem cell self-renewal
EP2250251B1 (en) * 2008-01-09 2017-11-22 Sartorius Stedim Cellca GmbH Improved culture media additive and process for using it
EP2814951B1 (en) 2012-02-13 2019-04-03 Gamida-Cell Ltd. Culturing of mesenchymal stem cells
US9567569B2 (en) 2012-07-23 2017-02-14 Gamida Cell Ltd. Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
US20190119636A1 (en) 2017-10-23 2019-04-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
WO2018064681A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003214614B2 (en) * 2002-03-18 2008-11-20 Gamida-Cell Ltd. Methods of inducing differentiation in ex vivo expanded stem cells

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004016731A3 (en) 2004-09-10
AU2003250519A1 (en) 2004-03-03
JP2006508692A (ja) 2006-03-16
AU2003250519A8 (en) 2004-03-03
EP1534820A4 (en) 2006-04-26
EP1534820A2 (en) 2005-06-01
CA2495824A1 (en) 2004-02-26
BR0314402A (pt) 2005-07-19
WO2004016731A2 (en) 2004-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8080417B2 (en) Methods of ex vivo hematopoietic stem cell expansion by co-culture with mesenchymal cells
AU2004217699B2 (en) Expansion of renewable stem cell populations using modulators of PI 3-kinase
JP4738738B2 (ja) 再生可能な幹細胞集団の拡大
US7655225B2 (en) Methods of expanding stem and progenitor cells and expanded cell populations obtained thereby
US20060205071A1 (en) Methods for ex-vivo expanding stem/progenitor cells
US8986992B2 (en) Expansion of stem/progenitor cells by inhibition of enzymatic reactions catalyzed by the Sir2 family of enzymes
US20050054097A1 (en) EX-VIVO expansion of hematopoietic system cell populations in mononuclear cell cultures
WO2005007073A2 (en) Ex vivo progenitor and stem cell expansion for use in the treatment of disease of endodermally-derived organs
MXPA05001992A (es) Expansion ex-vivo de poblaciones de celulas de tallo, hematopoyeticas, en cultivos de celulas mononucleares.
AU2005200679B2 (en) Ex-Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cell Populations in Mononuclear Cell Cultures
ZA200502111B (en) Ex-vivo expansion of hematopoietic stem cell popu lations in mononuclear cell cultures.
US20180320139A1 (en) Expansion of renewable stem cell populations
ZA200405901B (en) Expansion of renewable stem cell populations
ZA200407797B (en) Methods of inducing differentiation in ex vivo expanded stem cells.

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration