JP2006508692A - 単核細胞培養物における造血幹細胞集団のエクスビボ拡大 - Google Patents
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Abstract
造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞の造血幹細胞を拡大するエクスビボ方法、それにより得られた造血幹細胞の拡大された集団及びそれらの用途が開示される。
Description
本発明は、血液サンプルの造血単核細胞画分に存在する造血幹細胞のエクスビボ拡大(自己再生)方法、および、それにより得られる造血幹細胞の拡大(自己再生)された集団に関する。本発明は、さらに、これらの方法および/または上記方法によって得られた拡大造血幹細胞集団を使用する治療的適用に関する。
特に幹細胞拡大およびレトロウイルス媒介遺伝子形質導入などの目的のための造血幹細胞のエクスビボ培養物の必要性が高まっている。しかし、幹細胞のエクスビボ培養物の作製方法では通常、幹細胞集団の活性が急激に低下し、さらに、自己再生能力が著しく損なわれ、培養された細胞集団の移植可能性が減少する。このような方法を改良する必要性は幅広く認められている。さらに、レトロウイルスベクターを使用する遺伝子治療の適用には、増殖している造血幹細胞を使用する必要があり、さらに、これらの細胞は、形質導入された遺伝子の発現を長期間維持するために、培養物中で未分化の状態で維持する必要がある。したがって、長期自己再生能力を有する造血幹細胞集団のエクスビボ培養物を維持する能力は、広範な一連の治療用途に非常に重要である。
現在、再生可能な幹細胞は、線維芽細胞の支持層上で幹細胞を増殖させるか、初期作用性サイトカイントロンボポイエチン(TPO)、インターロイキン6(IL−6)、FLT−3リガンド、および幹細胞因子(SCF)の存在下で細胞を増殖させることによって、拡大されている(Madlambayan GJ et al(2001)J.Hematother.Stem Cell Res.10:481,Punzel M et al(1999)Leukemia 13:92,and Lange W et al(1996)Leukemia 10:943)。支持細胞層上での幹細胞の拡大により巨大で実質的に終わりなく細胞が拡大される一方で、上記の初期作用性サイトカインの存在下での支持細胞層を使用しない幹細胞の拡大により分化度が上昇する(実施例およびLeslie NR et al(Blood(1998)92:4798)、Petzer AL et al(1996)J.Exp.Med.Jun 183:2551、Kawa Y et al(2000)Pigment Cell Res.8:73に記載のコントロールを参照のこと)。
従って、インビボおよびインビトロの両方での造血幹細胞および先祖細胞(HPC)の自己再生(拡大)は、細胞分化によって制限される。造血系の分化には、他の変化もあるが、表面抗原発現の変化が含まれる(Sieff C,Bicknell D,Caine G,Robinson J,Lam G,Greaves MF(1982) Changes in cell surface antigen expression during hematopoietic differentiation. Blood 60:703)。正常なヒトでは、多能性造血幹細胞およびその系統が約束されている先祖細胞のほとんどがCD34+である。細胞の大部分はCD34+CD38+であり、少数の細胞(10%未満)はCD34+CD38−である。CD34+CD38−表現型は、自己再生が可能であり多系統への分化を行うことができるほとんど未成熟の造血細胞とみなすことができるようである。CD34+CD38−細胞画分は、長期培養開始細胞(LTC−IC)前CFUを含み、CD34+CD38+細胞と比較してその表現型をより長く維持し、サイトカインに対する増殖反応を遅延させる。CD34+CD38−は、インビトロでリンパ系細胞および骨髄性細胞を生じ、SCIDマウスを再生させる(repopulate)高い能力を有する(Bhatia M,Wang JCY,Kapp U,Bonnet D,Dick JE(1997)Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune−deficient mice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5320)。さらに、自己血球移植を受けた患者では、注入されたCD34+CD38−の細胞数は造血回復速度に正に相関する。これらの機能的特徴と一致して、CD34+CD38−細胞は、検出可能なレベルのテロメラーゼを有することが示されている。
造血幹細胞および造血前駆細胞のエクスビボ拡大に関する現在発表されている研究では、CD34抗原またはさらにより初期のAC133抗原を発現する始原細胞が高度に濃縮されている細胞を開始のために接種することが伴う[Dexter,T.M.、T.D.AllenおよびL.G.Lajtha、造血幹細胞の集団をインビトロで制御する条件、J.Cell Physiol.、1977、91(3):p.335〜44;Muench,M.O.、J.G.SchneiderおよびM.A.Moore、原始的なネズミ造血細胞の調節におけるコロニー刺激因子(IL−1β、IL−6およびkitリガンド)の間での相互作用、Exp.Hematol.、1992、20(3):p.339〜49;Verfaillie,C.M.、ヒトの原始的な造血前駆細胞と骨髄間質との直接的な接触は長期のインビトロ血液生成のために要求されない、Blood、1992、79(11):p.2821〜26;Migliaccio,G.、A.R.Migliaccio、M.L.Druzin、P.J.Giardina、K.M.ZseboおよびJ.W.Adamson、組換えヒト幹細胞因子の存在下でのCD34+臍帯血細胞の液体培養におけるコロニー形成細胞の長期にわたる生成、Blood、1992、79(10):p.2620〜27;Purdy,M.H.、C.J.Hogan、L.Hami、I.McNiece、W.Franklin、R.B.Jones、S.I.Bearman、R.J.Berenson、P.J.CagnoniおよびS.Heimfeld、移植のためのCD34陽性造血前駆細胞の大容量エクスビボ拡大、J.Hematother.、1995、4(6):p.515〜25;McNiece,I.、R.Andrews、M.Stewart、S.Clark、T.BooneおよびP.Quesenberry、高度に濃縮(富化)されたヒト造血前駆細胞に対するインターロイキン−3、G−CSFおよびGM−CSFの作用:GM−CSF+G−CSFの相乗的相互作用、Blood、1989、74(1):p.110〜14;Colter,M.、M.JonesおよびS.Heimfeld、CD34+始原細胞の選択:臨床的移植、腫瘍細胞パージング、遺伝子治療、エクスビボ拡大および臍帯血処理、J Hematother、1996、5(2):p.179〜84;Kohler,T.、R.Plettig、W.Wetzstein、B.Schaffer、R.Ordemann、H.O.Nagels、G.EhningerおよびM.Bornhauser、ヒト臍帯血細胞のエクスビボ拡大のための最適な条件の明確化。始原細胞濃縮、フィーダー層による妨害、早期作用サイトカインおよび培養槽の撹拌の影響、Stem Cells、1999、17(1):p.19〜24]。
単核細胞(MNC)画分全体をサイトカインの存在下で用いたエクスビボ培養の開始は培養の最初の数週間の間にCFUcの拡大をもたらし、その後、培養物の急速な衰退をもたらすことが示されていたので、CD34+(またはAC133)細胞の精製が、長期培養のコロニー形成細胞(LTC−CFUc)だけでなく、造血幹細胞の成功したエクスビボ拡大を達成するための必須条件であるとこれまで広く受け入れられている[Briddell,R.、Keren,B.P.、Zilm,K.L.他、CD34+細胞の精製は臍帯血細胞の最適なエクスビボ拡大のために不可欠である、J.Hematother.、6:145、1997;Ian K McNiece、Gregory B.Stoney、Brent P.KerenおよびRobert A.Briddell、Isolex300iおよびcliniMACS(商標)選択装置を使用した凍結臍帯血産物からのCD34+細胞の選択、Journal of hematotherapy、7:457〜461(1998)]。
国際特許出願公開WO99/40783、同WO00/18885、およびPeled他、Brit.J.Haematol.、116:655、2002(これらはすべて、本明細書中に詳しく示されるかのように参照により組み込まれる)には、造血前駆細胞の自己再生と分化との間でのバランスの調節に対する、細胞中に存在する遊離銅の影響が教示される。これらの参考文献では、細胞の銅含有量を減少させることができる薬剤を早期作用サイトカインと一緒にCD34+細胞の培養物に加えることにより、長期にわたるCD34+細胞の拡大が培養でのエクスビボでもたらされることが教示される。これらの参考文献の教示によれば、そのような薬剤には、好ましくは、銅と結合することができる遷移金属キレーター、例えば、線状ポリアミン(例えば、テトラエチレンペンタミン、TEPA)などが含まれる。従って、5μM〜10μMのTEPAをCD34+細胞培養物に早期作用サイトカインの存在下で加えることにより、細胞の銅含有量が(原子吸光によって測定されたとき)30%減少し、そして、長期にわたるCFU細胞およびCD34+細胞の拡大に関して長期培養の持続期間が延びたことがこれらの参考文献では示されている。
しかしながら、これらの参考文献に開示された方法ではまた、幹細胞または始原細胞の精製が培養におけるそれらの拡大の前に伴う。
このように、今日の技術を使用した場合、均一にまで最初に実質的に濃縮(富化)または単離されない限り、幹細胞を拡大することができない。従って、幹細胞集団をエクスビボ拡大する現在知られている方法は、培養の開始に先立つ、手間および費用のかかる幹細胞濃縮プロセスによって制限されている。
このように、事前の幹細胞濃縮を伴うことなく造血幹細胞をエクスビボ拡大する方法が必要であることが広く認められており、また、そのような方法を得ることは非常に好都合である。
本発明は、事前の幹細胞濃縮手法の使用を伴うことなく、血液サンプルの造血単核細胞画分に存在する造血幹細胞を拡大する際の様々な薬剤の使用、それにより得られる造血幹細胞の拡大(自己再生)された集団、およびその使用を開示する。
本発明の1つの局面によれば、造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法が提供される。
1つの実施形態において、この方法は、造血系の方向づけられた(committed)細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時にCD38の発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
別の実施形態において、この方法は、造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸、レチノイドおよび/またはビタミンDに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
さらに別の実施形態において、この方法は、造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸受容体、レチノイドX受容体および/またはビタミンD受容体を伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
なお別の実施形態において、この方法は、造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時に、PI3−キナーゼを伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
さらに別の実施形態において、この方法は、造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、そして同時に、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、または、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
なお別の実施形態において、この方法は、造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、そして同時にPI3−キナーゼ阻害剤とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
さらに別の実施形態において、この方法は、造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、そして同時に、1つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
さらに、本発明によれば、本明細書中上記に記載される方法によって得られる、造血幹細胞のエクスビボ拡大された集団が提供される。
本発明の別の局面によれば、造血細胞を移植または埋込みする方法が提供される。
1つの実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にCD38の発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに(c)造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸、レチノイドおよび/またはビタミンDに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに(c)造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
なお別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸受容体、レチノイドX受容体および/またはビタミンD受容体を伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに(c)造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
さらに別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、PI3−キナーゼを伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに(c)造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
なお別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、または、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに(c)造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
さらになお別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、PI3−キナーゼ阻害剤とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに(c)造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
なお別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にPI3−キナーゼの発現および/または活性を減少させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに(c)造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
さらになお別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、1つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートとを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに(c)造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
上記方法におけるドナーおよびレシピエントは、単一の個体または異なる個体、例えば、同種の個体または異種の個体であり得る。
本発明のさらに別の局面によれば、移植可能な造血細胞調製物が提供される。
1つの実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、CD38の発現および/または活性を減少させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害するための効果的な量の薬剤の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、PI3−キナーゼの発現および/または活性を減少させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害するための効果的な量の薬剤の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
さらに別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、レチノイン酸、レチノイドおよび/またはビタミンDに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
なお別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、レチノイン酸受容体、レチノイドX受容体および/またはビタミンD受容体のシグナル伝達に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
さらに別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、PI3−キナーゼのシグナル伝達に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
なお別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、および、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物からなる群から選択され、同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
さらに別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、PI3−キナーゼ阻害剤の、同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
なお別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、1つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートの、同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
本発明のさらなる局面によれば、養子免疫療法の方法が提供される。
1つの実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にCD38の発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、ならびに(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸、レチノイドおよび/またはビタミンDに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に幹細胞の分化を実質的に阻害すること、ならびに(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
さらに別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸受容体および/またはレチノイドX受容体および/またはビタミンD受容体を伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、ならびに(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
なお別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、PI3−キナーゼを伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、および(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
さらに別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、または、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、および(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
なお別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、PI3−キナーゼ阻害剤とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、および(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
さらに別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、1つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートとを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、および(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
さらに、本発明の1つの局面によれば、幹細胞を外因遺伝子(exogene)で遺伝子改変する方法が提供される。
1つの実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にCD38の発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にPI3−キナーゼの発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
さらに別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸、レチノイドおよび/またはビタミンDに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
なお別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸受容体および/またはレチノイドX受容体および/またはビタミンD受容体を伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、および(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
さらに別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、PI3−キナーゼを伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、および(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
なお別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、または、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、および(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
さらに別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、PI3−キナーゼ阻害剤とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、および(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
なお別の実施形態において、この方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、1つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートとを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、および(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
好ましい実施形態において、細胞を遺伝子改変することは、外因遺伝子を含むベクターによって達成され、この場合、そのようなベクターは、例えば、ウイルスベクターまたは核酸ベクターである。
本発明のさらにさらなる局面によれば、効果的な量のレチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニストおよび/またはビタミンD受容体アンタゴニスト、効果的な量のニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、およびニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物、効果的な量のPI3−キナーゼ阻害剤、あるいは、効果的な量の銅キレーターまたは銅キレートが補充された造血幹細胞回収/培養バッグが提供され、この場合、それらのそれぞれにより、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞の造血幹細胞画分の細胞分化が実質的に阻害される。
本発明のさらなる局面によれば、薬剤/分子が効果的な造血幹細胞拡大剤であるかどうかを明らかにするアッセイが提供される。このアッセイは、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、試験されている薬剤/分子の存在下で培養すること、および、造血幹細胞の拡大をモニターすることを含み、この場合、造血幹細胞の増大した拡大および低下した分化が、処理されていない造血単核細胞と比較して生じる場合、試験された薬剤/分子は効果的な造血幹細胞拡大剤である。
薬剤/分子は、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニスト、ビタミンD受容体アンタゴニスト、ニコチンアミドならびにそのアナログ、誘導体および代謝産物、PI3−キナーゼ阻害剤、銅キレーターおよび銅キレートであり得る。
下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、CD38発現を下方制御(ダウンレギュレート)する薬剤によってCD38の発現および/または活性を減少させる。
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、CD38発現を下方制御する薬剤は、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニスト、およびビタミンD受容体アンタゴニストからなる群から選択される。あるいは、この薬剤は、幹細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を減少させるためのアンタゴニストである。またあるいは、CD38発現を下方制御する薬剤は、PI3−キナーゼ阻害剤である。
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、CD38発現を下方制御する薬剤は、ポリヌクレオチドである。
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、CD38発現を下方制御する薬剤は、抗CD38抗体、抗レチノイン酸受容体抗体、抗レチノイドX受容体抗体、または抗ビタミンD受容体抗体、または抗PI3−キナーゼ抗体、または細胞内抗体をコードするポリヌクレオチドである。
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ポリヌクレオチドは、細胞内CD38、レチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、ビタミンD受容体またはPI3−キナーゼのmRNA分解を指示する干渉性低分子ポリヌクレオチド分子である。
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、CD38発現を下方制御する薬剤は、RNAi分子、アンチセンス分子、リボザイム分子、およびDNAzyme分子からなる群から選択される干渉性低分子ポリヌクレオチド分子である。
下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、CD38の発現および/または活性を、CD38活性を阻害する薬剤によって減少させる。薬剤は、例えば、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物であり得る。ニコチンアミドアナログは、好ましくは、ベンズアミド、ニコチンチオアミド、ニコチン酸、およびα−アミノ−3−インドールプロピオン酸からなる群から選択される。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、CD38の発現および/または活性を低下させることは、PI3−キナーゼ活性を阻害する薬剤によって達成される。
下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、エクスビボ細胞増殖のための条件を使用した幹細胞の獲得は、前記細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む。
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、サイトカインは初期活動サイトカインであり、例えば、幹細胞因子、FLT3リガンド、インターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−6、インターロイキン−10、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンなどであるが、これらに限定されない。
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、サイトカインは、後期活動サイトカイン(後期作動性サイトカイン)であり、例えば、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、FGF、EGF、NGF、VEGF、LIF、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子などであるが、これらに限定されない。
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、造血単核細胞は、骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する。
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、造血単核細胞のシグナル伝達経路に対する応答能力の減少は可逆的である(例えば、本質的に可逆的である)。
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、造血単核細胞の上記のアンタゴニストおよび/または上記の受容体のシグナル伝達経路に対する応答能力の減少は、好ましくは造血単核細胞の全エクスビボ培養期間の0.1〜50%、より好ましくは0.1〜25%、さらに好ましくは0.1〜15%の期間、有効量の少なくとも1つのレチノイン酸受容体アンタゴニスト、少なくとも1つのレチノイドX受容体アンタゴニスト、および/または少なくとも1つのビタミンD受容体アンタゴニストの存在下で造血単核細胞をエクスビボ培養することによる。
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、レチノイン酸受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される:
AGN194310;AGN193109;3−(4−メトキシ−フェニルスルファニル)−3−メチル−酪酸;
6−メトキシ−2,2−ジメチル−チオクロマン−4−オン,2,2−ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イルトリフルオロメタン−スルホネート;
エチル4−((2,2ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート;
エチル4−((2,2−ジメチル−4−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−(2H)−チオクロメン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート(41);
チオクロメン−6−イル]−エチニル−ベンゾエート(イル);
(p−[(E)−2−[3’4’−ジヒドロ−4,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’イル]プロペニル]安息香酸1’1’−ジオキシド;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ブトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−プロポキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ペントキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘキソキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘプトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−オクトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
(2E,4E,6E)−7−(3−t−ブチル−5−(1−フェニル−ビニル)−フェニル]−3−メチル−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−{[4,5−3H2]−n−ペントキシ}フェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸エチルエステル;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシフェニル]3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
4−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−カルボキシアミド)安息香酸;
(2E,4E)−3−メチル−5−[(1S,2S)−2−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−ナフタレン−2−イル)−シクロプロピル]−ペンタ−2,4−ジエン酸;
p−[(E)−2−[3’,4’−ジヒドロ−4’,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’−イル]プロペニル]安息香酸;
1’,1’−ジオキシド,4−(7,7,10,10−テトラメチル−1−ピリジン−3−イルメチル−4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−1H−ナフト[2,3−g]インドール−3−イル)−安息香酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−メトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−ヘキシルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−オクチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;および
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;
4−(5H−2,3(2,5ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;
4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;
4−{[4−(4−エチルフェニル)2,2−ジメチル−(2H)−チオクロメン−6−イル]エチニル}安息香酸;
4−[4−2メチル−1,2−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−1−イル−フェニルカルバモイル]安息香酸;
4−[4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−7,7,10,10−テトラメチル−1−(3−ピリジルメチル)−アントラ[1,2−b]ピロール−3−イル]安息香酸;
(3−ピリジルメチル)−]5−チアアントラ[2,1−b]ピロール−3−イル)安息香酸;および
(3−ピリジルメチル)−アントラ[2ml−d]ピラゾール−3−イル]安息香酸。
AGN194310;AGN193109;3−(4−メトキシ−フェニルスルファニル)−3−メチル−酪酸;
6−メトキシ−2,2−ジメチル−チオクロマン−4−オン,2,2−ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イルトリフルオロメタン−スルホネート;
エチル4−((2,2ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート;
エチル4−((2,2−ジメチル−4−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−(2H)−チオクロメン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート(41);
チオクロメン−6−イル]−エチニル−ベンゾエート(イル);
(p−[(E)−2−[3’4’−ジヒドロ−4,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’イル]プロペニル]安息香酸1’1’−ジオキシド;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ブトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−プロポキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ペントキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘキソキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘプトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−オクトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
(2E,4E,6E)−7−(3−t−ブチル−5−(1−フェニル−ビニル)−フェニル]−3−メチル−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−{[4,5−3H2]−n−ペントキシ}フェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸エチルエステル;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシフェニル]3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
4−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−カルボキシアミド)安息香酸;
(2E,4E)−3−メチル−5−[(1S,2S)−2−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−ナフタレン−2−イル)−シクロプロピル]−ペンタ−2,4−ジエン酸;
p−[(E)−2−[3’,4’−ジヒドロ−4’,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’−イル]プロペニル]安息香酸;
1’,1’−ジオキシド,4−(7,7,10,10−テトラメチル−1−ピリジン−3−イルメチル−4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−1H−ナフト[2,3−g]インドール−3−イル)−安息香酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−メトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−ヘキシルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−オクチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;および
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;
4−(5H−2,3(2,5ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;
4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;
4−{[4−(4−エチルフェニル)2,2−ジメチル−(2H)−チオクロメン−6−イル]エチニル}安息香酸;
4−[4−2メチル−1,2−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−1−イル−フェニルカルバモイル]安息香酸;
4−[4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−7,7,10,10−テトラメチル−1−(3−ピリジルメチル)−アントラ[1,2−b]ピロール−3−イル]安息香酸;
(3−ピリジルメチル)−]5−チアアントラ[2,1−b]ピロール−3−イル)安息香酸;および
(3−ピリジルメチル)−アントラ[2ml−d]ピラゾール−3−イル]安息香酸。
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、レチノイドX受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される:
LGN100572;LGN100574;
1−(3−ヒドロキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;
1−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;
3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エネニトリル;
3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エナール;
(2E,4E,6E)−7−3[−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−2−イル]−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;
4−[3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸;
4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]安息香酸;
4−[1(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]安息香酸;
4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ベンゼネート(benzenete)トラゾール;
2−[1−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エチル]ピリジン−5−カルボン酸;
エチル−2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボキシレート;
5−[1−3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−2−カルボン酸;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;
メチル2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボキシレート;
4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]−N−(4−ヒドロキシフェニル)ベンズアミド;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸ブチルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸プロピルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸シアノイミン;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸アリルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸4−(3−メチルブト−2−エン酸)オキシム;および
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸1−アミノエチルオキシム;
(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;および
4−(5H−2,3(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;および
4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸。
LGN100572;LGN100574;
1−(3−ヒドロキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;
1−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;
3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エネニトリル;
3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エナール;
(2E,4E,6E)−7−3[−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−2−イル]−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;
4−[3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸;
4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]安息香酸;
4−[1(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]安息香酸;
4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ベンゼネート(benzenete)トラゾール;
2−[1−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エチル]ピリジン−5−カルボン酸;
エチル−2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボキシレート;
5−[1−3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−2−カルボン酸;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;
メチル2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボキシレート;
4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]−N−(4−ヒドロキシフェニル)ベンズアミド;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸ブチルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸プロピルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸シアノイミン;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸アリルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸4−(3−メチルブト−2−エン酸)オキシム;および
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸1−アミノエチルオキシム;
(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;および
4−(5H−2,3(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;および
4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸。
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ビタミンD受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される:1α,25−(OH)−D3−26,23ラクトン;1α,25−ジヒドロキシビタミンD(3);25−カルボン酸エステルZK159222;(23S)−25−デヒドロ−1α−OH−D(3);(23R)−25−デヒドロ−1α−OH−D(3);1β,25(OH)2D3;1β,25(OH)2−3−エピ−D3;(23S)25−デヒドロ−1α(OH)D3−26,23−ラクトン;(23R)25−デヒドロ−1α(OH)D3−26,23−ラクトン;およびブチル−(5Z,7E,22E−(1S,7E,22E−(1S,3R,24R)−1,3,24−トリヒドロキシ−26,27−シクロ−9,10−セココレスタ−5,7,10(19),22−テトラエン−25−カルボキシレート)。
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、PI3−キナーゼ阻害剤は、ウォルトマンニンおよびLY294002からなる群から選択される。
本明細書中上記に記載される本発明の様々な局面において使用される銅キレートまたは銅キレーターは、好ましくは、ポリアミンキレーターを含む。
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ポリアミンキレーターは、銅以外の遷移金属と有機金属錯体を形成することができる。そのような遷移金属は、例えば、亜鉛、コバルト、ニッケル、鉄、パラジウム、白金、ロジウムおよびルテニウムであり得る。
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリアミンキレーターは線状ポリアミンである。
好ましくは、線状ポリアミンは下記の一般式Iを有する:
(式中、mは1〜10の整数である;nは0〜20の整数である;XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖であり、ただし、X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される)。
好ましくは、線状ポリアミンは下記の一般式Iを有する:
(式中、mは1〜10の整数である;nは0〜20の整数である;XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖であり、ただし、X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される)。
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、Aは、下記の一般式IIを有するアルキレン鎖である:
(式中、gは、0または3〜10に等しい整数である;R1、R2およびRgのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される)。
(式中、gは、0または3〜10に等しい整数である;R1、R2およびRgのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される)。
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、B1およびBnのそれぞれは独立して、下記の一般式IIIを有するアルキレン鎖である:
(式中、pは、0またはg+1に等しい整数である;qはg+2からg+20までの整数である;Rp、Rp+1およびRqのそれぞれは独立して、R1、R2およびRgに関して本明細書中上記に記載された置換基からなる群から選択される)。
(式中、pは、0またはg+1に等しい整数である;qはg+2からg+20までの整数である;Rp、Rp+1およびRqのそれぞれは独立して、R1、R2およびRgに関して本明細書中上記に記載された置換基からなる群から選択される)。
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、C1、C2およびCgの少なくとも1つ、ならびに/または、Cp、Cp+1およびCqの少なくとも1つはキラルな炭素原子である。
本発明による好ましい線状ポリアミンはテトラエチレンペンタミンである。
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリアミンキレーターは、シクラムなどの環状ポリアミンである。
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、環状ポリアミンは下記の一般式IVを有する:
(式中、mは1〜10の整数である;nは0〜20の整数である;XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;Dは、下記の一般式Vを有する架橋基である:
[式中、UおよびVはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される;Wは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される]、
ただし、X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される)。
(式中、mは1〜10の整数である;nは0〜20の整数である;XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;Dは、下記の一般式Vを有する架橋基である:
[式中、UおよびVはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される;Wは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される]、
ただし、X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される)。
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、式IVにおけるA、ならびに、B1およびBnのそれぞれは、本明細書中上記に記載されるように、一般式IIおよび一般式IIIを有するアルキレン鎖である。
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、環状ポリアミンは、下記の式VI〜式Xからなる群から選択される一般式を有する:
(式中、mは1〜10の整数である;nは0〜20の整数である;XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;Dは、本明細書中上記に記載されるように、一般式Vを有する架橋基であり、さらに、Dが一方の端部でA(式VI、式VIIおよび式X)に結合している場合、UまたはVはアルキレン鎖における1つの炭素原子に結合しており、また、Dが一方の端部でB1またはBn(式VIII、式IXおよび式X)に結合している場合、UまたはVはアルキレン鎖における1つの炭素原子に結合している;
ただし、X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される)。
(式中、mは1〜10の整数である;nは0〜20の整数である;XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;Dは、本明細書中上記に記載されるように、一般式Vを有する架橋基であり、さらに、Dが一方の端部でA(式VI、式VIIおよび式X)に結合している場合、UまたはVはアルキレン鎖における1つの炭素原子に結合しており、また、Dが一方の端部でB1またはBn(式VIII、式IXおよび式X)に結合している場合、UまたはVはアルキレン鎖における1つの炭素原子に結合している;
ただし、X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される)。
アルキレン鎖のA、B1およびBnは、好ましくは、本明細書中上記に記載される通りである。
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリアミンキレーターは少なくとも1つの線状ポリアミンおよび少なくとも1つの環状ポリアミンを含む。
そのようなポリアミンキレーターは、好ましくは、下記の一般式XIを有する:
(式中、nは1よりも大きい整数である;f、g、h、i、j、k、l、oおよびtのそれぞれは独立して、0〜10の整数である;E1、E2およびEnのそれぞれは独立して、本明細書中上記に記載されるような線状ポリアミンである;G1、G2およびGnのそれぞれは独立して、本明細書中上記に記載されるような環状ポリアミンである;Q1、Q2およびQnのそれぞれは独立して、これらのポリアミンの2つの間を連結するリンカーである;
ただし、Q1、Q2およびQnの少なくとも1つがアミン基であり、かつ/または、線状ポリアミンおよび環状ポリアミンの少なくとも1つが少なくとも1つのフリーのアミン基を有する)。
(式中、nは1よりも大きい整数である;f、g、h、i、j、k、l、oおよびtのそれぞれは独立して、0〜10の整数である;E1、E2およびEnのそれぞれは独立して、本明細書中上記に記載されるような線状ポリアミンである;G1、G2およびGnのそれぞれは独立して、本明細書中上記に記載されるような環状ポリアミンである;Q1、Q2およびQnのそれぞれは独立して、これらのポリアミンの2つの間を連結するリンカーである;
ただし、Q1、Q2およびQnの少なくとも1つがアミン基であり、かつ/または、線状ポリアミンおよび環状ポリアミンの少なくとも1つが少なくとも1つのフリーのアミン基を有する)。
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、Q1、Q2およびQnのそれぞれは独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、シクロアルキレン、ヘテロアリーレン、アミン、アゾ、アミド、スルホニル、スルフィニル、スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、ケトエステル、カルボニル、チオカルボニル、エステル、エーテル、チオエーテル、カルバマート、チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシおよびシラザからなる群から選択される)。
記載された好ましい実施形態におけるより一層強い特徴によれば、ポリアミンキレーターは、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、テトラエチレンペンタミン、アミノエチルエタノールアミン、アミノエチルピペラジン、ペンタエチレンヘキサミン、カプトプリル、ペニシラミン、N,N’−ビス(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミン、N,N’−ビス(2−アミノエチル)−1,3−プロパンジアミン、1,7−ジオキサ−4,10−ジアザシクロドデカン、1,4,8,11−テトラアザシクロテトラデカン−5,7−ジオン、1,4,7−トリアザシクロノナン三塩酸塩、1−オキサ−4,7,10−トリアザシクロドデカン、1,4,8,12−テトラアザシクロペンタデカン、1,4,7,10−テトラアザシクロドデカンからなる群から選択される。
本発明は、幹細胞について造血単核細胞を事前に濃縮することなく造血幹細胞を拡大する方法を提供することによって、現在知られている形態の様々な欠点に対処することに成功している。
別途に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等な方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記に記載される。矛盾する場合には、本特許明細書(定義を含む)が優先する。さらに、材料、方法および例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
図面の簡単な記述
本発明を、本明細書中で、例示のみを目的として添付の図面を参照して記載する。ここでは詳細な図面を参照して、示した個々の事項は本発明の好ましい実施形態の例示および例示的考察のみを目的とし、最も有用と考えられるものを示すことおよび本発明の原理および概念的局面の説明が容易に理解されるために示すことを強調する。これに関して、本発明の基本的理解に必要とされる以上により詳細に本発明の構造細部を示すことを意図せず、図面と共に示した説明により、どのようにして本発明のいくつかの形態を実際に実施することができるのかが当業者に明らかとなる。
図面において:
図1a〜bは造血単核細胞の培養におけるCD34+造血幹細胞の拡大に対するTEPAキレーターの影響を例示する。臍帯血単核細胞(MNC)がサイトカインの存在下で培養バッグに接種され、TEPAキレーターが補充され(MNC−TEPA)、または、TEPAキレーターが補充されなかった(MNCコントロール)。比較のために、精製されたCD34+細胞が、TEPAキレーターを補充することなく、同様に、サイトカインの存在下で培養バッグに接種された(CD34+培養)。すべての培養物は12週間インキュベーションされ、1週間間隔で、CD34+細胞が、miniMacsカラムを使用して培養物から精製され、計数される。
図2は上記に記載された未処理MNC培養物、TEPA処理MNC培養物およびCD34+細胞培養物におけるCD34+CD38−細胞密度のFACS分析を例示する。
図3は上記に記載された未処理MNC培養物、TEPA処理MNC培養物およびCD34+細胞培養物から1週間間隔で測定されたコロニー形成細胞(CFU)の比較可能な数を表す。
本発明を、本明細書中で、例示のみを目的として添付の図面を参照して記載する。ここでは詳細な図面を参照して、示した個々の事項は本発明の好ましい実施形態の例示および例示的考察のみを目的とし、最も有用と考えられるものを示すことおよび本発明の原理および概念的局面の説明が容易に理解されるために示すことを強調する。これに関して、本発明の基本的理解に必要とされる以上により詳細に本発明の構造細部を示すことを意図せず、図面と共に示した説明により、どのようにして本発明のいくつかの形態を実際に実施することができるのかが当業者に明らかとなる。
図面において:
図1a〜bは造血単核細胞の培養におけるCD34+造血幹細胞の拡大に対するTEPAキレーターの影響を例示する。臍帯血単核細胞(MNC)がサイトカインの存在下で培養バッグに接種され、TEPAキレーターが補充され(MNC−TEPA)、または、TEPAキレーターが補充されなかった(MNCコントロール)。比較のために、精製されたCD34+細胞が、TEPAキレーターを補充することなく、同様に、サイトカインの存在下で培養バッグに接種された(CD34+培養)。すべての培養物は12週間インキュベーションされ、1週間間隔で、CD34+細胞が、miniMacsカラムを使用して培養物から精製され、計数される。
図2は上記に記載された未処理MNC培養物、TEPA処理MNC培養物およびCD34+細胞培養物におけるCD34+CD38−細胞密度のFACS分析を例示する。
図3は上記に記載された未処理MNC培養物、TEPA処理MNC培養物およびCD34+細胞培養物から1週間間隔で測定されたコロニー形成細胞(CFU)の比較可能な数を表す。
本発明は、造血単核細胞に微量画分として存在する造血幹細胞の集団を、幹細胞を最初に濃縮することなく、その一方で同時に、造血幹細胞の分化を実質的に阻害しながらエクスビボ拡大する方法に関する。本発明は、幹細胞について造血単核細胞を事前に濃縮することなく、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、幹細胞の供給源としての造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を使用して、造血幹細胞のエクスビボ拡大された集団を効率的に提供するために使用することができる。本発明の造血幹細胞の拡大された集団は、例えば、造血細胞の移植において、細胞遺伝子治療のための遺伝子操作に好適な幹細胞を作製することにおいて、ならびに、さらなる適用、例えば、限定されないが、養子免疫療法、インビボでのシス分化状況およびトランス分化状況における幹細胞の埋込み、ならびに、シス分化状況およびトランス分化状況におけるエクスビボ組織工学などにおいて使用することができる。
本発明の方法では、上記で記載された造血幹細胞集団のエクスビボ拡大を誘導し、それにより、造血幹細胞のエクスビボ拡大のための効率的で、簡略化され、かつ、それにもかかわらず、万能的な技術を提供するために、CD38の発現および/または活性を妨げ、かつ/ならびに細胞内の銅含有量を妨げる様々な分子(これはまた本明細書中では薬剤として示される)が利用される。
本発明の原理および操作は、図面ならびに付随する説明および実施例を参照してさらに良く理解することができる。
本発明の少なくとも1つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の記載に示されるか、または実施例の節において例示される構成要素の組み立ておよび構成の細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられている表現法および用語法は説明目的のためであり、限定であるとして見なすべきでないことを理解しなければならない。
本明細書中上記で議論されたように、国際特許出願公開WO99/40783、同WO00/18885、および、Peled他、Brit.J.Haematol.、116:655、2002では、細胞の銅が、造血前駆細胞の自己再生と分化との間のバランスを調節することに関与していることが教示される。これらの参考文献の教示によれば、銅と結合することができる遷移金属キレーター(例えば、線状ポリアミンのテトラエチレンペンタミンなど)を早期作用サイトカインの存在下でCD34+細胞培養物に添加することにより、銅含有量が30%減少し、長期にわたるCFUおよびCD34+細胞の拡大に関して長期培養物の継続期間が長くなった。従って、これらの参考文献では、遷移金属キレーター(特に銅キレーター)の存在下でのエクスビボで幹細胞集団を拡大する方法が教示され、さらには、得られた拡大された幹細胞集団の様々な適用における使用が教示される。
国際特許出願PCT/IL03/00062には、銅キレート、すなわち、銅イオンとの複合体を形成し、そしてまた、そのような細胞の培養培地に加えられたときには、幹細胞および始原細胞の増殖を促進させ、かつ分化を阻害する銅キレーターが開示される。国際特許出願PCT/IL03/00062の教示によれば、これらの知見は、幹細胞および始原細胞の増殖および分化に対する銅キレートのこの作用が、細胞の銅含有量だけに関連せず、むしろ、さらなる調節経路に関連することを示唆している。
国際特許出願PCT/IL03/00064および米国仮特許出願第60/452545号(これらは、本明細書中に十分に示されているかのように参照により組み込まれる)には、CD38の発現および/または活性を妨げることができる一連の分子により、幹細胞の分化プロセスが抑制され、また、16週間〜18週間までの期間ではあるが、活発な細胞増殖および細胞拡大(再生)の段階がエクスビボで可逆的な様式で刺激され、かつ長くなることが開示される。従って、これらの参考文献は、幹細胞集団をエクスビボで拡大する方法であって、CD38の発現をダウンレギュレーションする薬剤、またはCD38の活性を阻害する薬剤のいずれかを幹細胞の培養培地に加えることを伴う方法を教示している。従って、国際特許出願PCT/IL03/00064および米国仮特許出願第60/452545号に開示された方法では、様々な分子が用いられており、例えば、RARスーパーファミリーおよびRXRスーパーファミリーのレチノイン酸受容体アンタゴニスト;ビタミンD受容体アンタゴニスト;抗CD38、抗レチノイン酸受容体、抗レチノイドX受容体、抗ビタミンD受容体などの抗体をコードするポリヌクレオチド;これらの受容体をコードする内因性ポリヌクレオチドの分解を生じさせるために向けられたポリヌクレオチド;PI3−キナーゼの発現および/または活性を妨げることができる分子;ならびに、ニコチンアミドおよびその関連化合物などのCD38阻害剤などが用いられている。
従って、国際特許出願公開WO99/40783、同WO00/18885、国際特許出願PCT/IL03/00064および米国仮特許出願第60/452545号はすべて、幹細胞集団のエクスビボ拡大のための方法における、幹細胞(特に造血幹細胞)の自己再生と分化との間のバランスを、異なった経路および/または機構を介して調節する様々な分子の使用を教示している。しかしながら、別途示されない限り、これらの分子による幹細胞の自己再生および分化の調節は、これらの参考文献の教示によれば、培養された細胞が幹細胞および/または前駆細胞について最初に濃縮されたときに得られ、従って、当該分野における現在の他の技術と一致して、予備的な幹細胞濃縮を必要とする。
本発明を実施に移しているとき、驚くべきことに、そして予想外にも、細胞の供給源が単核血液細胞の完全な画分(すなわち、濃縮されてない幹細胞)を含むとき、銅キレーター、銅キレートおよびレチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストなどの分子が造血幹細胞の分化を抑制し、かつ、造血幹細胞の増殖を刺激し、その増殖が長くなることが発見された。
本明細書中上記の背景の節で記載されたように、非常に好都合ではあるが、現時点では、濃縮されていない幹細胞を拡大するための技術は開示されていない。従って、事前の幹細胞濃縮を要しない、造血幹細胞集団をエクスビボ拡大する方法を伴う本明細書中に示され、かつ例示される技術は、エクスビボ拡大された造血幹細胞集団を得る効率的で、簡略された費用効果的な方法を規定する。本明細書中に示された技術によって得られる拡大された造血幹細胞集団は、様々な適用において使用することができ、いくつかが下記に列挙される。
造血細胞の移植:造血細胞の移植は、種々の遺伝病または悪性疾患に最適な治療となりつつある。初期の移植手順は骨髄(BM)集団全体を使用していたが、最近では、幹細胞(CD34+細胞)を富化させたより顕著な特性を有する集団が使用されている(Van Epps DE,et al.Harvesting,characterization,and culture of CD34+ cells from human bone marrow, peripheral blood,and cord blood.Blood Cells 20:411,1994)。骨髄に加えて、このような細胞は、末梢血(PB)および新生児臍帯血(CB)などの他の供給源から得ることもできる(Emerson SG.Ex−vivo expansion of hematopoietic precursors,progenitors,and stem cells:The next generation of cellular therapeutics.Blood 87:3082,1996)。BMと比較して、PB細胞の移植により、汎血球減少の期間が短くなり、感染および出血のリスクが低くなる(Brugger W,et al.Reconstitution of hematopoiesis after high−dose chematotherapy by autologous progenitor cells generated in−vivo.N Engl J Med 333:283,1995;Williams SF,et al.Selection and expansion of peripheral blood CD34+ cells in autologous stem cell transplantation for breast cancer.Blood 87:1687,1996;Zimmerman RM,et al.Large−scale selection of CD34+ peripheral blood progenitors and expansion of neutrophil precursors for clinical applications.J Heamatotherapy 5:247,1996)。
移植にPBを使用するさらなる利点は、その利用しやすさである。PBの移植を制限する要因は、循環している多能性幹細胞/先祖細胞数が少ないことである。
移植に十分なPB由来の幹細胞を得るためには、これらの細胞を、化学療法およびサイトカインでの治療による骨髄から循環へのその動員後に、ロイコフォレシスを繰り返すことによって「採取」する(Brugger W,et al.Reconstitution of hematopoiesis after high−dose chematotherapy by autologous progenitor cells generated in−vivo.N Engl J Med 333:283,1995;Williams SF,et al.Selection and expansion of peripheral blood CD34+ cells in autologous stem cell transplantation for breast cancer.Blood 87:1687,1996)。このような処置は、正常なドナーには明らかに適切ではない。
移植へのエクスビボで拡大した幹細胞の使用は以下の利点を有している(Koller MR,Emerson SG,Palsson BO.Large−scale expansion of human stem and progenitor cells from bone marrow mononuclear cells in continuous perfusion cultures.Blood 82:378,1993;Lebkowski JS,et al.Rapid isolation and serum−free expansion of human CD34+ cells.Blood Cells 20:404,1994)。
成体造血系の再構成に必要な血液量を減少させ、動員およびロイコフォレシスの必要性を回避することができる(Brugger W,et al.N Engl J Med 333:283,1995)。
将来使用する可能性のために少数のPBまたはCB幹細胞を保存することができる。
悪性疾患のレシピエントの自己移植の場合には、自己輸液への腫瘍細胞の混入が、多くの場合、疾患の再発の一因となる(Brugger W,et al.N Engl J Med 333:283,1995)。CD34+幹細胞を選択し拡大させることにより、最終的な移植片中の腫瘍細胞の負荷量が減少する。
培養によりTリンパ球が有意に減少し、これは移植片対宿主病の軽減のための同種異系移植の状況に有用であり得る。
臨床試験は、少数のPB CD34+細胞に由来するエクスビボで拡大させた細胞の移植により、高用量の化学療法で処置したレシピエントの造血を回復させることができることが示されるにもかかわらず、結果は依然としてこれらの培養細胞の長期間にわたるインビボ造血能力について結論を得ていない(Brugger W,et al.N Engl J Med 333:283,1995;Williams SF,et al.Blood 87:1687,1996)。
移植の成功のためには、血球減少期間の短縮ならびに長期間の植え付けが重大である。移植片に中期および後期先祖(前駆)細胞を含めることにより、ドナー由来の成熟細胞の産生が促進され、それにより血球減少期間を短縮することができる。したがって、エクスビボで拡大させた細胞には、幹細胞に加えて、短期間での回復および造血の長期間にわたる修復を最適にするためのより分化した先祖細胞が含まれることが重要である。幹細胞の拡大を同時に生じる、中期および後期先祖細胞(特に、好中球および巨核球系統に方向付けられたもの)の拡大はこの目的に役立つはずである(Sandstrom CE,et al.Effects of CD34+ cell selection and perfusion on ex−vivo expansion of peripheral blood mononuclear cells.Blood 86:958,1995)。
このような培養物は、骨髄が完全に取り除かれたレシピエントの造血の回復、さらには従来の放射線治療および化学療法後のレシピエントの骨髄回復を早めるための支援手段の獲得に有用であり得る。
稀な細胞における遺伝的欠損の出生前診断:出生前診断は、妊婦由来の子宮内の胚細胞の採取および遺伝的欠損の分析を含む。好ましい非侵襲性の胚細胞採取手段としては、末梢母体循環系に浸潤した胚性有核赤血球前駆体の分離が挙げられる。しかし、これらの細胞の量は非常に少ないので、さらに本発明を適用して、分析の前に、本明細書中に記載の方法によりこのような細胞を拡大させる。したがって、本発明は、出生前診断に適用するための胚細胞の拡大手段を提供する。
遺伝子治療:長期間にわたる遺伝子治療の成功のためには、そのゲノム内に安定に組み込まれた導入遺伝子で遺伝子が改変された幹細胞が高頻度で存在することが絶対に必要である。BM組織では、大部分の細胞は、循環している先祖細胞および前駆細胞であり、幹細胞は細胞集団の小さい割合を構成するにすぎず、そのほとんどが休止した循環していない状態にある。ウイルスベースの(例えば、レトロウイルス)ベクターは、宿主ゲノム中に導入遺伝子を組み込むために活発な細胞分裂を必要とする。したがって、新鮮なBM幹細胞への遺伝子導入はあまり効果がない。精製された幹細胞集団を拡大させ、その細胞分裂をエクスビボで調節する能力により、その遺伝子を改変する可能性が増大する(Palmiter RD.Regulation of metallothionein genes by heavy metals appears to be mediated by a zinc−sensitive inhibitor that interacts with a constitutively active transcription factor,MTF−1.Proc Natl Acad Sci USA 91(4):1219−1223,1994)。
養子免疫療法:エクスビボで拡大させ、顕著な特性を有するリンパ系小集団が研究されており、種々の悪性疾患、免疫不全疾患、ウイルス性疾患、および遺伝性疾患の養子免疫療法に使用されてきた(Freedman AR,et al.Generation of T lymphocytes from bone marrow CD34+ cells in−vitro.Nature Medicine 2:46,1996;Heslop HE,et al.Long term restoration of immunity against Epstein−Barr virus infection by adoptive transfer of gene−modified virus−specific T lymphocytes.Nature Medicine 2:551,1996;Protti MP,et al.Particulate naturally processed peptides prime a cytotoxic response against human melanoma in−vitro.Cancer Res 56:1210,1996)。
この処置により、必要な免疫応答が増強されるか、または欠損機能が置き換えられる。このアプローチは、非常に多数の自己のエクスビボで拡大させられた非特異的キラーT細胞を、続いて、エクスビボで拡大させられた特異的腫瘍浸潤性リンパ球を使用して、Rosenberg et al.(Rosenberg SA,et al.Prospective randomized trial of high−dose interleukin−2 alone or in conjunction with lymphokine−activated killer cells for the treatment of patients with advanced cancer.J Natl Cancer Inst 85:622,1993)によって最初に行われた。
同様に、機能的に活性な抗原提示細胞を、サイトカインを維持させた培養物中のCD34+PB細胞の出発集団から成長させることができた。これらの細胞は、インビトロで、自己T細胞に対する可溶性タンパク質抗原を提示することができるので、高用量の免疫治療の投与後に残っている極小さい病変の免疫療法に新しい見通しを与える。同様に、抗原を提示する樹状細胞のエクスビボでの拡大も研究されており、これは現在提案されている技術のさらなる有望な適用である(Bernhard H,et al. Generation of immunostimulatory dendritic cells from human CD34+ hematopoietic progenitor cells of the bone marrow and peripheral blood.Cancer Res 10:99,1995;Fisch P,et al.Generation of antigen−presenting cells for soluble protein antigens ex−vivo from peripheral blood CD34+ hematopoietic progenitor cells in cancer patients.Eur J Immunol 26:595,1996;Siena S,et al.Massive ex−vivo generation of functional dendritic cells from mobilized CD34+ bloodprogenitors for anticancer therapy.Expt Hematol 23:1463,1996)。
本明細書中上記で簡単に議論され、さらには国際特許出願公開WO99/40783、同WO00/18885、国際特許出願PCT/IL03/00064および米国仮特許出願第60/452545号に詳しく記載されるように、銅キレーター、銅キレートおよびレチノイド受容体アンタゴニストはそれぞれが、幹細胞の自己再生を、異なる経路を介して調節し、これにより、幹細胞の低下した分化および延長された増殖を生じさせる種々の細胞事象をもたらす。従って、これらの分子は、混合造血細胞集団に存在する造血幹細胞集団を拡大する作用を誘導することができる広範囲の様々な分子を表している。
従って、本発明の1つの局面によれば、造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時に、CD38の発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することによって達成される。
本明細書中で使用される表現「造血単核細胞」は、血液サンプルに存在する白血球の全レパートリーを示す。健康なヒトにおいて、白血球は、造血系の方向づけられた細胞および分化した細胞の混合物(典型的には、99%を越える単核細胞が方向づけられた細胞である)を含み、これには、例えば、方向づけられた始原細胞、CD34+CD33+(骨髄系の方向づけられた細胞)、CD34+CD3+(リンパ系の方向づけられた細胞)、CD34+CD41+(巨核球系の方向づけられた細胞)、および分化した細胞、すなわち、CD34−CD33+(骨髄系細胞、例えば、顆粒球および単球など)、CD34−CD3+、CD34−CD19+(それぞれ、T細胞およびB細胞)、CD34−CD41+(巨核球)、ならびに造血幹細胞および初期始原細胞、例えば、CD34+Lineage陰性(Lin−)、CD34−Lineage陰性CD34+CD38−(典型的には1%未満)が含まれる。
表現「造血系の方向づけられた(committed)細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞」は、白血球画分の任意の部分を記述するために本明細書中では使用され、この場合、細胞の大部分は造血系の方向づけられた細胞であり、その一方で、細胞の少数部分は造血幹細胞および造血前駆細胞である。これらの用語は本明細書中下記においてさらに定義される。
造血単核細胞は、典型的には、血液サンプルをFicoll−Hypaque層に載せ、密度勾配遠心分離後、Ficoll−Hypaqueと血清との間に存在する境界層を集めることによって血液サンプルから得られ、この場合、そのような境界層は、本質的にはすべてが、血液サンプルに存在する白血球からなる。
本明細書中で使用される表現「造血系の方向づけられた細胞」は、特定の造血細胞に方向づけられ、従って、生理学的条件のもとで、実質的にはこの特定の造血系譜にだけ発達することができる分化した造血細胞を示す。
本明細書中で使用される表現「造血幹細胞」は、正しい増殖条件が与えられた場合、血液に存在する任意の細胞系譜に発達することができる多能性の造血細胞を示す。本明細書中で使用されるこの表現は、血液における細胞集団を生じさせる元となる最も初期の再生可能な造血細胞集団(例えば、CD34−/AC133+細胞、CD34−/AC133−/Lineage−細胞、CD34+/AC133+細胞)、および、幾分より分化しているが、未だ拘束されておらず、容易に逆戻りして、最も初期の再生可能な造血細胞集団の一部になることができる非常に初期の造血前駆細胞(例えば、CD34+細胞、特に、CD34+CD38−細胞)の両方を示す。
通常のヒトでは、造血系の多能性幹細胞および方向づけられた始原細胞のほとんどがCD34+である。大部分の細胞がCD34+CD38+であり、少数の細胞(10%未満)がCD34+CD38−である。
CD34+CD38−幹細胞画分は、自己再生および多系譜分化が可能である最も未熟な造血細胞であることが確認されている。この画分は、より長期にわたる培養を開始させる細胞(LTC−IC)のプレCFUを含有し、CD34+CD38+細胞画分と比較して、幹細胞のより長い維持と、サイトカインに対する遅れた増殖応答とを示す。
現在、造血幹細胞は、上記で記載されたように密度差遠心分離により得られる造血単核細胞をさらに濃縮することによって得られている。このさらなる濃縮プロセスは、典型的には、免疫磁石分離またはFACSなどの免疫分離によって行われ、造血幹細胞について濃縮された細胞画分をもたらしている。
従って、造血単核細胞を、造血幹細胞の拡大された集団を得るための直接の供給源として使用することにより、拡大前の幹細胞濃縮が必要であることが回避され、それにより、プロセスが効率および費用の両方に関して実質的に簡略化される。
本明細書中で使用される場合は、用語「阻害」は、減速、減少、遅延、防止、または廃止をいう。
本明細書中で使用される場合は、用語「分化」は、発達の間の比較的一般化または特殊化した変化をいう。種々の系統の細胞分化は、十分に報告されたプロセスであり、本明細書中でさらに説明する必要はない。本明細書中で使用される場合は、用語「分化」は、多くの場合に細胞分裂に関与しているが、機能するための特定の細胞型へと成熟し、次いで例えばプログラムされた細胞死によって死滅するプロセスである、成熟とは異なる。
句「細胞の拡大」は、実質的に細胞分化を欠く細胞増殖プロセスを説明するために本明細書中で使用する。したがって、拡大される細胞は、その細胞再生特性を維持し、多くの場合は、本明細書中で再生可能な細胞(例えば、再生可能な幹細胞)をいう。
従って、造血幹細胞のための供給源として造血単核細胞を使用する造血幹細胞の拡大は、本発明によって教示されるように、単核細胞に存在する造血幹細胞および造血前駆細胞からなる(1%未満の)微量画分を、拡大後に、造血細胞集団だけではないが、少なくとも主画分に変換することをもたらし、それにより、幹細胞拡大の経過途中において、方向づけられた細胞が実質的に希釈され、かつ/または死滅する。
本明細書中で使用される場合は、用語「エクスビボ」は、生きた生物から細胞を取り出し、生物外(例えば、試験管内)で増殖させるプロセスをいう。しかし、本明細書中で使用される場合は、用語「エクスビボ」は、種々の細胞株(例えば、HL−60、MEL、HeLaなど)などのインビボでのみ増殖することが公知の細胞を培養するプロセスについては言わない。言い換えれば、本発明によってエクスビボで拡大された細胞は、これらが最終的に分化するという点で、細胞株に転換していない。
エクスビボでの細胞増殖のための条件をエクスビボで増殖させた細胞に与えることは、栄養素、好ましくは1つ以上のサイトカイン(以下にさらに詳述する)を細胞にあてがうことを含む。
上記のように、造血単核細胞をエクスビボで増殖させる条件での造血単核細胞の処理と同時に、CD38の発現および/または活性を低下させるために細胞を短期間または長期間処理する。
本発明の1つの実施形態では、CD38活性を阻害する薬剤(すなわち、CD38インヒビター)を細胞に与えることによって、CD38活性を低下させる。
本明細書中で使用される場合は、「CD38インヒビター」は、幹細胞中でCD38活性をダウンレギュレート(下方制御)または抑制することができる薬剤をいう。
本発明のこの態様のCD38インヒビターは、CD38内因性活性を阻害する「直接的インヒビター」またはCD38シグナル伝達成分(例えば、cADPRおよびリアノジンシグナル伝達経路)またはCD38活性に影響を受ける他のシグナル伝達経路の活性または発現を阻害する「間接的インヒビター」であり得る。
本発明のこの態様の現在公知の実施形態によれば、ニコチンアミドは好ましいCD38インヒビターである。
したがって、1つの実施形態では、本発明のこの態様による方法を、ニコチンアミド自体、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物のいずれかを造血単核細胞に与えることによって行う。
本明細書中で使用される場合は、句「ニコチンアミドアナログ」は、ニコチンアミドと同様に作用することが公知の任意の分子をいう。ニコチンアミドアナログの代表例には、ベンズアミド、ニコチンチオアミド(ニコチンアミドのチオールアナログ)、ニコチン酸、およびα−アミノ−3−インドールプロピオン酸が含まれるが、これらに限定されない。
句「ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体」は、ニコチンアミド自体の、またはニコチンアミドのアナログの任意の構造誘導体をいう。このような誘導体の例には、置換ベンズアミド、置換ニコチンアミド、およびニコチンチオアミド、およびN置換ニコチンアミドおよびニコチンチオアミドが含まれるが、これらに限定されない。
句「ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物」は、ニコチンアミドまたはそのアナログ由来の生成物(例えば、NAD、NADH、およびNADPHなど)をいう。
あるいは、本発明のこの態様のCD38インヒビターは、例えばCD38触媒ドメインに結合することによってCD38触媒活性を阻害する活性な中和抗体であり得る。それにもかかわらず、CD38が細胞内タンパク質であるので、原形質膜を介して送達することができるインヒビターの使用手段がとられることが認識される。これに関して、Fabフラグメント(以下に記載)などの断片化抗体を使用することが好ましい。
本発明で使用される、用語「抗体」には、完全な分子ならびにマクロファージに結合することができるその機能的フラグメント(Fab、F(ab’)2、およびFvなど)が含まれる。これらの機能的抗体フラグメントを以下のように定義する:
Fab:抗体分子の1価の抗原結合フラグメントを含み、完全な軽鎖および1つの重鎖の一部を得るために酵素パパインでの完全な抗体の消化によって産生される、フラグメント;
Fab’:完全な軽鎖および重鎖の一部を得るためにペプシンでの完全な抗体の処理およびその後の還元によって得ることができる抗体分子のフラグメント;抗体分子あたり2つのFab’フラグメントが得られる;
(Fab’)2:その後に還元することなく酵素ペプシンでの完全な抗体の処理によって得ることができる抗体のフラグメント;(Fab’)2は、2つのジスルフィド結合により互いに結合した2つのFab’フラグメントの二量体である;
Fv:2つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される;および
単鎖抗体(「SCA」):適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む、遺伝子融合された1本鎖分子としての遺伝子操作された分子。
Fab:抗体分子の1価の抗原結合フラグメントを含み、完全な軽鎖および1つの重鎖の一部を得るために酵素パパインでの完全な抗体の消化によって産生される、フラグメント;
Fab’:完全な軽鎖および重鎖の一部を得るためにペプシンでの完全な抗体の処理およびその後の還元によって得ることができる抗体分子のフラグメント;抗体分子あたり2つのFab’フラグメントが得られる;
(Fab’)2:その後に還元することなく酵素ペプシンでの完全な抗体の処理によって得ることができる抗体のフラグメント;(Fab’)2は、2つのジスルフィド結合により互いに結合した2つのFab’フラグメントの二量体である;
Fv:2つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される;および
単鎖抗体(「SCA」):適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む、遺伝子融合された1本鎖分子としての遺伝子操作された分子。
これらのフラグメントの作製方法は、当該分野で公知である(例えば、Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988(本明細書中で参考として援用されている)を参照のこと)。
本発明の抗体フラグメントを、E.coliまたは哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系)でフラグメントをコードするDNAを発現させることによって調製することができる。
従来の方法による完全な抗体のペプシンまたはパパイン消化によって、抗体フラグメントを得ることができる。例えば、F(ab’)2と呼ばれる5Sフラグメントを得るためのペプシンでの抗体の酵素分解によって抗体フラグメントを産生することができる。チオール還元剤、および必要に応じて、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基をブロックする基を使用してこのフラグメントをさらに切断して、1価の3.5SFab’フラグメント産生することができる。あるいは、ペプシンを使用した酵素切断により、2つの1価のFab’フラグメントおよびFcフラグメントを直接産生する。これらの方法は、例えば、Goldenberg、米国特許第4036945号、および同第4331647号ならびにこれらに記載の参考文献(これらの特許は、その全体が本明細書中で参考として援用されている)によって記載されている。Porter,R.R.,Biochem.J.,73:119−126,1959もまた参照のこと。フラグメントが完全な抗体によって認識される抗原に結合する限りは、1価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素技術、化学的技術、または遺伝子技術などの抗体を切断するための他の方法を使用することもできる。
Fvフラグメントは、VH鎖およびVL鎖の結合を含む。Inbar et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 69:2659−62,1972に記載のように、この結合は非共有結合であり得る。あるいは、可変鎖は、分子内ジスルフィド結合によって結合するか、グルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋することができる。好ましくは、Fvフラグメントは、ペプチド結合によって連結したVH鎖およびVL鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質(sFv)を、オリゴヌクレオチドによって連結されたVHおよびVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子の構築によって調製する。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、その後E.coliなどの宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単鎖ポリペプチドを合成する。sFvの産生方法は、例えば、Whitlow and Filpula,Methods,2:97−105,1991;Bird et al.,Science 242:423−426,1998;Pack et al.,Bio/Technology 11:1271−77,1993;and Ladner et al.,米国特許第4946778号(その全体が本明細書中で参考として援用されている)によって記載されている。
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。CDRペプチド(「最小認識単位」)を、目的の抗体のCDRをコードする遺伝子の構築によって得ることができる。このような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用して調製する。例えば、Larrick and Fry,Methods,2:106−10,1991を参照のこと。
非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化形態は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むそのフラグメント(Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、または抗体の他の抗原結合配列など)のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域(CDR)を形成する残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどのヒト以外の種(ドナー抗体)のCDR由来の残基に置換されたヒト免疫グロブリンレシピエント抗体が含まれる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基に置換する。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体、取り込まれたCDR、またはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、全てまたは実質的に全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である、実質的に全て、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域(Fc)(典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域)の少なくとも一部を含む(Jones et al.,Nature,321:522−525(1986);Riechmann et al.,Nature,332:323−329(1988);and Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593−596(1992))。
非ヒト抗体のヒト化方法は、当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源由来のアミノ酸残基に導入された1つ以上のアミノ酸残基を有する。典型的には導入可変ドメインから採取されるこれらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば導入残基といわれる。本質的に、げっ歯類CDRまたはCDR配列の対応するヒト抗体配列との置換によるWinter and co−workersの方法(Jones et al.,Nature,321:522−525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323−327(1988);Verhoeyen et al.,Science,239:1534−1536(1988))にしたがってヒト化を行うことができる。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に完全ではないヒト可変ドメインがヒト以外の種由来の対応配列に置換されているキメラ抗体である(米国特許第4816567号)。実際には、ヒト化抗体は一般に、いくつかのCDR残基およびおそらくいくつかのFR残基がげっ歯類抗体中の類似の部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
当該分野で公知の種々の技術(ファージディスプレイライブラリーを含む)を使用してヒト抗体を産生することもできる(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991))。ヒトモノクローナル抗体の調製のためのCole et al.and Boerner et al.の技術も利用可能である(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)およびBoerner et al.,J.Immunol.,147(1):86−95(1991))。同様に、トランスジェニック動物(例えば、外因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているマウス)へのヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によってヒトを作製することができる。チャレンジにより、ヒト抗体産生が認められる。これは、遺伝子の再配置、構築、および抗体レパートリーを含むあらゆる点でヒトで認められる非常に類似している。このアプローチは、例えば、米国特許第5545807号、同第5545806号、同第5569825号、同第5625126号、同第5633425号、同第5661016号、および以下の科学刊行物:Marks et al.,Bio/Technology 10,779−783(1992);Lonberg et al.,Nature 368 856−859(1994);Morrison,Nature 368 812−13(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14,845−51(1996);Neuberger,Nature Biotechnology 14,826(1996);Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13 65−93(1995)に記載されている。
あるいは、本発明のこの態様による方法を、エクスビボで培養した造血単核細胞にCD38発現をダウンレギュレートする薬剤を与えることによって行うことができる。
CD38発現をダウンレギュレートする薬剤とは、mRNAレベルまたはタンパク質レベルのいずれかでCD38合成(遅延)または分解(加速)に影響を与える任意の薬剤をいう。例えば、本発明のこの態様にしたがって、CD38発現をダウンレギュレートするようにデザインした干渉性低分子ポリヌクレオチドを使用することができる。
CD38発現をダウンレギュレートすることができる干渉性低分子ヌクレオチドの例は、干渉性低分子RNAまたはsiRNA(例えば、Munshi et al.(Munshi CB,Graeff R,Lee HC,J Biol Chem 2002 Dec 20;277(51):49453−8)によって記載された、以前に記載されたRNA干渉(RNAi)機構(Hutvagner and Zamore(2002)Curr.Opin.Genetics and Development 12:225−232)によってmRNAの配列特異的分解を指示する、二重鎖オリゴヌクレオチドを含むモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド)である。
本明細書中で使用される場合は、句「二重鎖オリゴヌクレオチド」は、1つの自己相補性核酸鎖または少なくとも2つの相補性核酸鎖のいずれかによって形成されたオリゴヌクレオチド構造またはその模倣物をいう。本発明の「二重鎖オリゴヌクレオチド」は、二本鎖RNA(dsRNA)、DNA−RNAハイブリッド、一本鎖RNA(ssRNA)、単離RNA(すなわち、部分精製されたRNA(本質的に純粋なRNA))、合成RNA、および組換えRNAから構成され得る。
好ましくは、本発明の特異的干渉性低分子二重鎖オリゴヌクレオチドは、主にリボ核酸から構成されるオリゴリボヌクレオチドである。
RNA干渉を媒介することができる二重鎖オリゴヌクレオチドの作製説明書は、www.ambion.comに記載されている。
したがって、本発明の干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、RNAi分子(干渉性RNA分子)であり得る。
あるいは、干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、以下にさらに記載されているCD38特異的アンチセンス分子またはリボザイム分子などのオリゴヌクレオチドであり得る。
本発明の教示にしたがってデザインしたオリゴヌクレオチドを、当該分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド合成方法(酵素合成または固相合成など)にしたがって作製することができる。固相合成を実施するための装置および試薬は、例えば、Applied Biosystemsから市販されている。このような合成のための任意の他の手段も使用することができる;オリゴヌクレオチドの実際の合成は、十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明のこの実施形態で使用したオリゴヌクレオチドは、10〜約200塩基、好ましくは15〜150塩基、より好ましくは20〜100塩基、最も好ましくは20〜50塩基の範囲から選択される長さを有するものである。
本発明のオリゴヌクレオチドは、3’〜5’ホスホジエステル結合で結合したプリン塩基およびピリミジン塩基からなる複素環式ヌクレオシドを含み得る。
好ましくは、使用するオリゴヌクレオチドは、以下で広く説明するように、骨格、ヌクレオシド間結合、または塩基のいずれかで修飾されたものである。このような修飾は、しばしばオリゴヌクレオチド取り込みおよび細胞内条件に対する抵抗性を促進させることができる。
本発明のこの態様で有用な好ましいオリゴヌクレオチドの特定の例には、修飾された骨格または非天然のヌクレオシド内結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドとして、米国特許第4687808号、同第4469863号、同第4476301号、同第5023243号、同第5177196号、同第5188897号、同第5264423号、同第5276019号、同第5278302号、同第5286717号、同第5321131号、同第5399676号、同第5405939号、同第5453496号、同第5455233号、同第5466677号、同第5476925号、同第5519126号、同第5536821号、同第5541306号、同第5550111号、同第5563253号、同第5571799号、同第5587361号、および同第5625050号に開示の骨格中にリン原子を保持するものが挙げられる。
好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、通常の3’−5’結合を有するホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルのホスホネート(3’アルキルホスホネートおよびキラルなホスホネートを含む)、ホスフィナート、ホスホラミデート(3’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネートを含む)、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェート、これらの2’−5’結合アナログ、およびヌクレオシド単位の隣接対が3’−5’から5’−3’または2’−5’から5’−2’で結合している逆の極性を有するものが挙げられる。種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も使用することができる。
あるいは、その中にリン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド内結合、混合へテロ原子、およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド内結合、または1つ以上の短鎖へテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド内結合によって形成された骨格を有する。これらには、モルホリノ結合(一部がヌクレオシドの糖部分から形成される);シロキサン骨格;スルフィド、スルフォキシド、およびスルホン骨格;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;アルケン含有骨格;スルファマート骨格;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格;スルホネートおよびスルホンアミド骨格;アミド骨格;および混合N、O、S、およびCH2成分を有する他の骨格を有するものが含まれ、これらは、米国特許第5034506号、同第5166315号、同第5185444号、同第5214134号、同第5216141号、同第5235033号、同第5264562号、同第5264564号、同第5405938号、同第5434257号、同第5466677号、同第5470967号、同第5489677号、同第5541307号、同第5561225号、同第5596086号、同第5602240号、同第5610289号、同第5602240号、同第5608046語、同第5610289号、同第5618704号、同第5623070号、同第5663312号、同第5633360号、同第5677437号、同第5677439号に開示されている。
本発明で使用することができる他のオリゴヌクレオチドは、糖およびヌクレオシド内結合の両方が修飾されたものである(すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が新規の基に置換されている)。適切なポリヌクレオチド標的との相補性のために塩基単位は維持される。このようなオリゴヌクレオチド模倣物の例には、ペプチド核酸(PNA)が含まれる。PNAオリゴヌクレオチドは、糖−骨格がアミド含有骨格(特に、アミノエチルグリシン骨格)に置換されたオリゴヌクレオチドをいう。塩基が保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する米国特許には、米国特許第5539082号、同第5714331号および同第5719262号(それぞれ本明細書中で参考として援用されている)が含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用することができる他の骨格修飾は、米国特許第6303374号に開示されている。
本発明のオリゴヌクレオチドには、塩基の修飾または置換も含み得る。本明細書中で使用される場合は、「非修飾」または「天然の」塩基には、プリン塩基であるアデニン(A)およびグアニン(G)ならびにピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)、およびウラシル(U)が含まれる。修飾塩基には、5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2−プロピルおよび他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミン、および2−チオシトシン、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピルウラシルおよびシトシン、6−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、5−ウラシル(偽ウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシル、および他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニンおよび3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニンなどの他の合成および天然の塩基が含まれるが、これらに限定されない。さらなる塩基としては、米国特許第3687808号に開示の塩基、The Concise Encycloipedia Of Polymer Science And Engineering,pages858−859,Kroschwitz,J.I.ed.John Wiley & Sons,1990に開示の塩基、Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613に開示の塩基、およびSanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,pages289−302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.ed.,CRC Press,1993に開示されている塩基を挙げることができる。このような塩基は、特に、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性の増大に有用である。これらには、5置換ピリミジン、6−アザピリミジン、およびN−2、N−6、およびO−6置換プリン(2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシル、および5−プロピニルシトシンが含まれる)が含まれる。5−メチルシトシン置換により、核酸二重鎖の安定性が0.6〜1.2℃増大することが示されており(Sanghvi YS et al.(1993)Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton 276−278)、これが現在好ましい塩基置換であり、特に2’−O−メトキシエチル糖修飾と組み合わせるとさらに好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増大させる1つ以上の部分もしくは抱合体へのオリゴヌクレオチドの化学結合を含む。このような部分には、米国特許第6303374号に開示のコレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル(例えば、ヘキシル−S−トリチルチオール)、チオコレステロール、脂肪族鎖(例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基)、リン脂質(例えば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロール)またはトリエチルアンモニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミン、またはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。
所与のオリゴヌクレオチド分子中の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、1つの化合物または1つのオリゴヌクレオチド内の1つのヌクレオシドに1つ以上の上記修飾を組み込むことができる。
上記のように、本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくはキメラ分子であるアンチセンス分子である。「キメラアンチセンス分子」は、それぞれが少なくとも1つのヌクレオチドから構成される2つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解耐性の増大、細胞取り込みの増大、および/または標的ポリヌクレオチドに対する結合親和性の増大を付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾された少なくとも1つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素の基質として作用することができる。このような酵素の例には、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼであるRNアーゼHが含まれる。したがって、RNアーゼHの活性化により、RNA標的が切断され、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率が非常に増大する。したがって、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合、同一の標的領域とハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して短いオリゴヌクレオチドを使用して類似の結果をしばしば得ることができる。必要に応じて、当該分野で公知の核酸ハイブリッド形成技術と組み合わせたゲル電気泳動によってRNA標的の切断を日常的に検出することができる。
上記のように2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの複合構造(修飾オリゴヌクレオチド)として本発明のキメラアンチセンス分子を形成することができる。このようなハイブリッド酵素の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第5013830号、同第5149797号、同第5220007号、同第5256775号、同第5366878号、同第5403711号、同第5491133号、同第5565350号、同第5623065号、同第5652355号、同第5652356号、および同第5700922号(それぞれ全体が本明細書中で参考として援用されている)が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のオリゴヌクレオチドは、リボザイム配列をさらに含み得る。リボザイムは、mRNAの切断による遺伝子発現の配列特異的阻害のために使用されつつある。いくつかのリボザイム配列を、本発明のオリゴヌクレオチドに融合することができる。これらの配列には、VEGF−R(血管内皮成長因子受容体)の形成を特異的に阻害するANGIOZYME(血管形成経路における重要成分)、およびHEPTAZYME(C型肝炎ウイルス(HCV)RNAを選択的に破壊するようにデザインされたリボザイム)(Rybozyme Pharmaceuticals,Incorporated−WEBホームページ)が含まれるが、これらに限定されない。
あるいは、本発明の干渉性低分子ポリヌクレオチドは、DNAzymeであり得る。
DNAzymeは、一本鎖の触媒性核酸分子である。DNAzymeの一般的なモデル(「10−23」モデル)が提案されている。「10−23」DNAzymeは、それぞれ7から9個のデオキシリボヌクレオチドの2つの基質認識ドメインに隣接した15個のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。このDNAzyme型は、プリン:ピリミジン連結点でその基質RNAを有効に切断することができる(Santoro,S.W.& Joyce,G.F.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 199;DNAzymeの概説については、Khachigian,LM Curr Opin Mol Ther 2002,4:119−21を参照のこと)。
一本鎖および二本鎖標的切断部位を認識する合成された操作DNAzymeの構築および増幅の例は、Joyce et al.に付与された米国特許第6326174号に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に指向する類似のデザインのDNAzymeは、最近、ウロキナーゼ受容体発現を阻害し、インビボで結腸癌細胞転移を首尾よく阻害することが認められた(Itoh et al.,20002,Abstract 409,Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.org)。別の適用では、bcr−ab1癌遺伝子に相補的なDNAzymeは、白血病細胞中での癌遺伝子の発現を首尾よく阻害し、CMLおよびALLの場合には、自己骨髄移植における再発率を低下させた。
あるいは、上記のように、およびPCT/IL03/00064および米国仮特許出願第60/452545号にさらに詳しく記載されるように、レチノイド受容体の活性および/または発現をダウンレギュレートまたは抑制するレチノイド受容体スーパーファミリーインヒビター(例えば、アンタゴニスト、siRNA分子、アンチセンス分子、抗体など)を使用して、CD38発現をダウンレギュレートすることができる。
簡単に述べれば、レチノイン酸受容体(RAR)、レチノイドX受容体(RXR)、およびビタミンD受容体(VDR)などのレチノイド受容体は、細胞の増殖および分化ならびに特にCD38発現の調節に関連する遺伝子発現経路の調節に関与していることが報告されている(Kapil M.,Teresa M.,Taghi M.,Michael A.,Steven C.,Maher A..Involvement of retinoic acid receptor mediated signaling pathway in induction of CD38 cell surface antigen,Blood.1997;89:3607−3614;Ueno H,Kizaki M,Matsushita H,Muto A,Yamato K,Nishihara T,Hida T,Yoshimura H,Koeffler HP,Ikeda Y.A novel retinoic acid receptor(RAR)−selective antagonist inhibits differentiation and apoptosis of HL−60 cells: implications of RAR alpha−mediated signals in myeloid leukemic cells.Leuk Res.1998;22:517−25)。したがって、本発明のCD38発現をダウンレギュレートする好ましい薬剤には、RARアンタゴニスト、RXRアンタゴニスト、およびVDRアンタゴニスト、あるいは、造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるためのアンタゴニストが含まれる。
本明細書中で使用される場合は、用語「アンタゴニスト」は、受容体のアゴニストまたは天然のリガンドの効果を反作用または消滅させる薬剤をいう。このようなアンタゴニストに関するさらなる特徴を以下に詳述する。
さらにあるいは、米国仮特許出願第60/452545号に詳しく記載されるように、CD38発現のダウンレギュレーションを、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(これはまた、PI3−キナーゼとして本明細書中を通して示される)の発現および/または活性をダウンレギュレーションすることによって得ることができる。簡単に記載すると、PI3−キナーゼは、適正な受容体シグナル伝達経路に対する必須因子として、レチノイド受容体スーパーファミリーおよびビタミンD受容体などの様々な核受容体の活性化において非常に重要な機能を果たしており、従って、細胞分化に関与することが報告されている。
従って、PI3−キナーゼの発現および/または活性を妨げる薬剤はまた、本発明によれば、CD38をダウンレギュレーションするための好ましい薬剤である。PI3−キナーゼ活性を阻害する薬剤の代表的な例には、既知のPI3−キナーゼ阻害剤であるウォルトマンニンおよびLY294002、ならびにそれらのアナログ、誘導体および代謝産物が含まれるが、これらに限定されない。PI3−キナーゼ阻害剤のさらなる例が米国特許第5378725号(これは、本明細書中に詳しく示されるかのように参照により組み込まれる)に記載される。本発明に従ってPI3−キナーゼの発現をダウンレギュレーションする薬剤の代表的な例には、CD38の発現をダウンレギュレーションすることに関して本明細書中上記で記載された方法論を使用するポリヌクレオチド(例えば、小さい干渉性のRNA分子、アンチセンスリボザイムおよびDNAザイムなど)、ならびに細胞内抗体が含まれるが、これらに限定されない。
上記の各薬剤は、CD38の発現または活性をそれぞれ低下させることができる。しかし、本発明はまた、これらの薬剤の任意の組み合わせの使用を含むことを目的とする。
以下にさらに記載するように、本発明のタンパク質薬(例えば、抗体)を、これをコードするポリヌクレオチドから発現させ、適切な遺伝子送達媒介物/方法および核酸構築物を使用してエクスビボした培養造血単核細胞に提供することができることが明らかである。
適切な構築物の例には、pcDNA3、pcDNA3.1(+/−)、pGL3、PzeoSV2(+/−)、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto(それぞれ、Invitrogen Co.(www.invitrogen.com)から市販されている)が含まれるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターおよびパッケージング系の例は、Clontech,San Diego,Calif.から販売されているもの(多クローニング部位にクローニングすることができ、導入遺伝子がCMVプロモーターから転写される、Retro−XベクターpLNCXおよびpLXSNが含まれる)である。導入遺伝子が5’LTRプロモーターから転写されるMo−MuLV由来のベクター(pBabeなど)もまた含まれる。
本発明のこの態様にしたがって、造血幹細胞集団をエクスビボで拡大すると同時に幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を、上で詳述するように、RAR、RXR、またはVDRアンタゴニスト、PI3−キナーゼ阻害剤またはニコチンアミドおよびそのアナログなどのCD38インヒビターを使用してタンパク質レベルまたは遺伝子操作技術による発現レベルのいずれかでCD38発現および/または活性を調節し、本発明にしたがって、いくつかの好ましい造血単核細胞の造血幹細胞集団のエクスビボでの拡大方法をさらに提供する。
1つの特定の実施形態では、造血幹細胞集団をエクスビボで拡大すると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を、エクスビボでの細胞増殖のための条件であり、同時に造血幹細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を方向づけられた造血細胞からなる主画分と、造血幹および前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に与える工程と、それにより造血幹細胞集団を拡大させると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程によって行う。
細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDまたはレチノイン酸、レチノイドX、および/またはビタミンD受容体のシグナル伝達に対する応答能力を、例えば、受容体アンタゴニストを含む化学的インヒビターの投与によって低下させることができる。
別の特定の実施形態では、幹細胞集団をエクスビボで拡大すると同時に幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を、エクスビボでの細胞増殖のための条件であって、同時に造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、および/またはビタミンD受容体を含むシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を方向づけられた造血細胞からなる主画分と、造血幹および前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に与える工程と、それにより造血細胞集団を拡大させると同時に造血細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程によって行う。
細胞のレチノイン酸、レチノイドX、および/またはビタミンD受容体のシグナル伝達事象に対する応答能力を低下させることには、細胞の連続的または短いパルス期間で供給するアンタゴニストでの処理を含み、これは、そのそれぞれの同族受容体による細胞シグナル伝達経路の縮小または破壊によって行われる。
PCT/IL01/00064に記載され、例示されるように、開示されたシグナル伝達経路に対する造血細胞の応答能力の低下は可逆的(例えば、本質的の可逆的)である。言い換えれば、本発明のプロトコールを使用して拡大させた細胞は、細胞株とはならない。したがって、このような細胞を十分な拡大後に、分化が誘導される成長条件に供することによって、細胞に対して、エクスビボおよびインビボでのシスおよびトランス分化を含む所望の方向へのエクスビボでの分化を指示することができる。
本明細書中で使用される場合は、「シス分化」は、成体幹細胞が得られた組織への成体幹細胞の分化をいう。例えば、CD34+造血細胞の異なる方向性/成熟血球への分化はシス分化に含まれる。
本明細書中で使用される場合は、「トランス分化」は、成体幹細胞が得られたものとは異なる組織への成体幹細胞の分化をいう。例えば、CD34+造血細胞の異なる組織起源の細胞(例えば、筋細胞)への分化はトランス分化に含まれる。
上記アンタゴニストおよび/または上記受容体およびキナーゼのシグナル伝達経路に対する造血単核細胞の応答能力の低下は、有効量の少なくとも1つのレチノイン酸受容体アンタゴニスト、少なくとも1つのレチノイドX受容体アンタゴニスト、および/または少なくとも1つのビタミンD受容体アンタゴニストの存在下で、好ましくは造血単核細胞の全エクスビボ培養期間の0.1〜50%、好ましくは0.1〜25%、より好ましくは0.1〜15%の期間、または全期間の間、造血単核細胞をエクスビボ培養することによって行われる。これに関して、驚いたことに、アンタゴニストへの最初のパルス曝露が、培養環境からアンタゴニストを除去したずっと後で細胞の拡大を生じるのに十分であることが明らかとなった。
アンタゴニストの最終濃度は、特定の適用に依存してμMまたはmMの範囲であり得る。例えば、約0.1μM〜約100mMの範囲内または約4μM〜約50mMの範囲内、より好ましくは約5μM〜約40mMの範囲内である。
本発明のこのおよび他の局面および実施形態で使用することができるRAR、RXR、およびVDRの多数のアンタゴニストが現在公知である。
かかるレチノイン酸受容体アンタゴニストの代表例は以下のものを含むがこれらに限定されない:AGN194310;AGN109;3−(4−メトキシ−フェニルスルファニル)−3−メチル−酪酸;
6−メトキシ−2,2−ジメチル−チオクロマン−4−オン,2,2−ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イルトリフルオロメタン−スルホネート;
エチル4−((2,2ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート;
エチル4−((2,2ジメチル−4−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−(2H)−チオクロメン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート(41);
チオクロメン−6−イル]−エチニル]−ベンゾエート(イル);
(p−[(E)−2−[3’4’−ジヒドロ−4,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’イル]プロペニル]安息香酸1’1’−ジオキシド;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ブトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−プロポキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ペントキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘキソキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘプトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−オクトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
(2E,4E,6E)−7−(3−t−ブチル−5(1−フェニル−ビニル)−フェニル]−3−メチル−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−{[4,5−3H2]−n−ペントキシ}フェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert.ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸エチルエステル;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert.ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert.ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert.ブチル−2−エトキシフェニル]3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert.ブチル−2−ブチルオキシフェニル]3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
4−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−カルボキシアミド)安息香酸;
(2E,4E)−3−メチル−5−[(1S,2S)−2−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−ナフタレン−2−イル)−シクロプロピル]−ペンタ−2,4−ジエン酸;
p−[(E)−2−[3’,4’−ジヒドロ−4’,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’−イル]プロペニル]安息香酸;
1’,1’−ジオキシド,4−(7,7,10,10−テトラメチル−1−ピリジン−3−イルメチル−4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−1H−ナフト[2,3−g]インドール−3−イル)−安息香酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert.ブチル−2−メトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert.ブチル−2−エトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert.ブチル−2−ヘキシルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert.ブチル−2−オクチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;
4−(5H−2,3(2,5ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;
4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;
4−{[4−(4−エチルフェニル)2,2−ジメチル−(2H)−チオクロメン−6−イル]エチニル}安息香酸;
4−[4−2−メチル−1,2−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−1−イル−フェニルカルバモイル]安息香酸;
4−[4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−7,7,10,10−テトラメチル−1−(3−ピリジルメチル)−アントラ[1,2−b]ピロール−3−イル]安息香酸;
(3−ピリジルメチル)−]5−チアアントラ[2,1−b]ピロール−3−イル)安息香酸;および
(3−ピリジルメチル)−アントラ[2ml−d]ピラゾール−3−イル]安息香酸。
6−メトキシ−2,2−ジメチル−チオクロマン−4−オン,2,2−ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イルトリフルオロメタン−スルホネート;
エチル4−((2,2ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート;
エチル4−((2,2ジメチル−4−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−(2H)−チオクロメン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート(41);
チオクロメン−6−イル]−エチニル]−ベンゾエート(イル);
(p−[(E)−2−[3’4’−ジヒドロ−4,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’イル]プロペニル]安息香酸1’1’−ジオキシド;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ブトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−プロポキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ペントキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘキソキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘプトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−オクトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
(2E,4E,6E)−7−(3−t−ブチル−5(1−フェニル−ビニル)−フェニル]−3−メチル−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−{[4,5−3H2]−n−ペントキシ}フェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert.ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸エチルエステル;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert.ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert.ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert.ブチル−2−エトキシフェニル]3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert.ブチル−2−ブチルオキシフェニル]3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
4−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−カルボキシアミド)安息香酸;
(2E,4E)−3−メチル−5−[(1S,2S)−2−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−ナフタレン−2−イル)−シクロプロピル]−ペンタ−2,4−ジエン酸;
p−[(E)−2−[3’,4’−ジヒドロ−4’,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’−イル]プロペニル]安息香酸;
1’,1’−ジオキシド,4−(7,7,10,10−テトラメチル−1−ピリジン−3−イルメチル−4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−1H−ナフト[2,3−g]インドール−3−イル)−安息香酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert.ブチル−2−メトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert.ブチル−2−エトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert.ブチル−2−ヘキシルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert.ブチル−2−オクチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;
(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;
4−(5H−2,3(2,5ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;
4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;
4−{[4−(4−エチルフェニル)2,2−ジメチル−(2H)−チオクロメン−6−イル]エチニル}安息香酸;
4−[4−2−メチル−1,2−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−1−イル−フェニルカルバモイル]安息香酸;
4−[4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−7,7,10,10−テトラメチル−1−(3−ピリジルメチル)−アントラ[1,2−b]ピロール−3−イル]安息香酸;
(3−ピリジルメチル)−]5−チアアントラ[2,1−b]ピロール−3−イル)安息香酸;および
(3−ピリジルメチル)−アントラ[2ml−d]ピラゾール−3−イル]安息香酸。
かかるレチノイドX受容体アンタゴニストの代表例は以下のものを含むがこれらに限定されない:LGN100572;
1−(3−ヒドロキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;
1−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;
3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エネニトリル;
3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エナール;
(2E,4E,6E)−7−3[−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−2−イル]−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;
4−[3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸;
4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]安息香酸;
4−[1(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]安息香酸;
4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ベンゼネートトラゾール;
2−[1−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エチル]ピリジン−5−カルボン酸;
エチル−2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボキシレート;
5−[1−3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−2−カルボン酸;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;
メチル2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボキシレート;
4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]−N−(4−ヒドロキシフェニル)ベンズアミド;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸ブチルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸プロピルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸シアノイミン;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸アリルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸4−(3−メチルブト−2−エン酸)オキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸1−アミノエチルオキシム;
(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;
4−(5H−2,3(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;および
4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5m。
1−(3−ヒドロキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;
1−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;
3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エネニトリル;
3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エナール;
(2E,4E,6E)−7−3[−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−2−イル]−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;
4−[3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸;
4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]安息香酸;
4−[1(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]安息香酸;
4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ベンゼネートトラゾール;
2−[1−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エチル]ピリジン−5−カルボン酸;
エチル−2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボキシレート;
5−[1−3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−2−カルボン酸;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;
メチル2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボキシレート;
4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]−N−(4−ヒドロキシフェニル)ベンズアミド;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;
2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸ブチルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸プロピルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸シアノイミン;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸アリルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸4−(3−メチルブト−2−エン酸)オキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸1−アミノエチルオキシム;
(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;
4−(5H−2,3(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;および
4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5m。
かかるビタミンD受容体アンタゴニストの代表例は以下のものを含むがこれらに限定されない:1α,25−(OH)−D3−26,23ラクトン;1α,25−ジヒドロキシビタミンD(3);25−カルボン酸エステルZK159222;(23S)−25−デヒドロ−1α−OH−D(3);(23R)−25−デヒドロ−1α−OH−D(3);1β,25(OH)2D3;1β,25(OH)2−3−エピ−D3;(23S)25−デヒドロ−1α(OH)D3−26,23−ラクトン;(23R)25−デヒドロ−1α(OH)D3−26,23−ラクトン;およびブチル−(5Z,7E,22E−(1S,7E,22E−(1S,3R,24R)−1,3,24−トリヒドロキシ−26,27−シクロ−9,10−セココレスタ−5,7,10(19),22−テトラエン−25−カルボキシレート)。
上記に列挙したアンタゴニストは、その各同族受容体に対して高親和性を有することが知られている。しかし、これらの分子を他の受容体に対して活性にすることができる場合もある。
従って別の特定の実施形態では、造血幹細胞集団をエクスビボで拡大すると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を、エクスビボでの細胞増殖のための条件であって、同時に造血単核細胞のPI3−キナーゼを含むシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を方向づけられた造血細胞からなる主画分と、造血幹および前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に与える工程と、それにより造血細胞集団を拡大させると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程によって行う。
別の特定の実施形態では、造血幹細胞集団をエクスビボで拡大すると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を、エクスビボでの細胞増殖のための条件であって、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を含むエクスビボ培養条件を方向づけられた造血細胞からなる主画分と、造血幹および前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に与える工程と、それにより造血幹細胞集団を拡大させると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程によって行う。
さらに別の特定の実施形態では、造血幹細胞集団をエクスビボで拡大すると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を、エクスビボでの細胞増殖のための条件であって、PI3−キナーゼ阻害剤を含むエクスビボ培養条件を方向づけられた造血細胞からなる主画分と、造血幹および前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に与える工程と、それにより造血幹細胞集団を拡大させると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程によって行う。
ニコチンアミドまたはそのアナログ、誘導体、または代謝産物およびPI3−キナーゼ阻害剤の最終濃度は、好ましくは、特定の適用に依存して、mM範囲である。例えば、約0.1mM〜約20mMの範囲内、好ましくは約1mM〜約10mMの範囲内、より好ましくは約5mM〜約10mMの範囲内である。
本明細書中上記に記載されるように、また、下記の実施例の節においてさらに例示されるように、造血単核細胞に存在する造血幹細胞集団の拡大はまた、銅キレーターまたは銅キレートの存在下で達成され得る。国際特許出願公開WO00/18885および国際特許出願PCT/IL03/00062において詳しく議論されているように、銅キレーターまたは銅キレートを細胞培養培地に加えることにより、細胞の銅濃度が影響を受け、これにより、次に、細胞分化に関連するシグナル伝達経路が影響を受ける。国際特許出願公開WO00/18885および国際特許出願PCT/IL03/00062の教示によれば、銅キレートを細胞培養培地に加えることにより、細胞の遊離銅の濃度が、細胞拡大時には実質的に変化しないで維持され、その一方で、銅キレーターを細胞培養培地に加えることにより、銅を利用する際の細胞の能力が低下する。
本明細書中で使用される表現「銅キレーター」は、環を形成するように銅または銅イオンと配位結合することができる少なくとも2つの原子を有するリガンドを示す。銅キレーターは銅イオンを含有せず、すなわち、銅イオンとの錯体を形成していない。キレート化作用に関連するさらなる特徴が、例えば、国際特許出願PCT/IL03/00062に記載される。
本明細書中を通して使用される表現「銅キレート」は、銅イオンとの錯体を形成している、本明細書中上記で定義されるような銅キレーターを示す。
従って、本発明によれば、造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する別の方法が提供される。本発明のこの局面によるこの方法は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、1つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートとを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することによって達成される。
本発明の銅キレートまたは銅キレーターは、多くの場合、銅以外の遷移金属との有機金属錯体を形成することができる。銅以外の金属が、典型的には、細胞に存在し(例えば、亜鉛)、または、治療時に細胞に投与され得る(例えば、白金)ので、他の金属とも相互作用することができる銅キレートまたは銅キレーターは非常に効果的であることが見出された。そのような遷移金属の代表的な例には、限定されないが、亜鉛、コバルト、ニッケル、鉄、パラジウム、白金、ロジウムおよびルテニウムが含まれる。
本発明の銅キレートは、銅イオン(例えば、Cu+1、Cu+2)と、1つまたは複数の銅キレーターとを含む。本発明による好ましい銅キレーターには、ポリアミン分子が含まれ、この場合、ポリアミン分子は、ポリアミンに存在する2つ以上のアミン基を介して銅イオンとの環状錯体を形成することができる。
従って、本発明の種々の局面および実施形態に関連して使用される銅キレートまたは銅キレーターには、好ましくは、ポリアミンキレーター、すなわち、1個〜10個のアミン成分(好ましくは2個〜8個のアミン成分、より好ましくは4個〜6個のアミン成分、最も好ましくは4個のアミン成分)によって置換および/または中断されるポリマー鎖が含まれる。
表現「アミン成分」、表現「アミン基」および単に表現「アミン」は、分子内のその位置に依存して、−NR’R”基または−NR’−基(式中、R’およびR”はそれぞれが独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環であり、これらの用語は本明細書中下記において定義される)を記載するために本明細書中では使用される。
ポリアミンキレーターは、線状ポリアミン、環状ポリアミンまたはそれらの組合わせであり得る。
線状ポリアミンは、本発明によれば、下記の一般式Iを有するポリアミンであり得る:
(式中、mは1〜10の整数である;nは0〜20の整数である;XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖であり、ただし、X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される)。
(式中、mは1〜10の整数である;nは0〜20の整数である;XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖であり、ただし、X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される)。
従って、線状ポリアミンは、本発明によれば、好ましくは、1つまたは複数のアルキレン鎖(式Iにおいて、Am、B1・・・Bn)から構成され、S、OおよびN(式Iにおいて、Y1・・・Yn)などの1つまたは複数のヘテロ原子によって中断され、2つのそのようなヘテロ原子(式Iにおいて、XおよびZ)で終わる。
アルキレン鎖Aは、本明細書中上記に記載されるように、1個〜10個の置換炭素原子または非置換炭素原子を有し、少なくともその一方の端部においてヘテロ原子(例えば、式IにおけるX)に連結する。2つ以上のアルキレン鎖Aが存在する場合(mが2以上である場合)には常に、最初のアルキレン鎖AのみがXに連結する。しかしながら、mは好ましくは1であり、従って、式Iに示される線状ポリアミンは、好ましくは、アルキレン鎖Aを1つだけ含む。
アルキレン鎖Bは、本明細書中上記に記載されるように、1個〜20個の置換炭素原子または非置換炭素原子を含む。アルキレン鎖Bは、その2つの端部において、ヘテロ原子(式Iにおいて、Y1・・・YnおよびZ)に連結する。
式Iに示される好ましい線状ポリアミンは、1個〜20個のアルキレン鎖B(B1・・・Bnとして表される)を含み、この場合、「B1・・・Bn」は、複数のアルキレン鎖B(すなわち、B1、B2、B3、・・・、Bn−1およびBn、ただし、nは0〜20に等しい)を記載するために本明細書中では使用される。これらのアルキレン鎖は同じまたは異なり得る。B1・・・Bnのそれぞれがそれぞれのヘテロ原子Y1・・・Ynに連結し、構造における最後のアルキレン鎖Bnもまたヘテロ原子Zに連結する。
本明細書中を通して、整数が0に等しいときには常に、すなわち、式の構成要素が数字0を伴っているときには常に、この構成要素は構造中に存在しないことに留意しなければならない。例えば、式Iにおけるnが0に等しい場合、アルキレン鎖Bは存在せず、かつ、ヘテロ原子Yが構造中には存在しないことが意味される。
好ましくは、nは2〜10であり、より好ましくは2〜8であり、最も好ましくは3〜5である。従って、式Iに示される線状ポリアミンは、好ましくは、3個〜5個のアルキレン鎖Bを含む、それぞれが3個〜5個のヘテロ原子Yに連結する。
式Iに示される線状ポリアミンは、少なくとも1つのアミン基(この用語は本明細書中上記に定義されている)、好ましくは少なくとも2つのアミン基、より好ましくは少なくとも4つのアミン基を含まなければならない。アミン基は、X、ZおよびY1・・・Ynの少なくとも1つが−NH−基であるように、ヘテロ原子X、ZまたはY1・・・Ynとして、あるいは、アルキレン鎖Aおよびアルキレン鎖B1・・・Bnにおける置換された炭素原子の1つまたは複数の置換基として構造中に存在させることができる。これらのアミン基の存在は、本明細書中上記で議論されたように、銅イオンとの安定なキレートを形成させるために必要である。
従って、アルキレン鎖Aは、R1基、R2基、R3基、・・・、Rg−1基およびRg基によってそれぞれ置換された複数の炭素原子C1、C2、C3、・・・、Cg−1およびCgから構成される。好ましくは、アルキレン鎖Aは、2個〜10個の炭素原子、より好ましくは2個〜6個の炭素原子、最も好ましくは2個〜4個の炭素原子を含む。
本明細書中上記で定義されたように、gが0に等しい場合、構成要素CgH(Rg)は構造中に存在せず、従って、アルキレン鎖Aは2個の炭素原子のみを含む。
R1、R2およびRgはそれぞれが、Aにおける炭素原子に結合する置換基である。R1、R2およびRgのそれぞれは独立して、限定されないが、下記のような置換基であり得る:水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラート。
R1、R2またはRgが水素であるときには常に、そのそれぞれの炭素原子は非置換炭素原子である。
本明細書中で使用される用語「アルキル」は、直鎖基および分枝鎖基を含む飽和脂肪族炭化水素である。好ましくは、アルキル基は1個〜20個の炭素原子を有する。より好ましくは、アルキル基は、1個〜10個の炭素原子を有する中サイズのアルキルである。最も好ましくは、アルキル基は、1個〜4個の炭素原子を有する低級アルキルである。アルキル基は置換または非置換であり得る。置換される場合、置換基は、例えば、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シアノ、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、O−カルバマート、N−カルバマート、O−チオカルバマート、N−チオカルバマート、C−アミド、N−アミド、C−カルボキシ、O−カルボキシ、ニトロ、スルホンアミド、シリル、グアニジン、ウレアまたはアミノ(これらの用語は本明細書中下記で定義される)であり得る。
用語「アルケニル」により、少なくとも2つの炭素原子および少なくとも1つの炭素−炭素の二重結合からなるアルキル基が記載される。
用語「アルキニル」により、少なくとも2つの炭素原子および少なくとも1つの炭素−炭素の三重結合からなるアルキル基が記載される。
用語「シクロアルキル」により、環の1つまたは複数が完全に共役したπ電子系を有しない、すべてが炭素の単環式環基または縮合環基(すなわち、炭素原子の隣接対を共有する環)が記載される。シクロアルキル基の非限定的な例には、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキサジエン、シクロヘプタン、シクロヘプタトリエンおよびアダマンタンが含まれる。シクロアルキル基は置換または非置換であり得る。置換されるとき、置換基は、例えば、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シアノ、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、O−カルバマート、N−カルバマート、C−アミド、N−アミド、ニトロまたはアミノ(これらの用語は本明細書中上記または本明細書中下記で定義される)であり得る。
用語「アリール」により、完全に共役したπ電子系を有する、すべてが炭素の単環状基または縮合環多環基(すなわち、炭素原子の隣接対を共有する環)が記載される。アリール基の非限定的な例には、フェニル、ナフタレニルおよびアントラセニルが含まれる。アリール基は置換または非置換であり得る。置換されるとき、置換基は、例えば、ハロ、トリハロメチル、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、O−カルバマート、N−カルバマート、O−チオカルバマート、N−チオカルバマート、C−アミド、N−アミド、スルフィニル、スルホニルまたはアミノ(これらの用語は本明細書中上記または本明細書中下記で定義される)であり得る。
用語「ヘテロアリール」により、例えば、窒素、酸素およびイオウなどの1つまたは複数の原子を環(1つまたは複数)に有し、かつ、さらには、完全に共役したπ電子系を有する単環式環基または縮合環基(すなわち、隣接原子対を共有する環)が記載される。ヘテロアリール基の非限定的な例には、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリンおよびプリンが含まれる。ヘテロアリール基は置換または非置換であり得る。置換されるとき、置換基は、例えば、アルキル、シクロアルキル、ハロ、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオカルボニル、スルホンアミド、C−カルボキシ、O−カルボキシ、スルフィニル、スルホニル、O−カルバマート、N−カルバマート、O−チオカルバマート、N−チオカルバマート、C−アミド、N−アミドまたはアミノ(これらの用語は本明細書中上記または本明細書中下記で定義される)であり得る。
用語「複素脂環」により、窒素、酸素およびイオウなどの1つまたは複数の原子を環(1つまたは複数)に有する単環式環基または縮合環基が記載される。環にはまた、1つまたは複数の二重結合が存在し得る。しかしながら、環は、完全に共役したπ電子系を有しない。複素脂環は置換または非置換であり得る。置換されるとき、置換基は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シアノ、ニトロ、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、O−カルバマート、N−カルバマート、O−チオカルバマート、N−チオカルバマート、スルフィニル、スルホニル、C−アミド、N−アミドまたはアミノ(これらの用語は本明細書中上記または本明細書中下記で定義される)であり得る。
用語「ハロ」により、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子が記載される。
用語「アミノ」により、本明細書中上記で「アミン」または「アミノ基」に関して定義されるように、−NR’R”基(式中、R’およびR”はそれぞれが独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環であり、これらの用語は本明細書中上記で定義されている)を記載するために本明細書中では使用される。
従って、用語「アルキルアミノ」、用語「アリールアミノ」、用語「シクロアルキルアミノ」、用語「複素脂環アミノ」および用語「ヘテロアリールアミノ」により、そのR’およびR”の少なくとも1つが、それぞれ、アルキル、アリール、シクロアルキル、複素環およびヘテロアリールである、上記で定義されるようなアミノ基が記載される。
用語「ヒドロキシ」により、−OH基が記載される。
「アルコキシ」により、本明細書中で定義されるような−O−アルキル基および−O−シクロアルキル基の両方が記載される。
「アリールオキシ」により、本明細書中で定義されるような−O−アリール基および−O−ヘテロアリール基の両方が記載される。
用語「アゾ」により、−N=N基が記載される。
「C−アミド」により、−C(=O)−NR’R”基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
「N−アミド」により、R’C(=O)−NR”−基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
「アンモニウム」により、−N+HR’R”基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「チオヒドロキシ」により、−SH基が記載される。
用語「チオアルコキシ」により、本明細書中上記で定義されるような−S−アルキル基および−S−シクロアルキル基の両方が記載される。
用語「チオアリールオキシ」により、本明細書中上記で定義されるような−S−アリール基および−S−ヘテロアリール基の両方が記載される。
「スルフィニル」により、−S(=O)−R基(式中、Rは、限定されないが、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールであり、これらは本明細書中上記で定義される)が記載される。
「スルホニル」により、−S(=O)2−R基(式中、Rは本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
「S−スルホンアミド」は、−S(=O)2−NR’R”基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)である。
「N−スルホンアミド」はR’(S=O)2−NR”−基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)である。
「ホスホニル」は−O−P(=O)(OR’)−R”基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)である。
「ホスフィニル」は−PR’R”基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)である。
「ホスホニウム」は−P+R’R”R’’’基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りであり、R’’’はR’またはR”のいずれかとして定義される)である。
用語「カルボニル」により、−C(=O)−R基(式中、Rは、本明細書中上記で定義されるように、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール(環炭素を介して結合する)または複素脂環(環炭素を介して結合する)である)が記載される。
「チオカルボニル」により、−C(=S)−R基(式中、Rは、用語「カルボニル」に関して本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
「C−カルボキシ」により、−C(=O)−O−R基(式中、Rは、用語「カルボニル」に関して本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
「O−カルボキシ」基により、RC(=O)−O−基(式中、Rは、用語「カルボニル」に関して本明細書中上記で定義される通りである)を示す。
「カルボン酸」は、Rが水素であるC−カルボキシ基である。
「C−チオカルボキシ」は−C(=S)−O−R基(式中、Rは、用語「カルボニル」に関して本明細書中上記で定義される通りである)である。
「O−チオカルボキシ」基はR−C(=S)−O−基(式中、Rは、用語「カルボニル」に関して本明細書中上記で定義される通りである)を示す。
用語「O−カルバマート」により、−OC(=O)−NR’R”基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
「N−カルバマート」により、R’−O−C(=O)−NR”−基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
「O−チオカルバマート」により、−O−C(=S)−NR’R”基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
「N−チオカルバマート」により、R’OC(=S)NR”−基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「ウレア」により、−NR’−C(=O)−NR’R”基(式中、R’、R”およびR’’’は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「チオウレア」により、−NR’−C(=S)−NR’R”基(式中、R’、R”およびR’’’は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「ボラート」により、−O−B−(OR)2基(式中、Rは本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「ボラン」により、−B−R’R”基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「ボラザ」により、−B(R’)(NR”R’’’)基(式中、R’、R”およびR’’’は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「シリル」により、−SiR’R”R’’’基(式中、R’、R”およびR’’’は本明細書中で定義される通りである)が記載される。
用語「シロキシ」は−Si−(OR)3(式中、Rは本明細書中上記で定義される通りである)である。
用語「シラザ」により、−Si−(NR’R”)3(式中、R’およびR”は本明細書中で定義される通りである)が記載される。
用語「アクア(aquo)」により、H2O基が記載される。
用語「アルコール」により、ROH基(式中、Rは本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「ペルオキソ」により、−OOR基(式中、Rは本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
本明細書中で使用される「アミンオキシド」は−N(=O)R’R”R’’’基(式中、R’、R”およびR’’’は本明細書中で定義される通りである)である。
「ヒドラジン」は−NR’−NR”R’’’基(式中、R’、R”およびR’’’は本明細書中で定義される通りである)が記載される。
従って、「アルキルヒドラジン」および「アリールヒドラジン」により、R’がそれぞれアルキルまたはアリールであり、R”およびR’’’が本明細書中上記で定義される通りであるヒドラジンが記載される。
用語「一酸化窒素」は−N=O基である。
用語「シアノ」は−C≡N基である。
「シアナート」は−O−C≡N基である。
「チオシアナート」は−S−C≡N基である。
「イソシアナート」は−N=C=O基である。
「イソチオシアナート」は−N=C=S基である。
用語「アルキルニトリル」および用語「アリールニトリル」により、−R−C≡N基(式中、Rはそれぞれアルキルまたはアリールである)が記載される。
用語「アルキルイソニトリル」および用語「アリールイソニトリル」により、R−N≡C−基(式中、Rはそれぞれアルキルまたはアリールである)が記載される。
「ニトラート」または「ニトロ」は−NO2基である。
「ニトリト」は−O−N=O基である。
「アジド」はN3 +基である。
「アルキルスルホン酸」および「アリールスルホン酸」により、−R−SO2−OH基(式中、Rはそれぞれアルキルまたはアリールである)が記載される。
「アルキルスルホキシド」、「アリールスルホキシド」および「アルキルアリールスルホキシド」により、−R’S(=O)R”基(式中、R’およびR”はそれぞれがアルキルであり、R’およびR”はそれぞれがアリールであり、ここで、それぞれ、R’はアルキルであり、かつR”はアリールである)が記載される。
「アルキルスルフェン酸」および「アリールスルフェン酸」により、−R−S−OH基(式中、Rはそれぞれアルキルまたはアリールである)が記載される。
「アルキルスルフィン酸」および「アリールスルフィン酸」により、−R−S(=O)−OH基(式中、Rはそれぞれアルキルまたはアリールである)が記載される。
本明細書中で使用される用語「アルキルカルボン酸」および用語「アリールカルボン酸」により、−R−C(=O)−OH基(式中、Rはそれぞれアルキルまたはアリールである)が記載される。
「アルキルチオールカルボン酸」および「アリールチオールカルボン酸」により、−R−C(=O)−SH基(式中、Rはそれぞれアルキルまたはアリールである)が記載される。
「アルキルチオールチオカルボン酸」および「アリールチオールチオカルボン酸」により、−R−C(=S)−SH基(式中、Rはそれぞれアルキルまたはアリールである)が記載される。
「スルファート」は−O−SO2−OR’基(式中、R’は本明細書中上記で定義される通りである)である。
「スルフィト」基は−O−S(=O)−OR’基(式中、R’は本明細書中上記で定義される通りである)である。
「ビスルフィト」は、R’が水素であるスルフィト基である。
「チオスルファート」は−O−SO2−SR’基(式中、R’は本明細書中上記で定義される通りである)である。
「チオスルフィト」は−O−S(=O)−SR’基(式中、R’は本明細書中上記で定義される通りである)である。
用語「アルキル/アリールホスフィン」により、−R−PH2基(式中、Rは、上記で定義されるように、それぞれアルキルまたはアリールである)が記載される。
用語「アルキルホスフィンオキシドおよび/またはアリールホスフィンオキシド」により、−R’−PR”2(=O)基(式中、R’およびR”は、本明細書中上記で定義されるように、アルキルおよび/またはアリールである)が記載される。
用語「アルキルホスフィンスルフィドおよび/またはアリールホスフィンスルフィド」により、−R’−PR”2(=S)基(式中、R’およびR”は、本明細書中上記で定義されるように、アルキルおよび/またはアリールである)が記載される。
用語「アルキル/アリールホスホン酸」により、−R’−P(=O)(OH)2基(式中、R’は、上記で定義されるようなアルキルまたはアリールである)が記載される。
用語「アルキル/アリールホスフィン酸」により、−R’−P(OH)2基(式中、R’は、上記で定義されるようなアルキルまたはアリールである)が記載される。
「ホスファート」は−O−P(=O)(OR’)(OR”)基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)である。
「ハイドロジェンホスファート」は、R’が水素であるホスファート基である。
「ジハイドロジェンホスファート」は、R’およびR”がともに水素であるホスファート基である。
「チオホスファート」は−S−P(=O)(OR’)2基(式中、R’は本明細書中上記で定義される通りである)である。
「ホスフィト」は−O−P(OR’)2基(式中、R’は本明細書中上記で定義される通りである)である。
「ピロホスフィト」は−O−P(OR’)−O−P(OR”)2基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)である。
「トリホスファート」により、−OP(=O)(OR’)−O−P(=O)(OR”)−O−P(=O)(OR’’’)2(式中、R’、R”およびR’’’は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
本明細書中で使用される用語「グアニジン」により、−R’NC(=N)−NR”R’’’基(式中、R’、R”およびR’’’は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「S−ジチオカルバマート」により、−SC(=S)−NR’R”基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「N−ジチオカルバマート」により、R’SC(=S)−NR”−基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
「ビカルボナート」は−O−C(=O)−O−基である。
「カルボナート」は−O−C(=O)−OH基である。
「ペルクロラート」は−O−Cl(=O)3基である。
「クロラート」は−O−Cl(=O)2基である。
「クロリト」は−O−Cl(=O)基である。
「ハイポクロリト」は−OCl基である。
「ペルブロマート」は−O−Br(=O)3基である。
「ブロマート」は−O−Br(=O)2基である。
「ブロミト」は−O−Br(=O)基である。
「ハイポブロミト」は−OBr基である。
「ペルヨーダート」は−O−I(=O)3基である。
「ヨーダート」は−O−I(=O)2基である。
用語「テトラハロマンガナート」により、MnCl4、MnBr4およびMnI4が記載される。
用語「テトラフルオロボラート」により、−BF4基が記載される。
「テトラフルオロアンチモナート」は、SbF6基である。
「ハイポホスフィト」は−P(OH)2基である。
用語「テトラアルキル/テトラアリールボラート」により、R’B−基(式中、R’は、上記で定義されるように、それぞれアルキルまたはアリールである)が記載される。
「タルタラート」は−OC(=O)−CH(OH)−CH(OH)−C(=O)OH基である。
「スクシナート」は−O−C(=O)−(CH2)2−COOH基である。
「シトラート」は−O−C(=O)−CH2−CH(OH)(COOH)−CH2−COOH基である。
「サッカリラート」は、2つのカルボン酸基を有する酸化型サッカリドである。
本明細書中で使用される用語「アミノ酸」には、天然アミノ酸および修飾アミノ酸が含まれ、従って、21個の天然に存在するアミノ酸;多くの場合にはインビボで翻訳後に修飾されたそのようなアミノ酸(これには、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンが含まれる);および、他の非通常的なアミノ酸(これには、2−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンが含まれるが、これらに限定されない)が含まれる。さらに、用語「アミノ酸」には、この用語が本明細書中で定義されるように、少なくとも1つの付加アミノ酸にペプチド結合またはペプチド結合アナログを介して連結されるD−アミノ酸およびL−アミノ酸の両方が含まれる。
「ヒドロキサム酸」は−C(=O)−NH−OH基である。
従って、アルキレン鎖B1・・・Bnのそれぞれは、Rp基、Rp+1基、Rp+2基、・・・、Rq−1基およびRq基によってそれぞれ置換される複数の炭素原子Cp、Cp+1、Cp+2、・・・、Cq−1およびCqから構成される。好ましくは、アルキレン鎖B1・・・Bnのそれぞれは、2個〜20個の炭素原子を含み、より好ましくは2個〜10個の炭素原子を含み、最も好ましくは2個〜6個の炭素原子を含む。
本明細書中上記で定義されるように、pが0に等しい場合、構成要素−CpH(Rp)−は構造中に存在しない。pがg+1に等しい場合、pは1または4〜11のいずれかであり得る。整数qは2または5〜20のいずれかであり得る。
置換基Rp、Rp+1、・・・、Rnのそれぞれは、R1、R2およびRgに関して本明細書中上記に記載される置換基のいずれかであり得る。
従って、本発明による好ましい線状ポリアミンは2つ以上のアルキレン鎖を含む。アルキレン鎖はヘテロ原子によってその間が中断され、それぞれがその一方の端部でヘテロ原子に連結する。好ましくは、アルキレン鎖のそれぞれが、ヘテロ原子と銅イオンとの間で安定なキレートを形成することができるように少なくとも2つの炭素原子を含む。
式Iに示される線状ポリアミンは、好ましくは、少なくとも1つのキラルな炭素原子を含む。従って、アルキレン鎖AにおけるC1、C2およびCgの少なくとも1つ、ならびに/あるいは、アルキレン鎖BにおけるCp、Cp+1およびCqの少なくとも1つがキラルである。
本発明による好ましい線状ポリアミンはテトラエチレンペンタミンである。本発明に関連して使用可能な好ましい線状ポリアミンの他の代表的な例には、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、アミノエチルエタノールアミン、ペンタエチレンヘキサミン、トリエチレンテトラミン、N,N’−ビス(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミン、およびN,N’−ビス(2−アミノエチル)−1,3−プロパンジアミンが含まれるが、これらに限定されない。
ポリアミンキレーターが環状ポリアミンである場合、ポリアミンは下記の一般式IVを有することができる:
(式中、mは1〜10の整数である;nは0〜20の整数である;XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;Dは、下記の一般式Vを有する架橋基である:
[式中、UおよびVはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される;Wは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される]、
ただし、前記X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、前記アルキレン鎖における前記炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される)。
(式中、mは1〜10の整数である;nは0〜20の整数である;XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;Dは、下記の一般式Vを有する架橋基である:
[式中、UおよびVはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される;Wは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される]、
ただし、前記X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、前記アルキレン鎖における前記炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される)。
場合により、環状ポリアミンは、下記の一般式VI〜一般式Xのいずれかを有する:
(式中、m、n、X、Y1、Yn、Z、A、BおよびDは上記で定義される通りであり、さらには、架橋基Dが一方の端部でA(式VI、式VIIおよび式X)に結合している場合、UまたはVはアルキレン鎖における1つの炭素原子に結合しており、また、Dが一方の端部でB1またはBn(式VIII、式IXおよび式X)に結合している場合、UまたはVはアルキレン鎖における1つの炭素原子に結合している)。
(式中、m、n、X、Y1、Yn、Z、A、BおよびDは上記で定義される通りであり、さらには、架橋基Dが一方の端部でA(式VI、式VIIおよび式X)に結合している場合、UまたはVはアルキレン鎖における1つの炭素原子に結合しており、また、Dが一方の端部でB1またはBn(式VIII、式IXおよび式X)に結合している場合、UまたはVはアルキレン鎖における1つの炭素原子に結合している)。
従って、本発明による好ましい環状ポリアミンは、線状ポリアミンに関して本明細書中上記に詳しく記載されるように、2つ以上のアルキレン鎖A、B1・・・Bnを含む。アルキレン鎖は、架橋基Dを介して、その両端の間で、すなわち、ヘテロ原子のXおよびZの間で連結されることによって環状構造を形成することができる(式IV)。場合により、アルキレン鎖は、架橋基Dを介してその間で連結されることによって立体配座が制限された環状構造を形成することができる(式X)。さらに場合により、立体配座が制限された環状構造を、1つのアルキレン鎖を1つの末端ヘテロ原子(XまたはZ、式VI〜式IX)に連結することによって形成することができる。
本明細書中上記で記載されたように、環状構造が、式VI〜式IXに示されるように、1つのアルキレン鎖を1つの末端ヘテロ原子に連結することによって形成される場合、架橋基Dは、末端ヘテロ原子(すなわち、XまたはZ)と、アルキレン鎖AおよびB1・・・Bnにおける1つの炭素原子とを連結する。この炭素原子は、本明細書中上記で記載されるC1、C2、Cg、Cp、Cp+1およびCqのいずれか1つであり得る。
さらに本明細書中上記で記載されたように、環状構造は、構造において2つの構成要素をつなぐ架橋基Dによって形成される。架橋基Dは一般式U−W−V(式中、UおよびVはそれぞれが置換炭化水素鎖または非置換炭化水素鎖である)を有する。
本明細書中で使用される表現「炭化水素鎖」により、共有結合により互いに結合し、とりわけ、水素原子によって置換される複数の炭素原子が記載される。炭化水素鎖は、飽和、不飽和、分枝状または非分枝状であり得るし、従って、1つまたは複数のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基およびアリール基ならびにそれらの組合せを含むことができる。
炭化水素鎖の長さ(すなわち、鎖における炭素原子の数)は、好ましくは、一方では、形成された環状構造の環の緊張が最小限になり、他方では、銅イオンとの効率的なキレート形成が達成されるように、環状ポリアミンの構造によって決定される。
炭化水素鎖が置換されるとき、置換基は、線状ポリアミンにおけるR1、R2およびRgに関して本明細書中上記で記載される置換基のいずれか1つまたはその組合せであり得る。
2つの炭化水素鎖は、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンであり得る基Wによってその間が連結される。
本明細書中で使用される用語「エーテル」は−O−基である。
用語「エステル」は−C(=O)−O−基である。
「ジスルフィド」は−S−S−基である。
「チオエーテル」は−S−基である。
「チオエステル」は−C(=O)−S−基である。
「イミン」は−C(=NH)−基である。
「アルケン」は−CH=CH−基である。
架橋基Dは、典型的には、例えば、米国特許第5811392号に記載されるように、広く知られている技術によってその間(W)の結合が生じるように炭化水素鎖のUおよびVの反応性誘導体を連結することによって形成される。
線状ポリアミンに関して上記で記載されたように、環状ポリアミンは、安定な銅キレートを形成するように、少なくとも1つのアミン基(好ましくは少なくとも2つのアミン基、より好ましくは少なくとも4つのアミン基)を含まなければならない。
本発明による好ましい環状ポリアミンはシクラム(1,4,8,11−テトラアザシクロテトラデカン)である。
本明細書中上記で記載されたように、本発明のポリアミンキレーターにはさらに、1つまたは複数の線状ポリアミンと、1つまたは複数の環状ポリアミンとの多量体組合せが含まれ得る。従って、そのようなポリアミンキレーターは、本明細書中上記で記載された線状ポリアミンおよび環状ポリアミンの任意の組合せから構成され得る。
好ましくは、そのようなポリアミンキレーターは下記の一般式XIを有する:
(式中、nは1よりも大きい整数である;f、g、h、i、j、k、l、oおよびtのそれぞれは独立して、0〜10の整数である;E1、E2およびEnのそれぞれは独立して、本明細書中上記に記載されるような線状ポリアミンである;G1、G2およびGnのそれぞれは独立して、本明細書中上記に記載されるような環状ポリアミンである;Q1、Q2およびQnのそれぞれは独立して、前記ポリアミンの2つの間を連結するリンカーであり、ただし、前記Q1、Q2およびQnの少なくとも1つがアミン基であり、かつ/または、前記線状ポリアミンおよび前記環状ポリアミンの少なくとも1つが少なくとも1つのフリーのアミン基を有する)。
(式中、nは1よりも大きい整数である;f、g、h、i、j、k、l、oおよびtのそれぞれは独立して、0〜10の整数である;E1、E2およびEnのそれぞれは独立して、本明細書中上記に記載されるような線状ポリアミンである;G1、G2およびGnのそれぞれは独立して、本明細書中上記に記載されるような環状ポリアミンである;Q1、Q2およびQnのそれぞれは独立して、前記ポリアミンの2つの間を連結するリンカーであり、ただし、前記Q1、Q2およびQnの少なくとも1つがアミン基であり、かつ/または、前記線状ポリアミンおよび前記環状ポリアミンの少なくとも1つが少なくとも1つのフリーのアミン基を有する)。
式XIにおけるE1、E2およびEnのそれぞれは、本明細書中上記で詳しく記載されたような線状ポリアミンを表し、一方、G1、G2およびGnのそれぞれは、本明細書中上記で詳しく記載されたような環状ポリアミンを表す。
式XIに記載されるポリアミンは、別の線状ポリアミンまたは環状ポリアミンにそれぞれがつながれる1つまたは複数の線状ポリアミンを含むことができる。
式XIにおける線状ポリアミンまたは環状ポリアミンはそれぞれが、式XIにおけるQ1、Q2およびQnによって表される1つまたは複数のリンカーを介して別のポリアミンにつながれる。
リンカー(Q1、Q2およびQn)のそれぞれは、例えば、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、シクロアルキレン、ヘテロアリーレン、アミン、アゾ、アミド、スルホニル、スルフィニル、スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、ケトエステル、カルボニル、チオカルボニル、エステル、エーテル、チオエーテル、カルバマート、チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシおよびシラザであり得る。
本明細書中で使用される用語「アルケニレン」により、少なくとも2つの炭素原子と、少なくとも1つの炭素−炭素の二重結合とからなるアルキル基が記載される。
用語「アルキニレン」により、少なくとも2つの炭素原子と、少なくとも1つの炭素−炭素の三重結合とからなるアルキル基が記載される。
用語「シクロアルキレン」により、環の1つまたは複数が完全に共役したπ電子系を有しない、すべてが炭素の単環式環基または縮合環基(すなわち、炭素原子の隣接対を共有する環)が記載される。シクロアルキル基の非限定的な例には、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキサジエン、シクロヘプタン、シクロヘプタトリエンおよびアダマンタンが含まれる。
用語「アリーレン」により、完全に共役したπ電子系を有する、すべてが炭素の単環状基または縮合環多環基(すなわち、炭素原子の隣接対を共有する環)が記載される。アリール基の非限定的な例には、フェニル、ナフタレニルおよびアントラセニルが含まれる。アリール基は置換または非置換であり得る。
用語「ヘテロアリーレン」により、例えば、窒素、酸素およびイオウなどの1つまたは複数の原子を環(1つまたは複数)に有し、かつ、さらには、完全に共役したπ電子系を有する単環式環基または縮合環基(すなわち、隣接原子対を共有する環)が記載される。ヘテロアリール基の非限定的な例には、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリンおよびプリンが含まれる。ヘテロアリール基は置換または非置換であり得る。
本発明のリンカーに関連して使用される用語「アミン」により、−NR’−(式中、R’は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環であり得、これらの用語は本明細書中上記で定義される)が記載される。
本発明のリンカーに関連してさらに使用される用語「アゾ」により、−N=N−基が記載される。
用語「アミド」により、−C(=O)NR’−基(式中、R’は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「アンモニウム」により、−N+HR’−基(式中、R’は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「スルフィニル」により、−S(=O)−基が記載される。
用語「スルホニル」により、−S(=O)2−基が記載される。
用語「スルホンアミド」により、−S(=O)2−NR’−基(式中、R’は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「ホスホニル」により、−O−P(=O)(OR’)−基(式中、R’は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「ホスフィニル」により、−PR’−基(式中、R’は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「ホスホニウム」により、−P+R’R”(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「ケトエステル」により、−C(=O)−C(=O)−O−基が記載される。
用語「カルボニル」により、−C(=O)−基が記載される。
用語「チオカルボニル」により、−C(=S)−基が記載される。
用語「カルバマート」により、−OC(=O)−NR’−基(式中、R’は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「チオカルバマート」により、−OC(=S)−NR’−基(式中、R’は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「ウレア」により、−NR’−C(=O)−NR”−基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「チオウレア」により、−NR’−C(=S)−NR’−基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「ボラート」により、−O−B−(OR)−基(式中、Rは本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「ボラン」により、−B−R−’−基(式中、Rは本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「ボラザ」により、−B(NR’R”)−基(式中、R’およびR”は本明細書中上記で定義される通りである)が記載される。
用語「シリル」により、−SiR’R”−基(式中、R’およびR”は本明細書中で定義される通りである)が記載される。
用語「シロキシ」は−Si−(OR)2−(式中、Rは本明細書中上記で定義される通りである)である。
用語「シラザ」により、−Si−(NR’R”)2−(式中、R’およびR”は本明細書中で定義される通りである)が記載される。
本発明のリンカーに関連して本明細書中上記で記載された用語はすべて、置換基に関して上記で記載されたのと同じであることに留意しなければならない。しかしながら、その一方の端部において構成要素に結合している置換基とは対照的に、リンカー基は、その2つの部位において2つの構成要素に結合しており、従って、これらの用語は、リンカーに関して再定義されている。
本明細書中上記で述べられているように、本発明の現時点で最も好ましい実施形態によれば、ポリアミンキレーターはテトラエチレンペンタミン(TEPA)である。しかしながら、他の好ましいポリアミンキレーターには、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、アミノエチルエタノールアミン、アミノエチルピペラジン、ペンタエチレンヘキサミン、トリエチレンテトラミン、カプトプリル、ペニシラミン、N,N’−ビス(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミン、N,N’−ビス(2−アミノエチル)−1,3−プロパンジアミン、1,7−ジオキサ−4,10−ジアザシクロドデカン、1,4,8,11−テトラアザシクロテトラデカン−5,7−ジオン、1,4,7−トリアザシクロノナン、1−オキサ−4,7,10−トリアザシクロドデカン、1,4,8,12−テトラアザシクロペンタデカン、および1,4,7,10−テトラアザシクロドデカンが含まれるが、これらに限定されない。
上記に列挙された好ましいキレーターは、銅イオンに対するその大きい親和性において知られている。しかしながら、これらのキレーターはさらに、RossおよびFrant[Ross JWおよびFrant MS、「Chelometric indicators, titration with the solid−state cupric ion selective electrode.」、Analytical Chemistry、41:1900、1969](これは、本明細書中に詳しく示されるかのように参照により組み込まれる)によって記載されるように、他の遷移金属に対してもまたその実質的な親和性によって有益に特徴づけられている。
本明細書中上記で記載されたポリアミンキレーターはすべて、市販品を入手することができるか、あるいは、例えば、T.W.Greene(編)、1999(“Protective Groups in Organic Synthesis”、第3版、John Wiley&Sons,Inc.、New York、779頁)、または、R.C.LarockおよびV.C.H.Wioley、“Comprehensive Organic Transformations−A Guide to Functional Group Preparations”(1992)、第2版)に記載されるなどの知られている手法を使用して合成することができる。
テトラエチレンペンタミン−銅キレート(TEPA−Cu)を調製するための好ましい手法が国際特許出願PCT/IL03/00062に記載される。
銅キレートまたは銅キレーターを細胞培養培地に与えることができる。銅キレートの最終濃度は、特定の適用に依存して、マイクロモル濃度〜ミリモル濃度の範囲、例えば、約0.1μM〜約100mMの範囲、好ましくは約4μM〜約50mMの範囲、より好ましくは約5μM〜約40mMの範囲であり得る。
造血幹細胞集団をエクスビボ拡大するための本明細書中上記に記載される方法は、とりわけ、造血幹細胞の拡大された集団をもたらす。
従って、さらに、本発明の1つの局面によれば、本明細書中上記に記載された方法のいずれかによって得られる、造血幹細胞のエクスビボ拡大された集団が提供される。本発明による造血幹細胞の拡大された集団は、3%〜20%の細胞が再選択可能なCD34+細胞であり、そのうちの少なくとも40%の細胞がCD34+ dimであること、すなわち、FACS分析において中央値強度に達しないこと、また、再選択可能なCD34+細胞において、Lin−である細胞の大部分もまたCD34+ dim細胞であることによって特徴づけられる複数の細胞を含む。
1つの実施形態において、造血幹細胞の集団は単一の遺伝的背景を有する。
別の実施形態において、造血幹細胞のエクスビボ拡大された集団は、単一のドナーに由来する少なくともN個の細胞を含む(この場合、Nは、造血単核細胞の1つのサンプルに由来するCD34+細胞の平均数を1000倍した数に等しい)。
CD34マーカーおよび/またはLinマーカーの細胞表面での発現は、例えば、FACS分析または免疫組織化学的染色技術によって明らかにすることができる。造血幹細胞の自己再生能は、下記の実施例の節においてさらに例示されるように、長期コロニー形成(LTC−CFUc)によってインビトロで明らかにすることができる。
本明細書中上記で詳しく議論されたように、造血幹細胞のエクスビボ拡大は、例えば、造血細胞の移植または埋込み、養子免疫療法、および遺伝子治療などの様々な適用において好都合に利用することができる。造血単核細胞を細胞供給源として用いて造血幹細胞のエクスビボ拡大を実施できることにより、これらの適用における本明細書中上記で記載された方法の利用が実質的に容易になる。
従って、本発明の別の局面によれば、造血細胞の移植または埋込みを行う方法が提供される。本発明のこの局面によるこの方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、(b)造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にCD38の発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、その結果、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに(c)そのようにして得られた造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることによって達成される。
本明細書中上記で記載されたように、様々な薬剤を、CD38の発現および/または活性を低下させるために本発明の種々の局面に関連して使用することができる。
従って、本発明のこの局面の特定の実施形態において、この方法は、本明細書中上記で記載されたように、造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸、レチノイドおよび/またはビタミンDに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供することによって達成される。
別の特定の実施形態において、この方法は、本明細書中上記で記載されたように、造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸受容体、レチノイドX受容体および/またはビタミンD受容体を伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供することによって達成される。
本発明のこの局面の別の特定の実施形態において、この方法は、本明細書中上記で記載されたように、造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、PI3−キナーゼを伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供することによって達成される。
本発明のこの局面のさらに別の特定の実施形態において、この方法は、本明細書中上記で記載されたように、造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、または、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物とを提供することによって達成される。
本発明のこの局面の別の特定の実施形態において、この方法は、本明細書中上記で記載されたように、造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、PI3−キナーゼ阻害剤とを提供することによって達成される。
本発明の別の局面において、上記で記載された、造血細胞の移植または埋込みを行う方法は、造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、本明細書中上記で記載された1つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートとを提供することによって達成される。
本発明のこの局面の方法のいずれかにおいて、ドナーおよびレシピエントは、単一の個体または異なる個体、例えば、同種の個体または異種の個体であり得る。同種移植が実施されるとき、当該分野では広く知られているように、インプラント拒絶および/または対宿主性移植片病を減少させるための治療法を講じなければならない。そのような治療法は、現在、ヒトの治療では実施されている。最も進んだ様々な治療法が、Slavin S.他による刊行物(例えば、J.Clin.Immunol.(2002)、22:64、および、J Hematother Stem Cell Res(2002)、11:265)、Gur H.他による刊行物(Blood(2002)、99:4174)、および、Martelli MF他による刊行物(Semin Hematol(2002)、39:48)に開示される(これらは参照により本明細書中に組み込まれる)。
本明細書中上記に記載された方法は、移植可能な造血細胞調製物を作製するために利用することができ、その結果、本発明のなお別の局面によれば、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、CD38の発現および/または活性を低下させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害するための効果的な量の薬剤の存在下でエクスビボ増殖された造血幹細胞の拡大された集団、および医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物が提供されるようになる。
本明細書中上記で記載されたように、様々な薬剤が、これらの条件のもとで、CD38の発現および/または活性を低下させ、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害するために見出されていた。
従って、本発明のこの局面の特定の実施形態において、上記で記載された薬剤は、レチノイン酸、レチノイドおよび/またはビタミンDに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させ、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤である。
本発明のこの局面の別の特定の実施形態において、上記で記載された薬剤は、レチノイン酸受容体、レチノイドX受容体および/またはビタミンD受容体のシグナル伝達に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させ、その一方で同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤である。
本発明のこの局面のなお別の特定の実施形態において、上記で記載された薬剤は、PI3−キナーゼのシグナル伝達に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させ、その一方で同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤である。
本発明のこの局面のさらに別の特定の実施形態において、上記で記載された薬剤は、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、および、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物からなる群から選択される薬剤の効果的な量を含む。
本発明のこの局面のさらに別の特定の実施形態において、上記で記載された薬剤は、PI3−キナーゼ阻害剤の効果的な量を含む。
本発明のさらに別の局面によれば、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、本明細書中上記で定義されるような少なくとも1つの銅キレートまたは銅キレーターの存在下、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害しながらエクスビボ増殖された造血幹細胞の拡大された集団、および医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物が提供される。
本明細書中上記でさらに議論されているように、本発明の造血幹細胞のエクスビボ拡大は養子免疫療法において利用することができる。
本発明の造血移植法または造血埋込み法と同様に、本発明による養子療法の方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、(b)本明細書中上記に詳しく記載されるように、造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、そして同時に、本明細書中上記に記載される銅キレーターまたは銅キレートのそれぞれ、ならびに/あるいは、本明細書中上記に記載される、CD38の発現および/または活性を低下させるための薬剤のそれぞれとを提供し、その結果、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、ならびに(c)そのようにして得られた造血幹細胞をレシピエントに移植することによって達成される。
下記においてさらに詳述されるように、一般には幹細胞、具体的には造血幹細胞は、細胞遺伝子治療を行うために役立ち得る。
本明細書中で使用される遺伝子治療は、遺伝的または後天的な疾患または状態または表現型を処置または防止するための、宿主への目的とする遺伝物質(例えば、DNAまたはRNA)の移入を示す。目的とする遺伝物質により、インビボでのその産生が所望される産物(例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、機能的RNA、アンチセンス)がコードされる。例えば、目的とする遺伝物質により、治療的に有益なホルモン、受容体、酵素、ポリペプチドまたはペプチドがコードされ得る。総説については、一般には、テキスト“Gene Therapy”(Advanced in Pharmacology 40、Academic Press、1997)を参照のこと。
遺伝子治療に対する2つの基本的な方法が発展してきている:(i)エクスビボ遺伝子治療または細胞遺伝子治療、および(ii)インビボ遺伝子治療。エクスビボ遺伝子治療では、細胞が患者から取り出され、そして、培養されながら、細胞がインビトロで処置される。一般には、機能的な置換遺伝子が、適切な遺伝子送達ビヒクル/方法(トランスフェクション、形質導入、相同的組換えなど)および必要に応じて発現システムによって細胞に導入され、その後、改変された細胞が培養で拡大され、宿主/患者に戻される。これらの遺伝子的に再埋込みされた細胞は、トランスフェクションされた遺伝物質をインサイチュで発現することが示されている。
従って、さらに、本発明の局面によれば、細胞を外因遺伝子(exogene)で遺伝子改変する方法が提供される。本発明のこの局面によるこの方法は、(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、(b)本明細書中上記に詳しく記載されるように、造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、そして同時に、本明細書中上記に記載される銅キレーターまたは銅キレートのそれぞれ、ならびに/あるいは、本明細書中上記に記載される、CD38の発現および/または活性を低下させるための薬剤のそれぞれとを提供し、その結果、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、ならびに(c)造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することによって達成される。
好ましい実施形態において、細胞を遺伝子改変することは、外因遺伝子または導入遺伝子を含むベクターによって達成され、この場合、そのようなベクターは、例えば、ウイルスベクターまたは核酸ベクターである。細胞遺伝子治療において使用される好適な多くのウイルスベクタ−が知られており、様々な例が本明細書中下記に示される。同様に、様々な核酸ベクターを、下記においてさらに記載されるように、本発明の拡大された細胞を遺伝的に形質転換するために使用することができる。
それによれば、本明細書中の拡大された細胞は、遺伝子産物を発現させるために改変することができる。本発明で使用される表現「遺伝子産物」は、タンパク質、ペプチドおよび機能的RNA分子を示す。一般には、核酸分子によりコードされる遺伝子産物が、対象に提供されることになる所望の遺伝子産物である。そのような遺伝子産物の例には、レシピエント対象の器官によって通常的に産生されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質およびリポタンパク質が含まれる。例えば、膵臓における不完全な器官に対する遺伝子置換として供給され得る遺伝子産物には、インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼA2、エラスターゼおよびアミラーゼが含まれる;肝臓により通常的に産生される遺伝子産物には、血液凝固因子(例えば、血液凝固の第VIII因子および第IX因子など)、UDPグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、および種々のチトクロームP450酵素、ならびに、血清アデノシンのプロセシングまたは低密度リポタンパク質のエンドサイトーシスの場合にはアデノシンデアミナーゼが含まれる;胸腺により産生される遺伝子産物には、血清胸腺因子、胸腺ホルモン因子、チモポイエチンおよびチモシンα1が含まれる;消化管細胞により産生される遺伝子産物には、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、セロチニンおよびサブスタンスPが含まれる。
あるいは、コードされる遺伝子産物は、所望される遺伝子産物の細胞による発現を誘導するものである(例えば、導入された遺伝物質により、対象に提供される遺伝子産物の転写を誘導する転写因子がコードされる)。
さらに別の実施形態において、組換え遺伝子により、異種タンパク質(例えば、それが発現される細胞に対して生来的でない異種タンパク質)を提供することができる。例えば、様々なヒトMHC成分を、ヒトレシピエントにおける生着を支援するために、非ヒト細胞に提供することができる。あるいは、導入遺伝子は、ドナーのMHC遺伝子産物の発現または作用を阻害するものである。
細胞に導入される核酸分子は、核酸によりコードされる遺伝子産物の細胞における発現のために好適な形態である。従って、核酸分子は、コード配列、および、遺伝子の転写のために要求され、また、遺伝子産物がタンパク質またはペプチドであるときには、遺伝子の翻訳のために要求される調節配列(またはその一部)を含み、そのような調節配列には、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナル、ならびに、コードされるタンパク質またはペプチドの輸送のために必要な配列(例えば、タンパク質またはペプチドを細胞の表面に輸送するためのN末端シグナル配列、または分泌のためのN末端シグナル配列)が含まれる。
遺伝子産物の発現を調節するヌクレオチド配列(例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列)が、遺伝子産物が発現させられる細胞のタイプ、および遺伝子産物の所望される発現レベルに基づいて選択される。例えば、プロモーターに連結された遺伝子の細胞タイプ特異的な発現をもたらすことが知られているプロモーターを使用することができる。筋芽細胞遺伝子の発現のために特異的なプロモーターを、その遺伝子産物の筋肉特異的な発現をもたらすために目的の遺伝子に連結することができる。当該分野で知られている筋肉特異的な調節エレメントには、ジストロフィン遺伝子に由来する上流領域(Klamut他(1989)、Mol.Cell Biol.、9:2396)、クレアチンキナーゼ遺伝子に由来する上流領域(BuskinおよびHauschka(1989)、Mol.Cell Biol.、9:2627)、およびトロポニン遺伝子に由来する上流領域(MarおよびOrdahl(1988)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:6404)が含まれる。他の細胞タイプについて特異的な調節エレメントが当該分野では知られている(例えば、肝臓特異的な発現のためのアルブミンエンハンサー;膵島細胞特異的な発現のためのインスリン調節エレメント;様々な神経細胞特異的な調節エレメント、これには、神経ジストロフィン、神経エノラーゼおよびA4アミロイドのプロモーターが含まれる)。
あるいは、様々な異なる細胞タイプにおいて遺伝子の構成的な発現を行わせることができる調節エレメント(例えば、ウイルスの調節エレメントなど)を使用することができる。遺伝子発現を行わせるために一般に使用されているウイルスプロモーターの例には、ポリオーマウイルス、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40に由来するプロモーター、ならびにレトロウイルスのLTRが含まれる。
あるいは、連結された遺伝子の誘導可能な発現をもたらす調節エレメントを使用することができる。誘導可能な調節エレメント(例えば、誘導可能なプロモーター)の使用は、細胞における遺伝子産物の産生の調節を可能にする。真核生物細胞において使用される潜在的に有用な誘導可能な調節システムの例には、ホルモンにより調節されるエレメント(例えば、Mader,S.およびWhite,J.H.(1993)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5603〜5607を参照のこと)、合成リガンドにより調節されるエレメント(例えば、Spencer,D.M.他(1993)、Science、262:1019〜1024を参照のこと)、およびイオン化放射線により調節されるエレメント(例えば、Manome,Y.他(1993)、Biochemistry、32:10607〜10613;Datta,R.他(1992)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:1014〜10153を参照のこと)が含まれる。開発され得るさらなる組織特異的または誘導可能な調節システムもまた、本発明に従って使用することができる。
本発明の細胞を改変するために適用され得る数多くの技術が、遺伝物質を細胞に導入するために当該分野では知られている。
1つの実施形態において、核酸はネイクド核酸分子の形態である。この状況では、改変される細胞に導入される核酸分子は、遺伝子産物をコードする核酸と、必要な調節エレメントとのみからなる。
あるいは、(必要な調節エレメントを含めて)遺伝子産物をコードする核酸はプラスミドベクターに含有される。プラスミド発現ベクターの例には、CDM8(Seed,B.(1987)、Nature、329:840)およびpMT2PC(Kaufman他(1987)、EMBO J.、6:187〜195)が含まれる。
別の実施形態において、細胞に導入されるための核酸分子はウイルスベクターに含有される。この状況では、遺伝子産物をコードする核酸はウイルスゲノム(または部分的なウイルスゲノム)に挿入される。遺伝子産物の発現を行わせる調節エレメントを、ウイルスゲノムに挿入された核酸とともに含ませることができる(すなわち、ウイルスゲノムに挿入された遺伝子に連結することができる)か、または、そのような調節エレメントをウイルスゲノム自身によって提供され得る。
ネイクド核酸は、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、直接的な注入、および受容体媒介による取り込みを使用して細胞に導入することができる。
ネイクド核酸(例えば、DNA)は、核酸およびリン酸カルシウムを含有する沈殿物を形成させることによって細胞に導入することができる。例えば、HEPES緩衝化生理的食塩水溶液を、塩化カルシウムおよび核酸を含有する溶液と混合して、沈殿物を形成させることができ、その後、沈殿物は細胞とインキュベーションされる。グリセロールまたはジメチルスルホキシドによるショック工程を、特定の細胞により取り込まれる核酸の量を増大させるために加えることができる。CaPO4媒介トランスフェクションは、安定(または一過性)に細胞をトランスフェクションするために使用することができ、また、細胞のインビトロ操作に対して適用可能であるにすぎない。CaPO4媒介トランスフェクションのための様々なプロトコルを、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel、F.M.他(編)、Greene Publishing Associates、(1989)、第9.1節)、およびMolecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、Sambrook他、Cold Spring Harbor Laboratory Press、(1989)、第16.32節〜第16.40節)、または他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。
ネイクド核酸は、核酸およびDEAE−デキストランの混合物を形成させ、混合物を細胞とインキュベーションすることによって細胞に導入することができる。ジメチルスルホキシドまたはクロロキンによるショック工程を、核酸取込みの量を増大させるために加えることができる。DEAE−デキストランによるトランスフェクションは、細胞のインビトロ操作に対して適用可能であるにすぎず、DNAを一過性に細胞に導入するために使用することができ、しかし、安定にトランスフェクションされた細胞を作製するためには好ましくない。従って、この方法は、遺伝子産物の短期間の産生のために使用することができ、しかし、遺伝子産物を長期間にわたって産生させるための優れた方法ではない。DEAE−デキストラン媒介トランスフェクションのための様々なプロトコルを、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel、F.M.他(編)、Greene Publishing Associates、(1989)、第9.2節)、およびMolecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、Sambrook他、Cold Spring Harbor Laboratory Press、(1989)、第16.41節〜第16.46節)、または他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。
ネイクド核酸はまた、適切な緩衝液において細胞および核酸を一緒にインキュベーションし、細胞に高電圧の電気パルスを与えることによって細胞に導入することができる。核酸がエレクトロポレーションによって細胞に導入される効率は、加えられた電場の強さ、電気パルスの長さ、温度、DNAの立体配座および濃度、ならびに媒体のイオン組成によって影響を受ける。エレクトロポレーションは、広範囲の様々な細胞タイプを安定(または一過性)にトランスフェクションするために使用することができ、また、細胞のインビトロ操作に対して適用可能であるにすぎない。細胞のエレクトロポレーションのための様々なプロトコルを、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel、F.M.他(編)、Greene Publishing Associates、(1989)、第9.3節)、およびMolecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、Sambrook他、Cold Spring Harbor Laboratory Press、(1989)、第16.54節〜第16.55節)、または他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。
ネイクド核酸が細胞に導入され得る別の方法には、リポソーム媒介トランスフェクション(リポフェクション)が含まれる。核酸は、カチオン性脂質を含有するリポソーム懸濁物と混合される。その後、DNA/リポソームの複合体が細胞とインキュベーションされる。リポソーム媒介トランスフェクションは、インビトロで培養中の細胞を安定(または一過性)にトランスフェクションするために使用することができる。様々なプロトコルを、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel、F.M.他(編)、Greene Publishing Associates、(1989)、第9.4節)、および他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。また、インビボでの遺伝子送達が、リポソームを使用して達成されている。例えば、Nicolau他(1987)、Meth.Enz.、149:157〜176;WangおよびHuang(1987)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:7851〜7855;Brigham他(1989)、Am.J.Med.Sci.、298:278;Gould−Fogerite他(1989)、Gene、84:429〜438を参照のこと。
ネイクド核酸はまた、核酸を細胞に直接注入することによって細胞に導入することができる。細胞のインビトロ培養物の場合、DNAをマイクロインジェクションによって導入することができる。それぞれの細胞が個々にマイクロインジェクションされるので、この方法は、非常に多数の細胞を改変するときには非常に労働集約的である。しかしながら、マイクロインジェクションが優れた方法である状況が、(下記においてより詳しく議論される)遺伝子組換え動物の作製においてである。この状況では、DNAは、受精した卵母細胞に安定に導入され、その後、卵母細胞は動物に発達させることができる。得られる動物は、卵母細胞に導入されたDNAを有する細胞を含有する。直接的な注入もまた、ネイクドDNAを細胞にインビボで導入するために使用されている(例えば、Acsadi他(1991)、Nature、332:815〜818;Wolff他(1990)、Science、247:1465〜1468を参照のこと)。DNAを細胞にインビボで注入するための送達装置(例えば、「遺伝子銃」)を使用することができる。そのような装置が(例えば、BioRadから)市販されている。
ネイクド核酸は、受容体媒介のエンドサイトーシスにより取り込まれるために細胞表面受容体に対するリガンドに結合されるポリリシンなどのカチオンに対して複合体を形成させることができる(例えば、Wu,G.およびWu,C.H.(1988)、J.Biol.Chem.、263:14621;Wilson他(1992)、J.Biol.Chem.、267:963〜967;米国特許第5166320号を参照のこと)。核酸−リガンド複合体が受容体に結合することにより、DNAの取込みが受容体媒介のエンドサイトーシスによって促進される。DNA−リガンド複合体が標的とする受容体には、トランスフェリン受容体およびアシアロ糖タンパク質受容体が含まれる。エンドソームを本来的に破壊し、それにより物質を細胞質内に放出するアデノウイルスカプシドに連結されたDNA−リガンド複合体を、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避するために使用することができる(例えば、Curiel他(1991)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:8850;Cristiano他(1993)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:2122〜2126を参照のこと)。受容体媒介によるDNA取込みを、DNAをインビトロまたはインビボのいずれかで細胞に導入するために使用することができ、また、受容体媒介によるDNA取込みは、目的とする標的細胞において選択的に発現する受容体に結合するリガンドの使用により、DNAが特定の細胞タイプに対して選択的に標的化され得るという別の特徴を有する。
一般に、ネイクドDNAが、(例えば、上記で記載されたトランスフェクション技術の1つによって)培養中の細胞に導入されるとき、小さい割合の細胞(105個のうちの約1個)のみが、典型的には、トランスフェクションされたDNAをそのゲノムに組込むにすぎない(すなわち、DNAは細胞においてエピソームに維持される)。従って、外因性DNAを取り込んでいる細胞を同定するために、選択マーカーをコードする核酸を目的とする核酸と一緒に細胞にトランスフェクションすることが好都合である。好ましい選択マーカーには、G418、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を付与するマーカーが含まれる。選択マーカーは、目的とする遺伝子と同じプラスミドで導入することができ、または、別個のプラスミドで導入することができる。
遺伝子産物をコードする核酸を細胞に導入するための好ましい方法は、遺伝子産物をコードする核酸(例えば、cDNA)を含有するウイルスベクターの使用による方法である。ウイルスベクターによる細胞の感染は、大きな割合の細胞が核酸を受け取るという利点を有しており、これにより、核酸を受け取っている細胞を選択しなければならないことが回避され得る。また、ウイルスベクター内にコードされる分子(例えば、ウイルスベクターに含有されるcDNA)が、ウイルスベクターの核酸を取り込んでいる細胞において効率的に発現される。ウイルスベクターシステムはインビトロまたはインビボのいずれでも使用することができる。
欠陥レトロウイルスが、遺伝子治療目的のための遺伝子移入における使用のために詳しく特徴づけられている(総説については、Miller,A.D.(1990)、Blood、76:271を参照のこと)。目的とする遺伝子産物をコードする核酸がレトロウイルスのゲノムに挿入された組換えレトロウイルスを構築することができる。また、レトロウイルスのゲノムの一部を除いて、レトロウイルスを複製欠陥にすることができる。その後、複製欠陥レトロウイルスはビリオンにパッケージングされ、これを使用して、標準的な技術によってヘルパーウイルスの使用により標的細胞に感染させることができる。組換えレトロウイルスを作製し、そのようなウイルスを用いてインビトロまたはインビボで細胞に感染させるための様々なプロトコルを、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel、F.M.他(編)、Greene Publishing Associates、(1989)、第9.10節〜第9.14節)、および他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。好適なレトロウイルスの例には、pLJ、pZIP、pWEおよびpEMが含まれ、これらは当業者には広く知られている。好適なパッケージングウイルス株の例には、ΨCrip、ΨCrip、Ψ2およびΨAmが含まれる。レトロウイルスは、様々な遺伝子を、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多くの異なる細胞タイプにインビトロおよび/またはインビボで導入するために使用されている(例えば、Eglitis他(1985)、Science、230:1395〜1398;Danosand Mulligan(1988)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:6460〜6464;Wilson他(1988)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:3014〜3018;Armentano他(1990)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87:6141〜6145;Huber他(1991)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:8039〜8043;Feri他(1991)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:8377〜8381;Chowdhury他(1991)、Science、254:1802〜1805:van Beusechem他(1992)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:7640〜7644;Kay他(1992)、Human Gene Therapy、3:641〜647;Dai他(1992)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:10892〜10895;Hwu他(1993)、J.Immunol.、150:4104〜4115;米国特許第4868116号;米国特許第4980286号;PCT国際特許出願公開WO89/07136;PCT国際特許出願公開WO89/02468;PCT国際特許出願公開WO89/05345;PCT国際特許出願公開WO92/07573を参照のこと)。レトロウイルスベクターでは、レトロウイルスのゲノム(およびそれに挿入される外来核酸)が宿主のゲノムに組み込まれて、核酸を細胞に安定に導入するためには、標的細胞の分裂が必要である。従って、標的細胞の複製を刺激することが必要となる場合がある。
アデノウイルスのゲノムを、目的とする遺伝子産物をコードし、かつ発現し、しかし、正常な溶解性ウイルス生活環において複製するその能力に関して不活性化されているように操作することができる。例えば、Berkner他(1988)、BioTechniques、6:616;Rosenfeld他(1991)、Science、252:431〜434;Rosenfeld他(1992)、Cell、68:143〜155を参照のこと。アデノウイルス株Adタイプ5dl324または他のアデノウイルス株(例えば、Ad2、Ad3、Ad7など)に由来する好適なアデノウイルスベクターが当業者には広く知られている。組換えアデノウイルスは、効果的な遺伝子送達ビヒクルであるために分裂中の細胞を要求せず、また、気道上皮(Rosenfeld他(1992)、上掲)、内皮細胞(Lemarchand他(1992)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:6482〜6486)、肝細胞(HerzおよびGerard(1993)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:2812〜2816)および筋肉細胞(Quantin他(1992)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:2581〜2584)を含む広範囲の様々な細胞タイプに感染させるために使用することができるという点で好都合である。また、導入されたアデノウイルスDNA(およびそれに含有される外来DNA)は宿主細胞のゲノムに組み込まれず、エピソームにとどまり、それにより、導入されたDNAが宿主ゲノムに組み込まれる状況(例えば、レトロウイルスDNA)における挿入変異誘発の結果として生じ得る潜在的な問題が回避される。そのうえ、外来DNAに対するアデノウイルスゲノムの運搬能が、他の遺伝子送達ベクターに対して大きい(8キロベースまでである)(Berkner他、上掲;Haj−AhmandおよびGraham(1986)、J.Virol.57:267)。現在使用されているほとんどの複製欠陥アデノウイルスベクターは、ウイルスのE1遺伝子およびE3遺伝子のすべてまたは一部について欠失されているが、アデノウイルスの遺伝物質の80%ほどが保持されている。
アデノ関連ウイルス(AAV)は、効率的な複製および繁殖的な生活環のためのヘルパーウイルスとして別のウイルス(例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなど)を要求する天然に存在する欠陥ウイルスである(総説については、Muzyczka他、Curr.Topics In Micro.And Immunol.(1992)、158:97〜129を参照のこと)。アデノ関連ウイルスはまた、DNAを非分裂の細胞に組み込むことができ、かつ、高頻度の安定な組み込みを示す数少ないウイルスの1つである(例えば、Flotte他(1992)、Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.、7:349〜356;Samulski他(1989)、J.Virol.、63:3822〜3828;McLaughlin他(1989)、J.Virol.、62:1963〜1973を参照のこと)。AAVの300塩基対もの少数を含有するベクターをパッケージングすることができ、かつ組み込むことができる。外因性DNAのための余地は約4.5kbに制限される。AAVベクター、例えば、Tratschin他(1985)、Mol.Cell.Biol.、5:3251〜3260に記載されるベクターなどを使用して、DNAを細胞に導入することができる。様々な核酸が、AAVベクターを使用して種々の細胞タイプに導入されている(例えば、Hermonat他(1984)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:6466〜6470;Tratschin他(1985)、Mol.Cell.Biol.、4:2072〜2081;Wondisford他(1988)、Mol.Endocrinol.、2:32〜39;Tratschin他(1984)、J.Virol.、51:611〜619;Flotte他(1993)、J.Biol.Chem.、268:3781〜3790を参照のこと)。
核酸を細胞に導入する特定の発現ベクターシステムの効率および方法の効率は、当該分野で日常的に使用されている標準的な方法をによって評価することができる。例えば、細胞に導入されたDNAをフィルターハイブリダイゼーション技術(例えば、サザンブロッティング)によって検出することができ、また、導入されたDNAの転写により産生されたRNAを、例えば、ノーザンブロッティング、RNase保護または逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって検出することができる。遺伝子産物を、適切なアッセイによって、例えば、特異的な抗体などを用いた、産生されたタンパク質の免疫学的検出によって、または、遺伝子産物の機能的活性を検出するための機能的アッセイ(例えば、酵素アッセイなど)によって検出することができる。細胞により発現されることが注目される目的とする遺伝子産物が容易にアッセイできない場合、発現システムは、使用される調節エレメントおよびベクターに連結されたレポーター遺伝子を使用して最初に最適化され得る。レポーター遺伝子は、容易に検出することができる遺伝子産物をコードし、従って、システムの効率を評価するために使用することができる。当該分野で使用されている標準的なレポーター遺伝子には、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよびヒト成長ホルモンをコードする遺伝子が含まれる。
核酸を細胞の集団に導入するために使用される方法により、細胞の大きな割合の改変、および、細胞による遺伝子産物の効率的な発現がもたらされる場合(例えば、ウイルス発現ベクターを使用した場合には多いが)、改変された細胞集団は、集団内の個々の細胞をさらに単離またはサブクローニングすることなく使用することができる。すなわち、さらなる細胞単離が必要とされないように、その細胞集団による遺伝子産物の十分な産生がもたらされ得る。あるいは、1個の改変された細胞から同一的に改変された細胞の均一な集団を成長させて、遺伝子産物を効率的に発現する細胞を単離することが望ましい場合がある。一様な細胞のそのような集団は、1個の改変された細胞を限界希釈クローニングにより単離し、その後、標準的な技術によって1個の細胞を培養で拡大して細胞のクローン集団にすることによって調製することができる。
本発明の好ましい実施形態によれば、本明細書中上記で記載された方法のそれぞれにおいて、造血単核細胞にエクスビボ細胞増殖のための条件を提供することは、細胞に、栄養分と、サイトカインとを提供することによって達成される。好ましくは、サイトカインは早期作用サイトカインであり、例えば、限定されないが、幹細胞因子、FLT3リガンド、インターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−6、インターロイキン−10、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子−αおよびトロンンボポイエチンなどである。これに関連して、新規なサイトカインが継続して発見され、そのいくつかが本発明の細胞拡大方法において有用であり得ることが理解される。
後期作用サイトカインもまた使用することができる。これらには、例えば、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、FGF、EGF、NGF、VEGF、LIF、肝細胞増殖因子およびマクロファージコロニー刺激因子が含まれる。
造血単核細胞に存在する造血幹細胞の分化を阻害する本発明の薬剤の能力は、細胞回収および細胞培養などの技術的適用においてさらに使用することができる。
本発明のさらなる局面によれば、造血幹細胞回収/培養バッグが提供される。本発明の細胞回収/培養バッグには、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞の造血幹細胞画分の細胞分化を実質的に阻害する効果的な量のレチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニストおよび/またはビタミンD受容体アンタゴニストが補充される。あるいは、本発明の造血幹細胞回収/培養バッグには、効果的な量のニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、または、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物が補充される。さらにあるいは、本発明の造血幹細胞回収/培養バッグには、効果的な量のPI3−キナーゼ阻害剤が補充される。さらにあるいは、本発明の造血幹細胞回収/培養バッグには、効果的な量の1つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートが補充される。
本発明のさらなる局面によれば、特定の分子/薬剤(例えば、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニスト、ビタミンD受容体アンタゴニスト、CD38阻害剤、PI3−キナーゼ阻害剤、銅キレーターまたは銅キレートなど)が、造血単核細胞画分に存在する造血幹細胞の集団を拡大するための効果的な薬剤であるかどうかを明かにするアッセイが提供される。
本発明のこの局面によるこのアッセイは、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、試験されている薬剤/分子の存在下で培養し、造血幹細胞の拡大を経時的に(例えば、数週間〜数ヶ月)モニターすることによって行われる。増大した拡大および低下した分化が、非処理の細胞と比較して生じる場合、試験された薬剤/分子は効果的な造血幹細胞拡大剤である。
好ましくは、造血単核細胞を培養することは、効果的な量のサイトカインの存在下で、好ましくは、早期作用サイトカインまたはそのようなサイトカインの組合せの存在下で、例えば、トロンボポイエチン(TPO)、インターロイキン−6(IL−6)、FLT−3リガンドおよび幹細胞因子(SCF)の存在下で行われる。このアッセイは、例えば、上記で列挙されたアンタゴニスト、阻害剤、または銅キレーターおよび銅キレートのどれが、本明細書中上記で記載された本発明の様々な方法および調製物を実行するために最も効率的であるかを明らかにするために、当業者によって使用することができる。このアッセイはさらに、異なる起源の造血単核細胞を用いて最適な結果を達成するために最も効果的な濃度および暴露時間を決定するために使用することができる。
本明細書中上記で記載された本発明の局面のそれぞれにおいて、造血単核細胞は、動物および植物の両方を含む任意の多細胞生物から得ることができる。好ましくは、造血単核細胞は、骨髄(Rowley SD他(1998)、Bone Marrow Transplant、21:1253)、末梢血(Koizumi K(2000)、Bone Marrow Transplant、26:787)、肝臓(Petersen BE他(1998)、Hepatology、27:433)および新生児臍帯血から得られる。
本発明のさらなる目的、利点、および新規の特徴は、制限を意図しない以下の実施例の実験によって当業者に自明である。さらに、上記の本発明および以下の特許請求の範囲に記載の各々の種々の実施形態および態様は、以下の実施例により支持される。
ここでは、上記説明と共に以下の実施例を参照して、非限定的様式で本発明を例示する。
実施例1
単核細胞培養物の造血幹細胞のエクスビボ拡大に対する銅キレーターの影響
実験手法
サンプル収集および処理:サンプルを、正常な満期出産の後の臍帯血から得て、分娩後24時間以内に凍結した。血液細胞をDextran緩衝液中で解凍し、10%ウシ胎児血清(FCS;Biological Industries)が補充されたMEM(Biological Industries、イスラエル)において15時間インキュベーションした。その後、細胞をFicoll−Hypaque(1.077グラム/mlの密度;Sigma)に重層して、400gで30分間、室温で遠心分離した。その後、境界層における単核細胞を集め、リン酸塩緩衝化生理的食塩水(PBS;Biological Industries)で3回洗浄し、0.5%ヒト血清アルブミン(HSA)を含有するPBSに再懸濁した。その後、細胞を2つに分け、1つを単核細胞(MNC)画分とし、もう一方の画分を、「MiniMACS CD34+始原(前駆)細胞単離キット」(Miltenyi Biotec、Aubum、CA)を製造者の説明書に従って使用する免疫磁石分離によってCD34+細胞を精製するために使用した。得られたCD34+細胞の純度は、フローサイトメトリーによる評価に基づいて95%〜98%の範囲であった。
単核細胞培養物の造血幹細胞のエクスビボ拡大に対する銅キレーターの影響
実験手法
サンプル収集および処理:サンプルを、正常な満期出産の後の臍帯血から得て、分娩後24時間以内に凍結した。血液細胞をDextran緩衝液中で解凍し、10%ウシ胎児血清(FCS;Biological Industries)が補充されたMEM(Biological Industries、イスラエル)において15時間インキュベーションした。その後、細胞をFicoll−Hypaque(1.077グラム/mlの密度;Sigma)に重層して、400gで30分間、室温で遠心分離した。その後、境界層における単核細胞を集め、リン酸塩緩衝化生理的食塩水(PBS;Biological Industries)で3回洗浄し、0.5%ヒト血清アルブミン(HSA)を含有するPBSに再懸濁した。その後、細胞を2つに分け、1つを単核細胞(MNC)画分とし、もう一方の画分を、「MiniMACS CD34+始原(前駆)細胞単離キット」(Miltenyi Biotec、Aubum、CA)を製造者の説明書に従って使用する免疫磁石分離によってCD34+細胞を精製するために使用した。得られたCD34+細胞の純度は、フローサイトメトリーによる評価に基づいて95%〜98%の範囲であった。
造血幹細胞のエクスビボ拡大:本明細書中上記に記載されるようにして得られた単核細胞(MNC)を、10%ウシ胎児血清(FBS;Biological Industries)が補充されたアルファ最少必須培地(α−MEM)とともに、約106細胞/mlの濃度で、24ウエルのCostar Cell Cluster(Corning Inc.、Corning、NY)に置床し、または培養バッグ(American Fluoroseal Corp.)に接種した。精製されたCD34+細胞を、約104細胞/mlの濃度で、同様に置床し、または培養バッグに接種した。培地には、テトラエチレンペンタミン(TEPA)キレーター(Sigmaから得られる)および/または下記のヒト組換えサイトカイン(すべてがPerpo Tech,Inc.(Rocky Hill、NJ)から得られる)を補充した:トロンボポイエチン(TPO)、50ng/ml;インターロイキン6(IL−6)、50ng/ml;FLT−3リガンド、50ng/ml;幹細胞因子(SCF)、50ng/ml;時々、SCFをIL−3(20ng/ml)により置き換えた。すべての培養物を、5%CO2/空気の雰囲気で加湿下、37℃でインキュベーションした。1週間間隔で、細胞培養物を半分除き、サイトカインを含有する新しい培地を補充した。種々のインキュベーション期間の後、細胞を集め、トリパンブルーで染色して、計数した。
形態学的評価:
サイトスピン(Cytocentrifuge,Shandon,Runcorn,UK)によりスライドガラス上に堆積した細胞のアリコートついて、得られた培養集団の形態学的特徴づけを行った。細胞を固定し、May−Gruwald/Giemsa染色液で染色し、顕微鏡で試験した。
サイトスピン(Cytocentrifuge,Shandon,Runcorn,UK)によりスライドガラス上に堆積した細胞のアリコートついて、得られた培養集団の形態学的特徴づけを行った。細胞を固定し、May−Gruwald/Giemsa染色液で染色し、顕微鏡で試験した。
表面抗原分析:
細胞を採取し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.1%アジ化ナトリウム(Sigma)を含むPBS溶液で洗浄し、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリトリン結合抗体(全てImmunoquality Products,the Netherlands)を用いて4℃で60分間染色した。次いで、細胞を同じ緩衝液で洗浄し、FACSキャリバまたはFacstarplusフローサイトメーターによって分析した。シース液として生理食塩水を使用して、細胞を1000細胞/秒の速度で通過させた。488nmのアルゴンレーザビームを励起光源として使用した。対数増幅を使用して10,000個の細胞の発光を測定し、CellQuestソフトウェアを使用して分析した。
細胞を採取し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.1%アジ化ナトリウム(Sigma)を含むPBS溶液で洗浄し、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリトリン結合抗体(全てImmunoquality Products,the Netherlands)を用いて4℃で60分間染色した。次いで、細胞を同じ緩衝液で洗浄し、FACSキャリバまたはFacstarplusフローサイトメーターによって分析した。シース液として生理食塩水を使用して、細胞を1000細胞/秒の速度で通過させた。488nmのアルゴンレーザビームを励起光源として使用した。対数増幅を使用して10,000個の細胞の発光を測定し、CellQuestソフトウェアを使用して分析した。
CD34+細胞およびサブセットの決定:
精製したCD34+細胞または全MNC画分のいずれかを用いて開始した短期および長期培養物について、CD34+表面発現を、以下のように決定した:CD34+細胞を再度ポジティブ選択し(Miltenyiキット)、計数した。その後、FACSおよび細胞形態分析によって、純度を確認した。
精製したCD34+細胞または全MNC画分のいずれかを用いて開始した短期および長期培養物について、CD34+表面発現を、以下のように決定した:CD34+細胞を再度ポジティブ選択し(Miltenyiキット)、計数した。その後、FACSおよび細胞形態分析によって、純度を確認した。
再選択したCD34+細胞サブセットを、以下の抗原の組み合わせで染色した:CD34PE/CD38FITCおよびCD34PE/38,33,14,15,3,4,61,19(Lin)FITC。
細胞集団の計算:
FACS分析の結果を、細胞の比率で示す。サブセットの絶対数を、CD34+細胞の絶対数から計算する。
FACS分析の結果を、細胞の比率で示す。サブセットの絶対数を、CD34+細胞の絶対数から計算する。
CD34+/CD38−細胞およびCD34+/Lin−細胞のベースラインの決定を、以下のように行った:CD34+細胞を3つの解凍臍帯血単位から精製し、上記マーカーについて染色した。これらの実験の平均を、ベースライン値と見なした。
総細胞数、CD34+細胞およびサブセットの数、ならびにCFU数を、培養物が継代されていないということを前提として、累積数(すなわち、mlあたりの細胞数×実施した継代の数)として示す。
コロニー形成単位(CFU)能力のアッセイ:
2IU/mlエリスロポイエチン(Eprex,Cilag AG Int.,Switzerland)、幹細胞因子、およびIL−3(共に20ng/ml)、ならびにG−CSFおよびGM−CSF(共に10ng/ml)(全てPerpo Tech)を補充した半固体メチルセルロース含有培地中で細胞をクローニングした。培養物を、37℃、5%CO2の加湿空気中で14日間インキュベートした。
2IU/mlエリスロポイエチン(Eprex,Cilag AG Int.,Switzerland)、幹細胞因子、およびIL−3(共に20ng/ml)、ならびにG−CSFおよびGM−CSF(共に10ng/ml)(全てPerpo Tech)を補充した半固体メチルセルロース含有培地中で細胞をクローニングした。培養物を、37℃、5%CO2の加湿空気中で14日間インキュベートした。
LTC−CFUc値の決定:
培養物の自己再生を維持する能力を、上記引例に記載されているように、長期および延長した長期培養物におけるコロニー形成単位(LTC−CFUc)の含有量の決定によって測定した。
培養物の自己再生を維持する能力を、上記引例に記載されているように、長期および延長した長期培養物におけるコロニー形成単位(LTC−CFUc)の含有量の決定によって測定した。
実験結果
単核細胞(MNC)を、上記に記載されるように培養バッグに接種し、栄養分およびサイトカイン(50ng/mlのFLt3、IL−6、TPOおよびSCF)を与えた。MNC培養物を様々な濃度(5〜10μM)のTEPAキレーターで処理(処置)し、または非処理(非処置)であった(非処理コントロール)。処理されたMNC培養物には、最初の3週間だけTEPAを補充し、3週目以降、キレーター非含有培地を重層した。事前に精製されたCD34+培養物には、TEPAを補充せず、これを陽性コントロールとして使用した。培養物を、細胞数(CFUc細胞、CD34+細胞およびCD34+CD38−細胞)について12週間の期間中、毎週分析した。CD34+細胞の含有量を正確に求めるために、CD34+細胞を毎週、実験群(処置MNC培養物および非処置MNC培養物)および陽性コントロール(CD34+培養物)のそれぞれから再選択し、計数した。
単核細胞(MNC)を、上記に記載されるように培養バッグに接種し、栄養分およびサイトカイン(50ng/mlのFLt3、IL−6、TPOおよびSCF)を与えた。MNC培養物を様々な濃度(5〜10μM)のTEPAキレーターで処理(処置)し、または非処理(非処置)であった(非処理コントロール)。処理されたMNC培養物には、最初の3週間だけTEPAを補充し、3週目以降、キレーター非含有培地を重層した。事前に精製されたCD34+培養物には、TEPAを補充せず、これを陽性コントロールとして使用した。培養物を、細胞数(CFUc細胞、CD34+細胞およびCD34+CD38−細胞)について12週間の期間中、毎週分析した。CD34+細胞の含有量を正確に求めるために、CD34+細胞を毎週、実験群(処置MNC培養物および非処置MNC培養物)および陽性コントロール(CD34+培養物)のそれぞれから再選択し、計数した。
結果が、下記の図1a〜b、図2および図3に示される。結果は、非精製MNC培養物へのTEPAキレーターの添加は、12週間の期間にわたって、CD34+細胞、CD34+コロニー形成細胞およびCD34+CD38−細胞の数を実質的かつ徐々に増大させたことを示している。従って、TEPAで処理されたMNC培養物では、CD34+細胞の累積数が、2週間後の検出不能レベルから12週間後の8x107細胞/ml以上に増大した(図1a〜b);CD34+CD38−細胞の累積数が、2週間後の検出不能レベルから12週間後の2.5x107細胞/mlに増大した(図2);CD34+CFUsの数が、2週間後の検出不能レベルから10週間後の3.2x107細胞/mlに増大した(図3)。他方で、TEPAがMNC培養物に添加されなかった場合(非処置コントロール)、幹細胞または始原細胞の著しい拡大は12週間の期間を通して測定されなかった。さらに、TEPAで処置されたMNC培養物における幹細胞および始原細胞の密度は、事前に精製されたCD34+細胞培養物(これはTEPAで処置されていない;陽性コントロール)における幹細胞および始原細胞の密度に等しいか、またはそれを超えていた。長期間にわたるTEPA処置MNC培養物に由来する細胞の形態学的分析により、非分化細胞の割合が大きく、一方、TEPAで処置されていない長期のMNC培養物に由来する細胞のほとんどは完全に分化していることが明らかにされた。
本実施例において記載される結果は、造血幹細胞および造血前駆細胞が、CD34+細胞の事前の精製を伴うことなく、混合(単核細胞画分)血液細胞の培養において、少なくとも12週間の期間にわたって継続してエクスビボで実質的に拡大され得ることを明瞭に示している。データはまた、この作用が、最初の3週間の培養時にだけTEPAキレーターを細胞培養培地に補充することから生じたことを示している。
これらの結果は、サイトカインに加えてTEPAが補充された短期間のMNC細胞培養物は、サイトカインだけで処置されたMNC培養物で得られるこれらの細胞の最小限の拡大と比較して、CD34+細胞および幹細胞/早期始原細胞(CD34+38−)の非常に大きい拡大を可能にしたことを示している。比較実験により、CD34+細胞およびその希なCD34+38−細胞サブセットの拡大が、延長された長期の培養において引き続き生じ、また、高度に精製されたCD34+細胞で開始された培養物から得られる拡大と比較してはるかに大きくなっていることが明らかにされた。従って、これらの結果から、TEPAによるMNCの短期間の処置は、長期にわたる自己再生能を伴って細胞のより大きい拡大を可能にする方法でMNC培養物を高めることが示唆され得る。
これらの結果からはまた、CD34+細胞およびその早期サブセットに対する調節作用に加えて、キレーターはまた、CD34+細胞画分に関して同時に精製されていない小さい細胞サブセットのエクスビボ拡大を可能にし得ることが示唆され得る。この細胞サブセットは、事実上CD34−であるとおそらくは考えられるが、延長された長期の培養の時におけるCD34+細胞およびそのサブセットの優れた拡大を支援し得る。
従って、本実施例では、混合単核細胞培養物における幹細胞および始原細胞の実質的なエクスビボ拡大が例示される。この新規な手法では、当該分野で現在使用されている、培養の開始に先立つ、手間および費用のかかる幹細胞濃縮の必要性が回避される。従って、TEPAなどの銅キレーターの使用により、幹細胞および/または始原細胞のエクスビボ拡大の手法が実質的に簡略化され、その費用が削減され、また、その効率が改善され得る。
実施例2
単核細胞培養物の造血幹細胞のエクスビボ拡大に対する銅キレートの影響
銅−TEPAキレートを、例えば、国際特許出願PCT/IL03/00062に記載されるように調製した。
単核細胞培養物の造血幹細胞のエクスビボ拡大に対する銅キレートの影響
銅−TEPAキレートを、例えば、国際特許出願PCT/IL03/00062に記載されるように調製した。
単核細胞(MNC)を、上記の実施例1に記載されるように培養バッグに接種し、これに栄養分およびサイトカインを与えた。単核細胞培養物は非処置(コントロール)であるか、または、Cu−TEPAキレートで処置された。処置されたMNC培養物には、銅−TEPAキレートが最初の3週間にわたって補充され、3週目以降はキレーター非含有培地が重層された。すべての培養物は、8週間の期間の後、8週間分析された。
結果が下記の表1に示される。結果は、MNC培養物への銅−TEPAキレートの添加により、8週間のインキュベーション期間の後、CD34+細胞の数、CD34+細胞の割合、およびCD34+CD38−細胞の数が著しく増大したことを示している。従って、インキュベーション後の培養バッグあたりのCD34+細胞の累積数は、非処置培養物(サイトカインのみ)、50μMの銅−TEPAで処置された培養物、および100μMの銅−TEPAで処置された培養物において、それぞれ、2.56x106、12.37x106または32.85x106であった。CD34+CD38−細胞の累積数は、非処置のコントロール培養物(サイトカインのみ)における2.1x105から、銅−TEPA(100μM)で処置された培養物における6.1x105にまで増大した。
本実施例において記載される結果から、造血幹細胞が、銅−TEPAなどの銅キレートの存在下、CD34+細胞の事前の精製を行うことなく、単核血液細胞の培養物において、少なくとも8週間の期間にわたってエクスビボで実質的に拡大され得ることが明らかにされる。
実施例3
単核細胞培養物の造血幹細胞のエクスビボ拡大に対するRARアンタゴニストの影響
材料および実験方法
高親和性レチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストの4−[[4−(4−エチルフェニル)−2,2−ジメチル−(2H)−チオコメン−6−イル]]安息香酸(AGN194310)を、国際特許出願PCT/IL03/00064に記載される手法に従って合成した。
単核細胞培養物の造血幹細胞のエクスビボ拡大に対するRARアンタゴニストの影響
材料および実験方法
高親和性レチノイン酸受容体(RAR)アンタゴニストの4−[[4−(4−エチルフェニル)−2,2−ジメチル−(2H)−チオコメン−6−イル]]安息香酸(AGN194310)を、国際特許出願PCT/IL03/00064に記載される手法に従って合成した。
単核細胞画分を、上記の実施例1に記載されるように集め、精製した。MNC培養物を、上記に記載されるように調製し、維持した。AGN194310のRARアンタゴニストを1x10−3M〜1x10−11M[すなわち、410μg/l〜4.1x10−5μg/l]の範囲の濃度で試験培養物に加えた。このアンタゴニストは、所定の限られた期間、3週間までの間、または全培養期間中連続して加えられた。
表2に表わされる結果は以下のことを示す:RARアンタゴニストおよびサイトカインの存在下で培養した単核細胞画分は、最初の播種から2週間後および5週間後(それぞれ)に再選択した高度に精製したCD34+細胞画分からFACS分析で定量したところ、コントロールの未処理MNC画分と比較して、CD34+Lin−細胞数の有意な増加を示した(78%、24%)。MNC細胞は、CD34+集団の精製を先に行わなくても、RARアンタゴニストに応答し、未分化の集団を拡大させた。RARアンタゴニストでの処理は、播種から5週間後で幹細胞/先祖細胞画分の特異的拡大を刺激するのに十分である一方で、コントロールの未処理MNCでは検出可能なCD34+集団は得られず、RARアンタゴニストで処理した培養物では有意な数のCD34+細胞が得られ、これらは系統マーカーを欠いていた。したがって、コントロールサンプル中でのCD34+細胞の生存を抑制するMNC培養細胞によって詳しく調べられた全ての因子では、この画分を詳しく調べるためにRARアンタゴニストによって得られたシグナルを超えるには不十分である。
明確にするために異なる実施形態の状況について記載してきた本発明の一定の特徴は、1つの実施形態において組み合わせて得ることもできることが認識される。逆に、簡潔にするために1つの実施形態の状況について記載した本発明の種々の特徴を、個別または任意の適切な組み合わせで得ることもできる。
本発明を特定の実施形態と共に記載しているが、多数の変更形態、修正形態、および変形形態が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれるこのような全ての変更形態、修正形態、および変形形態が含まれることが意図される。全ての刊行物、本明細書中に記載した特許および特許出願は、その全体が、それぞれの刊行物、本明細書中に記載した特許および特許出願があたかも特別または個別に本明細書中で参考として援用されるように示されるような範囲に本明細書中で参考として援用される。さらに、本出願における任意の引例の引用または識別により、このような引例が先行技術として本発明で利用可能であることを承認すべきではない。本発明および添付の特許請求の範囲の範囲は、ここに示されたいかなる明示のまたは特定の理論によって制限されるとみなされるべきではない。
Claims (200)
- 造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法であって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時にCD38の発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む方法。
- 以下の工程を含む、造血細胞を移植または埋込みする方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にCD38の発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みする工程。 - 前記ドナーおよび前記レシピエントが単一の個体である請求項2記載の方法。
- 以下の工程を含む、造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にCD38の発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する工程。 - 遺伝子改変することが外因遺伝子を含むベクターによって達成される請求項4記載の方法。
- ベクターがウイルスベクターまたは核酸ベクターである請求項5記載の方法。
- 以下の工程を含む、養子免疫療法の方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にCD38の発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植する工程。 - 造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、CD38の発現および/または活性を減少させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物。
- 前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項1、2、4および7のいずれかに記載の方法。
- エクスビボ細胞増殖のための前記条件を前記造血単核細胞に与えることは、前記造血単核細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む請求項1、2、4および7のいずれかに記載の方法。
- 前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項10記載の方法。
- 前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、FLT3リガンド、インターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−6、インターロイキン−10、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項11記載の方法。
- 前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項10記載の方法。
- 前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、FGF、EGF、NGF、VEGF、LIF、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項13記載の方法。
- CD38の前記発現および/または前記活性の減少のためのエクスビボ培養条件を前記造血単核細胞に与えることは、CD38発現を下方制御する薬剤を前記造血単核細胞に与えることによる請求項1、2、4および7のいずれかに記載の方法。
- 前記薬剤がCD38発現を下方制御する薬剤である請求項8記載の移植可能な造血細胞調製物。
- CD38発現を下方制御する前記薬剤は、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニスト、およびビタミンD受容体アンタゴニストからなる群から選択される請求項15および16のいずれかに記載の方法。
- CD38発現を下方制御する前記薬剤が、前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を減少させるためのアンタゴニストである請求項15および16のいずれかに記載の方法。
- CD38発現を下方制御する薬剤がポリヌクレオチドである請求項15および16のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、抗CD38抗体、抗レチノイン酸受容体抗体、抗レチノイドX受容体抗体、または抗ビタミンD受容体細胞内抗体をコードする請求項19記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、抗CD38抗体、抗レチノイン酸受容体抗体、抗レチノイドX受容体抗体、または抗ビタミンD受容体抗体をコードする請求項19記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、細胞内CD38、レチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、またはビタミンD受容体のmRNA分解を指示する干渉性低分子ポリヌクレオチド分子である請求項19記載の方法。
- 前記干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、RNAi分子、アンチセンス分子、リボザイム分子、およびDNAzyme分子からなる群から選択される請求項22記載の方法。
- CD38発現を下方制御する前記薬剤がPI3−キナーゼ発現を下方制御する薬剤である請求項15および16のいずれかに記載の方法。
- PI3−キナーゼ発現を下方制御する前記薬剤がポリヌクレオチドである請求項24記載の方法。
- PI3−キナーゼ発現を下方制御する薬剤が細胞内抗体である請求項24記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが細胞内PI3−キナーゼmRNAまたは遺伝子分解を指示する干渉性低分子ポリヌクレオチド分子である請求項25記載の方法。
- 前記干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、RNAi分子、アンチセンス分子、リボザイム分子、およびDNAzyme分子からなる群から選択される請求項27記載の方法。
- CD38発現を下方制御する前記薬剤がPI3−キナーゼ活性を阻害する薬剤である請求項15および16のいずれかに記載の方法。
- PI3−キナーゼ活性を阻害する前記薬剤は、ウォルトマンニンおよびLY294002からなる群から選択される請求項30記載の方法。
- CD38の前記発現および/または前記活性を減少させるためのエクスビボ培養条件を前記造血単核細胞に与えることは、CD38活性を阻害する薬剤を前記造血単核細胞に与えることによる請求項1、2、4および7のいずれかに記載の方法。
- 前記薬剤がCD38活性を阻害する薬剤である請求項8記載の移植可能な造血細胞調製物。
- CD38活性を阻害する前記薬剤が、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物である請求項31および32のいずれかに記載の方法。
- 前記ニコチンアミドアナログは、ベンズアミド、ニコチンチオアミド、ニコチン酸、およびα−アミノ−3−インドールプロピオン酸からなる群から選択される請求項33記載の方法。
- CD38の前記発現および/または前記活性を減少させるためのエクスビボ培養条件を前記造血単核細胞に与えることは、PI3−キナーゼ活性を阻害する薬剤を前記造血単核細胞に与えることによる請求項1、2、4および7のいずれかに記載の方法。
- 前記薬剤がPI3−キナーゼ活性を阻害する薬剤である請求項8記載の移植可能な造血細胞調製物。
- PI3−キナーゼ活性を阻害する前記薬剤は、ウォルトマンニンおよびLY294002からなる群から選択される請求項35および36のいずれかに記載の方法。
- 造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法であって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む方法。
- 以下の工程を含む、造血細胞を移植または埋込みする方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みする工程。 - 前記ドナーおよび前記レシピエントが単一の個体である請求項39記載の方法。
- 以下の工程を含む、造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する工程。 - 遺伝子改変することが外因遺伝子を含むベクターによって達成される請求項41記載の方法。
- ベクターがウイルスベクターまたは核酸ベクターである請求項42記載の方法。
- 以下の工程を含む、養子免疫療法の方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植する工程。 - 造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および/またはビタミンDに対する応答能力を減少させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物。
- 前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項38、39、41、44および45のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物。
- エクスビボ細胞増殖のための前記条件を前記造血単核細胞に与えることは、前記造血単核細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む請求項38、39および44のいずれかに記載の方法。
- 前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項47記載の方法。
- 前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、FLT3リガンド、インターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−6、インターロイキン−10、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項48記載の方法。
- 前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項47記載の方法。
- 前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、FGF、EGF、NGF、VEGF、LIF、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項50記載の方法。
- 前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイドおよび/またはビタミンDに対する前記応答能力の減少が可逆的である請求項38、39、41、44および45のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイドおよび/またはビタミンDに対する前記応答能力の減少が、有効量の少なくとも1つのレチノイン酸受容体アンタゴニスト、少なくとも1つのレチノイドX受容体アンタゴニスト、および/または少なくとも1つのビタミンD受容体アンタゴニストの存在下での前記造血単核細胞のエクスビボ培養による請求項38、39、41、44および45のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイドおよび/またはビタミンDに対する前記応答能力の減少が、前記造血単核細胞の全エクスビボ培養期間の0.1〜50%の期間、有効量の少なくとも1つのレチノイン酸受容体アンタゴニスト、少なくとも1つのレチノイドX受容体アンタゴニスト、および/または少なくとも1つのビタミンD受容体アンタゴニストの存在下で前記造血単核細胞をエクスビボ培養することによる請求項53記載の方法。
- 前記薬剤は、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニスト、および/またはビタミンD受容体アンタゴニストからなる群から選択される請求項45記載の移植可能な造血細胞調製物。
- 前記レチノイン酸受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項53、54および55のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物:
AGN194310;AGN193109;3−(4−メトキシ−フェニルスルファニル)−3−メチル−酪酸;6−メトキシ−2,2−ジメチル−チオクロマン−4−オン,2,2−ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イルトリフルオロメタン−スルホネート;エチル4−((2,2ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート;エチル4−((2,2−ジメチル−4−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−(2H)−チオクロメン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート(41);チオクロメン−6−イル]−エチニル−ベンゾエート(イル);(p−[(E)−2−[3’4’−ジヒドロ−4,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’イル]プロペニル]安息香酸1’1’−ジオキシド;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ブトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−プロポキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ペントキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘキソキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘプトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−オクトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;(2E,4E,6E)−7−(3−t−ブチル−5−(1−フェニル−ビニル)−フェニル]−3−メチル−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−{[4,5−3H2]−n−ペントキシ}フェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸エチルエステル;(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシフェニル]3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;4−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−カルボキシアミド)安息香酸;(2E,4E)−3−メチル−5−[(1S,2S)−2−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−ナフタレン−2−イル)−シクロプロピル]−ペンタ−2,4−ジエン酸;p−[(E)−2−[3’,4’−ジヒドロ−4’,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’−イル]プロペニル]安息香酸;1’,1’−ジオキシド,4−(7,7,10,10−テトラメチル−1−ピリジン−3−イルメチル−4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−1H−ナフト[2,3−g]インドール−3−イル)−安息香酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−メトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−ヘキシルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−オクチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;および(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;4−(5H−2,3(2,5ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;4−{[4−(4−エチルフェニル)2,2−ジメチル−(2H)−チオクロメン−6−イル]エチニル}安息香酸;4−[4−2メチル−1,2−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−1−イル−フェニルカルバモイル]安息香酸;4−[4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−7,7,10,10−テトラメチル−1−(3−ピリジルメチル)−アントラ[1,2−b]ピロール−3−イル]安息香酸;(3−ピリジルメチル)−]5−チアアントラ[2,1−b]ピロール−3−イル)安息香酸;および(3−ピリジルメチル)−アントラ[2ml−d]ピラゾール−3−イル]安息香酸。 - 前記レチノイドX受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項53、54および55のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物:
LGN100572;LGN100574;1−(3−ヒドロキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;1−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エネニトリル;3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エナール;(2E,4E,6E)−7−3[−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−2−イル]−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;4−[3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸;4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]安息香酸;4−[1(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]安息香酸;4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ベンゼネート(benzenete)トラゾール;2−[1−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エチル]ピリジン−5−カルボン酸;エチル−2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボキシレート;5−[1−3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−2−カルボン酸;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;メチル2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボキシレート;4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]−N−(4−ヒドロキシフェニル)ベンズアミド;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸ブチルオキシム;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸プロピルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸シアノイミン;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸アリルオキシム;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸4−(3−メチルブト−2−エン酸)オキシム;および4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸1−アミノエチルオキシム;(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;および4−(5H−2,3(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;および4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸。 - 前記ビタミンD受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項53、54および55のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物:1α,25−(OH)−D3−26,23ラクトン;1α,25−ジヒドロキシビタミンD(3);25−カルボン酸エステルZK159222;(23S)−25−デヒドロ−1α−OH−D(3);(23R)−25−デヒドロ−1α−OH−D(3);1β,25(OH)2D3;1β,25(OH)2−3−エピ−D3;(23S)25−デヒドロ−1α(OH)D3−26,23−ラクトン;(23R)25−デヒドロ−1α(OH)D3−26,23−ラクトン;およびブチル−(5Z,7E,22E−(1S,7E,22E−(1S,3R,24R)−1,3,24−トリヒドロキシ−26,27−シクロ−9,10−セココレスタ−5,7,10(19),22−テトラエン−25−カルボキシレート)。
- 造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法であって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、および/またはビタミンD受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む方法。
- 以下の工程を含む、造血細胞を移植または埋込みする方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、および/またはビタミンD受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みする工程。 - 前記ドナーおよび前記レシピエントが単一の個体である請求項60記載の方法。
- 以下の工程を含む、造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、および/またはビタミンD受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する工程。 - 遺伝子改変することが外因遺伝子を含むベクターによって達成される請求項62記載の方法。
- ベクターがウイルスベクターまたは核酸ベクターである請求項63記載の方法。
- 以下の工程を含む、養子免疫療法の方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、および/またはビタミンD受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植する工程。 - 造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、および/またはビタミンD受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を減少させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物。
- 前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項59、60、62、65および66のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物。
- エクスビボ細胞増殖のための前記条件を前記造血単核細胞に与えることは、前記造血単核細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む請求項59、60および65のいずれかに記載の方法。
- 前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項68記載の方法。
- 前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、FLT3リガンド、インターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−6、インターロイキン−10、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項69記載の方法。
- 前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項68記載の方法。
- 前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、FGF、EGF、NGF、VEGF、LIF、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項71記載の方法。
- 前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、および/またはビタミンD受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力の減少が可逆的である請求項59、60、62、65および66のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、および/またはビタミンD受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力の減少が、有効量の少なくとも1つのレチノイン酸受容体アンタゴニスト、少なくとも1つのレチノイドX受容体アンタゴニスト、および/または少なくとも1つのビタミンD受容体アンタゴニストの存在下での前記造血単核細胞画分のエクスビボ培養による請求項59、60、62、65および66のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドX受容体、および/またはビタミンD受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力の減少が、前記造血単核細胞の全エクスビボ培養期間の0.1〜50%の期間、有効量の少なくとも1つのレチノイン酸受容体アンタゴニスト、少なくとも1つのレチノイドX受容体アンタゴニスト、および/または少なくとも1つのビタミンD受容体アンタゴニストの存在下で前記造血単核細胞をエクスビボ培養することによる請求項74記載の方法。
- 前記薬剤は、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニスト、および/またはビタミンD受容体アンタゴニストからなる群から選択される請求項66記載の移植可能な造血細胞調製物。
- 前記レチノイン酸受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項74、75および76のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物:
AGN194310;AGN193109;3−(4−メトキシ−フェニルスルファニル)−3−メチル−酪酸;6−メトキシ−2,2−ジメチル−チオクロマン−4−オン,2,2−ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イルトリフルオロメタン−スルホネート;エチル4−((2,2ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート;エチル4−((2,2−ジメチル−4−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−(2H)−チオクロメン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート(41);チオクロメン−6−イル]−エチニル−ベンゾエート(イル);(p−[(E)−2−[3’4’−ジヒドロ−4,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’イル]プロペニル]安息香酸1’1’−ジオキシド;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ブトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−プロポキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ペントキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘキソキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘプトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−オクトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;(2E,4E,6E)−7−(3−t−ブチル−5−(1−フェニル−ビニル)−フェニル]−3−メチル−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−{[4,5−3H2]−n−ペントキシ}フェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸エチルエステル;(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシフェニル]3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;4−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−カルボキシアミド)安息香酸;(2E,4E)−3−メチル−5−[(1S,2S)−2−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−ナフタレン−2−イル)−シクロプロピル]−ペンタ−2,4−ジエン酸;p−[(E)−2−[3’,4’−ジヒドロ−4’,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’−イル]プロペニル]安息香酸;1’,1’−ジオキシド,4−(7,7,10,10−テトラメチル−1−ピリジン−3−イルメチル−4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−1H−ナフト[2,3−g]インドール−3−イル)−安息香酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−メトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−ヘキシルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−オクチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;および(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;4−(5H−2,3(2,5ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;4−{[4−(4−エチルフェニル)2,2−ジメチル−(2H)−チオクロメン−6−イル]エチニル}安息香酸;4−[4−2メチル−1,2−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−1−イル−フェニルカルバモイル]安息香酸;4−[4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−7,7,10,10−テトラメチル−1−(3−ピリジルメチル)−アントラ[1,2−b]ピロール−3−イル]安息香酸;(3−ピリジルメチル)−]5−チアアントラ[2,1−b]ピロール−3−イル)安息香酸;および(3−ピリジルメチル)−アントラ[2ml−d]ピラゾール−3−イル]安息香酸。 - 前記レチノイドX受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項74、75および76のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物:
LGN100572;LGN100574;1−(3−ヒドロキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;1−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エネニトリル;3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エナール;(2E,4E,6E)−7−3[−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−2−イル]−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;4−[3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸;4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]安息香酸;4−[1(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]安息香酸;4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ベンゼネート(benzenete)トラゾール;2−[1−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エチル]ピリジン−5−カルボン酸;エチル−2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボキシレート;5−[1−3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−2−カルボン酸;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;メチル2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボキシレート;4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]−N−(4−ヒドロキシフェニル)ベンズアミド;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸ブチルオキシム;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸プロピルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸シアノイミン;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸アリルオキシム;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸4−(3−メチルブト−2−エン酸)オキシム;および4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸1−アミノエチルオキシム;(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;および4−(5H−2,3(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;および4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸。 - 前記ビタミンD受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項74、75および76のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物:1α,25−(OH)−D3−26,23ラクトン;1α,25−ジヒドロキシビタミンD(3);25−カルボン酸エステルZK159222;(23S)−25−デヒドロ−1α−OH−D(3);(23R)−25−デヒドロ−1α−OH−D(3);1β,25(OH)2D3;1β,25(OH)2−3−エピ−D3;(23S)25−デヒドロ−1α(OH)D3−26,23−ラクトン;(23R)25−デヒドロ−1α(OH)D3−26,23−ラクトン;およびブチル−(5Z,7E,22E−(1S,7E,22E−(1S,3R,24R)−1,3,24−トリヒドロキシ−26,27−シクロ−9,10−セココレスタ−5,7,10(19),22−テトラエン−25−カルボキシレート)。
- 造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法であって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のためのエクスビボ培養条件およびニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む方法。
- 以下の工程を含む、造血細胞を移植または埋込みする方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件およびニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みする工程。 - 前記ドナーおよび前記レシピエントが単一の個体である請求項81記載の方法。
- 以下の工程を含む、造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件およびニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する工程。 - 遺伝子改変することが外因遺伝子を含むベクターによって達成される請求項83記載の方法。
- ベクターがウイルスベクターまたは核酸ベクターである請求項84記載の方法。
- 以下の工程を含む、養子免疫療法の方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件およびニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植する工程。 - 造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物からなる群から選択され、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物。
- 前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項80、81、83、86および87のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物。
- エクスビボ細胞増殖のための前記条件を前記造血単核細胞に与えることは、前記造血単核細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む請求項80、81および86のいずれかに記載の方法。
- 前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項89記載の方法。
- 前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、FLT3リガンド、インターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−6、インターロイキン−10、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項90記載の方法。
- 前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項89記載の方法。
- 前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、FGF、EGF、NGF、VEGF、LIF、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項92記載の方法。
- 前記ニコチンアミドアナログは、ベンズアミド、ニコチンチオアミド、ニコチン酸、およびα−アミノ−3−インドールプロピオン酸からなる群から選択される請求項80、81、83、86および87のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物。
- 造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法であって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時にPI3−キナーゼの発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む方法。
- 以下の工程を含む、造血細胞を移植または埋込みする方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にPI3−キナーゼの発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みする工程。 - 前記ドナーおよび前記レシピエントが単一の個体である請求項96記載の方法。
- 以下の工程を含む、造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にPI3−キナーゼの発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する工程。 - 遺伝子改変することが外因遺伝子を含むベクターによって達成される請求項98記載の方法。
- ベクターがウイルスベクターまたは核酸ベクターである請求項99記載の方法。
- 以下の工程を含む、養子免疫療法の方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にPI3−キナーゼの発現および/または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植する工程。 - 造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、PI3−キナーゼの発現および/または活性を減少させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物。
- 前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項95、96、98および101のいずれかに記載の方法。
- エクスビボ細胞増殖のための前記条件を前記造血単核細胞に与えることは、前記造血単核細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む請求項95、96、98および101のいずれかに記載の方法。
- 前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項104記載の方法。
- 前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、FLT3リガンド、インターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−6、インターロイキン−10、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項105記載の方法。
- 前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項104記載の方法。
- 前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、FGF、EGF、NGF、VEGF、LIF、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項107記載の方法。
- PI3−キナーゼの前記発現および/または前記活性の減少のためのエクスビボ培養条件を前記造血単核細胞に与えることは、PI3−キナーゼ発現を下方制御する薬剤を前記造血単核細胞に与えることによる請求項95、96、98および101のいずれかに記載の方法。
- 前記薬剤がPI3−キナーゼ発現を下方制御する薬剤である請求項102記載の移植可能な造血細胞調製物。
- PI3−キナーゼ発現を下方制御する前記薬剤がポリヌクレオチドである請求項109および110のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物。
- PI3−キナーゼ発現を下方制御する薬剤が細胞内抗体である請求項109および110のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記ポリヌクレオチドが細胞内PI3−キナーゼmRNAまたは遺伝子分解を指示する干渉性低分子ポリヌクレオチド分子である請求項112記載の方法。
- 前記干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、RNAi分子、アンチセンス分子、リボザイム分子、およびDNAzyme分子からなる群から選択される請求項113記載の方法。
- CD38の前記発現および/または前記活性を減少させるためのエクスビボ培養条件を前記造血単核細胞に与えることは、PI3−キナーゼ活性を阻害する薬剤を前記造血単核細胞に与えることによる請求項109および110のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記薬剤がPI3−キナーゼ活性を阻害する薬剤である請求項102記載の移植可能な造血細胞調製物。
- PI3−キナーゼ活性を阻害する前記薬剤は、ウォルトマンニンおよびLY294002からなる群から選択される請求項115および116のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物。
- 造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法であって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のためのエクスビボ培養条件、および同時に少なくとも1つの銅キレートまたは銅キレーターを提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む方法。
- 以下の工程を含む、造血細胞を移植または埋込みする方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件、および同時に少なくとも1つの銅キレートまたは銅キレーターを提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みする工程。 - 前記ドナーおよび前記レシピエントが単一の個体である請求項119記載の方法。
- 以下の工程を含む、造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件、および同時に少なくとも1つの銅キレートまたは銅キレーターを提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する工程。 - 遺伝子改変することが外因遺伝子を含むベクターによって達成される請求項121記載の方法。
- ベクターがウイルスベクターまたは核酸ベクターである請求項122記載の方法。
- 以下の工程を含む、養子免疫療法の方法:
(a)造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得る工程、
(b)前記造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件、および同時に少なくとも1つの銅キレートまたは銅キレーターを提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する工程、および
(c)前記造血幹細胞をレシピエントに移植する工程。 - 造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する少なくとも1つの銅キレートまたは銅キレーターの効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物。
- 前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項118、119、121、124および125のいずれかに記載の方法および/または移植可能な造血細胞調製物。
- エクスビボ細胞増殖のための前記条件を前記造血単核細胞に与えることは、前記造血単核細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む請求項118、119および124のいずれかに記載の方法。
- 前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項127記載の方法。
- 前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、FLT3リガンド、インターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−6、インターロイキン−10、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項128記載の方法。
- 前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項127記載の方法。
- 前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、FGF、EGF、NGF、VEGF、LIF、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項130記載の方法。
- 少なくとも1つの銅キレートまたは銅キレーターを前記造血単核細胞に与えることは、少なくとも1つの銅キレーターを前記造血単核細胞に与えることによる請求項118、119、121および124のいずれかに記載の方法。
- 前記造血単核細胞画分に亜鉛を与えることをさらに含む請求項132記載の方法。
- 前記造血幹細胞画分の前記拡大された集団が、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞から、少なくとも1つの銅キレーターの効果的な量の存在下でエクスビボ増殖される請求項125記載の移植可能な造血細胞調製物。
- 前記造血幹細胞画分の前記拡大された集団が、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞から、亜鉛の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖される請求項134記載の移植可能な造血細胞調製物。
- 遷移金属キレートまたはキレーターが造血幹細胞の分化を実質的に阻害および誘導するかどうかを明らかにするアッセイであって、
造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、遷移金属キレートまたはキレーターの存在下で培養すること、および、前記造血幹細胞の分化をモニターすることを含み、分化が処理されていない造血単核細胞と比較して増大する場合、遷移金属キレートまたはキレーターは分化を誘導し、分化が処理されていない造血単核細胞と比較して低下する場合、遷移金属キレートまたはキレーターは分化を阻害すること、
を含むアッセイ。 - 前記少なくとも1つの銅キレートまたは銅キレーターがポリアミンキレーターを含む請求項118、119、121、124、125、136および138〜141のいずれかに記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記ポリアミンキレーターが、銅以外の遷移金属との有機金属錯体を形成することができる請求項137記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記遷移金属は、亜鉛、コバルト、ニッケル、鉄、パラジウム、白金、ロジウムおよびルテニウムからなる群から選択される請求項138記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記ポリアミンキレーターが線状ポリアミンである請求項137記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記線状ポリアミンが下記の一般式Iを有する請求項140記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
mは1〜10の整数である;nは0〜20の整数である;
XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;
Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;
Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;
B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖であり、
ただし、前記X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、前記アルキレン鎖における前記炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される。 - 前記Aが下記の一般式IIを有するアルキレン鎖である請求項141記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
gは、0または3〜10に等しい整数である;
R1、R2およびRgのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。 - 前記B1およびBnのそれぞれは独立して、下記の一般式IIIを有するアルキレン鎖である請求項142記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
pは、0またはg+1に等しい整数である;
qはg+2からg+20までの整数である;および
Rp、Rp+1およびRqのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。 - 前記線状ポリアミンがテトラエチレンペンタミンである請求項141記載の方法、アッセイ、医薬組成物、キット、拡大された集団および/またはアッセイ。
- 前記C1、C2およびCgの少なくとも1つがキラルな炭素原子である請求項142記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記Cp、Cp+1およびCqの少なくとも1つがキラルな炭素原子である請求項143記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記ポリアミンキレーターが環状ポリアミンである請求項137記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記環状ポリアミンがシクラムである請求項147記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記環状ポリアミンが下記の一般式IVを有する請求項147記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
mは1〜10の整数である;
nは0〜20の整数である;
XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;
Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;
Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;
B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;
Dは、下記の一般式Vを有する架橋基である:
式中、
UおよびVはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される;
Wは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される、
ただし、X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される。 - 前記Aが下記の一般式IIを有するアルキレン鎖である請求項149記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
gは、0または3〜10に等しい整数である;
R1、R2およびRgのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。 - 前記B1およびBnのそれぞれは独立して、下記の一般式IIIを有するアルキレン鎖である請求項150記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
pは、0またはg+1に等しい整数である;
qはg+2からg+20までの整数である;および
Rp、Rp+1およびRqのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。 - 前記C1、C2およびCgの少なくとも1つがキラルな炭素原子である請求項150記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記Cp、Cp+1およびCqの少なくとも1つがキラルな炭素原子である請求項151記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記環状ポリアミンが下記の式VI〜式Xからなる群から選択される一般式を有する請求項147記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
mは1〜10の整数である;
nは0〜20の整数である;
XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;
Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;
Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;
B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;
Dは、本明細書中上記に記載されるように、一般式Vを有する架橋基であり、
式中、
UおよびVはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される;および
Wは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される、
さらに、前記Dが一方の端部でA(式VI、式VIIおよび式X)に結合している場合、前記Uまたは前記Vは前記アルキレン鎖における1つの炭素原子に結合しており、また、前記Dが一方の端部でB1またはBn(式VIII、式IXおよび式X)に結合している場合、前記Uまたは前記Vは前記アルキレン鎖における1つの炭素原子に結合している;
ただし、前記X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、前記アルキレン鎖における前記炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される。 - 前記Aが下記の一般式IIを有するアルキレン鎖である請求項154記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
gは、0または3〜10に等しい整数である;
R1、R2およびRgのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。 - 前記B1およびBnのそれぞれは独立して、下記の一般式IIIを有するアルキレン鎖である請求項155記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
pは、0またはg+1に等しい整数である;
qはg+2からg+20までの整数である;および
Rp、Rp+1およびRqのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。 - 前記C1、C2およびCgの少なくとも1つがキラルな炭素原子である請求項155記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記Cp、Cp+1およびCqの少なくとも1つがキラルな炭素原子である請求項156記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記ポリアミンキレーターが少なくとも1つの線状ポリアミンおよび少なくとも1つの環状ポリアミンを含む請求項137記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記ポリアミンキレーターが下記の一般式XIを有する請求項159記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
nは1よりも大きい整数である;
f、g、h、i、j、k、l、oおよびtのそれぞれは独立して、0〜10の整数である;
E1、E2およびEnのそれぞれは独立して線状ポリアミンである;
G1、G2およびGnのそれぞれは独立して環状ポリアミンである;
Q1、Q2およびQnのそれぞれは独立して、これらのポリアミンの2つの間を連結するリンカーである;
ただし、Q1、Q2およびQnの少なくとも1つがアミン基であり、かつ/または、前記線状ポリアミンおよび前記環状ポリアミンの少なくとも1つが少なくとも1つのフリーのアミン基を有する。 - 前記Q1、Q2およびQnのそれぞれは独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、シクロアルキレン、ヘテロアリーレン、アミン、アゾ、アミド、スルホニル、スルフィニル、スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、ケトエステル、カルボニル、チオカルボニル、エステル、エーテル、チオエーテル、カルバマート、チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシおよびシラザからなる群から選択される請求項160記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記E1,E2およびEnのそれぞれが独立して下記の一般式Iを有するで線状ポリアミンである請求項159記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
mは1〜10の整数である;nは0〜20の整数である;
XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;
Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;
Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;
B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖であり、
ただし、前記X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、前記アルキレン鎖における前記炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される。 - 前記Aが下記の一般式IIを有するアルキレン鎖である請求項162記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
gは、0または3〜10に等しい整数である;
R1、R2およびRgのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。 - 前記B1およびBnのそれぞれは独立して、下記の一般式IIIを有するアルキレン鎖である請求項163記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
pは、0またはg+1に等しい整数である;
qはg+2からg+20までの整数である;および
Rp、Rp+1およびRqのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。 - 前記C1、C2およびCgの少なくとも1つがキラルな炭素原子である請求項163記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記Cp、Cp+1およびCqの少なくとも1つがキラルな炭素原子である請求項164記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記G1、G2およびG2がそれぞれ独立して下記の一般式IVを有する環状ポリアミンである請求項160記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
mは1〜10の整数である;
nは0〜20の整数である;
XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;
Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;
Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;
B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;
Dは、下記の一般式Vを有する架橋基である:
式中、
UおよびVはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される;
Wは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される、
ただし、X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される。 - 前記Aが下記の一般式IIを有するアルキレン鎖である請求項167記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
gは、0または3〜10に等しい整数である;
R1、R2およびRgのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。 - 前記B1およびBnのそれぞれは独立して、下記の一般式IIIを有するアルキレン鎖である請求項168記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
pは、0またはg+1に等しい整数である;
qはg+2からg+20までの整数である;および
Rp、Rp+1およびRqのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。 - 前記C1、C2およびCgの少なくとも1つがキラルな炭素原子である請求項168記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記Cp、Cp+1およびCqの少なくとも1つがキラルな炭素原子である請求項169記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記環状ポリアミンが下記の式VI〜式Xからなる群から選択される一般式を有する請求項160記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
mは1〜10の整数である;
nは0〜20の整数である;
XおよびZはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;
Y1およびYnはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−NH基からなる群から選択される;
Aは、1個〜10個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;
B1およびBnはそれぞれが独立して、1個〜20個の置換炭素原子および/または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である;
Dは、本明細書中上記に記載されるように、一般式Vを有する架橋基であり、
式中、
UおよびVはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される;および
Wは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される、
さらに、前記Dが一方の端部でA(式VI、式VIIおよび式X)に結合している場合、前記Uまたは前記Vは前記アルキレン鎖における1つの炭素原子に結合しており、また、前記Dが一方の端部でB1またはBn(式VIII、式IXおよび式X)に結合している場合、前記Uまたは前記Vは前記アルキレン鎖における1つの炭素原子に結合している;
ただし、前記X、Z、Y1およびYnの少なくとも1つが−NH基であり、かつ/または、前記アルキレン鎖における前記炭素原子の少なくとも1つがアミン基により置換される。 - 前記Aが下記の一般式IIを有するアルキレン鎖である請求項172記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
gは、0または3〜10に等しい整数である;
R1、R2およびRgのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。 - 前記B1およびBnのそれぞれは独立して、下記の一般式IIIを有するアルキレン鎖である請求項173記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物:
式中、
pは、0またはg+1に等しい整数である;
qはg+2からg+20までの整数である;および
Rp、Rp+1およびRqのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、C−アミド、N−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、N−スルホンアミド、S−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、C−カルボキシ、O−カルボキシ、C−チオカルボキシ、O−チオカルボキシ、N−カルバマート、O−カルバマート、N−チオカルバマート、O−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、S−ジチオカルバマート、N−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。 - 前記C1、C2およびCgの少なくとも1つがキラルな炭素原子である請求項173記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記Cp、Cp+1およびCqの少なくとも1つがキラルな炭素原子である請求項174記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- 前記ポリアミンキレーターは、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、テトラエチレンペンタミン、アミノエチルエタノールアミン、アミノエチルピペラジン、ペンタエチレンヘキサミン、カプトプリル、ペニシラミン、N,N’−ビス(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミン、N,N’,ビス(2−アミノエチル)−1,3−プロパンジアミン、1,7−ジオキサ−4,10−ジアザシクロドデカン、1,4,8,11−テトラアザシクロテトラデカン−5,7−ジオン、1,4,7−トリアザシクロノナン、1−オキサ−4,7,10−トリアザシクロドデカン、1,4,8,12−テトラアザシクロペンタデカン、1,4,7,10−テトラアザシクロドデカンからなる群から選択される請求項137記載の方法、アッセイおよび/または移植可能な造血細胞調製物。
- レチノイン酸受容体アンタゴニストが効果的な造血幹細胞拡大剤であるかどうかを明らかにするアッセイであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、レチノイン酸受容体アンタゴニストの存在下で培養すること、および、前記造血幹細胞の拡大をモニターすることを含み、この場合、前記造血幹細胞の増大した拡大および低下した分化が、処理されていない造血単核細胞と比較して生じる場合、レチノイン酸受容体アンタゴニストは効果的な造血幹細胞拡大剤であるアッセイ。
- 前記レチノイン酸受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項178記載のアッセイ:
AGN194310;AGN193109;3−(4−メトキシ−フェニルスルファニル)−3−メチル−酪酸;6−メトキシ−2,2−ジメチル−チオクロマン−4−オン,2,2−ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イルトリフルオロメタン−スルホネート;エチル4−((2,2ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート;エチル4−((2,2−ジメチル−4−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−(2H)−チオクロメン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート(41);チオクロメン−6−イル]−エチニル−ベンゾエート(イル);(p−[(E)−2−[3’4’−ジヒドロ−4,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’イル]プロペニル]安息香酸1’1’−ジオキシド;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ブトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−プロポキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ペントキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘキソキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘプトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−オクトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;(2E,4E,6E)−7−(3−t−ブチル−5−(1−フェニル−ビニル)−フェニル]−3−メチル−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−{[4,5−3H2]−n−ペントキシ}フェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸エチルエステル;(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシフェニル]3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;4−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−カルボキシアミド)安息香酸;(2E,4E)−3−メチル−5−[(1S,2S)−2−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−ナフタレン−2−イル)−シクロプロピル]−ペンタ−2,4−ジエン酸;p−[(E)−2−[3’,4’−ジヒドロ−4’,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’−イル]プロペニル]安息香酸;1’,1’−ジオキシド,4−(7,7,10,10−テトラメチル−1−ピリジン−3−イルメチル−4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−1H−ナフト[2,3−g]インドール−3−イル)−安息香酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−メトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−ヘキシルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−オクチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;および(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;4−(5H−2,3(2,5ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;4−{[4−(4−エチルフェニル)2,2−ジメチル−(2H)−チオクロメン−6−イル]エチニル}安息香酸;4−[4−2メチル−1,2−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−1−イル−フェニルカルバモイル]安息香酸;4−[4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−7,7,10,10−テトラメチル−1−(3−ピリジルメチル)−アントラ[1,2−b]ピロール−3−イル]安息香酸;(3−ピリジルメチル)−]5−チアアントラ[2,1−b]ピロール−3−イル)安息香酸;および(3−ピリジルメチル)−アントラ[2ml−d]ピラゾール−3−イル]安息香酸。 - レチノイドX受容体アンタゴニストが効果的な造血幹細胞拡大剤であるかどうかを明らかにするアッセイであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、レチノイドX受容体アンタゴニストの存在下で培養すること、および、前記造血幹細胞の拡大をモニターすることを含み、この場合、前記造血幹細胞の増大した拡大および低下した分化が、処理されていない造血単核細胞と比較して生じる場合、レチノイドX受容体アンタゴニストは効果的な造血幹細胞拡大剤であるアッセイ。
- 前記レチノイドX受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項180記載のアッセイ:
LGN100572;LGN100574;1−(3−ヒドロキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;1−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エネニトリル;3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エナール;(2E,4E,6E)−7−3[−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−2−イル]−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;4−[3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸;4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]安息香酸;4−[1(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]安息香酸;4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ベンゼネート(benzenete)トラゾール;2−[1−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エチル]ピリジン−5−カルボン酸;エチル−2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボキシレート;5−[1−3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−2−カルボン酸;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;メチル2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボキシレート;4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]−N−(4−ヒドロキシフェニル)ベンズアミド;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸ブチルオキシム;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸プロピルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸シアノイミン;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸アリルオキシム;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸4−(3−メチルブト−2−エン酸)オキシム;および4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸1−アミノエチルオキシム;(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;および4−(5H−2,3(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;および4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸。 - ビタミンD受容体アンタゴニストが効果的な造血幹細胞拡大剤であるかどうかを明らかにするアッセイであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、ビタミンD受容体アンタゴニストの存在下で培養すること、および、前記造血幹細胞の拡大をモニターすることを含み、この場合、前記造血幹細胞の増大した拡大および低下した分化が、処理されていない造血単核細胞と比較して生じる場合、ビタミンD受容体アンタゴニストは効果的な造血幹細胞拡大剤であるアッセイ。
- 前記ビタミンD受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項182記載のアッセイ:1α,25−(OH)−D3−26,23ラクトン;1α,25−ジヒドロキシビタミンD(3);25−カルボン酸エステルZK159222;(23S)−25−デヒドロ−1α−OH−D(3);(23R)−25−デヒドロ−1α−OH−D(3);1β,25(OH)2D3;1β,25(OH)2−3−エピ−D3;(23S)25−デヒドロ−1α(OH)D3−26,23−ラクトン;(23R)25−デヒドロ−1α(OH)D3−26,23−ラクトン;およびブチル−(5Z,7E,22E−(1S,7E,22E−(1S,3R,24R)−1,3,24−トリヒドロキシ−26,27−シクロ−9,10−セココレスタ−5,7,10(19),22−テトラエン−25−カルボキシレート)。
- PI3−キナーゼ活性を阻害する薬剤が効果的な造血幹細胞拡大剤であるかどうかを明らかにするアッセイであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、PI3−キナーゼ活性を阻害する薬剤の存在下で培養すること、および、前記造血幹細胞の拡大をモニターすることを含み、この場合、前記造血幹細胞の増大した拡大および低下した分化が、処理されていない造血単核細胞と比較して生じる場合、PI3−キナーゼ活性を阻害する薬剤は効果的な造血幹細胞拡大剤であるアッセイ。
- ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物が効果的な造血幹細胞拡大剤であるかどうかを明らかにするアッセイであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物の存在下で培養すること、および、前記造血幹細胞の拡大をモニターすることを含み、この場合、前記造血幹細胞の増大した拡大および低下した分化が、処理されていない造血単核細胞と比較して生じる場合、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物は効果的な造血幹細胞拡大剤であるアッセイ。
- 前記造血単核細胞の培養がサイトカインの効果的な量の存在下で行われる請求項178、180、182、184および185のいずれかに記載の方法。
- 前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項186記載のアッセイ。
- 前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、FLT3リガンド、インターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−6、インターロイキン−10、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項187記載のアッセイ。
- 前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項186記載のアッセイ。
- 前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、FGF、EGF、NGF、VEGF、LIF、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項189記載のアッセイ。
- 前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項178、180、182、184および185のいずれかに記載のアッセイ。
- 低下した分化を前記モニターすることがCD34の造血細胞表面発現を決定することによる請求項178、180、182、184および185のいずれかに記載のアッセイ。
- 低下した分化を前記モニターすることは、造血細胞表面CD38、CD3、CD61、CD19、CD33、CD14、CD15、またはCD4を発現しないか、発現が実質的に消滅していることを決定することによる請求項178、180、182、184および185のいずれかに記載のアッセイ。
- 効果的な量のレチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドX受容体アンタゴニストおよび/またはビタミンD受容体アンタゴニストが補充された造血幹細胞回収/培養バッグであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞の造血幹細胞画分の細胞分化が実質的に阻害される造血幹細胞回収/培養バッグ。
- 前記レチノイン酸受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項194記載の造血幹細胞回収/培養バッグ:
AGN194310;AGN193109;3−(4−メトキシ−フェニルスルファニル)−3−メチル−酪酸;6−メトキシ−2,2−ジメチル−チオクロマン−4−オン,2,2−ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イルトリフルオロメタン−スルホネート;エチル4−((2,2ジメチル−4−オキソ−チオクロマン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート;エチル4−((2,2−ジメチル−4−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−(2H)−チオクロメン−6−イル)エチニル)−ベンゾエート(41);チオクロメン−6−イル]−エチニル−ベンゾエート(イル);(p−[(E)−2−[3’4’−ジヒドロ−4,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’イル]プロペニル]安息香酸1’1’−ジオキシド;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ブトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−プロポキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;
2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ペントキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘキソキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−ヘプトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−n−オクトキシフェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;(2E,4E,6E)−7−(3−t−ブチル−5−(1−フェニル−ビニル)−フェニル]−3−メチル−オクタ−2,4,6−トリエン酸;2E,4E,6E−[7−(3,5−ジ−t−ブチル−4−{[4,5−3H2]−n−ペントキシ}フェニル)−3−メチル]−オクタ−2,4,6−トリエン酸;(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸エチルエステル;(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;
(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシフェニル]3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;4−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−カルボキシアミド)安息香酸;(2E,4E)−3−メチル−5−[(1S,2S)−2−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−ナフタレン−2−イル)−シクロプロピル]−ペンタ−2,4−ジエン酸;p−[(E)−2−[3’,4’−ジヒドロ−4’,4’−ジメチル−7’−(ヘプチルオキシ)−2’H−1−ベンゾチオピラン−6’−イル]プロペニル]安息香酸;1’,1’−ジオキシド,4−(7,7,10,10−テトラメチル−1−ピリジン−3−イルメチル−4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−1H−ナフト[2,3−g]インドール−3−イル)−安息香酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−メトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−エトキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−ヘキシルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;(2E,4E,6Z)−7−[3,5−ジ−tert−ブチル−2−オクチルオキシフェニル]−3−メチル−2,4,6−オクタトリエン酸;および(2E,4E)−(1RS,2RS)−5−[2−(3,5−ジ−tert−ブチル−2−ブトキシ−フェニル)−シクロプロピル]−3−メチル−ペンタ−2,4−ジエン酸;(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;4−(5H−2,3(2,5ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;4−{[4−(4−エチルフェニル)2,2−ジメチル−(2H)−チオクロメン−6−イル]エチニル}安息香酸;4−[4−2メチル−1,2−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−1−イル−フェニルカルバモイル]安息香酸;4−[4,5,7,8,9,10−ヘキサヒドロ−7,7,10,10−テトラメチル−1−(3−ピリジルメチル)−アントラ[1,2−b]ピロール−3−イル]安息香酸;(3−ピリジルメチル)−]5−チアアントラ[2,1−b]ピロール−3−イル)安息香酸;および(3−ピリジルメチル)−アントラ[2ml−d]ピラゾール−3−イル]安息香酸。 - 前記レチノイドX受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項194記載の造血幹細胞回収/培養バッグ:
LGN100572;LGN100574;1−(3−ヒドロキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;1−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)エタノン;3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エネニトリル;3−(3−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)ブト−2−エナール;(2E,4E,6E)−7−3[−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレン−2−イル]−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;4−[3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸;4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]安息香酸;4−[1(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]安息香酸;4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ベンゼネート(benzenete)トラゾール;2−[1−(5,5,8,8−テトラメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エチル]ピリジン−5−カルボン酸;エチル−2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボキシレート;5−[1−3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−2−カルボン酸;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;メチル2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボキシレート;4−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]−N−(4−ヒドロキシフェニル)ベンズアミド;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル]ピリジン−5−カルボン酸;2−[1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)シクロプロピル]ピリジン−5−カルボン酸;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸ブチルオキシム;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸プロピルオキシム;
4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸シアノイミン;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸アリルオキシム;4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸4−(3−メチルブト−2−エン酸)オキシム;および4−[(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)カルボニル]安息香酸1−アミノエチルオキシム;(2E,4E,6Z)−7−(3−n−プロポキシ−5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチルナフタレン−2−イル)−3−メチルオクタ−2,4,6−トリエン酸;および4−(5H−2,3(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−n−プロピルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸;および4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5メチル−8−ニトロジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン−11−イル)安息香酸。 - 前記ビタミンD受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項194記載の造血幹細胞回収/培養バッグ:1α,25−(OH)−D3−26,23ラクトン;1α,25−ジヒドロキシビタミンD(3);25−カルボン酸エステルZK159222;(23S)−25−デヒドロ−1α−OH−D(3);(23R)−25−デヒドロ−1α−OH−D(3);1β,25(OH)2D3;1β,25(OH)2−3−エピ−D3;(23S)25−デヒドロ−1α(OH)D3−26,23−ラクトン;(23R)25−デヒドロ−1α(OH)D3−26,23−ラクトン;およびブチル−(5Z,7E,22E−(1S,7E,22E−(1S,3R,24R)−1,3,24−トリヒドロキシ−26,27−シクロ−9,10−セココレスタ−5,7,10(19),22−テトラエン−25−カルボキシレート)。
- 効果的な量のニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物が補充された造血幹細胞回収/培養バッグであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞の造血幹細胞画分の細胞分化が実質的に阻害される造血幹細胞回収/培養バッグ。
- 効果的な量のPI3−キナーゼ活性を阻害する薬剤が補充された造血幹細胞回収/培養バッグであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞の造血幹細胞画分の細胞分化が実質的に阻害される造血幹細胞回収/培養バッグ。
- 請求項1、38、59、80、95および118のいずれかに記載の方法によって得られる造血幹細胞のエクスビボ拡大集団。
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