JP2021132638A

JP2021132638A - 改変されたナチュラルキラー細胞、医薬組成物、その製造方法及びその使用方法

Info

Publication number: JP2021132638A
Application number: JP2020210259A
Authority: JP
Inventors: ジャン−モウ・リー; Jan-Mou Lee; チー−ハオ・ファン; Chih-Hao Fang; ヤ−ファン・チェン; ya-fang Cheng; ペイ−ユ・チョウ; Pei-Yu Chiou
Original assignee: FULLHOPE BIOMEDICAL CO Ltd
Current assignee: FULLHOPE BIOMEDICAL CO Ltd
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2021-09-13
Also published as: TW202132555A; CN113293138A; US20210260115A1; EP3868872A1

Abstract

【課題】がんのための有効な処置及び/又は予防への必要性を満たすために特異な表現型を有する改変されたナチュラルキラー細胞を提供すること。【解決手段】本開示は、NK細胞機能及び樹状細胞機能の両方を有する改変されたナチュラルキラー(NK)細胞、並びにそれを培養する方法を提供する。改変されたNK細胞の投与によって、対象のがん細胞は細胞媒介性免疫を通して効果的に阻害することができる。【選択図】なし

Description

本開示は、改変されたナチュラルキラー(NK)細胞及びそれを含む医薬組成物に関する。改変されたNK細胞を同定するための、及び改変されたNK細胞を培養するための方法も提供される。

免疫監視はがんに対して重要な役割を演じ、特にがんの管理における従来の手術、放射線及び化学療法の多くの欠点に照らして、非常に魅力的な治療的アプローチである。

がんに対する人体の第1の防御線はナチュラルキラー(NK)細胞であり、CD3^-CD14^-CD19^-CD56⁺CD16⁺NGK2D⁺CD11c^dimHLA-DR^-CD86^-CD83^-の表現型を有する。NK細胞は体を異常な細胞について活発に調べる細胞傷害性リンパ球であり、それらが実際のがん細胞に発達することができる前にそれらを破壊する。NK細胞が体をパトロールするにつれて、それらは、それらの多数の活性化及び抑制性表面受容体を使用して多くの種類の細胞と相互作用する。ほとんどのがん細胞はNK細胞の活性化受容体と係合し、それはその天然の殺傷応答を誘発する。

WO2015/100495

Remington's Pharmaceutical Science、Mack Publishing Company、Easton, Pa. (「Remington's」)の第21版 Sonderstrup、Springer、Sem. Immunopathol. 25: 35〜45頁、2003 Nikula等、Inhal. Toxicol. 4(12j: 123〜53頁、2000

がんのための有効な処置及び/又は予防への満たされていない必要性がなおあるので、これらの知見は、がん細胞に対するNKベースの療法及び臨床適用のためにより多数の治療的にコンピテントなNK細胞を生成するための培養方法を開発するための理論的根拠を支持する。本開示は、これら及び他の必要性を満たすために特異な表現型を有する改変されたナチュラルキラー細胞を提供する。これらの細胞は、自家療法において、又は非自家療法において使用することができる。

当技術分野の切迫した必要性に照らして、がんの処置において安全及び有効である改変されたナチュラルキラー(NK)細胞及びそれを含む医薬組成物が本明細書で提供される。

一実施形態では、本開示は、CD45⁺CD3^-CD19^-CD14^-の表現型を含む改変されたNK細胞を提供する。好ましい実施形態では、改変されたNK細胞は、CD56^hiCD16^dimNKG2D⁺CD11c⁺CD86⁺HLA-DR⁺CD83^-HLA-ABC⁺の表現型を更に含むことができ、すなわち、改変されたNK細胞は、CD45⁺CD3^-CD19^-CD14^-CD56^hiCD16^dimNKG2D⁺CD11c⁺CD86⁺HLA-DR⁺CD83^-HLA-ABC⁺の表現型を含むことができる。

一部の実施形態は、本明細書に記載される改変されたNK細胞及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

一部の実施形態は、がん細胞を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載される改変されたNK細胞又は医薬組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。

好ましい実施形態では、有効量は、1用量につき約1×10³〜約1×10⁹の細胞数であってもよい。

好ましい実施形態では、改変されたNK細胞は、自家又は同種異系であってもよい。

好ましい実施形態では、改変されたNK細胞は、末梢血、臍帯血又は骨髄に由来することができる。

好ましい実施形態では、本方法は、改変されたNK細胞をin vitroで増大させることを更に含むことができる。

他の実施形態は、NK細胞機能及び樹状細胞機能の両方を有する改変されたNK細胞を培養する方法であって、
単核細胞を含む体液を得ること;
単核細胞を、IL-15、IL-12及びIL-18を含む第1の培地と接触させて培養された細胞集団を得ること;及び
培養された細胞集団からCD3^-CD19^-CD14^-CD56^hiCD16^dimNKG2D⁺CD11c⁺CD86⁺HLA-DR⁺CD83^-の表現型を有する改変されたNK細胞を単離すること
を含む方法を提供する。

好ましい実施形態では、単核細胞は、末梢血、臍帯血又は骨髄に由来することができる。

好ましい実施形態では、第1の培地は、造血細胞培地、好ましくはAIM-V培地を更に含むことができる。

好ましい実施形態では、第1の培地は、血清タンパク質、好ましくはヒト血小板溶解物を更に含むことができる。

好ましい実施形態では、単核細胞は、第1の培地と約1〜6日間、接触することができる。

好ましい実施形態では、本方法は、第1の培地と接触させた後に、培養された細胞集団を、IL-15及びIL-12を含む第2の培地と接触させることを更に含むことができる。

好ましい実施形態では、第2の培地は、造血細胞培地、好ましくはAIM-V培地を更に含むことができる。

好ましい実施形態では、第2の培地は、血清タンパク質、好ましくはヒト血小板溶解物を更に含むことができる。

好ましい実施形態では、培養細胞集団は、第2の培地と約1〜6日間、接触することができる。

好ましい実施形態では、本方法は、第1の培地と接触させる前にCD3^-CD14^-CD19^-の表現型を有する細胞について単核細胞を負に選択することを更に含むことができる。

本明細書に記載される培養方法は、定量の試料、例えば10mLの血液からの、改変されたNK細胞のより多くの数の単離を可能にする。

以下の図面を参照して、本出願の例示的な実施形態が下で詳細に記載される。

様々な培地で培養した改変されたNK細胞の細胞数を例示する図である。 NKG2D、CD45、CD16、CD56、CD3、CD14、CD19、CD86、CD83、CD11c及びHLA-ABCの発現のために様々な培地で培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。 NKG2D、CD45、CD16、CD56、CD3、CD14、CD19、CD86、CD83、CD11c及びHLA-ABCの発現のために様々な培地で培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。 NKG2D、CD45、CD16、CD56、CD3、CD14、CD19、CD86、CD83、CD11c及びHLA-ABCの発現のために様々な培地で培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。 NKG2D、CD45、CD16、CD56、CD3、CD14、CD19、CD86、CD83、CD11c及びHLA-ABCの発現のために様々な培地で培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。 NKG2D、CD45、CD16、CD56、CD3、CD14、CD19、CD86、CD83、CD11c及びHLA-ABCの発現のために様々な培地で培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。 NKG2D、CD45、CD16、CD56、CD3、CD14、CD19、CD86、CD83、CD11c及びHLA-ABCの発現のために様々な培地で培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。 CD45、CD3、CD14及びCD19の発現のために様々な始原細胞から培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。それぞれNK表現型及びDC表現型のために様々な始原細胞から培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。それぞれNK表現型及びDC表現型のために様々な始原細胞から培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。それぞれNK表現型及びDC表現型のために様々な始原細胞から培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。 CD45、CD3、CD14及びCD19の発現のためにIFN-γの有る無しで培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。それぞれNK表現型及びDC表現型のためにIFN-γの有る無しで培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。それぞれNK表現型及びDC表現型のためにIFN-γの有る無しで培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。それぞれNK表現型及びDC表現型のためにIFN-γの有る無しで培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。様々なIL-12曝露期間で培養した改変されたNK細胞の細胞数を例示する図である。それぞれNK表現型及びDC表現型のために様々なIL-12曝露期間で培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。それぞれNK表現型及びDC表現型のために様々なIL-12曝露期間で培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。それぞれNK表現型及びDC表現型のために様々なIL-12曝露期間で培養した改変されたNK細胞のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。改変されたNK細胞の細胞傷害性を例示するフローサイトメトリー像のアセンブリーを示す図である。 Tリンパ球増殖への改変されたNK細胞の抗原提示細胞(APC)活性を例示する細胞分裂のフローサイトメトリー分析のアセンブリーを示す図である。様々なIL-18曝露濃度で培養した改変されたNK細胞の細胞数を例示する図である。 3日目の改変されたNK細胞のCD25、HLA-DR及びCD86の発現の上方制御のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。 3日目の改変されたNK細胞のCD25、HLA-DR及びCD86の発現の上方制御のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。 12日目の改変されたNK細胞のHLA-DR及びCD86の下方制御のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。 12日目の改変されたNK細胞のHLA-DR及びCD86の下方制御のフローサイトメトリー像のアセンブリーを例示する図である。 IL-18と培養した改変されたNK細胞の細胞傷害性を例示するフローサイトメトリー像のアセンブリーを示す図である。 IL-18と培養した改変されたNK細胞の細胞傷害性を例示するフローサイトメトリー像のアセンブリーを示す図である。 Tリンパ球増殖へのIL-18と培養した改変されたNK細胞のAPC活性を例示する細胞分裂のフローサイトメトリー分析のアセンブリーを示す図である。 Tリンパ球増殖へのIL-18と培養した改変されたNK細胞のAPC活性を例示する細胞分裂のフローサイトメトリー分析のアセンブリーを示す図である。様々なIL-18曝露期間で培養した改変されたNK細胞の細胞数を例示する図である。様々なIL-18曝露期間で培養した改変されたNK細胞の細胞数を例示する図である。様々なIL-18曝露期間で培養した改変されたNK細胞の細胞傷害性を例示するフローサイトメトリー像のアセンブリーを示す図である。様々なIL-18曝露期間で培養した改変されたNK細胞の細胞傷害性を例示するフローサイトメトリー像のアセンブリーを示す図である。様々なIL-18曝露期間で培養した改変されたNK細胞の細胞傷害性を例示するフローサイトメトリー像のアセンブリーを示す図である。 Tリンパ球増殖への様々なIL-18培養期間で培養した改変されたNK細胞のAPC活性を例示する細胞分裂のフローサイトメトリー分析のアセンブリーを示す図である。 Tリンパ球増殖への様々なIL-18培養期間で培養した改変されたNK細胞のAPC活性を例示する細胞分裂のフローサイトメトリー分析のアセンブリーを示す図である。改変されたNK細胞を培養する方法の実施形態によるフローチャートである。本出願の実施形態による改変されたNK細胞の表現型分析を示す図である。本出願の実施形態による改変されたNK細胞の表現型分析を示す図である。本出願の実施形態による改変されたNK細胞の表現型分析を示す図である。本出願の実施形態による改変されたNK細胞によって媒介される細胞傷害性を例示する図である。本出願の実施形態による改変されたNK細胞によって媒介されるAPC活性を例示する図である。

本開示の上述の及び他の態様は、本明細書に記載される他の実施形態に関してここから更に詳細に記載される。本発明は異なる形で具体化することができ、本明細書に示される実施形態に限定されるものと解釈するべきでないことを理解すべきである。むしろ、これらの実施形態は、この開示が完璧及び完全であるように、並びに本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。

ここで本発明の明細書で使用される用語は特定の実施形態を記載することだけが目的であり、本発明を限定するものではない。本発明の明細書及び添付の請求項で使用されるように、文脈が明らかに他を指示しない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数形も含むものである。

本明細書で使用されるように、用語「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、「含む(includes)」、「含んでいる(including)」、「有する」、「有している」、「含有する」、「含有している」、「特徴付けられる」又はその任意の他の変異形は、明示的に示される任意の限界に従って、非排他的な含有を包含するものである。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス又は方法は、それらの要素だけに必ずしも限定されず、しかし、明示的に掲載もされず、そのような組成物、混合物、プロセス又は方法に固有でもない他の要素を含むことができる。

移行句「からなる」は、明記されていないいかなる要素、工程又は成分も排除する。請求項における場合、それは、それらに通常付随している不純物を除いて、列挙されるもの以外の材料の含有に対して請求項を閉じるだろう。語句「からなる」が前文の直後ではなく請求項の本体の条項に出現する場合、それはその条項に示される要素だけに制限する。他の要素は、全体として請求項から排除されない。

出願人が発明又はその一部を「含んでいる」等のオープンエンド用語で規定している場合、この記述は(特記しない限り)、用語「からなる」を使用してそのような発明も記載すると解釈されるべきであることを容易に理解すべきである。

本明細書の全ての数字は、「約」によって修飾されると理解することができる。本明細書で使用されるように、用語「約」は、ある値が、例えば、測定装置、その値を判定するために用いられる方法の誤差の固有の変動、又は試験対象の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。一般的に、この用語は、状況によって、概ね1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%又は20%、又はそれ未満の変動性を包含するものである。

代替物だけを指すと明示されない限り、又は代替物が互いに排他的でない限り、用語「又は」の請求項での使用は、「及び/又は」を意味するために使用されるが、本開示は代替物だけ及び「及び/又は」を指す定義を支持する。

本明細書で使用される「対象」は、例えば、がんを診断されるか、又はそれを有するか若しくは起こすことが疑われる哺乳動物対象を含む動物を指す。一実施形態では、用語「対象」は、がんを有する脊椎動物、又はがん処置を必要とすると考えられる脊椎動物を指すことができる。対象には、哺乳動物等の温血動物、例えば霊長類、より好ましくはヒトが含まれる。非ヒト霊長類も、対象である。用語対象には、家畜動物、例えば、ネコ、イヌ、類人猿等、畜産動物(例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等)及び実験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモット等)が含まれる。したがって、獣医学的使用及び医療用製剤が、本明細書で企図される。

「投与する」又は「投与」は、本明細書において対象に本出願のNK細胞又は医薬組成物を提供することとみなされる。限定ではなく例として、投与は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、空洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、関節滑液嚢内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口内、舌下、鼻腔内及び経皮を通して実行することができる。例えば、注射は、静脈内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹腔内(i.p.)注射又は筋肉内(i.m.)注射によって実行することができる。1つ又は複数のそのような経路を用いることができる。非経口投与は、例えば、ボーラス注射によるか又は経時的な段階的かん流によることができる。代わりに、又は同時に、投与は経口経路によることができる。

用語「処置する」又は「処置」の使用は、本明細書において、障害、障害の症状、障害に二次性の疾患状態又は障害の素因を治癒、緩和、軽減、治療、予防又は改善するための、対象へのNK細胞又は医薬組成物の投与とみなされる。用語「阻害する」、「低減する」又は「阻止する」又はこれらの用語の任意の変異形は、請求項及び/又は明細書で使用されるとき、所望の結果を達成するための任意の測定可能な減少又は完全な阻害を含む。

本出願のNK細胞又は医薬組成物によって処置できる「がん」には、部位によって分類されるもの、例えば、口腔及び咽頭(唇、舌、唾液腺、口腔底、歯肉及び他の口、鼻咽頭、扁桃、中咽頭、下咽頭、他の口/咽頭)のがん;消化器系(食道;胃;小腸;結腸及び直腸;肛門、肛門管及び肛門直腸;肝臓;肝内胆管;胆嚢;他の胆管;膵臓;腹膜後腔;腹膜、網及び腸間膜;他の消化管)のがん;呼吸器系(鼻腔、中耳及び副鼻洞;喉頭;肺及び気管支;胸膜;気管、縦隔及び他の呼吸器)のがん;中皮腫;骨及び関節;及び心臓を含む軟組織のがん;皮膚がん、例えば、メラノーマ及び他の非上皮性皮膚がん;カポジ肉腫及び乳がん;女性生殖系(子宮頚;子宮体;子宮、卵巣;膣;外陰部;及び他の女性生殖器)のがん;男性生殖系(前立腺;精巣;ペニス;及び他の男性生殖器)のがん;泌尿器系(膀胱;腎臓及び腎盤;尿管;及び他の泌尿器)のがん;目及び眼窩のがん;脳及び神経系(脳;及び他の神経系)のがん;内分泌系(甲状腺、及び胸腺を含む他の内分泌)のがん;リンパ腫(ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫)、多発性骨髄腫、並びに白血病(リンパ球性白血病;骨髄性白血病;単球白血病;及び他の白血病)が含まれる。

本出願による治療組成物の好適な標的である可能性がある、組織型によって分類される他のがんには、限定されずに、悪性新生物;他に特定されない(NOS)癌腫;未分化癌腫、NOS;巨大及び紡錘体細胞癌;小細胞癌、NOS;乳頭状癌、NOS;扁平上皮癌、NOS;リンパ上皮癌;基底細胞癌、NOS;石灰化上皮腫;移行性細胞癌、NOS;乳頭状移行上皮癌;腺癌、NOS;悪性ガストリノーマ;胆管癌;肝細胞癌、NOS;肝細胞癌及び胆管癌の複合;小柱腺癌;腺様嚢胞癌;腺腫性ポリープにおける腺癌;腺癌、家族性大腸ポリポージス;固形癌腫、NOS;悪性カルチノイド腫瘍;細気管支肺胞性腺癌;乳頭状腺癌、NOS;嫌色素性癌腫;好酸性癌腫;酸親和性腺癌;好塩基球癌腫;透明細胞腺癌、NOS;顆粒細胞性癌腫;ろ胞性腺癌、NOS;乳頭状及びろ胞性腺癌;非封入性硬化性癌腫;副腎皮質癌;子宮内癌;皮膚付加物癌腫;アポクリン腺癌;皮脂性腺癌;耳垢腺癌;粘液性類表皮癌;嚢胞腺癌、NOS;乳頭状嚢胞腺癌、NOS;乳頭状漿液性嚢胞腺癌;粘液性嚢胞腺癌、NOS;粘液性腺癌;印環細胞癌;浸潤性導管癌;髄様癌、NOS;小葉癌;炎症性癌腫;乳房のページェット病;腺房細胞癌;腺扁平上皮癌;腺癌w/扁平上皮異形成;悪性胸腺腫;悪性卵巣間質性腫瘍;悪性卵胞膜細胞腫;悪性顆粒膜細胞腫;悪性細胞腫;セルトリ細胞癌腫;悪性ライディッヒ細胞腫;悪性脂質細胞腫;悪性パラガングリオーマ;悪性の乳房外パラガングリオーマ;褐色細胞腫;グロムス血管肉腫;悪性のメラノーマ、NOS;メラニン欠乏性黒色腫;表在性の拡散性メラノーマ;巨大色素性母斑における悪性メラノーマ;類上皮細胞メラノーマ;悪性の青色母斑;肉腫、NOS;線維肉腫、NOS;悪性線維組織球腫;粘液肉腫;脂肪肉腫、NOS;平滑筋肉腫、NOS;横紋筋肉腫、NOS;胎児性横紋筋肉腫;胞巣状横紋筋肉腫;間質性肉腫、NOS;悪性混合腫瘍、NOS;ミュラー混合腫瘍;腎芽腫;肝芽細胞腫;癌肉腫、NOS;悪性間葉細胞腫;悪性ブレンナー腫瘍;悪性仮葉腫瘍;滑膜肉腫、NOS;悪性中皮腫;未分化胚細胞腫;胎児性癌、NOS;悪性テラトーマ、NOS;悪性卵巣甲状腺腫;絨毛癌;悪性中腎腫;血管肉腫;悪性血管内皮腫;カポジ肉腫;悪性血管周囲細胞腫;リンパ管肉腫;骨肉腫、NOS;皮質近接骨肉腫;軟骨肉腫、NOS;悪性軟骨芽細胞腫;間葉性軟骨肉腫;骨巨細胞腫;ユーイングの肉腫;悪性歯原性腫瘍;エナメル芽細胞歯肉腫;悪性エナメル上皮腫;エナメル芽細胞線維肉腫;悪性松果体腫;脊索腫;悪性神経膠腫;上衣細胞腫、NOS;星状細胞腫、NOS;原形質星状細胞腫;線維性星状細胞腫;神経膠星状芽細胞腫;神経膠芽腫、NOS;希突起膠細胞腫、NOS;乏突起神経膠芽細胞腫;原始的神経外胚葉性;小脳肉腫、NOS;神経節芽細胞腫;神経芽細胞腫、NOS;網膜芽細胞腫、NOS;嗅覚神経原性腫瘍;悪性髄膜腫;神経線維肉腫;悪性神経鞘腫;悪性顆粒細胞腫;悪性リンパ腫、NOS;ホジキン病、NOS;ホジキン;側肉芽腫、NOS;悪性リンパ腫、小リンパ球;悪性の散在性リンパ腫、大細胞;悪性リンパ腫、ろ胞性、NOS;菌状息肉腫;他の特定された非ホジキンリンパ腫;悪性組織球症;多発性骨髄腫;肥満細胞肉腫;免疫増生性小腸疾患;白血病、NOS;リンパ性白血病、NOS;形質細胞白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞白血病;骨髄性白血病、NOS;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球白血病、NOS;肥胖細胞性白血病;巨核芽球白血病;骨髄性肉腫;及び毛様細胞白血病が含まれる。

「有効量」は、本明細書で使用されるように、体重減少、疼痛、又は触知可能な腫瘤として臨床的に、若しくは様々な画像化手段を通して放射線学的に検出可能である腫瘍質量を限定されずに含む、がんの症状及び徴候を低減するのに十分である、改変されたNK細胞又は医薬組成物の用量を指す。

ある特定の実施形態では、腫瘍又はがん病巣のサイズを制限、低減又は改善することが望まれる。投与経路は、標的の病巣又は部位の位置及び性質によって当然異なり、例えば、限局性、非経口、静脈内、筋肉内及び/又は全身投与及び製剤を含む。標的領域のために、臓器又は組織に対する直接的注射、及びそこから及びその中の脈管系又は血管への注射が特異的に企図される。局所、限局性又は全身性投与も、適当であるかもしれない。

本開示では、FACS/フローサイトメトリー分析を使用した細胞表面抗原の発現レベル又は表面密度は、表1に規定される。Table 1 (表1)の様々な発現レベルの解釈は、細胞表面抗原の発現レベルを規定する例である。フローサイトメトリーシグナルレベル強度は、以下の因子によって異なることに注意すべきである:フローサイトメトリー、ソフトウェア及び使用する抗体の異なるバッチ。

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、この発明が属する分野の当業技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書で引用される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参考文献が提示される文章及び/又は段落に関連する教示に関して、参照により完全に組み込まれる。

改変されたNK細胞
天然に存在するか又は従来のNK細胞は、CD16⁺CD56⁺表現型を有する。一実施形態では、天然に存在するか又は従来のNK細胞は、Table 2 (表2)に例示されるように、CD3^-CD14^-CD19^-CD56⁺CD16⁺NKG2D⁺CD11c^dim表現型を有する。

一実施形態では、本出願は、Table 2 (表2)に例示されるように、CD3^-CD19^-CD14^-CD56^hiCD16^dimNKG2D⁺CD11c⁺CD86⁺HLA-DR⁺CD83^-細胞表現型を含む改変されたNK細胞を提供する。本出願の改変されたNK細胞は、天然に存在しない。改変されたNK細胞は完全に活性化された樹状(DC)細胞表面抗原(例えば、HLA-DR及びCD86)の1つ又は複数を含み、NK細胞機能及びDC細胞機能の両方及び強化された抗がん活性を有する。

具体的には、本出願は、CD16^dimCD56^hi表現型を含む改変されたNK細胞を提供し、ここで、前記CD16^dimCD56^hi NK細胞はCD83細胞表面抗原(CD16^dimCD56^hiCD83^-の表現型を有する)を含まない。

WO2015/100495は、CD3^-CD19^-CD14^-CD56⁺CD16⁺NKG2D⁺CD11c^-CD86⁺HLA-DR⁺CD83⁺表現型を含む改変されたNK細胞を開示した。WO2015/100495の改変されたNK細胞と比較すると、本出願の改変されたNK細胞は、一般的なDC細胞表面抗原CD11cを有するが、完全に活性化されたDC細胞表面抗原CD83を欠いている。それにもかかわらず、本出願の改変されたNK細胞は、WO2015/100495の改変されたNK細胞よりも66%高く、強力なDC細胞機能、例えば抗原提示を有する。

一実施形態では、細胞表面抗原の発現レベル又は表面密度は、改変されたNK細胞を蛍光色素タグ付きの特異的抗ヒトモノクローナル抗体(例えば、CD86-PE(Beckman Coulter;カタログ番号:IM2729U)又は抗ヒトCD83-PE-Cy5(BioLegend;カタログ番号:305310)に曝露させ、続いてフローサイトメーター(例えば、Navios、Beckman Coulter社、USA、から市販されている)を使用して改変されたNK細胞を選別することによって定量化される。

改変されたNK細胞は一個人から生成することができ、例えば、自家又は同種異系であってよい。

医薬組成物
一実施形態では、本出願は、本明細書に記載される改変されたNK細胞及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

本出願は、それを必要とする対象に本改変されたNK細胞又は本医薬組成物を、がん細胞を阻害するために有効な量で投与することによってがん細胞を阻害する方法も提供する。いかなる特定の理論によっても縛られずに、改変されたNK細胞は、NK細胞/DC細胞機能:細胞傷害性を強化すること、がん特異的Tリンパ球増殖又はIFN-γ分泌を刺激すること、の1つ又は複数によってがん細胞を阻害すると考えられている。

本医薬組成物又は改変されたNK細胞の投与経路には、限定されずに、静脈内、筋肉内、皮下、経口、局所、皮内、経皮、皮膚下、非経口、直腸、脊髄又は表皮投与が含まれる。一実施形態では、改変されたNK細胞は、静脈内注射又は注入によって投与される。

本出願の医薬組成物は、液体溶液又は懸濁液としての注射剤として、又は注射前の液体ビヒクル中の溶液若しくは懸濁液に適する固体形として調製することができる。

本改変されたNK細胞は、哺乳動物対象への送達のための医薬組成物に製剤化される。医薬組成物は単独で、及び/又は薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤若しくは担体と混合されて投与される。好適なビヒクルは、例えば、食塩水(例えば生理食塩水)、デキストロース、グリセロール、血小板浮遊血漿(PRP)等、及びその組合せである。更に、ビヒクルは、少量の補助物質、例えば、湿潤若しくは乳化剤、pH緩衝剤又はアジュバントを含有することができる。薬学的に許容される担体は、例えば、本出願の医薬組成物の吸収又はクリアランス速度を安定化、又は増減する作用をする、生理的に許容される化合物を含有することができる。生理的に許容される化合物には、例えば、炭水化物、例えばグルコース、スクロース若しくはデキストラン、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸若しくはグルタチオン、キレート化剤、低分子タンパク質、界面活性剤、リポソーム担体又は賦形剤又は他の安定剤及び/又は緩衝剤を含めることができる。他の生理的に許容される化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤又は保存剤が含まれる。例えば、Remington's Pharmaceutical Science、Mack Publishing Company、Easton, Pa. (「Remington's」)の第21版を参照する。本出願の医薬組成物は、補助物質、例えば薬理学的薬剤、サイトカイン又は他の生体応答調節剤を含むこともできる。

そのような剤形の実際の調製方法は当業者に公知であるか又は明らかになる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton, Pennsylvania、第21版、を参照する。

改変されたNK細胞又は本医薬組成物は、改変されたNK細胞又は本医薬組成物が予防的目的又は治療目的で使用されるかどうかにかかわらず、対象の年齢、体重及び状態、使用される特定の組成物、及び投与経路等に適当である、単回投与処置法、又はスケジュールされた、及びある期間にわたる複数回投与処置法で投与することができる。例えば、一実施形態では、本出願による改変されたNK細胞又は医薬組成物は、1カ月に1回、1カ月に2回、1カ月に3回、隔週(qow)、1週に1回(qw)、1週に2回(biw)、1週に3回(tiw)、1週に4回(qiw)、1週に5回、1週に6回、1日おき(qod)、毎日(qd)、1日に2回(bid)、1日に3回(tid)又は1日に4回(qid)投与される。

本出願による改変されたNK細胞又は医薬組成物の処置期間、例えば、改変されたNK細胞又は医薬組成物が投与される期間は、様々な因子、例えば、対象応答等のいずれかによって異なることができる。例えば、改変されたNK細胞又は医薬組成物は、約1又は数秒から1又は数分、1又は数時間から1日〜約1週、約2週から約4週、約1カ月から約2カ月、約2カ月から約4カ月、約4カ月から約6カ月、約6カ月から約8カ月、約8カ月から約1年、約1年から約2年、又は、約2年から約4年、又はそれ以上の範囲の期間にわたって、投与することができる。

投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、投薬単位剤形で非経口医薬組成物又は改変されたNK細胞を製剤化することが有利である。本明細書で使用される投薬単位剤形は、処置対象のための単一投薬量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬用担体と共同して所望の治療効果を生むように計算された改変されたNK細胞の所定量を含有する。

細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用のための範囲の投薬量の製剤化で使用することができる。一実施形態では、そのようなNK細胞の投薬量は、毒性のほとんどないED₅₀を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路によって、この範囲内で異なることができる。別の実施形態では、治療的有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。細胞培養において判定されるIC₅₀(すなわち、症状の最大半減阻害を達成する改変されたNK細胞の濃度)を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて用量を処方することができる。Sonderstrup、Springer、Sem. Immunopathol. 25: 35〜45頁、2003。Nikula等、Inhal. Toxicol. 4(12j: 123〜53頁、2000。

医薬組成物は、本改変されたNK細胞の有効量を含有するように製剤化され、この量は処置する動物及び処置する状態に依存する。任意の特定の対象のための具体的な用量レベルは、具体的な改変されたNK細胞の活性、年齢、体重、一般健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路並びに排出速度、薬物組合せ、及び療法を受ける特定の疾患の重症度を含む様々な因子に依存する。本出願の改変されたNK細胞の治療的又は予防的に有効な量のための例示的な非限定的な範囲は、1用量につき少なくとも約1×10³の細胞数から1用量につき約1×10⁹の細胞数である。1用量につき1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸又は1×10⁹の細胞数を限定されずに含む、他の投薬量も可能である。

改変されたNK細胞又は医薬組成物は、単独で、又は別の治療剤、例えば、化学療法、放射線療法又は標的療法又はがんワクチンと組み合わせて投与することができる。

改変されたNK細胞を同定及び培養する方法
一実施形態では、最初のNK細胞を同定し、改変されたNK細胞を培養する方法は、図7に例示される。簡潔には、本方法は、:単核細胞を含有する体液を得るステップ;単核細胞を、IL-15、IL-12及びIL-18を含む第1の培地と接触させて培養された細胞集団を得るステップ;及び細胞マーカーCD3^-CD19^-CD14^-CD56^hiCD16^dimNKG2D⁺CD11c⁺CD86⁺HLA-DR⁺CD83^-を有する培養された細胞集団からNK細胞機能及び樹状細胞機能の両方を有するNK細胞を単離するステップを少なくとも含む。

好ましくは、改変されたNK細胞の選択又は生成のために本明細書で使用される単核細胞は、増大培養のための始原細胞集団としての精製されたCD3^-CD14^-CD19^-単核細胞である。

一実施形態では、CD3^-CD14^-CD19^-単核細胞の高度に精製された分画を得るための同定/消去ステップは、以下の通りである:
(a)対象から試料を収集するステップ;試料には、1つ又は複数の単核細胞を含有する任意の体液、例えば末梢血、臍帯血又は骨髄試料が限定されずに含まれる。
(b)遠心分離(Ficoll-Paque (商標) PREMIUM、GE Healthcare USA)を通して、ステップ(a)の試料の中の単核細胞を他のタイプの血液細胞から分離するステップ。単核細胞を分離する他の方法は、当業者に公知であるか又は明らかになる。
(c) CD3細胞表面抗原(例えば、単核細胞表現型CD3⁺CD56^-及びCD3⁺CD56⁺)、CD14細胞表面抗原又はCD19細胞表面抗原を含む1つ又は複数の単核細胞を、例えばMACSソーティング(Mitenyi Biotec、Germany)によって、ステップ(b)の他の単核細胞から除去するステップ。
(d)培養のためにステップ(c)のCD3^-CD14^-CD19^-単核細胞を収集するステップ。

本開示の一実施形態は、試料から始原細胞を同定する方法であって、前記試料中の単核細胞からの以下の細胞表面抗原: CD3、CD14又はCD19の1つ又は複数を消去するステップを含む方法を提供し、ここで、前記始原細胞は、CD3、CD14及びCD19から選択される細胞表面抗原の1つ又は複数を実質的に含有しない。

一実施形態では、ステップ(b)のCD3を含む単核細胞は、試料の中で消去される。別の実施形態では、ステップ(b)のCD14を含む単核細胞は、試料の中で消去される。更に別の実施形態では、ステップ(b)のCD19を含む単核細胞は、試料の中で消去される。更に別の実施形態では、ステップ(b)のCD14を含む1つ又は複数の単核細胞及びCD3を含む1つ又は複数の単核細胞は、試料の中で消去される。更に別の実施形態では、ステップ(b)のCD14を含む1つ又は複数の単核細胞及びCD19を含む1つ又は複数の単核細胞は、試料の中で消去される。更に別の実施形態では、ステップ(b)のCD19を含む1つ又は複数の単核細胞及びCD3を含む1つ又は複数の単核細胞は、試料の中で消去される。更に別の実施形態では、ステップ(b)のCD19を含む1つ又は複数の単核細胞、CD3を含む1つ又は複数の単核細胞及びCD14を含む1つ又は複数の単核細胞は、試料の中で消去される。

一実施形態では、CD3を含む単核細胞の実質的に全ては、試料の中で消去される。別の実施形態では、CD14を含む単核細胞の実質的に全ては、試料の中で消去される。更に別の実施形態では、CD19を含む単核細胞の実質的に全ては、試料の中で消去される。

一実施形態では、細胞を培養するための組成物は、IFN-γを更に含む。代替の実施形態では、細胞を培養するための組成物は、IFN-γを含まない。この実施形態では、IFN-γは、本明細書に開示される改変されたNK細胞の生成にほとんど影響を与えなかった。

IL-12を含む組成物の培養時間は、改変されたNK細胞の機能のために決定的である可能性がある。一実施形態では、改変されたNK細胞を生成するために、単核細胞をIL-12、例えばヒトIL-12と、1〜12日間、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12日間培養することができる。一実施形態では、IL-12と3、6、9又は12日間培養される単核細胞は、類似した細胞収率及び表現型パターンを有する改変されたNK細胞を生成する。別の実施形態では、IL-12の長期、例えば12日間の曝露は、より短い時間、例えば9日間のIL-12曝露を有する細胞と比較して、培養された細胞の細胞傷害性及び抗原提示細胞活性を増強した。

一実施形態では、細胞を培養するための組成物は、IL-18を更に含む。一実施形態では、IL-18の有効な濃度は、約1〜300ng/mL、例えば50、100、150、200、250、300ng/mLである。別の実施形態では、IL-18の有効な濃度は、約10〜約250ng/mL、又はその間の10ng/mL増分の任意の値、若しくは値の範囲である(例えば、約30ng/mL、約220ng/mL等)。

別の実施形態では、IL-18は、改変されたNK細胞の表現型パターン及び機能的活性に影響を与えた。長期IL-18曝露は、細胞のサイズ、表現型及び機能的活性に対して反対の影響を及ぼすことがある。一実施形態では、改変されたNK細胞を生成するために、単核細胞をIL-18、例えばヒトIL-18と、1〜12日間、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12日間培養することができる。一実施形態では、IL-18と3、6、9又は12日間培養される単核細胞は、様々な表現型を有する改変されたNK細胞を生成する。別の実施形態では、IL-18の十分な、例えば6日間の曝露は、より短い時間、例えば6日間のIL-18曝露を有する細胞と比較して、改変されたNK細胞の細胞サイズ、表現型及び機能に対して反対の影響を及ぼすことがある。

一実施形態では、CD3^-CD14^-CD19^-単核細胞の高度に精製された分画は、IL-18、IL-15及び/又はIL-12を含む培養組成物と接触している。別の実施形態では、ステップ(c)のCD3^-CD14^-CD19^-単核細胞は、造血細胞培地(例えば、X-vivo 20)、IL-18、IL-15、IL-12及び血清タンパク質(例えば、ヒト血小板溶解物)から実質的になる組成物と混合される。更に別の実施形態では、ステップ(c)のCD3^-CD14^-CD19^-単核細胞は、X-vivo 20、IL-18、IL-15、IL-12及びヒト血小板溶解物から実質的になる組成物と混合される。

別の実施形態では、組成物は、造血細胞培地を更に含む。造血細胞培地の非限定的な例には、X-vivo 10、X-vivo 15、X-vivo 20(Lonza、Switzerland、から市販されている)及びAIM-V(ThermoFisher Scientific、米国、から市販されている)が含まれる。

更に別の実施形態では、組成物は、血清タンパク質、例えばヒト血小板溶解物を更に含む。本出願では、「血清タンパク質」は、細胞活性の運搬及び調節を含む多くの異なる機能を果たす、血液又は血漿に存在するタンパク質である。血清タンパク質の非限定的な例には、酵素、補体構成成分、プロテアーゼ阻害剤、キニン前駆体、血清アルブミン、グロブリン及びフィブリノーゲン等が含まれる。

細胞を培養するための組成物の非限定的な例には、(a)造血細胞培地 + IL-15 + IL-18; (b)造血細胞培地 + IL-12 + IL-18; (c)造血細胞培地 + IL-15 + IL-12 + IL-18; (d) X-vivo 20 + IL-15 + IL-18; (e) X-vivo 20 + IL-12 + IL-18; (f) X-vivo 20 + IL-15 + IL-12 + IL-18; (g) AIM-V + IL-15 + IL-18; (h) AIM-V + IL-12 + IL-18; (i) AIM-V + IL-15 + IL-12 + IL-18; (j)造血細胞培地+ IL-15 + IL-18 +血清タンパク質; (k)造血細胞培地+ IL-12 + IL-18 +血清タンパク質; (l)造血細胞培地+ IL-15 + IL-12 + IL-18 +血清タンパク質; (m) X-vivo 20 + IL-15 + IL-18 +血清タンパク質; (n) X-vivo 20 + IL-12 + IL-18 +血清タンパク質; (o) X-vivo 20 + IL-15 + IL-12 + IL-18 +血清タンパク質; (p) AIM-V + IL-15 + IL-18 +血清タンパク質; (q) AIM-V + IL-12 + IL-18 +血清タンパク質;及び(r) AIM-V + IL-15 + IL-12 + IL-18 +血清タンパク質が含まれる。

一実施形態では、組成物は、37℃の5% CO₂の存在下で、改変されたNK細胞を培養するために使用される。

本出願の一部の実施形態による組成物は、改変されたNK細胞の増殖を強化する。一実施形態では、組成物は、改変されたNK細胞の上でCD11c細胞表面抗原の発現を実質的に強化する。別の実施形態では、組成物は、改変されたNK細胞の上で完全活性化DC細胞マーカー、例えば、HLA-DR及びCD86細胞表面抗原の発現を強化するが、CD83細胞表面抗原の発現は強化しない。改変されたNK細胞の増殖速度は、FACS及び生存可能な数を通してCD3^-CD14^-CD19^-細胞の純度によって判定された。細胞増殖のための他のアッセイ、例えば、クローン原性アッセイ、代謝アッセイ及び直接増殖アッセイは当技術分野で周知である。

CD3^-CD14^-CD19^-単核細胞及び組成物の接触時間の例示的な非限定的な範囲は、約1分から約1時間、約1時間から約24時間、約1日から約3日、約1日から約6日、約1日から約9日、約1日から約12日、約3日から約6日、約3日から約9日、約3日から約12日、約6日から約9日、約6日から約12日、又は少なくとも1日である。一実施形態では、接触時間は、約3日である。別の実施形態では、接触時間は約6日である。

一実施形態では、CD3^-CD14^-CD19^-単核細胞は、IL-15、IL-12及びIL-18を含む第1の組成物と接触し、続いてIL-15及びIL-12を含む第2の組成物と接触する。別の実施形態では、第1及び第2の組成物は、造血細胞培地、例えばAIM-V若しくはX-vivo、及び/又は血清タンパク質、例えばヒト血小板溶解物を更に含む。

本発明を実行するための具体的な態様の以下の実施例は、例示的な目的のためにだけ提供され、本発明の範囲を限定するものでは決してない。

(実施例1)
培地の選択
CD3^-CD14^-CD19^-単核細胞は、30ng/mLヒト組換えIL-15(hIL-15)、3ng/mLヒト組換えIL-12(hIL-12)、60ng/mLヒト組換えIL-2(hIL-2)、37.5ng/mLヒト組換えIL-18(hIL-18)及び必要に応じて4%(w/w)ヒト血小板溶解物(HPL)の存在下で、AIM-V培地又はX-vivo 20培地で15日間培養した。各群における細胞数は、トリパンブルー色素排除を使用して数えた。更に、その後、NKG2D-PE、CD45-ECD、CD16-PE-Cy7、CD56-APC-Alexa Flour 700、CD3-APC-Alexa Flour 750、CD14-APC-Alexa Flour 750、CD19-APC-Alexa Flour 750(Beckman Coulter)、CD86-Alexa488、CD83-PE-Cy5、CD11c-APC及びHLA-ABC-Pacific Blue(Biolegend)のモノクローナル抗体(mAb)で細胞を染色した。試料を取得し、Naviosフローサイトメーターを通して分析し、データ分析は、Kaluzaソフトウェア(Beckman Coulter)を通して実行した。

図1Aに示すように、HPLを追加したAIM-V培地で培養された細胞の細胞数は、X-vivo 20によるものより優れた細胞培養の収量に到達し、HPLを含有するAIM-V培地は、細胞の収量を増加させる能力を有していたことを示す。更に、HPLを追加したAIM-V培地で細胞を培養することは、X-vivo 20によるものと同等の表現型をもたらす(図1B〜1C)。

(実施例2)
初期の単核細胞の選択
CD3^-CD14^-CD19^-(TN1)又はCD25^-CD14^-CD19^-(TN2)単核細胞は、30ng/mL hIL-15、3ng/mL hIL-12、45ng/mLヒト組換えIFN-γ(hIFN-γ)及び4%(w/w) HPLの存在下で、AIM-V培地で9日間培養した。培養した細胞は、トリパンブルー色素排除を使用して数え、CD45-ECD、CD3-APC-Alexa Flour 750、CD14-APC-Alexa Flour 750及びCD19-APC-Alexa Flour 750(Beckman Coulter)のmAbで染色した。試料を取得し、Naviosフローサイトメーターを通して分析し、データ分析は、Kaluzaソフトウェア(Beckman Coulter)を通して実行した。

図2A及びTable 3 (表3)に示すように、TN1始原細胞は、TN2始原細胞を使用したものより優れた収量で、高い純度を有する標的細胞を与えた。

他方、培養した細胞は、それらの表現型を分析するために、NKG2D-PE、CD45-ECD、CD16-PE-Cy7、CD56-APC-Alexa Flour 700、CD3-APC-Alexa Flour 750、CD14-APC-Alexa Flour 750、CD19-APC-Alexa Flour 750(Beckman Coulter)、CD86-Alexa488、CD83-PE-Cy5、CD11c-APC及びHLA-ABC-Pacific Blue(Biolegend)のmAbで染色した。試料を取得し、Naviosフローサイトメーターを通して分析し、データ分析は、Kaluzaソフトウェア(Beckman Coulter)を通して実行した。

図2B及び2Cに示すように、表現型分析は、TN1及びTN2始原細胞から生成された培養細胞の類似したパターンを示した。

したがって、TN1始原細胞から生成された培養細胞はCD3^-CD14^-CD19^-CD56^hiCD16^dimNKG2D⁺CD11c⁺HLA-DR⁺CD86⁺CD83^-としてTN2始原細胞からのものと同等のNK及びDC表現型を発現したが、TN1始原細胞(CD3^-CD14^-CD19^-)は、TN2始原細胞(CD25^-CD14^-CD19^-)を使用したものより優れた収量で、高度に純粋な培養細胞を与えた。

(実施例3)
IFN-γの重要でない役割
WO2015/100495は、NK細胞及びDC細胞機能を有する改変されたNK細胞の生成のためにIFN-γが決定的であることを開示した。しかし、意外にも、IFN-γは、本明細書に開示される改変されたNK細胞の生成にほとんど影響を与えなかったことを見出した。

1×10⁶/mLのCD3^-CD14^-CD19^-単核細胞を、30ng/mL hIL-15、3ng/mL hIL-12の存在下で、及び45ng/mL hIFN-γの有る無しで9日間培養した。培養した細胞は、CD45-ECD、CD3-APC-Alexa Flour 750、CD14-APC-Alexa Flour 750及びCD19-APC-Alexa Flour 750(Beckman Coulter)のmAbで染色した。試料を取得し、Naviosフローサイトメーターを通して分析し、データ分析は、Kaluzaソフトウェア(Beckman Coulter)を通して実行した。

図3A及びTable 4 (表4)に示すように、IFN-γの有る無しで培養された細胞は、培養された細胞に関して実質的に同じ純度及び収量をもたらし、TN1始原細胞からの培養細胞の出現がIFN-γから独立していたことを示す。更に、表現型分析は、IFN-γの有無にかかわらず培養された細胞の類似したパターンを示した(図3B及び3C)。

その結果、細胞純度、収量並びにNK及びDC表現型の取得に関して、本明細書に開示される培養された細胞の出現に、IFN-γはより少ない影響を与えた。

(実施例4)
IL-12の処置期間
CD3^-CD14^-CD19^-単核細胞を、30ng/mL hIL-15と12日間、及び3ng/mL hIL-12の存在下で9又は12日間培養した。6日目に細胞を継代培養し、3日おきに培地を交換した。培養された細胞は、トリパンブルー色素排除を使用して数えた。更に、培養した細胞は、NKG2D-PE、CD45-ECD、CD16-PE-Cy7、CD56-APC-Alexa Flour 700、CD3-APC-Alexa Flour 750、CD14-APC-Alexa Flour 750、CD19-APC-Alexa Flour 750(Beckman Coulter)、CD86-Alexa488、CD83-PE-Cy5、CD11c-APC及びHLA-ABC-Pacific Blue(Biolegend)のmAbで染色した。試料を取得し、Naviosフローサイトメーターを通して分析し、データ分析は、Kaluzaソフトウェア(Beckman Coulter)を通して実行した。

図4Aに示すように、IL-12の12日間の長期曝露は、9日間のIL-12曝露を有する細胞と比較して、細胞収量に関してより少ない影響を培養された細胞の出現に与えた。同様に、表現型分析は、9日間又は12日間のIL-12曝露を有する培養された細胞の類似したパターンを示した(図4B及び4C)。

他方、細胞傷害性及び抗原提示活性を評価するために、機能的アッセイも実行した。改変されたNK細胞の細胞傷害性の評価は、PanToxiluxキット(OncoImmunin社)によって実行した。ヒト慢性骨髄性白血病(CML)細胞系、K562は標的細胞の役目をし、50分間の最適濃度の下でTFL4によって染色された。TFL4標識標的細胞及び培養された細胞のカスパーゼ基質との37℃で20分間の共インキュベーション。細胞を採収し、フローサイトメトリーを通してTFL-4⁺基質⁺のシグナルを分析した。培養された細胞の抗原提示活性の評価は、混合リンパ球反応(MLR)によって実行した。応答体細胞(CD25-PBMC)を富化し、CellTrace(商標)CFSE細胞増殖キット(Invitrogen)で染色した。CSFE標識CD25-PBMC及び改変されたNK細胞の37℃で5日間の共培養。TCR係合の閾値を低減するために、1日目及び3日目にhIL-2及びhIL-15を加えた。細胞を採収し、フローサイトメトリーを通してCFSE希釈パターンを分析した。

図4D及び4Eに示すように、IL-12の12日間の長期曝露は、9日間のIL-12曝露を有する細胞と比較して、培養された細胞の細胞傷害性及び抗原提示細胞活性を増強した。

その結果、長期IL-12曝露は、細胞純度、収量並びにNK及びDC表現型の取得に関して、本明細書に開示される培養された細胞の出現により少ない影響を与えたが、改変されたNK細胞の細胞傷害性及び抗原提示細胞活性は、12日間の長期IL-12曝露によって実際増強された。

(実施例5)
改変されたNK細胞の出現に及ぼすIL-18の影響
CD3^-CD14^-CD19^-単核を、30ng/mL hIL-15、3ng/mL hIL-12、及び0、50、100又は200ng/mLのhIL-18の存在下で12日間培養した。6日目に細胞を継代培養し、3日おきに培地を交換した。培養された細胞を3、6、9及び12日目に採収し、トリパンブルー色素排除を使用して数えた。更に、3日目及び12日目の培養された細胞を採収し、NKG2D-PE、CD45-ECD、CD16-PE-Cy7、CD56-APC-Alexa Flour 700、CD3-APC-Alexa Flour 750、CD14-APC-Alexa Flour 750、CD19-APC-Alexa Flour 750(Beckman Coulter)、CD86-Alexa488、CD83-PE-Cy5、CD25-PerCP/Cyanine5.5 CD11c-APC及びHLA-ABC-Pacific Blue(Biolegend)に対するmAbで染色した。試料を取得し、Naviosフローサイトメーターを通して分析し、データ分析は、Kaluzaソフトウェア(Beckman Coulter)を通して実行した。

図5Aに示すように、IL-18の付加は、6日目の後から12日目まで培養された細胞の増大を増強した。予想外にも、表現型分析は、IL-18の付加が3日目のCD25、HLA-DR及びCD86の発現を上方制御したことを示した(図5B)。しかし、HLA-DR及びCD86の発現は、12日目に下方制御された(図5C)。

同様に、IL-18の様々な用量で処置した培養細胞の細胞傷害性及び抗原提示活性を評価するために、機能的アッセイも実行した。図5D及び5Eにより、IL-18の付加は、12日目に培養された細胞の細胞傷害性及び抗原提示細胞活性を負に調節した。

その結果、50ng/mL IL-18の付加は、3日目の改変されたNK細胞のCD25、HLA-DR及びCD86の発現を増強し、改変されたNK細胞の細胞集団増大は12日目まで増強した。しかし、長期IL-18曝露は、改変されたNK細胞の細胞のサイズ、表現型及び機能に対して反対の影響を及ぼすことがある。したがって、改変されたNK細胞生成のために、IL-18の十分な曝露期間が重要である可能性がある。

(実施例6)
IL-18の処置期間
CD3^-CD14^-CD19^-単核を、30ng/mL hIL-15、3ng/mL hIL-12の存在下で12日間培養した。0、3及び6日目の50ng/mL hIL-18の動態学的曝露。6日目に細胞を継代培養し、3日おきに培地を交換した。培養された細胞を3、6、9、12及び15日目に採収し、トリパンブルー色素排除を使用して数えた。

同様に、様々な期間のIL-18で処置した培養細胞の細胞傷害性及び抗原提示活性を評価するために、機能的アッセイも実行した。

図6Aに示すように、0日目及び3日目(すなわち、6日間の曝露)のIL-18の付加は、0日目(すなわち、3日間の曝露)又は0、3及び6日目(すなわち、9日間の曝露)のIL-18の付加を有する細胞より、15日目に培養細胞の最良の増大を促進した。細胞傷害性については、6日間のIL-18への曝露は、3日間又は9日間のIL-18への曝露より、9日目の培養細胞の最良の細胞傷害性を促進した(図6B)。抗原提示活性については、6日間のIL-18への曝露は、3日間又は9日間のIL-18への曝露より、12日目の培養細胞の最良の抗原提示細胞活性を促進した(図6C)。

それに加えて、IL-18に6日間曝露させた培養細胞の抗原提示活性は、12日目に最大レベルに到達し、その後15日目にかなり低下した。その結果、現在のサイトカインニッチの下での培養細胞の最適な培養期間は、15日未満であった。

(実施例7)
始原細胞の調製
健康なボランティアから40mLの末梢血を、K2EDTAを含有している真空管の中に収集した。血液試料を、予熱したリン酸緩衝食塩水(PBS)(Biological Industries、Israel)の等量と混合した。40mLの希釈した末梢血アリコートを、50mL遠心管に入れ、10mLの予熱したFicoll-Paque(商標)PREMIUMを添加した。室温で30分間、遠心管を2000rpmで遠心分離した。インターフェース層の中の単核細胞を収集し、PBSの中で一度洗浄した。細胞ペレットは、10⁶細胞/100mL MACS緩衝液の密度に再懸濁させた。

CD14⁺細胞、CD19⁺細胞及びCD3⁺細胞を消去するために、製造業者の説明書により「QuadroMACS分離器」(Miltenyi Biotec Bergisch、Gladbach、Germany)を使用して、単核細胞を免疫磁気ビーズ分離に付した。簡潔には、単核細胞をビオチン-抗CD14、ビオチン-抗CD19及びビオチン-抗CD3と反応させ、磁気分離器によって分離し、CD14^-、CD19^-及びCD3^-細胞分画を洗浄によって未結合細胞から精製した。富化した単核細胞分画は、CD14⁺細胞、CD19⁺細胞及びCD3⁺細胞を実質的に含有しなかった。

(実施例8)
改変されたNK細胞培養
負の消去の後、実施例7からの精製されたCD14^-、CD19^-及びCD3^-NK細胞分画を、以下の通りに培養した:
(a) 0日目に1×l0⁶/mL CD14^-CD19^-CD3^-始原細胞を、AIM-V培地、HPL(濃度: 4%w/w)、IL-15(濃度: 30ng/mL)、IL-12(濃度: 3ng/mL)及びIL-18(濃度: 50ng/mL)を含む組成物と接触させる。
(b) 6日目にステップ(a)の始原細胞の半量を採収して遠沈させ、続いて細胞ペレットをAIM-V培地、HPL、IL-15及びIL-12を含む組成物で再懸濁する。
(c) 12日目にステップ(b)の培養細胞の全部を収集する。

必要に応じて、細胞を培養するための組成物は、新鮮培地によって、同じ構成成分によってそれぞれ0日目及び6日目に、3日及び9日に置き換えることができる。例えば、始原細胞は以下の通りに培養することができる:
(a) 0日目に1×l0⁶/mL CD14^-CD19^-CD3^-NK細胞を、AIM-V培地、HPL(濃度: 4%w/w)、IL-15(濃度: 30ng/mL)、IL-12(濃度: 3ng/mL)及びIL-18(濃度: 50ng/mL)を含む組成物と接触させる。
(b) 3日目に培地をAIM-V培地、HPL、IL-15、IL-12及びIL-18を含む組成物によって置き換える。
(c) 6日目にステップ(b)の培養細胞の半量を採収して遠沈させ、続いて細胞ペレットをAIM-V培地、4%w/w HPL、30ng/mLのIL-15及び3ng/mLのIL-12を含む組成物によって再懸濁する。
(d) 9日目に培地をAIM-V培地、HPL、IL-15及びIL-12を含む組成物によって置き換える。
(e) 12日目にステップ(d)の培養細胞の全部を収集する。

或いは、細胞を培養するための組成物は、新鮮培地によって、同じ構成成分によってそれぞれ0日目及び6日目に、3日及び9日に置き換えることができる。例えば、始原細胞は以下の通りに培養することができる:
(a) 0日目に1×l0⁶/mL CD14^-CD19^-CD3^-NK細胞を、AIM-V培地、HPL(濃度: 4%w/w)、IL-15(濃度: 30ng/mL)、IL-12(濃度: 3ng/mL)及びIL-18(濃度: 50ng/mL)を含む組成物と接触させる。
(b) 3日目に培地をAIM-V培地、HPL、IL-15、IL-12及びIL-18を含む組成物によって置き換える。
(c) 6日目にステップ(b)の培養細胞の半量を採収して遠沈させ、続いて細胞ペレットをAIM-V培地、4%w/w HPL、30ng/mLのIL-15、3ng/mLのIL-12及び50ng/mLのIL-18を含む組成物によって再懸濁する。
(d) 9日目に培地をAIM-V培地、HPL、IL-15、IL-12及びIL-18を含む組成物によって置き換える。
(e) 12日目にステップ(d)の培養細胞の全部を収集する。

ステップ(e)の培養細胞は、Naviosフローサイトメーター(10色/3つのレーザー、シリアル番号: AW40325、Beckman Coulter社USA)、Kazulaソフトウェアバージョン2.1(Beckman Coulter社USA)及びTable 5 (表5)に掲載される抗体を使用して、それらの表現型に関して分析した。

結果:図8に示すように、得られた改変されたNK細胞は、CD3^-CD19^-CD14^-CD56^hiCD16^dimNKG2D⁺CD11c⁺CD86⁺HLA-DR⁺CD83^-のNK及びDC関連の表現型を有する。

(実施例9)
NK細胞の機能の判定
「死滅」アッセイ
実施例8からの改変されたNK細胞の細胞傷害性の評価は、PanToxiluxキット(OncoImmunin社)によって実行した。ヒト慢性骨髄性白血病(CML)細胞系、K562は標的細胞の役目をし、50分間の最適濃度の下でTFL4によって染色された。TFL-4標識標的細胞及び改変されたNK細胞のカスパーゼ基質との37℃で20分間の共インキュベーション。細胞を採収し、フローサイトメトリーを通してTFL-4⁺基質⁺のシグナルを分析した。カスパーゼの陽性細胞は、死滅を示す。

結果:図9Aに示すように、カスパーゼ陽性標的細胞(改変されたNK細胞無しの)の百分率は0.77%であったが、カスパーゼ陽性標的細胞(改変されたNK細胞が有る)の百分率は40.2%であった。この結果は、改変されたNK細胞が白血病標的細胞K562に細胞傷害性効果を有することを示す。

抗原提示活性のアッセイ
実施例8からの改変されたNK細胞の抗原提示活性の評価は、混合リンパ球反応(MLR)によって実行した。応答体細胞(CD25^-PBMC)を富化し、CellTrace(商標)CFSE細胞増殖キット(Invitrogen)で染色した。CSFE標識CD25^-PBMC及び改変されたNK細胞の37℃で5日間の共培養。TCR係合の閾値を低減するために、1日目及び3日目にhIL-2及びhIL-15を加えた。その後細胞を採収し、フローサイトメトリーを通してCFSE希釈パターンを分析した。

結果:図9Bに示すように、フローサイトメトリーによって確認される通り、応答体細胞の4.32%は分裂していた。しかし、細胞の24.71%は、実施例8からの改変されたNK細胞の存在下で分裂していた。この結果は、改変されたNK細胞がCD25^-PBMC応答体細胞に抗原提示活性を有することを示す。

本発明の具体的な態様が記載され、例示されたが、付随する請求項により解釈される通り、そのような態様は本発明を例示するだけであり、本発明を限定するものではないと考えるべきである。本明細書で引用される全ての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が全ての目的のために参照により組み込まれることが具体的に及び個々に示されるかのように、全ての目的のために参照により本明細書に完全に組み込まれる。理解の明瞭さのために上の発明を例示及び実施例により多少詳細に記載したが、本発明の教示を考慮して、添付の請求項の精神又は範囲から逸脱せずに、ある特定の変更及び改変をそれに加えることができることは当業者に容易に明らかになる。

更なる推敲なしで、上の記載に基づいて、当業技術者は本発明をその最大限まで利用することができると考えられている。したがって、以下の具体的な実施例は、単に例示的であって、本開示の残りを限定するものでは決してないと解釈するべきである。本明細書で引用される全ての刊行物は、参照により組み込まれる。

Claims

CD3^-CD19^-CD14^-CD56^hiCD16^dimNKG2D⁺CD11c⁺CD86⁺HLA-DR⁺CD83^-の表現型
を含む、改変されたナチュラルキラー(NK)細胞。
(a)請求項1に記載の改変されたNK細胞;及び
(b)薬学的に許容される担体又は賦形剤
を含む、医薬組成物。
がん細胞を処置する方法であって、
それを必要とする対象に、請求項1に記載の改変されたNK細胞を含む組成物の有効量を投与する工程
を含む方法。
前記有効量が1用量につき約1×10³〜約1×10⁹の細胞数である、請求項3に記載の方法。
前記改変されたNK細胞が自家又は同種異系である、請求項3に記載の方法。
前記改変されたNK細胞が末梢血、臍帯血又は骨髄に由来する、請求項3に記載の方法。
前記改変されたNK細胞をin vitroで増大させることを更に含む、請求項3に記載の方法。
改変されたNK細胞を培養する方法であって、
単核細胞を含む体液を得る工程と;
前記単核細胞を、IL-15、IL-12及びIL-18を含む第1の培地と接触させて培養された細胞集団を得る工程と;
培養された前記細胞集団からCD3^-CD19^-CD14^-CD56^hiCD16^dimNKG2D⁺CD11c⁺CD86⁺HLA-DR⁺CD83^-の表現型を有する改変されたNK細胞を単離する工程と
を含む方法。
前記単核細胞が末梢血、臍帯血又は骨髄に由来する、請求項8に記載の方法。
前記第1の培地が造血細胞培地を更に含む、請求項8に記載の方法。
前記造血細胞培地がAIM-V培地を含む、請求項10に記載の方法。
前記第1の培地が血清タンパク質を更に含む、請求項10に記載の方法。
前記血清タンパク質がヒト血小板溶解物を含む、請求項13に記載の方法。
前記単核細胞が、前記第1の培地と約1〜6日間、接触する、請求項8に記載の方法。
前記第1の培地と接触させた後に、培養された前記細胞集団を、IL-15及びIL-12を含む第2の培地と接触させることを更に含む、請求項8に記載の方法。
前記第2の培地が造血細胞培地を更に含む、請求項15に記載の方法。
前記造血細胞培地がAIM-V培地を含む、請求項16に記載の方法。
前記第2の培地が血清タンパク質を更に含む、請求項16に記載の方法。
前記血清タンパク質がヒト血小板溶解物を含む、請求項18に記載の方法。
培養された前記細胞集団が、前記第2の培地と約1〜6日間、接触する、請求項15に記載の方法。
前記第1の培地と接触させる前にCD3^-CD14^-CD19^-の表現型を有する細胞について前記単核細胞を負に選択することを更に含む、請求項8に記載の方法。