JP2007533633A - 教育済みnkt細胞及び免疫関連の障害の治療におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2001年12月24日付けで出願された国際特許出願公開第PCT/IL01/01197号明細書の371である2003年6月25日付けで出願されたヤロン・イラン(Yaron Ilan)ら、による「教育済みNKT細胞及び免疫関係の障害の治療におけるその使用」という題の米国特許出願の部分継続出願である。上述の特許出願の内容は、その全体が本明細書に参照として援用されている。
本発明は、哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害の治療における治療用方法、組成物及びその使用の分野に関する。より特定的には、該発明の方法及び組成物は、抗炎症性又は炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってのTh1/Th2細胞バランスの変調を結果としてもたらす対象のNKT細胞集団の操作及び免疫関係の障害の治療におけるそれらの使用に向けられている。
本出願内で引用又は識別されている全ての特許、特許出願、特許公報、科学論文などは、本発明が関係する技術の現状をより完全に記述する目的でその全体が本明細書に参照として援用されるものである。
炎症性腸疾患(IBD)は、Th1−炎症誘発性及びTh2−抗炎症性亜型の免疫応答の間のバランス不全の結果であるものとして感知され得る一般的な胃腸障害である[ストローバ(Strober)、W.ら、Immunol Today 18:61〜64頁、(1997年);ノイラート(Neurath)、M.ら、J.Exp.Med.183:2605〜2615頁(1996年)]。
CD4及びCD8の両方のリンパ球が共に、IL−2及びIFNγを産生するTh1細胞か又はIL−4及びIL−10を産生するTh2細胞のいずれかとして型別可能である。免疫系が外来性及び自己抗原に応答する方法は、2つの亜型の応答間のバランスの結果である[ウェイナー(Weiner)、H.L.ら、Immunol.Today 18:335〜343頁アドリーニ(Adorini)、L.ら、Immunol.Today18:209〜211頁(1997年);ラバニ(Rabbani)E.ら、欧州特許出願公開第1149586A1号明細書(2001年4月27日出願)、本明細書に参照として援用]。Th1型の応答は、IBDといった複数の自己免疫及び慢性炎症性障害の病因に関与している。[アドリーニ(Adorini)、L.ら(1997年)上掲書;ミゾグチ(Mizoguchi)、A.ら、J.Exp.Med.183:847〜856頁(1996年)]。かくして、ヒトにおける実験的結腸炎及びIBDは、炎症誘発性Th1型及び抗炎症性Th2型サイトカインの間のバランス不全として感知できる。最近、動物及びヒトの両方において、IL10といった抗炎症性サイトカインがTh1媒介型サイトカインの炎症誘発性効果をダウンレギュレートしかくして免疫介在性障害を緩和することができる、ということが示されてきた[ミゾグチ、A.ら、(1996年)同上;マドセン(Madsen)、K.L.ら、Gastroenterology113:151〜159頁(1997年);ヴァン・デバンター・サンダー(Van Deventer Sander)、J.ら、Gastroenterology113:383〜389頁(1997年)]。
経口寛容(経口免疫調節)は、抗原特異的末梢免疫低応答性の誘発のための認知された手順である[ウェイナー(Weiner)、H.L.ら、(1997年)同上;ウェイナー、H.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10762〜10765頁(1994年);ロイ・チョードリ(Roy−Chowdury)ら、国際公開第98/37917号パンフレット(1998年2月26日出願)、本明細書に参照として援用]。抗原の経口投与は、動物及びヒトの両方において、コラーゲン誘発された関節炎、ブドウ膜炎、糖尿病及び実験的アレルギー性脳脊髄炎といった複数の自己免疫障害を防止する又は緩和することが示されてきた。[エスビョルン(Esbjorn)、T.ら、Int.Arch.Allergy Immunol.113:219〜223頁(1997年);ヴォン・ヘラース(Von Herrath)、M.G.ら、J.Clin.Inves.98:1324〜1331頁(1996年);ハンコック(Hancock)、W.ら、Am.J.Path.147:1193〜1197頁(1993年);ウェイナー、H.L.ら、Science261:1321〜1324頁(1993年)]。
肝臓は、長い間免疫調節機能に関与することが示唆されてきた。それは、体内で最大の網内系器官であり、その細胞の複数の亜集団が抗原の提示及び/又はプロセッシングに関与している[カルリ(Callery)、M.P.ら、J.Surg.Res.46:391〜394頁(1989年);ナカノ(Nakano)、Y.ら、Surgery 111:668〜676頁(1992年);ユー(Yu)、S.Y.ら、Surgery 116:229〜234頁(1994年)]。
成人の肝臓は、その免疫変調機能に関与する細胞の複数の亜集団を含有している。クッパー細胞は、門脈循環を通って肝臓に入る抗原に対する第1線の防御において重要であることが発見された。抗原活性化されたクッパー細胞は、抗原提示、食作用を有し、サイトカインの分泌を介して殺傷特性を示した。これらの細胞は同様に走化性及びリンパ球凝集をも誘発する[クリスプ.N.ら、(1996年)上掲書」。さらに、成人肝臓は、多能性幹細胞を含有し、胸腺及び胸腺外T細胞、顆粒球及び赤血球系統細胞を含めた多数の細胞系統を発生させる[クリスプ.N.ら、(1996年)上掲書」。実際、T細胞は、成人肝臓内で胸腺外で分化できる[コリンズ(Collins)C.ら、Eur.J.Immunol.26:3114〜3118頁(1996年)]。
第1の態様では、該発明は、かかる治療を必要とする哺乳類の対象において免疫関連又は免疫介在性の障害を、適切な手段により前記対象のNKT細胞集団を操作することによって治療するための方法において、該NKT細胞集団の前記操作が抗炎症性又は炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってのTh1/Th2細胞バランスの変調を結果としてもたらす治療方法に関する。
a. 対象又はもう1つの対象からNKT細胞を得る工程;
b. 結果として得られた教育済みNKT細胞が、抗炎症性又は炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かって前記Th1/Th2細胞バランスを変調させる能力を有するような形で、工程(a)で得られたNKT細胞を、ex vivo教育する工程;及び
c. 工程(b)で得られた教育済みNKT細胞を前記対象に再導入する工程;
を含む、哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害の治療のための方法に関する。抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってのTh1/Th2細胞バランスの変調は、結果としてIL4及びIL10のいずれか1つ対IFNγの定量比の増大をもたらす。炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってのTh1/Th2細胞バランスの変調は、IL4及びIL10のいずれか1つの対IFNγの定量比の減少を結果としてもたらす。
a. 治療すべき免疫関連又は免疫介在性の障害と結びつけられる抗原又はそれらの任意の組合せ;
b. 同じ免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は前記対象の少なくとも1つの肝臓関連細胞;
c. 少なくとも1つのサイトカイン又は接着分子;及び
d. 上記(a)、(b)及び(c)のいずれかの組合せ;
のうちのいずれか1つの存在下でこれらの細胞を培養することにより実施可能である。
a. 前記免疫関連又は免疫介在性の障害と結びつけられる抗原又はそれらの任意の組合せ;
b. 前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は治療すべき対象の少なくとも1つの肝臓関連細胞;
c. 少なくとも1つのサイトカイン又は接着分子;及び
d. 上記(a)、(b)及び(c)のいずれかの組合せ;
のうちのいずれか1つの存在下で、該発明の組成物中でのその使用に先立ちex vivoで培養される。
a. 治療すべき免疫関連又は免疫介在性の障害と結びつけられる抗原又はそれらの任意の組合せ;
b. 前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は前記対象の少なくとも1つの肝臓関連細胞;
c. 少なくとも1つのサイトカイン又は接着分子;及び
d. 上記(a)、(b)及び(c)のいずれかの組合せ;
のうちのいずれか1つの存在下でex vivo培養されてきたものである。
NK1.1T細胞は、サイトカイン分泌を介して抗炎症性及び炎症誘発性リンパ球の間のバランスを保つこと及び/又は殺傷することに関与している可能性があり、又、Tヘルパー細胞の分化の判定に関与する可能性もある[アラセ(Arase)、H.ら、Eur.J.Immunol.23:307〜310頁(1993年);ヨシモト(Yoshimoto)、T.ら、J.Exp.Med.179:1285〜1295頁(1994年);マクドナルド、H.R.ら、J.Exp.Med.182:633〜638頁(1995年);セダー(Seder)、R.A.ら、Annu.Rev.Immuno.12:635〜673頁(1994年);ヨシモト、T.ら、Science 270:1845〜1847頁(1995年)]。NK1.1T細胞活性化について多数のシグナリング経路が同定された。NK1.1+T細胞は安定した形で分極されず、異なるトリガーの時点で、TCR係合がこれらの細胞由来のTh1及びTh2の両方のサイトカインの分泌をトリガーする、と仮定されている。[ベンデラク、A.ら、Annu.Rev.Immunol.15:535〜562頁(1997年);アラセ、H.ら、J.Immunol.151:546頁(1993年);カワムラ、T.ら、J.Immunol.160:16〜19頁(1998年);チェン、H.ら、J.Immonol.159:2240〜2249頁(1997年);アラセ、H.ら、Eur.J.Immunol.23:307〜310頁(1998年);ヨシモト、T.J.Exp.Med.179:1285〜1295頁(1994年);マクドナルド、H.R.J.上掲書、(1995年)]。NK1.1R又はIL12R係合は、Th1分泌パラダイムを選択的に促進し得る[ベンデラク(Bendelac)、ら.(1997年)上掲書;アラセ、H.ら、J.Exp.Med.183:2391〜2396頁(1996年);ハヤカワ(Hayakawa)、T.ら、J.Exp.Med.176:269〜274頁(1992年)]。
a. 対象又はもう1つの対象からNKT細胞を得る工程;
b. 結果として得られた教育済みNKT細胞が、抗炎症性又は炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かって前記Th1/Th2細胞バランスを変調させる能力を有するような形で、工程(a)で得られたNKT細胞を、ex vivo教育する工程;及び
c. 工程(b)で得られた教育済みNKT細胞を前記対象に再導入する工程;
を含む。抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってのTh1/Th2バランスの変調は、結果としてIL4及びIL10のいずれか1つ対IFNγの定量比の増大をもたらす。炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってのTh1/Th2バランスの変調は、IL4及びIL10のいずれか1つの対IFNγの定量比の減少を結果としてもたらす。
a. 治療すべき免疫関連又は免疫介在性の障害に対して第3者エピトープと結びつけられる少なくとも1つの抗原又はそれらの任意の組合せ;
b. 同じ免疫障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は治療すべき対象の少なくとも1つの肝臓関連細胞又はそれらの任意の組合せ;
c. 少なくとも1つのサイトカイン、又は接着分子、又はその任意の組合せ;及び
d. 上記(a)、(b)及び(c)のいずれかの組合せ;
のうちのいずれか1つの存在下でこれらの細胞を培養することにより実施可能である。
a. 前記対象からNKT細胞を得る工程;
b. 結果としての教育済みNKT細胞が抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってTh1/Th2細胞バランスを変調させる能力を有するような形で、工程(a)で得られたNKT細胞をex vivo教育する工程;及び
c. 工程(b)で得られた教育済みNKT細胞を前記対象に再導入する工程;
を含む。抗炎症性サイトカイン産生細胞の産生に向かってのTh1/Th2バランスの変調は、結果としてIL4及びIL10のいずれか一方対IFNγの定量比の増加をもたらす。
a. クローン病と結びつけられる少なくとも1つの抗原;これらの抗原には、クローン病を患うドナーからの同種抗原、異種抗原、患者自身からの自家抗原及び組換えにより調製された抗原又はそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに制限されるわけではない;
b. クローン病を患う寛容化された又はされていない患者から又は治療を受ける患者からの少なくとも1つの肝臓関連細胞;これらの細胞には、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、肝臓関連幹細胞及び任意のその他の肝臓関連リンパ球又はそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに制限されるわけではない;
c. IL4、IL10、TGFβ、IFNγ、IL12及びIL15といった少なくとも1つのサイトカイン、又はインテグリン、セレクチン及びICAMといった接着分子又はそれらの任意の組合せ;及び
d. 上記(a)、(b)及び(c)の組合せ。
a. 治療すべき免疫関連又は免疫介在性の障害に対して第3者エピトープと結びつけられる少なくとも1つの抗原又はそれらの任意の組合せ;
b. 同じ免疫障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は治療すべき対象の少なくとも1つの肝臓関連細胞又はそれらの任意の組合せ;
c. 少なくとも1つのサイトカイン、又は接着分子、又はその任意の組合せ;及び
d. 上記(a)、(b)及び(c)のいずれかの組合せ。
a. 治療すべき免疫関連又は免疫介在性の障害と結びつけられる少なくとも1つの抗原;これらの抗原は、同じ免疫関連又は免疫介在性の障害を患うドナーからの同種抗原、異種抗原、治療を受ける患者からの自家抗原、及び組換えにより調製された抗原又はそれらの任意の組合せのうちのいずれか1つであり得る;
b. 前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は治療を受ける対象からの少なくとも1つの肝臓関連細胞;これらの細胞には、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、及び任意のその他の肝臓関連リンパ球又はそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに制限されるわけではない;
c. IL4、IL10、IGFβ、IFNγ、IL12及びIL15といった少なくとも1つのサイトカイン、又はインテグリン、セレクチン及びICAMといった接着分子;及び
d. 上記(a)、(b)及び(c)の組合せ。
a. 前記免疫関連又は免疫介在性の障害と結びつけられる少なくとも1つの抗原、又はその任意の組合せ;
b. 前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない患者の又は前記対象の少なくとも1つの肝臓関連細胞、又はその任意の組合せ;
c. 少なくとも1つのサイトカイン、又は接着分子;及び
d. 上記(a)、(b)及び(c)のいずれかの組合せ。
非アルコール系脂肪性肝炎(NASH)は、アルコール消費の履歴を全くもたない患者における肝脂肪蓄積、炎症及び線維形成から成る臨床病理学的疾患単位である。これは20%の症例で肝硬変まで進行することになり、西欧世界では特発性肝硬変の最も一般的な原因と考えられている(カルドウェル(Caldwell)SH、ら、Hepatology 29:664頁(1999年);マッテオーニ(Matteoni)CA、ら、Gastroenterology 116:1413頁(1999年))。NASHは該障害の病因における貢献的役割を果たすものとして示唆されているその他の代謝障害を患う患者に一般的である。これらの代謝障害としては、インシュリン耐性(サニアル(Sanyal)AJ、ら、Gastroenterology 120:1183頁(2001年)、肥満関係のATP枯渇(コルテス−ピント(Cortez−Pinto)H.ら、Jama 282:1659頁(1999年))、遊離脂肪酸ベータ過酸化の増大(ハーシュケヴィッツ(Hruszkewycz)AM、Biochem Biophys Res Commun 153:191頁(1988年))、鉄分蓄積(ジョージ(George)DK、ら、gastroenterology 114:311頁(1998年))、酸化防止剤枯渇(ハリソン(Harrison)SA.ら、gastroenterology 123:M1332頁(2002年))及びレプチン欠損症(コーエン(Cohen)、B.ら、Science 274:1185頁(1996年))が含まれる。それでも体重の低下、厳重な糖尿病制御、脂質レベルの正常化及び酸化防止剤治療を含めたいかなる治療的介入も全くなされない場合、該障害の自然な進行の改変を一貫して示したことがない(Angulo P.New England Journal of Medicine 346:1221〜1231頁(2002年))。
CD4及びCD8リンパ球は、IL−2を産生するTh1細胞、IFNγ、又はIL−4及びIL−10を産生するTh2細胞のいずれかとして分類される。免疫系は、応答の2つの亜型の間のバランスシフトによって外来性及び自己抗原に応答する[ウェイナー、H.L.ら、Immunol.Today 18:335〜343頁(1997年);アドリーニ、L.ら、Immunol.Today 18:209〜211頁(1997年)]。通常、Th1型の応答は、炎性誘発性反応[アドリーニ、L.ら、(1997年)上掲書;ミゾグチ、A.ら、J.Exp.Med.183−847〜856頁(1996年)]。をひき起こし、一方、IL10といった抗炎症性サイトカインは、抗炎症性Th2反応に向かってバランスをシフトさせ、かくして免疫介在性障害を緩和する[ミゾグチ、A.ら(1996年)上掲書;マドセン、K.L.ら、Gastroenterology 113:151〜159頁(1997年);ファン・デベンター・サンダー(Van Deventer Sander)、J.ら、Gastroenterology 113:383〜389頁(1997年)]。異なる内因性及び外因性刺激に応答して、NKT細胞は、Th1又はTh2経路のいずれかに向かっての免疫系の誘導において主たる役割を果たすと考えられている。
免疫系と脂肪組織代謝の調節は相互に密に連結していると思われる。脂肪組織内部の最高50パーセントの細胞は、数多くの免疫細胞を含めて非脂肪細胞から成る(モンタギュ(Montague)CT.ら、Diabetes 47:1384〜91頁(1998年))。大部分の研究が病的肥満の免疫学的結果に焦点をあてたものであった。肥満の動物及びヒトに存在するものとして知られる免疫学的改変には、DTHの減少及び分裂刺激されたリンパ球増殖応答(チャンドラ(Chandra)RK.ら、Acta Paediatr Scand 69:25〜30頁(1980年))、食細胞の数及び機能の低下(クリシュナン(Krishnan)EC.ら、J Surg Res 33:89〜97頁(1982年))、インシュリン誘発型リンパ球細胞毒性の減衰(コッフラー(Koffler)M.ら、Diabetes 40:364〜360頁(1991年))、及び特に減量試行中のCD4/CD8比の変化(フィールド(Field)CJ.ら、Am.J.Clin.Nutr.54:123〜129頁(1991年))が含まれる。
移植片対宿主病(GVHD)は、骨髄移植の成分にとっての主たる障害物である。GVHDは、幹細胞の移植(SCT)の後に発生する多臓器不全である[フェラーラ(Ferrara)JLM、デーク(Deeg)HJ.Graft versus host disease.New Eng J of Med 1991年;324:667〜72頁)]。病因には、組織破壊を結果としてもたらす同種反応性抗原の認識及びT細胞及びその他の免疫コンピテントエフェクタ細胞の活性化が関与する[ボーゲルサング(Vogelsang GB.Graft versust host disease:Implications from basic immunology for prophylaxis and treatment.Cancer Treat and Res 1997年;77:87〜97頁]。GVHDにおける肝臓の関与は、レシピエントの胆管に対する移植されたドナーのリンパ球による免疫攻撃の結果である。
材料と方法
動物
ハーラン(Harlan)から正常な近交系の生後2〜4ヵ月のC57BL雄マウスを得、ハダサ・ヘブライ(Hadassah−Hebrew)大学医学部の動物コア内に維持した。標準的研究室用食事でマウスを維持し、12時間の明暗サイクルに保った。
記述された通り、50%のエタノール100ml中に溶解させたマウス1匹あたり1mgのTNBSを直腸点滴注入により、TNBS−結腸炎を誘発した[コリンズ(Collins)C、ら、Eur.J.Immunol.26:3114〜3118頁(1996年)]。
TNBSで誘発した結腸炎のマウスから結腸をとり出し、小片にカットし、機械で均質化した。40mmのナイロン製セルストレーナを通してろ過した後、無傷の細胞をスピンダウンし、取出した。タンパク質検定キット(バイオラド(Biorad)、ドイツ、ミュンヘン)を用いて、タンパク質を定量化した。結腸炎抽出タンパク質(CEP)を、11日間隔日に給餌用無外傷性針を用いて(合計5用量)、以下に記述された実験グループに導入した。
以前に記述された通りに[カワムラ、T.ら、J.Immunol.160:16〜19頁(1998年)]、マウス抗マウスNK1.1モノクローナル抗原(セロテック(Serotec)、英国、オクスフォード)を用いて、NK1.1+細胞の枯渇を実施した。ドナーマウスからの脾細胞収獲より36時間前に一日50μgをマウスに腹腔内(IP)注射した。
全てのグループからのドナーマウスを、結腸炎の導入から14日目に屠殺し、脾臓から誘導したリンパ球の単一の懸濁液を記述通りに調製した[ウェイナー、H、ら、Annu.Rev.Immunol.12:809〜837頁(1994年)]。移植の前にPBS中に細胞を再懸濁させた。全てのグループからの脾臓リンパ球を実験未使用のレシピエントマウス内に移植し、ひき続き24時間後にTNBSで直腸に攻撃誘発した。
結腸炎について以下のパラメータを監視することにより、寛容誘発の効果を評価した。
研究全体を通して毎日下痢が続いた。
標準パラメータを用いて、結腸炎誘発から14日後に結腸査定を実施した[マドセン、K.L.ら、Gastroenterology 113:151〜159頁(1997年);トロップ、S.ら、Hepatology 27:746〜755頁(1999年)]。
炎症の組織学的評価のために、遠位結腸組織(最後の10cm)を取出し、10%のホルムアルデヒドで定着させた。各マウスからの5つのパラフィン切片を次に、標準技術を用いてヘマトキシリン−エオシンで染色した。結腸の顕微鏡断面上の炎症度を0から4まで半定量的に等級づけした(マドセンら、(1997年)上掲書;トロップら、Hepatology 27:746〜755頁(1999年)。等級0:炎症の兆候が全く無く正常、等級1:非常に低レベルの白血球浸潤;等級2:低レベルの白血球浸潤;及び等級3:高い血管密度を伴う高レベルの浸潤及び腸壁の肥厚;等級4:杯細胞の喪失を伴う貫壁性浸潤物、高い血管密度、壁肥厚及び正常な腸アーキテクチャの破断。等級づけは2人の経験豊かな盲検検査官により実施された。
肝臓及び脾臓リンパ球の単離
以前に記述された通りに脾細胞を単離し、赤血球を取り出した[ビカーリ(Vicari、A.P.ら、Immunology Today 17(2):71頁(1996年)]。幾分かの修正を加えて、以前に記述された通りに肝内リンパ球を研究の終りで全てのマウスグループから単離した[ビカーリら、(1996年)上掲書;Bleicher、P.A.ら、Science 250:679〜682頁(1990年)]。横隔膜より上で下大動脈をカットし、青くなるまで肝臓を低温PBS5mlで洗い流した。結合組織と胆のうを除去し、肝臓を10−ml入りの皿の中で低温無菌PBS内に置いた。肝臓と脾臓をステンレスメッシュを通してつぶした(サイズ60、シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)セントルイス、ミズーリ州)。3分間50ml入りの管の中に細胞懸濁液を入れ、低温PBS中(10分間1,250×rpm)で2回洗浄し、デブリを除去した。細胞をPBS中で再懸濁させ、細胞懸濁液を予めPBS中に浸漬したナイロンメッシュを通して入れ、未結合の細胞を収集した。細胞を45mlのPBS中で2回(室温で1,250×rpm)洗浄した。肝臓及び脾臓リンパ球の単離のために、50ml入り管内でPBS7ml中に懸濁させられた細胞の下に20mlのヒストパーク1077(シグマダイアグノスティクス(Sigma Diagnostics)セントルイス、ミズーリ州)をゆっくりと入れた。管を1,640rpmで室温にて15分間遠心分離した。界面にある細胞を収集し、50ml入りの管内に希釈し、氷冷PBSで2回洗浄した(10分間1,250rpm)。マウス1匹につきおよそ1×106個の細胞を回収した。トリパンブルー染色による生存可能性は、95%を上回っていた。脾細胞及び肝臓関連リンパ球の両方を、全実験グループ中の全ての動物から単離した。
リンパ球単離の直後に、10分間1%のBSA4mlでインキュベートしたFalcon2052管の中に2〜5×104個の細胞/500μlのPBSのトリプリケートを入れ、5分間1400rpmで遠心分離した。1:20のFITC−抗マウスNK1.1抗体(NKR−P1C、ファーミンゲン、米国)を伴う10μlのFCS中に細胞を再懸濁させ、30分間にわたり10分毎に混合した。細胞を1%のBSA中で2回洗浄し、読取るまで4℃内に保った。対照グループについては、5μlの1%BSAしか添加しなかった。螢光細胞分析分離装置(ファクスタープラス(FACSTAR plus)、ベクトンディッキンソン(Becton Dickinson))を用いて、各グループからの1×104個の細胞上で分析的細胞選別を実施した。生きた細胞だけを計数し、抗体処理されていないリンパ球からの背景螢光を、得られたレベルから演繹した。前方−側方散乱装置上でゲートにセットして、死んだ細胞及び赤血球を排除した。コンソート(Consort)30の2色輪郭プロットプログラム(ベクトン・ディキンソン、オクスナード、カリフォルニア州)又はセルクエスト(CELLQuest)プログラムを用いてデータを分析した。
脾細胞及び肝臓関連リンパ球を全てのグループ(A’〜F’)の中のマウスから収獲し、24ウエルの組織培養平板の中で培養した。トリプリケートを、全ての研究グループ内の各動物から調製し、12時間培養した。5%で37℃で12時間細胞からサイトカインが放出されるのを防ぐのに必要とされる2μMのモネンシン(バイオソース(Biosource)、カリフォルニア州)及びConA 2μg/mlを共に、RPMI1640 1mlあたり1×106個の脾細胞の割合でリンパ球を細胞皿の中で活性化させた。RPMI培地は、次のものを含有する:10%のFCS、200mMのHepes、100Uのペニシリン及び100Mgのストレプトマイシン/ml、10mMのHepes IL2−10U/ml、CEP−50Mg/ml。細胞はモネンシン2μM(バイオソース、カリフォルニア州)と共に、2.5×106個の脾細胞と0.5×106個のLALを含んでいた。上清流体を、ELISAによるサイトカイン測定のため両方のセットから収集し、記述された通り[コリンズ(Collins)、C.ら、Eur.J.Immunol.26:3114〜3118頁(1996年)]、フローサイトメトリによりリンパ球を分析した。
全てのウエルから細胞を収獲し、2重染色した。以下の抗体を用いて、以前に記述された通りに、CD4+T−細胞集団(Th1及びTh2細胞)を検出するための細胞外及び細胞内染色を使用した。すなわち、CD4+IL4+細胞の検出のためには、FITC接合された抗CD4及びPE接合された抗IL4mAbを使用した(ファーミンゲン(PharMingen)、サンディエゴ、カリフォルニア州)。CD4+IFNγ細胞の検出のためには、FITC接合された抗CD4及びPE接合された抗IFNγmAbを使用した(フィーミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア州)。全てはメーカーの指示事項に従って行なわれた(ICスクリーン、バイオソース細胞内染色キット、カリフォルニア州)。リンパ球をフローサイトメトリにより分析した。
これらの研究内で使用された標的細胞は、10%のFCSを伴う補足済みRPMIを利用することによって、組織培養内での連続的成長に適合されたリンパ腫細胞系であるYAC−1細胞であった。YAC−1細胞を、RPMI10%のFCSを伴う25ml入りフラスコ中で2×105細胞/mlの密度でそれらを播種し24時間後にこれらを収集することにより、NK検定用に調製した。細胞を50ml入り管内で懸濁させ収集し、10分間遠心分離(1250rpm)により培地で2回洗浄した。この手順により、51Crを用いて効果的な標識及びNK細胞による溶解の高感受性が保証された。標的細胞を51Cr(ニューライフサイエンス(New Life Science)、ボストンMA、ガミドール、イスラエル)で標識し、37℃で90分間インキュベートした(300μlのRPMI培地中2×106個の細胞あたり200mCi)。10分毎に細胞を手作業で混合した。インキュベーションの後、20%のFCS RPMI3mlを添加し、37℃で30分間再インキュベートした。RPMI10%FCS中で3回細胞を洗浄し、計数した。標識効率度を判定するために、100μlの細胞を計数し、最低0.6cpm/細胞を測定した。エフェクタ細胞は、上述のグループA−H由来の肝臓から単離された肝臓リンパ球であった。51Cr−放出検定をCostar 96ウエル平板内で実施した。100μl中の等級付けされた数のエフェクタ細胞を、100:1、50:1、及び10:1のエフェクタ対標的比(E:T比)で、100μl中5000個の標識された標的細胞と混合させた。各ウエルは、合計200μlの体積で標的及びエフェクタ細胞を収納していた。各試料からの各比率について、5つのウエルをテストした。自然放出の判定のためには、6ウエルの類似した数の標的細胞を100μlのRPMI10%FCSを用いて平板固定した。最大放出の判定のためには、100μlの培地中の6ウエルの標的細胞を100μlのトリトンXと混合した。平板を2分間遠心分離に付し(500rpm)その後37℃で5%のCO2内で4時間インキュベートした。平板を次に再び2分間(500rpm)遠心分離に付し、ガンマ計数器を用いて上清を収獲し計数した。結果は、細胞毒性%=検定の平均cpm−自然放出からのcpm/トリトンXで溶解させた標的からのcpm−自然放出からのcpm×100という等式を用いて計算される標的細胞の特異的溶解パーセントとして表現された。
両方のトリプリケートセットから上清流体を収集し、全ての寛容化された及びされていないグループからの全てのマウス、NK1.1枯渇したマウス及び枯渇していないウスについて、サイトカインレベルを測定した。メーカーの指示事項に従ってジェンザイムダイアグノスティクス(Genzyme Diagnostics)キット(ジェンザイムダイアグノスティクス、マサチューセッツ州、米国)を用いて「サンドイッチ」ELISAによりIL4、IL10、IL12及びIFNγレベルを測定した。寛容化された及びされていないNK1.1枯渇された及びされていないマウスからの5匹のマウスにおいて、結腸炎誘発から10日目に血清レベルを測定した。
リンパ球の単離及び分離
脾細胞を調製し、CD4+、CD8+、NK及び樹状細胞という4つのリンパ球サブセットへと分離した。磁気細胞選別(MACS)を用いて、細胞分離を行なった。各々のリンパ球サブセットについて特異的マイクロビーズを使用した。すなわちCD4及びCD8マイクロビーズ及び抗−NKビーズ[ミルテニルバイオテック(Miltenyl Biotec)、ドイツ]である。リンパ球単離の直後に、10分間1%のBSA4mlでインキュベートしたFalcon2052管の中に2〜5×104個の細胞/500μlのPBSのトリプリケートを入れ、5分間1400rpmで遠心分離した。1:20のFITC−抗マウスNK1.1抗体(NKR−PIC、ファーミンゲン、米国)を伴う10μlのFCS中に細胞を再懸濁させ、30分間にわたり10分毎に混合した。細胞を1%のBSA中で2回洗浄し、読取るまで4℃内に保った。対照グループについては、5μlの1%BSAしか添加しなかった。螢光細胞分析分離装置(ファクスタープラス、ベクトンディッキンソン)を用いて、各グループからの1×104個の細胞上で分析的細胞選別を実施した。生きた細胞だけを計数し、抗体処理されていないリンパ球からの背景螢光を、得られたレベルから演繹した。前方−側方散乱装置上にゲートをセットして、死んだ細胞及び赤血球を排除した。Consort30の2色輪郭プロットプログラム(ペクトン・ディキンソン、オクスナード、カリフォルニア州)又はセルクエストプログラムを用いてデータを分析した。
脾細胞を全てのグループの中のマウスから収獲し、24ウエルの組織培養平板の中で培養した。トリプリケートを、全ての研究グループ内の各動物から調製し、12時間培養した。上清流体を、ELISAによるサイトカイン測定のため両方のセットから収集した。
実験的結腸炎における寛容誘発の効果
実験的結腸炎における寛容誘発の効果を評価するために、各々20匹の動物から成る6つのマウスグループを研究した(表1)。直腸TNBS(グループA、B、D及びE)又は標準的食塩水(対照グループC及びF)を用いて研究一日目に全てのマウスを攻撃誘発した。全てのグループ中のマウスを、結腸炎誘発の日から始めて11日間隔日に給餌した(50μg/マウス)。グループB及びEは、結腸炎抽出タンパク質(CEP)での給餌を受けたマウスを含んでいた。グループA、C、D及びF内のマウスは、ウシ血清アルブミン(BSA、50μg/マウス)の給餌を受けた。全てのグループ中のマウスを、結腸炎誘発から14日目に屠殺した。グループD〜F内のマウスは、上述の通り、研究が終結する36時間前に抗NK1.1抗マウスモノクローナル抗体で処置した。グループA〜Cのマウスは、NK1.1枯渇されていなかった。
それぞれマウスCEPで給餌されるか又はNK1.1−枯渇されたグループB及びDからの寛容化されたマウスの中で、下痢の著しい減少が観察された。これとは対照的に、BSAで給餌されたか又はマウス−CEPで給餌されNK1.1で枯渇されたグループA及びEからのマウスは、重症の下痢に苦しんだ。マウスの体重の追跡調査は、グループA及びE中のマウスと比較してグループB及びD中の寛容化されたマウスの間で統計的に有意な体重の減少を明らかにした(それぞれ13.5%及び11.65%対3.2%及び4.8%、p<0.005)。
マウス抽出の結腸炎由来のタンパク質の給餌又はNK1.1−枯渇(グループB及びD)による経口寛容の誘発は、結腸炎の巨視的等級付けを有意に緩和した。結腸炎のテストされた巨視的パラメータについての評点は、結腸炎潰瘍形成の度合い、腸及び腹膜接着、壁厚み及び粘膜浮腫の度合い、であった。合計巨視的評点は、それぞれ、未処理対照及びCEP給餌NK1.1枯渇グループA及びEにおいて3.1±0.54及び3.05±0.67(p<0.005)であったのに比べ、グループB及びDのマウスではそれぞれ0.35±0.01及び0.63±0.03であった。
腸組織の組織学的評価は、グループA及びEの中の寛容化されていないマウスと比べて、グループB及びD内の寛容化されたか又はNK1.1枯渇されたマウスにおいて、炎症性応答及び粘膜潰瘍形成の著しい減少を示した。グループB及びD内のマウスでは、ほぼ正常な切片又は最小限のリンパ球浸潤しか検出されなかった。これとは対照的に、寛容化されていないマウスから取った腸標本の中には重症の炎症性反応(等級3〜4)が見られた。
NK1.1+リンパ球は、寛容化されたマウスにおいてCD4+IL4+/CD4+IFNγ+比を増大させ、実験的結腸炎を有する寛容化されていないマウスにおいてCD4+IL4+/CD4+IFNγ+比を減少させた
寛容化されたマウス
寛容化されたマウスにおけるNK1.1+リンパ球の効果を研究するため、全てのグループ内のマウスから脾細胞及び肝臓関連リンパ球(2.5×106個の脾細胞と0.5×106のLAL)を収獲し、CEP及びAPCの存在下で72時間培養した。フローサイトメトリ分析は、経口寛容誘発の後のNK1.1−枯渇が、NK1.1LAL枯渇されていない寛容化されたマウスと比べてCD4+IL4+/CD4+IFNγ+比を減少させた(それぞれグループE及びBにおいて0.99±0.03対1.8±0.35のCD4+IL4+/CD4+IFNγ+、p<0.005、図2)ということを示した。対照NK1.1−枯渇されたグループ(グループF)は、NK1.1枯渇されてないグループCに比べてCD4+IL4+/CD4+IFNγ+比の減少を明らかにした(それぞれグループC及びFについて2.13±0.36対1.6±0.29)。
寛容化されたグループとは対照的に、NK1.1−枯渇は、実験的結腸炎を有する寛容化されていないマウスに対し反対の効果を示した。CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比は、NK1.1枯渇も寛容化もされていないグループと比べて、NK1.1−枯渇された寛容化されていないグループ内で増大した(それぞれグループA及びDにおいて0.74±0.06対0.56±0.05)。
インビトロ感作の役割及び、実験的結腸炎を有する寛容化された及びされていないマウスにおけるCD4+IL4+/CD4+IFNγ+比に対する疾病−標的−抗原の効果
CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比に対する疾病標的抗原のインビトロ暴露の効果を評価するために、全てのグループ(表1に列挙)の中のマウスから、脾細胞及び肝臓関連リンパ球(2.5×106)の脾細胞及び(0.5×106)のLALを収獲し、ConAの存在下で及びCEP及びAPCの不在下で12時間培養した。抗原の不在下でNK1.1枯渇の効果の評価は、抗原の存在下で見い出されるものと類似であった。グループBの中の寛容化されたマウスから収獲されたリンパ球は、寛容化されたグループE内のNK1.1−枯渇されたマウスに比べて、有意に高いCD4+IL4+/CD4+IFNγ+比を明らかにした(それぞれ0.7±0.02対1.1±0.02、p<0.005)。これとは対照的に、NK1.1枯渇は、抗原の不在下でグループA及びDからの寛容化されていないマウスにおいてCD4+IL4+/CD4+IFNγ+比の増大を誘発した(それぞれ1.21±0.03対0.96±0.01、p<0.005、表2、図5)。これらの結果は、免疫教育がインビボで達成され、インビトロでの細胞−抗原インキュベーションに影響されなかったということを示唆する。
上清流体を、両方のトリプリケートセットから収集し、全ての寛容化された及びされていないグループからの全てのマウスについてサイトカインレベルを測定した。「サンドイッチ」ELISAによりIL4及びIFNγレベルを測定した。寛容化されたマウスは、Th1からTh2の免疫応答サイトカイン分泌のシフトを明示した。これらのマウス(グループB)はIL4レベルの増加及びIFNγレベルの減少を明示した。これとは対照的に、寛容化されていないグループ(グループA、E)からのマウスは、高いIFNγと低いIL4レベルを示した。グループB内の寛容化されたマウスから収獲したリンパ球は、寛容化されたグループE内のNK1.1枯渇されているマウスと比べて、有意に高いIL4及び低いIFNγレベルを明らかにした(それぞれ24.4±1.4及び14.1±0.4対22.6±0.7及び189.8±8.4、図6)。これとは対照的にNK1.1枯渇は、抗原の不在下でグループA及びDからの寛容化されていないマウスにおいてIFNγの増大及びIL4レベルの減少を誘発した(それぞれ128.3±3.7及び0.6±0.01対48.3±4.1及び19.1±0.4、図6)。NK1.1枯渇は、CEPの給餌を受けたグループではIL12レベルの増大を導く(475±23.3対145±5.7及びグループEについて、それぞれ、図7)が、CEPの給餌を受けていないグループ内では反対の効果を有していた(それぞれ、グループA及びDについて165±7.4及び74±3.3)。
実験的結腸炎における脾細胞の養子免疫伝達に対する寛容誘発の効果
実験的結腸炎モデルにおける寛容誘発の効果を評価するために、各々10匹の動物から成る6つのドナーマウスグループを研究した(表3に異なるグループが列挙されている)。TNBSでの直腸攻撃誘発により、グループGからJまでのマウスにおいて結腸炎を誘発した。グループK及びL内の対照マウスは、標準食塩水で攻撃誘発した。グループK及びL中の対照マウスは、標準食塩水で攻撃誘発した。全てのグループ内のマウスに、結腸炎誘発の日から開始して11日間隔日で50μg/マウスでの給餌を施した。グループI及びJは、結腸炎抽出タンパク質(CEP)での給餌を受けたマウスを含んでいた。グループG、H、K及びL内のマウスには、ウシ血清アルブミン(BSA50μg/マウス)を給餌した。脾細胞収獲の36時間前に、グループG、I及びKからのマウスにおいて、上述の通りNK1.1枯渇を実施した。全てのグループ内のマウスを、結腸炎誘発から14日後に屠殺した。
マウスCEPで給餌されたグループJ’からの寛容化されたマウスからの寛容化された細胞のレシピエント内、ならびにグループJの寛容化されたマウス内において、下痢の著しい減少が見られた。これとは対照的に、グループH’からの寛容化されていない脾細胞のレシピエント及びグループHからのBSAでの給餌を受けたマウスは、重症の下痢に苦しんだ。マウスの体重の追跡調査は、グループH及びH’中の寛容化されていないマウスと比較してグループJ及びJ’中の寛容化されたマウスの間で統計的に有意な体重の減少を明らかにした(それぞれ10.8%及び11.2%対5.7%及び5.5%、p<0.005)。
マウス抽出の結腸炎由来のタンパク質の給餌(グループJ)及び寛容化されたリンパ球の養子免疫伝達(グループJ’)による経口寛容の誘発は、結腸炎の巨視的等級付けを有意に緩和した。結腸炎のテストされた巨視的パラメータについての評点は、結腸炎潰瘍形成の度合い、腸及び腹膜接着、壁厚み及び粘膜浮腫の度合いであった。合計巨視的評点は、それぞれ、グループH及びH’の寛容化されていないマウスにおける3.22±0.15及び3.32±0.26に比べて、それぞれグループJ及びJ’において0.31±0.24及び0.3±0.25であった。グループGからのNK1.1枯渇されたマウス及びグループG’からのそのリンパ球のレシピエントは、疾病の緩和を明示した(それぞれ0.8±0.4及び0.85±0.5)。これとは対照的に、グループIからのNK1.1枯渇されたマウス及びそのリンパ球のレシピエント(グループI’)は、重症の結腸炎を明示した(それぞれ3.72±0.22及び3.77±0.6、p<0.005)。グループK’及びL’からのマウスは、重症の結腸炎の証拠を示した(それぞれ3.4±0.29及び3.27±0.22)。
腸組織の組織学的評価は、グループJ及びJ’の中の寛容化されたマウスにおいて、炎症性応答及び粘膜潰瘍形成の著しい減少を示し、組織学的評点は、それぞれ1.8及び1.7であった。これらのマウスにおいては、ほぼ正常な切片又は最小限のリンパ球浸潤しか検出されなかった。これとは対照的に、グループH及びH’内の寛容化されていないマウスから取った腸標本の中に重症の炎症性反応が見られ、組織学的評点は3.3及び3.08(それぞれグループH及びH’、p<0.005、図8)であった。グループG内の寛容化されていないNK1.1枯渇されたマウス及びその脾細胞のレシピエント(グループG’)において、炎症性反応及び粘膜潰瘍形成の著しい減少が検出された。グループG及びG’についての組織学的標点はそれぞれ2.08及び2であった。グループIからのNK1.1枯渇されたマウス及びそのリンパ球のレシピエント(グループI’)は、重症の結腸炎を明示した。グループI及びI’内のマウスについての評点はそれぞれ2.9及び2.5であった。グループK及びLは、TNBSでの直腸攻撃誘発を受けなかった。
NK1.1+リンパ球は、寛容化されたマウスにおいてCD4+IL4+/CD4+IFNγ+比を増大させ、実験的結腸炎を有する寛容化されていないマウスにおいてCD4+IL4+/CD4+IFNγ+比を減少させた
寛容化されたマウス
寛容化された及びされていないレシピエントマウスの間のCD4+IL4+/CD4+IFNγ+比の比較は、全ての寛容化されたグループにおいて高い比率を明らかにした。グループJ’からの寛容化されたレシピエントマウスは、グループH’内の寛容化されていないマウスと比較して有意に高い比率を示した。CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比はそれぞれ2.16と0.55であった(p<0.005)。
寛容化されていないリンパ球の養子免疫伝達は、レシピエントマウスにおいてCD4+IL4+/CD4+IFNγ+比を減少させた。寛容化されたグループとは対照的に、NK1.1枯渇は、実験的結腸炎を有する寛容化されていないマウスに対して反対の効果を有していた。フローサイトメトリ分析は、NK1.1枯渇された寛容化されていないドナーマウスからの脾細胞の養子免疫伝達が、寛容化されていないNK1.1枯渇されていないマウスからの脾細胞と比べてCD4+IL4+/CD4+IFNγ+比を増加させたことを示した(それぞれ、グループG’及びH’において1.7対0.55、p<0.005、図9及び表4)。図10は、寛容化されたNK1.1枯渇されていない及び枯渇されたドナーのレシピエントから、及び寛容化されていないNK1.1枯渇されていない及び枯渇されたドナーから(グループG’−J’)の単離済みリンパ球上のIL4及びIFNγの発現の代表的結果を示している。
フローサイトメトリ分析は、対照のNK1.1枯渇されているマウスからの脾細胞の養子免疫伝達が、NK1.1枯渇されていないドナーマウスに比べてCD4+IL4+/CD4+IFNγ+比を増加させることを示した(それぞれグループK’及びL’、1.13対0.69、p<0.005)。
NK1.1による肝臓リンパ球細胞毒性
これらの研究では、100:1、50:1溶解及び10:1のE:T比で標的細胞としてYAC−1細胞を使用した。NK1.1枯渇された及び枯渇されていない寛容化された及び寛容化されていないマウスのレシピエントから単離した肝臓リンパ球を用いて、研究を実施した。寛容化されずNK1.1枯渇されていないマウス(グループH’)からのレシピエントは、その他のグループ(12.37%の細胞毒性)に比べて溶解をほぼ全く示さなかった(100:1のE:T、図11)。グループG’内の寛容化されておらずNK1.1枯渇されたマウスからのレシピエントは、グループH’に比べ高い溶解を示した(それぞれ20.4%対12.37%の細胞毒性)。グループI’からのNK1.1枯渇されCEP給餌を受けたマウスからのレシピエントは、グループJ’内のNK1.1枯渇されていないマウスよりも低い溶解を示した(それぞれ42.58%対46.98%の細胞毒性)。対照グループからのレシピエントは、それぞれ、グループL’と比べてグループK’内のマウスについて、23.1%対22.47%の細胞毒性を有していた(p<0.005、図11)。
両方のトリプリケートセットから上清流体を収集し、全ての寛容化された及びされていないグループからの全てのマウスについてサイトカインレベルを測定した。「サンドイッチ」ELISAによってIL4、IL10及びIFNγレベルを測定した。寛容化されたマウスは、Th1からTh2までの免疫応答サイトカイン分泌のシフトを明示した。これらのマウス(グループH)は、IL4、IL10レベルの増加及びIFNγレベルの減少を明示した。これとは対照的に、寛容化されていないグループ(グループG、J、K)からのマウスは高いIFNγ及び低いIL10レベルを示した。グループH内の寛容化されたマウスから収獲したリンパ球は、寛容化されたグループK内のNK1.1枯渇されたマウスと比べて、有意に高いIL4、IL10及び低いIFNγレベルを明らかにした(それぞれ18.4±3.7、23.1±2.9及び5.1±0.4対2.9±0.6、0.8±0.1及び19.8±3.8、図12)。これとは対照的に、NK1.1枯渇は、抗原の不在下でグループG及びJからの寛容化されていないマウスにおいて、IFNγレベルの増加及びIL4、IL10レベルの減少を誘発した(それぞれ24.3±3.7、3.1±0.9及び4.6±0.4対18.3±1.1、3.2±0.1及び2.1±0.4、図12)。
NKTリンパ球のex vivo免疫プログラミング
先行する実施例で示されているように、マウス抽出された結腸炎由来のタンパク質の給餌による経口寛容の誘発は、寛容化されていないマウスと比べて、結腸炎の異なる症候(結腸炎の巨視的等級づけ、重症の下痢、炎症性応答及び粘膜潰瘍形成)を有意に緩和した。
1. 結腸炎無し及び処置(経口寛容化)無しの対照動物から収獲された細胞。これらの細胞を、BSAと共にex vivoでインキュベートした。
2. 結腸炎を有し処置(経口寛容化)無しの対照動物から収獲された細胞。これらの細胞を、BSAと共にex vivoでインキュベートした。
3. 結腸炎を有し経口寛容化を介した処置を受けた動物から収獲された細胞。細胞をBSAと共にインビトロでインキュベートした。
4. 結腸炎無し及び処置(経口寛容化)無しの対照動物から収獲された細胞。これらの細胞を、CEPと共にex vivoでインキュベートした。
5. 結腸炎を有し処置(経口寛容化)無しの対照動物から収獲された細胞。細胞を、CEPと共にex vivoでインキュベートした。
6. 結腸炎を有し経口寛容化を介した処置を受けた動物から収獲された細胞。細胞を、CEPと共にex vivoでインキュベートした。
材料と方法
動物
雌の免疫コンピテント(異型接合)胸膜欠損Balb/cマウスをジャクソンラボラトリ(Jackson Laboratories)バーハーバー、メイン州から購入した。全ての動物を滅菌したケージ内で層流フード内に保ち、照射済みの食料及び無菌酸性化水を与えた。動物実験を、Hebrew University−Hadassah Institutional Committee for Care and Use of Laboratory Animalsの指針及び委員会の承認に従って実施した。
可欠アミノ酸及び10%の熱不活性化済みウシ胎児血清で補足された培地の中で、単層としての培養で、ヒト肝臓癌細胞系Hep−3Bを分泌するHBsAgを成長させた。
胸膜欠損マウスを、亜致死線量照射(600cGy)で条件づけした。照射から24時間後に、マウスに、107個のヒト肝臓癌Hep3B細胞を右肩に皮下注射した。照射から3日後、ドナー免疫コンピテントマウスから脾細胞を収獲した。レシピエント胸膜欠損マウスには、1×107細胞/マウスの割合でドナー脾臓細胞を静脈内注射し、レシピエント内にコンピテントな免疫系を確立した。次に抗原パルスしたNKT細胞をマウスに注射した。
ドナー免疫コンピテントBalb/Cマウスから収獲した脾臓から、脾細胞を調製した。脾臓から結合組織を除去した後、脾臓を10ml入り皿の低温滅菌PBS中に入れ、ステンレス鋼メッシュ(サイズ60、シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州)を通して圧壊した。リンパ球の単離のためには、50ml入り管の中で、PBS7ml中に懸濁させられた細胞の下側に、ヒストパーク1077 20ml(シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州)を置いた。界面にある細胞を収集し、50ml入り管内で希釈し、氷冷PBSで2回洗浄した(10分間1250rpm)。約1×108個の細胞/マウスを回収した。特異的抗NKマイクロビーズ(ミルテニルバイオテク(Miltenyl Biotec)、ドイツ)と共に磁気細胞選択(MACS)を用いてNKT細胞分離を行なった。
腫瘍又はウイルス関連抗原でex vivoパルスすることでNKT細胞を教育した。0.5mlのPBS中の1×106個のNKT細胞をフラスコ中に設置し、72時間、HCC溶解物(3μg/ml)、Hep3B細胞又はウシ血清アルブミン(BSA)(1μg/ml)と共にインキュベートした。
免疫コンピテンスの回復後7日後に養子免疫伝達を実施した。これは、HCC溶解物、Hep3B細胞又はBSAに対しインビトロで暴露されたNKT細胞の静脈内注射によって実施された。
ex vivo教育済みNKTリンパ球の養子免疫伝達の効果を、以下のパラメータを監視することによって評価した。
6週間2週間隔でレシピエントマウスを追跡調査した。生存率、体重及び腫瘍体積(カリパスを用いて)を査定した。苦痛の徴候を示したマウス及び過度に体重低下(測定間で10%超又は初期体重の25%超)したマウスを屠殺した。
4週目の間、全てのグループ内のマウスから血液を採取し、14,000rpmで遠心分離した。ジェンザイムダイアグノステックスキッツ(Genzyme Diagnostics kits)(ジェンザイムダイアグノスティックス(Genzyme Diagnostics)、マサチューセッツ州、米国)を用いて「サンドイッチ」ELISAにより血清サイトカインレベルを測定した。
肝臓及び脾臓由来のリンパ球の単離を上述の通りに実施し、Falcon2052管の中に2×104細胞/500μlPBSのトリプリケートを置いた。細胞を、1:20のFITC抗マウスNK1.1抗体[NKR−P1C、ファーミンジェン(Pharmigen)、米国]を伴う10μlのウシ胎児血清(FCS)中に再懸濁させ、30分間10分毎に混合した。1%のBSA中で細胞を2回洗浄し、読取りまで4℃中に保った。螢光細胞分析分離装置(FACStarplus、ベクトンディッキンソン、カリフォルニア州)を用いて各グループからの1×104個の細胞について分析的細胞選別を実施した。生きた細胞のみを計数し、抗原処置されていないリンパ球からの背景螢光を、得られたレベルから差し引いた。データをコンソート(Consort)30、2色輪郭プロットプログラム(ベクトンディッキンソン、カリフォルニア州)で分析した。
STATタンパク質発現の判定のため、全てのグループ中のマウスから脾細胞を得た。モーター駆動式テフロン(登録商標)乳棒が備わったガラスホモジナイザを用いて0.25Mのスクロース/10mMのトリス−HCl、pH7.4中で組織ホモジェネート(200mg/ml)を調製した。SDS−ポリアクリルアミド(7.5%)ゲル上での電気泳動により、タンパク質(100μg/レーン)を分解し、ニトロセルロース膜に対し電気ブロットした。STATタンパク質を検出するために、異なるSTATタンパク質に導かれたポリクローナルウサギ抗マウス抗体そしてそれに続いてアルカリホスファターゼでカップリングされたヤギ抗ウサギIgG(ベッチルラボラトリーズ(Bethyl Lab.)、モンゴメリ、テキサス州)を用いて、膜をプローブ探査した。
ex vivo免疫変調済み調節NKTリンパ球の養子免疫伝達の効果
教育済みNKT細胞の養子免疫伝達のインビボ抗腫瘍効果を評価するために、各々10匹の動物から成る胸膜欠損Balb/Cマウスの4つのグループ(グループA−D)を研究した(表1)。全てのマウスを亜致死線量照射し、ヒトHep3BHCCを移植した。免疫コンピテントBalb/Cマウスから調製したNKT細胞を、HCC由来の抗原(HCC溶解物)、Hep3B細胞及びBSAを用いてex vivoでパルスした。その後、1×106個の教育済みNKT細胞を養子免疫伝達により各HCC包含マウスの体内に注射した。グループAは、HCC溶解物でパルスしたNKT細胞を受け;グループBは、Hep3B細胞でパルスしたNKT細胞を受け;グループCはBSAでパルスしたNKT細胞を受け;グループDはNKT移植を受けなかった。
HCC由来の抗原でパルスされたNKT細胞(グループA)の養子免疫伝達は、結果として、4週間以内で腫瘍を完全に消滅させ、体重減少を弱めた(6.5%)。これとは対照的に、グループB、グループC及びグループD内のマウスは、大きい壊死腫瘍及び重大な体重減少(グループB、グループC及びグループD内でそれぞれ21%、17%及び23%の体重減少、p<0.05)を発生させた;従って、生存率を査定することができなかった。
材料と方法
試薬
コンカナバリンAをウォーシントンバイオケミカル(Worthington Biochemical Corporation)、米国から購入した。
実験用プロトコルは、Animal studies commitee of the Jerusalem Hebrew University Medical Schoolにより承認された。ハーラン(Harlan)研究所から、生後10週間の雄レプチン欠乏C57BL/6Jマウス及びその脂肪の少ない同腹子(+/?)を購入した。ハダサ・ヘブライ大学医学部の動物コアで動物達を恒温で収納した。マウスを規則的な12時間の明暗サイクルに保ち、標準的なマウス食を給餌し、びんから水道水を入手することができた。隔日にマウスを計量し、食物摂取を記録した。実験の終了時に、イソフルラン麻酔下での頸部断頭によりマウスを屠殺した。
肝臓を関係するマウスから取り出し、小片にカットし、機械で均質化した。40mmのナイロン細胞ストレーナを通したろ過の後、無傷の細胞をスピンダウンし、取出した。タンパク質検定キット(バイオラド(Biorad)、ミュンヘン、ドイツ)を使用してタンパク質を定量し、30日間隔日に(合計15用量)、給餌用無外傷性針を用いて以下に記述する実験グループの体内に導入した。
自動型手順を用いて血清ALT及びAST血漿活性を測定した。ロッシュ(Roche)トリグリセリトGPO−RAP酵素試行キットを用いて、血清220cc血液試料を処理した。試料のトリグリセリドレベルを、550nmの波長を用いてCobas DP−25分光光度計で測定した。
グルコース寛容の測定のためには、マウスは、体重1キログラムあたり1グラムの量でグルコースの給餌を受けた。経口給餌の後、時点0でそして次に15分毎に合計3時間イソフルラン麻酔の下で尾から血液を採取した。エリート(Elite)グルコース試験片及びグルコメータでグルコースレベルを測定した。
以前に記述された通りに脾細胞を単離し、赤血球を取り出した[ビカーリ、A.P.ら、Immunology Today 17(2):71頁(1996年)]。幾分かの修正を加えて、以前に記述された通りに肝内リンパ球を研究の終りで全てのマウスグループから単離した[ビカーリら、(1996年)上掲書;ブライシャー、P.A.ら、Science 250:679〜682頁(1990年)]。横隔膜より上で下大動脈をカットし、青くなるまで肝臓を低温PBS5mlで洗い流した。結合組織と胆のうを除去し、肝臓を10ml入りの皿の中で低温無菌PBS内に置いた。肝臓と脾臓をステンレスメッシュを通してつぶした(サイズ60、シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州)。3分間50ml入りの管の中に細胞懸濁液を入れ、低温PBS中(10分間1,250×rpm)で2回洗浄し、デブリを除去した。細胞をPBS中で再懸濁させ、細胞懸濁液を予めPBS中に浸漬したナイロンメッシュを通して入れ、未結合の細胞を収集した。細胞を45mlのPBS中で2回(室温で1,250×rpm)洗浄した。肝臓及び脾臓リンパ球の単離のために、50ml入り管内でPBS7ml中に懸濁させられた細胞の下に20mlのヒストパーク1077(シグマダイアグノスティクス、セントルイス、ミズーリ州)をゆっくりと入れた。管を1,640rpmで室温にて15分間遠心分離した。界面にある細胞を収集し、50ml入りの管内に希釈し、氷冷PBSで2回洗浄した(10分間1,250rpm)。マウス1匹につきおよそ1×106個の細胞を回収した。トリパンブルー染色による生存可能性は、95%を上回っていた。脾細胞及び肝臓関連リンパ球の両方を、全実験グループ中の全ての動物から単離した。
関係するグループ全てのドナーマウスを養子免疫伝達実験の一日目に屠殺し、脾臓に由来するリンパ球の単一懸濁液を、記述されている通り[ウィナー、H.ら、Annu Rev Immunol 12:809〜837頁(1994年)]に調製した。移植の前にPBS中に細胞を再懸濁させた。全てのグループからの脾臓リンパ球を、先行する照射無しで、実験未使用のレシピエント内に移植した。
1. 血清サイトカイン:全ての寛容された及び寛容されないグループからの全てのマウスについて、サイトカインレベルを測定した。メーカーの指示事項に従って、ジェンザイムダイアグノステックスキッツ(ジェンザイムダイアグノスティックス、マサチューセッツ州、米国)を用いて「サンドイッチ」ELISAによりIFNγ、TGF−β、TNF、IL4、IL6及びIL10レベルを測定した。
2. 脾臓サイトカイン:上述の通り100万個/mlの脾細胞を収集した。その後、Elispot方法(ダイアクローンリサーチ(Diaclone Research)、米国)を用いて、IFNγ及びIL10レベルを計算した。
リンパ球単離の直後に、2〜5×104細胞/500μlPBSのトリプリケートを、Falcon2052管内に入れ、10分間1%のBSA4mlでインキュベートし、5分間1400rpmで遠心分離した。1:20のFITC−抗マウスNK1.1抗体(NKR−P1C、ファーミンジェン、米国)と共に10μlのFCS中で細胞を再懸濁させ、30分間10分毎に混合した。1%のBSA中で2回細胞を洗浄し、読取りまで4℃に保った。対照グループについては、5μlの1%BSAのみを添加した。螢光細胞分析分離装置(FACSTAR plus、ベクトンディッキンソン)を用いて各々のグループから1×104個の細胞について分析的細胞選別を実施した。生きた細胞のみを計数し、抗原処置されていないリンパ球からの背景螢光を、得られたレベルから差し引いた。ゲートを前方散乱及び側方散乱上にセットして、死滅細胞及び赤血球を排除した。データをコンソート30 2色輪郭プロットプログラム(ベクトンディッキンソン、オクスナード、カリフォルニア州)又はセルクエストプログラムで分析した。
ウエスタンブロット分析キットを用いてStat1、3、4、6レベルを推定した。
マウスの肝臓中の脂肪の査定/定量化のため、単一回の捕捉で、同相(in−phase)及び対向相(opposed−phase)画像を提供する2重エコー化学シフト勾配−エコー磁気共鳴映像法(MRI)シーケンスの技術を用いて、肝脂肪含有量を測定した。T1−加重対向相MRI技術は、組織内の脂肪の比較的小さな割合の検出に関し感度が高い。全てのMRIは、1.5−Tシステム(シグナ(Signa)LX;GE、ミルウウォーキ州、米国)で実施された。2重エコーMR映像法を、125msecの繰返し時間(TR)、4及び6.5msecの2重エコー時間(TEs)及び80°のフリップ角度で実施した。画像形成パラメータには、3mmの切片厚み、13cmの視野、256*160のマトリクス、そして膝コイルを用いて1つの信号の捕捉が含まれていた。交差点ギャップ無く切片厚み3mmで肝臓のレベルで横方向(軸方向)及び冠状画像が捕捉された。以前の報告書で記述されている通り[ミッチェル(Mitchell)DG ら、Invest.Radiol 26:1041〜1052頁(1991年);トモヒロ(Tomohiro)N.ら、Radiology 218:642〜646頁(2001年)]同相及び対向相の画像間のSI変化の信号強度(SI)測定の定量的査定を計算した。SIインデックスは、以下の式から計算した:SIインデックス=(SIip−Siop)/SIip、(式中、SIipは同相画像上のSIであり、SIopは、対向相画像上のSIである。SIインデックスは、同相画像上のSIと比較した対向相画像上のSI損失の分数を反映している。
各々のマウスについて、10%の緩衝ホルムアルデヒドの中で単一の肝臓セグメントを定着させ、組織学的分析のためパラフィン内に包埋した。切片(μm)を、ヘマトキシリン/エオシンで染色し、組織学的評点を実施した。
データは、平均±SEMとして表現されている。上述のパラメータに関する異なるグループ間の統計学的有意性は、対応のないスチューデントt検定を用いて計算された。0.05未満のp値は、統計的に有意な差を表わすものとみなされた。
グルコース寛容に対するNKT1.1リンパ球養子免疫伝達の効果
ob/obNASHモデル中で観察された代謝及び肝臓の機能の乱れにおけるNKT1.1リンパ球の役割を査定するために、表1に示されている通りに、マウスを5つのグループへと分割した。実験12日目に、上述のように全てのマウスグループ内で耐糖能試験を実施した。
肝脂肪含有量に対するNKT1.1リンパ球の養子免疫伝達効果
肝臓脂肪症のレベルに対するNKT1.1リンパ球の養子免疫伝達の効果を査定するために、実験の終りにおいて、全てのグループのマウス(表3参照)は腹部MRIを受け、肝脂肪含有量を上述の方法に従って推定し、SIインデックスとして提示した。
コンカナバリン−A肝炎に対する罹病性に対するNKT1.1リンパ球の養子免疫伝達の効果
Con−Aで誘発された肝炎に対するob/obマウスのこれまでに既知の耐性に対するNKT1.1リンパ球の役割を査定する目的で、全てのグループのマウス(表4)は、実験の12日目に、その尻尾の1本の静脈内に、合計体積を0.1ccとして発熱物質無しの食塩水の中に溶解された200μgのCon−Aの静脈内注射を受けた。24時間後、全てのマウスを屠殺し、血清トランスアミナーゼレベル及び肝臓炎症の組織学的度合を判定した。図4及び図3a及び3bに示されているように、グループD及びグループEのマウスは、Con−A攻撃誘発に応答したその基線レベルに比べて穏やかな肝臓トランスアミナーゼの上昇しか発生させなかった(AST、その基線レベルのそれぞれ1.48及び1.40倍、及びALT、その基線レベルのそれぞれ1.52及び1.79倍)。これとは対照的に、グループA及びBは、ConAに応答して、AST(その基線レベルの3.6及び2.44倍)及びALT(その基線レベルの5.2及び3.46倍)の両方において有意な上昇を発生させた。野生型脾細胞の移植を受けたグループCのマウスは、グループA及びグループBのものとグループDとグループEのものの中間で肝臓トランスアミナーゼの控めな上昇を特色としていた。この実験の結果は、NKTリンパ球の養子免疫伝達が、場合によってCon−A肝炎に関与するCD4リンパ球の活性化によって、ob/obマウスをよりCon−A肝炎にかかりやすいものにする可能性があるということを示唆している。
グルコース寛容に対する経口免疫調節(肝臓抽出物給餌による)の効果
NASHモデルのさまざまな代謝及び免疫学的成分に対する経口免疫調節の効果を評価するために、マウスを表5に記されているように各々14のマウスから成る6つのグループへと分割した。隔日に、各グループに、マウス1匹につき50μgのob/op肝臓抽出物、50μgの正規同腹子肝臓抽出物又は50μgのウシ血清アルブミンのいずれかを与えた。
肝脂肪含有量に対する肝臓抽出物給餌による経口免疫調節誘発の効果
肝脂肪含有量に対する経口免疫調節の効果を判定するために、6つのグループ全てのマウスに、実験59日目に腹部MRIを行った(表7)。肝脂肪含有量を、上述の方法を用いて判定し、SIインデックスとして記述した。3匹の野生型マウスは全て、ob/obマウスグループよりも有意に低い肝脂肪含有量を特色としてもち(全てのグループでp<0.001)、肝臓抽出物の給餌の効果は全く指摘されなかった(図2a)。野生型及びob/ob肝臓抽出物をそれぞれ受けたグループA及びグループBのマウスは、グループCのマウスに比べて肝脂肪含有量における有意な減少を示した(それぞれにp=0.03及びp=0.019)。図5a及び図5bにこれらの結果が示されている。
コンカナバリン−A肝炎への罹病性に対する肝臓抽出物給餌による経口免疫調節誘発の効果
野生型マウスとは対照的に、ob/ob(レプチン欠乏症の脂肪質のマウス)マウスは、以前、コンカナバリン−A誘発型肝炎に対するユニークな耐性を提示することが示されてきた。この耐性は、これらのマウスの体内のNKT1.1リンパ球集団内の定量的及び定性的改変から判定された。実験60日目に、Con−A肝炎への罹病性に対する肝臓抽出物給餌による経口免疫調節誘発の効果を判定するために、イソフルラン麻酔下で全てのマウスの眼窩後方神経叢から血液を採取し、血清トランスアミナーゼレベルを測定した。同じ日に、全てのマウスは、合計体積0.1ccとなるよう発熱物質を含まない食塩水の中で溶解させられた200μgのCon−Aをその尾部静脈中の静脈注射で受けた。24時間後に、全てのマウスを屠殺し、血清トランスアミナーゼレベル及び肝炎症の組織学的度合いを判定した。
B型肝炎ワクチン接種に対する応答
外部刺激に対する免疫学的T細胞媒介型応答に関してob/obマウスとその脂肪の少ない同腹子の間に存在する深遠な差異を確認するために、10匹のob/obマウスと10匹の脂肪の少ない同腹子をB型肝炎に対し免疫化した。実験1日目、14日目、21日目、25日目及び30日目に、全てのマウスに腹腔内で0.4μグラムのbio Hep Bワクチンを注射した。30日目に、全てのマウスを屠殺し、標準的な機器を用いて抗−HBS抗体力価を測定した。その脂肪の少ない同腹子に比べて、ob/obマウスは減衰された免疫応答を示し、有意に低い抗HBS抗体力価を特色としていた(p=0.027)。このことは表8及び図7に描かれている。このことは、ob/obマウスが深く損われたT細胞免疫応答を有するという、先行する実験からの印象の正当性を立証しており、このことは、ob/obマウス内での上述の代謝的及び免疫学的な現象の発生において主たる役割を果たす可能性がある。肝臓抽出物との経口寛容及びNKT細胞の養子免疫伝達がこの応答を矯正し得る。
材料と方法
GVHDにおけるNKT細胞の推定上の保護的役割を査定するために、NKT枯渇された脾細胞の移植を受けたマウスに対する増大する数のNKTリンパ球(0〜4.5×106細胞)の養子免疫伝達を実施した。レシピエントマウスを、GVHD関連の肝臓、腸及び皮膚の損傷の組織学的パラメータについて追跡調査した。NKT細胞媒介型免疫変調機序及び寛容誘発における肝臓の役割を判定するために、肝内及び脾臓内リンパ球を単離しFACSによりCD4+及びCD8+亜集団について分析し、血清サイトカインレベルを判定した。
ドナーマウスは、ジャクソンラボラトリーズ(Jackson Laboratories)(アンヌハーバー、メイン州)から得た生後12週間のC57BL/6の雄であった。レシピエントは(C57BL/6×Balb/c)F1の雌のマウスであった。マウスをハダッシュヘブライ大学医学部の動物コアにおいて12時間の明暗サイクル中に保った。全ての動物を、正規の実験室食で給餌し、不断吸水させた。全ての動物実験は、Hebrew−University−Hadassah Institutional Committee for the Care and Use of Laboratory Animalsにより承認された。照射及び脾細胞移植の後、マウスを層流アイソレータ内に維持した。
ドナーC57BLマウスから収獲した脾臓から、脾細胞を調製した。結合組織を除去した後、脾臓を10ml入り皿の低温滅菌PBS中に入れ、ステンレスメッシュ(サイズ60、シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州)を通して圧壊した。リンパ球の単離のためには、50ml入り管の中で、PBS7ml中に懸濁させられた細胞の下側に、ヒストパーク1077 20ml(シグマダイアグノスティックス、セントルイス、ミズーリ州)を置いた。界面にある細胞を収集し、50ml入り管内で希釈し、氷冷PBSで2回洗浄した(10分間1250rpm)。約1×108個の細胞/マウスを回収した。特異的抗DX5マイクロビーズ(ミルテニルバイオテク、ドイツ)と共に磁気細胞選択(MACS)を用いてNKT細胞分離を行なった。
GVHDを誘発するため、C57BL/6ドナーマウスからの2×107脾臓細胞を(C57BL/6×Balb/c)F1レシピエントマウス内に静脈内注射した。移植前にマウスに60Co全身照射(7Gy)を行った。
GVHDにおけるNKT細胞の推定上の保護的役割を査定するため、増大する数のNKTリンパ球の養子免疫伝達を実施した。グループAのマウスに全脾細胞を移植し、グループBのマウスにNKT枯渇された脾細胞を移植し、グループC、グループD及びグループEのマウスには、0.5、2.5及び4.5×106個のNKT細胞を添加したNKT枯渇脾細胞を移植した。グループFのマウスは脾細胞移植を受けなかった。
皮膚、肝臓及び腸の炎症の度合いを評価するために、組織を全てのグループ内のマウスから採取し、10%のホルムアルデヒド内に保つ。各マウスからの5つの組織切片をパラフィン内に包埋し、切片化し、標準的手順によりヘマトキシリン−エオシンで染色し、実験条件を知らない経験豊かな病理学者がこれを検査した。
リンパ球単離の直後に、Falcon2052管の中に2〜5×106個の細胞/500μλのPBSのトリプリケートを入れ、10分間1%のBSA4mlでインキュベートし、5分間1400rpmで遠心分離した。1:20のFITC−抗マウスCD4及びCD81抗体(ファーミンゲン、米国)を伴う10μlのFCS中に細胞を再懸濁させ、10分毎に30分間混合した。細胞を1%のBSA中で2回洗浄し、読取るまで4℃内に保った。螢光細胞分析分離装置(ファクスタープラス(FACSTAR plus、ベクトンディッキンソン)を用いて、各グループからの1×104個の細胞上で分析的細胞選別を実施した。生きた細胞だけを計数し、抗体処置されていないリンパ球からの背景螢光を、得られたレベルから差し引いた。前方−側方散乱装置上でゲートをセットして、死んだ細胞及び赤血球を排除した。コンソート30の2色輪郭プロットプログラム(ベクトン・ディキンソン、オクスナード、カリフォルニア州)又はセルクエスト25プログラムのいずれかを用いてデータを分析した。
全てのグループ内のマウスから血液を採取し、14,000rpmで遠心分離した。ジェンザイムダイアグノステックスキッツ(ジェンザイムダイアグノスティックス、マサチューセッツ州、米国)を用いて「サンドイッチ」ELISAにより血清IFNγ、TNFα、IL−10及びIL−12レベルを測定した。
スチューデントt検定(両側検定)により分析した。
実施例1
皮膚のGVHDの緩和
全てのグループからのマウス内で皮膚生検を実施した。GVHDにおける表皮は、基底細胞層の広汎性脈管化、海綿状態及び異常角化ケラチノサイト及び表皮下裂溝形成、急性GVHDの等級IIを特徴づける形態変化を示した。一部においては、表皮の局所性完全喪失を伴う表皮下裂溝形成が観察され、これは急性GVHDの等級III−IVと相容性あるものであった。NKT細胞の養子免疫伝達はこれらの変化を改善した。
小腸GVHDの緩和
小腸生検を、全てのグループからのマウスにおいて実施した。NKT細胞の移植を受けたマウスにおいて、全てのGVHD関係組織学パラメータの有意な減衰が観察された。対照においては、等級Iの急性GVHDの特徴であるアポトーシス体(単一細胞壊死)が、数多くの腺窩の中に見られた。一部の標本では、腸腺窩の中に壊死破片が存在し、これは等級IIの急性GVHDと相容性あるものであった。
GVHD関連肝臓病の改善
NKT細胞の移植を受けたマウスにおいて、穏やかな門脈炎症、リンパ球浸潤及び肝内胆管の断裂が指摘された。これとは対照的に、NKT枯渇されたマウスは、内皮炎が随伴する重症の非化膿性の胆管炎を発生させた。この内皮炎は、静脈内皮に対する損傷、リンパ球浸潤及び腐肉の形成として明らかであった。
GVHD関連死亡率に対するNKT細胞の養子免疫伝達の効果
4.5×106個のNKT細胞の養子免疫伝達は、生存率を有意に改善した(28日目で85%の生存率)。これとは対照的に、NKT細胞の枯渇は、高い死亡率を導いた(14日目で100%の死亡率)。移植されたNKT細胞の数との直接的相関が指摘された(4.5×106個のNKT細胞の移植で最大の効果)。これらの結果は図8に示されている。
末梢寛容誘発としての肝内CD8リンパ球トラッピングに対するNKT細胞の養子免疫伝達の効果
寛容誘発は、NKT細胞枯渇されたマウス(p<0.05)と比べた4.5×106個のNKT細胞の移植を受けたマウスにおける肝内CD4/CD8比の16分の1減少と同時の末梢CD4/CD8比の2.26倍増加によって明示されるCD8リンパ球の肝内トラッピングと結びつけられた。これらの結果は図9及び図10の中に示されている。
血清サイトカインに対するNKT細胞の養子免疫伝達の効果
血清IL−12レベルは、NKT細胞枯渇された動物(p<0.05)と比べて、4.5×106個のNKT細胞の移植を受けた寛容化されたマウスにおいて、有意に低く(52pg/ml対735pg/ml)、血清IL−10レベルは有意に高い(112pg/ml対50pg/ml)ものであった。グループ間の血清IFNγ及びTNFαレベルの有意な差異は全く存在しなかった。これらの結果は図11及び図12で描かれている。
4.5×106個のNKT細胞の養子免疫伝達は、GVHDに関係する肝臓、腸及び皮膚の傷害を有意に緩和した。これとは対照的に、NKT細胞の枯渇は、重症のGVHD関連多器官傷害を導いた。
Claims (140)
- 治療を必要とする哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、前記対象におけるNKT細胞集団を操作する方法であり、
前記NKT細胞集団の操作が、炎症性応答に向かってTh1/Th2細胞バランスの変調をもたらし、前記変調は、前記対象又はもう1つの対象における異なる構成要素、細胞、組織又は器官によって媒介される、治療方法。 - 治療を必要とする哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、前記対象におけるNKT細胞集団を操作する方法であり、
前記NKT細胞集団の操作が、抗炎症性又は炎性誘発性応答に向かってTh1/Th2細胞バランスの変調をもたらし、前記変調は、前記対象又はもう1つの対象の免疫系における異なる構成要素、細胞、組織又は器官によって媒介される、治療方法。 - 治療を必要とする哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、前記対象におけるNKT細胞集団を操作する方法であり、
前記NKT細胞集団の操作が、抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってTh1/Th2細胞バランスの変調をもたらし、前記変調は、前記対象又はもう1つの対象の免疫系の異なる構成要素、細胞、組織又は器官によって媒介されている、治療方法。 - 前記構成要素が細胞免疫反応要素、体液性免疫反応要素及びサイトカインを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記操作が、前記NKT細胞集団を枯渇させることにより実施される、請求項3に記載の方法。
- a.前記対象又はもう1つの対象からNKT細胞を得る工程;
b.結果として得られる教育済みNKT細胞が、抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってTh1/Th2細胞バランスを変調させ得るような形で、工程(a)で得られたNKT細胞を、ex vivo教育する工程;及び
c.抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってTh1/Th2細胞バランスを変調させ得る工程(b)で得られた教育済みNKT細胞を前記対象に再導入し、結果としてIL4及びIL10のいずれか1つとIFNγとの定量比の増大をもたらす工程;
を含む、請求項3に記載の哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法。 - a.治療すべき前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患に関連する抗原又はエピトープ、免疫介在性炎症性応答に関連する抗原、又はエピトープ、又はそれらの任意の組合せ;
b.前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない対象の、又は前記対象の、少なくとも1つの肝臓関連細胞;
c.少なくとも1つのサイトカイン、又は接着分子、又はそれの任意の組合せ;及び
d.(a)、(b)及び(c)の任意の組合せ;
のうちのいずれか1つの存在下で前記NKT細胞を培養することにより工程(b)の前記ex vivo教育が実施される、請求項6に記載の方法。 - 前記ex vivo教育が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患に関連する抗原の存在下で前記NKT細胞を培養することによって実施される、請求項7に記載の方法。
- 前記抗原が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患うドナーから得た同種抗原、異種抗原、同系抗原、自家抗原、非自家抗原、組換えにより調製された抗原、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記肝臓関連細胞が、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、肝臓関連幹細胞、アポリポタンパク質、又は任意のその他の肝臓関連リンパ球を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記サイトカインがIL4、IL10、TGFβ、IFNγ、IL12、IL2、IL18又はIL15を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記接着分子がインテグリン、セレクチン又はICAMを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記教育済みNKT細胞が、養子免疫伝達により前記対象に再導入される、請求項6に記載の方法。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う任意の同種ドナー、異種供給源、同系供給源、自家供給源、非自家供給源、免疫学的に機能的な等価物、又はそれらの任意の組合せに由来する構成要素、細胞、組織、及び/又は器官を前記対象に投与することによって、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の免疫変調を前記対象の体内で惹起する工程をさらに含む、請求項6又は7に記載の方法。
- 前記構成要素、細胞、組織又は器官が経口投与される、請求項14に記載の方法。
- 治療を必要とする哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、
経口寛容化によって免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患に対する免疫応答のアップ又はダウンレギュレーションを前記対象の体内で惹起する、治療方法。 - 治療を必要とする哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、
経口寛容誘発又は経口免疫調節を介して免疫変調する、治療方法。 - 経口寛容誘発又は経口免疫調節を介する前記免疫変調には、肝臓抽出物の経口投与が関与する、請求項17に記載の方法。
- 前記投与方法には、経口、静脈内、非経口、経皮、皮下、膣内、腹腔内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所又は直腸投与、又はそれらの任意の組合せが含まれる、請求項14に記載の方法。
- 経口寛容誘発又は経口免疫調節を介する前記免疫変調には、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う任意の同種ドナー、異種供給源、同系供給源、自家供給源、非自家供給源、免疫学的に機能的な等価物又はそれらの任意の組合せに由来する構成要素、細胞、組織、及び/又は器官を含む材料の経口投与が関与する、請求項17に記載の方法。
- 経口寛容化、経口寛容誘発又は経口免疫調節による前記障害又は疾患に対する免疫応答のアップ又はダウンレギュレーションを前記対象の体内で惹起することをさらに含む、請求項6又は7に記載の方法。
- 経口寛容誘発又は経口免疫調節を介する免疫変調をさらに含む、請求項6又は7に記載の方法。
- 治療を必要とする哺乳類の対象における、骨粗鬆症、多発性硬化症、SLE、関節リウマチ、JRA、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ITP、PA、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患(糖尿病を含まない)、脈管炎、強皮症、CREST、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、経口寛容誘発又は経口免疫調節を介して免疫変調する方法であり、
Th1/Th2バランスがTh2、即ち抗炎症性応答に向かってシフトし、その結果CD4+IL4+IL10+/CD4+IFNγ比が増大する、治療方法。 - 治療を必要とする哺乳類の対象における、骨粗鬆症、多発性硬化症、SLE、関節リウマチ、JRA、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ITP、PA、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患(糖尿病を含まない)、脈管炎、強皮症、CREST、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、NKT細胞を変調する方法であり、
Th1/Th2バランスがTh2、即ち抗炎症性応答に向かってシフトし、その結果CD4+IL4+IL10+/CD4+IFNγ比が増大する、治療方法。 - 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、SLE、関節リウマチ、JRA、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ITP、PA、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患(糖尿病を含まず)、脈管炎、強皮症、CREST、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳類の対象がヒトの患者である、請求項25〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NKT細胞が、CD56マーカーを発現しているNKT細胞である、請求項6又は7に記載の方法。
- 哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための治療用組成物であって、
前記組成物は、Th1/Th2細胞バランスを抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かって変調させる能力をもつex vivo教育済みの異種、同系、自家又は非自家NKT細胞を有効成分として含み、さらに薬学的に受容可能な担体、希釈剤、賦形剤及び/又は添加剤を任意に含む、治療用組成物。 - 前記教育済みNKT細胞がIL4及びIL10のうちのいずれか1つ対IFNγの定量比の増大を媒介する、請求項33に記載の治療用組成物。
- 前記教育済みNKT細胞が、
a.治療すべき前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患と関連する抗原又はエピトープ、免疫介在性炎症性応答に関連する抗原、又はエピトープ、又はそれらの任意の組合せ;
b.前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない対象の、又は前記対象の、少なくとも1つの肝臓関連細胞;
c.少なくとも1つのサイトカイン、又は接着分子、又はそれの任意の組合せ;及び
d.(a)、(b)及び(c)の任意の組合せ;
のうちのいずれか1つの存在下でex vivo培養することにより得られる、請求項34に記載の治療用組成物。 - 前記教育済みNKT細胞が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害に関連する抗原の存在下でex vivo培養することによって得られる、請求項35に記載の治療用組成物。
- 前記抗原が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患うドナーから得た同種抗原、異種抗原、同系抗原、自家抗原、非自家抗原、組換えにより調製された抗原、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項36に記載の治療用組成物。
- 前記肝臓関連細胞が、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、及び任意のその他の肝臓関連リンパ球を含む、請求項35に記載の治療用組成物。
- 前記サイトカインがIL4、IL10、TGFβ、IFNγ、IL2、IL18、IL12又はIL15を含む、請求項35に記載の治療用組成物。
- 前記接着分子がインテグリン、セレクチン又はICAMを含む、請求項35に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項33〜40のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項33〜40のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項33〜40のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項33〜40のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項33〜40のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、SLE、関節リウマチ、JRA、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ITP、PA、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患(糖尿病を含まず)、脈管炎、強皮症、CREST、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項33〜40のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う哺乳類の対象の体内で抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってTh1/Th2細胞バランスを変調させるための治療用組成物の製造における、教育済み自家、異種、同系又は非自家NKT細胞の使用。
- 哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための治療用組成物の製造における教育済み自家、異種、同系又は非自家NKT細胞の使用であって、該教育済みNKT細胞はTh1/Th2細胞バランスを抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かって変調させる、使用。
- 前記教育済みNKT細胞が、IL4及びIL10のいずれか1つ対IFNγの定量比の増大を媒介する、請求項47又は48に記載の使用。
- 前記組成物の教育済みNKT細胞が、免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う哺乳類の対象においてTh1/TH2細胞バランスを抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かって変調させ、前記NKT細胞が、IL4及びIL10のうちのいずれか1つ対IFNγの定量比の増大を媒介する、請求項33〜40のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 前記組成物の教育済みNKT細胞がTh1/Th2細胞バランスを抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かって変調させる、哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための請求項33〜40のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 治療を必要とする哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療において使用するためのex vivo教育済み自家、同系、異系又は非自家NKT細胞。
- 前記教育済みNKT細胞が、
a.治療すべき前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患と関連する抗原又はエピトープ、免疫介在性炎症性応答に関連する抗原、又はエピトープ、又はそれらの任意の組合せ;
b.前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない対象の、又は前記対象の、少なくとも1つの肝臓関連細胞;
c.少なくとも1つのサイトカイン、又は接着分子、又はそれの任意の組合せ;及び
d.(a)、(b)及び(c)の任意の組合せ;
のうちのいずれか1つの存在下でex vivo培養されている、請求項52に記載の教育済みNKT細胞。 - 前記抗原が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患うドナーの同種抗原、異種抗原、同系抗原、自家抗原、非自家抗原、組換えにより調製された抗原、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項53に記載の教育済みNKT細胞。
- 前記肝臓関連細胞が、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、又は任意のその他の肝臓関連リンパ球を含む、請求項53に記載の教育済みNKT細胞。
- 前記サイトカインがIL4、IL10、TGFβ、IFNγ、IL2、IL18、IL12又はIL15を含む、請求項53に記載の教育済みNKT細胞。
- 前記接着分子がインテグリン、セレクチン又はICAMを含む、請求項53に記載の教育済みNKT細胞。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項52〜57のいずれか1項に記載の教育済みNKT細胞。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項52〜57のいずれか1項に記載の教育済みNKT細胞。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項52〜57のいずれか1項に記載の教育済みNKT細胞。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項52〜57のいずれか1項に記載の教育済みNKT細胞。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項52〜57のいずれか1項に記載の教育済みNKT細胞。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、SLE、関節リウマチ、JRA、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ITP、PA、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患(糖尿病を含まず)、脈管炎、強皮症、CREST、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項52〜57のいずれか1項に記載の教育済みNKT細胞。
- 治療を必要とする哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療における、ex vivo教育済みの自家、同系、異種又は非自家NKT細胞の使用。
- 前記教育済みNKT細胞が、請求項53〜57のいずれか1項に記載の通りである、請求項64に記載の使用。
- NKT細胞を特異的に認識する抗体を有効成分として含む、免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項66に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項66に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項66に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項66に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項66に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、SLE、関節リウマチ、JRA、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ITP、PA、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患(糖尿病を含まず)、脈管炎、強皮症、CREST、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項66の治療用組成物。
- 免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う哺乳類の対象においてNKT細胞集団の操作をするための治療用組成物の製造における、NKT細胞を特異的に認識する抗体の使用。
- 前記操作が、前記NKT細胞集団の枯渇である、請求項73に記載の使用。
- 前記NKT細胞集団の枯渇が、結果として抗炎症性サイトカイン産生細胞に向かってTh1/Th2細胞バランスを変調させることになる、請求項74に記載の使用。
- 哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための治療用組成物の製造における、NKT細胞を特異的に認識する抗体の使用。
- 前記免疫関連の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項73〜76のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫関連の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項73〜76のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項73〜76のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項73〜76のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項73〜76のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、SLE、関節リウマチ、JRA、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ITP、PA、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患(糖尿病を含まず)、脈管炎、強皮症、CREST、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項73〜76のいずれか1項に記載の使用。
- 治療を必要とする哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害の治療方法であって、前記対象におけるNKT細胞集団を操作する方法であり、
前記NKT細胞集団の操作が、炎性誘発性サイトカイン産生細胞に向かってTh1/Th2細胞バランスの変調をもたらし、前記変調は、前記対象又はもう1つの対象における免疫系の異なる構成要素、細胞、組織又は器官によって媒介されている、治療方法。 - 前記構成要素が細胞免疫反応要素、体液性免疫反応要素及びサイトカインを含む、請求項83に記載の方法。
- 前記操作が、前記NKT細胞集団の枯渇により実施される、請求項83に記載の方法。
- a.前記対象又はもう1つの対象からNKT細胞を得る工程;
b.結果として得られる教育済みNKT細胞が、炎性誘発性サイトカイン産生細胞に向かってTh1/Th2細胞バランスを変調させ得るような形で、工程(a)で得られた前記NKT細胞を、ex vivo教育する工程;及び
c.炎性誘発性サイトカイン産生細胞に向かってTh1/Th2細胞バランスを変調させ得る工程(b)で得られた教育済みNKT細胞を前記対象に再導入し、結果としてIL4及びIL10のいずれか1つ対IFNγの定量比の減少をもたらす工程;
を含む、請求項83に記載の哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害の治療方法。 - a.治療すべき免疫関連又は免疫介在性の障害に関連する抗原又はエピトープ、免疫介在性炎症性応答と結びつけられる抗原又はエピトープ、又はそれらの任意の組合せ;
b.前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う寛容化された又はされていない対象の、又は前記対象の少なくとも1つの肝臓関連細胞;
c.少なくとも1つのサイトカイン、又は接着分子、又はその任意の組合せ;及び
d.(a)、(b)及び(c)のいずれかの組合せ;
のうちのいずれか1つの存在下で前記NKT細胞を培養することにより工程(b)のex vivo教育が実施される、請求項86に記載の方法。 - 前記ex vivo教育が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害に関連する抗原の存在下で前記NKT細胞を培養することによって実施される、請求項87に記載の方法。
- 前記抗原が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患うドナー対象から得た同種抗原、異種抗原、自家抗原又は組換えにより調製された抗原、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項88に記載の方法。
- 前記肝臓関連細胞が、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、肝臓関連幹細胞及び任意のその他の肝臓関連リンパ球から成る群から選択されている、請求項85に記載の方法。
- 前記サイトカインがIL4、IL10、TGFβ、IFNγ、IL12、IL2、IL18又はIL15を含む、請求項87に記載の方法。
- 前記接着分子がインテグリン、セレクチン又はICAMを含む、請求項87に記載の方法。
- 前記教育済みNKT細胞が、養子免疫伝達により前記対象に再導入される、請求項86に記載の方法。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害を患う任意の同種ドナー、異種供給源、自家供給源又は免疫学的に機能的な等価物又はそれらの任意の組合せに由来する構成要素、細胞、組織、及び/又は器官を前記対象に投与することによって、免疫関連又は免疫介在性の障害の免疫変調を前記対象の体内で惹起する工程をさらに含む、請求項86又は87に記載の方法。
- 前記構成要素、細胞、組織又は器官が経口投与される、請求項94に記載の方法。
- 経口寛容化による免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患に対する免疫応答のアップ又はダウンレギュレーションを哺乳類の対象の体内で惹起することにより、かかる治療を必要としている哺乳類の対象において免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を治療するための方法。
- 経口寛容誘発又は経口免疫調節を通した免疫変調により、かかる治療を必要としている哺乳類の対象の体内で免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を治療するための方法。
- 経口寛容誘発又は経口免疫調節を通した前記免疫変調には、肝臓抽出物の経口投与が関与している、請求項97に記載の方法。
- 前記投与方法には、経口、静脈内、非経口、経皮、皮下、膣内、腹腔内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所又は直腸投与、又はそれらの任意の組合せが含まれる、請求項94に記載の方法。
- 経口寛容誘発又は経口免疫調節を通した前記免疫変調には、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う任意の同種ドナー、異種供給源、同系供給源、自家供給源、非自家供給源、免疫学的に機能的な等価物、又はそれらの任意の組合せに由来する構成要素、細胞、組織、及び/又は器官を含む材料の経口投与が関与する、請求項97に記載の方法。
- 経口寛容化、経口寛容誘発又は経口免疫調節による前記障害又は疾患に対する免疫応答のアップ又はダウンレギュレーションを前記対象の体内で惹起することをさらに含む、請求項86又は87に記載の方法。
- 経口寛容誘発又は経口免疫調節を介した免疫変調をさらに含む、請求項86又は87に記載の方法。
- 治療必要とする哺乳類の対象における、骨粗鬆症、多発性硬化症、SLE、関節リウマチ、JRA、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ITP、PA、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患(糖尿病を含まない)、脈管炎、強皮症、CREST、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、経口寛容誘発又は経口免疫調節を介して免疫変調にする方法であり、
Th1/Th2バランスがTh1、即ち炎症誘発性応答に向かってシフトし、その結果CD4+IL4+IL10+/CD4+IFNγ比が減少する、方法。 - 治療を必要とする哺乳類の対象における、骨粗鬆症、多発性硬化症、SLE、関節リウマチ、JRA、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ITP、PA、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患(糖尿病を含まず)、脈管炎、強皮症、CREST、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療方法であって、NKT細胞を変調する方法であり、
Th1/Th2バランスがTh1、即ち炎性誘発性応答に向かってシフトし、その結果CD4+IL4+IL10+/CD4+IFNγ比が減少することになる、方法。 - 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項83〜104のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項83〜104のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項83〜104のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項83〜104のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項83〜104のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、SLE、関節リウマチ、JRA、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ITP、PA、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患(糖尿病を含まず)、脈管炎、強皮症、CREST、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項83〜104のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳類の対象がヒトの患者である、請求項105〜110のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NKT細胞が、CD56マーカーを発現しているNKT細胞である、請求項86又は87に記載の方法。
- 哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための治療用組成物であって、
前記組成物は、Th1/Th2細胞バランスを炎性誘発性サイトカイン産生細胞に向かって変調させる能力をもつex vivo教育済みの異種、同系、自家又は非自家NKT細胞を有効成分として含み、さらに薬学的に受容可能な担体、希釈剤、賦形剤及び/又は添加剤を任意に含む、治療用組成物。 - 前記教育済みNKT細胞がIL4及びIL10のうちのいずれか1つ対IFNγの定量比の減少を媒介する、請求項113に記載の治療用組成物。
- a.治療すべき前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患と関連する抗原又はエピトープ、免疫介在性炎症性応答に関連する抗原、又はエピトープ、又はそれらの任意の組合せ;
b.前記障害又は疾患を患う寛容化された又はされていない患者の又は前記対象の少なくとも1つの肝臓関連細胞;
c.少なくとも1つのサイトカイン、又は接着分子、又はその任意の組合せ;及び
d.上記(a)、(b)及び(c)のいずれかの組合せ;
のうちのいずれか1つの存在下でex vivo培養することにより前記教育済みNKT細胞が得られる、請求項114に記載の治療用組成物。 - 前記教育済みNKT細胞が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害と結びつけられる抗原の存在下でex vivo培養することによって得られる、請求項115に記載の治療用組成物。
- 前記抗原が、前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患うドナーからの同種抗原、異種抗原、同系抗原、自家抗原、非自家抗原、組換えにより調製された抗原、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項116に記載の治療用組成物。
- 前記肝臓関連細胞が、クッパー細胞、星細胞、肝臓内皮細胞、及び任意のその他の肝臓関連リンパ球を含む、請求項115に記載の治療用組成物。
- 前記サイトカインがIL4、IL10、TGFβ、IFNγ、IL2、IL18、IL12又はIL15を含む、請求項115に記載の治療用組成物。
- 前記接着分子がインテグリン、セレクチン又はICAMを含む、請求項115に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項113〜120のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項113〜120のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項113〜120のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項113〜120のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項113〜120のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、SLE、関節リウマチ、JRA、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ITP、PA、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患(糖尿病を含まず)、脈管炎、強皮症、CREST、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項113〜120のいずれか1項に記載の治療用組成物。
- 免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う哺乳類の対象において、炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってTh1/Th2細胞バランスを変調させるための治療用組成物の製造における、教育済み自家、異種、同系又は非自家NKT細胞の使用。
- 哺乳類の対象の免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための治療用組成物の製造における教育済み自家、異種、同系又は非自家NKT細胞の使用であって、該教育済みNKT細胞がTh1/Th2細胞バランスを炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かって変調させる、使用。
- 前記教育済みNKT細胞が、IL4及びIL10のいずれか1つ対IFNγの定量比の増大を媒介する、請求項127又は128に記載の使用。
- 前記組成物の教育済みNKT細胞が、免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う哺乳類の対象において炎性誘発性サイトカイン産生細胞に向かってTh1/TH2細胞バランスを変調させ、前記NKT細胞が、IL4及びIL10のうちのいずれか1つ対IFNγの定量比の減少を媒介する、請求項127または128に記載の治療用組成物。
- 前記組成物の教育済みNKT細胞が炎症誘発性サイトカイン産生細胞に向かってTh1/Th2細胞バランスを変調させる、哺乳類の対象における免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患の治療のための請求項127または128に記載の治療用組成物。
- 免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患を患う哺乳類の対象のNKT細胞集団の操作のための治療用組成物の製造における、NKT細胞を特異的に認識する抗体の使用。
- 前記操作が、前記NKT細胞集団の枯渇である、請求項132に記載の使用。
- 前記NKT細胞集団の枯渇が、結果として炎性誘発性サイトカイン産生細胞に向かってTh1/Th2細胞バランスを変調させることになる、請求項133に記載の使用。
- 前記免疫関連の障害又は疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項132〜134のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫関連の障害又は疾患が真性糖尿病又は耐糖能異常である、請求項132〜134のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が肥満である、請求項132〜134のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患がメタボリック・シンドロームである、請求項132〜134のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が移植片対宿主病である、請求項132〜134のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫関連又は免疫介在性の障害又は疾患が骨粗鬆症、多発性硬化症、SLE、関節リウマチ、JRA、眼疾患、皮膚疾患、腎臓疾患、血液疾患、ITP、PA、自己免疫肝疾患、その他のリウマチ性疾患、内分泌疾患(糖尿病を含まず)、脈管炎、強皮症、CREST、神経系疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、又は重症筋無力症を含む、請求項132〜134のいずれか1項に記載の使用。
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