PT1926813T

PT1926813T - Populações de células que têm atividade imunorreguladora, método para isolamento e usos

Info

Publication number: PT1926813T
Application number: PT67771972T
Authority: PT
Inventors: Büscher Dirk; Ángel González De La Peña Manuel; Delgado Mora Mario
Original assignee: Consejo Superior Investigacion; Tigenix S A U
Priority date: 2005-09-23
Filing date: 2006-09-22
Publication date: 2016-09-06
Also published as: ES2589311T3; IL246494B; LT1926813T; EP1926813B2; SI1926813T2; KR101536239B1; CA2953782A1; PL1926813T5; IL190363A0; US20170296592A1; EP3184631B1; KR20080048555A; US20220313742A1; CN101313062A; IL228670A; EP1926813B1; HUE030503T2; CA2623353C; SI1926813T1; CA2623353A1

Description

DESCRIÇÃO "POPULAÇÕES DE CÉLULAS QUE TÊM ATIVIDADE IMUNORREGULADORA, MÉTODO PARA ISOLAMENTO E USOS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à prevenção, tratamento ou melhoria de um ou mais sintomas de distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica utilizando populações de células derivadas de tecidos adultos. Em particular, a presente invenção fornece uma população de células derivadas de tecido conjuntivo que respondem ao interferão-gama (IFN-γ) expressando indolamina2,3-dioxigenase (IDO) para o uso na prevenção, no tratamento ou na melhoria de um ou mais sintomas associados a distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, incluindo, porém sem limitação, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e doenças imunologicamente mediadas incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 sistema imunológico em vertebrados superiores representa a primeira linha de defesa contra vários antígenos que podem entrar no corpo vertebrado, incluindo micro- organismos tais como bactérias, fungos e vírus que são agentes causadores de uma variedade de doenças. Além disso, o sistema imunológico está também envolvido numa variedade de outras doenças ou distúrbios, incluindo doenças autoimunes ou imunopatológicas, síndromes de imunodeficiência, aterosclerose e várias doenças neoplásicas. Apesar de haver métodos disponíveis para tratar estas doenças, muitas terapias atuais fornecem resultados menos adequados. De entre as novas estratégias terapêuticas emergentes, aquelas com base em terapia celular parecem constituir uma ferramenta potencialmente útil para tratar um grande número de doenças. Assim, atualmente está a ser feito um grande esforço por pesquisadores a fim de alcançar o dito objetivo.

DOENÇAS AUTOIMUNES

As doenças autoimunes são causadas quando o sistema imunológico do corpo, que se destina a defender o corpo contra bactérias, vírus e qualquer outro produto estranho, funciona defeituosamente e produz uma resposta patológica contra tecido, células e órgãos saudáveis. Anticorpos, células T e macrófagos fornecem proteção benéfica, mas podem também produzir respostas imunológicas nocivas ou letais.

As doenças autoimunes podem ser específicas de órgão ou sistémicas e são provocadas por diferentes mecanismos patogénicos. A autoimunização específica de órgão é distinguida pela expressão anormal de antígenos de complexo de histocompatibilidade principal (MHC), imitação antigénica e variações alélicas em genes de MHC. As doenças autoimunes sistémicas envolvem a ativação de célula B policlonal e anormalidades de células T imunorreguladoras, recetores de célula T e genes de MHC. Os exemplos de doenças autoimunes específicas de órgão são diabetes, hipertiroidismo, insuficiência adrenal autoimune, anemia pura dos glóbulos vermelhos, esclerose múltipla e cardite reumática. As doenças autoimunes sistémicas representativas são lúpus eritematoso sistémico, inflamação crónica, sindrome de Sjogren, polimiosite, dermatomiosite e esclerodermia. 0 tratamento atual de doenças autoimunes consiste em administrar agentes imunossupressores, tais como cortisona, derivados de aspirina, hidroxicloroquina, metotrexato, azatioprina e ciclofosfamida ou combinações dos mesmos. 0 dilema enfrentado quando se administra agentes imunossupressores, entretanto, consiste no facto de que quanto mais eficazmente a doença autoimune é tratada, mais desprotegido o paciente é deixado ao ataque de infeções e também mais suscetível de desenvolver tumores. Assim, há uma grande necessidade de novas terapias para o tratamento de doenças autoimunes.

DISTÚRBIOS INFLAMATÓRIOS A inflamação é um processo pelo qual os glóbulos brancos do corpo e fatores secretados protegem os corpos contrainfeção por substâncias estranhas, tais como bactérias e virus. Os fatores secretados conhecidos como citocinas e prostaglandinas controlam este processo e são libertados numa cascata ordenada e autolimitante no sangue ou tecidos afetados.

Doença Inflamatória Intestinal (IBD) IBD é uma familia de doenças crónicas, idiopáticas, reincidentes e destruidoras de tecido distinguida pela disfunção de células T mucosais, produção de citocinas alterada e inflamação celular que leva finalmente a danos do intestino delgado distai e da mucosa colónica. A IBD é clinicamente subdividida em dois fenótipos: doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa. A CD é uma doença autoimune atualmente incurável com uma prevalência de 0,05% que leva à inflamação crónica resultando numa gama de sintomas gastrointestinais e extraintestinais, incluindo dor abdominal, sangramento retal, diarreia, perda de peso, distúrbios de pele e olhos e maturação sexual e crescimento atrasados em crianças. Estes sintomas podem impactar consideravelmente o bem-estar, a qualidade de vida e a capacidade de função dos pacientes. Como a CD é crónica e tem, tipicamente, inicio antes dos 30 anos de idade, os pacientes geralmente exigem tratamento para toda a vida. Embora a sua etiologia permaneça desconhecida, há evidência circunstancial para ligar a CD a uma falha do sistema imunológico mucosal para atenuar a resposta imunológica a antigenos endógenos.

Os agentes terapêuticos atualmente usados para CD, incluindo aminossalicilatos, corticosteroides, azatioprina, 6-mercaptopurina, antibióticos e metotrexato, não são inteiramente eficazes, não especificos e com múltiplos efeitos colaterais adversos. Na maioria dos casos, a resseção cirúrgica é a melhor alternativa. Portanto, a presente estratégia terapêutica é encontrar fármacos ou agentes que modulem especificamente ambos os componentes da doença, isto é, as respostas inflamatórias e acionadas por células T.

Recentemente, o fármaco infliximabe foi aprovado para o tratamento de doença de Crohn moderada a grave que não responde a terapias padrão e para o tratamento de fistulas de drenagem abertas. Infliximabe, o primeiro tratamento aprovado especificamente para doença de Crohn é um anticorpo de fator de necrose antitumoral (TNF). TNF é uma proteína produzida pelo sistema imunológico que pode causar a inflamação associada à doença de Crohn. Anti-TNF remove TNF da corrente sanguínea antes de o mesmo alcançar os intestinos, prevenindo, assim, a inflamação. Entretanto, já que o mesmo tem um efeito sistémico, e o TNF é um fator bastante pleiotrópico, efeitos colaterais graves são relativamente comuns, e sua segurança a longo prazo ainda será determinada. Também, a eficácia é limitada porque muitos dos processos inflamatórios que ocorrem nos pacientes não são dependentes da sinalização de TNF.

Artrite reumatoide (RA)

Artrite reumatoide e artrite reumatoide juvenil são tipos de artrite inflamatória. Artrite é um termo geral que descreve a inflamação em articulações. Alguns, mas nem todos os tipos de artrite são o resultado da inflamação mal direcionada. A artrite reumatoide afeta cerca de 1% da população mundial e é essencialmente incapacitante. A artrite reumatoide é um distúrbio autoimune em que o sistema imunológico do corpo identifica impropriamente as membranas sinoviais que secretam o fluido lubrificante nas articulações como estranhas. A inflamação resulta e a cartilagem e os tecidos dentro e ao redor das articulações são danificados ou destruídos. 0 corpo substitui o tecido danificado com o tecido da cicatriz, fazendo com que os espaços normais dentro das articulações se tornem mais estreitos e com que os ossos se fundam em conjunto.

Na artrite reumatoide há um ciclo autoimune de apresentação de antígeno persistente, estimulação de célula T, secreção de citocina, ativação de célula sinovial e destruição de articulação. A terapia atualmente disponível para a artrite incide na redução da inflamação das articulações com medicações anti-inflamatórias ou imunossupressoras. A primeira linha de tratamento de qualquer artrite é, usualmente, com anti-inflamatórios, tais como aspirina, ibuprofeno e inibidores de Cox-2 tais como celecoxibe e rofecoxibe. Anticorpos monoclonais humanizados anti-TNF, tais como infliximabe são também usados; entretanto, os mesmos têm muitos efeitos secundários ou efeitos colaterais e a sua eficácia é bastante baixa. "Fármacos de segunda linha" incluem ouro, metotrexato e esteroides. Embora estes tratamentos estejam consolidados para a artrite, muito poucos pacientes entram em remissão apenas nestas linhas de tratamento, e problemas relacionados com tratamentos difíceis permanecem em pacientes com artrite reumatoide.

Em geral, os tratamentos atuais para distúrbios inflamatórios crónicos têm uma eficácia bastante limitada, e muitos dos mesmos têm uma alta incidência de efeitos colaterais, ou não podem impedir completamente a progressão da doença. Até agora, nenhum tratamento é ideal, e não há nenhuma cura para este tipo de patologia. Assim, há uma grande necessidade de novas terapias para o tratamento de distúrbios inflamatórios.

INIBIÇÃO DE RESPOSTAS DE CÉLULA T

Todas as respostas imunológicas são controladas por células T. As células autorreativas com o potencial de produzir respostas autoimunes compreendem uma parte do repertório da célula T normal, mas, no estado saudável, a sua ativação é impedida por células supressoras. Embora as células supressoras T tenham sido originalmente descritas na década de 1970, um progresso significativo na caracterização de subconjuntos de célula T tem sido feito apenas recentemente, quando as mesmas foram renomeadas como células T reguladoras. Há diferentes subconjuntos de CD4+, CD8+, célula exterminadora natural e célula γδΤ com atividade reguladora (supressora). Os dois principais tipos de células T-reg foram distinguidos na população CD4+, isto é, as células T-reg geradas no timo de ocorrência natural e as células T-reg secretoras de TGF-β ou IL-10 perifericamente induzidas (células Trl) . As células T-reg de ocorrência natural que manifestam Foxp3 CD4+CD25+ geradas no timo migram e são mantidas na periferia. Os sinais para a sua geração timica e manutenção na periferia não são inteiramente definidos, embora tanto a estimulação de CD28 quanto IL-2 parecem ser exigidas. O número de células T-reg CD4+CD25+ na periferia não diminui com a idade, embora estas células sejam anérgicas e propensas à apoptose, e seu sitio de origem, o timo, passe pela involução relacionada à idade. Isto sugere que o agrupamento de células T-reg CD4+CD25+ é mantido perifericamente. Diversos modelos experimentais sustentam a ideia de geração periférica de células T-reg CD4+CD25+ a partir de células CD4+CD25-T. Os fatores e mecanismos endógenos que controlam a expansão periférica de células T-reg CD4+CD25+ são, na maioria das vezes, desconhecidos. Há evidência de que o fator beta de crescimento de transformação de citocina (TGF-β ) desempenha um papel importante na expansão de precursores de CD4+ CD25+ profissionais derivados do timo que circulam no sangue. TGF-β está também envolvido na geração de subconjuntos reguladores de CD4+ e CD8+ induzidos perifericamente.

Entretanto, os dados experimentais recentes sugerem que um mecanismo de imunotolerência poderia ser dependente do metabolismo de triptofano e, particularmente, da atividade da enzima indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) que é uma enzima que contém heme intracelular que catalisa a etapa limitante de taxa inicial na degradação de triptofano ao longo da trajetória de quinurenina. Há evidência considerável que sustenta a hipótese de que as células que manifestam IDO podem suprimir respostas de célula T e promover a tolerância (Mellor e Munn, Nat Rev Immunol. Outubro de 2004; 4(10):762 a 774). IDO é expressa em alguns subconjuntos de células dendriticas (DCs) que são reguladores-chave de respostas imunológicas (DCs tolerogênicas). Estas DCs têm a capacidade de suprimir respostas de célula T in vivo esgotando localmente o triptofano (Patente n° US 2002/0155104). À exceção de DCs derivadas de monócito e macrófagos, diversas linhagens de tumor, células intestinais e trofoblastos manifestam IDO. A expressão de IDO em trofoblastos parece ser constitutiva e foi fortemente correlacionada à tolerância do tecido alogénico do feto. Acredita-se que a IDO induza a apoptose em células T e cause a tolerância espontânea a aloenxertos hepáticos.

Os mecanismos moleculares atrás da atividade imunossupressora da IDO não são conhecidos. Entretanto, foi demonstrado que as DCs que manifestam IDO têm a capacidade de induzir a geração de células T reguladoras. A IDO é induzida em células humanas por diversos mediadores inflamatórios, incluindo interferões e lipopolissacarideo (LPS), assim como por infeção virai. Diversos estudos mostraram que as células tumorais alogénicas sendo rejeitadas pelo sistema imunológico hospedeiro in vivo regulam positivamente a IDO, e este efeito é mediado por IFN-γ.

Experiências recentes indicaram uma capacidade imunossupressora in vitro das células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (MSCs) e células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs), assim como uma capacidade imunossupressora in vivo de MSCs. Esta capacidade in vivo foi estudada em transplantes de medula óssea, nos quais a infusão de MSCs expandidas parece reduzir a doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD) aguda e crónica. 0 efeito in vitro é distinguido por uma supressão da proliferação de linfócitos em experiências em que os linfócitos foram ativados tanto por meio de uma reação mista de linfócitos (MLR) como por estimulação com fito-hemaglutinina (PHA). Entretanto, os mecanismos moleculares responsáveis pelos efeitos imunossupressores das ditas células não foram inequivocamente identificados. 0 documento US 2002/044923 AI revela o uso de MSCs humanas modificadas para expressar um antigeno como imunosupressores induzindo a anergia de célula T especifica. As MSCs são usadas para o tratamento de doenças autoimunes e doenças inflamatórias, por exemplo, artrite reumatoide.

Outro grupo descreveu que as MSCs que são reveladas como sendo negativas para expressão de CD14 e CD45 e positivas para expressão de CD44 e CD105 aumentam a população de células T reguladoras quando as mesmas são cocultivadas com células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) (Aggarwal e Pittenger, Blood 2005; 105(4):1.815 a 1.822).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção baseia-se na revelação de que determinadas populações de células com potencial de multilinhagem que estão presentes em diferentes tecidos conjuntivos têm a capacidade de atuar como agentes imunorreguladores in vivo e in vitro. Os inventores isolaram uma população de células derivadas do tecido conjuntivo que respondem ao interferão-gama (IFN-γ) expressando indolamina-2,3-dioxigenase (IDO). Os efeitos imunorreguladores das ditas células podem ser usados para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, incluindo, porém, sem limitação, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e doenças mediadas imunologicamente incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados.

Assim, num aspeto, este documento descreve uma população de células isolada do tecido conjuntivo em que as células da dita população de células: (i) não manifestam pelo menos um marcador específico para células de apresentação de antígeno (APC), noutras palavras, marcadores específicos para células de apresentação de antígeno, em que o marcador específico para APC é CDllb, CDllc, CD14, CD45 ou HLAII; (ii) não manifestam indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente; (iii) manifestam IDO mediante a estimulação com interferão-gama (IFN-γ) ; e (iv) apresentam a capacidade de serem diferenciadas em pelo menos duas linhagens celulares.

Noutro aspeto, o documento descreve um método para o isolamento da dita população de células. A população de células obtenível de acordo com o dito método constitui uma revelação adicional deste documento.

Noutro aspeto, este documento refere-se à dita população de células para o uso na prevenção, no tratamento ou na melhoria de um ou mais sintomas de distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica.

Noutro aspeto, a invenção refere-se à dita população de células para o uso como medicamento ou para induzir a tolerância a transplante ou para tratar doenças autoimunes ou para tratar uma doença inflamatória. Numa modalidade particular, a dita doença inflamatória é uma doença inflamatória crónica, tal como, por exemplo, a Doença Inflamatória Intestinal (IBD) ou a Artrite Reumatoide (RA).

Noutro aspeto, a invenção refere-se ao uso da dita população de células na preparação de um medicamento, tal como um medicamento para a prevenção, o tratamento ou a melhoria de um ou mais sintomas de distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, por exemplo, um medicamento para induzir a tolerância a transplante, ou um medicamento para tratar doenças autoimunes, ou um medicamento para tratar uma doença inflamatória.

Noutro aspeto, a invenção refere-se ao uso da dita população de células na preparação ou geração in vitro de células T reguladoras (T-reg). A dita população de células T-reg, assim como um método para o isolamento da mesma constituem revelações adicionais deste documento. 0 documento também revela a dita população de células T-reg para o uso como medicamento ou para induzir a tolerância a transplante ou para tratar doenças autoimunes ou para tratar uma doença inflamatória. 0 documento também revela o uso da dita população de células T-reg na preparação de um medicamento, tal como um medicamento para a prevenção, tratamento ou melhoria de um ou mais sintomas de distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, por exemplo, um medicamento para induzir a tolerância a transplante, ou um medicamento para tratar doenças autoimunes, ou um medicamento para tratar uma doença inflamatória, ou um medicamento para tratar alergias, por exemplo, porém, sem limitação, reações de hipersensibilidade do Tipo IV. 0 documento também revela um método para o isolamento de uma população de células irradiadas, o qual compreende irradiar a dita população de células com uma fonte controlada de radiação ionizante sob condições adequadas. A dita população de células irradiadas constitui uma revelação adicional deste documento. 0 documento também revela a dita população de células irradiadas para o uso como medicamento ou para induzir a tolerância a transplante ou para tratar doenças autoimunes ou para tratar uma doença inflamatória. 0 documento também revela o uso da dita população de células irradiadas na preparação de um medicamento, tal como um medicamento para a prevenção, o tratamento ou a melhoria de um ou mais sintomas de distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, por exemplo, um medicamento para induzir a tolerância a transplante, ou um medicamento para tratar doenças autoimunes, ou um medicamento para tratar uma doença inflamatória. 0 documento também revela um método que compreende submeter a dita população de células ao tratamento com interferão-γ (IFN-γ) . A dita população de células tratadas com IFN-γ constitui uma revelação adicional do documento. 0 documento também revela a dita população de células tratadas com IFN-γ para o uso como medicamento ou para induzir a tolerância a transplante ou para tratar doenças autoimunes ou para tratar uma doença inflamatória. 0 documento também revela o uso da dita população de células tratadas com IFN-γ na preparação de um medicamento, tal como um medicamento para a prevenção, o tratamento ou a melhoria de um ou mais sintomas de distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, por exemplo, um medicamento para induzir a tolerância a transplante, ou um medicamento para tratar doenças autoimunes, ou um medicamento para tratar uma doença inflamatória. 0 documento também revela um método que compreende submeter a dita população de células à (i) irradiação e (i i) estimulação com IFN-γ, em que os tratamentos (i) e (ii) são executados em qualquer ordem. A dita população de células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas ou a população de células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ constituem uma revelação adicional do documento. 0 documento também revela a dita população de células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas ou população de células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ para o uso como um medicamento, ou para induzir tolerância a transplante, ou para tratar doenças autoimunes, ou para tratar uma doença inflamatória. 0 documento também revela o uso da dita população de células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas ou população de células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ na preparação de um medicamento, tal como um medicamento para a prevenção, o tratamento ou a melhoria de um ou mais sintomas de distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, por exemplo, um medicamento para induzir a tolerância a transplante, ou um medicamento para tratar doenças autoimunes, ou um medicamento para tratar uma doença inflamatória.

Noutro aspeto, a invenção refere-se ao uso da dita população de células, ou este documento também revela o uso da dita população de células T-reg, ou da dita população de células irradiadas, ou da dita população de células tratadas com IFN-γ, ou da dita população de células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas, ou da dita população de células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios, ou doenças imunologicamente mediadas incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados.

Noutro aspeto, o documento revela um método para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios ou doenças imunologicamente mediadas num individuo que sofre de qualquer um destes distúrbios, ou doenças que compreende administrar ao dito individuo que precisa deste tratamento uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz da referida população de células, ou da dita população de células T-reg, ou da dita população de células irradiadas, ou da dita população de células tratadas com IFN-γ, ou da referida população de células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas, ou da dita população de células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ. Este documento também revela o uso de tais métodos na terapia de combinação, noutras palavras, uma população de células revelada por este documento é coadministrada com um ou mais agentes, tanto simultaneamente com o segundo agente ou agente adicional, como separadamente, por exemplo, sequencialmente.

Noutro aspeto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende a dita população de células, ou este documento também revela uma composição farmacêutica compreendendo a dita população de células T-reg, ou a dita população de células irradiadas, ou a referida população de células tratadas com IFN-γ, ou a dita população de células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas, ou a dita população de células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Noutro aspeto, a invenção revela um método para distinguir células multipotentes adultas de células diferenciadas compreendendo a etapa de verificar se a célula expressa IDO mediante a estimulação com IFN-γ.

Noutro aspeto, a invenção refere-se a um kit compreendendo a dita população de células ou revela um kit compreendendo a dita população de células T-reg, ou a dita população de células irradiadas, ou a dita população de células tratadas com IFN-γ, ou a dita população de células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas, ou a dita população de células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra a cinética de crescimento das células fornecidas pelo presente documento, isoladas do tecido adiposo humano e cultivadas ex vivo para mars do que 25 duplicações de população de células. A Figura 2 mostra histogramas de imunocitometria de fluorescência correspondendo ao perfil de marcadores de superficies obtidos a partir das células descritas pelo presente documento, isoladas do tecido adiposo humano. Os histogramas que correspondem aos controlos de isótipo (controlos negativos) são mostrados sombreados a cinzento. A Figura 3 mostra a análise da expressão de IDO após a incubação das células descritas pelo presente documento isoladas do tecido adiposo humano com diferentes reagentes pró-inflamatórios por diferentes períodos de tempo, detetada por meio de RT-PCR (Figura 3A) ou western blotting (Figura 3B) . IL-1, interleucina 1; TNF-cx, fator alfa de necrose tumoral; LPS, lipopolissacarídeo; IFN-γ, interferão-gama; C-, controlo negativo; C+, controlo positivo; n.i., células não induzidas com IFN-γ. GAPDH (gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase) é usada como o controlo de carregamento da RTPCR. A Figura 4 mostra a deteção por western blotting da expressão de IDO após 48 horas de tratamento com IFN-γ das células descritas pelo presente documento isoladas de diferentes tecidos humanos (tecido adiposo, medula óssea, cartilagem e pele). Ctrl-, controlo negativo (meio de cultura); Ctrl+, controlo positivo; (-) , células não tratadas com IFN-γ; ( + ) , células tratadas com IFN-γ por 48 horas. A Figura 5 mostra a perda de peso corporal em murganhos tratados com administração de TNBS (ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfónico). A Figura mostra uma melhoria dependente de dose do peso aumentado após a administração das células descritas pelo presente documento isoladas do tecido adiposo humano. Após 10 dias, os murganhos que receberam lxlO6 células não mostraram nenhuma diferença de peso significativa em comparação com o grupo de controlo. A Figura 6 mostra a taxa de sobrevivência de murganhos tratados com TNBS após a administração das células descritas pelo presente documento isoladas do tecido adiposo humano. Novamente, uma dependência em relação à dose pode ser observada com lxlO6 células mostrando um efeito mais forte do que 0,3xl06 células, embora, em ambos os casos, as células tenham melhorado significativamente a taxa de sobrevivência dos murganhos tratados com TNBS. A Figura 7 mostra a comparação de peso corporal em murganhos tratados com TNBS após a administração de lxlO6 células descritas pelo presente documento isoladas do tecido adiposo humano e lxlO6 das mesmas células pré-estimuladas com 30 ng/ml de IFN-γ durante 48 horas. O gráfico mostra a perda de peso grave em murganhos tratados com TNBS e uma clara melhoria após 3 dias em murganhos que receberam células. Após 8 dias, estes murganhos mostraram até um aumento de peso, enquanto que os murganhos de controlo (murganhos tratados com TNBS sem administração de células) ainda mostravam uma perda de peso grave. Além do mais, as células pré-estimuladas com IFN-γ mostraram uma recuperação mais rápida e mais forte do tratamento com TNBS do que células não pré-estimuladas. A Figura 8 mostra os dados da Figura 7 como "Experiência 1" e adicionalmente aos dados de um conjunto de dados adicional "Experiência 2" descrito no Exemplo 5. O gráfico mostra que os murganhos tratados com TNBS perderam peso dramaticamente e uma clara melhoria nos murganhos que receberam células. Esta melhoria foi também mensurável pela gravidade da colite. A Figura 9 mostra que todas as citocinas pró-inflamatórias (TNF-a, IL-6, IL-lb, IL-12 e IFNy) e quimiocinas (MIP-2 e RANTES) testadas, tanto no cólon (resposta local) quanto no soro (resposta sistémica), tinham teor menor em animais tratados com células em comparação a murganhos não tratados. A Figura 10 mostra que a infiltração neutrófila, conforme medido pela atividade de MPO, foi menor em animais tratados com ASC, e ainda menor quando as células foram pré- estimuladas com IFN-γ. A Figura 11 mostra que as células identificadas com CFSE foram localizadas nos nódulos linfáticos de drenagem dos animais tratados por meio da citometria de células. Esta é a localização esperada se as células administradas estiverem a funcionar como APCs. A Figura 12 mostra a indução de marcadores de APC em ASCs humanas pelo tratamento com IFN-γ. Linha superior: histogramas citométricos de ASCs não tratadas; linha inferior, histogramas citométricos de ASCs após o tratamento com IFN-γ por 4 dias. Os controlos de isótipo são mostrados sombreados a preto. A Figura 13 mostra que as células reveladas por este documento diminuem a gravidade e incidência de CIA. A, Gravidade da artrite, avaliada por pontuação clinica ou medições da espessura da pata, em murganhos com CIA estabelecida injetada. Os números em parênteses representam a incidência da artrite (% de murganhos com pontuação de artrite > 2 no dia 50) no controlo, grupos i.p. e i.a. As imagens mostram os exemplos representativos de inchaço da pata em murganhos dos diferentes grupos experimentais (controlo e ASC i.p.) . n=8 a 11 murganhos por grupo. p<0,001 versus controlo após o dia 32. A atividade de mieloperoxidase (MPO) medindo a infiltração de neutrófilos nas articulações. *p<0,001 versus controlo. A Figura 14 mostra a inibição da resposta inflamatória. A expressão sistémica e local de mediadores inflamatórios em murganhos com CIA tratados com ASC ou não tratados (controlo) avaliada no dia 35 após a imunização. A, Teores de citocina/quimioquina nas articulações. Uma pata de um murganho não imunizado foi analisada simultaneamente para a avaliação da resposta basal. B, Niveis séricos de TNFa e IL-β. n=6 a 8 murganhos/grupo. *p<0,001 versus controlos. A Figura 15 mostra que as células reveladas por este documento regulam negativamente a resposta mediada por Thl em CIA. A, Resposta proliferativa e produção de citocinas das células de nódulos linfáticos de drenagem (DLN) isoladas no dia 30 de murganhos com CIA tratados com ASC ou não tratados (controlo) e estimuladas in vitro com diferentes concentrações de CII. A estimulação de células de DLN com anticorpos anti-CD3 (▼, para murganhos com CIA não tratados; V, para murganhos com CIA tratados com AM) é usada para a avaliação da estimulação não especifica. Um agrupamento de 3 células de DLN DBA/1 não imunizadas foi usado para a avaliação da resposta basal. n=5 murganhos/grupo. B, Número de células T que produzem citocina especificas para CII. As células de DLN de murganhos com CIA tratados com ASC ou não tratados (controlo) foram estimuladas novamente in vitro com CII (10 yg/ml) e analisadas para CD4 e expressão de citocina intracelular por citometria de fluxo (para expressão de IFNy/TNFa ou IL-4/IL-10 em células T CD4 fechadas) . 0 número de IFNy-, IL-4- e IL-10- expressando as células T em relação a 104 células T CD4 é mostrado. Os dados revelados representam os valores agrupados de duas experiências independentes. C, Resposta proliferativa especifica para CII em células de membrana sinovial isoladas de murganhos com CIA tratados com ASC ou não tratados (controlo) e estimuladas in vitro com CII (10 mg/ml) por 48 h. Os dados mostram os resultados de células sinoviais agrupadas de 3 animais por grupo. D, Niveis de IgG, IgGl e IgG2a específicos para CII em soro coletado no dia 35 de murganhos com CIA tratados com ASC ou não tratados (controlo) (8 a 12 murganhos/grupo). *p<0,001 versus controlos. A Figura 16.A. mostra que tanto o DLN quanto a membrana sinovial de murganhos com CIA tratados com as células reveladas por este documento induzem um aumento nos números de células T reguladoras (CD4+CD25+Foxp3+) , sem qualquer aumento nos números de células T efetoras, em comparação a murganhos com CIA não tratados (controlo). A Figura 16.B. mostra que os murganhos com CIA tratados com as células reveladas pelo documento, mas não murganhos com CIA de controlo (não tratados), contêm células T reguladoras que inibem especificamente a resposta de célula T efetora contra CII. A Figura 17 mostra que a cocultura de ASCs e linfócitos resulta numa inibição da proliferação de linfócitos. A Figura 18 mostra que as ASCs colocadas em placas a 5.000 células/cm2 e estimuladas a 3 ng/ml de IFN-γ por até 120 horas produzem IDO, cuja atividade é medida pela metabolização de triptofano e produção de quinurenina usando HPLC. A Figura 19 mostra que as ASCs colocadas em placas a 5.000 células/cm2 e estimuladas a 3 pg/ml de IFN-γ por até 120 horas falham em produzir IDO. Nenhuma quinurenina poderia ser detetada. A Figura 20 mostra que as ASCs colocadas em placas a 500 células/cm2 e estimuladas a 3 ng/ml de IFN-γ por até 120 horas falham em produzir quantidades significativas de IDO. A Figura 21A mostra células que têm FITC dextrano fagocitado numa imagem de campo claro. A Figura 21B mostra a mesma população usando microscopia de fluorescência que usa filtros de Proteína Verde Fluorescente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Conforme foi anteriormente mencionado, os inventores revelaram que determinadas populações de células com potencial de multilinhagem que estão presentes em vários, se não todos, tecidos conjuntivos e respondem ao interferão-gama (IFN-γ) expressando-se indolamina-2,3-dioxigenase (IDO) têm a capacidade de atuar como agentes imunorreguladores in vivo e in vitro. Os efeitos imunorreguladores e imunosupressores das ditas células podem ser usados para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, incluindo, porém sem limitação, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e doenças mediadas imunologicamente incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados.

Definições A fim de facilitar o entendimento da presente descrição, o significado de alguns termos e expressões no contexto da invenção será explicado abaixo. As definições adicionais serão incluídas ao longo da descrição quando for necessário. 0 termo "células de apresentação de antígeno" (APC) refere-se a uma população de células que exibe antígeno estranho complexado com MHC (complexo de histocompatibilidade principal) na sua superfície. Embora quase toda a célula no corpo tenha capacidade de apresentar antígenos às células T, o termo "células de apresentação de antígeno" (APC) é limitado no presente documento àquelas células especializadas, também chamadas de APCs profissionais, que manifestam HLAII na sua superfície e são derivadas da linhagem de monócito-macrófago (por exemplo, células dendríticas). 0 termo "doença autoimune" refere-se a uma afeção num indivíduo distinguido por lesão celular, de tecido e/ou órgão causada por uma reação imunológica do indivíduo às suas próprias células, tecidos e/ou órgãos. Os exemplos ilustrativos e não limitadores de doenças autoimunes que podem ser tratadas com a população de células revelada por este documento incluem alopecia areata, espondilite anquilosante, síndrome de antifosfolipídio, doença de Addison autoimune, doenças autoimunes da glândula suprarrenal, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, ooforite e orquite autoimunes, trombocitopenia autoimune, doença de Behcet, penfigoide bolhoso, cardiomiopatia, dermatite de sprue celíaco, fadiga crónica e síndrome da disfunção imune (CFIDS), polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome CREST, doença por aglutininas a frio, lúpus discoide, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia-fibromiosite, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barre, tiroidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, trombocitopenia idiopática púrpura (ITP), neuropatia por IgA, artrite juvenil, liquen plano, doença de Ménière, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, diabetes mellitus imunomediada ou tipo 1, miastenia gravis, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, poliartrite nodosa, policondrite, sindromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoriase, artrite psoriática, fenómeno de Raynaud, sindrome de Reiter, sarcoidose, esclerodermia, esclerose sistémica progressiva, sindrome de Sjõgren, sindrome de Goodpasture, sindrome da pessoa rigida, lúpus eritematoso sistémico, lúpus eritematoso, artrite Takayasu, arterite temporal/arterite de células gigantes, colite ulcerosa, uveite, vasculites tais como vasculite de dermatite herpetiforme, vitiligo, granulomatose de Wegener, etc. 0 termo "agente imunorregulador" refere-se a um agente que inibe ou reduz uma ou mais atividades biológicas do sistema imunológico. Um agente imunorregulador é um agente que inibe ou reduz uma ou mais atividades biológicas (por exemplo, a proliferação, diferenciação, preparação, função efetora, produção de citocinas ou expressão de antigenos) de uma ou mais células imunes (por exemplo, células T). 0 termo "doença inflamatória" refere-se a uma afeção num indivíduo distinguida pela inflamação, por exemplo, inflamação crónica. Os exemplos ilustrativos e não limitadores de distúrbios inflamatórios incluem, porém sem limitação, artrite reumatoide (RA), Doença Inflamatória Intestinal (IBD), asma, encefalite, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), osteólise inflamatória, doenças alérgicas, choque séptico, fibrose pulmonar (por exemplo, fibrose pulmonar idiopática), vasculite inflamatória (por exemplo, poliartrite nodosa, granulomatose de Wegener, arterite de Takayasu, arterite temporal, e granulomatose linfomatoide), angioplastia vascular pós-traumática (por exemplo, restenose após angioplastia), espondiloartropatia indiferenciada, artropatia indiferenciada, artrite, osteólise inflamatória, hepatite crónica e inflamação crónica resultante de infeções bacterianas ou virais crónicas. 0 termo "isolada" aplicado a uma população de células refere-se a uma população de células isolada do corpo humano ou animal que é substancialmente livre de uma ou mais populações de células que são associadas à dita população de células in vivo ou in vitro. 0 termo "MHC" (complexo de histocompatibilidade principal) refere-se a um subconjunto de genes que codifica proteínas de apresentação de antígeno de superfície celular. Em seres humanos, estes genes são referidos como genes de antígeno de leucócito humano (HLA). No presente documento, as abreviações MHC ou HLA são usadas intercambiavelmente. 0 termo "indivíduo" refere-se a um animal, de preferência, um mamífero incluindo um não primata (por exemplo, uma vaca, porco, cavalo, gato, cão, rato ou murganho) e um primata (por exemplo, um macaco ou um humano). Numa modalidade preferencial, o indivíduo é um ser humano. 0 termo "célula T" refere-se a células do sistema imunológico que são um subconjunto de linfócitos que manifestam o recetor de célula T (TCR). 0 termo "células T reguladoras" (células T-reg) refere-se a subconjuntos de células T que suprimem ativamente a ativação do sistema imunológico e impedem a autorreatividade patológica, isto é, uma doença autoimune.

Conforme usado no presente documento, os termos "tratar", "tratamento" e "tratando" referem-se à melhoria de um ou mais sintomas associados a um distúrbio incluindo, porém sem limitação, um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada incluindo a rejeição de órgão e tecidos transplantados que resulta da administração da população de células revelada pelo documento, da população de células T-reg revelada pelo documento, ou da população de células pré-estimulada com IFN-γ revelada pelo documento, ou uma composição farmacêutica compreendendo a mesma, a um indivíduo que precisa do tratamento mencionado. 0 termo "terapia de combinação" refere-se ao uso das populações de células reveladas pelo presente documento com outros agentes ativos ou modalidades de tratamento na maneira do presente documento para a melhoria de um ou mais sintomas associados a um distúrbio incluindo, porém sem limitação, um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados. Estes outros agentes ou tratamentos podem incluir fármacos e terapias conhecidos para o tratamento de tais distúrbios. As populações de células reveladas por este documento podem também ser combinadas com corticosteroides, compostos anti-inflamatórios não esteroidais, ou outros agentes úteis no tratamento de inflamação. 0 uso combinado dos agentes do presente documento com estas outras terapias ou modalidades de tratamento pode ser concomitante ou dado sequencialmente, isto é, os dois tratamentos podem ser divididos de modo a que uma população de células ou uma composição farmacêutica compreendendo a mesma do presente documento possa ser dada antes ou após a outra terapia ou modalidade de tratamento. 0 médico responsável pode decidir a sequência adequada de administração da população de células, ou uma composição farmacêutica compreendendo a mesma, em combinação com outros agentes, terapia ou modalidade de tratamento. Células

Num aspeto, o presente documento revela uma população de células isolada do tecido conjuntivo, doravante referida como "população de células revelada pelo documento", distinguida pelo fato de que as células da dita população de células: a) não manifestam marcadores específicos para células de apresentação de antígeno (APC), b) não manifestam indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente, em que constitutivamente é entendido como significando a expressão de um gene sem qualquer indução específica. c) manifestam IDO mediante a estimulação com interferão-gama (IFN-γ) e, d) apresentam a capacidade de serem diferenciadas em pelo menos duas linhagens de células.

As células da população de células revelada por este documento, doravante referidas como as "células reveladas por este documento", derivam do tecido conjuntivo. O termo "tecido conjuntivo" refere-se ao tecido derivado do mesênquima e inclui diversos tecidos que são distinguidos pelo fato de que as suas células estão incluidas dentro da matriz extracelular. De entre os diferentes tipos de tecidos conjuntivos, tecidos adiposos e cartilaginosos são incluídos. Numa revelação particular, as células reveladas por este documento são da fração do estroma do tecido adiposo. Noutra revelação particular, as células reveladas por este documento são obtidas a partir de condrócitos, as únicas células encontradas na cartilagem hialina. Noutra revelação particular, as células reveladas por este documento são obtidas a partir da pele. Também, noutra revelação particular, as células reveladas por este documento são obtidas a partir da medula óssea.

As células reveladas por este documento podem ser obtidas a partir de qualquer fonte adequada de tecido conjuntivo a partir de qualquer animal adequado, incluindo seres humanos. Em geral, as ditas células são obtidas a partir de tecidos conjuntivos de mamíferos pós-natais não patológicos. Numa revelação preferencial, as células reveladas por este documento são obtidas a partir de uma fonte do tecido conjuntivo, tal como a fração do estroma do tecido adiposo, cartilagem hialina, medula óssea, pele, etc. Também, numa revelação particular, as células da população de células revelada por este documento são de um mamífero, por exemplo, um roedor, primata, etc., de preferência, de um ser humano.

Conforme mencionado acima, as células reveladas por este documento são distinguidas pelo fato de que (i) as mesmas não manifestam marcadores específicos para APCs; (ii) as mesmas não manifestam IDO constitutivamente; (iii) as mesmas manifestam IDO mediante a estimulação com IFN-γ; e (iv) as mesmas apresentam a capacidade de serem diferenciadas em pelo menos duas linhagens de células.

Marcadores

As células reveladas por este documento são negativas para pelo menos um, dois, três, quatro ou, de preferência, todos os seguintes marcadores CDllb, CDllc, CD14, CD45 e HLAII que são marcadores específicos para linhagens de APCs. Assim, as células reveladas por este documento não constituem uma subpopulação anteriormente descrita de APCs especializadas.

Além disso, as células reveladas por este documento são negativas para pelo menos um, dois ou, de preferência, todos os marcadores de superfície celular a seguir: CD31, CD34 e CD133.

Conforme usado no presente documento, "negativo" em relação aos marcadores de superfície celular significa que, numa população de células compreendendo as células reveladas por este documento, menos do que 10%, de preferência, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou nenhuma das células mostra um sinal para um marcador de superfície celular específico na citometria de fluxo acima do sinal de fundo, usando métodos e aparelhos convencionais (por exemplo, um sistema Beckman Coulter Epics XL FACS usado com anticorpos comercialmente disponíveis e protocolos padrão conhecidos na técnica). Numa revelação particular, as células reveladas por este documento são distinguidas pelo fato de que as mesmas manifestam pelo menos um, dois, três, quatro ou, de preferência, todos os marcadores de superfície celular a seguir: CD9, CD44, CD54, CD90 e CD105; isto é, as células reveladas por este documento são positivas para pelo menos um, dois, três, quatro e, de preferência, todos os ditos marcadores de superfície celular (CD9, CD44, CD54, CD90 e CD105). De preferência, as células reveladas por este documento são distinguidas pelo fato de que as mesmas têm níveis de expressão significativos de pelo menos um, dois, três, quatro e, de preferência, todos os ditos marcadores de superfície celular (CD9, CD44, CD54, CD90 e CD105. Conforme usado no presente documento, a expressão "expressão significativa" significa que, numa população de células compreendendo as células reveladas por este documento, mais do que 10%, de preferência, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou todas as células mostram um sinal para um marcador de superfície celular específico na citometria de fluxo acima do sinal de fundo usando métodos e aparelhos convencionais (por exemplo, um sistema de FACS Beckman Coulter Epics XL usado com anticorpos comercialmente disponíveis e protocolos padrão conhecidos na técnica). O sinal de fundo é definido como a intensidade de sinal dada por um anticorpo não específico do mesmo isótipo que o anticorpo específico usado para detetar cada marcador de superfície na análise por FACS convencional. Assim, para um marcador ser considerado positivo, o sinal específico observado é mais forte do que 10%, de preferência, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 500%, 1.000%, 5.000%, 10.000% ou mais do que a intensidade de sinal de fundo usando os métodos e aparelhos convencionais (por exemplo, um sistema de FACS Beckman Coulter Epics XL usado com anticorpos comercialmente disponíveis e protocolos padrão conhecidos na técnica).

Opcionalmente, as células reveladas por este documento são também negativas para o marcador de superfície celular CD106(VCAM-1). Nos exemplos de tais células são determinadas populações de células-tronco do estroma derivadas do tecido adiposo conforme descrito no presente documento.

Anticorpos monoclonais conhecidos e comercialmente disponíveis contra os ditos marcadores de superfície celular (por exemplo, recetores celulares e proteínas transmembranares) podem ser usados para identificar as células reveladas por este documento.

Expressão de IDO

As células reveladas por este documento não manifestam IDO constitutivamente, mas as mesmas manifestam IDO mediante a estimulação com IFN-γ. As experiências efetuadas pelos inventores mostraram que as ditas células, mediante a estimulação com outros mediadores pró-inflamatórios por si próprias, tal como interleucina-1 (IL-1) usada a uma concentração de 3 ng/ml, fator alfa de necrose tumoral (TNF-oí) usado a uma concentração de 50 ng/ml, ou a endotoxina LPS usada a uma concentração de 100 ng/ml, não induziram a expressão de IDO, conforme medido por análise por Western Blot e RT-PCR convencional. A estimulação com IFN-γ, por exemplo, a 3 ng/ml ou mais pode também induzir a expressão de HLAII nas células reveladas por este documento para gerar um sinal positivo conforme definido no presente documento para um marcador de superfície celular. A dita expressão pode ser detetada por aqueles peritos na técnica usando qualquer tecnologia conhecida que permita a deteção da expressão das proteínas específicas. De preferência, as ditas tecnologias são tecnologias de citometria de células.

Diferenciação

As células reveladas por este documento apresentam a capacidade de proliferar e ser diferenciadas em pelo menos duas, com mais preferência, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais linhagens de células. Os exemplos ilustrativos não limitadores das linhagens de células em que as células reveladas por este documento podem ser diferenciadas incluem osteócitos, adipócitos, condrócitos, tenócitos, miócitos, cardiomiócitos, células do estroma de suporte hematopoiético, células endoteliais, neurónios, astrócitos e hepatócitos.

As células reveladas por este documento podem-se proliferar e diferenciar em células de outras linhagens por métodos convencionais. Os métodos para identificar e isolar subsequentemente as células diferenciadas a partir das suas contrapartes não diferenciadas podem também ser executados por métodos bem conhecidos na técnica.

As células reveladas por este documento têm também a capacidade de serem expandidas ex vivo. Isto é, após o isolamento, as células reveladas por este documento podem ser mantidas e deixadas proliferar ex vivo no meio de cultura. Este meio é composto de, por exemplo, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), com antibióticos (por exemplo, 100 unidades/ml de penicilina e 100 yg/ml de estreptomicina) ou sem antibióticos, e glutamina a 2 mM, e suplementado com 2 a 20% de soro bovino fetal (FBS) . Está dentro da habilitação de um perito na técnica modificar ou modular as concentrações dos meios e/ou suplementos de meio para as células usadas conforme necessário. Os soros contêm frequentemente fatores e componentes celulares e não celulares que são necessários para a viabilidade e a expansão. Os exemplos de soros incluem FBS, soro bovino (BS) , soro de bezerro (CS) , soro fetal de bezerro (FCS) , soro de bezerro recém-nascido (NCS), soro de cabra (GS), soro de cavalo (HS) , soro suino, soro de ovelha, soro de coelho, soro de rato (RS), etc. É também contemplada, se as células reveladas por este documento forem de origem humana, a suplementação do meio de cultura celular com um soro humano, de preferência, de origem autóloga. Entende-se que os soros podem ser inativados por aquecimento a 55 a 65 °C se for considerado necessário inativar os componentes da cascata de complementos. A modulação das concentrações séricas e a retirada de soro do meio de cultura podem também ser usadas para promover a sobrevivência de um ou mais tipos de célula desejados. De preferência, as células reveladas por este documento beneficiarão de concentrações de FBS de cerca de 2% a cerca de 25%. Noutra revelação, as células reveladas por este documento podem ser expandidas num meio de cultura de composição definida no qual o soro é substituído por uma combinação de albumina sérica, transferrina sérica, selénio e proteínas recombinantes incluindo, porém sem limitação: insulina, fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) e fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) conforme conhecido na técnica.

Muitos meios de cultura celular já contêm aminoácidos; entretanto, alguns exigem suplementação antes de cultivar as células. Tais aminoácidos incluem, porém sem limitação, L-alanina, L-arginina, ácido L-aspártico, L-asparagina, L- cisteína, L-cistina, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-glicina e similares.

Os agentes antimicrobianos são também tipicamente usados na cultura celular para mitigar a contaminação bacteriana, do micoplasma e fúngica. Tipicamente, os compostos antibióticos ou antimicóticos usados são misturas de penicilina/estreptomicina, mas também podem incluir, porém sem limitação, anfotericina (Fungizone ®), ampicilina, gentamicina, bleomicina, higromacina, canamicina, mitomicina, etc.

As hormonas podem também ser vantajosamente usadas na cultura celular e incluem, porém sem limitação, D-aldosterona, dietilestilbestrol (DES), dexametasona, b-estradiol hidrocortisona, insulina, prolactina, progesterona, somatostatina/hormona do crescimento humano (HGH), etc.

As condições de manutenção das células reveladas por este documento podem também conter fatores celulares que permitem que as células permaneçam numa forma não diferenciada. É evidente aos peritos na técnica que, antes da diferenciação, os suplementos que inibem a diferenciação celular devem ser removidos do meio de cultura. É também evidente que nem todas as células exigirão estes fatores. De fato, estes fatores podem produzir efeitos indesejados, dependendo do tipo de célula.

Vantajosamente, as células reveladas por este documento não têm atividade tumorigénica in vivo. Assim, as ditas células são distinguidas pelo fato de que as mesmas não apresentam atividade tumorigénica, isto é, as mesmas não apresentam um comportamento alterado ou fenótipo proliferativo que dá origem a uma célula tumoral.

Numa revelação, as células reveladas por este documento podem ser administradas a um indivíduo que sofre de doenças autoimunes, doenças inflamatórias ou doenças imunologicamente mediadas, tal como a rejeição de órgãos e tecidos transplantados, para suprimir a resposta imunológica. Assim, é necessário que as células reveladas por este documento não apresentem atividade tumorigénica. A atividade tumorigénica das células reveladas por este documento pode ser testada realizando-se estudos em animais usando cepas de murganhos imunodeficientes. Nestas experiências, diversos milhões de células são implantados subcutaneamente nos animais recetores, sendo mantidas por diversas semanas e analisadas quanto à formação de tumor. Um ensaio particular é revelado no Exemplo 3.

As células reveladas por este documento podem ser transfetadas ou geneticamente modificadas para expressar, pelo menos, um polipéptido antigénico. Numa revelação, o antígeno compreende um polipéptido purificado ou sintético ou recombinante representando um antígeno específico ao qual é desejado que tolerância seja induzida, ou um fragmento de polipéptido sintético curto derivado da sequência de aminoácidos de tal antígeno. De preferência, a fonte de antígeno compreende antígenos expressos por um enxerto de tecido de doador. Também de preferência, a fonte de antígeno compreende uma proteína à qual o paciente tem um distúrbio autoimune.

Método para isolar células que manifestam IDO 0 presente documento revela um método para isolar uma população de células do tecido conjuntivo, em que as células da dita população de células apresentam um fenótipo distinguido pelo fato de que (i) as mesmas não manifestam marcadores específicos para APCs; (ii) as mesmas não manifestam IDO constitutivamente; (iii) as mesmas manifestam IDO mediante a estimulação com IFN-γ; e (iv) as mesmas apresentam capacidade de serem diferenciadas em pelo menos duas linhagens de células, sendo que o dito método compreende as etapas de: (i) preparar uma suspensão de células a partir de uma amostra de um tecido conjuntivo; (ii) recuperar as células da dita suspensão de células; (iii) incubar as ditas células num meio de cultura celular adequado numa superfície sólida sob condições que permitem que as células adiram à superfície sólida e se proliferem; (iv) lavar a dita superfície sólida após a incubação para remover células não aderidas; (v) selecionar as células que, após serem passadas pelo menos duas vezes em tal meio, permanecem aderidas à dita superfície sólida; e (vi) confirmar que a população de células selecionada apresenta o fenótipo de interesse.

Conforme usado no presente documento, o termo "superfície sólida" refere-se a qualquer material que permita que as células reveladas por este documento adiram. Numa revelação particular, o dito material é um material plástico tratado para promover a adesão de células de mamíferos à sua superfície, por exemplo, placas de poliestireno comercialmente disponíveis opcionalmente revestidas com poli-D-Lisina ou outros reagentes.

As etapas (i) a (vi) podem ser executadas por tecnologias convencionais conhecidas por peritos na técnica. Sucintamente, as células reveladas por este documento podem ser obtidas por meios convencionais a partir de qualquer fonte adequada de tecido conjuntivo de qualquer animal adequado, incluindo seres humanos, por exemplo, do tecido adiposo ou tecido cartilaginoso humano. 0 animal pode estar vivo ou morto, contanto que as células de tecido conjuntivo dentro do animal sejam viáveis. Tipicamente, as células adiposas humanas são obtidas a partir de doadores vivos usando protocolos bem reconhecidos tal como lipectomia de sucção ou cirúrgica. De fato, como procedimentos de lipoaspiração são tão comuns, o efluente de lipoaspiração é uma fonte particularmente preferencial da qual as células reveladas por este documento podem ser derivadas. Assim, numa revelação particular, as células reveladas por este documento são da fração do estroma do tecido adiposo humano obtido por lipoaspiração. Noutra revelação particular, as células reveladas por este documento são da cartilagem articular hialina humana obtidas por tecnologias artroscópicas. Noutra revelação particular, as células reveladas por este documento são da pele humana obtidas por tecnologias de biópsia. Também noutra revelação particular, as células reveladas por este documento são da medula óssea humana obtidas por aspiração. A amostra do tecido conjuntivo é, de preferência, lavada antes de ser processada para separar as células reveladas por este documento do restante material. Num protocolo, a amostra do tecido conjuntivo é lavada com solução salina fisiologicamente compatível (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS)) e, então, vigorosamente agitada e deixada assentar, uma etapa que remove a matéria solta (por exemplo, tecido danificado, sangue, eritrócitos, etc.) do tecido. Assim, as etapas de lavagem e assentamento são geralmente repetidas até o sobrenadante ser relativamente livre de detritos. As células restantes estarão presentes geralmente em amontoados de vários tamanhos, e o protocolo procede usando etapas medidas para degradar a estrutura bruta enquanto minimizam os danos às próprias células. Um método para alcançar esta finalidade é tratar os agrupamentos de células lavados com uma enzima que enfraquece ou destrói as ligações entre as células (por exemplo, colagenase, dispase, tripsina, etc.). A quantidade e a duração de tal tratamento enzimático variarão dependendo das condições empregadas, mas o uso de tais enzimas é geralmente conhecido na técnica. Em alternativa ou em conjunto com tal tratamento enzimático, os agrupamentos de células podem ser degradados com o uso de outros tratamentos, tais como agitação mecânica, energia sónica, energia térmica, etc. Se a degradação for realizada por métodos enzimáticos, é desejável neutralizar a enzima após um período adequado para minimizar os efeitos deletérios nas células. A etapa de degradação produz tipicamente uma pasta fluida ou suspensão de células agregadas e uma fração fluida contendo células estromais geralmente livres (por exemplo, glóbulos vermelhos, células musculares lisas, células endoteliais, células de fibroblasto e células-tronco). 0 próximo estágio no processo de separação é separar as células agregadas das células reveladas por este documento. Isso pode ser realizado por centrifugação que força as células num pélete coberto por um sobrenadante. 0 sobrenadante pode, então, ser descartado, e o pélete suspenso num fluido fisiologicamente compatível. Além disso, as células suspensas incluem tipicamente eritrócitos, e, na maioria dos protocolos, é desejável lisar os mesmos. Os métodos para lisar seletivamente os eritrócitos são conhecidos na técnica, e qualquer protocolo adequado pode ser empregado (por exemplo, incubação num meio hiper ou hipotónico, por lise com o uso de cloreto de amónio, etc.). Certamente, se os eritrócitos forem lisados, as células restantes devem, então, ser separadas do lisado, por exemplo, por filtração, sedimentação ou fracionamento de densidade.

Independentemente se os eritrócitos são lisados, as células suspensas podem ser lavadas, centrifugadas novamente e ressuspensas uma ou mais vezes sucessivas para alcançar uma pureza maior. Alternativamente, as células podem ser separadas com base no perfil de marcador de superfície celular ou com base no tamanho e granularidade da célula.

Após o isolamento e a ressuspensão finais, as células podem ser cultivadas e, se for desejado, analisadas quanto ao número e à disponibilidade para avaliar o rendimento. Desejavelmente, as células serão cultivadas sem diferenciação, numa superfície sólida, com o uso de um meio de cultura celular adequado, nas densidades celulares e condições de cultura adequadas. Assim, numa revelação particular, as células são cultivadas sem a diferenciação numa superfície sólida, usualmente feita de material plástico, tais como placas de Petri ou frascos para cultura de células, na presença de um meio de cultura celular adequado [por exemplo, DMEM, tipicamente suplementado com 5 a 15% (por exemplo, 10%) de um soro adequado, tal como soro humano ou soro bovino fetal], e incubadas sob condições que permitem que as células adiram à superficie sólida e se proliferem. Após a incubação, as células são lavas a fim de remover células não aderidas e fragmentos de células. As células são mantidas em cultura no mesmo meio e sob as mesmas condições até que as mesmas atinjam a confluência adequada, tipicamente, cerca de 80% de confluência de célula, com substituição do meio de cultura celular quando necessário. Após atingirem a confluência de célula desejada, as células podem ser expandidas por meio de passagens consecutivas com o uso de um agente de separação, tal como tripsina e inoculação numa superficie de cultura celular maior na densidade celular adequada (usualmente 2.000 a 10.000 células/cm2) . Assim, as células são, então, passadas pelo menos duas vezes em tal meio sem diferenciação, enquanto ainda retêm o seu fenótipo de desenvolvimento, e, com mais preferência, as células podem ser passadas pelo menos 10 vezes (por exemplo, pelo menos 15 vezes ou até pelo menos 20 vezes) sem perder o fenótipo de desenvolvimento. Tipicamente, as células são colocadas em placas numa densidade desejada, tal como entre cerca de 100 células/cm2 a cerca de 100.000 células/cm2 (tal como cerca de 500 células/cm2 a cerca de 50.000 células/cm2, ou, mais particularmente, entre cerca de 1.000 células/cm2 a cerca de 20.000 células/cm2). Se forem colocadas em placas a densidades menores (por exemplo, cerca de 300 células/cm2), as células podem ser mais facilmente isoladas por clonagem. Por exemplo, após alguns dias, as células colocadas em placas em tais densidades proliferarão numa população homogénea. Numa revelação particular, a densidade celular está entre 2.000 a 10.000 células/cm2.

As células que permanecem aderidas à superfície sólida após tal tratamento compreendendo pelo menos duas passagens são selecionadas, e o fenótipo de interesse é analisado por métodos convencionais a fim de confirmar a identidade das células reveladas por este documento conforme será mencionado abaixo. As células que permanecem aderidas à superfície celular após a primeira passagem são de origem heterogénea; portanto, as ditas células devem ser submetidas a pelo menos outra passagem. Como um resultado do método acima, uma população de células homogénea que tem o fenótipo de interesse é obtida. 0 Exemplo 1 descreve de uma maneira detalhada o isolamento das células reveladas por este documento do tecido adiposo humano e do tecido cartilaginoso humano.

Usualmente, as células que permanecem aderidas à superfície sólida após a segunda passagem mostram o fenótipo de interesse, embora isso tenha que ser confirmado para que as células possam ser usadas de acordo com a invenção. Portanto, a adesão das células à superfície sólida após pelo menos duas passagens constitui uma revelação preferencial deste documento para selecionar as células reveladas por este documento. A confirmação do fenótipo de interesse pode ser executada com o uso de meios convencionais.

Os marcadores de superfície celular podem ser identificados por qualquer tecnologia convencional adequada, usualmente com base numa seleção positiva/negativa; por exemplo, anticorpos monoclonais contra marcadores de superfície celular, cuja presença/ausência nas células tem de ser confirmada, podem ser usados, embora outras tecnologias também possam ser usadas. Assim, numa revelação particular, os anticorpos monoclonais contra um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou, de preferência, todos dentre CDllb, CDllc, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34 e CD133 são usados a fim de confirmar a ausência dos ditos marcadores nas células selecionadas; e os anticorpos monoclonais contra um, dois, três, quatro ou, de preferência, todos dentre CD9, CD44, CD54, CD90 e CD105 são usados a fim de confirmar a presença dos mesmos ou niveis de expressão detetáveis de, pelo menos um, e, de preferência, de todos os ditos marcadores. Os referidos anticorpos monoclonais são conhecidos, comercialmente disponíveis, ou podem ser obtidos por um perito na técnica por métodos convencionais. A atividade de IDO induzivel por IFN-γ nas células selecionadas pode ser determinada por qualquer ensaio convencional. Por exemplo, as células selecionadas podem ser estimuladas com IFN-γ e analisadas quanto à expressão de IDO; então, a análise por Western-blot convencional quanto à expressão de proteína de IDO pode ser realizada, e a atividade da enzima IDO após a estimulação com IFN-γ das células selecionadas pode ser medida pela conversão de triptofano em quinurenina, por exemplo, por meio da análise por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) e da determinação fotométrica da concentração de quinurenina no sobrenadante conforme a leitura. Já que as células reveladas por este documento manifestam IDO sob determinadas condições, qualquer tecnologia adequada que permita a deteção da atividade de IDO após a estimulação com IFN-γ pode ser usada para selecionar as células reveladas por este documento. Um ensaio adequado para determinar a atividade de IDO induzivel por IFN-γ nas células selecionadas é revelado no Exemplo 2. A quantidade de IDO produzida depende do número de células por centímetro quadrado que está, de preferência, a um nivel de 5.000 células/cm2 ou mais, mas não se limitando a esta concentração e da concentração de IFN-γ que é, idealmente, 3 ng/ml ou mais, mas não se limitando a esta concentração. A atividade de IDO produzida sob as condições descritas resultará numa produção detetável da quinurenina na faixa de μΜ após 24 horas ou mais. A capacidade das células selecionadas se diferenciarem em pelo menos duas linhagens de células pode ser analisada por métodos convencionais conforme conhecido na técnica.

As células e populações de células descritas pelo presente documento podem ser expandidas por clonagem, ser for desejado, com o uso de um método adequado para clonar populações de células. Por exemplo, uma população proliferada de células pode ser fisicamente coletada e inoculada numa placa separada (ou na cavidade de uma placa de múltiplas cavidades). Em alternativa, as células podem ser subclonadas numa placa de múltiplas cavidades a uma razão estatistica para facilitar o plaqueamento de uma única célula em cada cavidade (por exemplo, de cerca de 0,1 a cerca de 1 célula/cavidade ou até cerca de 0,25 a cerca de 0,5 célula/cavidade, tal como 0,5 célula/cavidade). Certamente, as células podem ser clonadas colocando as mesmas em placas a uma baixa densidade (por exemplo, numa placa de Petri ou outro substrato adequado) e isolando as mesmas de outras células com o uso de dispositivos, tais como anéis de clonagem. A produção de uma população clonal pode ser expandida em qualquer meio de cultura adequado. Em qualquer evento, as células isoladas podem ser cultivadas a um ponto adequado em que o seu fenótipo de desenvolvimento pode ser avaliado.

Investigações adicionais executadas pelos inventores mostraram que a expansão ex vivo das células reveladas por este documento sem induzir a diferenciação pode ser realizada por períodos de tempo alargados, por exemplo, com o uso de lotes de soro adequado especialmente triados (tal como soro humano ou soro bovino fetal) . Os métodos para medir a viabilidade e o rendimento são conhecidos na técnica (por exemplo, exclusão de azul de tripano).

Qualquer uma das etapas e procedimentos para isolar as células da população de células revelada por este documento pode ser realizada manualmente, se for desejado. Em alternativa, o processo de isolar tais células pode ser facilitado e/ou automatizado através de um ou mais dispositivos adequados, cujos exemplos são conhecidos na técnica.

Usos das células da invenção

As células reveladas por este documento podem ser usadas para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, incluindo, porém sem limitação, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e rejeição de órgãos e tecidos transplantados. Assim, noutro aspeto, a invenção refere-se a uma população de células isolada do tecido adiposo distinguidas pelo fato de que as células da referida população de células: i) não manifestam, pelo menos, um marcador específico para células de apresentação de antígeno (APC), em que o marcador específico para APC é CDllb, CDllc, CD14, CD45 ou HLAII, ii) não manifestam indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente, iii) manifestam IDO mediante a estimulação com interferão-gama (IFN-γ) e, iv) apresentam a capacidade de serem diferenciadas em, pelo menos, duas linhagens celulares para uso como um medicamento. Numa modalidade particular, os medicamentos que contêm as células reveladas por este documento podem ser usadas para induzir tolerância a transplante, ou para tratar e, assim, aliviar os sintomas de distúrbios autoimunes ou inflamatórios, ou a rejeição de órgãos e tecidos transplantados, num indivíduo que sofre de qualquer um dos ditos distúrbios ou doenças. Assim, a população de células isolada de acordo com este aspeto deste documento pode ser usada para tratar terapêutica ou profilaticamente e, assim, alivar os sintomas de distúrbios autoimunes ou inflamatórios num indivíduo que sofre de qualquer um dos ditos distúrbios, ou alivar os sintomas de doenças imunologicamente mediadas num indivíduo que sofre das doenças referidas.

Conforme usado no presente documento, os termos "distúrbio" e "doença" são usados de forma intercambiável para se referirem a uma afeção num indivíduo. Em particular, o termo "doença autoimune" é usado de modo intercambiável com o termo "distúrbio autoimune" para se referir a uma afeção num indivíduo distinguido por lesão celular, de tecido e/ou órgão causada por uma reação imunológica do indivíduo a suas próprias células, tecidos e/ou órgãos. 0 termo "doença inflamatória" é usado de forma intercambiável com o termo "distúrbio inflamatório" para se referir a uma afeção num indivíduo distinguida pela inflamação, de preferência, inflamação crónica. Os distúrbios autoimunes podem ser associados à inflamação ou não. Além disso, a inflamação pode ser causada por um distúrbio autoimune ou não. Assim, determinados distúrbios podem ser distinguidos como distúrbios autoimunes e inflamatórios.

Os mecanismos pelos quais determinadas afeções podem resultar em autoimunidade em alguns indivíduos não são geralmente bem entendidos, mas podem envolver fatores genéticos e extrínsecos. Por exemplo, bactérias, vírus ou fármacos podem desempenhar um papel na ativação de uma resposta autoimune num indivíduo que já tem uma predisposição genética ao distúrbio autoimune. Foi sugerido, por exemplo, que os indivíduos com determinadas alergias comuns são mais suscetíveis a distúrbios autoimunes.

Praticamente qualquer doença autoimune, distúrbio inflamatório ou doença imunologicamente mediada pode ser tratada com as células reveladas por este documento. Os exemplos ilustrativos que não limitam as ditas doenças e distúrbios que podem ser tratados são aqueles anteriormente listados sob o cabeçalho "Definições". Numa modalidade particular, a dita doença inflamatória é uma doença inflamatória crónica, tal como, por exemplo, IBD ou RA.

Noutro aspeto, a presente invenção refere-se ao uso de uma população de células isolada do tecido adiposo distinguidas pelo fato de que as células da dita população de células: i) não manifestam pelo menos um marcador específico para células de apresentação de antígeno (APC), em que o marcador específico para APC é CDllb, CDllc, CD14, CD45 ou HLAII, ii) não manifestam indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente, iii) manifestam IDO mediante a estimulação com interferão-gama (IFN-γ) e, iv) apresentam a capacidade de serem diferenciadas em pelo menos duas linhagens celulares para a preparação de um medicamento para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, incluindo, porém sem limitação, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e rejeição de órgãos e tecidos transplantados. Assim, a invenção refere-se adicionalmente ao uso desta população de células isolada do tecido adiposo para a preparação de um medicamento para suprimir a resposta imunológica, ou para induzir tolerância a transplante, ou para tratar doenças autoimunes, ou para tratar distúrbios inflamatórios. Os exemplos das ditas doenças autoimunes e doenças inflamatórias foram anteriormente mencionados. Numa modalidade particular, a doença é uma doença inflamatória, tal como uma doença inflamatória crónica, por exemplo, IBD ou RA.

Noutro aspeto, a presente invenção refere-se ao uso de uma população de células isolada do tecido adiposo distinguidas pelo fato de que as células da dita população de células: i) não manifestam, pelo menos, um marcador específico para células de apresentação de antígeno (APC), em que o marcador específico para APC é CDllb, CDllc, CD14, CD45 ou HLAII, ii) não manifestam indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente, iii) manifestam IDO mediante a estimulação com interferão-gama (IFN-γ), e iv) apresentam a capacidade de serem diferenciadas em pelo menos duas linhagens celulares para a preparação ou geração in vitro de células T reguladoras (T-reg), isto é, células que suprimem ativamente a ativação do sistema imunológico e impedem a autorreatividade patológica, isto é, uma doença autoimune. Células T-reg

Este documento revela adicionalmente células T reguladoras (T-reg), isto é, células (incluindo Foxp3+CD4+CD25+ T-reg e células Trl que produzem IL-10/TGFb) que suprimem ativamente a ativação do sistema imunológico e impedem a autorreatividade patológica, isto é, uma doença autoimune, obteníveis a partir das células reveladas pelo documento, doravante referidas como células T-reg reveladas pelo documento.

Assim, noutro aspeto, a presente invenção refere-se a um método para o isolamento de uma população de células T-reg revelada pelo documento que compreende: (a) colocar uma população de células isolada do tecido adiposo em contacto com leucócitos sanguíneos periféricos, em que as células da dita população de células i) não manifestam pelo menos um marcador específico para células de apresentação de antígeno (APC), em que o marcador específico para APC é CDllb, CDllc, CD14, CD45 ou HLAII, ii) não manifestam indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente, iii) manifestam IDO mediante a estimulação com interferão-gama (IFN-γ) e, iv) apresentam a capacidade de serem diferenciadas em pelo menos duas linhagens celulares e (b) selecionar a população de células T-reg revelada pelo documento.

Consequentemente, as células reveladas por este documento podem ser usadas para produzir um subconjunto de células T, as células T-reg reveladas por este documento, que constitui uma revelação adicional do presente documento. As células T-reg reveladas por este documento podem ser isoladas por meios convencionais conhecidos por um perito na técnica.

As células T-reg reveladas por este documento podem ser usadas para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, incluindo, porém sem limitação, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e doenças mediadas imunologicamente incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados. 0 dito uso constitui uma revelação adicional do presente documento.

Assim, noutra revelação, as células T-reg reveladas por este documento são usadas como um medicamento. Numa revelação particular, os medicamentos que contêm as células T-reg reveladas por este documento podem ser usadas para induzir tolerância a transplante, ou para tratar e, assim, aliviar os sintomas de distúrbios autoimunes ou inflamatórios, ou doenças imunologicamente mediadas incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados, num indivíduo que sofre de qualquer um dos ditos distúrbios ou doenças. Assim, as células T-reg reveladas por este documento podem ser usadas para tratar terapêutica ou profilaticamente e aliviando, assim, os sintomas de distúrbios autoimunes ou inflamatórios num indivíduo que sofre de qualquer um dos ditos distúrbios ou alivar os sintomas de doenças imunologicamente mediadas num indivíduo que sofre das ditas doenças.

Praticamente qualquer doença autoimune, distúrbio inflamatório ou doença imunologicamente mediada, pode ser tratada com as células T-reg reveladas por este documento. Os exemplos ilustrativos que não limitam as ditas doenças e os distúrbios que podem ser tratados são aqueles anteriormente listados sob o cabeçalho "Definições". Numa revelação particular, a dita doença inflamatória é uma doença inflamatória crónica, tal como, por exemplo, IBD ou RA.

Noutra revelação, o presente documento revela o uso das células T-reg reveladas por este documento para a preparação de um medicamento para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, incluindo, porém, sem limitação, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e doenças mediadas imunologicamente que incluem a rejeição de órgãos e tecidos transplantados. Assim, este documento descreve adicionalmente o uso de células T-reg reveladas por este documento para a preparação de um medicamento para suprimir a resposta imunológica, ou para induzir tolerância a transplante, ou para tratar doenças autoimunes, ou para tratar distúrbios inflamatórios. Os exemplos das ditas doenças autoimunes e doenças inflamatórias foram anteriormente mencionados. Numa revelação particular, a doença é uma doença inflamatória, tal como uma doença inflamatória crónica, por exemplo, IBD ou RA.

Este documento também revela o uso das populações de células reveladas por este documento na produção de células T-reg específicas para um antígeno ou grupo de antígenos escolhido, e o uso das mesmas no tratamento de doenças ou distúrbios relacionados com este antígeno ou grupo de antígenos. Os exemplos de tais antígenos são aqueles que desempenham um papel em doenças autoimunes, tais como, por exemplo, artrite reumatoide, doença de Crohn, reação de hipersensibilidade Tipo IV, lúpus, psoríase e outros distúrbios autoimunes conhecidos na técnica e descritos noutra parte do presente documento. Sucintamente, as populações de células reveladas por este documento são cultivadas in vitro na presença de um antígeno escolhido, grupo de antígenos ou tipos de célula manifestando e/ou apresentando este antígeno ou antígenos. As células reveladas por este documento podem ser opcionalmente pré-estimuladas com IFNy, LPS ou outros agentes ativadores conhecidos na técnica. Após um período de cultura de cerca de 2, 4, 6, 12, 24, 48 ou mais horas, de preferência, entre cerca de 12 a cerca de 24 horas, a população de células revelada por este documento é adicionalmente cocultivada, opcionalmente após a remoção do antígeno, grupo de antígenos ou células carregando o dito antígeno, com leucócitos de sangue periférico obtidos a partir de um indivíduo. Este cocultivo resultará na produção de células T-reg específicas para o antígeno escolhido que pode ser usado para o tratamento do indivíduo. Opcionalmente, estas células T-reg podem ser expandidas em número ex vivo usando tecnologias de cultura conhecidas na técnica antes de serem administradas ao paciente. Sem se aterem à teoria, os Inventores acreditam que as populações de células reveladas por este documento têm a capacidade de apresentar o antígeno escolhido por meio de HLA Classe II na superfície celular (parecendo induzido por IFNy) aos leucócitos de sangue periférico de modo a que as células T-reg sejam aumentadas e/ou ativadas dentro da população de leucócitos de sangue periférico. Conforme mostrado no Exemplo 11, os Inventores demonstraram que as populações de células reveladas por este documento têm a capacidade de fagocitar moléculas de peso molecular pequeno e, assim, têm a capacidade de apresentar tais moléculas após a estimulação com IFNy por meio de moléculas de HLA Classe II. Acredita-se que a apresentação do antígeno escolhido por meio deste mecanismo com a interação com os leucócitos de sangue periférico resulte na produção de células T-reg descrita acima. Como uma metodologia de tratamento alternativo, conforme descrito no Exemplo 7, uma população de células revelada por este documento é administrada diretamente in vivo sem qualquer cocultivo e pode gerar células T-reg específicas que, por sua vez, podem tratar um distúrbio.

Assim, o documento descreve um método in vitro para obter células T-reg específicas para um antígeno ou grupo de antígenos escolhido que compreende: (a) colocar uma população de células revelada por este documento em contacto com o dito antígeno ou grupo de antígenos escolhido; (b) colocar a dita população de células em contacto com leucócitos de sangue periférico; (c) selecionar uma população de células T-reg especificas para o dito antigeno ou grupo de antigenos escolhido.

Este documento também descreve o uso das células T-reg especificas da etapa (c) no tratamento de doenças e distúrbios relacionados com o referido antigeno ou grupos de antigenos escolhidos pela administração das ditas células T-reg ao indivíduo, do qual os leucócitos de sangue periférico foram obtidos. A população de células revelada por este documento, conforme usado neste método, pode ser do indivíduo (autólogo) ou de um doador (alogénico). Células Irradiadas da invenção

Se desejado, as células reveladas por este documento podem ser irradiadas usando uma fonte controlada adequada de radiação ionizante, tal como um dispositivo irradiador gama. As condições de irradiação devem ser experimentalmente ajustadas por um perito na técnica para determinar o tempo de exposição exigido para conferir uma dose de radiação que cause a interrupção do crescimento a longo prazo das células reveladas por este documento. A dita dose de radiação pode ser, por exemplo, 1 a 100, 5 a 85, 10 a 70, 12 a 60 Gy, ou com mais preferência, 15 a 45 Gy. Já que as células reveladas por este documento podem ser usadas para usos terapêuticos, a irradiação das células reveladas por este documento antes da administração ao indivíduo pode ter um resultado benéfico, já que o dito tratamento com irradiação torna as células incapazes de proliferar ou sobreviver por longos períodos de tempo no indivíduo. As referidas células irradiadas constituem uma revelação adicional do presente documento.

As células irradiadas reveladas por este documento podem ser usadas para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, incluindo, porém sem limitação, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e doenças mediadas imunologicamente, incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados. 0 dito uso constitui uma revelação adicional do presente documento.

Assim, noutra revelação, as células irradiadas reveladas por este documento são usadas como um medicamento. Numa revelação particular, os medicamentos contendo as células irradiadas reveladas por este documento podem ser usadas para induzir tolerância a transplante, ou para tratar e, assim, aliviar os sintomas de distúrbios autoimunes ou inflamatórios, ou doenças imunologicamente mediadas incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados, num indivíduo que sofre de qualquer um dos ditos distúrbios ou doenças. Assim, as células irradiadas reveladas por este documento podem ser usadas para tratar terapêutica ou profilaticamente e aliviando, assim, os sintomas de distúrbios autoimunes ou inflamatórios num indivíduo que sofre de qualquer um dos ditos distúrbios, ou alivar os sintomas de doenças imunologicamente mediadas num indivíduo que sofre das ditas doenças.

Praticamente qualquer doença autoimune, distúrbio inflamatório ou doença imunologicamente mediada, pode ser tratada com as células irradiadas reveladas por este documento. Os exemplos ilustrativos não limitadores das ditas doenças e distúrbios que podem ser tratados são aqueles anteriormente listados sob o cabeçalho "Definições". Numa revelação particular, a dita doença inflamatória é uma doença inflamatória crónica, tal como, por exemplo, IBD ou RA.

Noutra revelação, o presente documento refere-se ao uso das células irradiadas reveladas por este documento para a preparação de um medicamento para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, incluindo, porém sem limitação, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e doenças mediadas imunologicamente incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados. Assim, este documento descreve adicionalmente o uso de células irradiadas reveladas por este documento para a preparação de um medicamento para suprimir a resposta imunológica, ou para induzir tolerância a transplante, ou para tratar doenças autoimunes, ou para tratar distúrbios inflamatórios. Os exemplos das ditas doenças autoimunes e doenças inflamatórias foram anteriormente mencionados. Numa revelação particular, a doença é uma doença inflamatória, tal como uma doença inflamatória crónica, por exemplo, IBD ou RA. Células pré-estimuladas com IFN-y da invenção

Também, se desejado, as células reveladas por este documento podem ser pré-estimuladas com IFN-γ. Os métodos para a pré-estimulação com IFN-γ são evidentes para àqueles peritos na técnica, e um procedimento é dado no Exemplo 2. De preferência, as células são pré-estimuladas usando uma concentração de IFN-γ entre 0,1 e 100, 0,5 e 85, 1 e 70, 1,5 e 50, 2,5 e 40 ng/ml ou, com mais preferência, 3 e 30 ng/ml, e um tempo de estimulação, de preferência, mais longo do que 12 horas, por exemplo, 13, 18, 24, 48, 72 horas ou mais. Já que as células reveladas por este documento podem ser usadas para usos terapêuticos, a pré-estimulação das células reveladas por este documento com IFN-γ antes da administração ao indivíduo pode ter um resultado benéfico, já que o período de tempo entre a administração de célula pré-estimulada com IFN-γ e a expressão de IDO no indivíduo pode ser reduzido.

Assim, noutra revelação, o presente documento descreve um método que compreende o tratamento das células reveladas por este documento com IFN-γ a fim de pré-estimular as ditas células. As células obteníveis de acordo com o dito método, doravante referidas como "células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento", constituem uma revelação adicional ao presente documento.

As células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento podem ser isoladas por meios convencionais conhecidos por um perito na técnica.

As células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento podem ser usadas para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, incluindo, porém sem limitação, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e doenças mediadas imunologicamente, incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados. 0 dito uso constitui uma revelação adicional do presente documento.

Assim, noutra revelação, as células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento são usadas como um medicamento. Numa revelação particular, os medicamentos contendo as células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento podem ser usadas para induzir tolerância a transplante, ou para tratar e, assim, aliviar os sintomas de distúrbios autoimunes ou inflamatórios, ou doenças imunologicamente mediadas incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados, num indivíduo que sofre de qualquer um dos ditos distúrbios ou doenças. Assim, as células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento podem ser usadas para tratar terapêutica ou profilaticamente e aliviando, assim, os sintomas de distúrbios autoimunes ou inflamatórios num indivíduo que sofre de qualquer um dos ditos distúrbios ou alivar os sintomas de doenças imunologicamente mediadas num indivíduo que sofre das ditas doenças.

Praticamente qualquer doença autoimune, distúrbio inflamatório ou doença imunologicamente mediada pode ser tratada com as células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento. Os exemplos ilustrativos não limitadores das ditas doenças e distúrbios que podem ser tratados são aqueles anteriormente listados sob o cabeçalho "Definições". Numa revelação particular, a dita doença inflamatória é uma doença inflamatória crónica, tal como, por exemplo, IBD ou RA.

Noutra revelação, o presente documento descreve o uso das células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento para a preparação de um medicamento para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um individuo é benéfica, incluindo, porém sem limitação, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e doenças mediadas imunologicamente incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados. Assim, este documento descreve adicionalmente o uso de células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento para a preparação de um medicamento para suprimir a resposta imunológica, ou para induzir tolerância a transplante, ou para tratar doenças autoimunes, ou para tratar distúrbios inflamatórios. Os exemplos das ditas doenças autoimunes e doenças inflamatórias foram anteriormente mencionados. Numa revelação particular, a doença é uma doença inflamatória, tal como uma doença inflamatória crónica, por exemplo, IBD ou RA. Células pré-estimuladas com IFN-y irradiadas da invenção e células irradiadas pré-estimuladas com IFN-y da invenção

Além disso, se desejado, as células reveladas por este documento podem ser submetidas aos tratamentos de irradiação e estimulação com IFN-γ, em qualquer ordem; isto é, as células reveladas por este documento podem ser submetidas primeiramente à irradiação, e as células resultantes podem ser subsequentemente submetidas à estimulação com IFN-γ, ou vice versa, as células reveladas por este documento podem ser primeiramente submetidas à estimulação com IFN-γ, e, subsequentemente, as células resultantes podem ser submetidas à irradiação.

Assim, numa revelação, as células reveladas por este documento podem ser pré-estimuladas com IFN-γ, e as células resultantes (células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas pelo documento) podem ser irradiadas para fornecer células irradiadas doravante referidas como "células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento".

Noutra revelação, as células reveladas por este documento podem ser irradiadas, e as células resultantes (as células irradiadas reveladas por este documento) podem ser pré-estimuladas com IFN-γ para fornecer células pré-estimuladas com IFN-γ, doravante referidas como "células irradiadas pré-estimuladas com IFN^reveladas por este documento".

Os métodos para a pré-estimulação de células com IFN-γ, assim como os métodos para irradiação de células são bem conhecidos por aqueles peritos na técnica, e alguns dos mesmos foram anteriormente mencionados acima. Qualquer um dos ditos métodos pode ser usado.

Assim, noutra revelação, o presente documento refere-se a um método que compreende submeter as células reveladas por este documento à (i) irradiação e (ii) estimulação com IFN-γ, em que os tratamentos (i) e (ii) podem ser executados em qualquer ordem, a fim de irradiar células pré-estimuladas com IFN-γ ou pré-estimular com INF- células irradiadas. As células obteníveis de acordo com o dito método, no presente documento referidas como "células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento" ou "células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento", respetivamente, constituem revelações adicionais do presente documento. As ditas células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento, assim como as ditas células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento podem ser isoladas por meios convencionais conhecidos por um perito na técnica. Já que as células reveladas por este documento podem ser usadas para usos terapêuticos, a administração a um indivíduo das células reveladas por este documento anteriormente submetidas à irradiação e estimulação com IFN-γ, em qualquer ordem, pode ter um resultado benéfico pelas razões anteriormente mencionadas (por exemplo, submetendo as células a um tratamento com irradiação para tornar as células incapazes de proliferar ou sobreviver por longos períodos de tempo no indivíduo, enquanto que a pré-estimulação das células com IFN-γ, antes da administração ao indivíduo, pode envolver uma redução no período de tempo entre a administração de células pré-estimuladas com IFN-γ e a expressão de IDO no indivíduo.

As células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento, assim como as células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento, podem ser usadas para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, incluindo, porém sem limitação, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e doenças mediadas imunologicamente incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados. 0 dito uso constitui uma revelação adicional do presente documento.

Assim, noutra revelação, as células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento, assim como as células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento são usadas como um medicamento. Numa revelação particular, os medicamentos contendo as células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento, ou as células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento, podem ser usadas para induzir tolerância a transplante, ou para tratar e, assim, aliviar os sintomas de distúrbios autoimunes ou inflamatórios, ou doenças imunologicamente mediadas incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados num indivíduo que sofre de qualquer um dos ditos distúrbios ou doenças. Assim, as células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento, assim como as células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento, podem ser usadas para tratar terapêutica ou profilaticamente e aliviando, assim, os sintomas de distúrbios autoimunes ou inflamatórios num indivíduo que sofre de qualquer um dos ditos distúrbios ou alivar os sintomas de doenças imunologicamente mediadas num indivíduo que sofre das ditas doenças.

Praticamente qualquer doença autoimune, distúrbio inflamatório ou doença imunologicamente mediada pode ser tratada com as células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento ou com as células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento. Os exemplos ilustrativos não limitadores das ditas doenças e distúrbios que podem ser tratados são aqueles anteriormente listados sob o cabeçalho "Definições". Numa revelação particular, a dita doença inflamatória é uma doença inflamatória crónica, tal como, por exemplo, IBD ou RA.

Noutra revelação, o presente documento descreve o uso das células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento, ou as células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento para a preparação de um medicamento para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a distúrbios em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, incluindo, porém sem limitação, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e doenças mediadas imunologicamente incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados. Assim, este documento refere-se adicionalmente ao uso das células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento ou das células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento para a preparação de um medicamento para suprimir a resposta imunológica, ou para induzir tolerância a transplante, ou para tratar doenças autoimunes, ou para tratar distúrbios inflamatórios. Os exemplos das ditas doenças autoimunes e doenças inflamatórias foram anteriormente mencionados. Numa revelação particular, a doença é uma doença inflamatória, tal como uma doença inflamatória crónica, por exemplo, IBD ou RA.

Composições farmacêuticas A presente invenção fornece composições farmacêuticas para o tratamento, a profilaxia e a melhoria de um ou mais sintomas associados a um distúrbio em que a modulação do sistema imunológico de um indivíduo é benéfica, tais como doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e rejeição de órgãos e tecidos transplantados.

Assim, noutro aspeto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica, doravante referida como a composição farmacêutica da invenção, compreendendo uma população de células isolada do tecido adiposo distinguida pelo fato de que as células da dita população de células i) não manifestam, pelo menos, um marcador especifico para células de apresentação de antigeno (APC), em que o marcador especifico para APC é CDllb, CDllc, CD14, CD45 ou HLAII, ii) não manifestam indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente, iii) manifestam IDO mediante a estimulação com interferão-gama (IFN-γ) e, iv) apresentam a capacidade de serem diferenciadas em, pelo menos, duas linhagens celulares e um veiculo farmaceuticamente aceitável para uso na prevenção, no tratamento ou na melhoria de um ou mais sintomas associados a doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios ou rejeição de órgãos e tecidos transplantados. A composição farmacêutica da invenção compreende uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos (isto é, a célula revelada pelo documento, ou uma célula T-reg revelada por este documento, ou uma célula irradiada revelada por este documento, ou uma célula pré-estimulada com IFN-γ revelada por este documento, ou uma célula pré-estimulada com IFN-γ irradiada revelada por este documento, ou uma célula irradiada pré-estimulada com IFN-γ revelada por este documento, ou uma combinação das mesmas) e um veiculo farmaceuticamente aceitável. Numa modalidade especifica, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual, ou listado na Farmacopeia dos EUA ou na Farmacopeia europeia ou noutra farmacopeia geralmente reconhecida para o uso em animais e, mais particularmente, em seres humanos. O termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou portador com o qual o agente terapêutico é administrado. A composição, se desejado, pode também conter pequenas quantidades de agentes de tamponamento de pH. Os exemplos de tais veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences", por E.W. Martin. Tais composições conterão uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de um agente profilático ou terapêutico, de preferência em forma purificada juntamente com uma quantidade adequada de veículo de modo a fornecer a forma para a administração adequada ao indivíduo. A formulação deve adaptar-se ao modo de administração. Numa modalidade preferencial, as composições farmacêuticas são estéreis e estão numa forma adequada para a administração a um indivíduo, de preferência, um indivíduo animal, com mais preferência, um indivíduo mamífero e, de preferência máxima, um indivíduo humano. A composição farmacêutica da invenção pode estar numa variedade de formas. As mesmas incluem, por exemplo, formas sólidas, semissólidas e liquidas, tais como preparações liofilizadas, soluções ou suspensões liquidas, soluções injetáveis ou infusiveis, etc. A forma preferencial depende do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica. A administração da população de células revelada por este documento, ou a composição farmacêutica compreendendo a mesma, ao indivíduo que precisa da mesma pode ser executada por meios convencionais. Numa modalidade particular, a dita população de células é administrada ao indivíduo por um método que envolve transferir as células para o tecido desejado, tanto in vitro (por exemplo, como um enxerto antes do implante ou enxerto) como in vivo, para o tecido animal diretamente. As células podem ser transferidas para o tecido desejado por qualquer método adequado que variará geralmente de acordo com o tipo de tecido. Por exemplo, as células podem ser transferidas para o enxerto banhando o enxerto (ou infundindo o mesmo) com o meio de cultura contendo as células. Em alternativa, as células podem ser inoculadas no sítio desejado dentro do tecido para estabelecer uma população. As células podem ser transferidas para sítios in vivo usando dispositivos tais como cateteres, trocartes, cânulas, stents (que podem ser inoculados com as células), etc.

As células reveladas por este documento podem ser irradiadas antes da administração ao indivíduo. Este tratamento torna as células incapazes de proliferar ou sobreviver por longos períodos de tempo no indivíduo. Assim, numa revelação particular, a composição farmacêutica da invenção compreende células irradiadas reveladas por este documento.

Também, as células reveladas por este documento podem ser pré-estimuladas com IFN-γ, antes da administração ao indivíduo a fim de reduzir o período de tempo entre a administração de células e a expressão de IDO no indivíduo. Assim, numa revelação particular, a composição farmacêutica da invenção compreende células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento.

Além disso, as células reveladas por este documento podem ser tanto irradiadas quanto pré-estimuladas com IFN-γ, em qualquer ordem, antes da administração ao indivíduo. Assim, numa revelação particular, a composição farmacêutica da invenção compreende células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento, ou células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento.

As populações de células reveladas por este documento e as composições farmacêuticas da invenção podem ser usadas numa terapia de combinação. Numa modalidade específica, a terapia de combinação é administrada a um indivíduo com um distúrbio inflamatório que é refratário a um ou mais agentes anti-inflamatórios. Noutra modalidade, a terapia de combinação é usada em conjunto com outros tipos de agentes anti-inflamatórios incluindo, porém sem limitação, fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), fármacos anti-inf lamatórios esteroidais, beta-agonistas, agentes anticolinérgicos e metil xantinas. Os exemplos de NSAIDs incluem, porém sem limitação, ibuprofeno, celecoxibe, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, indometacina, cetoralaco, oxaprozina, nabumentona, sulindaco, tolmentina, rofecoxibe, naproxeno, cetoprofeno, nabumetona, etc. Tais NSAIDs funcionam inibindo uma enzima ciclo-oxigenase (por exemplo, COX-1 e/ou COX-2). Os exemplos de fármacos anti-inflamatórios esteroidais incluem, porém sem limitação, glucocorticoides, dexametasona, cortisona, hidrocortisona, prednisona, prednisolona, triancinolona, azulfidina e eicosanoides, tais como tromboxanos e leucotrienos. Os anticorpos monoclonais, tais como infliximabe, podem também ser usados.

Em conformidade com a revelação acima, as terapias de combinação reveladas por este documento podem ser usadas antes, concomitantemente ou subsequentemente à administração de tais agentes anti-inflamatórios. Além do mais, tais agentes anti-inflamatórios não abrangem agentes caracterizados no presente documento como indutores de tecidos linfoides e/ou agentes imunomoduladores. Método para distinguir células multipotentes adultas de células diferenciadas A expressão de IDO mediante a estimulação com IFN-γ pode ser usada para distinguir as células que manifestam a dita enzima das células que não manifestam IDO.

Assim, noutra revelação, o documento descreve um método para distinguir células multipotentes adultas de células diferenciadas compreendendo a etapa de verificar se a célula multipotente expressa IDO mediante a estimulação com IFN-γ. A determinação de IDO mediante a estimulação com IFN-γ pode ser executada por qualquer tecnoloqia convencional; numa revelação, a determinação de IDO mediante a estimulação com IFN-γ pode ser executada conforme revelado no Exemplo 2.

Conforme anteriormente mencionado, as células da população de células revelada por este documento são distinguidas pelo fato de que as mesmas não manifestam IDO constitutivamente, mas apenas mediante a estimulação com IFN-γ. Além disso, com exceção de IFN-γ, nenhuma outra molécula pró-inflamatória tal como IL-1, TNF-α ou endotoxina tem a capacidade de induzir por si própria a expressão de IDO nas células da população de células revelada por este documento. Este recurso pode ser usado para distinguir as células da população de células revelada por este documento de outras células.

Kits

Noutro aspeto, o documento descreve um kit que compreende uma população de células contendo (i) as células reveladas por este documento e/ou (ii) as células T-reg reveladas por este documento e/ou (iii) as células irradiadas reveladas por este documento e/ou (iv) as células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento e/ou (v) as células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento e/ou (vi) as células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento. Os kits revelados por este documento podem compreender um, dois, três, quatro, cinco ou todos tais tipos de célula. Métodos de tratamento

Noutra revelação, o presente documento descreve o uso de uma população de células contendo as células reveladas por este documento, a população de células T-reg revelada por este documento, as células irradiadas reveladas por este documento, as células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento, as células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento, ou as células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios ou doenças imunologicamente mediadas, incluindo a rejeição de órgãos e tecidos transplantados. Numa revelação particular, as ditas populações de células podem ser usadas para induzir tolerância a transplante, ou para tratar e, assim, aliviar os sintomas de distúrbios autoimunes ou inflamatórios ou doenças imunologicamente mediadas num indivíduo que sofre dos ditos distúrbios ou doenças. Os exemplos das ditas doenças autoimunes e doenças inflamatórias foram anteriormente mencionados. Numa revelação particular, a doença é uma doença inflamatória, tal como uma doença inflamatória crónica, por exemplo, IBD ou RA.

Noutra revelação, o presente documento descreve métodos para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios ou doenças imunologicamente mediadas num indivíduo que sofrem dos ditos distúrbios, ou doenças que consistem em administrar ao dito indivíduo que precisa de tal tratamento uma quantidade profilática ou terapeuticamente de uma população de células contendo células reveladas por este documento, células T-reg reveladas por este documento, células irradiadas reveladas por este documento, células pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento, células pré-estimuladas com IFN-γ irradiadas reveladas por este documento, ou células irradiadas pré-estimuladas com IFN-γ reveladas por este documento. Numa revelação particular, as ditas populações de células podem ser usadas para induzir tolerância a transplante, ou para tratar e, assim, aliviar os sintomas de distúrbios autoimunes ou inflamatórios ou doenças imunologicamente mediadas num individuo que sofre dos ditos distúrbios ou doenças. Os exemplos das ditas doenças autoimunes e doenças inflamatórias foram anteriormente mencionados. Numa revelação particular, a doença é uma doença inflamatória, tal como uma doença inflamatória crónica, por exemplo, IBD ou RA.

EXEMPLOS A invenção será agora descrita mais detalhadamente, por meio de exemplos que não se destinam, de nenhum modo, a limitar o escopo da invenção, mas que, em vez disso, servirão para ilustrar a invenção em referência às figuras anexas. EXEMPLO 1

Isolamento e expansão das células reveladas pelo documento I. Material e Métodos

Isolamento das células reveladas por este documento do tecido adiposo 0 tecido adiposo humano foi obtido por lipoaspiração, sob anestesia local e sedação geral. Uma cânula com ponta romba oca foi introduzida no espaço subcutâneo através de uma pequena incisão (menos do que 0,5 cm de diâmetro) . Com sucção suave, a cânula foi movida através do compartimento de parede abdominal do tecido adiposo para a rutura mecânica do tecido gorduroso. Uma solução salina e a epinefrina vasoconstritora foram injetadas no compartimento de tecido adiposo para minimizar a perda de sangue. Deste modo, 80 a 100 ml de lipoaspirado cru foram obtidos a partir de cada paciente a ser tratado. O lipoaspirado cru foi lavado extensivamente com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS; Gibco BRL, Paisley, Escócia, Reino Unido) para remover as células sanguíneas, a solução salina e o anestésico local. A matriz extracelular foi digerida com uma solução de colagenase tipo II (0,075%; Gibco BRL) numa solução de sal equilibrada (5 mg/ml; Sigma, St. Louis, EUA) por 30 minutos a 37 °C para liberar a fração celular. Então, a colagenase foi inativada pela adição de um volume igual de meio de cultura celular (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco BRL) que continha soro fetal bovino 10% (FBS; Gibco BRL). A suspensão de células foi centrifugada a 250 x g por 10 minutos. As células foram ressuspensas em NPUCl a 0,16 M e deixadas repousar por 5 minutos à temperatura ambiente (TA) para a lise dos eritrócitos. A mistura foi centrifugada a 250 x g, e as células foram ressuspensas em DMEM mais FBS 10% e mistura de ampicilina/estreptomicina 1% (Gibco BRL), e, então, as mesmas foram filtradas através de uma malha de 40 ym e foram colocadas em placas em frascos para cultura de tecidos a uma concentração de 10 a 30 x 103 células/cm2.

Isolamento das células reveladas por este documento da cartilagem articular A cartilagem articular hialina humana foi obtida a partir da articulação do joelho de um doador por meio de técnicas artroscópicas. Cerca de 4 cm2 de cartilagem foram retirados da margem externa do côndilo femoral, mas o tamanho da biópsia pode variar dependendo da idade do doador, da estrutura da articulação e da consideração do cirurgião. A biópsia foi suspensa numa solução salina estéril e armazenada a 3 a 8 °C até ser usada. As amostras de cartilagem vivas não devem ser armazenadas por mars do que 48 horas. A biópsia de cartilagem foi transferida para 1 ml do meio de cultura celular estéril contendo FBS 1% e fracionada para obter fragmentos de tecido tão pequenos quanto possivel. Os fragmentos de cartilagem resultantes foram suspensos num meio similar contendo colagenase 0,1% (em p/v) e incubados a 37 °C com agitação continua e suave. Após a digestão, a suspensão de células obtida foi filtrada através de uma malha de 40 mm, e as células foram colocadas em placas em frascos para cultura de tecidos a uma concentração de 10 a 30 x 103 células/cm2.

Expansão ex vivo de células

As células do tecido adiposo e da cartilagem articular foram cultivadas separadamente por 24 horas a 37 °C numa atmosfera de CO2 a 5% no ar. Então, os frascos para cultura foram lavados com PBS para remover as células e os fragmentos de células não aderentes. As células foram mantidas em cultura no mesmo meio e sob as mesmas condições até que as mesmas atingissem aproximadamente 8 0% de confluência, com a substituição do meio de cultura a cada 3 a 4 dias. As células foram, então, passadas com tripsina-EDTA (Gibco BRL) a uma diluição de 1:3 que corresponde a uma densidade celular de aproximadamente cerca de 5 a 6xl03 células/cm2. A cinética de crescimento celular das células isoladas do tecido adiposo humano e cultivadas ex vivo para mais do que 25 duplicações de população de células é mostrada na Figura 1.

Caracterização de célula A caracterização de célula foi realizada com o uso de células nas passagens de cultura 1 a 25. Células do tecido adiposo e da cartilagem articular foram analisadas por meio de citometria de fluxo com o uso de anticorpos identificados com um marcador fluorescente (isto é, por imunocitometria de fluorescência) quanto à presença/ausência de uma série de marcadores de superfície que incluíram: - Marcadores de células de apresentação de antígeno (APCs): CDllb, CDllc, CD14, CD45 e HLAII. - Marcadores de células endoteliais: CD31. - Outros marcadores: CD9, CD34, CD90, CD44, CD54, CD105 e CD133.

Os anticorpos usados no ensaio de citometria de fluxo foram os seguintes: - CD9: anticorpo identificado com FITC - IgG2b de clone de murganho MM2/57 (Serotec); - CDllb: anticorpo identificado com FITC - IgGl de clone de murganho ICRF44 (Serotec); - CDllc: anticorpo identificado com FITC - IgGl de clone de murganho BU15 (Serotec); - CD14: anticorpo identificado com FITC - IgG2a de clone de murganho UCHM1 (Serotec); - CD31: anticorpo identificado com FITC - IgGl de clone de murganho WM59 (Serotec); - CD34: anticorpo identificado com FITC - IgGl de clone de murganho QBEND 10 (Serotec); - CD44: anticorpo identificado com FITC - IgG2a de clone de murganho F10-44-2 (Serotec); - CD45: anticorpo identificado com FITC - IgG2a clone de murganho F10-89-4 (Serotec); - CD54: anticorpo identificado com FITC - IgGl de clone de murganho 15.2 (Serotec); - CD90: anticorpo identificado com FITC - IgGl de clone de murganho F15-42-1 (Serotec); - CD105: anticorpo identificado com FITC - IgGl de clone de murganho e SN6 (Serotec); e DP, DQ, DR de HLA classe II anti-humano: anticorpo identificado com FITC -IgG2a de clone de murganho WR18 (Serotec); - CD 133: anticorpo identificado com PE - IgG2b clone de murganho 293C3 (Miltenyi Biotec). II. Resultados

Os resultados são coletados na Figura 2, que mostra que as células analisadas foram positivas para CD9, CD44, CD54, CD90 e CD105 e negativas para CDllb, CDllc, CD14, CD31, CD34, CD45, CD 133 e HLAII. As células foram negativas para todos os marcadores testados que são específicos para as linhagens endoteliais ou de APC (CDllb, CDllc, CD14, CD45 e HLAII).

Exemplo 2

Indução de indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) por interferão-gama (IFN-y) I. Material e Métodos

As células reveladas por este documento isoladas do tecido adiposo humano (Exemplo 1) foram inoculadas em placas de cultura de tecido a uma densidade de 10.000 células/cm2 e incubadas por 48 horas nas condições anteriormente descritas para expansão celular. Então, diferentes estímulos pró-inflamatórios foram adicionais ao meio de cultura incluindo: • Interleucina-1 (IL-1): 3 ng/ml • Interferão-gama (IFN-γ) : 3 ng/ml • Fator alfa de necrose tumoral (TNF-cx) : 5 ng/ml • Lipopolissacarídeo (LPS): 100 ng/ml

As células foram incubadas na presença do estimulo correspondente por períodos na faixa de 30 minutos a 48 horas e, então, as mesmas foram coletadas pela digestão de tripsina e lisadas em tampão RIPA (Tris-HCl a 50 mM pH 7,4, NaCl a 150 mM, PMSF a 1 mM (fenil-metilsulfonilfluoreto) , EDTA a 1 mM (ácido etilenodiaminatetra-acético), 5 yg/ml de Aprotinina, 5 mg/ml de Leupeptina, Triton x-100 1%, deoxicolato de sódio 1%, SDS 0,1%) contendo inibidores de protease. Os lisados celulares foram, então, usados numa experiência de western blot com o uso de um anticorpo monoclonal específico para IDO (IgG monoclonal de clone de murganho 10.1, junto à Upstate cell signaling solutions). Também, o RNA foi isolado das células tratadas e testado por experiências de reação em cadeia de polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR) com o uso de iniciadores especificos para o cDNA de IDO (n° de acesso ao GenBank M34455 (GI:185790)) direto 5' GGATTCTTCCTGGTCTCTCTATTGG 3T; inverso 5' CGGACTGAGGGATTTGACTCTAATG 3'). II. Resultados

Os resultados desta experiência [Figura 3A (RTPCR) e 3B (western blotting)] mostram que as células fornecidas pelo presente documento não manifestam IDO constitutivamente. O mRNA de IDO é induzido após 2 horas de estimulação com IFN-γ, mas a expressão da proteina pode apenas ser detetada entre 8 a 24 horas de indução.

Resultados similares foram obtidos quando as células reveladas por este documento foram isoladas de outros tecidos humanos, incluindo: medula óssea, cartilagem articular e pele (Figura 4). EXEMPLO 3

Comportamento tumorigénico I. Material e Métodos

Esta experiência foi realizada com as células reveladas por este documento isoladas do tecido adiposo humano conforme descrito no Exemplo 1. As amostras de células foram cultivadas por 2 a 7 semanas antes da implantação subcutânea em murganhos imunodeficientes (5 χ 106 células/murganhos). Os murganhos foram de cepa nu/nu obtida junto à Charles River Laboratories. Os murganhos não tinham timo e eram deficientes de célula T. Os murganhos implantados foram acompanhados por 4 meses antes do sacrifício e estudo patológico.

Estudo patológico: Uma necropsia foi realizada em todos os animais. Os animais foram examinados quanto às grandes anormalidades no cérebro, pulmões, coração, figado, rins, baço, nódulos linfáticos abdominais e sitio de injeção. Os tecidos foram coletados para um exame histológico (seção de parafina e manchamento com hematoxilina-eosina (H&E)), incluindo o sitio de injeção, pulmões e nódulos linfáticos. A linhagem celular de teratoma (N-TERA) foi usada como um controlo positivo que foi implantado sob condições idênticas. II. Resultados

Os resultados mostram que, enquanto que todos os murganhos implantados com células de teratoma desenvolveram tumores após algumas semanas, nenhum dos animais implantados com células reveladas por este documento desenvolveu tumores dentro dos primeiros 4 após a implantação [dados não mostrados]. EXEMPLO 4

Tratamento de IBP induzida experimentalmente em murganhos I. Materiais e Métodos

Foi induzida colite em murganhos Balb/c (6 a 8 semanas de vida, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) conforme previamente descrito (Neurath, M.F., et al. 1995.

Antibodies to IL- 12 abrogate established experimental colitis in mice. J. Exp. Med. 182, 1.281 a 1.290). Em suma, os murganhos foram ligeiramente anestesiados com halotano, e um cateter 3.5 F foi inserido por via intrarretal 4 cm a partir do ânus. Para induzir a colite, 100 μΐ de 50 ou 30 mg/ml de TNBS (ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfónico) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) em etanol a 50% (para romper a barreira epitelial intestinal) foram administrados lentamente no lúmen por meio do cateter preenchido a uma seringa de 1 ml. Os murganhos de controlo receberam etanol a 50% apenas (100 μΐ) . Os animais foram tratados por via intrarretal com números diferentes das células reveladas por este documento obtidas a partir de tecido adiposo humano conforme descrito no Exemplo 1 (0,3 x 106 e 1 x 1°6 células, suspensas em solução salina tamponada com fosfato, PBS) 12 horas após a instilação de TNBS. Em algumas experiências, as ditas células foram pré-tratadas com 200 U/ml de IFN-γ por 24 horas antes da injeção. Os animais foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência, aparecimento de diarreia e perda de peso corporal (Figuras 5, 6 e 7) . II. Resultados

Conforme mostrado na Figura 5, ouve um aprimoramento dependente de dose de peso aumentado após a administração das células reveladas pelo documento. De fato, uma dependência de dose pode ser observada na Figura 6 com 1 x 106 células, mostrando um efeito mais forte que 0,3 x 106 células. Em ambos os casos, as células aprimoraram a taxa de sobrevivência dos murganhos tratados com TNBS significativamente.

Além do mais, as células pré-estimuladas com IFN-γ mostraram uma recuperação mais rápida e mais forte do tratamento com TNBS do que células não pré-estimuladas (Figura 7). O gráfico mostra que os murganhos tratados com TNBS perderam peso dramaticamente e mostra uma clara melhoria nos murganhos que receberam células. EXEMPLO 5

Tratamento de doença intestinal inflamatória (IBP) induzida experimentalmente em murganhos - experiências adicionais: I. Materiais e Métodos

Numa extensão das mesmas experiências do Exemplo 4, foi induzida colite em murganhos Balb/c (6 a 8 semanas de vida, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) conforme previamente descrito (Neurath, M.F., et al. 1995. Antibodies to IL- 12 abrogate established experimental colitis in mice. J. Exp. Med. 182, 1.281 a 1.290). Em suma, os murganhos foram ligeiramente anestesiados com halotano, e um cateter 3.5 F foi inserido por via intrarretal 4 cm a partir do ânus. Para induzir a colite, 100 μΐ de 50 ou 30 mg/ml de TNBS (ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfónico) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) em etanol a 50% (para romper a barreira epitelial intestinal) foram administrados lentamente no lúmen por meio do cateter preenchido a uma seringa de 1 ml. Os murganhos de controlo receberam etanol a 50% apenas (100 ml) . Os animais foram tratados por via intrarretal ou intraperitoneal (i.p.) com números diferentes das células reveladas por este documento obtidas a partir de tecido adiposo humano (ASC) conforme descrito no Exemplo 1 (0,3 x 106 e 1 x 106 células, suspensas em solução salina tamponada com fosfato, PBS) 12 horas após a instilação de TNBS. Em algumas experiências, as ditas células foram pré-tratadas com 200 U/ml de IFN-γ por 24 horas antes da injeção. Além disso, em algumas experiências, as células foram identificadas com CFSE (uma sonda fluorescente) antes da administração nos murganhos. Os animais foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência, aparecimento e severidade de diarreia e perda de peso corporal. Foi coletado soro e extratos proteicos foram obtidos a partir dos colons na fase aguda da doença (dia 3) . Os teores de citocina/quimiocina em extratos proteicos e em soro foram determinados por ELISA. A presença de células identificadas com CSFE nos nodos linfáticos mesentéricos foi analisada por citometria de fluxo. II. Resultados

Em todos os casos, os murganhos tratados com as células reveladas por este documento (ASCs) mostraram um aprimoramento claro nos seus sintomas inflamatórios, em comparação aos animais não tratados. O aprimoramento foi dependente da dose e estatisticamente significativo em todos os parâmetros testados, quando as células foram administradas localmente (por via intrarretal) ou sistemicamente (i.p.), embora esta última via pareça ser mais eficaz. Conforme previamente mostrado na Figura 5, ouve um aprimoramento dependente de dose de peso aumentado após a administração das células reveladas pelo documento.

De fato, uma dependência de dose pode ser observada nas Figuras 6, 7 e 8 com 1 x 106 células, mostrando um efeito mais forte que 0,3 χ 106 células. Em ambos os casos, as células aprimoraram a taxa de sobrevivência dos murganhos tratados com TNBS significativamente.

Além do mais, as células pré-estimuladas com IFN-γ mostraram uma recuperação mais rápida e mais forte do tratamento com TNBS do que células não pré-estimuladas (Figura 8). O gráfico mostra que os murganhos tratados com TNBS perderam peso dramaticamente e mostra uma clara melhoria nos murganhos que receberam células. Este aprimoramento foi também mensurável pela severidade da colite. A resposta imunológica inflamatória é claramente diminuída em animais tratados com as células reveladas pelo documento. Conforme mostrado na Figura 9, todas as citocinas pró-inflamatórias (TNF-a, IL-6, IL-lb, IL-12, e IFNy) e quimiocinas (MIP-2 e RANTES) testadas, tanto no cólon (resposta local) como no soro (resposta sistémica) foram mais baixas em animais tratados com célula em comparação aos murganhos não tratados. Esta resposta inibidora foi intensificada em animais tratados com células pré-estimuladas com IFNy. Por outro lado, a citocina imunorreguladora IL-10 foi aumentada no cólon de murganhos tratados com ASC, em comparação com animais tanto de controlo, como com lesão de TNBS não tratados. Além disso, a infiltração de neutrófilos, conforme medida por atividade de MPO, foi mais baixa em animais tratados com ASC, e ainda mais baixa quando as células foram pré-estimuladas com IFNy(Figura 10).

As células identificadas foram localizadas nos nódulos linfáticos de drenagem de animais tratados por meio de citometria celular (Figura 11). Esta é a localização esperada se as células administradas estiverem a funcionar como APCs. EXEMPLO 6

Indução de marcadores de APC nas células reveladas por este documento após estimulação com IFNy I. Materiais e Métodos

As células reveladas por este documento foram obtidas a partir de tecido adiposo subcutâneo humano (ASCs), conforme descrito no Exemplo 1. Após um minimo de 3 passagens de cultura, as células foram incubadas em meio de cultura padrão ou em meio de cultura contendo 3 ng/ml de IFNy por 4 dias. Após o mesmo, as células foram manchadas para alguns marcadores de superfície relacionados à resposta imunológica (especificamente relatados com a atividade de células que apresentam antígeno (APCs)). Estes marcadores incluíram os seguintes: • HLA-II (DP, DQ, DR). Este recetor apresenta fragmentos de antígenos estranhos para células T, iniciando a resposta imunológica adaptativa (é o primeiro sinal para ativação de células T) . As células reveladas por este documento não manifestam HLA-II constitutivamente. 0 anticorpo usado foi obtido junto à Serotec. • CD40. Esta proteína liga-se a CD40L, que é manifestado na superfície de células T ativadas. A células reveladas por este documento manifestam níveis indetetáveis ou muito baixos de CD40, constitutivamente. 0 anticorpo usado foi obtido junto à Serotec. • ICAM-1 (CD54). É a proteína principal envolvida na ligação entre células T e APCs. A sua expressão é necessária para outras interações entre APCs e células T serem executadas de modo adequado. A células reveladas por este documento manifestam níveis baixos-médios de ICAM-1, constitutivamente. 0 anticorpo usado foi obtido junto à Serotec. • Membros da família de proteínas coestimuladoras (entregam o segundo sinal para ativação de células T): o CD80 (B7-1). Anticorpo obtido junto à Serotec. 0 CD86 (B7-2). Anticorpo obtido junto à Serotec. 0 ICOSL (B7-H2). Anticorpo obtido junto à e-Bioscience. 0 B7-H4. Anticorpo obtido junto à e-Bioscience. 0 PD-Ll (B7-H1). Anticorpo obtido junto à e-Bioscience. 0 PD-L2 (B7-DC). Anticorpo obtido junto à e-Bioscience.

Os primeiros quatro entregam principalmente um sinal estimulador (promovendo indução de clones efetores de células T), enquanto PDL1 e PD-L2 são principalmente tolerogénicos (promovendo indução de inativação de anergia de células T) . Nenhum dos mesmos é expresso pelas células reveladas por este documento, constitutivamente. II. Resultados

Após o tratamento com IFNy, as células reveladas por este documento induzem a expressão de HLA-II, PD-Ll e PD-L2, e uma regulação ascendente forte de CD40 e ICAM-1. Os resultados desta experiência são mostrados na Figura 12.

Estes resultados são muito relevantes devido ao facto de que, em conjunto com a indução de atividade de IDO, os mesmos demonstram que as células reveladas pelo documento, mediante tratamento com IFNy, exibem um fenótipo característico de APCs tolerogénicas. EXEMPLO 7

Tratamento de artrite induzida por colagénio (CIA) com ASCs I. Materiais e Métodos A artrite experimental foi induzida em murganhos machos DBAl/Jlac (6 a 8 semanas de vida), injetando-se por via subcutânea s.c.) uma emulsão contendo 200 yg de colagénio de frango tipo II (CII) em adjuvante de Freund completo (CFA) e 200 yg de Mycobacterium tuberculosis H37RA. A evolução de CIA foi seguida por dois técnicos diferentes, medindo-se uma vermelhidão de inflamação - anquilose das articulações de membros superiores e inferiores, de acordo com um sistema de pontuação pré-estabelecido.

Quando os sintomas clinicos mostraram o estabelecimento de CIA (dia 23 pós-imunização, p.i.), os animais foram injetados i.p. diariamente por 5 dias com 2 x 105 células reveladas por este documento, obtidas a partir de tecido adiposo humano, conforme descrito no Exemplo 1 (ASCs), ou com PBS como controlo. Em alternativa, os murganhos com CIA foram injetados por via intra-articular (i.a.) uma vez numa das articulações afetadas. A evolução dos animais tratados foi seguida conforme descrito anteriormente e, no dia 50 p.i., os mesmos foram alvo de eutanásia. Diversos parâmetros foram medidos no sangue e nas articulações, os quais incluem: citocinas de articulação, citocinas de soro, isótipos de imunoglobulina, assim como fenótipo e produção de citocina de linfócitos. II. Resultados

Conforme mostrado nas Figuras 13, 14 e 15, as células reveladas por este documento diminuem claramente a incidência e a gravidade de CIA no modelo do murganho. Em particular, o efeito sobre a resposta imunológica é consistente com uma inibição forte da resposta de Thl (IFN-γ, TNFoí, IL-2, IL-Ιβ, IL-6, IL-12, MIP2, RANTES e IgG2a) sem qualquer aumento na resposta de Th2 (IL-4, IgGl), e com a indução de níveis altos de citocinas imunorreguladoras (IL-10 e TNF-β). EXEMPLO 8

Indução in vivo de células T reguladoras com as células reveladas pelo documento I. Materiais e Métodos

Num estudo similar àquele descrito no Exemplo 7, células T efetoras (CD4+CD25“Foxp3~) e reguladoras (CD4+CD25+Foxp3+) foram isoladas do nódulo linfático de dreno (DLN) e da membrana sinovial de murganhos com CIA não tratados e tratados com ASC, por meio de citometria celular, e o número de células em cada população foi avaliado. A fim de avaliar a capacidade de células T reguladoras presentes nos murganhos com CIA tratados com ASC para inibir as células efetoras ClI-específicas, foi realizado um ensaio proliferativo em que células T autorreativas isoladas de murganhos com CIA foram cocultivadas com números crescentes de células T DLN (células T reguladoras) de murganhos com CIA tratados com ASC ou não tratados (controlo) (razões de 1/64 a 1/1), e estimuladas com CII (10 yg/ml) e APCs esplénicas. II. Resultados

Conforme mostrado na Figura 16.A., tanto o DLN quanto a membrana sinovial de murganhos com CIA tratados com as células reveladas por este documento, induzem um aumento nos números de células T reguladoras (CD4+CD25+Foxp3+) , sem qualquer aumento nos números de células T efetoras, em comparação com murganhos com CIA não tratados (controlo).

Os dados mostrados na Figura 16.B. demostram que os murganhos com CIA tratados com as células reveladas pelo documento, mas não murganhos com CIA de controlo (não tratados), contêm células T reguladoras que inibem especificamente a resposta de célula T efetora contra CII.

Em conclusão, o tratamento de modelo de animal de uma doença autoimune experimental (CIA) com as células reveladas por este documento induz a emergência de células T reguladoras antigeno-especificas com capacidade de suprimir a resposta efetora de células T autorreativas. EXEMPLO 9

Ensaio de proliferação de linfócitos

As ASCs derivadas de adipose reveladas pelo documento, obtidas por meio dos métodos do Exemplo 1, foram colocadas em placas a 5.000 células/cm2 com e sem 200.000 linfócitos (ativados com 10 yg de PHA/ml) e cocultivadas por 3 dias. A proliferação dos linfócitos foi medida pela incorporação de H3. Conforme mostrado na Figura 17, a cocultura de ASCs e linfócitos resultou numa inibição de 86% da proliferação de linfócitos. A adição de diferentes concentrações de lMetil-triptofano (1-MT) reverteu esta supressão. 1-MT é um análogo de triptofano não metabolizável. Este ensaio demonstra a necessidade de catabolismo de triptofano por meio de IDO para induzir a atividade imunossupressora das células reveladas pelo documento. EXEMPLO 10

Potência de ASCs (produção de IDO) em relação ao número de células e concentração de IFN-γ

Materiais e Métodos HPLC: HPLC convencional foi executada com o uso de uma bomba de HPLC Waters 1515 Isocratic, um Autoamostrador Waters 717 e um Detetor de Absorbância Waters 2487 Dual

Protocolo - HPLC

Soluções frescas na faixa de 100 μΜ a 100 mM de triptofano e quinurenina foram preparadas em 10% de acetonitrilo em tampão fosfato de potássio (50 mM, pH 6,0). A partir destas soluções de estoque, 50 μΐ de triptofano e 10 μΐ de quinurenina e 940 μΐ de BSA (70 g/1) ou 10% de FCS foram combinados para constituir a amostra de controlo e armazenados a -80 °C.

Preparação de amostra: 200 μΐ ou mais de sobrenadante de amostras (culturas celulares) foram coletados em tubos de Eppendorf e armazenados a -80 °C. As amostras e as amostras de controlo foram descongeladas e 200 μΐ de tampão fosfato de potássio a 50 mM pH 6,0 foram adicionados a cada 200 ml de amostra num tubo de Eppendorf. 50 μΐ de TCA a 2 M (ácido tricloroacético) foram adicionados ao tubo de Eppendorf. O tubo foi submetido a vórtice e centrifugado por 10 min a 13.000 g a 4 °C. Do tubo de Eppendorf, 150 μΐ foram removidos para medição.

Preparação de coluna para medição por HPLC A coluna de HPLC foi preparada conforme conhecido na técnica e equilibrada com fase móvel, que consistiu em 40 mM de citrato de sódio em p H5 - em 50 μΐ de acetonitrilo a 5% da amostra descrita acima de 150 μΐ de amostra foram injetados na coluna (fase reversa de C18) . A separação ocorre por uma taxa de fluxo isocrática de 700 μΐ/min. A deteção fotométrica de L-quinurenina ocorre em 365 nm, para L-triptofano em 280 nm.

Resultados

Conforme mostrado na Figura 18, ASCs colocadas em placas a 5.000 células/cm2 e estimuladas a 3 ng/ml de IFN-γ por até 120 horas produzem IDO, cuja atividade é medida pela metabolização de triptofano e produção de quinurenina usando HPLC. As ASCs colocadas em placa a 5.000 células/cm2 e estimuladas a 3 pg/ml de IFN-γ por até 120 horas não produziram IDO. Nenhuma quinurenina pode ser detetada (Figura 19) . Similarmente, as ASCs colocadas em placas a 500 células/cm2 e estimuladas a 3 ng/ml de IFN-γ por até 120 horas não produziram quantidades significativas de IDO (Figura 20). EXEMPLO 10

Capacidade de ASCs de Fagocitar moléculas pequenas: Materiais e Métodos 4kda-Dextran-FITC (Sigma) foi adicionado às células do Exemplo 1 por 24 horas em cultura. As células foram lavadas e analisadas quanto à incorporação do FITC fluorescente.

Resultados A Figura 21A mostra a imagem de campo claro de células da população de células lavadas. A Figura 21B mostra a mesma população usando microscopia de fluorescência que usa filtros de Proteína Verde Fluorescente conhecidos na técnica. A absorção do marcador fluorescente visível na Figura 21B mostra que as células tinham capacidade de fagocitar moléculas de peso pequeno, e isso indica que estas células têm capacidade de apresentação de antígeno por meio de HLA classe II induzido por tratamento adicional das células com IFN-y.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma população de células isolada do tecido adiposo caracterizado por as células da dita população a) não expressarem pelo menos um marcador específico para células de apresentação de antígeno (APC), em que o marcador específico para APC é CDllb, CDllc, CD14, CD45 ou HLAII, b) não expressarem indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente, c) expressarem IDO mediante a estimulação com interferão-gama (IFN-γ) e, d) apresentaram a capacidade de serem diferenciadas em, pelo menos, duas linhagens celulares para a preparação ou geração in vitro de células T reguladoras.
2. Método para o isolamento de uma população de células T-reg caracterizado por compreender: (a) colocar uma população de células isolada do tecido adiposo em contacto com leucócitos sanguíneos periféricos, em que as células da dita população de células i) não expressam pelo menos um marcador específico para células de apresentação de antígeno (APC), em que o marcador específico para APC é CDllb, CDllc, CD14, CD45 ou HLAII, ii) não expressam indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente, iii) expressam IDO mediante a estimulação com interferão- gama (IFN-γ) e, iv) apresentam a capacidade de serem diferenciadas em, pelo menos, duas linhagens celulares e (b) selecionar a população de células T-reg.
3. População de células isolada do tecido adiposo caracterizada por as células da dita população de células: i) não expressarem pelo menos um marcador especifico para células de apresentação de antigeno (APC), em que o marcador especifico para APC é CDllb, CDllc, CD14, CD45 ou HLAII, ii) não expressarem indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente, iii) expressarem IDO mediante a estimulação com interferão-gama (IFN-γ) e, iv) apresentam a capacidade de serem diferenciadas em pelo menos duas linhagens celulares para uso como medicamento.
4. População de células isolada do tecido adiposo caracterizada por as células da dita população de células i) não expressarem pelo menos um marcador especifico para células de apresentação de antigeno (APC), em que o marcador específico para APC é CDllb, CDllc, CD14, CD45 ou HLAII, ii) não expressarem indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente, iii) expressarem IDO mediante a estimulação com interferão- gama (IFN-γ) e, iv) apresentam a capacidade de serem diferenciadas, em pelo menos, duas linhagens celulares para uso na prevenção, no tratamento ou na melhoria de um ou mais sintomas associados a doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios ou rejeição de órgãos e tecidos transplantados.
5. População de células isolada para uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por a dita doença ser selecionada dentre Doença Inflamatória Intestinal (IBD) e Artrite Reumatoide (RA).
6. Composição farmacêutica que compreende uma população de células isolada do tecido adiposo caracterizada por as células da dita população de células i) não expressarem pelo menos um marcador especifico para células de apresentação de antigeno (APC), em que o marcador especifico para APC é CDllb, CDllc, CD14, CD45 ou HLAII, ii) não expressarem indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente, iii) expressarem IDO mediante a estimulação com interferão-gama (IFN-γ) e, iv) apresentam a capacidade de serem diferenciadas em, pelo menos, duas linhagens celulares e um veiculo farmaceuticamente aceitável para uso na prevenção, no tratamento ou na melhoria de um ou mais sintomas associados a doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios ou rejeição de órgãos e tecidos transplantados .
7. Kit que compreende uma população de células isolada do tecido adiposo caracterizado por as células da dita população de células i) não expressarem pelo menos um marcador especifico para células de apresentação de antigeno (APC), em que o marcador específico para APC é CDllb, CDllc, CD14, CD45 ou HLAII, ii) não expressarem indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente, iii) expressarem IDO mediante a estimulação com interferão-gama (IFN-γ) e, iv) apresentam a capacidade de serem diferenciadas, em pelo menos duas, linhagens celulares para uso na prevenção, no tratamento ou na melhoria de um ou mais sintomas associados a doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios ou rejeição de órgãos e tecidos transplantados.
8. Uso de uma população de células isolada do tecido adiposo caracterizado por as células da dita população de células i) não expressarem pelo menos um marcador específico para células de apresentação de antigeno (APC), em que o marcador específico para APC é CDllb, CDllc, CD14, CD45 ou HLAII, ii) não expressarem indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) constitutivamente, iii) expressarem IDO mediante a estimulação com interferão-gama (IFN-γ) e, iv) apresentam a capacidade de serem diferenciadas em, pelo menos, duas linhagens celulares para a preparação de um medicamento para prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas associados a doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios ou rejeição de órgãos e tecidos transplantados.
9. Uso, conforme definido na reivindicação 1, método, conforme definido na reivindicação 2, população de células isolada, conforme definido na reivindicação 3, população de células isolada para uso, conforme definido nas reivindicações 4 ou 5, composição farmacêutica para uso, conforme definido na reivindicação 6, kit para uso, conforme definido na reivindicação 7, ou uso, conforme definido na reivindicação 8, caracterizado por a dita população de células ser negativa para os marcadores de superfície de célula a seguir: CDllb, CDllc, CD14, CD31, CD34, CD45, CD133 e HLAII.
10. Uso, conforme definido na reivindicação 1, método, conforme definido na reivindicação 2, população de células isolada, conforme definido na reivindicação 3, população de células isolada para uso, conforme definido nas reivindicações 4 ou 5, composição farmacêutica para uso, conforme definido na reivindicação 6, kit para uso, conforme definido na reivindicação 7, ou uso, conforme definido na reivindicação 8, caracterizado por a dita população de células ser positiva para pelo menos um e, de preferência, todos os marcadores de superfície de célula a seguir: CD9, CD44, CD54, CD90 e CD105.
11. Uso, conforme definido na reivindicação 1, método, conforme definido na reivindicação 2, população de células isolada, conforme definido na reivindicação 3, população de células isolada para uso, conforme definido nas reivindicações 4 ou 5, composição farmacêutica para uso, conforme definido na reivindicação 6, kit para uso, conforme definido na reivindicação 7, ou uso, conforme definido na reivindicação 8, caracterizado por a dita população de células ter a capacidade de ser expandida ex vi vo.
12. Uso, conforme definido na reivindicação 1, método, conforme definido na reivindicação 2, população de células isolada, conforme definido na reivindicação 3, população de células isolada para uso, conforme definido nas reivindicações 4 ou 5, composição farmacêutica para uso, conforme definido na reivindicação 6, kit para uso, conforme definido na reivindicação 7, ou uso, conforme definido na reivindicação 8, caracterizado por a dita população de células expressar pelo menos um polipéptido antigénico.