ES2589311T3 - Poblaciones de células que tienen actividad inmunorreguladora, método de aislamiento y usos - Google Patents
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Abstract
Uso de una población de células aisladas de tejido adiposo caracterizado en que las células de dicha población: a) no expresan al menos un marcador específico para células presentadoras de antígeno (CPA), en donde el marcador específico para CPA es CD11b, CD11c, CD14, CD45 o HLAII, b) no expresan indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) de manera constitutiva, c) expresan IDO tras la estimulación con interferón-gamma (IFN-γ) y, d) presentan capacidad para diferenciarse en al menos dos linajes celulares. para la preparación o generación in vitro de células T reguladoras.
Description
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administración de las células descritas por el presente documento aisladas de tejido adiposo humano. Tras 10 días, los ratones que recibieron 1x106 células no mostraron una diferencia de peso significativa en comparación con el grupo control.
La figura 6 muestra la tasa de supervivencia de los ratones tratados con TNBS tras la administración de las células descritas por el presente documento aisladas de tejido adiposo humano. De nuevo, puede observarse una dependencia de la dosis, mostrando 1x106 células un efecto más fuerte que 0,3x106 células, aunque en ambos casos las células mejoraron significativamente la tasa de supervivencia de los ratones tratados con TNBS.
La figura 7 muestra la comparación del peso corporal en ratones tratados con TNBS tras la administración de 1x106 células descritas por el presente documento aisladas de tejido adiposo humano y 1x106 de las mismas células preestimuladas con 30 ng/ml de IFN-γ durante 48 horas. La gráfica muestra la grave pérdida de peso en los ratones tratados con TNBS y una clara mejora tras 3 días en los ratones que recibieron células. Tras 8 días, estos ratones mostraron incluso una ganancia de peso, mientras que los ratones control (ratones tratados con TNBS sin administración de células) mostraban aún una grave pérdida de peso. Además, las células preestimuladas con IFN-γ mostraron una recuperación más rápida y más fuerte del tratamiento con TNBS que las células no preestimuladas.
La figura 8 muestra los datos de la figura 7 como “experimento 1” y además los datos de un conjunto de datos adicional “experimento 2” descrito en el ejemplo 5. La gráfica muestra que los ratones tratados con TNBS perdieron peso drásticamente y una clara mejora en los ratones que recibieron células. Esta mejora podía medirse también mediante la gravedad de la colitis
La figura 9 muestra que todas las citocinas proinflamatorias (TNF-a, IL-6, IL-1b, IL-12, e IFNγ) y quimiocinas (MIP-2 y RANTES) sometidas a prueba, tanto en el colon (respuesta local) como en el suero (respuesta sistémica), eran inferiores en los animales tratados con células en comparación con los ratones no tratados.
La figura 10 muestra que la infiltración de neutrófilos, tal como se mide mediante la actividad MPO, era inferior en los animales tratados con CMA, e incluso inferior cuando las células estaban preestimuladas con IFN-γ
La figura 11 muestra que las células marcadas con CFSE estaban localizadas en los ganglios linfáticos de drenaje de los animales tratados por medio de citometría celular. Esta es la ubicación esperada si las células administradas estuviesen actuando como CPA.
La figura 12 muestra la inducción de marcadores de CPA en CMA humanas mediante tratamiento con IFN-γ. Fila superior: histogramas citométricos de CMA sin tratar; fila inferior, histogramas citométricos de CMA tras el tratamiento con IFN-γ durante 4 días. Los controles de isotipo se muestran sombreados en negro.
La figura 13 muestra que las células divulgadas por este documento disminuyen la gravedad e incidencia de AIC. A, gravedad de la artritis, evaluada mediante la puntuación clínica o la medición del grosor de la pata, en ratones con AIC establecida inyectados. Los números entre paréntesis representan la incidencia de artritis (% de ratones con puntuación de artritis > 2 el día 50) en los grupos control, i.p. e i.a. Las imágenes muestran ejemplos representativos de la hinchazón de la pata en ratones de los diferentes grupos experimentales (control y CMA i.p.). n=8-11 ratones por grupo. p<0,001 frente al control tras el día 32. Actividad mieloperoxidasa (MPO) que mide la infiltración de neutrófilos en las articulaciones. *p<0,001 frente al control.
La figura 14 muestra la inhibición de la respuesta inflamatoria. Expresión sistémica y local de los mediadores inflamatorios en ratones sin tratar (control) o ratones con AIC tratados con CMA el día 35 posterior a la inmunización. A, contenido en citocinas/quimiocinas en las articulaciones. Se analizó una pata de un ratón no inmunizado simultáneamente para evaluar la respuesta basal. B, niveles de TNFα e IL-1β en suero. n=6-8 ratones/grupo. *p<0,001 frente a los controles.
La figura 15 muestra que las células divulgadas por este documento regulan por disminución la respuesta mediada por Th1 en la AIC. A, respuesta proliferativa y producción de citocinas de células de ganglios linfáticos de drenaje (GLD) aisladas el día 30 de ratones sin tratar (control) o ratones con AIC tratados con CMA y estimuladas in vitro con diferentes concentraciones de CII. La estimulación de células de GLD con anticuerpos anti-CD3 (, para ratones con AIC sin tratar; , para ratones con AIC tratados con AM) se usa para evaluar la estimulación no específica. Se usó un conjunto células de GLD de 3 ratones DBA/1 no inmunizados para evaluar la respuesta basal. n=5 ratones/grupo. B, número de células T productoras de citocinas específicas de CII. Se reestimularon células de GLD de ratones sin tratar (control) o ratones con AIC tratados con CMA in vitro con CII (10 µg/ml) y se analizaron para determinar la expresión de citocinas intracelulares y CD4 mediante citometría de flujo (para la expresión de IFNγ/TNFα o IL-4/IL-10 en células T CD4 seleccionadas). Se muestra el número de células T que expresan IFNγ, IL4 e IL-10 respecto a 104 células T CD4. Los datos mostrados representan los valores reunidos de dos experimentos independientes. C, respuesta proliferativa específica de CII en células de la membrana sinovial aisladas de ratones sin tratar (control) o ratones con AIC tratados con CMA y estimuladas in vitro con CII (10 µg/ml) durante 48 h. Los datos muestran los resultados de células sinoviales reunidas de 3 animales por grupo. D, niveles de IgG, IgG1 e
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Opcionalmente, las células divulgadas por este documento también son negativas para el marcador de superficie celular CD106(VCAM-1). Ejemplos de tales células son ciertas poblaciones de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo tal como se describe en el presente documento.
Pueden usarse anticuerpos monoclonales conocidos y disponibles comercialmente contra dichos marcadores de superficie celular (por ejemplo, receptores celulares y proteínas transmembrana) para identificar las células divulgadas por este documento.
Expresión de IDO
Las células divulgadas por este documento no expresan IDO de manera constitutiva, pero expresan IDO tras la estimulación con IFN-γ. Los experimentos llevados a cabo por los inventores han demostrado que dichas células, tras la estimulación con otros mediadores proinflamatorios por sí mismos, tales como interleucina-1 (IL-1) utilizada a una concentración de 3 ng/ml, factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α) utilizado a una concentración de 50 ng/ml o la endotoxina LPS utilizada a una concentración de 100 ng/ml, no inducían la expresión de IDO, tal como se mide mediante RT-PCR y análisis de inmunotransferencia de tipo Western convencionales. La estimulación con IFN-γ por ejemplo a 3 ng/ml o superior también puede inducir la expresión de HLAII en las células divulgadas por este documento para dar una señal positiva tal como se define en el presente documento para un marcador de superficie celular. Dicha expresión puede detectarse por los expertos en la materia usando cualquier técnica conocida que permita la detección de la expresión de proteínas específicas. Preferiblemente, dichas técnicas son técnicas de citometría celular.
Diferenciación
Las células divulgadas por este documento presentan la capacidad de proliferar y diferenciarse en al menos dos, más preferiblemente tres, cuatro, cinco, seis, siete o más linajes celulares. Los ejemplos ilustrativos, no limitantes de linajes celulares en los que las células divulgadas por este documento pueden diferenciarse incluyen osteocitos, adipocitos, condrocitos, tenocitos, miocitos, cardiomiocitos, células del estroma que apoyan la hematopoyesis, células endoteliales, neuronas, astrocitos y hepatocitos.
Las células divulgadas por este documento pueden proliferar y diferenciarse a células de otros linajes mediante métodos convencionales. Los métodos de identificación y posteriormente aislamiento de células diferenciadas de sus homólogos no diferenciados también pueden llevarse a cabo mediante métodos bien conocidos en la técnica.
Las células divulgadas por este documento también pueden expandirse ex vivo. Es decir, tras el aislamiento, las células divulgadas por este documento pueden mantenerse y dejarse proliferar ex vivo en medio de cultivo. Tal medio está compuesto de, por ejemplo, medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), con antibióticos (por ejemplo, penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 µg/ml) o sin antibióticos, y glutamina 2 mM, y complementado con suero bovino fetal (FBS) al 2-20%. Está dentro del conocimiento de un experto en la materia modificar o modular las concentraciones de los medios y/o complementos de los medios según sea necesario para las células utilizadas. Los sueros contienen con frecuencia factores celulares y no celulares y componentes que son necesarios para la viabilidad y la expansión. Los ejemplos de sueros incluyen FBS, suero bovino (BS), suero de ternero (CS), suero de ternero fetal (FCS), suero de ternero recién nacido (NCS), suero de cabra (GS), suero de caballo (HS), suero porcino, suero de oveja, suero de conejo, suero de rata (RS), etc. También se contempla, si las células divulgadas por este documento son de origen humano, complementar el medio de cultivo celular con un suero humano, preferiblemente de origen autólogo. Se entiende que los sueros pueden inactivarse por calor a 5565ºC si se considera necesario para inactivar los componentes de la cascada del complemento. La modulación de las concentraciones de suero, la retirada del suero del medio de cultivo también puede usarse para fomentar la supervivencia de uno o más tipos celulares deseados. Preferiblemente, las células divulgadas por este documento se beneficiarán de concentraciones de FBS de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 25%. En otra divulgación, las células divulgadas por este documento pueden expandirse en un medio de cultivo de composición definida, en el que el suero se sustituye por una combinación de seroalbúmina, transferrina de suero, selenio y proteínas recombinantes incluyendo, pero sin limitarse a: insulina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) tal como se conoce en la técnica.
Muchos medios de cultivo celular ya contienen aminoácidos; sin embargo, algunos requieren complementación antes del cultivo de células. Tales aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, L-alanina, L-arginina, ácido Laspártico, L-asparragina, L-cisteína, L-cistina, ácido L-glutámico, L-glutamina, L-glicina y similares.
También se usan normalmente agentes antimicrobianos en el cultivo celular para mitigar la contaminación bacteriana, micoplásmica y fúngica. Normalmente, los antibióticos o compuestos antimicóticos utilizados son mezclas de penicilina/estreptomicina, pero también pueden incluir, pero no se limitan a anfotericina (Fungizone®), ampicilina, gentamicina, bleomicina, higromicina, kanamicina, mitomicina, etc.
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También pueden usarse hormonas de manera ventajosa en el cultivo celular e incluyen, pero no se limitan a, Daldosterona, dietilestilbestrol (DES), dexametasona, b-estradiol, hidrocortisona, insulina, prolactina, progesterona, somatostatina/hormona del crecimiento humana (HGH), etc.
Las condiciones de mantenimiento de las células divulgadas por este documento también pueden contener factores celulares que permitan a las células permanecer en una forma no diferenciada. Es evidente para los expertos en la materia que antes de la diferenciación, los complementos que inhiben la diferenciación celular deben eliminarse del medio de cultivo. También es evidente que no todas las células requerirán estos factores. De hecho, estos factores pueden provocar efectos indeseados, dependiendo del tipo celular.
De manera ventajosa, las células divulgadas por este documento carecen de actividad tumorígena in vivo. Por tanto, dichas células se caracterizan porque no presentan actividad tumorígena, es decir, no presentan un comportamiento alterado o un fenotipo proliferativo que dé lugar a una célula tumoral.
En una divulgación, las células divulgadas por este documento pueden administrarse a un sujeto que padece enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias o enfermedades mediadas inmunológicamente, tales como rechazo de tejidos y órganos trasplantados, para suprimir la respuesta inmunitaria. Por tanto, es necesario que las células divulgadas por este documento no presenten actividad tumorígena.
La actividad tumorígena de las células divulgadas por este documento puede someterse a prueba realizando estudios en animales usando cepas de ratones inmunodeficientes. En estos experimentos, se implantan varios millones de células por vía subcutánea en los animales receptores, que se mantienen durante varias semanas y se analizan para detectar la formación de tumores. En el ejemplo 3 se divulga un ensayo particular.
Las células divulgadas por este documento pueden transfectarse o modificarse mediante ingeniería genética para expresar, al menos, un polipéptido antigénico. En una divulgación, el antígeno comprende un polipéptido purificado o sintético o recombinante que representa un antígeno específico frente al que se desea inducir tolerancia, o un fragmento polipeptídico sintético corto derivado de la secuencia de aminoácidos de un antígeno de este tipo. Preferiblemente, la fuente de antígeno comprende antígenos expresados por un injerto de tejido donante. También preferiblemente, la fuente de antígeno comprende una proteína frente a la que un paciente tiene un trastorno autoinmunitario.
Método para aislar células que expresan IDO
El presente documento divulga un método para aislar una población de células de tejido conjuntivo, en el que las células de dicha población de células presentan un fenotipo caracterizado porque (i) no expresan marcadores específicos de CPA; (ii) no expresan IDO de manera constitutiva; (iii) expresan IDO tras la estimulación con IFN-γ; y
- (iv)
- presentan capacidad para diferenciarse en al menos dos linajes celulares, dicho método comprende las etapas de:
- (i)
- preparar una suspensión celular de una muestra de un tejido conjuntivo;
- (ii)
- recuperar las células de dicha suspensión celular;
(iii) incubar dichas células en un medio de cultivo celular adecuado sobre una superficie sólida en condiciones que permitan a las células adherirse a la superficie sólida y proliferar;
- (iv)
- lavar dicha superficie sólida tras la incubación para eliminar las células no adheridas;
- (v)
- seleccionar las células que tras pasarse al menos dos veces en tal medio permanecen adheridas a dicha superficie sólida; y
- (vi)
- confirmar que la población de células seleccionada presenta el fenotipo de interés.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “superficie sólida” se refiere a cualquier material que permita a las células divulgadas por este documento adherirse. En una divulgación particular, dicho material es un material plástico tratado para fomentar la adhesión de células de mamífero a su superficie, por ejemplo, placas de poliestireno disponibles comercialmente recubiertas opcionalmente con poli-D-lisina u otros reactivos.
Las etapas (i)-(vi) pueden llevarse a cabo mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. En resumen, las células divulgadas por este documento pueden obtenerse por medios convencionales de cualquier fuente adecuada de tejido conjuntivo de cualquier animal adecuado, incluyendo seres humanos, por ejemplo, de tejido adiposo o tejido cartilaginoso humano. El animal puede estar vivo o muerto, siempre que las células de tejido conjuntivo del animal sean viables. Normalmente, las células de tejido adiposo humanas se obtienen de donantes vivos, usando protocolos bien reconocidos tales como lipectomía quirúrgica o de succión. De hecho, debido a que los procedimientos de liposucción son tan comunes, el efluente de liposucción es una fuente particularmente preferida de la que pueden derivarse las células divulgadas por este documento. Por tanto, en una divulgación particular, las células divulgadas por este documento son de la fracción del estroma de tejido adiposo humano obtenido mediante liposucción. En otra divulgación particular, las células divulgadas por este documento son de cartílago articular hialino humano obtenido mediante técnicas artroscópicas. En otra divulgación particular, las células divulgadas por este documento son de piel humana obtenida mediante técnicas de biopsia. También en
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otra divulgación particular, las células divulgadas por este documento son de médula ósea humana obtenida mediante aspiración.
La muestra de tejido conjuntivo se lava, preferiblemente, antes de procesarse para separar las células divulgadas por este documento del material restante. En un protocolo, la muestra de tejido conjuntivo se lava con solución salina fisiológicamente compatible (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS)) y luego se agita vigorosamente y se deja sedimentar, una etapa que elimina la materia suelta (por ejemplo, tejido dañado, sangre, eritrocitos, etc.) del tejido. Por tanto, las etapas de lavado y de sedimentación se repiten generalmente hasta que el sobrenadante está relativamente libre de desechos. Las células restantes estarán presentes normalmente en grupos de diversos tamaños, y el protocolo continúa usando etapas calibradas para degradar la estructura macroscópica mientras que minimiza el daño a las propias células. Un método para lograr este fin es tratar los grumos lavados de células con una enzima que debilite o destruya enlaces entre las células (por ejemplo, colagenasa, dispasa, tripsina, etc.). La cantidad y duración de tal tratamiento enzimático variarán, dependiendo de las condiciones empleadas, pero el uso de tales enzimas se conoce generalmente en la técnica. Alternativamente o junto con tal tratamiento enzimático, los grumos de células pueden degradarse usando otros tratamientos, tales como agitación mecánica, energía acústica, energía térmica, etc. Si la degradación se consigue mediante métodos enzimáticos, es deseable neutralizar la enzima tras un periodo adecuado, para minimizar los efectos perjudiciales sobre las células.
La etapa de degradación produce normalmente una mezcla espesa o suspensión de células agregadas y una fracción fluida que contiene generalmente células del estroma libres (por ejemplo, glóbulos rojos, células de músculo liso, células endoteliales, fibroblastos y células madre). La siguiente fase en el procedimiento de separación es separar las células agregadas de las células divulgadas por este documento. Esto puede lograrse mediante centrifugación, que provoca que las células formen un sedimento cubierto por un sobrenadante. El sobrenadante puede entonces desecharse y resuspenderse el sedimento en un líquido fisiológicamente compatible. Además, las células resuspendidas incluyen normalmente eritrocitos, y en la mayoría de los protocolos es deseable lisarlos. En la técnica se conocen métodos para lisar selectivamente eritrocitos, y puede emplearse cualquier protocolo adecuado (por ejemplo, incubación en un medio hiper o hipotónico, mediante lisis usando cloruro de amonio, etc.). Por supuesto, si se lisan los eritrocitos, deben separarse entonces las células restantes del lisado, por ejemplo, mediante filtración, sedimentación o fraccionamiento por densidad.
Independientemente de si se lisan los eritrocitos, las células resuspendidas pueden lavarse, volverse a centrifugar y resuspenderse una o más veces sucesivas para lograr una pureza mayor. Alternativamente, las células pueden separarse basándose en el perfil de marcador de superficie celular o basándose en la granularidad y el tamaño celular.
Tras el aislamiento y la resuspensión finales, las células pueden cultivarse y, si se desea, someterse a ensayo para determinar su número y viabilidad para evaluar el rendimiento. De manera deseable, las células se cultivarán sin diferenciación, sobre una superficie sólida, usando un medio de cultivo celular adecuado, a las densidades celulares y condiciones de cultivo apropiadas. Por tanto, en una divulgación particular, las células se cultivan sin diferenciación sobre una superficie sólida, fabricada habitualmente de un material plástico, tal como placas Petri o botellas de cultivo celular, en presencia de un medio de cultivo celular adecuado [por ejemplo, DMEM, normalmente complementado con el 5-15% (por ejemplo, el 10%) de un suero adecuado, tal como suero bovino fetal o suero humano], e incubado en condiciones que permitan a las células adherirse a la superficie sólida y proliferar. Tras la incubación, las células se lavan con el fin de eliminar las células no adheridas y los fragmentos celulares. Las células se mantienen en cultivo y en las mismas condiciones hasta que alcanzan la confluencia adecuada, normalmente, aproximadamente el 80% de confluencia celular, con sustitución del medio de cultivo celular cuando sea necesario. Tras alcanzar la confluencia celular deseada, las células pueden expandirse por medio de pases consecutivos usando un agente de separación tal como tripsina y sembrando sobre una superficie de cultivo celular más grande a la densidad celular apropiada (habitualmente 2.000-10.000 células/cm2). Por tanto, las células se pasan entonces al menos dos veces en tal medio sin diferenciación, mientras que conservan aún su fenotipo de desarrollo, y más preferiblemente, las células pueden pasarse al menos 10 veces (por ejemplo, al menos 15 veces o incluso al menos 20 veces) sin perder el fenotipo de desarrollo. Normalmente, las células siembran en placa a una densidad deseada tal como entre aproximadamente 100 células/cm2 y aproximadamente 100.000 células/cm2 (tal como de aproximadamente 500 células/cm2 a aproximadamente 50.000 células/cm2, o, más particularmente, entre aproximadamente 1.000 células/cm2 y aproximadamente 20.000 células/cm2). Si se siembran en placa a densidades inferiores (por ejemplo, de aproximadamente 300 células/cm2), las células pueden aislarse clonalmente de manera más sencilla. Por ejemplo, después de algunos días, las células sembradas en placa a tales densidades proliferarán en una población homogénea. En una divulgación particular, la densidad celular está entre 2.000-10.000 células/cm2.
Se seleccionan las células que permanecen adheridas a la superficie sólida tras tal tratamiento que comprende al menos dos pases y se analiza el fenotipo de interés mediante métodos convencionales con el fin de confirmar la identidad de las células divulgadas por este documento tal como se mencionará a continuación. Las células que permanecen adheridas a la superficie sólida tras el primer pase son de origen heterogéneo; por tanto, dichas células deben someterse a al menos otro pase. Como resultado del método anterior, se obtiene una población de células
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homogénea que tiene el fenotipo de interés. El ejemplo 1 describe de manera detallada el aislamiento de las células divulgadas por este documento de tejido adiposo humano y de tejido cartilaginoso humano.
Habitualmente, las células que permanecen adheridas a la superficie sólida tras el segundo pase muestran el fenotipo de interés, aunque ha de confirmarse de modo que las células puedan usarse según la invención. Por tanto, la adhesión de las células a la superficie sólida tras al menos dos pases constituye una divulgación preferida de este documento para seleccionar las células divulgadas por este documento. La confirmación del fenotipo de interés puede llevarse a cabo usando medios convencionales.
Pueden identificarse marcadores de superficie celular mediante cualquier técnica convencional adecuada, habitualmente basada en una selección positiva/negativa; por ejemplo, pueden usarse anticuerpos monoclonales frente a marcadores de superficie celular, cuya presencia/ausencia en las células ha de confirmarse; aunque también pueden usarse otras técnicas. Por tanto, en una divulgación particular, se usan anticuerpos monoclonales frente a uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete de, o preferiblemente todos de CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34 y CD133 con el fin de confirmar la ausencia de dichos marcadores en las células seleccionadas; y se usan anticuerpos monoclonales frente a uno, dos, tres, cuatro de, o preferiblemente todos de CD9, CD44, CD54, CD90 y CD105 con el fin de confirmar la presencia de los mismos o los niveles de expresión detectable de, al menos uno de y preferiblemente todos de, dichos marcadores. Dichos anticuerpos monoclonales se conocen, están comercialmente disponibles o pueden obtenerse por un experto en la materia mediante métodos convencionales.
La actividad de IDO inducible por IFN-γ en las células seleccionadas puede determinarse mediante cualquier ensayo convencional adecuado. Por ejemplo, las células seleccionadas pueden estimularse con IFN-γ y someterse a ensayo para determinar la expresión de IDO; entonces pueden realizarse análisis de inmunotransferencia tipo Western convencional para detectar la expresión de proteína IDO y puede medirse la actividad de la enzima IDO tras la estimulación con IFN-γ de las células seleccionadas mediante la conversión de triptófano a quinurenina con, por ejemplo, análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y determinación fotométrica de la concentración de quinurenina en el sobrenadante como la lectura. Dado que las células divulgadas por este documento expresan IDO en ciertas condiciones, puede usarse cualquier técnica adecuada que permita la detección de la actividad IDO tras la estimulación con IFN-γ para seleccionar las células divulgadas por este documento. En el ejemplo 2 se divulga un ensayo adecuado para determinar la actividad IDO inducible por IFN-γ en las células seleccionadas. La cantidad de IDO producida depende del número de células por centímetro cuadrado, que está preferiblemente a un nivel de 5000 células/cm2 o más, pero no se limita a esta concentración, y de la concentración de IFN-γ, que idealmente es de 3 ng/ml o más, pero no se limita a esta concentración. La actividad de IDO producida en las condiciones descritas dará como resultado una producción detectable de quinurenina en el intervalo µM tras 24 horas o más.
La capacidad de las células seleccionadas para diferenciarse en al menos dos linajes celulares puede someterse a ensayo mediante métodos convencionales tal como se conoce en la técnica.
Las células y poblaciones de células descritas por el presente documento pueden expandirse clonalmente, si se desea, usando un método adecuado para clonar poblaciones de células. Por ejemplo, una población de células proliferada puede recogerse físicamente y sembrarse en una placa separada (o el pocillo de una placa de múltiples pocillos). Alternativamente, las células pueden subclonarse en una placa de múltiples pocillos a una razón estadística para facilitar la colocación de una única célula en cada pocillo (por ejemplo, desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 1 células/pocillo o incluso de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,5 células/pocillo, tal como 0,5 células/pocillo). Por supuesto, las células pueden clonarse sembrándolas en placa a baja densidad (por ejemplo, en una placa Petri u otro sustrato adecuado) y aislándolas de las otras células usando dispositivos tales como anillos de clonación. La producción de una población clonal puede expandirse en cualquier medio de cultivo adecuado. En cualquier caso, las células aisladas pueden cultivarse hasta un punto adecuado en el que pueda evaluarse su fenotipo de desarrollo.
Investigaciones adicionales llevadas a cabo por los inventores han demostrado que puede lograrse la expansión ex vivo de las células divulgadas por este documento sin inducir diferenciación durante periodos de tiempo prolongados por ejemplo usando lotes especialmente seleccionados de suero adecuado (tal como suero bovino fetal o suero humano). En la técnica se conocen métodos para medir la viabilidad y el rendimiento (por ejemplo, exclusión de azul tripán).
Cualquiera de las etapas y los procedimientos para aislar las células de la población de células divulgada por este documento puede realizarse manualmente, si se desea. Alternativamente, el procedimiento de aislamiento de tales células puede facilitarse y/o automatizarse a través de uno o más dispositivos adecuados, de los que se conocen ejemplos en la técnica.
Usos de las células de la invención
Las células divulgadas por este documento pueden usarse para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con trastornos en los que la modulación del sistema inmunitario de un sujeto es beneficiosa, incluyendo,
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pero sin limitarse a, enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios y rechazo de tejidos y órganos trasplantados.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una población de células aislada de tejido adiposo caracterizada en que las células de dicha población de células:
i) no expresan al menos un marcador específico para células presentadoras de antígeno (CPA), en donde el
marcador específico para CPA es CD11b, CD11c, CD14, CD45 o HLAII, ii) no expresan indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) de forma constitutiva, iii) expresan IDO tras estimulación con interferón-gamma (IFN-γ), y iv) presentan capacidad de diferenciarse en al menos dos linajes celulares
para uso como un medicamento. En una realización particular, pueden usarse medicamentos que contienen las células divulgadas por este documento para inducir tolerancia a trasplante, o para tratar, y así aliviar, síntomas de trastornos autoinmunitarios o inflamatorios, o rechazo de tejidos y órganos trasplantados, en un sujeto que padece cualquiera de dichos trastornos o enfermedades. Por tanto, la población de células aisladas según este aspecto de este documento puede usarse para tratar terapéutica o profilácticamente y así aliviar los síntomas de trastornos autoinmunitarios o inflamatorios en un sujeto que padece cualquiera de dichos trastornos o para aliviar los síntomas de enfermedades mediadas inmunológicamente en un sujeto que padece dichas enfermedades.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “trastorno” y “enfermedad” se usan de manera intercambiable para referirse a un estado en un sujeto. En particular, el término “enfermedad autoinmunitaria” se usa de manera intercambiable con el término “trastorno autoinmunitario” para referirse a un estado en un sujeto caracterizado por lesión celular, de tejido y/o de órgano producida por una reacción inmunológica del sujeto contra sus propias células, tejidos y/u órganos. El término “enfermedad inflamatoria” se usa de manera intercambiable con el término “trastorno inflamatorio” para referirse a un estado en un sujeto caracterizado por inflamación, preferiblemente inflamación crónica. Los trastornos autoinmunitarios pueden estar o no asociados con la inflamación. Además, la inflamación puede estar o no producida por un trastorno autoinmunitario. Por tanto, ciertos trastornos pueden caracterizarse como trastornos tanto autoinmunitarios como inflamatorios.
Los mecanismos mediante los que ciertos estados pueden producir autoinmunidad en algunos sujetos no se entienden bien generalmente, pero pueden implicar factores tanto genéticos como extrínsecos. Por ejemplo, las bacterias, virus o fármacos pueden desempeñar un papel en el desencadenamiento de una respuesta autoinmunitaria en un sujeto que ya tenía una predisposición genética al trastorno autoinmunitario. Se ha propuesto, por ejemplo, que sujetos con ciertas alergias comunes son más susceptibles a trastornos autoinmunitarios.
Prácticamente cualquier enfermedad autoinmunitaria, trastorno inflamatorio o enfermedad mediada inmunológicamente puede tratarse con las células divulgadas por este documento. Ejemplos ilustrativos, no limitantes de dichos trastornos y enfermedades que pueden tratarse son los enumerados previamente con el encabezado “definiciones”. En una realización particular, dicha enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria crónica, tal como, por ejemplo, EII o AR.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una población de células aislada de tejido adiposo caracterizada en que las células de dicha población de células:
i) no expresan al menos un marcador específico para células presentadoras de antígeno (CPA), en donde el
marcador específico para CPA es CD11b, CD11c, CD14, CD45 o HLAII, ii) no expresan indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) de forma constitutiva, iii) expresan IDO tras estimulación con interferón-gamma (IFN-γ), y iv) presentan capacidad de diferenciarse en al menos dos linajes celulares
para la preparación de un medicamento para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con trastornos en los que la modulación del sistema inmunitario de un sujeto es beneficiosa, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios y rechazo de tejidos y órganos trasplantados. Por tanto, la invención se refiere además al uso de esta población de células aisladas de tejido adiposo para la preparación de un medicamento para suprimir la respuesta inmunitaria, o para inducir tolerancia a trasplante, o para tratar enfermedades autoinmunitarias, o para tratar trastornos inflamatorios. Se han mencionado previamente ejemplos de dichas enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias. En una realización particular, la enfermedad es una enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad inflamatoria crónica, por ejemplo, EII o AR.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una población de células aislada de tejido adiposo caracterizada en que las células de dicha población de células:
i) no expresan al menos un marcador específico para células presentadoras de antígeno (CPA), en donde el
marcador específico para CPA es CD11b, CD11c, CD14, CD45 o HLAII, ii) no expresan indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) de forma constitutiva,
iii) expresan IDO tras estimulación con interferón-gamma (IFN-γ), y
iv) presentan capacidad de diferenciarse en al menos dos linajes celulares
para la preparación o generación in vitro de células T reguladoras (T-reg), es decir, células que suprimen de manera 5 activa la activación del sistema inmunitario y previenen la autorreactividad patológica, es decir una enfermedad autoinmunitaria.
Células T-reg
10 Este documento divulga además células T reguladoras (T-reg), es decir, células (incluyendo T-reg Foxp3+CD4+CD25+ y células Tr1 productoras de IL-10/TGFb) que suprimen de manera activa la activación del sistema inmunitario y previenen la autorreactividad patológica, es decir una enfermedad autoinmunitaria, que pueden obtenerse de las células divulgadas por este documento, denominadas a continuación en el presente documento como células T-reg divulgadas por este documento.
15 Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para el aislamiento de una población de células T-reg divulgadas por este documento, que comprende:
(a) poner en contacto una población de células aisladas de tejido adiposo con leucocitos de sangre periférica, en donde las células de dicha población de células 20 i) no expresan al menos un marcador específico para células presentadoras de antígeno (CPA), en
donde el marcador específico para CPA es CD11b, CD11c, CD14, CD45 o HLAII,
ii) no expresan indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) de forma constitutiva,
iii) expresan IDO tras estimulación con interferón-gamma (IFN-γ), y
25 iv) presentan capacidad de diferenciarse en al menos dos linajes celulares y
(b) seleccionar la población de células T-reg del documento.
En consecuencia, las células divulgadas por este documento pueden usarse para producir un subconjunto de células
30 T, las células T-reg divulgadas por este documento, que constituye una divulgación adicional del presente documento. Las células T-reg divulgadas por este documento pueden aislarse por medios convencionales conocidos por un experto en la materia.
Las células T-reg divulgadas por este documento pueden usarse para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas
35 asociados con trastornos en los que la modulación del sistema inmunitario de un sujeto es beneficiosa, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios y enfermedades mediadas inmunológicamente incluyendo rechazo de tejidos y órganos trasplantados. Dicho uso constituye una divulgación adicional del presente documento.
40 Por tanto, en otra divulgación, las células T-reg divulgadas por este documento se usan como medicamento. En una divulgación particular, pueden usarse medicamentos que contienen las células T-reg divulgadas por este documento para inducir tolerancia a trasplante, o para tratar, y así aliviar, los síntomas de trastornos autoinmunitarios o inflamatorios, o enfermedades mediadas inmunológicamente incluyendo rechazo de tejidos y órganos trasplantados, en un sujeto que padece cualquiera de dichos trastornos o enfermedades. Por tanto, las células T-reg divulgadas por
45 este documento pueden usarse para tratar terapéutica o profilácticamente y así aliviar los síntomas de trastornos autoinmunitarios o inflamatorios en un sujeto que padece cualquiera de dichos trastornos o para aliviar los síntomas de enfermedades mediadas inmunológicamente en un sujeto que padece dichas enfermedades.
Prácticamente cualquier enfermedad autoinmunitaria, trastorno inflamatorio o enfermedad mediada
50 inmunológicamente puede tratarse con las células T-reg divulgadas por este documento. Ejemplos ilustrativos, no limitantes de dichos trastornos y enfermedades que pueden tratarse son los enumerados previamente con el encabezado “definiciones”. En una divulgación particular, dicha enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria crónica, tal como, por ejemplo, EII o AR.
55 En otra divulgación, el presente documento divulga el uso de las células T-reg divulgadas por este documento para la preparación de un medicamento para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con trastornos en los que la modulación del sistema inmunitario de un sujeto es beneficiosa, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios y enfermedades mediadas inmunológicamente incluyendo rechazo de tejidos y órganos trasplantados. Por tanto, este documento describe además el uso de las células T-reg
60 divulgadas por este documento para la preparación de un medicamento para suprimir la respuesta inmunitaria, o para inducir tolerancia a trasplante, o para tratar enfermedades autoinmunitarias, o para tratar trastornos inflamatorios. Se han mencionado previamente ejemplos de dichas enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias. En una divulgación particular, la enfermedad es una enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad inflamatoria crónica, por ejemplo, EII o AR.
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cualquiera de dichos trastornos o para aliviar los síntomas de enfermedades mediadas inmunológicamente en un sujeto que padece dichas enfermedades.
Prácticamente cualquier enfermedad autoinmunitaria, trastorno inflamatorio o enfermedad mediada inmunológicamente puede tratarse con las células preestimuladas con IFN-γ irradiadas divulgadas por este documento o con las células irradiadas preestimuladas con IFN-γ divulgadas por este documento. Ejemplos ilustrativos, no limitantes de dichas enfermedades y trastornos que pueden tratarse son los enumerados previamente con el encabezamiento “definiciones”. En una divulgación particular, dicha enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria crónica, tal como, por ejemplo, EII o AR.
En otra divulgación, el presente documento describe el uso de las células preestimuladas con IFN-γ irradiadas divulgadas por este documento o las células irradiadas preestimuladas con IFN-γ divulgadas por este documento para la preparación de un medicamento para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con trastornos en los que la modulación del sistema inmunitario de un sujeto es beneficiosa, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios y enfermedades mediadas inmunológicamente incluyendo rechazo de tejidos y órganos trasplantados. Por tanto, este documento se refiere además al uso de las células preestimuladas con IFN-γ irradiadas divulgadas por este documento o las células irradiadas preestimuladas con IFNγ divulgadas por este documento para la preparación de un medicamento para suprimir la respuesta inmunitaria, o para inducir tolerancia a trasplante, o para tratar enfermedades autoinmunitarias, o para tratar trastornos inflamatorios. Se han mencionado previamente ejemplos de dichas enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias. En una divulgación particular, la enfermedad es una enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad inflamatoria crónica, por ejemplo, EII o AR.
Composiciones farmacéuticas
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para el tratamiento, la profilaxis y la mejora de uno
o más síntomas asociados con un trastorno en el que la modulación del sistema inmunitario de un sujeto es beneficiosa tal como enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias y rechazo de tejidos y órganos trasplantados.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica, denominada a continuación en el presente documento la composición farmacéutica de la invención, que comprende una población de células aisladas de tejido adiposo caracterizada en que las células de dicha población de células
i) no expresan al menos un marcador específico para células presentadoras de antígeno (CPA), en donde el
marcador específico para CPA es CD11b, CD11c, CD14, CD45 o HLAII, ii) no expresan indolamina 2,3-dioxiganasa (IDO) de forma constitutiva, iii) expresan IDO tras estimulación con interferón-gamma (IFN-γ), y iv) presentan capacidad de diferenciarse en al menos dos linajes celulares
y un soporte farmacéuticamente aceptable para uso en prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios o rechazo de órganos y tejidos trasplantados.
La composición farmacéutica de la invención comprende una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de uno
o más agentes profilácticos o terapéuticos (es decir, una célula divulgada por este documento, o una célula T-reg divulgada por este documento, o una célula irradiada divulgada por este documento, o una célula preestimulada con IFN-γ divulgada por este documento, o una célula preestimulada con IFN-γ irradiada divulgada por este documento o una célula irradiada preestimulada con IFN-γ divulgada por este documento, o una combinación de las mismas), y un soprte farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, la expresión “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o uno estatal o enumerado en la Farmacopea Estadounidense, o la Farmacopea Europea u otra farmacopea reconocida generalmente para el uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término “soporte” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. La composición, si se desea, también puede contener cantidades minoritarias de agentes reguladores del pH. Se describen ejemplos de soportes farmacéuticos adecuados en “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por E.W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un agente profiláctico o terapéutico, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de soporte de manera que se proporciona la forma para la administración apropiada al sujeto. La formulación debe adecuarse al modo de administración. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas son estériles y están en una forma adecuada para su administración a un sujeto, preferiblemente un sujeto animal, más preferiblemente un sujeto mamífero, y lo más preferiblemente un sujeto humano.
La composición farmacéutica de la invención puede estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas sólidas, semisólidas y líquidas, tales como preparaciones liofilizadas, disoluciones o suspensiones líquidas, disoluciones inyectables e infusibles, etc. La forma preferida depende del modo de administración previsto y de la aplicación terapéutica.
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En otro aspecto, el documento describe un kit que comprende una población de células que contiene (i) células divulgadas por este documento y/o (ii) células T-reg divulgadas por este documento y/o (iii) células irradiadas divulgadas por este documento y/o (iv) células preestimuladas con IFN-γ divulgadas por este documento y/o (v) células preestimuladas con IFN-γ irradiadas divulgadas por este documento y/o (vi) células irradiadas preestimuladas con IFN-γ divulgadas por este documento. Los kits divulgados por este documento pueden comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o todos de tales tipos de células.
Métodos de tratamiento
En otra divulgación, el presente documento describe el uso de una población de células que contiene células divulgadas por este documento, población de células T-reg divulgadas por este documento, células irradiadas divulgadas por este documento, células preestimuladas con IFN-γ divulgadas por este documento, células preestimuladas con IFN-γ irradiadas divulgadas por este documento o células irradiadas preestimuladas con IFN-γ divulgadas por este documento para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios o enfermedades mediadas inmunológicamente incluyendo rechazo de tejidos y órganos trasplantados. En una divulgación particular, dichas poblaciones de células pueden usarse para inducir tolerancia a trasplante, o para tratar, y de ese modo aliviar, los síntomas de trastornos autoinmunitarios o inflamatorios, o enfermedades mediadas inmunológicamente en un sujeto que padece dichos trastornos o enfermedades. Se han mencionado previamente ejemplos de dichas enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias. En una divulgación particular, la enfermedad es una enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad inflamatoria crónica, por ejemplo, EII o AR.
En otra divulgación, el presente documento describe métodos de prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios o enfermedades mediadas inmunológicamente, en un sujeto que padece dichos trastornos o enfermedades, que comprende administrar a dicho sujeto que necesita tal tratamiento una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una población de células que contiene células divulgadas por este documento, células T-reg divulgadas por este documento, células irradiadas divulgadas por este documento, células preestimuladas con IFN-γ divulgadas por este documento, células preestimuladas con IFN-γ irradiadas divulgadas por este documento o células irradiadas preestimuladas con IFN-γ divulgadas por este documento. En una divulgación particular, dichas poblaciones de células pueden usarse para inducir tolerancia a trasplante, o para tratar, y de ese modo aliviar, los síntomas de trastornos autoinmunitarios o inflamatorios o enfermedades mediadas inmunológicamente en un sujeto que padece dichos trastornos o enfermedades. Se han mencionado previamente ejemplos de dichas enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias. En una divulgación particular, la enfermedad es una enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad inflamatoria crónica, por ejemplo, EII o AR.
Ejemplos
La invención se describirá ahora en más detalle, a modo de ejemplos que de ninguna manera pretenden limitar el ámbito de la invención, sino que, más bien, estos ejemplos servirán para ilustrar la invención con referencia a las figuras adjuntas.
Ejemplo 1
Aislamiento y expansión de células de la invención
I. Material y métodos
Aislamiento de células divulgadas por este documento de tejido adiposo
Se obtuvo tejido adiposo humano mediante liposucción, con anestesia local y sedación general. Se introdujo una cánula hueca de punta roma en el espacio subcutáneo a través de una pequeña incisión (inferior a 0,5 cm de diámetro). Con succión suave, la cánula se movió a través del compartimento de tejido adiposo de la pared abdominal para la rotura mecánica del tejido graso. Se inyectaron una solución salina y el vasoconstrictor epinefrina en el compartimento del tejido adiposo para minimizar la pérdida de sangre. De esta manera, se obtuvieron de 80 a 100 ml de lipoaspirado de partida de cada paciente que iba a tratarse.
Se lavó el lipoaspirado de partida exhaustivamente con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS; Gibco BRL, Paisley, Escocia, RU) para eliminar las células sanguíneas, la solución salina y el anestésico local. Se digirió la matriz extracelular con una disolución de colagenasa tipo II (0,075%; Gibco BRL) en solución salina equilibrada (5 mg/ml; Sigma, St. Louis, EE UU) durante 30 minutos a 37ºC para liberar la fracción celular. Entonces se inactivó la colagenasa mediante la adición de un volumen igual de medio de cultivo celular (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco BRL)) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS; Gibco BRL). Se centrifugó la suspensión de células a 250 x g durante 10 minutos. Se resuspendieron las células en NH4Cl 0,16 M y se dejaron reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente (TA) para la lisis de los eritrocitos. Se centrifugó la mezcla a 250 x g y se resuspendieron las células en DMEM más FBS al 10% y mezcla al 1% de ampicilina/estreptomicina (Gibco
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I. Material y métodos
Se sembraron las células divulgadas por este documento aisladas de tejido adiposo humano (ejemplo 1) sobre placas de cultivo de tejidos a una densidad de 10.000 células/cm2, y se incubaron durante 48 horas en las condiciones descritas anteriormente para la expansión celular. Luego, se añadieron diferentes estímulos proinflamatorios al medio de cultivo, incluyendo:
Interleucina-1 (IL-1): 3 ng/ml Interferón-gamma (IFN-γ): 3 ng/ml Factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α): 5 ng/ml Lipopolisacárido (LPS): 100 ng/ml
Se incubaron las células en presencia del estímulo correspondiente durante periodos que oscilaban desde 30 minutos hasta 48 horas, y entonces se recogieron mediante digestión con tripsina, y se lisaron en tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, PMSF 1 mM (fluoruro de fenil-metilsulfonilo), EDTA 1 mM (ácido etilendiaminotetraacético), aprotinina 5 µg/ml, leupeptina 5 µg/ml, Triton x-100 al 1%, desoxicolato de sodio al 1%, SDS al 0,1%) que contenía inhibidores de proteasa. Entonces se usaron los lisados celulares en un experimento de inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo monoclonal específico para IDO (IgG monoclonal de ratón, clon 10.1, de Upstate cell signaling solutions). Además, se aisló ARN de las células tratadas y se sometió a prueba mediante experimentos de transcripción inversa -reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) usando cebadores específicos para el ADNc de IDO (número de registro de GenBank M34455 (GI:185790))
directo 5’ GGATTCTTCCTGGTCTCTCTATTGG 3’; inverso: 5’ CGGACTGAGGGATTTGACTCTAATG 3’).
II. Resultados
Los resultados de este experimento [figura 3A (RT-PCR) y 3B (inmunotransferencia de tipo Western)] muestran que las células proporcionadas por el presente documento no expresan IDO de manera constitutiva. El ARNm de IDO se induce tras 2 horas de estimulación con IFN-γ, pero la expresión de la proteína puede detectarse sólo entre 8-24 horas de inducción.
Se obtuvieron resultados similares cuando se aislaron las células divulgadas por este documento de otros tejidos humanos, incluyendo: médula ósea, cartílago articular y piel (figura 4).
Ejemplo 3
Comportamiento tumorígeno
I. Material y métodos
Se realizó este experimento con células divulgadas por este documento aisladas de tejido adiposo humano tal como se describió en el ejemplo 1. Se cultivaron las muestras de células durante 2-7 semanas antes del implante subcutáneo en ratones inmunodeficientes (5 x 106 células/ratón). Los ratones eran de la cepa nu/nu obtenidos de Charles River Laboratories. Los ratones carecían de timo y tenían deficiencia en células T. Se siguieron los ratones a los que se les realizó el implante durante 4 meses antes del sacrificio y el estudio patológico.
Estudio patológico: Se realizó una necropsia en todos los animales. Se examinaron los animales para determinar anomalías macroscópicas en el cerebro, pulmones, corazón, hígado, riñones, bazo, ganglios linfáticos abdominales y sitio de inyección. Se recogieron los tejidos para realizar un examen histológico (seccionamiento en parafina y tinción con hematoxilina-eosina (H&E), incluyendo el sitio de inyección, los pulmones y los ganglios linfáticos.
Se usó la línea celular de teratoma (N-TERA) como control positivo, que se implantó en condiciones idénticas.
II. Resultados
Los resultados muestran que, mientras que todos los ratones a los que se les implantaron células de teratoma desarrollaron tumores tras unas pocas semanas, ninguno de los animales a los que se les implantaron las células divulgadas por este documento desarrollaron tumores en el plazo de los 4 primeros meses tras el implante [datos no mostrados].
Ejemplo 4
Tratamiento de EII inducida experimentalmente en ratones
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