KR101536239B1 - 면역조절활성을 갖는 세포 개체군, 분리 방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 이에 제한되지는 않지만 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선에 사용되는 인돌아민-2,3-디옥시게나아제 (IDO)를 발현함에 의해 인터페론-감마 (IFN-γ)에 반응하는 결합 조직 유래 세포들의 개체군을 제공한다.

Description

면역조절활성을 갖는 세포 개체군, 분리 방법 및 용도{CELL POPULATIONS HAVING IMMUNOREGULATORY ACTIVITY, METHOD FOR ISOLATION AND USES}
본 발명은, 성인 조직으로부터 유래된 세포 개체군들을 이용하여 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들의 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 이에 제한되지는 않지만 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선에 사용되는 인돌아민-2,3-디옥시게나아제 (IDO)를 발현함에 의해 인터페론-감마 (IFN-γ)에 반응하는 결합 조직 유래 세포들의 개체군을 제공한다.
고등 척추동물에서, 면역계는 각종 질환들의 원인 물질인 세균, 진균 및 바이러스와 같은 미생물들을 포함하는, 그 척추동물의 체내로 들어갈 수 있는 각종 항원들에 대항하는 1차 방어선을 의미한다. 또한, 면역계는, 자가 면역 또는 면역병리학적 질환들, 면역결핍 증후군들, 아테롬성 동맥경화증 (atherosclerosis) 및각종 종양성 질환들을 포함하는, 각종 기타 질환들 또는 장애들에도 관련된다. 이들 질환들의 치료 방법들이 있지만, 현재의 많은 치료법들은 적절한 수준 이하의 결과들을 제공한다. 신규의 새로운 치료 전략들 중, 세포 치료에 기초를 둔 전략들이 다수의 질환들의 치료에 대해 잠재적으로 유용한 도구를 구성하는 것으로 보인다. 따라서, 상기 목적을 달성하기 위하여, 연구자들에 의해 많은 노력이 이루어지고 있다.
자가면역 질환
세균, 바이러스 및 임의의 기타 외래물에 대항하여 신체를 방어하도록 되어있는 신체 면역계가 제대로 기능하지 않고, 건강한 조직, 세포 및 장기에 대하여 병리학적인 반응을 일으킬 때, 자가면역 질환이 유발된다. 항체들, T 세포들 및 마크로파지들은 유익한 보호를 제공하지만, 해롭거나 또는 치명적인 면역학적 반응들도 생성할 수 있다.
자가면역 질환은 장기 특이적 또는 전신성일 수 있으며, 상이한 병원성 메커니즘에 의해 유발된다. 장기 특이적 자가면역화는 주조직적합성 복합체 (MHC) 항원의 이상 발현, 항원성 의태 (mimicry) 및 MHC 유전자에서의 대립유전자 변이에 의해 특징된다. 전신성 자가면역 질환은 다클론성 B 세포 활성화 및 면역조절성 T 세포, T 세포 수용체 및 MHC 유전자의 이상을 포함한다. 장기 특이적 자가면역 질환의 예로는 당뇨병, 갑상선기능 항진증, 자가면역 부신 기능부전, 순적혈구 빈혈, 다발성 경화증 및 류마티스성 심질환이 있다. 대표적인 전신 자가면역 질환들에는 전신 홍반성 낭창, 만성 염증, 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 다발성 근염, 피부근염 및 경피증이 있다.
현재 자가면역 질환의 치료는 코르티손 (cortisone), 아스피린 유도체, 히드록시클로로퀸 (hydroxychloroquine), 메토트렉세이트 (methotrexate), 아자티오프린 (azathioprine) 및 시클로포스파미드 (cyclophosphamide) 또는 이들의 조합과 같은 면역억제제의 투여를 포함한다. 그러나, 면역억제제 투여시 직면하는 딜레마는, 그 자가면역 질환이 보다 효과적으로 치료될수록, 환자가 감염의 공격에 대해 보다 무방비가 되고, 종양 발생에 대한 감수성 또한 더욱 커진다는 것이다. 따라서, 자가면역 질환의 치료를 위한 신규 치료법들이 크게 요구되고 있다.
염증성 장애
염증은, 그로 인해 신체의 백혈구 세포들 및 분비된 인자들이, 세균 및 바이러스와 같은 외래 물질들에 의한 감염으로부터 우리 신체를 보호하는 과정이다. 시토카인 및 프로스타글란딘으로 알려진 분비 인자들이 이 과정을 제어하며, 순차적이고 자기제한적인 (self-limiting) 캐스캐이드 반응으로, 혈액 또는 병에 걸린 조직 내로 방출된다.
염증성 장질환( IBD : Inflammatory Bowel Disease )
IBD는 만성, 특발성, 재발성 및 조직 파괴성 질환들의 군으로, 점막 T 세포들의 기능장애, 변경된 시토카인 생산 및 궁극적으로 원위 소장 및 결장 점막의 손상을 일으키는 세포 감염에 의해 특징된다. IBD는 임상적으로 2 개의 표현형으로 분류된다: 크론병 (CD) 및 궤양성 대장염. CD는 현재 치료할 수 없는, 0.05% 유병률 (prevalence)의 자가면역 질환으로, 일정 범위의 위장관 및 비창자성 증상을 초래하는 만성 염증을 유발하며, 복통, 직장 출혈, 설사, 체중감소, 피부 및 눈의 장애, 및 어린이에서 성장 및 성적 성숙의 지연을 포함한다. 이들 증상들은 환자의 안녕, 삶의 질 및 기능 역량에 큰 영향을 줄 수 있다. CD는 만성이고 전형적으로 30세 이전에 발병하기 때문에, 환자들은 일반적으로 평생의 치료를 필요로 한다. 이의 병인은 알지 못한 채로 남겨져 있으나, CD가 내생의 항원에 대한 면역 반응을 약화시키는 점막 면역계의 기능부전과 관련된다는 추정적인 증거가 있다.
현재 CD에 사용되는 치료제들은 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드, 아자티오프린, 6-머캡토퓨린, 항생제 및 메토트렉세이트를 포함하며, 이들은 완전히 유효하지는 않으며, 비특이적이고 다수의 좋지 않은 부작용을 갖는다. 대부분의 경우들에서, 외과적 절제술이 최종적인 대안이다. 따라서, 본 치료 전략은 질환의 두 성분들, 즉 염증성 및 T-세포 유도된 반응들을 모두 특이적으로 조절하는 약물 또는 약제를 찾고자 하는 것이다.
최근, 인플릭시맵 (infliximab) 약물이, 표준 치료법에 반응하지 않는 중증 내지 심한 크론병의 치료, 및 개방된, 유출 누공 (draining fistual)의 치료에 대해 승인되었다. 인플릭시맵은 크론병에 대해 특이적으로 승인된 최초의 치료로, 항-종양 괴사 인자 (TNF) 항체이다. TNF는, 크론병과 관련된 염증을 유발할 수 있는, 면역계에 의해 생성된 단백질이다. 항-TNF는 TNF가 창자에 도달하기 전에 혈류로부터 그를 제거하여, 염증을 방지한다. 그러나, 이는 전신 효과를 갖고, TNF는 매우 다면적인 (pleiotropic) 인자이기 때문에, 심각한 부작용들이 비교적 일반적이며, 그의 장기간 안전성도 결정되어져야 한다. 또한, 환자들에서 일어나는 많은 염증성 과정들이 TNF 신호화 (signalling)에 의존적이지 않기 때문에, 그 효능도 제한적이다.
류마티스 관절염 ( RA )
류마티스 관절염 및 소아 류마티스 관절염은 염증성 관절염의 유형이다. 관절염은 관절에서의 염증을 설명하는 일반적인 용어이다. 전부는 아니지만 일부 유형의 관절염은 잘못겨냥된 (misdirected) 염증의 결과이다. 류마티스 관절염은 세계 인구의 약 1 %가 걸리며, 본질적으로 불구화된다. 류마티스 관절염은, 신체 면역계가 관절에서 윤활액을 분비하는 활막을 이질의 것으로서 부적절하게 인지하는 자가면역 장애이다. 염증 결과 및 관절 내 및 관절 주변의 연골 및 조직들은 손상되거나 또는 파괴된다. 신체는 손상된 조직을 반흔(scar) 조직으로 대체하여, 관절 내의 정상적인 공간을 협소하게 만들고 뼈들은 서로 융합되게 한다.
류마티스 관절염에서는, 계속적인 항원 제시, T-세포 자극, 시토카인 분비, 활액세포 활성화 및 관절 파괴의 면역 사이클이 있다.
현재 유용한 관절염 치료법은 소염성 또는 면역억제성 약물을 이용하여 관절의 염증을 감소시키는 데 집중하는 것이다. 임의의 관절염의 제 1선의 치료는 일반적으로 소염제, 예컨대 아스피린, 이부프로펜 및 Cox-2 저해제 예컨대 셀레콕십 (celecoxib) 및 로페콕십 (rofecoxib)이다. 항-TNF 인간화 단일클론성 항체, 예컨대 인플릭시맵도 사용된다; 그러나 이는 많은 이차적인 효과들 또는 부작용들을 가지며 그의 효능은 상당히 낮다. "제 2선의 약물"은 금, 메토트렉세이트 및 스테로이드를 포함한다. 이들은 비록 관절염에 대해 잘 확립된 치료들이지만, 매우 소수의 환자들만이 이들 치료선상 단독에서 차도를 보이며, 류마티스 관절염 환자들에서 어려운 치료 문제들이 여전히 남아있다.
일반적으로, 현재 만성 염증성 장애들의 치료들은 매우 한정적인 효능을 가지며, 그들 중 다수가 높은 부작용 발생률을 가지거나 또는 질환의 진전을 완전히 방지할 수 없다. 이때까지, 어떤 치료도 이상적이지 않으며, 이러한 유형의 병리학에 대한 치료는 없다. 따라서, 염증성 장애들의 치료를 위한 신규 치료법이 크게 요구된다.
T-세포 반응의 저해
모든 면역 반응들은 T 세포에 의해 제어된다. 자가면역 반응들을 내는 능력을 갖는 자기반응성 세포들은 정상의 T 세포 레퍼토리 (repertoire)의 일부를 포함하지만, 건강한 상태에서는, 그들의 활성화는 억제세포들에 의해 방지된다. T 억제세포들은 원래 1970년대에 설명되었지만, T-세포 서브세트들 (subsets)을 특징화하는데 있어서의 진전은 겨우 최근에야 이루어졌으며, 이때 이들은 규제 T 세포로서 다시 명명되었다.
규제 (억제) 활성을 갖는 상이한 CD4+, CD8+, 자연 살상세포, 및 γδ T 세포 서브세트들이 있다. 2 가지 주요 유형의 T-reg 세포들은 CD4+ 개체군, 즉 자연적으로 존재하는 흉선-생성된 T-reg 세포들, 및 말초적으로 유도된 IL-10 또는 TGF-β 분비 T-reg 세포들 (Tr1 세포들)로 특징된다. CD4+CD25+는, 흉선에서 생성된, 자연적으로 존재하는 Foxp3-발현 T-reg 세포로, 이동하여 말초에서 유지된다. 이들의 흉선 생성에 대한 신호 및 말초에서의 유지는 완전히 규정되지 않았지만, CD28 자극 및 IL-2 모두가 필요한 것으로 나타난다. 이들 세포들은 아네르기성 (anergic)이며 아폽토시스 (apoptosis)되는 경향이 있고, 그들의 기원 자리인 흉선은 연령에 따라 퇴화되지만, 말초에서의 CD4+CD25+ T-reg 세포들의 수는 나이에 따라 감소하지 않는다. 이는 CD4+CD25+ T-reg 세포들의 풀이 말초적으로 유지된다는 것을 암시한다. 몇몇 실험들은 CD4+CD25- T 세포들로부터의 CD4+CD25+ T-reg 세포들의 말초 생성에 대한 생각을 뒷받침하여준다. CD4+CD25+ T-reg 세포들의 말초 확장을 제어하는 내생의 인자들 및 메커니즘들은 대개 알려지지 않았다.
시토카인 변형 성장 인자-베타 (TGF-β)가 혈액 내에서 순환하는 흉선 유래의, 전문 CD4+ CD25+ 전구체들의 확장에 중요한 역할을 한다는 증거가 있다. TGF-β는 말초적으로 유도된 CD4+ 및 CD8+ 규제 서브세트의 생성에도 연루된다.
그러나, 최근 실험 데이타는, 면역내성의 메커니즘은 트립토판 대사, 특히 키누레닌(kynurenine) 경로를 따른 트립토판 분해에서 초기 속도-제한 (rate-limiting) 단계를 촉매하는 세포내 헴-함유 효소인 인돌아민 2,3-디옥시게나아제 (IDO)의 활성에 의존적일 수 있다는 것을 제안한다.
IDO를 발현하는 세포들이 T 세포 반응을 억제하고 내성을 촉진할 수 있다는 가설을 뒷받침하는 현저한 증거가 있다 (Mellor 및 Munn, Nat Rev Immunol. 2004 Oct; 4(10):762-74). IDO는, 면역 반응의 주요 조절제들인, 일부 수지상 세포들 (DCs)의 서브세트들에서 발현된다 (면역관용원성 DCs). 이들 DCs 는 국부적으로 트립토판을 고갈시킴에 의해 생체 내 T-세포 반응들을 억제할 수 있다 (US 특허 제 2002/0155104호). 단핵세포 유래의 DCs 및 마크로파지들은 제외하고, 몇몇 종양주들, 장관 세포들 및 영양모세포들(trophoblasts)은 IDO를 발현한다. 영양모세포들에서 IDO의 발현은 구성적인 것으로 나타나며, 태아로부터의 동종성 (allogeneic) 조직의 내성에 강하게 상관되어 왔다. IDO는 T 세포들에서 아폽토시스를 유도하고, 간 동종이식편에 대한 자발적인 내성을 유발하는 것으로 생각된다.
IDO의 면역억제 활성 이면의 분자 메커니즘은 알려지지 않았다. 그러나, IDO를 발현하는 DCs가 규제 T 세포들의 생성을 유도할 수 있다는 것이 증명되어져 왔다. IDO는, 인터페론 및 지질다당질 (LPS)을 포함하는 몇몇 염증성 매개자들에 의해, 또한 바이러스 감염에 의해 인간 세포들에서 유도된다. 몇몇 연구들은, 숙주 면역계에 의해 거부되는 동종성 종양 세포들이 생체 내 실험에서 IDO 를 상향조절 (up-regulate)하고, 이러한 효과는 IFN-γ에 의해 매개된다는 것을 보여주었다.
최근 실험들은 골수 유래된 중배엽 줄기세포들 (MSCs) 및 지방세포 유래 줄기세포들 (ASCs)의 시험관 내 면역억제능 및 MSCs의 생체 내 면역억제능을 지적하였다. 이러한 생체 내 활성은 골수 이식에서 연구되어 왔으며, 여기에서 확장된 MSCs의 주입은 급성 및 만성의 이식편 대 숙주 질환을 (GVHD)을 감소시키는 것으로 나타난다. 상기 시험관 내 효과는, 림프구들이 혼합 림프구 반응 (MLR) 또는 파이토헤마글루티닌 (phytohemagglutinin) (PHA)을 이용한 자극 중 하나를 통해 활성화되는 실험들에서 림프구 증식의 억제에 의해 특징된다. 그러나, 상기 세포들의 면역억제 효과에 책임이 있는 분자 메커니즘은 명확하게 확인되지는 않았다.
본 발명은, 성인 조직으로부터 유래된 세포 개체군들을 이용하여 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들의 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선을 목적으로 한다. 특히, 본 발명은, 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선에 사용되는 인돌아민-2,3-디옥시게나아제 (IDO)를 발현함에 의해 인터페론-감마 (IFN-γ)에 반응하는 결합 조직 유래 세포들의 개체군을 제공함을 목적으로 한다.
발명의 개요
본 발명은, 상이한 결합 조직들 중에 존재하는 다중계통 (multilineage)능을 갖는 특정 세포 개체군들이 생체 내 및 시험관 내에서 면역조절제로서 작용할 수 있다는 발견을 기초로 한다. 본 발명자들은 인돌아민-2,3-디옥시게나아제 (IDO)를발현함에 의해 인터페론-감마 (IFN-γ)에 반응하는 결합 조직 유래 세포들의 개체군을 분리하였다. 상기 세포들의 면역조절 효과는 이에 제한되지는 않지만, 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선에 사용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 결합 조직으로부터 분리된 세포 개체군에 관한 것으로, 여기에서 상기 세포 개체군의 세포들은: (i) 항원-제시 세포들 (APC)로부터 특이적인 마커들, 즉 항원 제시 세포들에 대해 특이적인 마커들을 발현하지 않고; (ii) 인돌아민 2,3-디옥시게나아제 (IDO)를 구성적으로 발현하지 않으며; (iii) 인터페론-감마 (IFN-γ)로 자극시 IDO를 발현하고; 및 (iv) 적어도 두 개의 세포 계통들로 분화되는 능력을 나타낸다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 세포 개체군의 분리 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 의해 수득가능한 세포 개체군은 본 발명의 추가적인 측면을 구성한다.
다른 측면에서, 본 발명은 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들의 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선에 사용되는 상기 세포 개체군에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서의 용도를 위한 또는 이식 내성 유도를 위한, 또는 자가면역 질환들의 치료를 위한, 또는 염증성 질환의 치료를 위한 상기 세포 개체군에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 상기 염증성 질환은, 예로서 염증성 대장 질환 (IBD) 또는 류마티스 관절염 (RA)와 같은 만성 염증성 질환이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 세포 개체군의 의약 제조에서의 용도에 관한 것으로, 예컨대 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들의 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선용 의약, 예로서 이식 내성 유도용 의약, 또는 자가면역 질환 치료용 의약, 또는 염증성 질환 치료용 의약이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 세포 개체군의 규제 T-세포들 (T-reg)의 생산 및 생성에서의 용도에 관한 것이다. 상기 T-reg 세포 개체군 및 그의 분리 방법도 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서의 용도를 위한, 이식 내성의 유도를 위한, 또는 자가면역 질환의 치료를 위한, 또는 염증성 질환의 치료를 위한, 상기 T-reg 세포 개체군에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 T-reg 세포 개체군의 의약 제조에서의 용도에 관한 것으로, 예컨대 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들의 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선용 의약, 예로서 이식 내성 유도용 의약, 또는 자가면역 질환 치료용 의약, 또는 염증성 질환 치료용 의약, 또는 알레르기, 예로서 이에 제한되지는 않지만 과민감성 IV형 반응 치료용 의약이다.
다른 측면에서, 본 발명은 방사선 조사된 세포 개체군의 분리 방법에 관한 것으로, 이는 상기 세포 개체군을 적절한 조건 하에서 전리 방사선 (ionizing radiation)의 제어된 공급원을 사용하여 조사하는 것을 포함한다. 상기 방사선 조사된 세포 개체군은 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서의 용도를 위한 또는 이식 내성의 유도를 위한, 또는 자가면역 질환의 치료를 위한, 또는 염증성 질환의 치료를 위한 상기 방사선 조사된 세포 개체군에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 방사선 조사된 세포 개체군의 의약 제조에서의 용도에 관한 것으로, 예컨대 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들의 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선용 의약, 예로서 이식 내성 유도용 의약, 또는 자가면역 질환 치료용 의약, 또는 염증성 질환 치료용 의약이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 상기 세포 개체군을 인터페론-γ (IFN-γ) 처리에 투입하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 IFN-γ 처리된 세포 개체군은 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.
다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서의 용도를 위한 또는 이식 내성의 유도를 위한, 또는 자가면역 질환의 치료를 위한, 또는 염증성 질환의 치료를 위한 상기 IFN-γ 처리된 세포 개체군에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 IFN-γ 처리된 세포 개체군의 의약 제조에서의 용도에 관한 것으로, 예컨대 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들의 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선용 의약, 예로서 이식 내성 유도용 의약, 또는 자가면역 질환 치료용 의약, 또는 염증성 질환 치료용 의약이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 상기 세포 개체군을 (i) 방사선 조사, 및 (ii) IFN-γ로의 자극에 투입하는 것을 포함하는 방법에 관한 것으로, 여기에서 상기 처리 (i) 및 (ii)는 임의의 순서로 실시된다. 상기 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포 개체군 또는 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포 개체군은 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.
다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서의 용도를 위한 또는 이식 내성의 유도를 위한, 또는 자가면역 질환의 치료를 위한, 또는 염증성 질환의 치료를 위한 상기 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포 개체군 또는 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포 개체군에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포 개체군 또는 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포 개체군의 의약 제조에서의 용도에 관한 것으로, 예컨대 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들의 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선용 의약, 예로서 이식 내성 유도용 의약, 또는 자가면역 질환 치료용 의약, 또는 염증성 질환 치료용 의약이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 염증성 장애, 또는 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들과 관련된 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 개선하기 위한, 상기 세포 개체군, 또는 상기 T-reg 세포 개체군, 또는 상기 방사선 조사된 세포 개체군, 또는 상기 IFN-γ 처리된 세포 개체군, 또는 상기 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포 개체군 또는 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포 개체군의 용도에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 장애들 또는 질환들 중 임의의 병을 겪고 있는 대상에서 자가면역 질환, 염증성 장애 또는 면역학적으로 매개된 질환들과 관련된 하나 이상의 증상들을 예방, 치료 또는 개선하는 방법에 관한 것으로, 이는 그러한 치료를 필요로 하는 상기 대상에게 예방 또는 치료 유효량의 상기 세포 개체군 또는 T-reg 세포 개체군 또는 상기 방사선 조사된 세포 개체군, 또는 상기 IFN-γ 처리된 세포 개체군, 또는 상기 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포 개체군 또는 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포 개체군을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 병용 요법에서의 상기 방법들의 용도에 관한 것으로, 즉 본 발명의 세포 개체군은 하나 이상의 약제와 함께, 제 2 또는 추가의 약제와, 동시에 또는 개별적으로, 예로서 순차적으로 공동투여된다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 세포 개체군 또는 T-reg 세포 개체군 또는 상기 방사선 조사된 세포 개체군, 또는 상기 IFN-γ 처리된 세포 개체군, 또는 상기 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포 개체군 또는 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포 개체군 및 허용가능한 약학적 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 세포가 IFN-γ로 자극시 IDO를 발현하는지의 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 다능성 성체 세포들 (adult multipotent cell)을 분화된 세포들로부터 구분하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 세포 개체군 또는 T-reg 세포 개체군 또는 상기 방사선 조사된 세포 개체군, 또는 상기 IFN-γ 처리된 세포 개체군, 또는 상기 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포 개체군 또는 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포 개체군을 포함하는 키트에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
이미 언급된 바와 같이, 발명자들은 전부는 아니어도 각종 결합 조직들에 존재하고, 인돌아민-2,3-디옥시게나아제 (IDO)를 발현함으로써 인터페론-γ (IFN-γ)에 반응하는 다중계통능을 가진 특정 세포 개체군들이 생체 내 및 시험관 내에서 면역조절제로서 작용할 수 있음을 발견하였다. 상기 세포들의 면역억제 면역조절 효과는 이에 제한되지는 않지만 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계의 조절이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선에 사용될 수 있다.
정의
본 발명의 설명의 이해를 돕기 위하여, 본 발명의 문맥에서의 일부 용어들 및 표현의 의미를 아래에 설명할 것이다. 추가의 정의들은 필요한 경우 설명에 포함될 것이다.
"항원 제시 세포" (APC)라는 용어는 그의 표면 상에서 MHC (주조직적합성 복합체)와 합성된 외래 항원을 나타내는 세포 개체군을 의미한다. 신체 내의 거의 모든 세포가 T 세포들에게 항원을 제시할 수 있으나, 여기에서 "항원 제시 세포" (APC)는 그들의 표면에서 HLAII를 발현하고, 단핵구-마크로파지 계통 (예로서, 수지상 세포들)으로부터 유래된, 전문 APC로도 명명되는, 전문화된 세포들에 한정된다.
"자가면역 질환"이라는 용어는 어떤 대상에서, 그 대상의 자신의 세포, 조직 및/또는 장기에 대한 면역학적 반응에 의해 일어난 세포, 조직 및/또는 장기 손상으로써 특징되는 상태를 의미한다. 본 발명의 세포 개체군으로 처리될 수 있는 자가면역 질환들의 예시적이며 비제한적인 예들은 다음을 포함한다: 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 에디슨병 (autoimmune Addison's disease), 부신선의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병 (Behcet's disease), 유천포창 (bullous pemphigoid), 심근증, 셀리악 스프루-피부염 (celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역 기능부전 증후군 (CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발 신경병증 (chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 척-스트라우스 증후군 (Churg-Strauss syndrome), 반흔성 탈모증, CREST 증후군, 저온 응집병 (cold agglutinin disease), 원판상 낭창 (discoid lupus), 본태성 복합 냉글로불린혈증 (essential mixed cryoglobulinemia), 섬유근육통-섬유근육염 (fibromyalgia-fibromyositis), 사구체 신염, 그레이브즈 병 (Graves' disease), 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre), 하시모토 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis), 특발성 폐 섬유증 (idiopathic pulmonary fibrosis), 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), IgA 신경장애, 연소기 관절염 (juvenile arthritis), 편평 태선, 메니에르병 (Meniere's disease), 혼합성 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 1 형 또는 면역-매개된 진성 당뇨병, 중근무력증, 심상성 천포창 (pemphigus vulgaris), 악성 빈혈, 결절성 다발 동맥염, 다발연골염 (polychrondritis), 다분비선 증후군, 다발성 근육통, 다발성 근염 및 피부다발성근염, 원발성 무감마글로불린혈증 (primary agammaglobulinemia), 원발성 담즙 경화 (primary biliary cirrhosis), 건선, 건선 관절염, 레이놀즈 현상 (Raynauld's phenomenon), 라이터 증후군 (Reiter's syndrome), 유육종증 (sarcoidosis), 피부경피증 (scleroderma), 진행성 전신성 경피증, 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 굿 패스쳐스 증후군 (Good pasture's syndrome), 강직인간 증후군 (stiff-man syndrome), 전신 홍반성 낭창, 홍반성 낭창, 다까야수 동맥염 (takayasu arteritis), 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관병증 예컨대 포진상 피부염 혈관병증 (dermatitis herpetiformis vasculitis), 백반증, 베게너 육아종 (Wegener's granulomatosis), 등.
"면역 조절제" 라는 용어는 면역계의 하나 이상의 생물학적 활성들을 저해 또는 감소시키는 약제를 의미한다. 면역 조절제는 하나 이상의 면역 세포들 (예로서, T 세포들)의 하나 이상의 생물학적 활성들 (예로서, 항원들의 증식, 분화, 프라이밍 (priming), 작동체 기능, 시토카인의 생산 또는 항원들의 발현)을 저해 또는 감소시키는 약제이다.
"염증성 질환"이라는 표현은 염증, 예로서 만성 염증으로써 특징되는 어떤 대상에서의 상태를 의미한다. 염증성 장애들의 예시적인, 비제한적인 예들은 이에 제한되지는 않지만, 류마티스 관절염 (RA), 염증성 장 질환 (IBD), 천식, 뇌염, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 염증성 골 용해, 알레르기성 장애, 패혈성 쇼크, 폐 섬유화증 (예로서, 특발성 폐 섬유화증), 염증성 혈관병증 (예로서, 결절성 다발 동맥염, 베게너 육아종, 다까야수 동맥염, 측두 동맥염 및 육아종성 림프종), 외상후 혈관 혈성술 (예로서, 혈관형성술 후 재협착), 미분화된 척추관절병증, 미분화된 관절증, 관절염, 염증성 골 용해, 만성 간염 및 만성 바이러스성 또는 세균 감염으로 인한 만성 염증을 포함한다.
세포 개체군에 적용된 "분리된"이라는 용어는 인간 또는 동물의 신체로부터 분리된, 생체 내 또는 시험관 내에서 상기 세포 개체군과 연합되는 하나 이상의 세포 개체군들이 실질적으로 없는, 세포 개체군을 의미한다.
"MHC (주조직 적합성 복합체)" 라는 용어는 세포 표면 항원 제시 단백질들을 암호화하는 유전자들의 서브세트를 의미한다. 인간에서, 이들 유전자는 인체 백혈구 항원 (HLA) 유전자로서 명명된다. 여기에서, MHC 또는 HLA 라는 약어는 상호교환가능하게 사용된다.
"대상"이라는 용어는, 동물, 바람직하게는 비-영장류 (예로서, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 또는 마우스) 및 영장류(원숭이 또는 인간)를 포함한 포유동물을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 상기 대상은 인간이다.
"T-세포"라는 용어는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하는 림프구들의 서브세트인 면역계의 세포들을 의미한다.
"규제 T-세포들" (T-reg 세포들)이라는 용어는 면역계의 활성화를 활발히 억제하고 병리학적 자가-반응성, 즉 자가면역 질환을 방지하는 T 세포 서브세트들을 의미한다.
여기 사용된 것과 같은, "치료하다", "치료" 및 "치료"라는 용어들은 이에 제한되지는 않지만, 본 발명의 세포 개체군, 본 발명의 T-reg 세포 개체군, 또는 본 발명의 IFN-γ-예비자극된 세포 개체군, 또는 이를 포함하는 약학 조성물을, 상기 치료를 필요로 하는 대상에게 투여함에 의해 초래되는, 염증성 장애, 자가면역 질환 또는 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질병을 포함하는 장애와 관련된 하나 이상의 증상들의 개선을 의미한다.
"병용 요법"이라는 용어는 본 발명의 세포 개체군들과 함께 기타 활성제 또는 치료 양식들을, 이에 제한되지는 않지만 염증성 장애, 자가면역 질환 또는 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환을 포함하는 장애와 관련된 하나 이상의 증상들의 개선을 위하여, 본 발명의 방식으로 사용하는 것을 의미한다. 이들 기타 약제들 또는 치료들은 그러한 장애들의 치료에 알려진 약물 및 치료법들을 포함할 수 있다. 본 발명의 세포 개체군들은 코르티코스테로이드, 비스테로이드성 소염성 화합물, 또는 염증 치료에 유용한 기타 약제들과 병용될 수도 있다. 본 발명의 약제와의 이들 기타 치료법 또는 치료 양식의 병용된 이용은 동시에 또는 소정의 순서에 의할 수 있으며, 즉 상기 두 치료는 본 발명의 세포 개체군 또는 그를 함유하는 약학 조성물이 기타 치료법 또는 치료 양식 전 또는 후에 제공될 수 있는 방식으로 나누어질 수 있다는 것이다. 주치의는 기타 약제, 치료법 또는 치료 양식과 함께, 본 발명의 세포 개체군 또는 그를 함유하는 약학 조성물의 적절한 투여순서를 결정할 수 있다.
본 발명의 세포들
한 측면에서, 본 발명은 결합 조직으로부터 분리된 세포 개체군에 관한 것으로, 이하에서는 "본 발명의 세포 개체군"으로서 언급되며, 상기 세포 개체군의 세포들은:
(a) 항원-제시 세포들 (APC)에 특이적인 마커들을 발현하지 않고;
(b) 인돌아민 2,3-디옥시게나아제 (IDO)를 구성적으로 발현하지 않으며, 여기에서 구성적이라는 말은 어떤 특이적 유도 없이 유전자의 발현을 의미하는 것으로 이해되어야 함;
(c) 인터페론-감마 (IFN-γ)로 자극시 IDO를 발현하고; 및
(d) 적어도 두 개의 세포 계통들로 분화되는 능력을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 세포 개체군의 세포들은, 이하에서 "본 발명의 세포"로서 언급되며, 결합조직으로부터 유래된다. "결합조직"이라는 용어는 중간엽으로부터 유래된 조직을 의미하며, 그들의 세포가 세포외 기질 내에 포함되는 것을 특징으로 하는 몇몇 조직들을 포함한다. 결합조직들의 상이한 유형들 중, 지방 및 연골성 조직들이 포함된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 세포들은 지방 조직의 간질 분획으로부터의 것이다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 세포들은, 유리질 연골에서 유일하게 발견되는 세포인 연골 세포로부터 수득된다. 또다른 특정 구현예에서, 본 발명의 세포들은 피부로부터 수득된다. 또한, 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 세포들은 골수로부터 수득된다.
본 발명의 세포들은, 인간을 포함한 임의의 적합한 동물로부터의 결합 조직의 임의의 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일반적으로, 상기 세포들은 비-병리학적 출생후 포유동물의 결합 조직으로부터 수득된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 세포들은, 지방 조직, 유리질 연골, 골수, 피부 등의 간질 분획과 같은 결합 조직의 공급원으로부터 수득된다. 또한, 특정 구현예에서, 본 발명의 세포 개체군의 세포들은 포유동물, 예로서 설치류, 영장류 등으로부터 유래하며, 바람직하게는 인간으로부터 유래한다.
상기 언급된 것과 같이, 본 발명의 세포들은 (i) APCs에 특이적인 마커들을 발현하지 않고; (ii) IDO를 구성적으로 발현하지 않으며; (iii) IFN-γ로 자극시 IDO를 발현하고; 및 (iv) 적어도 두 개의 세포 계통들로 분화되는 능력을 나타내는 것을 특징으로 한다.
마커들
본 발명의 세포들은, APCs 계통에 특이적인 마커들인, CD11b, CD11c, CD14, CD45, 및 HLAII들 중 적어도 1, 2, 3, 4 또는 바람직하게는 모두에 대해 음성이다. 따라서, 본 발명의 세포들은 앞서 언급된, 특수화된 APCs의 하위개체군을 구성하지 않는다.
또한, 본 발명의 세포들은 다음의 세포 표면 마커들 중 적어도 1, 2 또는 바람직하게는 이들 모두에 대해 음성이다: CD31, CD34 및 CD133.
여기 사용된 것과 같은, 세포 표면 마커들과 관련하여 "음성"이라는 표현은, 본 발명의 세포들을 함유하는 세포 개체군에서, 세포들의 10% 미만, 바람직하게는 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0%가, 통상적인 방법들 및 장치 (예로서, 상업적으로 구입가능한 항체들 및 본 기술분야에서 알려진 표준 프로토콜을 사용하는 Beckman Coulter Epics XL FACS 시스템)를 사용한 흐름 세포분석기에서 특이적 세포 표면 마커에 대한 신호가 배경 신호 이상임을 나타낸다는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 세포들은 다음 세포 표면 마커들 중 적어도 1, 2, 3, 4 또는 바람직하게는 이들 모두를 발현하는 것을 특징으로 한다: CD9, CD44, CD54, CD90 및 CD105; 즉, 본 발명의 세포들은 상기 세포 표면 마커들 (CD9, CD44, CD54, CD90 및 CD105) 중 적어도 1, 2, 3, 4 및 바람직하게는 모두에 대해 양성이다. 바람직하게는, 본 발명의 세포들은, 그들이 상기 세포 표면 마커들 (CD9, CD44, CD54, CD90 및 CD105) 중 적어도 1, 2, 3, 4 및 바람직하게는 모두가 현저한 발현 수준을 갖는다는 것을 특징으로 한다. 여기 사용된 것과 같은, "현저한 발현"이라는 표현은, 본 발명의 세포들을 포함하는 세포 개체군에서, 상기 세포들의 10% 이상, 바람직하게는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 이들 모두가, 통상적인 방법 및 장치 (예로서, 상업적으로 구입가능한 항체들 및 본 기술분야에서 알려진 표준 프로토콜을 사용하는 Beckman Coulter Epics XL FACS 시스템)를 사용하여, 흐름 세포분석기에서 특이적 세포 표면 마커에 대한 신호가 배경 신호 이상임을 나타낸다는 것을 의미한다. 상기 배경 신호는 통상적인 FACS 분석에서 각 표면 마커를 탐지하는데 사용되는 특정 항체로서 동일한 아이소타입의 비-특이적 항체에 의해 제공되는 신호 강도로서 정의된다. 따라서, 양성으로 여겨지는 마커는, 관찰되는 특이적 신호가, 통상적인 방법 및 장치 (예로서, 상업적으로 구입가능한 항체들 및 본 기술분야에서 알려진 표준 프로토콜을 사용하는 Beckman Coulter Epics XL FACS 시스템)를 이용한 배경 신호 강도에 비해, 10% 더 강하며, 바람직하게는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 500%, 1000%, 5000%, 10000% 또는 그 이상으로 강하다.
임의적으로, 본 발명의 세포들은 세포 표면 마커 CD106(VCAM-1)에 대해서도 음성이다. 이러한 세포들의 예들은 여기 기재된 것과 같은, 지방 조직 유래 간질 줄기세포들의 특정 개체군들이다.
상기 세포 표면 마커들 (예로서, 세포 수용체 및 막투과 단백질)에 대한, 상업적으로 구입가능한, 알려진 단일클론성 항체들이, 본 발명의 세포들을 확인하는데 사용될 수 있다.
IDO 의 발현
본 발명의 세포들은 IDO를 구성적으로 발현하지 않지만, IFN-γ 자극시 IDO를 발현한다. 본 발명자들에 의해 실시된 실험들은 상기 세포들이, 3ng/ml의 농도로 사용된 인터류킨-1 (IL-1), 50ng/ml의 농도로 사용된 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 또는 100ng/ml의 농도로 사용된 내독소 LPS와 같이, 기타 전-염증성 매개자들을 단독으로 이용한 자극시, IDO 발현을 유도하지 않았음을 보여주었으며, 이는 통상적인 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정되었다. 예로서, 3ng/ml 또는 그 이상의 IFN-γ를 이용한 자극도 본 발명의 세포들에서 HLAII의 발현을 유도하여, 세포 표면 마커에 대해 여기 정의된 것과 같은 양성 신호를 제공할 수 있다. 상기 발현은, 특정 단백질의 발현의 검출을 가능하게 하는 임의의 알려진 기술을 사용하여, 본 기술 분야의 숙련자들에 의해 검출될 수 있다. 바람직하게는, 상기 기술은 세포 분석기술이다.
분화
본 발명의 세포들은 적어도 2, 보다 바람직하게는 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상의 세포 계통으로 증식 및 분화될 수 있는 능력을 제공한다. 본 발명의 세포들이 분화될 수 있는 세포 계통들의 예시적인, 비제한적인 예들은 골세포, 지방세포, 연골세포, 건세포 (tenocytes), 근세포 (myocytes), 심근세포, 조혈-지지 간질 세포, 내피세포, 뉴런, 성상세포 (astrocytes), 및 간세포를 포함한다.
본 발명의 세포들은 통상적인 방법들에 의해 기타 계통의 세포들로 증식 및 분화될 수 있다. 분화된 세포들을 그들의 분화되지 않은 대응물로부터 동정하고 이어서 분리하는 방법은 본 기술분야에서 공지의 방법들에 의해 실시될 수도 있다.
본 발명의 세포들은 생체 외에서 확장될 수도 있다. 즉, 분리 후, 본 발명의 세포들은 배양 배지 중에서 유지 및 생체 외 증식될 수 있다는 것이다. 이러한 배지는 예로서, 항생제가 있거나 (예로서, 100유닛/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신) 또는 항셍제 없는 둘베코 개량 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM) 및 2 mM 글루타민으로 구성되며, 2-20% 우태혈청 (FBS)으로 보충된다. 사용된 세포들의 필요에 따라 배지의 농도 및/또는 배지 보충물을 변경 또는 조절하는 것은 본 기술분야의 기술에 속한다. 혈청들은 종종 세포성 및 비세포성 인자들 및 생육 및 확장에 필요한 성분들을 함유한다. 혈청의 예들은 FBS, 소 혈청(BS), 우아혈청 (CS), 우태아혈청 (FCS), 신생우아혈청 (NCS), 염소 혈청 (GS), 말 혈청 (HS), 돼지 혈청, 양 혈청, 토끼 혈청, 래트 혈청 (RS), 등을 포함한다. 본 발명의 세포들이 인간 기원인 경우, 인간 혈청, 바람직하게는 자기 유래의 것으로 세포 배양 배지를 보충하는 것도 고려된다. 보체 캐스캐이드 반응의 성분들을 비활성화할 필요가 있는 것으로 생각되는 경우, 혈청들을 55-65℃에서 열-비활성화할 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 혈청 농도의 조절, 배양 배지에서 혈청의 철회도 하나 이상의 원하는 세포 유형들의 생존을 촉진하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 세포들은 약 2% 내지 약 25%의 FBS 농도로부터 이익을 얻을 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 세포들은 일정 조성물의 배지에서 확장될 수 있으며, 여기에서 상기 혈청은 혈청 알부민, 혈청 트랜스페린, 셀레늄, 및 이에 제한되지는 않지만, 본 기술 분야에서 알려진 것과 같은, 인슐린, 혈소판-유래 성장인자 (PDGF) 및 기본 섬유모세포 성장인자 (bFGF)를 포함하는 재조합 단백질들의 조합으로 대체된다.
많은 세포 배양 배지들은 이미 아미노산들을 함유하지만; 일부는 세포들을 배양하기 전에 보충하는 것을 필요로 한다. 그러한 아미노산들로는, 이에 제한되지는 않지만, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-시스테인, L-시스틴, L-글루탐산, L-글루타민, L-글리신 등을 포함한다.
세균, 마이코플라스마성 (mycoplasmal) 및 진균 오염을 완화시키기 위해 항균제들이 세포 배양에 사용될 수도 있다. 전형적으로, 사용되는 항생제 또는 항진균성 화합물들은 페니실린/스트렙토마이신의 혼합물이며, 이에 제한되지는 않지만 암포테리신 (Fungizone®), 암피실린, 젠타마이신, 블레오마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 미토마이신 등도 포함할 수 있다.
호르몬들도 세포 배양에 유리하게 사용될 수 있으며, 이에 제한되지는 않지만, D-알도스테론, 디에틸스틸베스트롤 (DES), 덱사메타손, b-에스트라디올, 하이드로코르티손, 인슐린, 프로락틴, 프로게스테론, 소마토스타틴/인간 성장 호르몬 (HGH) 등을 포함한다.
본 발명의 세포들의 유지 조건은 세포들이 분화되지 않은 형태로 유지되는 것을 가능하게 하는 세포 인자들을 포함할 수 있다. 분화 전에, 세포 분화를 저해하는 보충물들이 배지로부터 제거되어야만 한다는 것은 본 기술 분야의 숙련자들에게 있어 명백하다. 모든 세포들이 이들 인자들을 필요로 하지는 않는다는 것도 명백하다. 실제로, 이들 인자들은, 세포 유형에 따라 원하지 않는 효과를 효과를 낼 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 세포들은 생체 내 종양형성성 활성이 없다. 따라서, 상기 세포들은 그들이 종양형성성 활성을 나타내지 않는다는 것, 즉 종양 세포를 일으키는 변경된 활동 또는 증식성 표현형을 나타내지 않는다는 것을 특징으로 한다.
한 구현예에서, 본 발명의 세포들은 면역반응을 억제하기 위하여, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 이식된 장기 및 조직의 거부반응과 같이 면역학적으로 매개된 질환들을 겪고 있는 대상에게 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포들은 종양형성성 활성을 나타내지 않는다.
본 발명의 세포들의 종양형성성 활성은 면역결핍 마우스 주 (strain)들을 사용하는 동물 연구를 수행함에 의해 시험될 수 있다. 이들 실험들에서, 수백만 세포들이 수령 동물에서 피하 이식되며, 이들은 몇 주 동안 유지되고 종양 형성에 대해 분석된다. 특정 분석을 실시예 3 에 개시하였다.
본 발명의 세포들은 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 발현하도록 형질감염되거나 또는 유전공학적으로 처리될 수 있다. 한 구현예에서, 항원은 그에 대한 내성이 유도되어지는 것이 바람직한 특정 항원을 나타내는 정제된 또는 합성 또는 재조합 폴리펩티드, 또는 그러한 항원의 아미노산 서열로부터 유래된 짧은 합성 폴리펩티드 절편을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항원 공급원은 공여자 조직 이식편에 의해 발현된 항원들을 포함한다. 또한 바람직하게는, 항원 공급원은 환자가 그에 대한 자가면역 장애를 갖는 단백질을 포함한다.
IDO -발현 세포들의 분리 방법
한 구현예에서, 본 발명은 결합 조직으로부터의 세포 개체군 분리 방법에 관한 것으로, 여기에서 상기 세포 개체군의 세포들은, (i) APC로부터 특이적인 마커들을 발현하지 않고; (ii) IDO를 구성적으로 발현하지 않으며; (iii) IFN-γ로 자극시 IDO를 발현하고; 및 (iv) 적어도 두 개의 세포 계통들로 분화되는 능력을 나타내는 것을 특징으로 하는 표현형을 나타내고,
상기 방법이 다음 단계들을 포함하는 방법:
(i) 결합 조직 샘플로부터 세포 현탁액을 제조하는 단계;
(ii) 상기 세포 현탁액으로부터 세포들을 회수하는 단계;
(iii) 고체 표면상의 적합한 세포 배지 중의 상기 세포들을, 그 세포들이 고체 표면에 부착되어 증식되도록 하는 조건하에서 인큐베이션하는 단계;
(iv) 비-부착된 세포들을 제거하기 위하여, 인큐베이션 후 상기 고체 표면을 세척하는 단계;
(v) 그러한 배지 중에서 적어도 2 회 계대된 후 (passaged) 상기 고체 표면에 부착된 채로 남은 세포들을 선발하는 단계;
(vi) 상기 선발된 세포 개체군이 관심대상의 표현형을 나타내는지를 확인하는 단계.
여기 사용된 것과 같은, "고체 표면"이라는 용어는 본 발명의 세포들이 부착되어지는 임의의 물질이다. 특정 구현예에서, 상기 물질은 포유류 세포들의 그의 표면에의 부착을 촉진하도록 처리된 플라스틱 물질로, 예로서 폴리-D-리신 또는 기타 시약들로 임의로 코팅된 상업적으로 이용가능한 폴리스티렌 판들이다.
단계 (i)-(vi)는 본 기술분야의 숙련자들에 의해 알려진 통상적인 기술들에 의해 실시될 수 있다. 간략히는, 본 발명의 세포들은, 인간을 포함한 임의의 적합한 동물로부터의 결합조직의 임의의 적합한 원으로부터, 예로서 인간 지방 조직 또는 연골 조직으로부터 통상적인 방법에 의해 수득될 수 있다. 상기 동물은, 그 동물 내의 결합 조직이 살아있는 한, 살아있거나 또는 죽은 것일 수 있다. 전형적으로, 인간 지방 세포들은 살아있는 공여자들로부터, 외과적 또는 흡입 지방제거술과 같은 잘-인지된 프로토콜들을 사용하여 수득된다. 실제로, 지방흡입 절차들은 매우 흔하기 때문에, 지방흡입 유출물들은, 본 발명의 세포들이 유래될 수 있는 특히 바람직한 공급원이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 세포들은 지방흡입에 의해 수득된 인간 지방 조직의 간질 분획으로부터의 것이다. 또다른 특정 구현예에서, 본 발명의 세포들은 관절경 기술에 의해 수득된 인간 유리질 관절 연골로부터의 것이다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 세포들은 생검 기술에의해 수득된 인간 피부로부터의 것이다. 또한 또다른 특정 구현예에서, 본 발명의 세포들은 흡인에 의해 수득된 인간 골수로부터의 것이다.
결합 조직의 샘플은, 바람직하게는, 재료의 나머지 부분으로부터 본 발명의 세포들을 분리하기 위해 가공되기 전에 세척된다. 프로토콜에서, 결합 조직의 샘플은 생리학적으로 적합한 식염수 (예로서, 인산염 완충 식염수 (PBS))로 세척된 후, 힘차게 진탕되어 침전되도록 방치되며, 이는 유리된 물질 (예로서, 손상된 조직, 혈액, 적혈구 등)을 조직으로부터 제거하는 단계이다. 따라서, 세척 및 침전 단계들은 일반적으로, 상등액에 파편들이 비교적 없을 때까지 반복된다. 남아있는 세포들은 일반적으로 다양한 크기의 덩어리들로 존재할 것이며, 프로토콜은, 세포들 자신들에 대한 손상은 최소화하면서, 큰 구조를 분해하도록 맞추어진 단계들을 사용하여 진행된다. 이러한 목적을 달성하는 한 방법은 세포들의 세척된 덩어리들을 세포들 간의 결합들을 약화시키거나 또는 파괴하는 효소로 처리하는 것이다 (예로서, 콜라게나아제, 디스파제 (dispase), 트립신 등). 이러한 효소 처리의 양 및 기간은, 이용된 조건에 따라 변화할 것이나, 이러한 효소들의 사용은 본 기술 분야에 일반적으로 알려져 있다. 이러한 효소 처리에 대안적으로 또는 이와 함께, 세포들의 덩어리들은 기계적 진탕, 음파 에너지, 열 에너지 등과 같은 다른 처리들을 사용하여 분해될 수 있다. 분해가 효소적 방법에 의해 달성된 경우, 세포들에 대해 유해한 효과를 최소화하기 위하여, 적합한 기간 후에 효소를 중화하는 것이 바람직하다.
상기 분해 단계는 전형적으로, 응집된 세포들의 슬러리 또는 현탁액 및 일반적으로 자유 간질 세포들을 함유하는 액 분획을 생성한다 (예로서, 적혈구 세포들, 평활근 세포들, 상피 세포들, 섬유아세포들 및 줄기 세포들). 분리 공정에서의 다음 단계는 본 발명의 세포들로부터 응집된 세포들을 분리하는 것이다. 이는 원심분리에 의해 달성될 수 있으며, 이는 세포들을 상등액으로 덮힌 펠렛이 되도록 만든다. 상등액은 그 후 폐기되고, 상기 펠렛은 생리학적으로 적합한 액 중에 현탁될 수 있다. 또한, 현탁된 세포들은 전형적으로 적혈구들을 포함하며, 대부분의 프로토콜들에서, 이들을 용해시키는 것이 바람직하다. 선택적으로 적혈구들을 용해하는 방법은 본 기술 분야에 알려져 있으며, 임의의 적합한 프로토콜이 이용된다 (예로서, 염화 암모늄 등을 이용하여 분해함에 의해, 고장성 (hypertonic) 또는 저장성 (hypotonic) 매질 중에 인큐베이션). 물론, 적혈구들이 용해된 경우, 남아있는 세포들은 그 후, 예로서 여과, 침강 또는 밀도 분획화에의해 용해물로부터 분리되어야만 한다.
적혈구들이 용해되는지의 여부에 상관없이, 현탁된 세포들은 1 회 이상 연속적으로 세척, 재원심분리, 및 재현탁되어 보다 큰 순도를 달성할 수 있다. 대안적으로, 상기 세포들은 세포 표면 마커 프로파일의 기초 하에 분리될 수 있거나 또는 세포 크기 및 입도를 기초로 하여 분리될 수 있다.
최종 분리 및 재현탁에 이어, 세포들을 배양할 수 있으며, 바람직한 경우, 수율을 평가하기 위하여 숫자 및 생육력을 평가할 수 있다. 바람직하게는, 세포들은 분화 없이, 고체 표면 상에서, 적합한 세포 배지를 사용하여, 적절한 세포 밀도 및 배양 조건에서 배양될 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 세포들은, 페트리 접시 또는 세포 배양 플라스크와 같이, 일반적으로 플라스틱 물질로 만든 고체 표면 상에서, 적합한 세포 배지의 존재 하에서 배양되고 [예로서, DMEM, 전형적으로 5-15% (예로서, 10%)의 적합한 혈청, 예컨대 우태 혈청 또는 인간 혈청으로 보충됨], 세포들이 고체 표면에 부착되어 증식되는 것을 가능하게 하는 조건 하에서 인큐베이션 된다. 인큐베이션 후, 부착되지 않은 세포들 및 세포 절편들을 제거하기 위하여 세포들을 세척한다. 적절한 컨플루언스 (confluence), 전형적으로 약 80% 세포 컨플루언스에 도달할 때까지, 필요한 경우 세포 배지를 교체하며, 세포들을 동일한 매질 중 및 동일한 조건 하에서 배양을 유지한다. 원하는 세포 컨플루언스에 도달한 후, 트립신과 같은 탈착제를 사용하여, 적절한 세포 밀도 (일반적으로 2,000-10,000 세포들/㎠)로 보다 큰 세포 배양 표면 상에 접종하는 연속적인 계대를 통하여 확장될 수 있다. 이에 따라, 세포들의 발달 표현형을 그대로 유지하면서, 세포들을 그러한 매질 중에서 분화 없이 적어도 2 회 계대하고, 보다 바람직하게는 세포들을 발달 표현형을 잃지 않으면서 적어도 10 회 계대할 수 있다 (예로서, 적어도 15 회 또는 심지어는 적어도 20 회). 전형적으로, 세포들을 원하는 밀도, 예컨대 약 100 세포들/㎠ 내지 약 100,000 세포들/㎠ 사이 (예컨대 약 500세포들/㎠ 내지 약 50,000세포들/㎠, 또는 보다 구체적으로, 약 1,000세포들/㎠ 내지 약 2,000세포들/㎠ 사이)로 도말한다. 보다 낮은 밀도로 도말되는 경우 (예로서, 약 300세포들/㎠), 세포들은 클론적으로 보다 쉽게 분리될 수 있다. 예로서, 몇 일 후, 그러한 밀도로 도말된 세포들은 동종성 군으로 증식할 것이다. 특정 구현예에서, 세포 밀도는 2,000-10,000세포들/㎠ 사이이다.
상기와 같이 적어도 2 회의 계대를 포함하는 처리 후, 고체 표면에 부착된 채로 남아있는 세포들을 선발하고, 본 발명의 세포들의 정체를 확인하기 위하여 관심 대상이 되는 표현형을 통상적인 방법에 의해 분석하며, 이는 하기에서 언급될 것이다. 첫 번째 계대 후 고체 표면에 부착된 채로 남아있는 세포들은 이종성 기원으로부터 유래하며; 따라서 상기 세포들은 적어도 다른 계대에 투입되어야만 한다. 상기 방법의 결과로서, 관심 대상의 표현형을 갖는 동종성 세포 개체군이 수득된다. 실시예 1은 인간 지방 조직 및 인간 연골 조직으로부터 본 발명의 세포들을 분리하는 상세한 방법을 기재하고 있다.
일반적으로, 세포들이 본 발명에 따라 사용될 수 있는지 확인되어야만 하지만, 두 번째 계대 후 고체 표면에 부착된 채로 남아있는 세포들은 관심 대상의 표현형을 나타낸다. 따라서, 적어도 2 회 계대 후 고체 표면에 대한 세포들의 부착은, 본 발명의 세포들을 선발하기 위한 본 발명의 바람직한 한 구현예를 구성한다. 관심 대상의 표현형의 확인은 통상적인 수단을 사용하여 실시될 수 있다.
세포-표면 마커들은 임의의 적당한 통상적인 기술, 일반적으로 양성/음성 선발에 근거한 기술에 의해 동정될 수 있다; 예로서, 세포 중에서 그의 존재/부재가 확인되어져야만 하는, 세포 표면 마커들에 대한 단일클론성 항체들이 사용될 수 있다; 하지만 다른 기술들도 사용될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34 및 CD133 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 바람직하게는 이들 모두에 대한 단일클론성 항체들이, 선발된 세포들 중에서 상기 마커들의 부재를 확인하기 위하여 사용된다; 그리고 CD9, CD44, CD54, CD90 및 CD105 중 1, 2, 3, 4, 또는 바람직하게는 이들 모두에 대한 단일성 항체들이, 상기 마커들 중 적어도 하나 그리고 바람직하게는 이들 모두의 존재 또는 그의 검출가능한 발현 수준을 확인하기 위하여, 사용된다. 상기 단일클론성 항체들은 알려져 있으며, 상업적으로 구입가능하거나, 또는 본 기술 분야의 당업자에 의해 통상적인 방법들에 의해 수득될 수 있다.
선발된 세포들에서 IFN-γ 유도가능한 IDO 활성은 임의의 적합한 통상적인 분석에 의해 결정될 수 있다. 예로서, 선발된 세포들은 IFN-γ로 자극될 수 있고, IDO 발현에 대해 분석된다; 그 후 IDO 단백질 발현에 대한 통상적인 웨스턴-블롯 분석을 수행할 수 있으며, 선발된 세포들의 IFN-γ 자극에 이은 IDO 효소 활성은, 예로서 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석 및 상등액 중에서 키누레닌 농도의 광도측정 결정을 정보판독으로서 이용하여 트립토판에서 키누레닌으로의 전환에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 세포들은 특정 조건 하에서 IDO를 발현하기 때문에, IFN-γ 자극에 이은 IDO 활성의 검출을 가능하게 하는 임의의 적합한 기술을 사용하여 본 발명의 세포들을 선발할 수 있다. 선발된 세포들에서 IFN-γ 유도가능한 IDO 활성을 결정하기 위한 적합한 분석이 실시예 2에 개시된다. 생성된 IDO의 양은 제곱 센티미터 당 세포들의 수에 따라 달라지며, 이는 바람직하게는 5000세포들/cm2 이상의 수준이지만, 이 농도에 제한되지는 않으며, IFN-γ의 농도는 이상적으로는 3ng/ml 이상이지만, 이 농도에 제한되지는 않는다. 기재된 조건들 하에서 생성된 IDO의 활성은 24 시간 이상 후 μM 범위 내에서 키누레닌의 검출가능한 생산을 일으킬 것이다.
선발된 세포들의 적어도 두 개의 세포 계통으로의 분화능은 본 기술 분야에 알려진 것과 같은 통상적인 방법들에 의해 분석될 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 세포 및 세포 군들은, 바람직한 경우, 세포 개체군의 클로닝에 적합한 방법을 사용하여 클론적으로 확장될 수 있다. 예로서, 세포들의 증식된 군을 물리적으로 채집하여 별개의 플레이트 (또는 다중-웰 플레이트의 웰) 내로 접종할 수 있다. 선택적으로, 세포들은 다중 웰 플레이트 상에, 단일 세포를 각 웰 내로 배치하는 것을 용이하게 하기 위한 통계적 비율로 서브클로닝될 수 있다 (예로서, 약 0.1 내지 약 1 세포/웰 또는 약 0.25 내지 약 0.5 세포들/웰, 예로서 0.5세포들/웰). 물론, 세포들은 그들을 저밀도로 도말하고 (예로서, 페트리 접시 또는 기타 적합한 기질에), 그들을 클로닝 링 (ring)과 같은 장치들을 사용하여 기타 세포들로부터 분리함으로써 클로닝될 수 있다. 클론성 군의 제조는 임의의 적합한 배지 중에서 확장될 수 있다. 임의의 경우에, 분리된 세포들은 그들의 발달 표현형이 평가될 수 있는 때, 적합한 지점으로 배양될 수 있다.
본 발명자들에 의해 실시된 추가의 연구들은, 분화 유도 없이 본 발명의 세포들의 생체 외 확장이, 예로서 특수하게 스크리닝된 많은 적합한 혈청 (예컨대 우태 혈청 또는 인간 혈청)을 이용함에 의해 연장된 기간 동안 달성될 수 있다는 것을 보여주었다. 생육성 및 수율 측정 방법은 본 기술 분야에서 알려져 있다 (예로서, 트립판 블루 배제법).
본 발명의 세포 개체군의 세포들을 분리하기 위한 임의의 단계들 및 절차들은 바람직한 경우, 수동적으로 수행될 수 있다. 선택적으로, 그러한 세포들을 분리하는 방법은 하나 이상의 적합한 장치들을 통해 촉진 및/또는 자동화될 수 있으며, 그들의 예는 본 기술 분야에 알려져 있다.
본 발명의 세포들의 용도들
본 발명의 세포들은, 이에 제한되지는 않지만, 자가 면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상에서 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들을 예방, 치료 또는 개선하는데 사용될 수 있다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명의 세포들은 의약으로서 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 세포들을 함유하는 의약들은 이식 내성의 유도를 위해, 또는 자가면역 또는 염증성 장애들, 또는 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함한 면역학적으로 매개된 질환들의 증상들을 치료 및 그에 따른 개선을 위해, 상기 장애들 또는 질환들 중 임의의 것을 겪고 있는 대상에, 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포들은 상기 장애들 중 임의의 것을 겪고 있는 대상에서 자가면역 또는 염증성 장애들의 증상들을 치료적으로 또는 예방적으로 치료하고 그에 따라 개선하기 위해, 또는 상기 질환들을 겪고 있는 대상에서 면역학적으로 매개된 질환들의 증상들을 개선하기 위해 사용될 수 있다.
여기서 사용된 것과 같은, "장애" 및 "질환"은 어떤 대상에서의 상태를 언급하는데 있어서 상호교환적으로 사용된다. 특히, "자가면역 질환"이라는 용어는 "자가면역 장애"라는 용어와 상호교환가능하게 사용되어, 어떤 대상에서, 그 자신의 세포, 조직 및/또는 장기에 대한 그 대상의 면역학적 반응에 의해 유발된 세포, 조직 및/또는 장기의 상처에 의해 특징되는 대상에서의 상태를 의미한다. "염증성 질환"이라는 용어는 "염증성 장애"라는 용어와 상호교환가능하게 사용되어, 염증, 바람직하게는 만성 염증에 의해 특징되는 어떤 대상에서의 상태를 의미한다. 자가면역 장애들은 염증과 관련되거나 또는 관련되지 않을 수 있다. 또한, 염증은 자가면역 장애에 의해 일어나거나 또는 일어나지 않을 수 있다. 따라서, 특정 장애들은 자가면역 및 염증성 장애들 모두로서 특징될 수 있다.
특정 조건들이 그에 의해 일부 대상들에서 자가면역을 일으킬 수 있는 메카니즘들은 일반적으로 잘 이해되지 않지만, 유전적 및 외적인 인자들 모두를 연루한다. 예로서, 세균, 바이러스 또는 약물들은, 이미 자가면역 장애에 대한 유전적 소인을 갖는 어떤 대상에서 자가면역 반응을 유발시키는 역할을 할 수 있다. 예로서, 어떤 일반적인 알레르기를 갖는 대상들은 자가면역 장애들에 좀더 걸리기 쉽다.
실질적으로, 임의의 자가면역 질환, 염증성 장애 또는 면역학적으로 매개된 질환이 본 발명의 세포들로 치료될 수 있다. 치료될 수 있는 상기 질환들 및 장애들의 예시적이고, 비제한적인 예들로는 "정의" 라는 제목 하에 앞서 열거된 것들이 있다. 특정 구현예에서, 상기 염증성 질환은 예로서, IBD 또는 RA와 같은 만성 염증성 질환이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 이에 제한되지는 않지만 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 세포들의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한, 면역 반응의 억제를 위한, 또는 이식 내성 유도를 위한, 또는 자가면역 질환 치료를 위한, 또는 염증성 장애들의 치료를 위한 본 발명의 세포들의 용도에 관한 것이다. 상기 자가면역 질환들 및 염증성 질환들의 예들은 앞서 언급되었다. 특정 구현예에서, 질환은 염증성 질환으로, 예컨대 만성 염증성 질환, 예로서 IBD 또는 RA이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 규제 T-세포들 (T-reg), 즉 면역계의 활성을 활발하게 억제하고 병리학적인 자가-반응성, 즉 자가면역 질환을 예방하는 세포들의 제조 또는 생성을 위한 본 발명의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 T- reg 세포들
본 발명은 또한, 다른 측면에서, 규제 T-세포들 (T-reg), 즉 면역계의 활성화를 활발하게 억제하고 병리학적인 자가-반응성, 즉 자가면역 질환을 예방하는 세포들 (Foxp3+CD4+CD25+ T-reg 및 IL-10/TGFb-생성 Tr1 세포들을 포함)에 관한 것으로, 본 발명의 세포들로부터 수득가능하고, 이하에서 본 발명의 T-reg 세포들로 언급된다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 T-reg 세포군의 분리 방법에 관한 것으로, 이는 다음을 포함한다:
(a) 본 발명의 세포개체군을 말초혈액 백혈구와 접촉시키고, 및
(b) 본 T-reg 세포개체군을 선발한다.
결과적으로, 본 발명의 세포들은 T-세포들의 서브세트인, 본 발명의 T-reg 세포들을 제조하는데 사용될 수 있으며, 이는 본 발명의 추가적인 측면을 구성한다. 본 발명의 T-reg 세포들은 본 기술 분야의 당업자에 의해 알려진 통상적인 수단에 의해 분리될 수 있다.
본 발명의 T-reg 세포들은 이에 제한되지는 않지만 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선에 사용될 수 있다. 상기 용도는 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명의 T-reg 세포들은 의약으로서 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 T-reg 세포들을 함유하는 의약은 이식 내성의 유도를 위해, 또는 자가면역 또는 염증성 장애들, 또는 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환을, 상기 장애 또는 질환들 중 임의의 것을 겪고 있는 대상에서 치료 및 그에 따른 개선을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 T-reg 세포들은, 상기 장애들 중 임의의 것을 겪고 있는 대상에서 자가면역 또는 염증성 장애들의 증상을 치료적으로 또는 예방적으로 치료 및 그에 따라 개선하거나 또는 상기 질환들을 겪고 있는 대상에서 면역학적으로 매개된 질환들의 증상을 개선하는데 사용될 수 있다.
실질적으로, 임의의 자가면역 질환, 염증성 장애 또는 면역학적으로 매개된 질환은 본 발명의 T-reg 세포들로 처리될 수 있다. 치료될 수 있는 상기 질환들 및 장애들의 예시적이며 비제한적인 예들로는 "정의"라는 제목 하에 앞서 열거된 것들이 있다. 특정 구현예에서, 상기 염증성 질환은 IBD 또는 RA와 같은 만성 염증성 질환이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 이에 제한되지는 않지만, 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 T-reg 세포들의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한, 면역 반응의 억제를 위한, 또는 이식 내성 유도를 위한, 또는 자가면역 질환 치료를 위한, 또는 염증성 장애들의 치료를 위한 의약 제조를 위한 본 발명의 T-reg 세포들의 용도에 관한 것이다. 상기 자가면역 질환들 및 염증성 질환들의 예들은 앞서 언급되었다. 특정 구현예에서, 질환은 염증성 질환으로, 예컨대 만성 염증성 질환, 예로서 IBD 또는 RA이다.
본 발명은 또한, 선택된 항원 또는 항원들의 군에 대해 특이적인 Treg 세포들의 제조에서의 본 발명의 세포 개체군의 용도 및 상기 항원 또는 항원들의 군에 관련된 질환 또는 장애들의 치료에서의 이들의 용도를 제공한다. 이러한 항원들의 예들로는, 예로서 류마티스 관절염, 크론병, IV 형 과민감성 반응, 낭창, 건선 및 본 기술분야에서 알려지고 본 명세서 어딘가에 기재된 기타 자가면역 장애들과 같은, 자가면역 질환들에서 어떤 역할을 하는 것들이 있다. 간략하게는, 본 발명의 세포 개체군들은 선택된 항원, 항원들의 군 또는 이러한 항원 또는 항원들을 발현 및/또는 제시하는 세포 유형의 존재 하에서 시험관 내 배양된다. 본 발명의 세포들은 IFN-γ, LPS 또는 본 기술분야에서 알려진 기타 활성화제로 임의로 예비자극될 수 있다. 약 2, 4, 6, 12, 24, 48 시간 이상의 배양 기간 후, 바람직하게는 약 12 내지 약 24 시간 후, 본 발명의 세포 개체군은, 임의로 항원, 항원들의 군, 또는 상기 항원을 갖는 세포들을 제거한 후, 어떤 대상으로부터 수득된 말초 혈액 백혈구와 함께 추가로 공동배양된다. 이 공동배양은 선택된 항원에 대해 특이적인 Treg 세포들의 제조를 일으킬 것이며, 이는 그 대상의 치료에 사용될 수 있다. 임의로, 이들 Treg 세포들은, 환자에게 투여되기 전에 본 기술분야에서 알려진 배양 기술을 사용하여 생체 외적으로 그 수가 확장될 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 본 발명의 세포 개체군들이 세포 표면 상에서 HLA 클래스 II를 통하여 선택된 항원을 (IFN-γ에 의해 유도된 것으로 보임) 말초 혈액 백혈구에 제시할 수 있어서, Treg 세포들이 말초 혈액 백혈구들의 군 내에서 증대되고/거나 활성화되도록 할 수 있다고 생각한다. 실시예 11에 나타낸 것과 같이, 본 발명자들은, 본 발명의 세포 개체군이 소분자량 분자들을 대식할 수 있고, 이에 따라 HLA 클래스 II 분자들을 통해 IFN-γ 자극 후 그러한 분자들을 제시할 수 있음을 증명하였다. 이러한 메카니즘을 통한, 말초 혈액 백혈구들과 상호작용하는 선택된 항원의 제시는 상기 기재된 Treg 세포 개체군을 초래하는 것으로 생각된다. 선택적인 치료 방법론으로서, 실시예 7 에 기재된 것과 같이, 본 발명의 세포 개체군은 임의의 공동 배양 없이 생체 내에 직접적으로 투여되고, 특이적인 Treg 세포들을 생성할 수 있으며, 이는 그 결과, 장애를 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명은 선택된 항원 또는 항원들의 군에 특이적인 Treg 세포들의 시험관 내 수득 방법을 제공하며, 이는 다음을 포함한다:
(a) 본 발명의 세포 개체군을 상기 선택된 항원 또는 항원들의 군과 접촉시키고;
(b) 상기 세포 개체군을 말초 혈액 백혈구들과 접촉시키고; 및
(c) 상기 선택된 항원 또는 항원들의 군에 특이적인 T-reg 세포 개체군을 선발.
본 발명은, Treg 세포들을 상기 말초 혈액 백혈구들이 수득된 대상에 투여함에 의해, 상기 선택된 항원 또는 항원들의 군에 관련된 질환들 및 장애들의 치료에서의 상기 단계 (c)의 특이적 Treg 세포들의 용도도 제공한다. 이 방법에서 사용된 것과 같은 본 발명의 세포 개체군은 상기 대상으로부터 (자기유래) 또는 공여자 로부터의(동종이계) 것일 수 있다.
본 발명의 방사선 조사된 세포들
바람직한 경우, 본 발명의 세포들은, 감마 방사선 조사 장치와 같은 전리 방사선의 적합한 제어된 공급원을 사용하여 방사선 조사될 수 있다. 방사선 조사 조건은 본 발명의 세포들의 장기간 성장 정지를 일으키는 방사선 조사량을 부여하는데 필요한 노출 시간을 결정하기 위하여 본 발명의 당업자에 의해 실험적으로 조절되어야 한다. 상기 방사선 조사량은, 예로서 1-100, 5-85, 10-70, 12-60 Gy, 또는 보다 바람직하게는 15-45 Gy일 수 있다.
본 발명의 세포들은 치료 용도로 사용될 수 있기 때문에, 대상에의 투여 전에 본 발명의 세포들의 방사선 조사는 유리한 결과를 가져올 수 있으며, 이는 상기 방사선 조사 처리가 상기 대상에서 세포들이 장기간 동안 증식 또는 생존할 수 없도록 만들기 때문이다.
본 발명의 방사선 조사된 세포들은, 이에 제한되지는 않지만 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선에 사용될 수 있다. 상기 용도는 본 발명의 추가적인 측면을 구성한다.
따라서, 또다른 측면에서, 본 발명의 방사선 조사된 세포들은 의약으로서 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방사선 조사된 세포들을 함유하는 의약은 이식 내성의 유도를 위해, 또는 자가면역 또는 염증성 장애들, 또는 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들의 증상들의 치료 및 그에 따른 개선을 위해, 상기 장애들 또는 질환들 중 임의의 것을 겪고 있는 대상에, 사용될 수 있다. 따라서, 방사선 조사된 세포들은 상기 장애들 중 임의의 것을 겪고 있는 대상에서 자가면역 또는 염증성 장애들의 증상들을 치료적으로 또는 예방적으로 치료하고 그에 따라 개선하기 위해, 또는 상기 질환들을 겪고 있는 대상에서 면역학적으로 매개된 질환들의 증상들을 개선하기 위해 사용될 수 있다.
실질적으로, 임의의 자가면역 질환, 염증성 장애 또는 면역학적으로 매개된 질환이 본 발명의 방사선 조사된 세포들로 치료될 수 있다. 치료될 수 있는 상기 질환들 및 장애들의 예시적이고, 비제한적인 예들로는 "정의" 라는 제목 하에 앞서 열거된 것들이 있다. 특정 구현예에서, 상기 염증성 질환은 예로서, IBD 또는 RA와 같은 만성 염증성 질환이다.
다른 측면에서, 본 발명은 이에 제한되지는 않지만, 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 방사선 조사된 세포들의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한, 면역 반응의 억제를 위한, 또는 이식 내성 유도를 위한, 또는 자가면역 질환 치료를 위한, 또는 염증성 장애들의 치료를 위한 의약 제조를 위한 본 발명의 방사선 조사된 세포들의 용도에 관한 것이다. 상기 자가면역 질환들 및 염증성 질환들의 예들은 앞서 언급되었다. 특정 구현예에서, 질환은 염증성 질환으로, 예컨대 만성 염증성 질환, 예로서 IBD 또는 RA이다.
본 발명의 IFN -γ 예비자극된 세포들
또한, 바람직한 경우, 본 발명의 세포들은 IFN-γ로 예비자극될 수 있다. IFN-γ을 이용한 예비자극 방법은 본 기술 분야의 숙련자들에게는 자명하며, 절차는 실시예 2 에 나타내었다. 바람직하게는, 상기 세포들은 0.1 내지 100, 0.5 내지 85, 1 내지 70, 1.5 내지 50, 2.5 내지 40 ng/ml 이상, 바람직하게는 3 내지 30 ng/ml 사이의 IFN-γ 농도를 사용하여 예비자극되며, 자극 시간은 바람직하게는 12 시간 이상, 예로서 13, 18, 24, 48, 72 시간 이상이다.
본 발명의 세포들은 치료 용도로 사용될 수 있기 때문에, 대상에의 투여 전에 본 발명의 세포들의 IFN-γ를 이용한 예비자극은 유리한 결과를 가져올 수 있으며, 이는 대상에서의 IFN-γ 예비자극된 세포 투여 및 IDO 발현 사이의 기간이 감소될 수 있기 때문이다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은, 상기 세포들을 예비자극하기 위하여 IFN-γ를 이용한 본 발명의 세포들의 처리를 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 따라 수득가능한 세포들은, 이하에서 "본 발명의 IFN-γ 예비자극된 세포들"로 언급되며, 이는 본 발명의 추가의 측면을 구성한다. 상기 본 발명의 IFN-γ 예비자극된 세포들은 본 기술 분야의 당업자에게 알려진 통상적인 수단들에 의해 분리된다.
본 발명의 IFN-γ 예비자극된 세포들은 이에 제한되지는 않지만 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선에 사용될 수 있다. 상기 용도는 본 발명의 추가적인 측면을 구성한다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명의 IFN-γ 예비자극된 세포들은 의약으로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 IFN-γ 예비자극된 세포들을 함유하는 의약은 이식 내성의 유도를 위해, 또는 자가면역 또는 염증성 장애들, 또는 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함한 면역학적으로 매개된 질환들의 증상들을 치료 및 그에 따른 개선을 위해, 상기 장애들 또는 질환들 중 임의의 것을 겪고 있는 대상에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 IFN-γ 예비자극된 세포들은 상기 장애들 중 임의의 것을 겪고 있는 대상에서 자가면역 또는 염증성 장애들의 증상들을 치료적으로 또는 예방적으로 치료하고 그에 따라 개선하기 위해, 또는 상기 질환들을 겪고 있는 대상에서 면역학적으로 매개된 질환들의 증상들을 개선하기 위해 사용될 수 있다.
실질적으로, 임의의 자가면역 질환, 염증성 장애 또는 면역학적으로 매개된 질환이 본 발명의 IFN-γ 예비자극된 세포들로 치료될 수 있다. 치료될 수 있는 상기 질환들 및 장애들의 예시적이고, 비제한적인 예들로는 "정의" 라는 제목 하에 앞서 열거된 것들이 있다. 특정 구현예에서, 상기 염증성 질환은 예로서, IBD 또는 RA와 같은 만성 염증성 질환이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 이에 제한되지는 않지만, 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 INF-γ 예비자극된 세포들의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한, 면역 반응의 억제를 위한, 또는 이식 내성 유도를 위한, 또는 자가면역 질환 치료를 위한, 또는 염증성 장애들의 치료를 위한 의약 제조를 위한 본 발명의 IFN-γ 예비자극된 세포들의 용도에 관한 것이다. 상기 자가면역 질환들 및 염증성 질환들의 예들은 앞서 언급되었다. 특정 구현예에서, 질환은 염증성 질환으로, 예컨대 만성 염증성 질환, 예로서 IBD 또는 RA이다.
본 발명의 방사선 조사되고 IFN -γ 예비자극된 세포들 및 본 발명의 IFN -γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포들
또한, 바람직한 경우, 본 발명의 세포들은 방사선 조사 및 IFN-γ 자극 처리에 임의의 순서로 투입될 수 있으며; 즉, 본 발명의 세포들은 먼저 방사선 조사에 투입되고, 그 결과의 세포들을 이어서 IFN-γ 자극에 투입할 수 있거나, 또는 그 반대로, 본 발명의 세포들을 먼저 IFN-γ 자극에 투입하고 이어서 결과의 세포들을 방사선 조사에 투입할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명의 세포들을 IFN-γ 로 예비자극하고, 그 결과의 세포들 (본 발명의 IFN-γ 예비자극된 세포들)을 방사선 조사하여 방사선 조사된 세포들로 만들 수 있으며, 이는 이하에서 "본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포들"로서 언급된다.
다른 측면에서, 본 발명의 세포들을 방사선 조사하고, 결과의 세포들을 (본 발명의 방사선 조사된 세포들) IFN-γ 로 예비자극하여 IFN-γ 예비자극된 세포들로 만들 수 있으며, 이는 이하에서 "본 발명의 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포들"로서 언급된다.
IFN-γ을 이용하여 세포들을 예비자극하는 방법 및 세포들을 방사선 조사하는 방법들은 본 기술 분야의 숙련자들에게 공지이며, 이들 중 일부는 상기에서 이미 언급되었다. 상기 방법들 중 임의의 것이 사용될 수 있다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 세포들을 (i) 방사선 조사, 및(ii) IFN-γ를 이용한 자극에 투입하는 것을 포함하고, 여기에서 처리들 (i) 및 (ii)는, IFN-γ 예비자극된 세포들을 방사선 조사하거나 또는 방사선 조사된 세포들을 IFN-γ 예비자극하기 위하여, 임의의 순서로 실시될 수 있다. 상기 방법에 따라 수득가능한 세포들은, 이하에서 각각 "본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포들"로서 언급되거나, 또는 "본 발명의 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포들"로서 언급되며, 이는 본 발명의 추가의 측면들을 구성한다. 상기 본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포들 및 본 발명의 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포들은 본 기술분야의 당업자에 의해 알려진 통상적인 방법에 의해 분리될 수 있다.
본 발명의 세포들은 치료 용도로 사용될 수 있기 때문에, 본 발명의, 임의의 순서로 미리 방사선 조사 및 IFN-γ 자극에 투입된 본 발명의 세포들의 대상에의 투여는 상기 언급된 것과 같은 이유로, 유리한 결과를 가져올 수 있으며, (예로서 세포들을 대상에서 장기간 동안 증식 또는 생존할 수 없도록 만들기 위하여 세포들을 방사선 조사 처리에 투입하는 것), 반면에 대상에의 투여 전 IFN-γ를 사용한 세포들의 예비자극은 대상에서 IFN-γ-예비자극된 세포의 투여와 IDO 발현 사이의 기간에서 감소를 연루할 수 있다.
본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포들 및 본 발명의 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포들은, 이에 제한되지는 않지만 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선에 사용될 수 있다. 상기 용도는 본 발명의 추가적인 측면을 구성한다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포들 및 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포들은 의약으로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포들 또는 본 발명의 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포들을 함유하는 의약들은 이식 내성의 유도를 위해, 또는 자가면역 또는 염증성 장애들, 또는 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함한 면역학적으로 매개된 질환들의 증상들을 치료 및 그에 따른 개선을 위해, 상기 장애들 또는 질환들 중 임의의 것을 겪고 있는 대상에, 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포들 및 본 발명의 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포들은 상기 장애들 중 임의의 것을 겪고 있는 대상에서 자가면역 또는 염증성 장애들의 증상들을 치료적으로 또는 예방적으로 치료하고 그에 따라 개선하기 위해, 또는 상기 질환들을 겪고 있는 대상에서 면역학적으로 매개된 질환들의 증상들을 개선하기 위해 사용될 수 있다.
실질적으로, 임의의 자가면역 질환, 염증성 장애 또는 면역학적으로 매개된 질환은 본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포들 또는 본 발명의 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포들로 치료될 수 있다. 치료될 수 있는 상기 질환들 및 장애들의 예시적이고, 비제한적인 예들로는 "정의" 라는 제목 하에 앞서 열거된 것들이 있다. 특정 구현예에서, 상기 염증성 질환은 예로서, IBD 또는 RA와 같은 만성 염증성 질환이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 이에 제한되지는 않지만, 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포들 또는 본 발명의 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포들의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한, 면역 반응의 억제를 위한, 또는 이식 내성 유도를 위한, 또는 자가면역 질환 치료를 위한, 또는 염증성 장애들의 치료를 위한 의약 제조를 위한 본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포들 또는 본 발명의 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포들의 용도에 관한 것이다. 상기 자가면역 질환들 및 염증성 질환들의 예들은 앞서 언급되었다. 특정 구현예에서, 질환은 염증성 질환으로, 예컨대 만성 염증성 질환, 예로서 IBD 또는 RA이다.
약학 조성물
본 발명은, 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들과 같이, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 질병들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선을 위한 약학 조성물을 제공한다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 약학 조성물에 관한 것으로, 이하에서는 본 발명의 약학 조성물로서 언급되며, 이는 본 발명의 세포, 또는 본 발명의 T-reg 세포 또는 본 발명의 방사선 조사된 세포, 또는 본 발명의 IFN-γ 예비자극된 세포, 또는 본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포 또는 본 발명의 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포, 및 허용가능한 약학 담체를 포함한다. 상기 유형의 세포들의 둘 이상의 조합들이 본 발명에 의해 제공된 약학 조성물의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 약학 조성물은 예방적으로 또는 치료적으로 유효한 양의 하나 이상의 예방 또는 치료제 (즉, 본 발명의 세포, 본 발명의 T-reg 세포 또는 본 발명의 방사선 조사된 세포, 또는 본 발명의 IFN-γ-예비자극된 세포, 또는 본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ-예비자극된 세포, 또는 본 발명의 IFN-γ-예비자극되고 방사선 조사된 세포, 또는 그의 조합), 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 특정 구현예에서, "약학적으로 허용가능한"이라는 용어는, 연방정부 또는 주정부의 규제당국 또는 US 약전, 또는 유럽 약전, 또는 동물들, 보다 구체적으로 인간에서의 용도를 위한 일반적으로 인지된 기타 약전에 열거된 규제 당국에 의해 승인된 것을 의미한다. "담체"라는 용어는, 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 의미한다. 바람직한 경우, 상기 조성물은 소량의 pH 완충제를 함유할 수 있다. 적당한 약학적 담체들의 예들이 E.W. Martin에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다. 그러한 조성물들은 예방적으로 또는 치료적으로 유효한 양의, 바람직하게는 정제된 형태의, 예방제 또는 치료제를, 적당한 양의 담체와 함께 함유하여, 대상에의 적절한 투여를 위한 형태를 제공할 것이다. 이러한 제형은 투여 방식에 적합하여야만 한다. 바람직한 구현예에서, 약학 조성물들은 멸균상태이며, 대상, 바람직하게는 동물, 보다 바람직하게는 포유동물, 그리고 가장 바람직하게는 인간 대상에의 투여에 적당한 형태이다.
본 발명의 약학 조성물은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이들은, 예로서 고체, 반고체 및 액체 투약 형태를 포함하며, 예컨대 동결건조된 제형, 액상 용액 또는 현탁액, 주사 및 주입가능한 용액 등이 있다. 바람직한 형태는 투여 및 치료적 적용의 의도된 방식에 따라 달라진다.
본 발명의 세포 개체군, 또는 그를 포함하는 약학 조성물의, 그를 필요로 하는 대상에의 투여는 통상적인 방법에 의해 실시될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 세포 개체군은, 세포들을 시험관 내 (예로서 이식 또는 인그래프트 (engrafting) 전 그래프트로서) 또는 생체 내에서, 원하는 조직, 동물 조직으로 직접적으로 전달하는 것을 포함하는 방법에 의해 대상에게 투여된다. 상기 세포들은 적절한 방법에 의해 원하는 조직으로 이동될 수 있으며, 이는 일반적으로 조직 유형에 따라 변할 것이다. 예로서, 세포들은, 그래프트를 세포들을 함유하는 배지에 담그어 (또는 주입하여), 그래프트로 이동될 수 있다. 선택적으로 세포들은 개체군을 수립하여 조직 내에서 원하는 자리 상에 접종될 수 있다. 세포들은 카테테르 (catheters), 투관침 (trocars), 캐뉼러 (cannulae), 스텐트 (stents) (세포들과 함께 접종될 수 있음), 등과 같은 장치들을 사용하여 생체 내 자리들로 이동될 수 있다.
본 발명의 세포들은, 대상에의 투여 전에 방사선 조사될 수 있다. 이러한 처리는 세포들이 상기 대상에서 장기간 동안 증식 또는 생존할 수 없게 만든다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 방사선 조사된 세포들을 포함한다.
또한, 대상에서 세포 투여 및 IDO 발현 사이의 기간을 감소시키기 위하여, 대상에의 투여 전에 본 발명의 세포들은 IFN-γ로 예비자극될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 IFN-γ 예비자극된 세포들을 포함한다.
또한, 본 발명의 세포들은 대상에의 투여 전에, 임의의 순서로, 방사선 조사 및 IFN-γ 로 예비자극될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ-예비자극된 세포들 또는 본 발명의 IFN-γ-예비자극되고 방사선 조사된 세포들을 포함한다.
본 발명의 세포 개체군들 및 약학 조성물들은 병용 요법에서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 조합 치료는 하나 이상의 소염제에 잘 듣지 않는 염증성 장애를 가진 대상에게 투여된다. 다른 구현예에서, 상기 병용 요법은, 이에 제한되지는 않지만, 소염성 약물 (NSAIDs), 스테로이드성 소염성 약물, 베타-아고니스트, 항콜린생성제 (anticholingeric agents), 및 메틸 크산틴을 포함하는, 기타 유형의 소염제들과 함께 사용된다. NSAIDs의 예들은, 이에 제한되지는 않지만, 이부프로펜, 셀레콕십 (celecoxib), 디클로페낙 (diclofenac), 에토돌락 (etodolac), 페노프로펜, 인도메타신 (indomethacin), 케토랄락 (ketoralac), 옥사프로진 (oxaprozin), 나부멘톤 (nabumentone), 술린닥 (sulindac), 톨멘틴(tolmentin), 로페콕십 (rofecoxib), 나프록센, 케토프로펜, 나부메톤 (nabumetone) 등을 포함한다. 그러한 NSAIDs 는 시클로옥시게나아제 효소 (예로서, COX-1 및/또는 COX-2)를 저해함에 의해 기능한다. 스테로이드성 소염성 약물들의 예는, 이에 제한되지는 않지만, 글루코코르티코이드, 덱사메타손, 코르티손, 하이드로코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 아줄피딘 (azulfidine) 및 에이코사노이드 예컨대 트롬복산, 및 류코트리엔 (leukotrienes)을 포함한다. 인플릭시맵과 같은 단일클론성 항체들도 사용될 수 있다.
상기 구현예에 따라, 본 발명의 병용 요법들은, 그러한 소염제들의 투여 전, 투여와 함께, 또는 투여에 이어서 사용될 수 있다. 또한, 그러한 소염제들은 여기에서 림프 조직 유도물질 및/또는 면역조절제로서 특징된 약제들을 포괄하지 않는다.
다능성 성체 세포들을 분화된 세포들로부터 구분하는 방법
IFN-γ를 이용한 자극에 따른 IDO의 발현은 상기 효소를 발현하는 세포들을 IDO를 발현하지 않는 세포들로부터 구분하는데 사용될 수 있다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 다능성 세포가 IFN-γ 자극시 IDO를 발현하는지의 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 다능성 성체 세포들을 분화된 세포들로부터 구분하는 방법에 관한 것이다. IFN-γ 자극시 IDO의 측정은 임의의 기존 방법에 의해 실시될 수 있으며; 한 구현예에서, IFN-γ 자극시 IDO의 측정은 실시예 2에 개시된 것과 같이 실시될 수 있다.
상기 언급된 것과 같이, 본 발명의 세포 개체군의 세포들은, IDO를 구성적으로 발현하지 않지만, IFN-γ를 이용한 자극시에만 발현한다는 것을 특징으로 한다. 또한, IFN-γ 외에, IL-1, TNF-α 또는 내독소와 같은 어떤 기타 전-염증성 분자도 본 발명의 세포 개체군의 세포들 중에서 IDO의 발현을 혼자서 유도할 수 없다. 이러한 특징은 본 발명의 세포 개체군의 세포들을 다른 세포들과 구분하는데 사용될 수 있다.
키트
다른 측면에서, 본 발명은 (i) 본 발명의 세포들 및/또는 (ii) 본 발명의 T-reg 세포들 및/또는 (iii) 본 발명의 방사선 조사된 세포들 및/또는 (iv) 본 발명의 IFN-γ 예비-자극된 세포들 및/또는 (v) 본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비-자극된 세포들 및/또는 (vi) 본 발명의 IFN-γ 예비-자극되고 방사선 조사된 세포들을 함유하는 세포 개체군을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트들은 그러한 세포 유형들 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 모두를 포함할 수 있다.
치료 방법
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 세포들, 본 발명의 T-reg 세포들, 본 발명의 방사선 조사된 세포들, 본 발명의 IFN-γ 예비-자극된 세포들, 본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비-자극된 세포들 또는 본 발명의 IFN-γ 예비-자극되고 방사선 조사된 세포들을 함유하는 세포 개체군의, 자가면역 질환, 염증성 장애 또는 이식된 장기 및 조직들의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들과 관련된 하나 이상의 증상들을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 상기 세포 개체군들은 이식 내성의 유도를 위해, 또는 자가면역 또는 염증성 장애들, 또는 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함한 면역학적으로 매개된 질환들의 증상들을 치료 및 그에 따른 개선을 위해, 상기 장애들 또는 질환들 중 임의의 것을 겪고 있는 대상에, 사용될 수 있다. 상기 자가면역 질환들 및 염증성 질환들의 예들은 앞서 언급되었다. 특정 구현예에서, 질환은 염증성 질환으로, 예컨대 만성 염증성 질환, 예로서 IBD 또는 RA이다.
다른 측면에서, 본 발명은 자가면역 또는 염증성 장애들 또는 면역학적으로 매개된 질환 관련된 하나 이상의 증상들을, 상기 장애 또는 질환을 겪고 있는 대상에서, 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공하며, 이는 그러한 치료를 필요로 하는 상기 대상에, 본 발명의 세포들, 본 발명의 T reg 세포들, 본 발명의 방사선 조사된 세포들, 본 발명의 IFN-γ 예비자극된 세포들, 본 발명의 방사선 조사되고 IFN-γ 예비자극된 세포들, 또는 본 발명의 IFN-γ 예비자극되고 방사선 조사된 세포들을 함유하는 세포 개체군의 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 세포 개체군들은 이식 내성의 유도를 위해, 또는 자가면역 또는 염증성 장애들, 또는 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함한 면역학적으로 매개된 질환들의 증상들을 치료 및 그에 따른 개선을 위해, 상기 장애들 또는 질환들 중 임의의 것을 겪고 있는 대상에, 사용될 수 있다. 상기 자가면역 질환들 및 염증성 질환들의 예들은 앞서 언급되었다. 특정 구현예에서, 질환은 염증성 질환으로, 예컨대 만성 염증성 질환, 예로서 IBD 또는 RA이다.
본 발명은, 자가면역 질환, 염증성 장애 및 이식된 장기 및 조직의 거부반응을 포함하는 면역학적으로 매개된 질환들을 포함하는, 어떤 대상의 면역계를 조절하는 것이 유리한 장애들과 관련된 하나 이상의 증상들의 예방, 치료 또는 개선에 사용되는 인돌아민-2,3-디옥시게나아제 (IDO)를 발현함에 의해 인터페론-감마 (IFN-γ)에 반응하는 결합 조직 유래 세포들의 개체군을 제공한다.
도 1은 인간 지방 조직으로부터 분리되고 25 이상의 세포 개체군 배가 (doublings) 동안 생체 외 배양된, 본 발명에 의해 제공된 세포들의 성장 역학을 나타낸다.
도 2는 인간 지방 조직으로부터 분리된, 본 발명에 의해 제공된 세포들로부터 수득된 표면 마커들의 프로파일에 대응하는 형광 면역세포분석의 히스토그램을 나타낸다. 아이소타입 (isotype) 대조구들에 대응하는 (음성 대조구들) 히스토그램을 회색으로 어둡게 나타내었다.
도 3은 인간 지방 조직으로부터 분리된 본 발명에 의해 제공된 세포들을 상이한 기간 동안 전 염증 반응물 (pro-inflammatory reagents)과 함께 인큐베이션한 후, RT-PCR (도 3A) 또는 웨스턴 블롯팅 (도 3B)에 의해 검출된 IDO 발현 분석을 나타낸다. IL-1, 인터류킨 1; TNF-α, 종양 괴사 인자-알파; LPS, 지질다당질; IFN-γ, 인터페론-감마; C-, 음성 대조구 ; C+, 양성 대조구; n.i., IFN-γ로 유도되지 않은 세포들. GAPDH (글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제)는 RT-PCR의 부하 대조구로서 사용된다.
도 4는 상이한 인간 조직들 (지방, 골수, 연골 및 피부)로부터 분리된 본 발명에 의해 제공된 세포들의 48 시간의 IFN-γ 처리 후 IDO 발현의 웨스턴 블롯팅 검출을 나타낸다. Ctrl-, 음성 대조구 (배지); Ctrl+, 양성 대조구; (-), IFN-γ로 처리되지 않은 세포들; (+), 48 시간 동안 IFN-γ로 처리된 세포들.
도 5는 TNBS (2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산) 투여로 처리된 마우스들에서의 체중 감소를 나타낸다. 본 도면은 인간 지방 조직으로부터 단리된 본 발명에 의해 제공된 세포들의 투여 후 증가된 중량의 투여량-의존적인 향상을 보여준다. 10일 후 1x106 세포들을 수령한 마우스들은 대조구에 비해 유의한 중량 차이를 나타내지는 않았다.
도 6은 인간 지방 조직으로부터 분리된 본 발명에 의해 제공된 세포들의 투여 후 TNBS 처리된 마우스들의 생존률을 나타낸다. 역시, 투여량 의존성이 관찰되었으며, 1x106 세포들이 0.3x106 세포들보다 더 강한 효과를 나타내었으나, 두 경우 모두에서 세포들은 TNBS 처리된 마우스들의 생존률을 현저히 향상시켰다.
도 7은 인간 지방 조직으로부터 분리된 본 발명에 의해 제공된 1x106 세포들 및 48 시간 동안 30ng/ml IFN-γ로 예비자극된 동일한 1x106 세포들의 투여 후 TNBS 처리된 마우스들에서의 중량의 비교를 나타낸다. 이 그래프는 TNBS 처리된 마우스들에서의 심각한 중량 감소 및 세포들을 수령한 마우스들에서 3일 후 명백한 개선을 보여준다. 8 일 후, 이들 마우스들은 심지어는 중량 증가를 나타낸 반면, 대조구 마우스들 (세포 투여 없이 TNBS 처리된 마우스들)은 여전히 심한 체중 감소를 나타내었다. 또한, IFN-γ 예비자극된 세포들은 비-예비자극된 세포들보다 TNBS 처리로부터 보다 신속하고 보다 강한 회복을 나타내었다.
도 8은 도 7의 데이터를 "실험 1"로서, 그리고 추가로 실시예 5에 기재된 추가의 데이터 세트인 "실험 2"로부터의 추가 데이타를 보여준다. 이 그래프는 TNBS 처리된 마우스들에서의 극적인 중량 감소 및 세포들을 수령한 마우스들에서의 명백한 향상을 보여준다. 이러한 향상은 대장염의 심각성에 의해서도 측정가능하였다.
도 9는 결장 (국부 반응) 및 혈청 (전신 반응) 모두에서, 시험된 전염증성 시토카인 (TNF-α, IL-6, IL-1b, IL-12, 및 IFN-γ) 및 케모카인 (MIP-2 및 RANTES)이 비-처리된 마우스들에 비해 세포-처리된 동물들에서 보다 낮았음을 보여준다.
도 10은 MPO 활성에 의해 측정된 것과 같은, 호중성 백혈구 침윤이 ASC-처리된 동물에서 더욱 낮았으며, 세포들이 IFN-γ로 예비자극된 경우 더욱 낮았음을 나타낸다.
도 11은 세포 분석기에 의해, CFSE 표지된 세포들이 처리된 동물들의 유출 림프절에 국한되었다는 것을 보여준다. 이는 투여된 세포들이 APCs로서 기능하고 있던 경우 예측된 국재성(localization)이다.
도 12는 IFN-γ 처리에 의한 인간 ASCs 에서 APC 마커들의 유도를 보여준다. 윗줄: 처리되지 않은 ASCs 의 세포 분석기 히스토그램; 아랫줄, IFN-γ로 4 일 동안 처리 후 ASCs의 세포 분석기 히스토그램. 아이소타입 대조구들은 검정으로 어둡게 나타내었다.
도 13은 본 발명의 세포들이 CIA 발생률 및 심각성을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 수립된 CIA가 주입된 마우스들에서 관절염의 심각성인 A는, 임상적 스코어링 (scoring) 또는 발 두께 측정에 의해 평가하였다. 괄호 내의 숫자들은 대조구인, i.p. 및 i.a. 군들에서의 관절염 발생률 (50일 째에 관절염 스코어가 >2인 마우스들의 %)을 나타낸다. 사진들은 상이한 실험군들 (대조구 및 ASC i.p.)의 마우스들에서 발 팽창의 대표적인 예들을 보여준다. 군 당 n=8-11 마우스들. p<0.001 대 32일 후의 대조구. 관절에서 호중성 백혈구 침윤을 측정하는 미엘로퍼옥시다아제 (MPO) 활성. *p<0.001 대 대조구.
도 14는 염증성 반응의 저해를 나타낸다. 처리되지 않은 (대조구) 또는 ASC-처리된 CIA 마우스들에서 염증성 매개자들의 전신 및 국부 발현을 후-면역화한지 35일에 분석하였다. A, 관절에서 시토카인/케모카인 함량. 면역화되지 않은 마우스로부터의 발을 분석하였으며, 기본 반응의 평가에 대해서도 동시에 분석하였다. B, 혈청 TNFα 및 IL-1β 수준. n=6-8 마우스들/군. *p<0.001 대 대조구들.
도 15는 본 발명의 세포들이 CIA에서 TH1-매개 반응을 하향 조절(down regulate)한다는 것을 나타낸다. A, 처리되지 않은 (대조구) 또는 ASC-처리된 CIA 마우스들 및 상이한 농도의 CII로 시험관 내 자극된 마우스들로부터 30일에 분리된 유출 림프절의 세포들의 증식 반응 및 시토카인 생산. 항-CD3 항체들 (▼, 처리되지 않은 CIA 마우스들; ▽, AM-처리된 CIA 마우스들)을 이용한 DLN 세포들의 자극을 비특이적 자극의 평가에 이용한다. 3 개의 면역화되지 않은 DBA/1 DLN 세포들의 풀을, 기본 반응의 평가에 사용하였다. n=5 마우스들/그룹. B, CII-특이적 시토카인-생산 T 세포들의 수. 처리되지 않은 DLN 세포들 (대조구) 또는 ASC-처리된 CIA 마우스들을 CII (10 ㎍/ml)를 사용하여 시험관 내에서 재평가하고, CD4 및 세포내 시토카인 발현에 대해 흐름 세포분석기로 분석하였다 (게이트처리된 (gated) CD4 T 세포들에서 IFNg/TNFα 또는 IL-4/IL-10 발현). 104 CD4 T 세포들에 상대적인 IFN-γ, IL-4 및 IL-10을 발현하는 T 세포들의 수를 나타낸다. 나타낸 데이터는 두 개의 독립적인 실험들로부터의 합동(pooled) 값들을 나타낸다. C, 처리되지 않거나 (대조구) 또는 ASC-처리된 CIA 마우스들로부터 분리되고 CII (10 ㎍/ml)로 48 시간 동안 시험관 내에서 자극된 활막 세포들에서의 CII-특이적 증식 반응. 데이터는 그룹 당 3 마리의 동물들로부터의 합동된 활막 세포들의 결과를 나타낸다. D, 처리되지 않거나 (대조구) 또는 ASC-처리된 CIA 마우스들 (8-12 마우스들/그룹)로부터 35일에 수집된 혈청에서의 CII-특이적 IgG, IgG1 및 IgG2a 수준. *p<0.001 대 대조구.
도 16.A.는 본 발명의 세포로 처리된 CIA 마우스들의 DLN 및 활막 모두가, 처리되지 않은 (대조구) CIA 마우스들에 비해, 작동체 T 세포들의 수에서의 어떤 증가도 없이, 규제 T 세포들 (CD4+CD25+Foxp3+)의 수에서의 증가를 유도함을 나타낸다.
도 16.B.는 본 발명의 세포들로 처리된 CIA 마우스들, (그러나 대조구 (처리되지 않은) CIA 마우스들은 아님)이 CII에 대한 작동체 T 세포 반응을 특이적으로 저해하는 규제 T 세포들을 포함한다는 것을 보여준다.
도 17은 ASCs 와 림프구들의 공동배양이 림프구 증식의 저해를 일으키는 결과를 낸다는 것을 보여준다.
도 18은 5000개 세포/cm2로 도말되고 3ng/ml IFN-γ로 120 시간에 이르는 시간 동안 자극된 ASCs가 IDO를 생산한다는 것을 보여주며, 그 활성은 트립토판 대사 및 HPLC를 이용한 키누레닌 생산에 의해 측정된다.
도 19는 5000개 세포/cm2로 도말되고 3pg/ml IFN-γ로 120 시간에 이르는 시간 동안 자극된 ASCs가 IDO를 생산하지 못한다는 것을 보여준다. 키누레닌은 검출되지 않았다.
도 20은 500개 세포/cm2로 도말되고 3ng/ml IFN-γ로 120 시간에 이르는 시간 동안 자극된 ASCs가 현저한 양의 IDO를 생산하지 못한다는 것을 보여준다.
도 21A는 밝은 필드 사진으로, 식세포작용된 덱스트란 FITC를 갖는 세포들을 보여준다. 도 21B는 녹색 형광 단백질 필터를 사용한 형광 현미경분석을 사용한 동일 개체군을 보여준다.
이제 본 발명은, 실시예들에 의해 보다 상세히 설명될 것이며, 이들은 결코 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니며, 이들 실시예들은 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명을 상술하는 역할을 할 것이다.
실시예 1
본 발명의 세포들의 분리 및 확장
I. 재료 및 방법
지방 조직으로부터 본 발명의 세포들의 분리
인간 지방 조직을, 국소 마취 및 일반 진정작용 하에, 지방흡입에 의해 수득하였다. 중공의 끝이 무딘 캐뉼러를 작은 절개 (직경 0.5cm 미만)를 통해 피하 공간 내로 도입시켰다. 온건한 흡입으로, 지방 조직의 기계적 붕괴를 위해 캐뉼러를 지방 조직 복부벽 구역을 통해 이동시켰다. 혈액 손실을 최소화하기 위하여, 식염수 및 혈관수축제인 에피네프린을 지방조직 구역 내로 주입하였다. 이러한 방식으로, 80 내지 100 ml의 생 지방흡입물을 치료될 각 환자로부터 수득하였다.
생 지방흡입물을 멸균 인산염 완충 식염수 (PBS; Gibco BRL, Paisley, Scotland, UK)로 광범위하게 세척하여 혈액 세포, 식염수 및 국소 마취제를 제거하였다. 세포외 기질은 균형 염 용액 (5 mg/ml; Sigma, St. Louis, USA) 중에서 II 형 콜라게나아제 (0.075%; Gibco BRL)로 37℃ 에서 30 분 동안 분해시켜 세포 분획을 방출시켰다. 그 후, 콜라게나아제를 10% 우태혈청 (FBS; Gibco BRL)을 포함한 동량의 세포 배지 (둘베코 개량 이글 배지)(DMEM; Gibco BRL)를 첨가함으로써 불활성화시켰다. 세포들의 현탁액을 250 x g 에서 10 분 동안 원심분리하였다. 세포들을 0.16 M NH4Cl에 재현탁시키고, 적혈구 용해를 위해 실온에서 (RT) 5 분 동안 정치시켰다. 이 혼합물을 250 x g 에서 원심분리하고, 세포들을 DMEM + 10% FBS 및 1% 암피실린/스트렙토마이신 혼합물 (Gibco BRL) 중에 재현탁시킨 후, 이들을 40μm 메쉬를 통해 여과시키고, 10-30 x 103 세포들/cm2의 농도로 조직 배양 플라스크들 중에 도말하였다.
관절 연골로부터의 본 발명의 세포들의 분리
관절경 기술을 이용하여 공여자의 무릎 관절로부터 인간 유리질 관절 연골을 수득하였다. 약 4 cm2의 연골을 페모럴 컨다일 (phemoral condile)의 외측 가장자리로부터 취하였으나, 상기 생검물의 크기는 공여자의 연령, 관절 구조 및 수술자의 생각에 따라 달라질 수 있다. 상기 생검물을 멸균 식염수 중에 현탁시키고, 그의 사용까지 3-8℃ 에서 저장하였다. 생 연골 샘플들은 48 시간 이상 저장되어서는 안된다.
연골 생검물을 1% FBS를 함유하는 1ml의 멸균 세포 배지로 옮기고, 가능한 한 작은 조직 절편들을 수득하도록 다졌다. 결과의 연골 절편들을 0.1% (w/v) 콜라게나아제를 함유하는 유사 매질 중에 현탁시키고, 연속적으로 부드럽게 진탕하면서 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 분해 후, 수득된 세포 현탁액을 40μm 메쉬를 통해 여과시키고, 세포들을 조직 배양 플라스크에 10-30 x 103 세포들/cm2의 농도로 도말하였다.
세포들의 생체 외 확장
지방 조직 및 관절 연골 모두로부터의 세포들을, 공기 중 5% CO2 분위기 중, 37℃에서 24 시간 동안 개별적으로 배양하였다. 그 후, 상기 배양 플라스크들을 PBS로 세척하여 부착되지 않은 세포들 및 세포 절편들을 제거하였다. 세포들을, 동일한 매질 및 동일한 조건 하에서, 매 3 일 내지 4 일 배지를 교체하면서, 그들이 약 80% 컨플루언스에 도달될 때까지, 배양을 유지하였다. 세포들을 그 후 약 5-6 x 103 세포들/cm2의 세포 밀도에 대응하는, 1:3의 희석으로, 트립신-EDTA (Gibco BRL)을 이용하여 계대하였다. 인간 지방 조직으로부터 분리되고 25 이상의 세포 개체군 배가 동안 생체 외 배양된 세포들의 세포 성장 동력학을 도 1에 나타내었다.
세포 특징화
배양 계대 1 내지 25에서의 세포들을 사용하여 세포 특징화를 수행하였다. 지방 조직 및 관절 연골 모두로부터의 세포들을, 다음을 포함하는 일련의 표면 마커들의 존재/부재에 대한 형광 마커 (즉, 형광 면역세포측정법)로 표지된 항체들을 사용하여, 흐름 세포 분석기로 분석하였다:
- 항원 제시 세포들 (APCs)의 마커들: CD11b, CD11c, CD14, CD45, 및 HLAII.
- 상피 세포들의 마커들: CD31.
- 기타 마커들: CD9, CD34, CD90, CD44, CD54, CD105 및 CD133.
흐름 세포분석기 분석에 사용된 항체들은 다음과 같았다:
- CD9: 클론 MM2/57 마우스 IgG2b - FITC 표지된 항체 (Serotec);
- CD11b: 클론 ICRF44 마우스 IgG1 - FITC 표지된 항체 (Serotec);
- CD11c: 클론 BU15 마우스 IgG1 - FITC 표지된 항체 (Serotec);
- CD14: 클론 UCHM1 마우스 IgG2a - FITC 표지된 항체 (Serotec);
- CD31: 클론 WM59 마우스 IgG1 - FITC 표지된 항체 (Serotec);
- CD34: 클론 QBEND 10 마우스 IgG1 - FITC 표지된 항체 (Serotec);
- CD44: 클론 F10-44-2 마우스 IgG2a - FITC 표지된 항체 (Serotec);
- CD45: 클론 F10-89-4 마우스 IgG2a- FITC 표지된 항체 (Serotec);
- CD54: 클론 15.2 마우스 IgG1 - FITC 표지된 항체 (Serotec);
- CD90: 클론 F15-42-1 마우스 IgG1-FITC 표지된 항체 (Serotec);
- CD105: 클론 SN6 마우스 IgG1 - FITC 표지된 항체 (Serotec); 및
- 항 인간 HLA 클래스 II DP, DQ, DR: 클론 WR18 마우스 IgG2a - FITC 표지된 항체 (Serotec);
- CD133: 클론 293C3 마우스 IgG2b- PE 표지된 항체 (Miltenyi Biotec).
II . 결과
결과들을 도 2에 모았으며, 이는 분석된 세포들이 CD9, CD44, CD54, CD90 및 CD105에 대해 양성이고, CD11b, CD11c, CD14, CD31, CD34, CD45, CD133 및 HLAII에 대해 음성임을 나타낸다. 세포들은 상피 또는 APC 계통들에 대해 특이적인 시험된 마커들 모두에 대해 음성이었다 (CD11b, CD11c, CD14, CD45, 및 HLAII).
실시예 2
인터페론-감마 ( IFN -γ)에 의한 인돌아민 2,3- 디옥시게나아제 ( IDO )의 유도
I. 재료 및 방법
인간 지방 조직으로부터 분리된 본 발명의 세포들 (실시예 1)을, 10,000 세포들/cm2의 밀도로 조직 배양 플레이트들 상에 접종하고, 세포 확장에 대해 이전에 언급된 조건 중에서 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 다음을 포함하는 상이한 전-염증성 자극물들을 배지에 첨가하였다:
· 인터류킨-1 (IL-1): 3 ng/ml
· 인터페론-감마 (IFN-γ): 3 ng/ml
· 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α): 5 ng/ml
· 지질다당류 (LPS): 100 ng/ml
세포들을 대응 자극물들의 존재 하에, 30분 내지 48 시간 범위의 기간 동안 인큐베이션한 후, 이들을 트립신 분해에 의해 수집하고, 프로테아제 저해제들을 함유하는 RIPA 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF (페닐-메틸술포닐플루오라이드), 1 mM EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), 5 ㎍/ml 아프로티닌, 5 ㎍/ml 류펩틴, 1% 트리톤 x-100, 1% 나트륨 디옥시콜레이트, 0.1% SDS) 중에서 용해시켰다. 세포 용균물들을 그 후 IDO-특이적 단일클론성 항체 (마우스 단일클론성 IgG, 클론 10.1, Upstate cell signaling solutions로부터)를 사용하여 웨스턴 블롯 실험에서 사용하였다. 또한, RNA를 처리된 세포들로부터 분리하고, IDO cDNA 에 특이적인 프라이머들을 사용하는 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 실험에 의해 시험하였다 (GenBank 수납 번호. M34455 (GI:185790)).
전방 5' GGATTCTTCCTGGTCTCTCTATTGG 3';
후방: 5' CGGACTGAGGGATTTGACTCTAATG 3').
II . 결과
본 실험의 결과들 [도 3A (RT-PCR) 및 3B (웨스턴 블롯팅)]은 본 발명에 의해 제공된 세포들이 IDO를 구성적으로 발현하지 않는다는 것을 보여준다. IDO mRNA 는 IFN-γ 자극 2시간 후에 유도되지만, 그 단백질의 발현은 유도의 8-24 시간 사이에서만 검출될 수 있었다.
본 발명의 세포들을 골수, 관절 연골 및 피부를 포함하는 다른 인간 조직들로부터 분리한 경우, 유사한 결과들을 수득하였다 (도 4).
실시예 3
종양형성 거동
I. 재료 및 방법
실시예 1에 기재된 것과 같은 인간 지방 조직으로부터 분리된 본 발명의 세포들로 본 실험을 수행하였다. 면역결핍 마우스들에게 피하 주입 (5 x 106 세포들/마우스) 전, 세포 샘플들을 2-7 주동안 배양하였다. 마우스들은 Charles River Laboratories로부터 수득된 nu / nu 주들이었다. 마우스들은 흉선이 없으며, T-세포 결핍이었다. 주입된 마우스들을, 희생 및 병리학적 연구 전에 4 달 동안 지속시켰다.
병리학적 연구: 모든 동물들에서 부검을 행하였다. 동물들은 뇌, 폐, 심장, 간, 콩팥, 비장, 복부 림프절 및 주사 부위에서의 큰 이상에 대해 검사되었다. 조직학적 검사 (파라핀 절단 및 헤마톡실린-에오신 (hematoxilin-eosin: H&E) 염색)를 위해 조직들을 수집하였으며, 이는 주사 부위, 폐 및 림프절들을 포함하였다.
기형종 세포계 (N-TERA)를 양성 대조구로서 사용하였으며, 이는 동일한 조건 하에서 주입되었다.
II . 결과
결과들은, 기형종 세포들이 이식된 모든 마우스들이 몇 주 후 종양을 발생한 반면, 본 발명의 세포들이 이식된 동물들 중 어떤 것도 이식 후 최초 4 달 내에 종양을 발생시키지 않았음을 보여준다. [데이타는 나타내지 않음].
실시예 4
마우스들에서 실험적으로 유도된 IBD 의 치료
I. 재료 및 방법
전에 설명된 바에 따라 (Neurath, M.F., 등 1995. Antibodies to IL-12 abrogate established experimental colitis in mice. J. Exp . Med . 182, 1281-1290), Balb/c 마우스들 (6-8 주령, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)에서 대장염을 유도하였다. 간략하면, 마우스들을 할로세인으로 가볍게 마취시키고, 3.5 F 카테테르를 항문으로부터 직장 내로 4cm 삽입하였다. 대장염을 유도하기 위하여, 50% 에탄올 (장 상피 장벽을 파괴하기 위하여) 중의 50 또는 30 mg/ml의 TNBS (2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) 100 ㎕를 1ml 주사기에 채워 카테테르를 통해 내강 내로 서서히 투여하였다. 대조구 마우스들은 50% 에탄올만을 단독으로 수령하였다 (100 ㎕). 실시예 1에 기재된 것과 같은 인간 지방 조직으로부터 수득된 상이한 수의 본 발명의 세포들을 사용하여, TNBS 적하 후 12 시간에 동물들을 직장내 처리하였다 (0.3 x 106 및 1 x 106 세포들, 인산염 완충 식염수인, PBS에 현탁됨). 일부 실험들에서, 상기 세포들은 주사 전 24 시간 동안 200 U/ml IFN-γ로 예비처리되었다. 동물들을 생존, 설사의 출현, 및 체중 감소에 대해 매일 모니터링하였다 (도 5, 6 및 7).
II . 결과
도 5에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 세포들의 투여 후 수득된 중량의 투여량-의존적 향상이 있었다. 실제로, 투여량 의존성이 도 6에서 관찰될 수 있으며, 1x106 세포들이 0.3x106 세포들보다 강한 효과를 나타내었다. 두 경우 모두에서, 세포들은 TNBS 처리된 마우스들의 생존률을 현저히 향상시켰다.
또한, IFN-γ 예비자극된 세포들은 예비자극되지 않은 세포들에 비해 TNBS 처리로부터 보다 빠르고 더욱 강한 회복을 나타내었다 (도 7). 그래프는 TNBS 처리된 마우스들이 체중을 극적으로 손실하였으며, 세포들을 수령한 마우스들에서는 명백한 향상이 있었음을 보여준다.
실시예 5
마우스들에서 실험적으로 유도된 염증성 장 질환 ( IBD )의 치료-추가 실험들:
I. 재료 및 방법
실시예 4의 동일한 실험들의 연장으로, 이전에 기재된 것과 같이 (Neurath, M.F., 등 1995. Antibodies to IL-12 abrogate established experimental colitis in mice. J. Exp . Med . 182, 1281-1290) Balb/c 마우스들 (6-8 주령, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)에서 대장염을 유도하였다. 간략하면, 마우스들을 할로세인으로 가볍게 마취시키고, 3.5 F 카테테르를 항문으로부터 직장내로 4cm 삽입하였다. 대장염을 유도하기 위하여, 50% 에탄올 (장 상피 장벽을 파괴하기 위하여) 중의 50 또는 30 mg/ml의 TNBS (2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) 100 ㎕를 1ml 주사기에 채워 카테테르를 통해 내강 내로 서서히 투여하였다. 대조구 마우스들은 50% 에탄올만을 단독으로 수령하였다 (100 ㎕). 실시예 1에 기재된 것과 같은 인간 지방 조직 (ASC)으로부터 수득된 상이한 수의 본 발명의 세포들을 사용하여, TNBS 적하 후 12 시간에 동물들을 직장내 또는 복강내 (i.p.) 처리하였다 (0.3 x 106 및 1 x 106 세포들, 인산염 완충 식염수인, PBS에 현탁됨). 일부 실험들에서, 상기 세포들은 주사 전 24 시간 동안 200 U/ml IFN-γ로 예비처리되었다. 또한, 일부 실험들에서는, 세포들을 마우스들에 투여하기 전에 CFSE (형광 프로브)로 표지하였다. 동물들을 생존, 설사의 출현 및 심각성, 및 체중 감소에 대해 매일 모니터링하였다. 질환의 급성기에, 혈청을 수집하고 단백질 추출물들을 결장으로부터 수득하였다 (3일). 단백질 추출물들 및 혈청에서의 시토카인/케모카인 함량을 ELISA에 의해 결정하였다. 장간막 림프절 중의 CSFE-표지된 세포들의 존재를 흐름 세포분석기로 분석하였다.
II . 결과
모든 경우들에서, 본 발명의 세포들(ASCs)로 처리된 마우스들은 처리되지 않은 동물들에 비해 염증 증상에서 명백한 향상을 보였다. 세포들이 국소 (직장내) 또는 전신 (i.p.)투여된 경우, 전신 경로가 더욱 유효한 것 같기는 하나, 상기 향상은 투여량 의존적이었으며, 시험된 모든 파라미터들에서 통계적으로 유의하였다. 도 5에 앞서 나타낸 것과 같이, 본 발명의 세포들의 투여 후 늘어난 체중의 투여량 의존성 향상이 있었다. 실제로, 투여량 의존성이 도 6, 7 및 8 에서 관찰될 수 있으며, 1x106 세포들이 0.3x106 세포들에 비해 더욱 강한 효과를 나타내었다. 모든 경우들에서, 세포들은 TNBS 처리된 마우스들의 생존률을 현저히 개선시켰다.
나아가, IFN-γ 예비자극된 세포들은 예비자극되지 않은 세포들에 비해 TNBS 처리로부터 더 빠르고 더 강한 회복을 보였다 (도 8). 그래프는, TNBS 처리된 마우스들은 체중이 현저히 감소되었으며, 세포들을 수령한 마우스들에서는 명백히 향상되었음을 보여준다. 이러한 향상은 대장염의 심각성에 의해서도 측정가능하였다.
염증성 면역 반응은 본 발명의 세포들로 처리된 동물들에서 명백히 감소되었다. 도 9에 나타난 것과 같이, 결장 (국소 반응) 및 혈청 (전신 반응) 모두에서 시험된 모든 전염증성 시토카인들 (TNF-α, IL-6, IL-1b, IL-12, 및 IFN-γ) 및 케모카인들 (MIP-2 및 RANTES)은 처리되지 않은 마우스들에 비해 세포 처리된 동물들에서 더욱 낮았다. 이러한 저해 반응은 IFN-γ로 예비자극된 세포들로 처리된 동물들에서 증진되었다. 한편, 면역규제 시토카인 IL-10 은, 처리되지 않은 TNBS-손상된 동물들 및 대조구 동물들 모두에 비해, ASC-처리된 마우스들의 결장에서 증가되었다. 또한, MPO 활성에 의해 측정된 것과 같은, 호중구 침윤은 ASC-처리된 동물들에서 더욱 낮았으며, 세포들이 IFN-γ로 예비자극된 경우에는 더욱 낮았다 (도 10).
세포 분석기를 통해, 표지된 세포들이 처리된 동물들의 유출 림프절들에 국한되었음을 알았다 (도 11). 이는, 투여된 세포들이 APCs로서 기능하고 있던 경우 예측된 국재성이다.
실시예 6
IFN -γ 자극 후 본 발명의 세포들에서의 APC 마커들의 유도
I. 재료 및 방법
본 발명의 세포들은, 실시예 1 에 기재된 것과 같은 인간 피하 지방 조직 (ASCs)으로부터 수득되었다. 최소 3 배양 계대 후, 세포들을 표준 배지 중에 또는 3ng/ml IFN-γ를 함유하는 배지 중에서 4 일 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포들을 면역 반응에 관련된 일부 표면 마커들에 대해 염색하였다 (항원 제시 세포들 (APCs)의 활성에 특이적으로 관련됨). 이들 마커들은 다음을 포함하였다:
· HLA-II (DP, DQ, DR). 이 수용체는 T 세포들에 외래 항원의 절편들을 제시하여, 후천성 면역 반응을 개시한다 (이는 T 세포 활성화에 대한 첫번째 신호이다). 본 발명의 세포들은 HLA-II 를 구성적으로 발현하지 않는다. 사용된 항체는 Serotec으로부터 수득되었다.
· CD40. 이 단백질은, 활성화된 T 세포들의 표면에서 발현되는 CD40L에 결합한다. 본 발명의 세포들은 CD40을 검출가능하지 않거나 또는 매우 낮은 수준으로 구성적으로 발현한다. 사용된 항체는 Serotec으로부터 수득하였다.
· ICAM-1 (CD54). 이는 T 세포들과 APCs 간의 결합에 연루되는 주요 단백질이다. 이의 발현이 적당하게 실시되기 위해서는 APCs와 T 세포들간의 다른 상호작용이 필요하다. 본 발명의 세포들은 저-중간 수준의 ICAM-1을 구성적으로 발현한다. 사용된 항체는 Serotec으로부터 수득하였다.
· 보조자극 단백질의 B7 족의 원들 (이들은 T 세포 활성화에 대한 이차 신호를 전달한다):
o CD80 (B7-1). Serotec으로부터 수득된 항체.
o CD86 (B7-2). Serotec으로부터 수득된 항체.
o ICOSL (B7-H2). e-Bioscience 으로부터 수득된 항체.
o B7-H4. e-Bioscience 으로부터 수득된 항체.
o PD-L1 (B7-H1). e-Bioscience 으로부터 수득된 항체.
o PD-L2 (B7-DC). e-Bioscience 으로부터 수득된 항체.
처음 4 개는 주로 자극 신호를 전달하는 한편 (T 세포 작동기 클론들의 유도를 촉진), PD-L1 및 PD-L2 는 주로 관용원성 (tolerogenic) (T 세포 아네르기-비활성화의 유도를 촉진)이다. 이들 중 어떤 것도 본 발명의 세포들에 의해 구성적으로 발현되지 않는다.
II . 결과
IFN-γ 처리 후, 본 발명의 세포들은 HLA-II, PD-L1 및 PD-L2의 발현 및 CD40 및 ICAM-1의 상향조절 (upregulation)을 유도하였다. 이 실험의 결과들을 도 12에 나타내었다.
이들 결과들은 매우 상관되며, 이들은, IDO 활성의 유도와 함께, IFN-γ 처리시 본 발명의 세포들이 관용성 APCs의 표현형 특징을 나타낸다는 것을 증명하기 때문이다.
실시예 7
ASCs 를 이용한 콜라겐-유도된 관절염 ( CIA )의 치료
I. 재료 및 방법
DBA1/Jlac 수컷 마우스들 (6-8 주령)에서 200 ㎍의 완전 프레운드 보조제 (complete Freund's adjuvant: CFA) 중의 닭 II 형 콜라겐 (CII) 및 200㎍의 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) H37RA를 함유하는 에멀션을 피하 주사하여 실험적 관절염을 유도하였다. 미리 수립된 점수 시스템에 따라, 다리의 위부분 및 아래 부분의 관절의 염증-적색-관절강직을 측정함에 의해, 매일 2 회, 다른 기술자에 의해 CIA를 전개시켰다.
임상적 증상이 CIA의 수립을 나타내는 경우 (면역화 후 23 일에, p.i.), 동물들을 실시예 1에 기재된 것과 같은 인간 지방 조직으로부터 수득된 본 발명의 2x105개의 세포들을 사용하여 또는 PBS를 대조구로서 사용하여 5일 동안 매일 i.p. 주사하였다. 다르게는, CIA 마우스들을 관절내 (i.a.)로, 병에 걸린 관절염들 중 하나에 일 회 주사하였다. 앞서 설명된 것과 같이, 처리된 동물들을 전개시키고, 50 일째 p.i. 에서, 마우스들을 안락사시켰다. 다음을 포함하는 몇몇 파라미터들을 혈액 및 관절에서 측정하였다: 관절 시토카인, 혈청 시토카인, 면역글로불린 아이소타입, 및 림프구들의 표현형 및 시토카인.
II . 결과
도 13, 14, 및 15에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 세포들은 마우스 모델 중에서 명백히 CIA 빈도 및 심각성을 감소시킨다. 특히, 면역 반응에 대한 효과는 Th2 반응(IL-4, IgG1)에서의 어떤 증가도 없이, 그리고 면역규제 시토카인들 (IL-10 및 TGF-β)의 높은 수준의 유도로, Th1 반응 (IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-1β, IL-6, IL-12, MIP2, RANTES, 및 IgG2a)의 강한 저해와 일치하였다.
실시예 8
본 발명의 세포들을 이용한 규제 T 세포들의 생체 내 유도
I. 재료 및 방법
실시예 7에 기재된 것과 유사한 연구에서, 작동체 (CD4+CD25-Foxp3-) 및 규제 T 세포들 (CD4+CD25+Foxp3+)을 유출 림프절 (DLN)로부터, 그리고 처리되지 않은 CIA 마우스 및 ASC-처리된 CIA 마우스들의 활막으로부터, 세포 분석기에 의해 분리하였으며, 각 개체군에서 세포들의 수를 평가하였다.
ASC-처리된 CIA 마우스들에 존재하는 규제 T 세포들의 CII-특이적 작동체 세포들을 저해하는 능력을 평가하기 위하여, 증식 분석을 수행하였으며, 여기에서 CIA 마우스들로부터 분리된 자가반응 T 세포들은, 처리되지 않은 CIA 마우스들 (대조구) 또는 ASC-처리된 CIA 마우스들 (1/64 내지 1/1의 비율)로부터의 DLN T 세포들 (규제 T 세포들)의 수를 증가시키며 공동배양되고, CII (10mg/ml) 및 비장성 APCs로 자극되었다.
II . 결과
도 16.A.에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 세포들로 처리된 CIA 마우스들의 DLN 및 활막은 모두, 처리되지 않은 CIA 마우스들 (대조구)에 비해, 작동체 T세포들의 수에서의 임의의 증가 없이, 규제 T 세포들 (CD4+CD25+Foxp3+)에서의 수의 증가를 유도하였다.
도 16.B에 나타낸 데이타는, 본 발명의 세포들로 처리된 CIA 마우스들이, CII 에 대한 작동체 T 세포 반응을 특이적으로 저해하는 규제 T 세포들을 함유하지만, 대조구 (처리되지 않음) CIA 마우스들은 그렇지 않음을 증명한다.
결론적으로, 실험적 자가면역 질환 (CIA)의 동물 모델의 본 발명의 세포들을 이용한 처리는 자가반응성 T 세포 작동체 반응을 억제할 수 있는 항원-특이적 규제 T 세포들의 출현을 유도한다.
실시예 9
림프구 증식 분석
실시예 1의 방법을 통해 수득된, 본 발명의 지방 유래된 ASCs를 200.000 림프구와 함께 그리고 림프구 없이 (활성화된 w/10㎍PHA/ml) 5000 세포들/cm2 로 도말하고 3일 동안 공동배양 하였다. 림프구들의 증식을 H3 혼입에 의해 측정하였다. 도 17에 나타낸 것과 같이, ASCs 및 림프구들의 공동배양은 림프구 증식의 86% 저해를 초래하였다. 상이한 농도의 1메틸-트립토판 (1-MT)의 첨가는 이러한 억제를 본래상태로 되돌렸다. 1-MT는 대사되지 않는 트립토판 유사체이다. 이 분석은 본 발명의 세포들의 면역억제 활성을 유도하는, IDO를 통한 트립토판 이화작용의 필요성을 증명한다.
실시예 10
세포 수 및 IFN -γ 농도에 대한 ASCs 능 ( IDP 생산)
재료 및 방법
HPLC :
Waters 1515 등용매 (Isocratic) HPLC 펌프, Waters 717 오토샘플러 (Autosampler) 및 Waters 2487 이중 흡수 검출기 (Dual Absorbance Detector)를 사용하여 통상적인 HPLC를 실시하였다.
*HPLC -프로토콜
100μM 내지 100mM 범위의 트립토판 및 키누레닌의 새로 만든 용액들을 칼륨-인산염 완충액 (50mM pH 6.0) 중의 10% 아세토니트릴 중에서 제조하였다. 이들 저장 용액들로부터, 50㎕의 트립토판 및 10㎕의 키누레닌 및 940㎕ (70g/l) 또는 10% FCS를 조합하여 대조구 샘플을 만들고 -80℃ 에서 저장하였다.
샘플 제조: 샘플들 (세포 배양물)로부터 200㎕ 이상의 상등액을 에펜도르프 튜브에 수집하여 -80℃에 저장하였다. 샘플들 및 대조구 샘플들을 해동시키고, 200㎕의 pH6.0의 50mM 칼륨-인산염 완충액을 에펜도르프 튜브 중의 각 200㎕ 샘플에 첨가하였다. 50㎕의 2M TCA (트리클로로아세트산)을 에펜도르프 튜브에 첨가하였다. 상기 튜브를 와동시키고, 13.000g, 4℃ 에서 10 분 동안 원심분리하였다. 측정을 위하여 에펜도르프 튜브로부터 150㎕를 제거하였다.
HPLC 측정을 위한 컬럼 준비
HPLC 컬럼을 본 기술분야에서 알려진 것과 같이 준비하고, 5% 아세토니트릴 중-40mM 나트륨-시트레이트 pH5 구성된 이동상을 이용하여 평형화시켰다. 150㎕ 샘플 중 상기 기재된 샘플 .50㎕을 컬럼에 주입하였다 (C18 역상). 유속 700㎕/분의 등용매에 의해 분리시켰다. L-키누레닌의 광도계 검출은 365nm에서 일어났으며, L-트립토판의 경우 280nm에서 일어났다.
결과
도 18에 나타낸 바와 같이, 5000세포들/cm2로 도말되고 3ng/ml IFN-γ 로 120 시간에 이르는 시간 동안 자극된 ASCs은 IDO를 생산하며, 그의 활성은 트립토판 대사 및 HPLC를 이용한 키누레닌 생산에 의해 측정하였다. 5000세포들/cm2 로 도말되고 120 시간에 이르는 시간 동안 3pg/ml IFN-γ로 자극된 ASCs 들은 IDO를 생산하지 않았다. 키누레닌은 검출되지 않았다 (도 19). 유사하게, 500세포들/cm2 로 도말되고 120 시간에 이르는 시간 동안 3ng/ml IFN-γ로 자극된 ASCs 는 현저한 양의 IDO를 생성하지 않았다 (도 20).
실시예 10
대식구 소분자들에 대한 ASCs 의 능력:
재료 및 방법
4kda-덱스트란-FITC (Sigma)를 실시예 1 의 세포들에 24 시간 동안 배양 중에 첨가하였다. 세포들을 세척하고 형광 FITC의 혼입에 대해 분석하였다.
결과
도 21A는 세척된 세포 개체군의 세포들의 명 시야상 (birght field image)을 나타낸다. 도 21B는 본 기술 분야에서 알려진 녹색 형광 단백질 필터를 사용한 형광 현미경을 사용한 동일한 개체군을 나타낸다. 도 21B에서 볼 수 있는 형광 마커의 흡수는 세포들이 작은 중량의 분자들을 대식할 수 있음을 보여주며, 이는 이들 세포들이, IFN-γ를 이용한 세포들의 추가적인 처리에 의해 유도된 HLA 클래스 II 를 통한 항원-제시가 가능하다는 것을 나타낸다.

Claims (89)

  1. 지방 조직으로부터 분리된 세포 개체군 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 염증성 장 질환 (IBD) 또는 류마티스 관절염 (RA)으로부터 선택되는 염증성 장애에 따른 염증을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 약학 조성물로서, 상기 세포 개체군이:
    (a) 항원-제시 세포들 (APC)에 특이적인 마커들인 CD11b, CD11c, CD14, CD45, 및 HLAII 를 발현하지 않고;
    (b) 인돌아민 2,3-디옥시게나아제 (IDO)를 구성적으로(constitutively) 발현하지 않으며;
    (c) 인터페론-감마 (IFN-γ)로 자극시 IDO를 발현하고; 및
    (d) 적어도 두개의 세포계통들로 분화되는 능력을 나타내며, 여기서 세포계통들은 골세포, 지방세포, 연골세포, 건세포 (tenocytes), 근세포 (myocytes), 심근세포, 조혈-지지 간질 세포, 내피세포, 뉴런, 성상세포 (astrocytes), 및 간세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 분리된 세포 개체군은 종양형성 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 분리된 세포 개체군은 다음의 세포 표면 마커들: CD11b, CD11c, CD14, CD31, CD34, CD45, CD133 및 HLAⅡ 에 대하여 음성인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 분리된 세포 개체군은 다음의 세포 표면 마커들: CD44, CD54, CD90 및 CD105 의 적어도 하나에 대하여 양성인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 분리된 세포 개체군은 생체 외에서 확대되어질 수 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 분리된 세포 개체군은 인간 기원에서 온 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 분리된 세포 개체군은 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드를 발현하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 삭제
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