KR102213527B1 - 패혈증 치료용 중간엽 기질세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피실험자에서 패혈증의 치료를 위한 중간엽 기질세포(MSC)의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 패혈증의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법을 제공한다.

Description

패혈증 치료용 중간엽 기질세포{MESENCHYMAL STROMAL CELLS FOR TREATING SEPSIS}

본 발명은 패혈증의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법에 관한 것이다.

전신성 염증 반응 증후군(SIRS)은 특별한 감염원이 없는 전신의 염증 상태이다. 상기는 다수의 인자들, 예를 들어 비제한적으로 외상, 수술, 부신 기능부전, 폐 색전증, 심근 경색, 출혈, 아나필락시스, 약물 과다복용, 면역결핍 및 화상에 의해 야기될 수 있다. 하기에 나열되는 바와 같은, SIRS의 4개의 주요 진단학적 증상들이 존재하지만, 이 중 임의의 2개의 존재면 진단에 충분하다(예를 들어 문헌[Nystrom (1998) Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 41, Suppl. A, 1-7]을 참조하시오).

i) 분당 90 박동 초과의 심박수;

ii) 36 ℃ 미만 또는 38 ℃ 초과의 체온;

iii) 분당 20 호흡 초과의 호흡수(빈호흡); 및

vi) 4000 세포/㎣ 미만 또는 12000 세포/㎣ 초과의 백혈구수, 또는 10% 초과의 미성숙 호중구의 존재.

SIRS는 급성기 면역원성 단백질의 광범위한 활성화를 야기하며, 이는 보체 시스템 및 응고 경로에 영향을 미치고, 차례로 혈관뿐만 아니라 내부 기관에 손상을 야기한다. 다양한 신경내분비 역-조절 시스템들이 후속적으로 활성화되며, 이는 종종 상기 문제를 더욱 심하게 한다.

패혈증은 SIRS의 특수 형태이며, 중환자실 사망의 가장 흔한 원인이다. 상기는 의심되거나 검출된 감염에 의해 야기된다. 상기는 내인성 염증전 사이토킨의 활동항진 및 불균형 네트워크를 특징으로 하며, 종종 광범위한 염증 및 혈액 응고를 유도하여, 발적, 발열, 종창, 통증, 기관 기능장애 또는 기관 부전을 생성시킬 수 있다. 패혈증 동안의 혈액 응고는 또한 사지 및 생명중추기관으로의 혈류를 감소시킬 수 있으며, 기관 부전 또는 괴저의 개시에 이르게 할 수 있다.

SIRS처럼, 패혈증은 종종 신체 전체를 통해 존재하는 급성 염증을 생성시키며, 따라서 흔히 발열 및 백혈구증가증(상승된 백혈구수)과 관련된다. 현재 패혈증 이면의 이론은 상기 감염에 대한 숙주의 면역 반응이 SIRS를 촉발하고, 이는 차례로 상술한 증상들을 제공한다는 것이다. 감염 및 패혈증에 이어서, 조직 관류 및 산소 전달이 감소되어 패혈성 쇼크에 이르게 될 수 있다. 패혈성 쇼크로 진단되기 위해서는 상기 환자에서 감염 및 난치성 저혈압의 증거가 있어야 한다.

SIRS, 패혈증 및 패혈성 쇼크는 중증의 의학적 상태들이다. 즉각적이고 공격적인 치료에도 불구하고, 이들 질병은 다발성 기관 기능장애 증후군으로 진행하기 쉬우며 심지어 사망에 이를 수도 있다.

지금까지의 대부분의 치료 전략들은 염증-전 매개인자들을 표적화하였으나, 이들 전략은 대규모 다-기관 임상 시험에서 연구되었을 때 환자들의 생존을 개선시키지 않는 것으로 밝혀졌다. 하나의 단일 사이토킨, 예를 들어 TNFα 및 IL-1β를 차단하도록 고안된 치료법들은 아마도 이들 염증성 사이토킨의 조기 및 일시적인 동역학으로 인해 제한된 효능을 나타내었다. 최근에, 국제적인 중환자관리 및 감염질병 전문가들이 SIRS, 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 앓고 있는 환자들에게 제공된 치료를 개선시키기 위한 관리 지침을 개발하였다. 이들 지침은 복잡한 진단 및 치료 판정을 간단한 "업무에 필수적인(mission critical)" 임무로 전환시키는 것을 목표로 하며, 다른 치료 중에서도, 광범위 항생제, 스테로이드 및 드로트레코긴 알파(활성화된)의 투여를 제시한다.

그러나, 패혈증과 관련된 사망률은 30% 내지 50%로 여전한 반면, 패혈성 쇼크에 대한 사망률은 훨씬 더 높은, 50% 내지 60%인 것으로 보고되고 있다. 매년 대략 750,000건의 새로운 패혈증 사례가 보고되고 있으며, 이중 적어도 210,000건은 사망에 이른다. 의학적 치료가 보다 공격적으로 됨에 따라, SIRS, 패혈증 및 패혈성 쇼크의 발생도 증가하는 듯하며, 결과적으로 이들 상태에 대한 새로운 신뢰할만한 치료가 요구된다.

중간엽 기질세포(MSC), 특히 인간 지방조직 유래된 기질세포(hASC)의 투여가 SIRS, 패혈증, 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크의 치료에 유용한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, MSC, 특히 hASC는 폐렴 관련된 패혈증에서 사망을 방지하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 MSC가 SIRS, 패혈증 및 패혈성 쇼크의 치료에 유용할 수 있다는 증거를 제공한다. MSC는, 다양한 염증성 사이토킨 및 케모킨의 전신 수준의 감소 및 다양한 표적 기관내로의 백혈구 침투의 억제에 의해 여러 수준으로 SIRS, 패혈증, 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크의 중요한 태양들을 조절하는 기능을 하는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 하나의 태양에서, 본 발명은 폐렴이 있거나 폐렴 이후의 피실험자에서 패혈증의 치료에 사용하기 위한, 예를 들어 폐렴이 있거나 폐렴 이후의 피실험자에서 패혈증의 치료 방법에 사용하기 위한 중간엽 기질세포(MSC)를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 폐렴이 있거나 폐렴 이후의 패혈증 피실험자를 치료하기 위한 약제의 제조에서 중간엽 기질세포(MSC)의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 폐렴이 있거나 폐렴 이후의 피실험자에게 중간엽 기질세포(MSC)를 투여함을 포함하는, 상기 피실험자에서 패혈증을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 및 다른 태양들을 하기에 보다 상세히 기재한다.

도 1 내지 4는 감염후 48시간째에 다양한 조직 중의 세균 크기이다. A 및 B는 2개의 독립적인 실험으로부터의 결과를 나타낸다. PLACEBO = 링거의 락테이트에 의한 처리; ASC = ASC에 의한 처리; CFU = 콜로니 형성 단위. 도 1: 혈액; 도 2: 폐 균질물; 도 3: 간 균질물; 및 도 4: 비장 균질물.
도 5 내지 8은 감염후 48시간째에 폐 균질물 중의 사이토킨 및 케모킨 수준이다. A 및 B는 2개의 독립적인 실험으로부터의 결과를 나타낸다. PLACEBO = 링거의 락테이트에 의한 처리; ASC = ASC에 의한 처리. 도 5: TNFα; 도 6: IL1β; 도 7: IL6; 및 도 8: Mip-2.
도 9 내지 12는 감염후 다양한 조직 중의 세균 크기이다. PLACEBO = 링거의 락테이트에 의한 처리; ASC = ASC에 의한 처리; CFU = 콜로니 형성 단위. 도 9: 혈액; 도 10: 폐 균질물; 도 11: 간 균질물; 및 도 12: 비장 균질물.

정의

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 하기의 용어 및 어구들은 하기에 제시된 의미들을 가질 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 과학기술 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

관사 "하나"는 상기 관사의 하나 또는 하나 초과(즉 하나 이상)의 문법적 목적어를 지칭한다. 예로서, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.

"약"이란 용어는 값과 관련하여 사용되는 경우 상기 값±10%에 관한 것이다.

"지방조직"은 임의의 지방조직을 의미한다. 지방조직은 예를 들어 피하, 복막/내장, 유방, 생식선, 또는 다른 지방조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 지방조직일 수 있다. 바람직하게, 상기 지방조직은 피하 백색 지방조직이다. 상기 지방조직은 1차 세포 배양물 또는 불멸화된 세포주를 포함할 수 있다. 상기 지방조직은 지방조직을 갖는 임의의 유기체로부터의 것일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 지방조직은 포유동물이며, 추가의 실시태양에서 상기 지방조직은 인간이다. 지방조직의 편리한 공급원은 지방흡입술이다. 그러나, 상기 지방조직의 공급원이나 지방조직의 단리 방법은 본 발명에 중요하지 않음을 알 것이다. 본 명세서에 기재된 세포를 피실험자에게 자가이식하고자 하는 경우, 상기 지방조직을 상기 피실험자로부터 단리할 것이다.

"지방조직-유래된 기질세포(ASC)"는 지방조직으로부터, 일반적으로 인간 지방조직(hASC)으로부터 기원하는 MSC를 지칭한다.

"생물학적 의약 생성물"이란 용어는, 전형적으로 천연(조작되지 않은) 생물 공급원으로부터 직접적인 추출 이외의 수단에 의해 생성되는, 치료학적 용도를 위한 단백질 또는 핵산-기재 약학 물질을 의미하는 것으로 간주될 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "세포/㎏"이란 용어는 환자의 체중 킬로그램당 투여되는 세포(예를 들어 MSC)의 수를 의미하는 것으로 간주될 것이다.

"구성적으로"란 용어는 임의의 특이적인 유도 부재하의 유전자의 발현을 의미하는 것으로 이해된다.

"배양"이란 용어는 배지에서의 세포, 유기체, 다세포 존재 또는 조직의 생육을 지칭한다. "배양하는"이란 용어는 상기와 같은 생육을 성취하는 임의의 방법을 지칭하며, 다수의 단계들을 포함할 수 있다. "추가로 배양하는"이란 용어는 세포, 유기체, 다세포 존재 또는 조직을 일정한 생육 단계로 배양하고, 이어서 또 다른 배양 방법을 사용하여 상기 세포, 유기체, 다세포 존재 또는 조직을 또 다른 생육 단계로 가져감을 지칭한다. "세포 배양"은 시험관내 세포의 생육을 지칭한다. 상기와 같은 배양에서, 세포는 증식하지만, 조직 자체로 기관화하지는 않는다. "조직 배양"은 구조 및 기능을 보존하기 위한 시험관내에서의 조직, 예를 들어 원시 기관 또는 성체 기관의 외식체의 유지 또는 생육을 지칭한다. "단층 배양"은 세포가 적합한 배지 중에서 주로 서로 및 기판에 부착되어 있으면서 번식하는 배양을 지칭한다. 더욱 또한, "현탁 배양"은 세포가 적합한 배지 중에 현탁되어 있으면서 번식하는 배양을 지칭한다. 마찬가지로, "연속적인 유동 배양"은 세포 생육, 예를 들어 생육성을 유지시키기 위해서 새로운 배지의 연속적인 유동 하에서의 세포 또는 외식체의 배양을 지칭한다. "순화 배지"란 용어는, 배지가 세포에 의해 생성되고 배양물내로 분비되는 몇몇 주변분비 및/또는 자가분비 인자를 포함하도록 변경시키기 위해 상기 배지를 일정 기간 상기 배양된 세포와 접촉시킨 후에 생성되는, 예를 들어 배양된 세포/조직이 없는 상등액을 지칭한다. "융합 배양"은 모든 세포가 접촉하고 따라서 배양 용기의 전체 표면을 덮는 세포 배양이며, 상기 세포가 또한 그의 최대 밀도에 도달했음을 암시하지만, 융합은 분열이 멈추거나 또는 집단의 크기가 증가하지 않음을 반드시 의미하는 것은 아니다.

상기 "배양 배지" 또는 "배지"란 용어는 당해 분야에 인지되어 있으며, 일반적으로 살아있는 세포의 배양을 위해 사용되는 임의의 물질 또는 제제를 지칭한다. 세포 배양에 관하여 사용되는 바와 같은 "배지"란 용어는 상기 세포를 둘러싸는 환경의 성분들을 포함한다. 배지는 고체, 액체, 기체상 또는 상들과 물질들의 혼합물일 수 있다. 배지는 액체 생육배지뿐만 아니라 세포 생육을 지속시키지 않는 액체 배지를 포함한다. 배지는 또한 젤라틴성 배지, 예를 들어 아가, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 기질을 포함한다. 예시적인 기체상 배지는 페트리 디쉬 또는 다른 고체 또는 반고체 지지체상에서 생육하는 세포가 노출되는 기체 상을 포함한다. "배지"라는 용어는 또한, 세포와 아직 접촉하지 않았다 하더라도, 세포 배양에 사용하고자 하는 물질을 지칭한다. 즉, 세균 배양을 위해 제조된 영영분 풍부 액체는 배지이다. 유사하게, 물 또는 다른 액체와 혼합시 세포 배양에 적합하게 되는 분말 혼합물을 "분말 배지"라 칭할 수 있다. "제한 배지"는 화학적으로 한정된(대개는 정제된) 성분으로 제조된 배지를 지칭한다. "제한 배지"는 불충분하게 특성화된 생물학적 추출물, 예를 들어 효모 추출물 및 비프 브로쓰는 함유하지 못한다. "풍부 배지"는 대부분의 또는 모든 생육 가능한 형태의 특정 종의 생육을 지지하도록 고안된 배지를 포함한다. 풍부 배지는 종종 복잡한 생물 추출물을 포함한다. "고밀도 배양의 생육에 적합한 배지"란 용어는 다른 조건(예를 들어 온도 및 산소 전달율)이 상기와 같은 생육을 허용하는 경우 세포 배양물이 3 이상의 OD600에 도달하게 하는 임의의 배지이다. "기본 배지"란 용어는 임의의 특별한 영양 보충물을 요구하지 않는 다수의 형태의 미생물의 생육을 촉진하는 배지를 지칭한다. 대부분의 기본 배지는 일반적으로 4개의 기본 화학 그룹들을 포함한다: 아미노산, 탄수화물, 무기염, 및 비타민. 기본 배지는 일반적으로 보다 복잡한 배지에 대한 토대로서 작용하며, 여기에 보충물, 예를 들어 혈청, 완충제, 생육인자, 지질 등이 첨가된다. 기본 배지의 예로는 비제한적으로 이글 기본 배지, 최소 필수 배지, 둘베코의 변형된 이글 배지, 배지 199, 영양분 혼합물 햄스(Ham's) F-10 및 햄스 F-12, 맥코어(McCoy)의 5A, 둘베코의 MEM/F-I 2, RPMI 1640 및 아이스코베(Iscove)의 변형된 둘베코의 배지(IMDM)가 있다.

"포함하다" 및 "포함하는"이란 용어는 총괄적인, 개방적 의미로 사용되며, 추가적인 요소가 포함될 수도 있음을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "확대된"이란 용어는 세포에 관하여 언급될 때 당해 분야에서 그의 통상적인 의미를 갖는 것으로, 즉 시험관내에서 증식된 세포로 간주될 것이다. MSC는 표준 배양 조건하에서 확대되어 상기 MSC의 적어도 하나의 생물학적 기능, 전형적으로 플라스틱 표면에 부착하는 능력을 유지하는 세포 집단을 제공할 수 있다. 상기 세포의 확대된 집단은 하나 이상의 세포 유형으로 분화하는 능력을 유지할 수 있다.

"포함하는"이란 용어는 본 명세서에서 "비제한적으로 포함하는"을 의미하는데 사용된다. "포함하는" 및 "비제한적으로 포함하는"은 호환적으로 사용된다.

"마커"는, 존재, 농도, 활성 또는 인산화 상태가 검출될 수 있고 세포의 표현형을 식별하는데 사용될 수 있는 생물 분자를 지칭한다.

"중간엽 기질세포(또한 본 명세서에서 "MSC"로서 지칭된다)는 다능성 기질세포이다, 즉 상기 세포는 다수의 상이한 유형의 세포를 생성시킬 수 있는 세포이다.

본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 "환자", "피실험자" 또는 "숙주"는 인간 또는 비-인간 동물을 의미할 수 있다.

"약학 조성물"이란 용어는 치료법에 사용하고자 하는 조성물을 지칭한다. 본 발명의 조성물은 SIRS, 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크 및 패혈성-유사 상태의 치료에 사용하고자 하는 약학 조성물이다. 본 발명의 조성물은 MSC 외에, 비-세포성 성분을 포함할 수 있다. 상기와 같은 비-세포성 성분의 예는 비제한적으로 세포 배양 배지를 포함하며, 상기 배지는 단백질, 아미노산, 핵산, 뉴클레오타이드, 조-효소, 산화방지제 및 금속 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

"약학적으로 허용 가능한"이란 어구는 본 명세서에서, 건전한 의학적 판단의 범위내에서 합리적인 이익/위험 비에 상응하는, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형을 지칭하는데 사용된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 어구는 신체의 한 기관 또는 부분으로부터 상기 신체의 또 다른 기관, 또는 부분으로 주 물질을 운반하거나 수송하는데 관련된 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다.

"표현형"이란 용어는 세포의 관찰 가능한 특징, 예를 들어 크기, 형태, 단백질 발현 등을 지칭한다.

"증식"은 세포수의 증가를 지칭한다. "증식하는" 및 "증식"은 유사분열을 겪는 세포를 지칭한다.

"난치성"은 질병의 치료에 사용될 때 현저한 임상적 이점이 없음, 예를 들어 질병의 증상 또는 후속적인 재발의 현저한 개선 또는 개량이 없음을 의미하는 것으로 간주될 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "용액"이란 용어는 본 발명에 사용되는 MSC가 여전히 생육성으로 남아있는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.

MSC 집단에 관하여 "실질적으로 순수한"이란 용어는 세포 수를 기준으로 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%가 MSC인 세포 집단을 지칭한다. 즉, MSC 집단에 관하여 "실질적으로 순수한"이란 용어는 계통 수임세포 수를 기준으로 약 20% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만을 함유하는 세포 집단을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "지지체"는 지방조직-유래된 기질 줄기세포의 생육을 위한 토대 또는 기질로서 작용할 수 있는 임의의 장치 또는 물질을 지칭한다.

"치료제" 또는 "치료학적"은 숙주에 대해 목적하는 생물학적 효과를 가질 수 있는 작용제를 지칭한다. 화학요법제 및 유전자독성물질은 각각 생물학적과 상반되게, 화학물질 기원인 것으로 일반적으로 공지된, 또는 특정한 작용 기전에 의해 치료 효과를 야기하는 치료제들의 예이다. 생물학적 기원의 치료제의 예는 성장인자, 호르몬 및 사이토킨을 포함한다. 다양한 치료제는 당해 분야에 공지되어 있으며 그의 효과에 의해 식별될 수 있다. 몇몇 치료제는 세포 증식 및 분화를 조절할 수 있다. 예로서 화학요법적 뉴클레오타이드, 약물, 호르몬, 비-특이성(비-항체) 단백질, 올리고뉴클레오타이드(예를 들어 표적 핵산 서열(예를 들어 mRNA 서열)에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드), 펩타이드 및 펩타이드유사물질을 포함한다.

상세한 설명

본 발명은 피실험자에서 패혈증을 치료하는데 사용하기 위한 중간엽 기질세포(MSC)를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가의 실시태양에서 본 발명은 또한 피실험자에서 패혈증의 치료를 위한 약제의 제조에서 중간엽 기질세포(MSC)의 용도를 제공한다. 또 다른 실시태양에서 본 발명은 또한 피실험자에게 중간엽 기질세포(MSC)를 투여함을 포함하는, 상기 피실험자에서 패혈증을 치료하는 방법을 제공한다. "피실험자"는 본 발명과 관련하여 전형적으로는 치료가 필요한 피실험자인 것으로 이해될 것이다. 상응하게 본 발명은 또한 폐렴이 있거나 폐렴 이후의 패혈증 치료가 필요한 피실험자에게 중간엽 기질세포(MSC)를 투여함을 포함하는, 상기 피실험자에서 패혈증을 치료하는 방법을 제공한다.

바람직하게 상기 패혈증은 염증성 폐 상태, 전형적으로 폐렴과 관련되거나, 상기에 의해 야기되거나 또는 상기에 후속이다. 하나의 실시태양에서, 상기 패혈증은 폐렴에 부차적이다. 바람직하게 상기 패혈증은 중증 패혈증이며 염증성 폐 상태, 전형적으로 폐렴과 관련되거나, 상기에 의해 야기되거나 또는 상기에 후속이다. 하나의 실시태양에서, 상기 패혈증은 폐렴에 부차적인 중증 패혈증이다. 상기 폐렴은 진균, 세균 또는 바이러스에 의해 야기될 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 폐렴은 세균, 예를 들어 그람-음성 세균에 의해 야기된다(그람-음성 폐렴). 상기 그람-음성 세균은 클렙시엘라(Klebsiella) 속, 예를 들어 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae) 종, 예를 들어 클렙시엘라 뉴모니아에 혈청형 2를 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서 상기 폐렴은 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia)에 의해 야기되고, 또 다른 실시태양에서 상기 폐렴은 하에모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumonia), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 또는 뉴모시스티스 지로베치(Pneumocystis jiroveci) 진균에 의해 야기될 수 있다. 상기 폐렴은 지역사회-획득, 건강관리-관련, 병원-획득 또는 환기-관련 폐렴일 수 있다. 상기 폐렴은 대엽성 폐렴, 기관지 폐렴 또는 급성 간질성 폐렴일 수 있다.

MSC는 특히 염증 부위에 면역-조절 효과를 부여하는 것으로 밝혀졌다. 외부에서 투여된 MSC는 전형적으로 폐에 정착하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, MSC는 염증성 폐 상태, 예를 들어 폐렴에 부차적인 패혈증의 치료에 특히 유효하다.

실시예는 ASC의 정맥내 투여가, 예를 들어 혈액 및 폐를 포함한 다양한 기관에서 세균 부하를 감소시키고, 상기 폐에서 사이토킨 및 케모킨 수준을 감소시킴으로써 폐렴-관련 패혈증의 중증도를 감소시킴을 나타낸다.

상응하게, 하나의 실시태양에서 본 발명은 인간 피실험자에서 폐렴-관련 패혈증의 치료 방법에 사용하기 위한 MSC, 예를 들어 ASC를 제공하며, 여기에서 예를 들어 정맥내 주사에 의한 MSC의 투여는 전신(예를 들어 혈액) 총 세균 부하(CFU/㎖)를, 치료되지 않은 피실험자의 전형적인 전신 총 세균 부하에 비해 통계학적 유의수준으로, 예를 들어 10 이상의 인자까지, 예를 들어 50 이상의 인자까지, 또는 100 이상의 인자까지 감소시킨다. 총 세균 부하를 당해 분야의 숙련가에게 주지된 방법, 예를 들어 반-정량적인 세균 배양 또는 정량적인 PCR에 의해 측정할 수 있다.

발명의 세포

MSC는 다른 세포로 분화하는 능력을 갖는 미분화 기질세포이고, 전형적으로는 결합 조직으로부터 유래되며, 따라서 비-조혈세포이다. "결합 조직"이란 용어는 중간엽으로부터 유래된 조직을 지칭하며, 그의 세포가 세포외 기질내에 포함됨을 특징으로 하는 다수의 조직들을 포함한다. 상이한 유형의 결합 조직들 중에는 지방 및 연골 조직이 포함된다. 하나의 실시태양에서, 상기 MSC는 지방 조직의 기질 분획으로부터 유래된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 MSC는 연골세포, 예를 들어 유리질 연골로부터 획득된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 MSC는 피부로부터 획득된다. 또한, 또 다른 실시태양에서, 상기 MSC는 골수로부터 획득된다. MSC의 또 다른 공급원은 비제한적으로 골막, 치수, 비장, 췌장, 인대, 힘줄, 골격근, 탯줄 및 태반을 포함한다.

상기 MSC를 임의의 적합한 공급원 및 인간을 포함한 임의의 적합한 동물로부터 획득할 수 있다. 전형적으로, 상기 세포를 산후 포유동물 결합 조직으로부터 획득한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 MSC를 결합 조직의 공급원, 예를 들어 지방 조직, 유리질 연골, 골수, 피부 등의 기질 분획으로부터 획득한다. 또한, 특정한 실시태양에서, 상기 MSC를 포유동물, 예를 들어 설치류, 영장류 등으로부터, 바람직하게는 인간으로부터 획득한다. 전형적으로, 상기 MSC를 인간 지방조직의 기질 분획으로부터 획득한다, 즉 상기는 지방조직-유래된 기질세포(ASC)이다.

상기 MSC는 표준 배양 조건하에서 플라스틱에 부착성이다.

MSC는 체세포, 예를 들어 중배엽 세포(예를 들어 지방, 연골세포, 조골세포)로 또는 상기를 향해 및 임의로 내배엽 및/또는 외배엽 세포 유형 또는 계통으로 또는 상기를 향해 분화하는 능력을 갖는 미분화된 다능성 세포이다. 전형적으로 상기 세포는 지방세포, 연골모세포 및 조골세포 계통으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 2개 또는 모든 세포 유형으로 또는 이들을 향해 분화하는 능력을 갖는다.

하나의 실시태양에서 상기 MSC는 줄기 세포, 전형적으로 지방 조직 유래된 줄기 세포일 수 있다. 전형적으로 상기 MSC는 (i) APC로부터 특이적인 마커를 발현하지 않고; (ii) IDO를 구성적으로 발현하지 않고 (iii) MHC II를 구성적으로 그다지 발현하지 않는다. 전형적으로 IDO 또는 MHC II의 발현은 IFN-γ에 의한 자극에 의해 유도될 수 있다.

전형적으로 상기 MSC는 마커 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상(예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상(예를 들어 13개 이하))을 발현할 수 있다. 예를 들어 상기 MSC는 마커 CD29, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상(예를 들어 2개, 3개 또는 전부), 예를 들어 CD59 및/또는 CD90을 발현할 수 있다.

전형적으로 상기 MSC는 마커 인자 VIII, 알파-액틴, 데스민, S-100, 케라틴, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 및 CD133 중 하나 이상(예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상(예를 들어 15개 이하))을 발현할 수 없다, 예를 들어 상기 MSC는 마커 CD34, CD45, CD31 및 CD14 중 하나 이상(예를 들어 2개, 3개 또는 전부), 예를 들어 CD31 및/또는 CD34를 발현하지 않는다.

확대된 MSC

하나의 실시태양에서 상기 MSC는 시험관내 배양 확대된 MSC 또는 그의 시험관내 배양 확대된 자손(상기 둘 모두 본 명세서에서 이후부터 확대된 MSC 또는 "eMSC"라 칭한다)이다. eMSC의 제조 방법은 예를 들어 WO2007039150에 기재된 바와 같이, 당해 분야에 공지되어 있다. eMSC는 MSC의 다수의 표현형 특징을 유지한다, 예를 들어 상기 eMSC는 표준 배양 조건하에서 플라스틱에 부착성이며 미분화된 표현형을 유지한다.

eMSC는 체세포, 예를 들어 중배엽 세포로 분화하는 능력을 갖는 미분화된 다능성 세포이다. MSC는 적어도 하나 이상의 특화된 세포 계통, 예를 들어 비제한적으로 지방세포, 연골모세포 및 조골세포 계통을 향해 분화하는 능력을 갖는 반면, 전형적으로 eMSC에서는 상기 분화하는 능력이 감소되거나 또는 심지어 존재하지 않을 수도 있다, 예를 들어 MSC는 적어도 골원성 및 지방세포 계통을 향해 분화할 수 있는 반면, 상기로부터 유래된 eMSC는 오직 지방세포 계통을 향해서만 분화할 수 있다. 이는 상기 세포의 치료학적 용도에 유리할 수 있으며, 이때 상기 세포는 eMSC의 예상되지 않는 잠재적으로 유해한 분화가 덜 발생할 듯한 것으로 합당하게 예상될 수 있기 때문에 환자에게 투여될 수 있다.

하나의 실시태양에서 상기 eMSC는 줄기 세포의 자손일 수 있다. 전형적으로 상기 eMSC는 (i) APC로부터 특이적인 마커를 발현하지 않고; (ii) IDO를 구성적으로 발현하지 않고 (iii) MHC II를 구성적으로 그다지 발현하지 않는다. 전형적으로 IDO 또는 MHC II의 발현은 IFN-γ에 의한 자극에 의해 유도될 수 있다.

전형적으로 상기 eMSC는 마커 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상(예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상(예를 들어 13개 이하))을 발현할 수 있다, 예를 들어 상기 MSC는 마커 CD29, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상(예를 들어 2개, 3개 또는 전부), 예를 들어 CD59 및/또는 CD90을 발현할 수 있다.

전형적으로 상기 eMSC는 마커 인자 VIII, 알파-액틴, 데스민, S-100, 케라틴, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 및 CD133 중 하나 이상(예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상(예를 들어 15개 이하))을 발현할 수 없다, 예를 들어 상기 MSC는 마커 CD34, CD45, CD31 및 CD14 중 하나 이상(예를 들어 2개, 3개 또는 전부), 예를 들어 CD31 및/또는 CD34를 발현하지 않는다. 더욱 또한, 상기 MSC는 마커 STRO-1을 임의로 발현하지 않을 수도 있다.

세포 집단

하나의 태양에서 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료학적 용도를 위한 MSC 및/또는 eMSC의 집단을 제공하며, 이들 집단을 본 명세서에서 이후부터 "본 발명의 세포 집단"이라 칭할 수 있다. 전형적으로, 상기 MSC는 확대된 인간 ASC, 전형적으로 동종이계 확대된 인간 ASC이다. 전형적으로 본 발명의 세포 집단은 MSC 및/또는 eMSC의 균일한 또는 실질적으로 균일한 집단이다. 본 발명의 세포 집단은 MSC 및/또는 eMSC를 포함하거나 또는 필수적으로 포함하나, 본 발명의 세포 집단은 또한 다른 세포유형들을 또한 포함할 수 있다. 상응하게 하나의 실시태양에서 본 발명은 세포의 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%가 MSC 및/또는 eMSC인 본 발명의 세포 집단을 제공한다.

전형적으로 본 발명의 세포 집단은 eMSC를 포함하거나 또는 필수적으로 포함하는 MSC의 배양 확대된 집단이나, 본 발명의 세포 집단은 또한 다른 세포 유형을 포함할 수도 있다. 상응하게 하나의 실시태양에서 본 발명은 세포의 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%가 eMSC인 본 발명의 세포 집단을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 eMSC는 eASC, 예를 들어 인간 eASC이다. 특정한 실시태양에서, 상기 세포는 치료되는 피실험자에 대해서 동종이계이다.

전형적으로 본 발명의 세포 집단은 적어도 하나 이상의 특화된 세포 계통, 예를 들어 비제한적으로 지방세포, 연골모세포 및 조골세포 계통을 향해 분화하는 능력을 가질 수 있다. 하나의 실시태양에서 본 발명의 세포 집단은 지방세포, 연골모세포 및 조골세포 계통으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 적어도 2개 또는 모든 세포 유형으로 또는 이들을 향해 분화하는 능력을 가질 수 있다. 그러나, 또 다른 실시태양에서 상기 분화하는 능력은 감소되거나 또는 심지어 존재하지 않을 수도 있다, 예를 들어 MSC는 적어도 골원성 및 지방세포 계통을 향해 분화할 수 있는 반면, 상기로부터 유래된 eMSC는 오직 지방세포 계통을 향해서만 분화할 수 있다. 이는 상기 세포의 치료학적 용도에 유리할 수 있으며, 이때 상기 세포는 eMSC의 예상되지 않는 잠재적으로 유해한 분화가 덜 발생할 듯한 것으로 합당하게 예상될 수 있기 때문에 환자에게 투여될 수 있다.

전형적으로 본 발명의 세포 집단은 마커 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상(예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상(예를 들어 13개 이하))을 발현할 수 있다, 예를 들어 상기 MSC는 마커 CD29, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상(예를 들어 2개, 3개 또는 전부), 예를 들어 CD59 및/또는 CD90을 발현할 수 있다. 상응하게, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 세포의 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%가 마커 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상(예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상(예를 들어 13개 이하))을 발현하는 본 발명의 세포 집단을 제공한다, 에를 들어 상기 MSC는 마커 CD29, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상(예를 들어 2개, 3개 또는 전부), 예를 들어 CD59 및/또는 CD90을 발현할 수 있다. 또 다른 실시태양에서 본 발명은 마커 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상(예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상(예를 들어 13개 이하))의 발현 수준이 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%인 본 발명의 세포 집단을 제공한다, 예를 들어 본 발명의 세포 집단은 마커 CD29, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상(예를 들어 2개, 3개 또는 전부), 예를 들어 CD59 및/또는 CD90을 상기 언급한 수준에서 발현할 수 있다.

전형적으로 본 발명의 세포 집단은 마커 인자 VIII, 알파-액틴, 데스민, S-100, 케라틴, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 및 CD133 중 하나 이상(예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상(예를 들어 15개 이하))을 발현할 수 없다, 예를 들어 상기 MSC는 마커 CD34; CD45; CD31; CD14 중 하나 이상(예를 들어 2개, 3개 또는 전부), 예를 들어 CD31 및/또는 CD34를 발현하지 않는다. 더욱 또한, 상기 MSC는 마커 STRO-1을 임의로 발현하지 않을 수도 있다.

상응하게 하나의 실시태양에서 본 발명은 세포의 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%가 마커 인자 VIII, 알파-액틴, 데스민, S-100, 케라틴, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 및 CD133 중 하나 이상(예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상(예를 들어 15개 이하))을 발현하지 않는 본 발명의 세포 집단을 제공한다, 예를 들어 상기 MSC는 마커 CD34, CD45, CD31 및 CD14 중 하나 이상(예를 들어 2개, 3개 또는 전부), 예를 들어 CD31 및/또는 CD34를 발현할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 마커 인자 VIII, 알파-액틴, 데스민, S-100, 케라틴, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 및 CD133 중 하나 이상(예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상(예를 들어 15개 이하))의 발현 수준이 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 5%, 적어도 약 1% 이하인 본 발명의 세포 집단을 제공한다, 예를 들어 본 발명의 세포 집단은 마커 CD34, CD45, CD31 및 CD14 중 하나 이상(예를 들어 2개, 3개 또는 전부), 예를 들어 CD31 및/또는 CD34를 상기 언급한 수준으로 발현할 수 있다.

일부 실시태양에서 MSC 또는 eMSC를, 그들의 증식 능력, 이동 능력, 생존 능력, 치료 효과 및 면역조절 성질 중 하나 이상을 증대시키기 위해서 예비-자극한다. 전형적으로 본 발명의 세포 집단의 적어도 약 40%(예를 들어 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%)를 그들의 증식 능력, 이동 능력, 생존 능력, 치료 효과 및 면역조절 성질 중 하나 이상을 증대시키기 위해서 예비-자극한다. 일부 실시태양에서, 예비-자극을, 상기 MSC를 사이토킨과 접촉시킴으로써 성취할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 예비-자극을, 상기 MSC를 IFN-γ와 접촉시킴으로써 성취할 수 있다.

발명의 조성물

하나의 실시태양에서 본 발명은 본 발명에 따른 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학 조성물이 바람직하다. 본 발명의 조성물은 MSC 또는 eMSC의 실질적으로 순수한 집단, 예를 들어 ASC 또는 eASC, 예를 들어 eASC의 실질적으로 순수한 집단을 포함할 수 있다. 상기 MSC, eMSC, ASC 또는 eASC는 줄기세포일 수 있다. 본 발명의 조성물은 세포 배양 성분, 예를 들어 아미노산, 금속 및 조효소 인자 중 하나 이상을 포함하는 배양 배지를 또한 포함할 수 있다. 상기 조성물은 다른 기질 세포의 소집단을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 또한 특정 환경하에서 상기 MSC의 생육 및 생존, 예를 들어 이식, 연속 배양에서의 생육, 또는 생물물질 또는 조성물로서의 용도를 지지할 수 있는 다른 비-세포 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물 중의 상기 MSC 및/또는 eMSC의 농도는 적어도 약 1 x 10⁴ 세포/㎖, 적어도 약 1 x 10⁵ 세포/㎖, 적어도 약 1 x 10⁶ 세포/㎖, 적어도 약 10 x 10⁶ 세포/㎖, 또는 적어도 약 40 x 10⁶ 세포/㎖일 수 있다. 전형적으로 상기 농도는 약 1 x 10⁶ 세포/㎖ 내지 1 x 10⁷ 세포/㎖, 예를 들어 약 5 x 10⁶ 세포/㎖ 내지 1 x 10⁷ 세포/㎖일 수 있다.

본 발명의 조성물은 일반적으로 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 포함할 것이다. 상기와 같은 담체 및 희석제의 예는 당해 분야에 주지되어 있으며, 당, 예를 들어 락토오스, 글루코스 및 슈크로스; 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말화된 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제, 예를 들어 코코아 버터 및 좌약 왁스; 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 잇꽃유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예를 들어 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예를 들어 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; 알긴산; 무-발열원 수; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알콜; pH 완충된 용액; 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 다중무수물; 및 약학 제형에 사용되는 다른 무독성 상용성 물질을 포함할 수 있다. 전형적으로 본 발명의 조성물은 담체로서 DMEM을 포함하며, 상기는 약 5% 이하, 약 10% 이하, 약 15% 이하, 약 20% 이하, 약 25% 이하, 약 30% 이하의 농도로 혈청(예를 들어 HSA)이 임의로 보충될 수 있다.

본 발명의 조성물은 멸균성, 및/또는 용이한 주사성이 존재하는 정도로 유동성일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 제조 및 보관 조건하에서 안정성이고 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대해서, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살의 사용을 통해 보존될 수 있다.

제조 방법

본 발명의 eMSC 및 세포 집단 및 본 발명의 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공하기 위한 MSC의 단리 및 배양 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 전형적으로 세포 집단을 포함하는 조성물의 제조 방법은 하기의 단계들을 포함한다:

(i) 조직으로부터의 MSC의 단리 및 적합한 표면, 예를 들어 플라스틱에 대한 부착에 의한 선택

(ii) eMSC를 포함하는 본 발명의 세포 집단을 제공하기 위한 MSC의 확대.

임의로 본 발명의 세포 집단을 상기 확대 단계 (ii) 동안 및/또는 상기 단계에 후속으로 저온보존할 수 있다. 임의로 본 발명의 세포 집단의 표현형을 상기 확대 단계 (ii) 동안 및/또는 상기 단계에 후속으로 평가할 수 있다. 임의로 본 발명의 세포 집단을 상기 확대 단계 (ii)에 후속으로 단리하고 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제에 재현탁시킬 수 있다.

본 발명에 사용하기 위한 MSC를 임의의 적합한 조직, 예를 들어 비제한적으로 말초혈액, 골수, 태반, 지방조직, 골막, 치수, 비장, 췌장, 인대, 피부, 힘줄, 골격근, 탯줄 및 태반으로부터 단리할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 MSC를 결합조직의 공급원, 예를 들어 지방조직의 기질 분획, 유리질 연골, 골수, 피부 등으로부터 획득한다.

하나의 실시태양에서, 상기 MSC를 지방조직의 기질 분획으로부터 획득한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 MSC를 연골세포로부터, 예를 들어 유리질 연골로부터 획득한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 MSC를 피부로부터 획득한다. 또한, 또 다른 실시태양에서, 상기 MSC를 골수로부터 획득한다.

상기 MSC를 임의의 적합한 공급원으로부터 및 인간을 포함한 임의의 적합한 동물로부터 획득할 수 있다.

전형적으로, 상기 세포를 산후 포유동물 결합조직으로부터 획득한다.

상기 MSC를 또한 피실험자와 동일하거나 상이한 종의 임의의 유기체로부터 단리할 수 있다. MSC를 갖는 임의의 유기체는 잠재적인 후보일 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 유기체는 포유동물일 수 있으며, 또 다른 실시태양에서 상기 유기체는 인간이다.

지방-유래된 MSC를 당해 분야의 임의의 표준 수단에 의해 획득할 수 있다. 전형적으로 상기 세포를 공급원 조직(예를 들어 지방흡입물 또는 지방조직)으로부터, 전형적으로는 상기 조직을 절단 효소, 예를 들어 콜라게나제로 처리함으로써 해리시켜 획득한다. 이어서 상기 절단된 조직 물질을 전형적으로는 약 20 마이크론 내지 1 ㎜의 필터를 통해 여과한다. 이어서 상기 세포를 단리하고(전형적으로는 원심분리에 의해) 부착성 표면(전형적으로 조직 배양 플레이트 또는 플라스크)상에서 배양한다. 상기와 같은 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국특허 제 6777231 호에 개시된 바와 같다. 상기 방법에 따라, 지방흡입물을 지방조직 및 상기로부터 유래된 세포로부터 획득한다. 상기 방법의 과정에서, 상기 세포를 바람직하게는 PBS로 세척하여 오염 찌꺼기 및 적혈구를 제거할 수 있다. 상기 세포를 PBS 중의 콜라게나제로 절단한다(예를 들어 37 ℃에서 30분, 0.075% 콜라게나제; I형, 인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재). 남아있는 적혈구를 제거하기 위해서, 상기 절단된 샘플을 세척하고(예를 들어 10% 소 태아 혈청), 160 mmol/L ClNH4로 처리하고, 최종적으로 DMEM 완전 배지(10% FBS, 2 mmol/L 글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM)에 현탁할 수 있다. 상기 세포를 40-㎛ 나일론 망을 통해 여과할 수 있다.

상기 세포를, MSC의 부착에 적합한 표면을 포함하는 적합한 조직 배양 용기, 예를 들어 플라스틱에서 배양한다. 비-부착성 세포를, 예를 들어 적합한 완충제 중에서 세척에 의해 제거하여 부착성 기질 세포(예를 들어 MSC)의 단리된 집단을 제공한다. 이러한 방식으로 단리된 세포를 조직 배양 플라스크상에 시딩하고(바람직하게는 2 내지 3 x 10⁴ 세포/㎠), 상기 배양 배지를 3 내지 4일마다 교환하면서 37 ℃ 및 5% CO₂에서 확대시킬 수 있다. 세포를 바람직하게는, 배양물이 90%의 세포밀집도에 도달할 때 새로운 배양 플라스크(1,000 세포/㎠)로 옮긴다.

세포 단리를 바람직하게는 멸균 또는 GMP 조건하에서 수행한다.

몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 적어도 약 15일, 적어도 약 20일, 적어도 약 25일, 또는 적어도 약 30일 동안 배양할 수 있다. 전형적으로, 배양시 세포의 확대는 상기 세포 집단에서 세포 표현형의 동종성을 개선시키며, 따라서 실질적으로 순수하거나 균일한 집단이 획득된다.

세포를 바람직하게는 배양물이 약 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 세포밀집도에 도달할 때 상기 부착성 표면으로부터 탈착시키고(예를 들어 트립신에 의해) 새로운 배양 용기로 옮긴다(계대배양).

몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 적어도 3회의 배양 계대수 동안 번식시키거나 또는 "적어도 3회 계대배양한다". 다른 실시태양에서, 상기 세포를 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 또는 적어도 10회 계대배양한다.

몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 적어도 3배의 집단 배가를 위해 배양시 확대시킨다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15배 집단 배가를 위해 배양시 확대시킨다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 7, 8, 9, 10 또는 15배 미만의 집단 배가를 위해 배양시 확대시킨다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 5 내지 10배 집단 배가를 위해 배양시 확대시킨다.

세포를 기질 줄기세포의 배양에 대해서 당해 분야에 공지된 임의의 기법에 의해 배양할 수 있다. 다양한 배양 기법뿐만 아니라 그들의 확대에 대한 논의를 문헌[Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition, Wiley-Liss 2000]에서 찾을 수 있다. 세포를 대규모 확대에 적합한 배양 플라스크 또는 생물반응기를 사용하여 확대시킬 수 있다. 중간엽 기질세포의 대규모 확대에 적합한 생물반응기를 상업적으로 입수할 수 있으며 상기는 2D(즉 실질적으로 평면) 및 3D 확대 생물반응기 모두를 포함한다. 상기와 같은 생물반응기의 예는 비제한적으로 플러그 플로우 생물반응기, 관류 생물반응기, 연속 교반식 탱크 생물반응기, 정지-상 생물반응기를 포함한다.

몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 단층 배양에 의해 배양한다. 조직 배양시 MCS를 지지할 수 있는 임의의 배지를 사용할 수 있다. MSC의 생육을 지지하는 배지 제형은 비제한적으로 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 알파 변형된 최소 필수 배지(αMEM), 및 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute) 배지 1640(RPMI 배지 1640)을 포함한다. 전형적으로 0 내지 20% 소 태아 혈청(FBS)을 기질 세포의 생육을 지지하기 위해 상기 배지에 가할 것이다. 그러나, 기질 세포 및 연골세포에 필요한 FBS 중의 생육인자, 사이토킨 및 호르몬이 확인되고 상기 생육배지 중에 적합한 농도로 제공되는 경우 제한 배지를 사용할 수 있었다. 본 발명의 방법에 유용한 배지는 하나 이상의 관심 화합물, 예를 들어 비제한적으로 기질세포용 항생제, 분열촉진 또는 분화 화합물을 함유할 수 있다. 본 발명의 세포를 가습 배양기에서 31 ℃ 내지 37 ℃의 온도에서 생육시킬 수 있다. 이산화 탄소 함량을 2% 내지 10%로 유지시킬 수 있으며 산소 함량은 1% 내지 22%로 유지시킬 수 있다.

상기 배지에 첨가될 수 있는 항생제는 비제한적으로 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함한다. 상기 화학적으로 제한된 배양 배지 중의 페니실린의 농도는 약 10 내지 약 200 단위/㎖일 수 있다. 상기 화학적으로 제한된 배양 배지 중의 스트렙토마이신의 농도는 약 10 내지 약 200 ug/㎖일 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 방법에 사용되는 바와 같은 상기 MSC는 확대된 세포 집단이며, 바람직하게 상기 세포를 확대시켜 실질적으로 순수하거나 균일한 집단을 제공한다.

하나의 실시태양에서 상기 세포 집단을, 마커 CD34의 발현이 새로 단리된, 확대되지 않은 세포에 비해 감소될 때까지 확대시킨다. 예를 들어 상기 세포 집단을 상기 마커 CD34의 발현이 상기 집단에서 세포의 50% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 또는 5% 미만, 예를 들어 35 내지 5% 또는 20 내지 10%의 수준으로 감소할 때까지 확대시킨다. 전형적으로, 상기 세포 집단을 상기 마커 CD34의 발현이 상기 집단에서 세포의 5% 미만의 수준으로 감소할 때까지 확대시킨다. 따라서, 본 발명의 eMSC의 집단은 50% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 또는 5% 미만, 예를 들어 35 내지 5% 또는 20 내지 10%의 CD34 발현 세포를 포함한다.

하나의 실시태양에서 상기 세포 집단을, 마커 STRO-1의 발현이 새로 단리된, 확대되지 않은 세포에 비해 감소될 때까지 확대시킨다. 예를 들어 상기 세포 집단을 상기 마커 STRO-1의 발현이 상기 집단에서 세포의 50% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 또는 5% 미만, 예를 들어 35 내지 5% 또는 20 내지 10%의 수준으로 감소할 때까지 확대시킨다. 전형적으로, 상기 세포 집단을 상기 마커 STRO-1의 발현이 상기 집단에서 세포의 5% 미만의 수준으로 감소할 때까지 확대시킨다. 따라서, 본 발명의 eMSC의 집단은 50% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 또는 5% 미만, 예를 들어 35 내지 5% 또는 20 내지 10%의 STRO-1 발현 세포를 포함한다.

전형적으로, 상기 세포 집단을, 마커 CD34 및 STRO-1의 발현이 새로 단리된, 확대되지 않은 세포에 비해 감소될 때까지 확대시킨다. 예를 들어 상기 세포 집단을 상기 마커 CD34 및 STRO-1의 발현이 상기 집단에서 세포의 50% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 또는 5% 미만, 예를 들어 35 내지 5% 또는 20 내지 10%의 수준으로 감소할 때까지 확대시킨다. 전형적으로, 상기 세포 집단을 상기 마커 CD34 및 STRO-1의 발현이 상기 집단에서 세포의 5% 미만의 수준으로 감소할 때까지 확대시킨다. 따라서, 본 발명의 eMSC의 집단은 50% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 또는 5% 미만, 예를 들어 35 내지 5% 또는 20 내지 10%의 CD34 및 STRO-1 발현 세포를 포함한다.

확대된 MSC 집단(예를 들어 5% 이하의 CD34 및/또는 STRO-1을 발현하는 것들)은 상기 집단이 새로 단리된 세포보다 더 낮은 다능성을 제공하기 때문에 유리하다, 즉 상기 집단은 천연의 확대되지 않은 MSC에 비해 다른 세포 표현형으로 분화하는 능력이 더 낮거나, 감소되거나 없을 수 있다.

본 발명의 조성물의 제조 방법이 제한되지 않으며, 임의의 방식으로 제조된 본 발명의 조성물이 본 발명의 범위내에 포함됨은 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 (a) 공여자로부터 조직을 수집하고; (b) 효소 처리에 의해 세포 현탁액을 수득하고; (c) 상기 세포 현탁액을 침강시키고 상기 세포를 배양 배지에 재-현탁시키고; (d) 상기 세포를 적어도 약 5일 또는 5배 집단 배가 동안 배양함을 포함하는, 본 발명의 조성물의 제조 방법을 제공한다.

하나의 실시태양에서 상기 세포를 투여전에, 예를 들어 확대 동안 및/또는 확대에 이어서 저온보존할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 저온보존된 세포를 제공한다. 세포 저온보존 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 전형적으로는 적합한 저온보호제(예를 들어 DMSO)의 사용을 요한다. 세포를 단리 및/또는 확대 단계 동안 임의의 시점에서 저온보존하고 투여전에 해동할 수 있다. 전형적으로 세포를 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15회 이상의 계대시에 저온보존할 수 있다, 예를 들어 세포를 3 내지 10회 또는 5 내지 10회 계대시의 저온보존할 수 있다. 임의로 상기 세포를 투여 전에 재도말하고 배양할 수도 있다.

하나의 실시태양에서 상기 세포를 투여 전에 저온보존 및/또는 배양 배지로부터 단리하고 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제(예를 들어 혈청이 임의로 보충된 DMEM)에 재현탁시킬 수 있다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물 중의 본 발명의 세포 집단을 그의 증식 능력, 이동 능력, 생존 능력, 치료 효과 및 면역조절 성질 중 하나 이상을 증대시키기 위해서 예비-자극할 수 있다. 일부 실시태양에서, 예비-자극을, 상기 MSC를 사이토킨과 접촉시킴으로써 성취할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 예비-자극을, 상기 MSC를 IFN-γ와 접촉시킴으로써 성취할 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시태양에서, 상기 MSC를 0.1 내지 100 ng/㎖의 IFN-γ 농도를 사용하여 예비-자극할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 MSC를 0.5 내지 85 ng/㎖, 1 내지 70 ng/㎖, 1.5 내지 50 ng/㎖, 2.5 내지 40 ng/㎖, 또는 3 내지 30 ng/㎖의 IFN-γ 농도를 사용하여 예비-자극할 수 있다. 예비-자극은 약 12시간보다 긴 자극 시간에 걸쳐 발생할 수 있다. 예비-자극은 약 13시간보다 긴, 약 18시간보다 긴, 약 24시간보다 긴, 약 48시간보다 긴, 또는 약 72시간보다 긴 자극 시간에 걸쳐 발생할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 MSC를 플라스미드, 바이러스 또는 선택적 벡터 전략을 사용하여 관심 핵산으로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염 또는 형질도입시킬 수 있다. 관심 핵산은 비제한적으로, 수복하고자 하는 조직 유형, 예를 들어 장벽 또는 질벽에서 발견되는 세포외 기질 성분의 집단을 증대시키는 유전자 산물을 암호화하는 것들을 포함한다.

기질 세포내로 조절 유전자를 운반하는 바이러스 벡터의 형질도입을 약 10:1 내지 2000:1의 감염배수(바이러스 단위:세포)로, 정제된(예를 들어 세슘 클로라이드 밴딩에 의해) 바이러스 벡터, 예를 들어 비제한적으로 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로 수행할 수 있다. 세포를 양이온성 세제, 예를 들어 폴리에틸렌이민 또는 리포펙타민(상표)의 부재 또는 존재하에서 약 1시간 내지 약 24시간의 기간 동안 무혈청 또는 혈청-함유 배지에서 상기 바이러스에 노출시킬 수 있다(문헌[Byk T. et al. (1998) Human Gene Therapy 9:2493-2502]; 문헌[Sommer B. et al. (1999) Calcif. Tissue Int. 64:45-49]).

벡터 또는 플라스미드의 기질 세포로의 다른 적합한 전달 방법은 지질/DNA 복합체, 예를 들어 미국특허 제 5,578,475; 5,627,175; 5,705,308; 5,744,335; 5,976,567; 6,020,202; 및 6,051,429 호에 기재된 것들을 포함한다. 적합한 시약은 막 여과된 수 중의 리포펙타민, 다중-양이온성 지질 2,3-다이올레일옥시-N-[2(스페르민카복스-아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄 트라이플루오로아세테이트(DOSPA)(화학 초록 등록명: N-[2-(2,5-비스[(3-아미노프로필)아미노]-1-옥스펜틸}아미노)에틸]-N,N-다이메틸-2,3-비스(9-옥타데세닐옥시)-1-프로판아미늄 트라이플루오로아세테이트) 및 중성 지질 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)의 3:1(w/w) 리포솜 제형을 포함한다. 예로서 리포펙타민 2000TM(깁코/라이프 테크놀로지스(Gibco/Life Technologies)로부터 입수할 수 있다 #11668019) 제형이 있다. 다른 시약은 FuGENETM 6 형질감염 시약(80% 에탄올 중의 비-리포솜 형태의 지질 및 다른 화합물들의 블렌드, 롯슈 다이아그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corp.)으로부터 수득할 수 있다 #1814443); 및 LipoTAXITM 형질감염 시약(인비트로젠 코포레이션으로부터의 지질 제형, #204110)을 포함한다. 기질세포의 형질감염을 일렉트로포레이션에 의해, 예를 들어 문헌[M.L. Roach and J.D. McNeish (2002) Methods in Mol. Biol. 185:1]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 안정한 유전학적 변경과 함께 기질세포를 생성시키기에 적합한 바이러스 벡터 시스템은 아데노바이러스 및 레트로바이러스를 기반으로 하며, 상업적으로 입수할 수 있는 바이러스 성분을 사용하여 제조할 수 있다.

상기 MSC내로 조절 유전자를 운반하는 플라스미드 벡터의 형질감염을, 칼슘 포스페이트 DNA 침전 또는 양이온성 세제 방법(리포펙타민(상표), DOTAP)의 사용에 의해 단층 배양으로 또는 플라스미드 DNA 벡터의 생체적합성 중합체내로의 직접적인 통합(문헌[Bonadio J. et al. (1999) Nat. Med. 5:753-759])에 의해 3차원 배양으로 성취할 수 있다.

이들 유전자에 의해 암호화된 기능성 단백질의 추적 및 검출을 위해서, 상기 바이러스 또는 플라스미드 DNA 벡터는 쉽게 검출가능한 마커 유전자, 예를 들어 녹색 형광 단백질 또는 베타-갈락토시다제 효소(이 둘은 모두 조직화학적 수단에 의해 추적될 수 있다)를 함유할 수 있다.

확대에 후속으로, 본 발명의 세포 집단을 분석하여 특징 마커의 발현을 측정하여 그의 표현형을 확인(이는 통상적인 수단을 사용함으로써 수행될 수 있다)하는 것이 바람직하다.

상기 "발현된"이란 용어는 세포내 마커의 존재를 기술하는데 사용된다. 발현되는 것으로 간주되기 위해서, 마커는 검출 가능한 수준으로 존재해야 한다. "검출 가능한 수준"이란 상기 마커를 표준 실험 방법들 중 하나, 예를 들어 PCR, 블럿팅 또는 FACS 분석을 사용하여 검출할 수 있음을 의미한다. MSC 집단의 표현형 표면 마커 특성화를 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행할 수 있다. 예로서, 비제한적으로, 상기 표현형 특성화를 개별 세포 염색에 의해 수행할 수 있다. 상기와 같은 염색은 항체의 사용을 통해 성취될 수 있다. 이는 표지된 항체를 사용함에 의한 직접 염색, 또는 상기 세포 마커에 특이적인 1차 항체에 대한 표지된 2차 항체를 사용하는 간접 염색일 수 있다. 항체 결합을 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 검출할 수 있다. 항체 결합을 또한 유식 세포측정, 면역형광 현미경검사 또는 방사선기록에 의해 검출할 수 있다.

한편으로 또는 추가로, 유전자는 발현이 30 PCR 주기 후에 합당하게 검출될 수 있는 경우(이는 세포당 적어도 약 100 사본수의 세포 중 발현 수준에 상응한다) 본 발명의 집단의 세포에 의해 발현되는 것으로 간주된다. 상기 "발현하다" 및 "발현"이란 용어는 상응하는 의미들을 갖는다. 상기 한계 미만의 발현 수준에서, 마커는 발현되지 않는 것으로 간주된다. 본 발명의 성체 기질세포에서의 발현 수준과 또 다른 세포, 예를 들어 배아줄기세포에서의 동일 마커의 발현 수준간의 비교를 바람직하게는, 동일한 종으로부터 단리된 2개의 세포 유형을 비교함으로써 수행할 수 있다. 바람직하게 상기 종은 포유동물이고, 보다 바람직하게 상기 종은 인간이다. 상기와 같은 비교를 편의상 역전사효소 폴리머라제 쇄 반응(RT-PCR) 실험을 사용하여 수행할 수 있다.

세포-표면 마커를 대개는 양성/음성 선택에 기반하여 임의의 적합한 통상적인 기법에 의해 식별할 수 있다; 예를 들어 세포 중의 존재/부재를 확인하고자 하는 세포-표면 마커에 대한 단클론 항체를 사용할 수 있지만; 다른 기법들도 또한 사용할 수 있다. 따라서, 특정한 실시태양에서, CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 전부에 대한 단클론 항체를 상기 선택된 세포 중의 상기 마커들의 부재를 확인하기 위해서 사용하며; 인자 VIII, 알파-액틴, 데스민, S-100, 케라틴, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 및 CD133 중 1, 2, 3, 4개 또는 전부에 대한 단클론 항체를 상기 마커들 중 적어도 하나 및 바람직하게는 전부의 존재 또는 검출 가능한 발현 수준을 확인하기 위해서 사용한다.

추가의 실시태양에서, CD34; CD45; CD31; CD14 중 적어도 1, 2, 3개 또는 전부, 예를 들어 CD31 및/또는 CD34에 대한 단클론 항체를 상기 마커들의 존재 또는 검출 가능한 발현 수준을 확인하기 위해서 사용한다. 추가의 실시태양에서 CD34에 대한 단클론 항체를 상기 선택된 세포 중의 상기 마커의 부재를 확인하기 위해서 사용한다. 추가의 실시태양에서, STRO-1에 대한 단클론 항체를 상기 선택된 세포 중의 상기 마커의 부재를 확인하기 위해서 사용한다. 추가의 실시태양에서 CD29; CD59; CD90; CD105 중 적어도 1, 2, 3개 또는 전부, 예를 들어 CD59 및/또는 CD90에 대한 단클론 항체를 상기 마커의 존재 또는 검출 가능한 발현 수준을 확인하기 위해서 사용한다.

상기 단클론 항체들은 공지되어 있거나, 상업적으로 입수할 수 있거나, 또는 통상적인 방법에 의해 당해 분야의 숙련가에 의해 획득될 수 있다.

상기 선택된 세포에서 IFN-γ-유도성 IDO 활성을 임의의 적합한 통상적인 분석에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택된 세포를 IFN-γ에 의해 자극하고 IDO 발현에 대해 분석할 수 있다; 이어서 IDO 단백질 발현에 대한 통상적인 웨스턴-블럿 분석을 수행하고 상기 선택된 세포의 IFN-γ 자극에 이은 IDO 효소 활성을, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석 및 정보읽기로서 상등액 중의 키누레닌 농도의 광도측정을 통한 트립토판에서 키누레닌으로의 전환에 의해 측정할 수 있다. 본 발명의 세포는 몇몇 조건하에서 IDO를 발현하기 때문에, IFN-γ 자극에 이은 IDO 활성의 검출을 허용하는 임의의 적합한 기법을 본 발명의 세포의 선택에 사용할 수 있다. 상기 선택된 세포에서 IFN-γ-유도성 IDO 활성의 측정을 위한 적합한 분석은 WO2007039150에 개시되어 있다. 생성되는 IDO의 양은 제곱 센티미터당 세포수(바람직하게는 5000 세포/㎠ 이상의 수준이나, 상기 농도로 제한되지 않는다) 및 IFN-γ의 농도(이상적으로는 3 ng/㎖ 이상이나, 상기 농도로 제한되지 않는다)에 따른다. 상기 기재된 조건하에서 생성된 IDO의 활성은 24시간 이상 후에 μM 범위의 검출 가능한 키누레닌을 생성시킬 것이다.

투여

하나의 실시태양에서, 본 발명의 조성물을 전신 투여용(예를 들어 직장, 코, 구강, 질로, 이식된 저장소를 통해 또는 흡입을 통해)으로 제조할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물을 국소 투여용으로 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물을 비경구 경로에 의해 투여할 수 있다. 조성물을 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 병변내, 림프내 및 두개내 경로에 의해 투여할 수 있다. 바람직한 투여 경로는 정맥내이다. 바람직한 MSC는 ASC이다.

따라서, 본 발명은 환자에서 폐렴에 부차적인 패혈증의 치료에 사용하기 위한 MSC, 예를 들어 ASC를 제공하며, 여기에서 상기 MSC는 정맥내 경로에 의해 투여된다. 전형적으로, 상기 환자는 인간이다.

하나의 실시태양에서, 본 발명은 환자, 예를 들어 인간 환자에서 폐렴에 부차적인 패혈증의 치료에 사용하기 위한 ASC를 제공하며, 여기에서 상기 ASC는 전신적으로, 예를 들어 정맥내 경로에 의해, 예를 들어 정맥내 주사에 의해, 예를 들어 림프 기관, 예를 들어 말초 림프 기관, 예를 들어 비제한적으로 림프절, 가장 바람직하게는 액와 또는 서혜부 림프절에의 림프내 주사에 의해 투여된다. 이들 각각의 실시태양에서, 상기 MSC는 ASC, 예를 들어 eASC일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "림프계"란 용어는 당해 분야에서 그의 통상적인 의미로 제공되며 림프관 및 림프 모세관의 전도 시스템에 의해 연결된 림프양 조직, 예를 들어 림프 기관을 지칭한다. "림프 기관"이란 용어는 림프절, 가장 바람직하게는 액와 또는 서혜부 림프절을 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 상기 ASC는 폐에 직접 투여되지 않거나 기관내 경로에 의해 직접 투여되지 않는다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 사용되는 MSC는 치료되는 피실험자에 관하여 자기조직일 수 있다. 추가의 실시태양에서, 본 발명에 사용되는 MSC는 치료되는 피실험자에 관하여 동종이계 또는 이종일 수 있다. 공여자로부터 유래된 동종이계 지방조직-유래된 기질 세포를 이론적으로는 MHC 부적합성에 관계 없이 임의의 환자의 치료에 사용할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 조성물을 치료되는 피실험자 중의 하나 이상의 표적 부위에 상기 조성물의 주사 또는 이식에 의해 투여할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 조성물을 주사 또는 이식에 의해 상기 피실험자내로의 상기 조성물의 전달을 촉진하는 전달 장치에 삽입할 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 전달 장치는 카테터를 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 전달 장치는 주사기를 포함할 수 있다.

투여량

MSC 및 임의의 추가적인 치료제의 투여량은 환자의 증상, 연령 및 체중, 치료되거나 예방되는 질환의 성질 및 중증도, 투여 경로, 및 추가적인 치료제의 형태에 따라 변할 것이다. 본 발명의 조성물을 단일 용량으로 또는 분할 용량으로 투여할 수 있다. MSC 및 임의의 추가적인 치료제(들)에 적합한 투여량은 공지된 기법에 의해 결정될 수 있다.

전형적으로 상기 용량은 피실험자 체중을 기준으로 약 10 x 10⁶ 세포/㎏ 이하, 약 9 x 10⁶ 세포/㎏ 이하, 약 8 x 10⁶ 세포/㎏ 이하, 약 7 x 10⁶ 세포/㎏ 이하, 약 6 x 10⁶ 세포/㎏ 이하, 약 5 x 10⁶ 세포/㎏ 이하이다. 또 다른 실시태양에서 상기 용량은 약 0.25 x 10⁶ 세포/㎏ 내지 약 5 x 10⁶ 세포/㎏; 또는 보다 바람직하게는 약 1 x 10⁶ 세포/㎏ 내지 약 5 x 10⁶ 세포/㎏일 수 있다. 상응하게 추가의 또 다른 실시태양에서 상기 용량은 약 0.25 x 10⁶ 세포/㎏, 0.5 x 10⁶ 세포/㎏, 0.6 x 10⁶ 세포/㎏, 0.7 x 10⁶ 세포/㎏; 0.8 x 10⁶ 세포/㎏; 0.9 x 10⁶ 세포/㎏; 1.1 x 10⁶ 세포/㎏; 1.2 x 10⁶ 세포/㎏; 1.3 x 10⁶ 세포/㎏; 1.4 x 10⁶ 세포/㎏; 1.5 x 10⁶ 세포/㎏; 1.6 x 10⁶ 세포/㎏; 1.7 x 10⁶ 세포/㎏; 1.8 x 10⁶ 세포/㎏; 1.9 x 10⁶ 세포/㎏ 또는 2 x 10⁶ 세포/㎏일 수 있다. 상기 용량은 다른 실시태양에서 0.1 내지 1 백만 세포/㎏; 또는 1 내지 2 백만 세포/㎏; 또는 2 내지 3 백만 세포/㎏; 또는 3 내지 4 백만 세포/㎏; 또는 4 내지 5 백만 세포/㎏; 또는 5 내지 6 백만 세포/㎏; 또는 6 내지 7 백만 세포/㎏; 또는 7 내지 8 백만 세포/㎏; 또는 8 내지 9 백만 세포/㎏; 또는 9 내지 1 천만 세포/㎏일 수 있다.

또 다른 실시태양에서 상기 세포를 상기 환자에게 환자 체중에 관계없이 고정된 용량으로 투여할 수 있다. 전형적으로 상기 용량은 약 1 천만 세포 내지 5 억 세포이고, 예를 들어 상기 용량은 약 10 x 10⁶ 세포, 50 x 10⁶ 세포, 10 x 10⁷ 세포, 50 x 10⁷ 세포이다.

따라서, 하나의 실시태양에서 본 발명은 인간 피실험자에서 폐렴에 부차적인 패혈증, 예를 들어 폐렴에 부차적인 중증 패혈증의 치료에 사용하기 위한 MSC, 예를 들어 ASC를 제공하며, 여기에서 상기 MSC를 정맥내 경로에 의해, 예를 들어 정맥내 주사에 의해, 피실험자 체중을 기준으로 약 0.25 x 10⁶ 세포/㎏ 내지 약 5 x 10⁶ 세포/㎏의 용량으로 투여한다. 상기 패혈증은 세균성 폐렴(예를 들어 그람-음성 폐렴)에 부차적일 수 있다.

상기 실시태양과 임의로 조합될 수 있는 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 인간 피실험자에서 폐렴에 부차적인 패혈증, 예를 들어 폐렴에 부차적인 중증 패혈증의 치료에 사용하기 위한 MSC, 예를 들어 ASC를 제공하며, 여기에서 상기 MSC는 반복적으로 투여된다, 즉 2회 이상 용량, 예를 들어 적어도 3회 용량, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 용량으로 투여된다. 하나의 실시태양에서, 2회 용량이 투여된다. 또 다른 실시태양에서, 3회 용량이 투여된다. 추가의 실시태양에서, 4회 용량이 투여된다. 용량들간의 간격은 하루, 1주일 또는 1개월일 수 있다. 전형적으로, 상기 간격은 하루이다. 상기 MSC를 1주일 이하의 기간에 걸쳐(예를 들어 하루 간격으로, 예를 들어 1일 및 3일째, 또는 1, 3 및 5일째, 또는 1, 3, 5 및 7일째) 투여할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 2회 용량의 MSC를 하루 간격으로, 즉 1일 및 3일째에(1일은 MSC의 첫 번째 용량을 나타낸다) 투여한다.

주어진 환자에서 가장 유효한 치료를 생성시키는 임의의 특정 작용제의 정확한 투여 시간 및 양은 상기 작용제의 활성, 약동학 및 생물학적 이용효능, 환자의 생리학적 조건(연령, 성별, 질병 유형 및 병기, 일반적인 신체 상태, 주어진 투여량에 대한 응답성 및 약물치료 유형을 포함한다), 투여 경로 등에 따라 변할 것이다. 본 명세서에 제공된 정보를 사용하여 상기 치료를 최적화할 수 있다, 예를 들어 최적의 투여 시간 및/또는 양을 결정할 수 있으며, 이는 통상적인 실험 이하의 실험, 예를 들어 상기 피실험자의 모니터링 및 상기 투여량 및/또는 타이밍의 조정을 필요로 할 것이다. 상기 피실험자를 치료하는 동안, 상기 피실험자의 건강을, 24시간의 기간 동안 소정의 시기에 관련 지수들 중 하나 이상을 측정함으로써 모니터할 수 있다. 투여량, 투여 시간 및 제형을 포함한 치료 섭생들을 상기와 같은 모니터링의 결과에 따라 최적화할 수 있다.

치료를 상기 최적 용량보다 적은 보다 작은 투여량으로 개시할 수 있다. 그 후에, 상기 투여량을 최적의 치료 효과가 획득될 때까지 작은 증분으로 증가시킬 수 있다.

다수 치료제의 복합 사용은 상이한 성분들의 효과의 개시 및 지속이 우대될 수 있기 때문에 임의의 개별적인 성분에 필요한 투여량을 감소시킬 수 있다. 상기와 같은 복합 치료법에서, 상기 상이한 활성제들을 함께 또는 별도로, 및 당일 내에 동시에 또는 상이한 시간으로 전달할 수 있다.

보조 치료법

하나의 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상(또는 2개 이상, 또는 3개 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 추가적인 치료제를 함유하거나 또는 한편으로 상기 치료제와 함께 투여될 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 MSC 및 상기 하나 이상의 추가적인 치료제를 상기 피실험자에게 동시에 투여할 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 MSC 및 상기 하나 이상의 추가적인 치료제를 상기 피실험자에게 연속적으로 투여할 수 있다. 상기 하나 이상의 추가적인 치료제를 상기 MSC의 투여 전 또는 투여 후에 투여할 수 있다.

치료제로서 말한 것을 하기 중에서 선택할 수 있다: 진통제, 예를 들어 비스테로이드성 소염 약물, 아편양 작용물질 또는 살리실레이트; 항-감염제, 예를 들어 구충제, 항혐기성, 항생제, 아미노글리코사이드 항생제, 항진균성 항생제, 광범위 항생제, 세팔로스포린 항생제, 마크로리드 항생제, β-락탐 항생제, 페니실린 항생제, 퀴놀론 항생제, 설폰아미드 항생제, 테트라사이클린 항생제, 항마이코박테리아제, 항결핵성 항마이코박테리아제, 항원충제, 항말라리아성 항원충제, 항바이러스제, 항-레트로바이러스제, 옴벌레살충제, 소염제, 코르티코스테로이드성 소염제, 항소양제/국소 마취제, 국소 항-감염제, 항진균성 국소 항-감염제, 항바이러스성 국소 항-감염제; 전해성 신장약, 예를 들어 산성화제, 알칼리화제, 이뇨제, 카보닉 안하이드라제 억제제 이뇨제, 루프 이뇨제, 삼투성 이뇨제, 칼륨-보존 이뇨제, 티아지드 이뇨제, 전해질 대체제, 및 요산배설 촉진제; 효소, 예를 들어 췌장 효소 및 혈전용해 효소; 위장약, 예를 들어 항설사제, 항구토제, 위장 소염제, 살리실레이트 위장 소염제, 항산성 항-궤양제, 위산-펌프 억제제 항-궤양제, 위장 점막 항-궤양제, H2-차단제 항-궤양제, 담석용해제, 소화제, 구토제, 하제 및 대변 연화제, 및 위장운동촉진제; 일반 마취제, 예를 들어 흡입 마취제, 할로겐화된 흡입 마취제, 정맥내 마취제, 바비튜레이트 정맥내 마취제, 벤조디아제핀 정맥내 마취제, 및 아편양 작용물질 정맥내 마취제; 호르몬 또는 호르몬 변형제, 예를 들어 낙태제, 부신제, 코르티코스테로이드 부신제, 안드로젠, 항-안드로젠, 면역생물제, 예를 들어 면역글로불린, 면역억제제, 톡소이드, 및 백신; 국소 마취제, 예를 들어 아미드 국소 마취제 및 에스테르 국소 마취제; 근골격제, 예를 들어 항-통풍성 소염제, 코르티코스테로이드 소염제, 금 화합물 소염제, 면역억제성 소염제, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 살리실레이트 소염제, 미네랄; 및 비타민, 예를 들어 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 및 비타민 K.

또 다른 실시태양에서, 상기 추가적인 치료제는 성장 인자, 또는 세포 증식 또는 활성화에 영향을 미치는 다른 분자일 수 있다. 추가의 실시태양에서 상기 성장 인자는 최종 분화를 유도할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 성장 인자는 천연 성장 인자의 변체 또는 단편일 수 있다. 상기와 같은 변체의 생성 방법은 당해 분야에 주지되어 있으며, 예를 들어 보존성 아미노산 변화를 만들거나 또는 변이도입 및 필요한 기능에 대한 생성된 변체의 분석에 의한 방법을 포함할 수 있다.

이제 본 발명을 하기의 실시예들에 의해 추가로 예시할 것이다. 이들 실시예는 단지 예시로서 제공되며 제한을 의도하지 않는다.

실시예 1

폐렴-관련 폐혈증에 대한 ASC 치료의 효과

목적: 폐에서 진행 및 세균의 전염, 및 염증전 사이토킨의 수준에 대한 감염 후 6시간째에 투여된 ADC의 효과를 측정하기 위함

마우스:

·8 내지 12주 된 것, 특정 병원체가 없는 암컷 C57BL/6 마우스

·환경 순응을 위해 실험 전 7일 동안 마우스를 무작위 수용하였다

·실험 동물을 하루에 2회 관찰하였다. 대단히 아픈 경우, 동물 윤리 위원회에 따라 보다 빈번한(6x) 관찰이 요구되었으며 이는 필수적이었다.

폐렴:

그람-음성 폐렴을, 생 클렙시엘라 뉴모니아에 혈청형 2(1 x 10⁴ CUF; ATCC 43816; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)의 비내 적하에 의해 유도하였다. 세균을 트립신 대두 브로쓰(TSB) 배지 및 혈액 아가(BA) 플레이트에서 배양하였다.

-1일: 배양 개시

-80 ℃ 클렙시엘라 뉴모니아에 모액 1 방울을 50 ㎖ TSB 배지에 놓고 37 ℃에서 밤새(16시간) 생육시켰다.

0일: 접종물 제조

1 ㎖의 상기 배양물(-1일)을 100 ㎖(따뜻한) TSB 배지에 재현탁시키고 OD=1.0(±2.5-3 시간)일 때까지 생육시켰다. 10 ㎖ 배양물을 4 ℃에서 10분 동안 4000 rpm 원심분리로 저온 멸균 0.9% NaCl(박스터(Baxter))로 세척하였다. 상등액을 제거하고 상술한 바와 같이 2회 더 세척하였다. 펠릿을 10 ㎖ NaCl에 재현탁시켰으며, 상기 세균 농도는 대략 0.4 x 10⁹ CUF/㎖이었다. 상기를 약 20 x 10⁴ CFU/㎖로 2000배 희석하였다. 상기 접종물의 농도를, 3개의 BA 플레이트상에 상기 접종물의 10² 내지 10⁴ 희석물 50 ㎕를 도말하여 검사하였다. 37 ℃에서 밤새 배양 후 CFU를 카운트하였다(1일). 마우스에 접종하였다:

접종물: 50 ㎕/마우스 → 1 x 10⁴ CFU

줄기 세포:

ASC(1 x 10⁶ 확대된 인간 지방조직 유래된 줄기 세포) 또는 위약(링거의 락테이트)을 상기 마우스의 비내 접종 후 6시간째에 정맥내 투여하였다.

연구 설계

T = 0시간

·아이소플루란 마취제

·모든 마우스: 생 클렙시엘라 뉴모니아에 혈청 2(50 ㎕, 1 x 10⁴ CFU)의 비내 적하

T = 6시간

·그룹 I: (n = 8) 200 ㎕ 위약(링거의 락테이트)을 1 x 정맥내(IV) 주사

·그룹 II: (n = 8) 1 x 10⁶ ASC(200 ㎕ 링거의 락테이트 중)를 1 x IV 주사

T = 48시간: 마우스 죽임

연구 종점:

·폐, 비장, 간 및 혈액 중 세균 부하(반-정량적인 배양)

·염증: 폐 균질물 중 사이토킨(TNF-α, IL-1β, IL-6) 및 케모킨(MIP-2)

결과:

도 1 내지 8은 2개의 독립적인 실험(각각 A 및 B 표지된)으로부터의 결과를 나타낸다. 도 1 내지 4에 나타낸 바와 같이, 위약에 비해, 6시간의 감염 후 ASC에 의한 처리는 혈액(도 1) 및 폐(도 2)에서 세균 부하를 감소시켰으며 간(도 3) 또는 비장(도 4)에서 또한 세균 부하를 감소시켰다. 더욱이, 도 5 내지 8에 나타낸 바와 같이, 염증-전 사이토킨 및 케모킨의 수준이 위약에 비해, ASC에 의한 처리 후 폐 균질물에서 감소되었다. 이들 결과는 ASC에 의한 처리가 폐렴-관련 패혈증의 중증도를 감소시킴을 입증한다. 세균 부하 및 염증-전 사이토킨/케모킨 수준이 다양한 조직, 예를 들어 폐렴과 관련된 표적 기관, 예를 들어 혈액 및 폐에서 감소되었다. 따라서, MSC, 예를 들어 ASC는 폐렴-관련 패혈증의 치료에 놀랍게도 유용하다.

추가의 연구로부터의 결과를 도 9 내지 12에 나타내며, 이는 다시 폐렴-관련 패혈증에서 ASC의 정맥내 투여가 혈액과 같은 다양한 기관들에서 세균 부하를 감소시킴을 입증한다.

실시예 2

임상 시험을 중증 패혈증 또는 패혈성 쇼크가 있는 중증 폐렴 환자에서 수행한다. 환자를 패혈증 진단 24시간 이내에 등록시킨다.

상기 연구에 등록한 환자 중 대략 절반은 링거의 락테이트 용액 중 공여자-유래된(동종이계) 확대된 지방 기질세포(eASC)의 현탁액으로 이루어지는 의약 생성물에 의한 치료를 수용한다. 다른 절반은 링거의 락테이트 용액의 현탁액으로 이루어지는 위약을 수용한다. 상기 치료 그룹의 환자들은 환자의 체중 ㎏당 4 백만 세포의 상기 의약 생성물의 단일 용량을 수용한다. 상기 위약 그룹의 환자는 단일 용량의 상기 위약을 수용한다. 상기 두 경우 모두 투여는 정맥내 주입에 의한다.

상기 의약 생성물은, 건강한 개인으로부터 지방흡입을 통해 수득되고 시험관내에서 확대된, 일회용 바이알 중의 동종이계 기원의 지방-유래된 기질세포(eASC)를 함유하는 멸균 완충 용액 중의 세포 현탁액이다. 상기 의약 생성물은 병변내 투여를 위한 멸균의 등명한 무색 현탁액으로서 공급되며, 6 ㎖ 바이알(인간 혈청 알부민과 함께 둘베코의 변형 이글 배지[DMEM]의 ㎖당 1 천만 eASC의 현탁액) 중에 제공되었다. 상기 의약 생성물을 4 ㎖/분의 주입속도로 링거의 락테이트 용액 중 현탁 후에 투여할 것이다.

상기 연구 위약은 4 ㎖/분의 주입 속도의 병변내 투여를 위한 링거의 락테이트 용액이다. 상응하는 위약 부피(링거의 락테이트 용액)가 상기 위약 그룹으로부터의 각 피실험자에게 투여될 것이다. 위약 부피는 상기 피실험자의 체중에 따라 계산될 것이다.

의약 생성물 제조

상기 동종이계 eASC 의약 생성물은 건강한 공여자의 피하 지방조직으로부터 추출된 살아있는 성체 기질세포의 세포 현탁액으로 이루어진다. 피하 지방조직을 상기 건강한 공여자로부터 지방흡입하고 GMP 제조 설비로 수송한다. 상기 공여, 조달 및 시험은 지침 2004/23/EC의 요구에 따라서 및 따라서 지침 2006/17/EC 및 2006/83/EC 하에 수행된다. ASC를, 상기 지방 조직을 I형 콜라게나제로 절단한 다음 원심분리에 의해 단리한다. 상기 수득된 세포 펠릿을 재현탁시키고 적혈구 용해 용액에 용해시키고 원심분리시킨다. 상기 세포 펠릿으로부터 생성되는 기질 혈관 분획을 세포 배양 용기 중의 배양 배지 및 항생제 중에 넣고, 가습 분위기하에 37 ℃ 및 5% CO2에서 배양한다. 24 내지 48시간 도말-후에, 상기 배양 배지를 제거하여 부착되지 않은 세포 분획은 제거한다. 상기 플라스틱 배양 플레이트에 부착된 ASC를 시험관내 조건하에서 확대시킨다. 3 내지 4일마다, 상기 배양 배지를 90 내지 95% 세포밀집도에 도달한 후에 교환하고, 상기 세포를 트립신/EDTA로 탈착시키고, 수집하고, 원심분리하고, 항생제 없이 필요한 복제로 확대시킨다. 이어서 상기를 수확하고 사용시까지 저온보존한다. 상기 지정된 투여일 전에, 충분한 저온보존된 바이알을 해동시켜 투여에 필요한 용량을 제공한다. ASC를 도말 및 배양에 의해 그의 저온보존된 상태로부터 회수한다(생육성을 확인하기 위해서). 상기 바이알을 충전하고 패키징한 당일에, 상기 배양물을 포스페이트 완충 용액, 및 트립신/EDTA로 세척하였다. 상기 ASC를 선택된 부형제(둘베코 변형 이글 배지 및 인간 알부민 혈청) 중에 즉시 재현탁시켜 의약 생성물을 제형화한다.

상기 eASC를 세포-기반 의약 생성물에 대한 지침(EMEA/CHMP/410869/2006) 및 줄기세포에 대한 심사 논문(EMA/CAT/571134/2009)에 따라 정체(표현형 프로파일), 순도, 효능, 형태, 생육성 및 세포성장 동역학에 대해 특성화한다.

Claims (16)

1. 지방조직-유래된 기질세포(ASC)를 포함하는 인간 대상에 있어서 패혈증의 치료에 사용되기 위한 약학 조성물에 있어서, 상기 패혈증은 염증성 폐 상태에 부차적이며, 상기 조성물은 정맥내 경로를 통해 투여하며, 상기 염증성 폐 상태는 폐렴인, 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 패혈증은 중증 패혈증인, 약학 조성물.
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 폐렴은 세균에 의해 야기된, 약학 조성물.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 기질세포는 확대된 지방조직-유래된 기질세포인, 약학 조성물.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 지방조직-유래된 기질세포(ASC)가 동종이계인, 약학 조성물.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 조성물이 피실험자의 체중 ㎏당 0.25 x 10⁶ 세포 내지 5 x 10⁶ 세포를 포함하는, 약학 조성물.
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 지방조직-유래된 기질세포(ASC)를 피실험자에게 반복해서 투여하는, 약학 조성물.
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 지방조직-유래된 기질세포(ASC)를 1일 및 3일에 피실험자에게 투여하는, 약학 조성물.
10. 제 1 항에 있어서,
    ASC의 적어도 50%가 마커 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상을 발현하는, 약학 조성물.
11. 제 1 항에 있어서,
    ASC의 적어도 50%가 마커 인자 VIII, 알파-액틴, 데스민, S-100, 케라틴, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 및 CD133을 발현하지 않는, 약학 조성물.
12. 제 1 항에 있어서,
    ASC를 약학적으로 허용 가능한 담체; 희석제; 또는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제; 와 함께 투여하는, 약학 조성물.
13. 제 1 항에 있어서,
    ASC를 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 투여하는, 약학 조성물.
    
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제

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