BR112016030758B1 - Uso de células estromais multipotentes derivadas de tecido adiposo mesenquimal - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO, USO DE CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS NA MANUFATURA DE UM MEDICAMENTO, E, MÉTODO DE TRATAMENTO DE SEPSE EM UM INDIVÍDUO. A invenção se refere ao uso de células estromais mesenquimais (MSCs) para o tratamento de sepse em um indivíduo. A invenção prove composições, usos e métodos para o tratamento de sepse.

Description

[001] A síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) é um estado inflamatório de todo o corpo sem uma fonte de infecção específica. Ela pode ser causada por muitos fatores, inclusive, entre outros, trauma, cirurgia, insuficiência suprarrenal, embolia pulmonar, infarto do miocárdio, hemorragia, anafilaxia, superdosagem de droga, imunodeficiência e queimaduras. Há quatro sintomas diagnósticos importantes da SIRS, conforme listado abaixo, mas a presença de dois destes é suficiente para um diagnóstico (vide, por exemplo, Nystrom (1998) Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 41, Suppl. A, 1-7). i) uma frequência cardíaca superior a 90 batimentos por minuto; ii) uma temperatura corporal abaixo de 36°C ou acima de 38°C; iii) uma frequência respiratória superior a 20 respirações por minuto (taquipneia); e vi) uma contagem de leucócitos abaixo de 4000 células/mm3ou acima de 12000 células/mm3, ou a presença de mais de 10% de neutrófilos imaturos.

[002] A SIRS causa ativação generalizada de proteínas imunogênicas de fase aguda, que afeta o sistema complemento e as vias de coagulação, que por sua vez causa dano à vasculatura, bem como aos órgãos internos. Diversos sistemas contrarreguladores neuroendócrinos são consequentemente ativados, o que frequentemente agrava o problema.

[003] A sepse é uma forma específica da SIRS e a causa mais comum de morte nas unidades de terapia intensiva. Ela é causada por suspeita ou detecção de uma infecção. É caracterizada por uma rede hiperativa ou desequilibrada de citoquinas endógenas pró-inflamatórias, e geralmente leva a inflamação generalizada e coagulação sanguínea, o que pode resultar em vermelhidão, calor, edema, dor, disfunção orgânica ou falência do órgão. A coagulação sanguínea durante a sepse também pode causar redução do fluxo sanguíneo aos membros e órgãos vitais e pode levar à falência do órgão ou ao início de gangrena.

[004] Como a SIRS, a sepse geralmente resulta em uma inflamação aguda presente em todo o corpo e é, portanto, frequentemente associada à febre e leucocitose (contagem de leucócitos elevadas). A teoria atual por detrás da sepse é que a resposta imune do hospedeiro à infecção desencadeia a SIRS, que, por sua vez, apresenta os sintomas descritos acima. Após a infecção e a sepse, a perfusão tecidual e o fornecimento de oxigênio podem ser reduzidos, levando a choque séptico. Para ser diagnosticado com choque séptico, deve haver evidência de infecção e hipotensão refratária no paciente.

[005] A SIRS, a sepse e o choque séptico são condições clínicas graves. Mesmo com tratamento imediato e agressivo, estas doenças são susceptíveis de progredir para síndrome de disfunção múltipla dos órgãos e pode até resultar em morte.

[006] A maioria das estratégias terapêuticas até o momento visaram os mediadores pró-inflamatórios, mas descobriu-se não melhorarem a sobrevida dos pacientes quando estudadas em grandes estudos clínicos multicêntricos. As terapias destinadas a bloquear uma única citocina, como TNFα e IL-1β, mostraram eficácia limitada provavelmente devido à cinética precoce e temporária destas citocinas inflamatórias. Recentemente, os peritos em cuidado crítico internacional e doença infecciosa desenvolveram diretrizes de tratamento para melhorar o tratamento fornecido a pacientes que sofrem de SIRS, sepse ou choque séptico. Estas diretrizes visam transformar o diagnóstico complexo e as decisões terapêuticas em simples tarefas de "missão crítica"e, entre outros tratamentos, sugerem a administração de antibióticos de amplo espectro e Drotrecogina Alfa (Ativada).

[007] No entanto, a mortalidade associada à sepse permanece em 30% a 50%, enquanto a taxa de mortalidade para choque séptico é relatada como sendo ainda maior, em 50% a 60%. Relata-se que existem aproximadamente 750.000 novos casos de sepse por ano, com pelo menos 210.000 destes resultando em uma fatalidade. Conforme os tratamentos médicos se tornam mais agressivos, é provável que a incidência de SIRS, sepse e choque séptico aumente, e consequentemente seja necessário um novo tratamento confiável para estas condições.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Descobriu-se que a administração de células estromais mesenquimais (MSCs), em particular células estromais derivadas de tecido adiposo humano (hASCs), é útil no tratamento de SIRS, sepse, sepse grave e choque séptico. Por exemplo, descobriu-se que as MSCs, em particular as hASCs, protegem contra a mortalidade em sepse associada à pneumonia, provendo evidência de que as MSCs podem ser úteis no tratamento de SIRS, sepse e choque séptico. Descobriu-se que as MSCs funcionam em diversos níveis para regular aspectos cruciais da SIRS, sepse, sepse grave e choque séptico, inclusive pela redução dos níveis sistêmicos de diversas citocinas inflamatórias e quimiocinas, e pela inibição de infiltração leucocitária em diversos órgãos alvo.

[009] Em um aspecto, a invenção prove, portanto, uma composição que compreende células estromais mesenquimais (MSCs) para uso no tratamento de sepse em um indivíduo com ou subsequente à pneumonia, por exemplo, para o uso em um método de tratamento de sepse em um indivíduo com ou subsequente à pneumonia.

[0010] A invenção também prove o uso de células estromais mesenquimais (MSCs) na manufatura de um medicamento para o tratamento de sepse de indivíduo com ou subsequente à pneumonia.

[0011] A invenção também prove um método de tratamento de sepse em um indivíduo com ou subsequente à pneumonia, compreendendo a administração de células estromais mesenquimais (MSCs) ao indivíduo.

[0012] Estes e demais aspectos da invenção são descritos mais detalhadamente abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0013] Figuras 1 a 4: Carga bacteriana em diversos tecidos em pós-infecção de 48 horas. A e B mostram os resultados de dois experimentos independentes. PLACEBO = tratamento com solução de Ringer lactato; ASC = tratamento com ASC; UFC = unidades de formação de colônia. Figura 1: Sangue; Figura 2: Homogeneizado pulmonar; Figura 3: Homogeneizado hepático e Figura 4: Homogeneizado esplênico.

[0014] Figuras 5 a 8: Níveis de citocinas e quimiocinas nos homogeneizados pulmonares em pós-infecção de 48 horas. A e B mostram os resultados de dois experimentos independentes. PLACEBO = tratamento com solução de Ringer lactato; ASC = tratamento com ASC. Figura 5: TNFα; Figura 6: IL1β; Figura 7: IL6; e Figure 8: Mip-2.

[0015] Figuras 9 a 12: Carga bacteriana em diversos tecidos após infecção. PLACEBO = tratamento com solução de Ringer lactato; ASC = tratamento com ASC; UFC = unidades de formação de colônia. Figura 9: Sangue; Figura 10: Homogeneizado pulmonar; Figura 11: Homogeneizado hepático e Figura 12: Homogeneizado esplênico.

DEFINIÇÕES

[0016] Conforme aqui utilizado, os termos e orações a seguir devem apresentar os significados estabelecidos abaixo. Exceto definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado do comumente compreendido ao perito da técnica à qual esta invenção pertence.

[0017] Os artigos “um” e “uma” referem-se a um ou mais de um (ou seja, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Por meio de exemplos, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.

[0018] O termo “aproximadamente”, quando utilizado em relação a um valor, refere-se ao valor ±10%.

[0019] Por “tecido adiposo” representa-se qualquer tecido adiposo. O tecido adiposo pode ser tecido adiposo marrom ou branco, derivado de, por exemplo, tecido adiposo subcutâneo, omental/visceral, mamário, gonadal ou local de tecido adiposo. Preferencialmente, o tecido adiposo é tecido adiposo branco subcutâneo. O tecido adiposo pode compreender uma cultura celular primária ou uma linhagem celular imortalizada. O tecido adiposo pode derivar de qualquer tecido adiposo que contém organismo. Em algumas realizações, o tecido adiposo é mamífero, e em outras realizações, o tecido adiposo é humano. Uma fonte conveniente de tecido adiposo é a cirurgia de lipoaspiração. No entanto, será compreendido que nem a fonte de tecido adiposo nem o método de isolamento do tecido adiposo são cruciais para a invenção. Se as células, conforme aqui descritas, são desejadas para o transplante autólogo em um indivíduo, o tecido adiposo será isolado a partir deste indivíduo.

[0020] “Células estromais derivadas de tecido adiposo (ASCs)” referem-se às MSCs que se originam do tecido adiposo, geralmente do tecido adiposo humano (hASCs).

[0021] O termo “produto medicinal biológico” deverá ser compreendido como uma substância farmacêutica baseada em proteína ou ácido nucleico para uso terapêutico, que normalmente é produzida por meios diferentes da extração direta de uma fonte biológica natural (não desenvolvida).

[0022] O termo “células/kg”, conforme aqui utilizado, deverá ser compreendido como o número de células (por exemplo, MSC) administradas por quilograma do peso corporal do paciente.

[0023] O termo “constitutivamente” é compreendido por significar a expressão de um gene sem qualquer indução específica.

[0024] O termo “cultura” se refere ao crescimento de células ou organismos, entidades multicelulares ou tecido em um meio. O termo “cultura” se refere a qualquer método de obtenção de tal crescimento e pode compreender diversas etapas. O termo “cultura adicional” se refere à cultura de uma célula ou organismo, entidade multicelular ou tecido para um determinado estágio de crescimento, usando então outro método de cultura para trazer a dita célula ou organismo, entidade multicelular ou tecido para outro estágio de crescimento. Uma “cultura celular” se refere ao crescimento de células in vitro. Em tal cultura, as células se proliferam, mas não se organizam em tecido por si só. Uma “cultura tecidual” se refere à manutenção ou crescimento de tecido, por exemplo, explantes de órgão primordial ou de um órgão adulto in vitro de modo a preservar sua arquitetura e função. Uma “cultura monocamada” se refere a uma cultura na qual as células se multiplicam em um meio adequado enquanto se fixam principalmente umas às outras e a um substrato. Além disso, uma “cultura de suspensão” se refere a uma cultura na qual as células se multiplicam enquanto estão suspensas em um meio adequado. Da mesma forma, uma “cultura de fluxo contínuo” se refere à cultura de células ou explantes em um fluxo contínuo de meio fresco para manter o crescimento celular, por exemplo, viabilidade. O termo “meio condicionado” se refere ao sobrenadante, por exemplo, sem as células/tecido em cultura, resultando após um período em contato com as células em cultura, de modo que o meio tenha sido alterado para incluir determinados fatores parácrinos e/ou autócrinos produzidos pelas células e secretados na cultura. Uma “cultura confluente” é uma cultura celular na qual todas as células estão em contator e, assim, toda a superfície do recipiente de cultura está coberta, e implica que as células também atingiram sua densidade máxima, embora a confluência não signifique necessariamente que a divisão cessará ou que a população não aumentará de tamanho.

[0025] O termo “meio de cultura” ou “meio” é reconhecido na técnica e se refere geralmente a qualquer substância ou preparação usada para a cultura de células vivas. O termo “meio”, conforme usado em referência a uma cultura celular, inclui os componentes do ambiente que circunda as células. Os meios podem ser sólidos, líquidos, gasosos ou uma mistura de fases e materiais. Os meios incluem meios de crescimento líquido, bem como meios líquidos que não mantêm o crescimento celular. Os meios também incluem meios gelatinosos, como agar, agarose, gelatina e matrizes de colágeno. Os meios gasosos exemplares incluem a fase gasosa em que as células crescem em uma placa de Petri ou outro suporte sólido ou semissólido que são expostos. O termo “meio” também se refere ao material que é pretendido para uso em uma cultura celular, mesmo se ainda não tiver entrado em contato com as células. Em outras palavras, um líquido rico em nutriente preparado para cultura bacteriana é um meio. Da mesma forma, uma mistura em pó que quando misturada à água ou outro líquido se torna adequada para cultura celular pode ser denominada um “meio em pó”. “Meio definido” se refere a meios que são feitos de componentes quimicamente definidos (geralmente purificados). “Meios definidos” não contêm extratos biológicos mal caracterizados, como extrato de levedura e caldo de carne. “Meio rico” inclui meios que são destinados a suportar o crescimento da maioria ou todas as formas viáveis de uma espécie em particular. Os meios ricos geralmente incluem extratos biológicos complexos. Um “meio adequado para crescimento de uma cultura de alta densidade” é qualquer meio que permite que uma cultura celular atinja um OD600 de 3 ou mais quando outras condições (como temperatura e taxa de transferência de oxigênio) permitem tal crescimento. O termo “meio basal” se refere a um meio que promove o crescimento de muitos tipos de microorganismos que não exigem nenhum suplemento nutricional especial. A maioria dos meios basais geralmente compreende quatro grupos químicos básicos: aminoácidos, carboidratos, sais inorgânicos e vitaminas. Um meio basal geralmente serve como a base para um meio mais complexo, ao qual os suplementos como soro, tampões, fatores de crescimento, lipídio e similares são adicionados. Os exemplos de meios basais incluem, entre outros, Meio Basal de Eagle, Meio Essencial Mínimo, Meio Eagle Modificado de Dulbecco, Meio 199, Misturas Nutricionais Ham F-10 e Ham F-12, 5A de McCoy, MEM/F-I 2 de Dulbecco, RPMI 1640 e Meio Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM).

[0026] Os termos “compreender” e “compreendendo” são utilizados no sentido inclusivo e aberto, significando que os elementos adicionais podem ser incluídos.

[0027] O termo “expandido”, conforme aqui utilizado, quando se refere a células deve-se considerar que possua seu significado habitual na técnica, isto é, células que foram proliferadas in vitro. Uma MSC pode ser expandida para prover uma população de células que preservam pelo menos uma função biológica da MSC, normalmente a capacidade de se fixar a uma superfície plástica, em condições de cultura padrão. A população de células expandidas pode preservar a capacidade de se diferenciar em um ou mais tipos de células.

[0028] O termo “inclusive” é aqui utilizado para significar “inclusive, entre outros”. “Inclusive” e “inclusive, entre outros” são usados indistintivamente.

[0029] “Marcador” se refere a uma molécula biológica cuja presença, concentração, atividade ou estado de fosforilação pode ser detectado e usado para identificar o fenótipo de uma célula.

[0030] “Células estromais mesenquimais (também mencionadas aqui como “MSCs”)” são células estromais multipotentes, ou seja, elas são células capazes de dar origem a vários tipos diferentes de células.

[0031] Um “paciente”, “indivíduo” ou “hospedeiro” a ser tratado pelo método tópico pode significar tanto um humano quanto animal não humano.

[0032] O termo “composição farmacêutica” se refere a uma composição pretendida para uso em terapia. As composições da invenção são composições farmacêuticas pretendidas para uso no tratamento de SIRS, sepse, sepse grave, choque séptico e condições similares a sepse. As composições da invenção podem incluir, em adição às MSCs, componentes não celulares. Os exemplos de tais componentes não celulares incluem, entre outros, meios de cultura celular, que podem compreender um ou mais dentre proteínas, aminoácidos, ácidos nucleicos, nucleotídeos, coenzima, antioxidantes e metais.

[0033] A oração “farmaceuticamente aceitável” é empregada aqui para se refere a estes compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, no escopo de avaliação clínica sólida, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, compatível com uma relação de risco/benefício razoável.

[0034] A oração “veículo farmaceuticamente aceitável”, conforme aqui utilizado, significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, como um enchimento líquido ou sólido, diluente, excipiente ou material de encapsulamento de solvente, envolvido no suporte ou transporte do composto tópico de um órgão, ou parte do corpo, para outro órgão, ou parte do corpo. Cada veículo deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com outros componentes da formulação e não nocivo ao paciente.

[0035] O termo “fenótipo” se refere às características visíveis de uma célula, como tamanho, morfologia, expressão proteica, etc.

[0036] “Proliferação” se refere a um aumento no número de célula. “Proliferando” e “proliferação” se referem às células submetidas à mitose.

[0037] “Refratário” deve ser compreendido como não tendo benefício clínico significativo quando usado no tratamento de doenças, por exemplo, sem melhora significativa ou melhoria de sintomas ou recidiva subsequente da doença.

[0038] Conforme aqui utilizado, o termo “solução” inclui um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável no qual as MSCs usadas na invenção permanecem viáveis.

[0039] O termo “substancialmente puro”, em relação às populações de MSC, refere-se a uma população de células na qual pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90% ou pelo menos aproximadamente 95%, por número das células são MSCs. Em outras palavras, o termo “substancialmente puro”, em relação às populações de MSC, refere-se a uma população de células que contém menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10% menos de aproximadamente 5% por número de células de linhagem comprometida.

[0040] “Suporte”, conforme aqui utilizado, refere-se a qualquer dispositivo ou material que pode servir como uma base ou matriz para o crescimento de células tronco estromais derivadas de tecido adiposo.

[0041] “Agente terapêutico” ou “terapêutico” se refere a um agente capaz de possuir um efeito biológico desejável em um hospedeiro. Agentes quimioterápicos e genotóxicos são exemplos de agentes terapêuticos que normalmente são conhecidos como de origem química, em oposição ao biológico, ou causam um efeito terapêutico por um mecanismo particular de ação, respectivamente. Os exemplos de agentes terapêuticos de origem biológica incluem fatores de crescimento, hormônio e citocinas. Uma variedade de agentes terapêuticos é conhecida na técnica e pode ser identificada por seus efeitos. Determinados agentes terapêuticos são capazes de regular a proliferação e diferenciação celular. Os exemplos incluem nucleotídeos quimioterápicos, drogas, hormônios, proteínas não específicas (não anticorpo), oligonucleotídeos (por exemplo, oligonucleotídeos antissentido que se ligam a uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, sequência de mRNA), peptídeos e peptidomiméticos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0042] A invenção prove uma composição que compreende células estromais mesenquimais (MSCs) para o uso no tratamento de sepse em um indivíduo. Em uma realização adicional, a invenção também prove o uso de células estromais mesenquimais (MSCs) na manufatura de um medicamento para o tratamento de sepse em um indivíduo. Em outra realização, a invenção também prove um método de tratamento de sepse em um indivíduo que compreende a administração de células estromais mesenquimais (MSCs) ao indivíduo. Será compreendido que um “indivíduo” no contexto desta invenção normalmente é um indivíduo que precisa de tratamento. Da mesma forma, a invenção também prove um método de tratamento de sepse em um indivíduo que precisa deste que possui ou subsequente à pneumonia, compreendendo a administração de células estromais mesenquimais (MSCs) ao indivíduo.

[0043] Preferencialmente, a dita sepse é associada a, causada por ou subsequente a uma condição pulmonar inflamatória, normalmente pneumonia. Em uma realização, a sepse é secundária à pneumonia. Preferencialmente, a dita sepse é sepse grave e é associada a, causada por ou subsequente a uma condição pulmonar inflamatória, normalmente pneumonia. Em uma realização, a sepse é sepse grave que é secundária à pneumonia. A dita pneumonia pode ser causada por fungos, bactérias ou vírus. Em uma realização, a pneumonia é causada por bactéria, por exemplo, bactérias Gram negativas (pneumonia Gram negativa). As bactérias Gram negativas podem compreender a espécie Klebsiella, por exemplo, a espécie Klebsiella pneumoniae, como Klebsiella pneumoniae sorotipo 2. Em outras realizações, a pneumonia é causada por Streptococcus pneumonia, em realizações alternativas, pneumonia pode ser causada por Haemophilus influenzae, Chlamydophila pneumonia, Legionella pneumophila ou os fungos Pneumocystis jiroveci. A pneumonia pode ser adquirida na comunidade, associada aos cuidados com a saúde, nosocomial ou pneumonia associada ao ventilador. A pneumonia pode ser pneumonia lobar, pneumonia brônquica ou pneumonia intersticial aguda.

[0044] Descobriu-se que as MSCs conferem efeito imunomodulador to, particularmente em locais de inflamação. Descobriu-se que as MSCs administradas via exógena normalmente se instalam nos pulmões. Portanto, as MSCs são particularmente eficazes no tratamento de sepse que é secundária a uma condição pulmonar inflamatória, como pneumonia.

[0045] Os exemplos mostram que a administração intravenosa de ASCs reduz a gravidade da sepse associada à pneumonia, por exemplo, por meio da redução de cargas bacterianas em diversos órgãos, inclusive sangue e pulmões, e redução dos níveis citocina e quimiocina nos pulmões.

[0046] Da mesma forma, em uma realização, a invenção prove MSCs, por exemplo, ASCs, para o uso em um método de tratamento de sepse associada à pneumonia em um indivíduo humano em que a administração, por exemplo, por injeção intravenosa, de MSCs reduz a carga bacteriana total (UFC/ml) sistêmica (por exemplo, sangue) a níveis estatisticamente significativos, por exemplo, por um fator de 10 ou mais, por exemplo, por um fator de 50 ou mais ou por um fator de 100 ou mais em comparação a cargas bacterianas totais sistêmicas típicas em indivíduos não submetidos a tratamento. As cargas bacterianas totais podem ser determinadas por métodos bem conhecidos pelo perito na técnica, por exemplo, cultura bacteriana semiquantitativa ou PCR quantitativa.

CÉLULAS DA INVENÇÃO

[0047] As MSCs são células estromais não diferenciadas que possuem a capacidade de se diferenciar de outras células e são normalmente derivadas do tecido conjuntivo, e são, portanto, células não hematopoiéticas. O termo “tecido conjuntivo” se refere ao tecido derivado do mesênquima e inclui diversos tecidos que são caracterizados por suas células estarem incluídas na matriz extracelular. Entre os diferentes tipos de tecidos conjuntivos, os tecidos adiposos e cartilaginosos estão incluídos. Em uma realização, as MSCs derivam da fração estromal do tecido adiposo. Em outra realização, as MSCs são obtidas dos condrócitos, por exemplo, da cartilagem hialina. Em outra realização, as MSCs são obtidas da pele. Além disso, em outra realização, as MSCs são derivadas da medula óssea. As fontes alternativas de MSCs incluem, entre outros, periósteo, polpa dentária, baço, pâncreas, ligamento, tendão, músculo esquelético, cordão umbilical e placenta.

[0048] As MSCs podem ser obtidas de qualquer fonte adequada e de qualquer animal adequado, inclusive humanos. Normalmente, as ditas células são obtidas dos tecidos conjuntivos mamíferos pós-natal. Em uma realização preferida, as MSCs são obtidas de uma fonte de tecido conjuntivo, como a fração estromal de tecido adiposo, cartilagem hialina, medula óssea, pele, etc. Além disso, em uma realização em particular, as MSCs são de um mamífero, por exemplo, um roedor, primata, etc., preferencialmente de um humano. Normalmente, as MSCs são obtidas da fração estromal de tecido adiposo humano, ou seja, são células estromais derivadas do tecido adiposo (ASCs).

[0049] As MSCs são aderentes ao plástico em condições de cultura padrão.

[0050] As MSCs são células multipotentes não diferenciadas que possuem a capacidade de se diferenciar em ou para células somáticas, como células mesodérmicas (por exemplo, adiposa, condrócitos, osteoblastos) e opcionalmente em ou para tipos ou linhagens celulares endodérmicas e/ou ectodérmicas. Normalmente, as células possuem a capacidades de se diferencial em ou para pelo menos dois ou todos os tipos de célula selecionados dentre o grupo que consiste de linhagens adipocíticas, condroblásticas e osteoblásticas.

[0051] Em uma realização, as MSCs podem ser células tronco, normalmente células tronco derivadas de tecido adiposo. Normalmente, as MSCs (i) não expressam marcadores específicos de APCs; (ii) não expressam IDO constitutivamente e (iii) não expressam de forma significativa MHC II constitutivamente. Normalmente, a expressão de IDO ou MHC II pode ser induzida pelo estímulo com IFN-Y.

[0052] Normalmente, as MSCs podem expressar um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quarto ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou dez ou mais (por exemplo, até 13)) dos marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 e CD105. Por exemplo, as MSCs podem expressar um ou mais (por exemplo, dois, três ou todos) dos marcadores CD29, CD59, CD90 e CD105, por exemplo, CD59 e/ou CD90.

[0053] Normalmente, as MSCs podem não expressar um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quarto ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou dez ou mais (por exemplo, até 15)) dos marcadores Fator VIII, alfa-actina, desmina, S-100, queratina, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 e CD133, por exemplo, as MSCs não expressam um ou mais (por exemplo, dois, três ou todos) dos marcadores CD34, CD45, CD31 e CD14, por exemplo, CD31 e/ou CD34.

MSC EXPANDIDA

[0054] Em uma realização, as MSCs são MSCs expandidas em cultura in vitro ou a progênie expandida de cultura in vitro desta (doravante ambas são denominadas MSCs expandidas ou “eMSC”). Os métodos para a preparação de eMSCs são conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito na WO2007039150. As eMSCs mantém diversas características fenotípicas das MSCs, por exemplo, as eMSCs são aderentes ao plástico em condições de cultura padrão e mantêm um fenótipo não diferenciado.

[0055] As eMSCs são células multipotentes não diferenciadas que possuem a capacidade de diferenciar em células somáticas, como células mesodérmicas. Considerando que as MSCs possuem a capacidade de se diferenciar em pelo menos uma ou mais linhagens celulares especializadas, como, entre outros, linhagens adipocíticas, condroblásticas e osteoblásticas, normalmente em eMSCs, esta capacidade de se diferenciar é reduzida ou pode até não estar presente, por exemplo, enquanto as MSCs podem se diferenciar em pelo menos as linhagens osteogênicas e adipocíticas, as eMSCs derivadas destas podem se diferenciar apenas em linhagem adipocítica. Isto pode ser vantajoso para aplicações terapêuticas das células, onde as células podem ser administradas a pacientes, uma vez que pode se esperar de forma razoável que a diferenciação imprevista e potencialmente nociva das eMSCs será menos provável de ocorrer.

[0056] Em uma realização, as eMSCs podem ser a progênie de células tronco. Normalmente, as eMSCs (i) não expressam marcadores específicos das APCs; (ii) não expressam IDO constitutivamente e (iii) não expressam de forma significativa MHC II constitutivamente. Normalmente, a expressão de IDO ou MHC II pode ser induzida pelo estímulo com IFN-Y.

[0057] Normalmente, as eMSCs podem expressar um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quarto ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou dez ou mais (por exemplo, até 13)) dos marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 e CD105, por exemplo, as MSCs podem expressar um ou mais (por exemplo, dois, três ou todos) dos marcadores CD29, CD59, CD90 e CD105, por exemplo, CD59 e/ou CD90.

[0058] Normalmente, as eMSCs podem não expressar um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quarto ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou dez ou mais (por exemplo, até 15)) dos marcadores Fator VIII, alfa-actina, desmina, S-100, queratina, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 e CD133, por exemplo, as MSCs não expressão um ou mais (por exemplo, dois, três ou todos) dos marcadores CD34, CD45, CD31 e CD14, por exemplo, CD31 e/ou CD34. Além disso, as MSCs podem não expressar opcionalmente o marcador STRO-1.

POPULAÇÕES CELULARES

[0059] Em um aspecto, a presente invenção prove populações de MSCs e/ou eMSCs para usos terapêuticos, conforme aqui descrito, estas populações pode ser doravante denominadas como “populações celulares da invenção”. Normalmente, as MSCs são ASCs humanas expandidas, normalmente ASCs humanas expandidas alogênicas. Normalmente, as populações celulares da invenção são uma população homogênea ou substancialmente homogênea de MSCs e/ou eMSCs. As populações celulares da invenção compreendem-se ou compreendem-se essencialmente de MSCs e/ou eMSCs, no entanto, as populações celulares da invenção também podem compreender outros tipos de células . De forma adequada, em uma realização, a invenção prove populações celulares da invenção, nas quais pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 55%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 65%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98% ou pelo menos aproximadamente 99% das células são MSCs e/ou eMSCs.

[0060] Normalmente, as populações celulares da invenção são uma população expandida em cultura de MSCs, compreendendo-se ou compreendendo-se essencialmente de eMSCs, no entanto, as populações celulares da invenção também podem compreender outros tipos de células. Da mesma forma, em uma realização, a invenção prove populações celulares da invenção, nas quais pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 55%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 65%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98% ou pelo menos aproximadamente 99% das células são eMSC. Em uma realização, as eMSCs são eASCs, por exemplo, eASCs humanas. Em uma realização em particular, as células são alogênicas em relação ao indivíduo a ser tratado.

[0061] Normalmente, a população celular da invenção pode ter a capacidade de se diferenciar em pelo menos uma ou mais linhas celulares especializadas, como, entre outros, linhagens adipocíticas, condroblásticas e osteoblásticas. Em uma realização, uma população celular da invenção pode ter a capacidade de se diferenciar em ou para pelo menos dois ou todos os tipos de células selecionados dentre o grupo que consiste de linhagens adipocíticas, condroblásticas e osteoblásticas. No entanto, em uma realização alternativa, esta capacidade de se diferenciar é reduzida ou pode até estar ausente, por exemplo, enquanto uma MSC pode se diferenciar em pelo menos as linhagens osteogênicas e adipocíticas, a população de eMSC derivada desta pode se diferenciar apenas em linhagem adipocítica. Isto pode ser vantajoso para aplicações terapêuticas das células onde as células podem ser administradas a pacientes, uma vez que se pode esperar razoavelmente que a diferenciação imprevista e potencialmente nociva das eMSCs será menos provável de ocorrer.

[0062] Normalmente, uma população celular da invenção pode expressar um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quarto ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou dez ou mais (por exemplo, até 13)) dos marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 e CD105, por exemplo, as MSCs podem expressar um ou mais (por exemplo, dois, três ou todos) dos marcadores CD29, CD59, CD90 e CD105, por exemplo, CD59 e/ou CD90. Da mesma forma, em uma realização, a invenção prove uma população celular da invenção na qual pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 55%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 65%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98% ou pelo menos aproximadamente 99% das células expressam um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou dez ou mais (por exemplo, até 13)) dos marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 e CD105, por exemplo, as MSCs podem expressar um ou mais (por exemplo, dois, três ou todos) dos marcadores CD29, CD59, CD90 e CD105, por exemplo, CD59 e/ou CD90. Em uma realização alternativa, a invenção prove populações celulares da invenção nas quais o nível de expressão de um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou dez ou mais (por exemplo, até 13)) dos marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 e CD105 é pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 55%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 65%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98% ou pelo menos aproximadamente 99%, por exemplo, uma população celular da invenção pode expressar um ou mais (por exemplo, dois, três ou todos) dos marcadores CD29, CD59, CD90 e CD105, por exemplo, CD59 e/ou CD90 no nível mencionado acima.

[0063] Normalmente, uma população celular da invenção pode não expressar um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou dez ou mais (por exemplo, até 15)) dos marcadores Fator VIII, alfa- actina, desmina, S-100, queratina, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 e CD133, por exemplo, as MSCs não expressam um ou mais (por exemplo, dois, três ou todos) dos marcadores CD34, CD45; CD31; CD14, por exemplo, CD31 e/ou CD34. Além disso, as MSCs podem opcionalmente não expressar o marcador STRO-1.

[0064] Da mesma forma, em uma realização, a invenção prove uma população celular da invenção na qual pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 55%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 65%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98% ou pelo menos aproximadamente 99% das células não expressam um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou dez ou mais (por exemplo, até 15)) dos marcadores Fator VIII, alfa-actina, desmina, S-100, queratina, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 e CD133, por exemplo, as MSCs podem expressar um ou mais (por exemplo, dois, três ou todos) dos marcadores CD34, CD45, CD31 e CD14, por exemplo, CD31 e/ou CD34. Em uma realização alternativa, a invenção prove populações celulares da invenção nas quais o nível de expressão de um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou dez ou mais (por exemplo, até 15)) dos marcadores Fator VIII, alfa-actina, desmina, S-100, queratina, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 e CD133 está abaixo de pelo menos aproximadamente 35%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 5%, pelo menos aproximadamente 1%, por exemplo, as populações celulares da invenção podem expressar um ou mais (por exemplo, dois, três ou todos) dos marcadores CD34, CD45, CD31 e CD14, por exemplo, CD31 e/ou CD34 no nível mencionado acima.

[0065] Em algumas realizações, as MSCs ou eMSCs são pré-estimuladas a fim de potencializar uma ou mais de sua capacidade de proliferação, capacidade de migração, capacidade de sobrevida, efeito terapêutico e propriedades imunorreguladoras. Normalmente, pelo menos aproximadamente 40% (por exemplo, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95% pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98% ou pelo menos aproximadamente 99%) das populações celulares da invenção são pré-estimuladas a fim de potencializar uma ou mais de sua capacidade de proliferação, capacidade de migração, capacidade de sobrevida, efeito terapêutico e propriedades imunorreguladoras. Em algumas realizações, o pré-estímulo pode ser atingido pelo contato das MSCs com uma citocina. Em algumas realizações da invenção, o pré-estímulo pode ser atingido pelo contator das MSCs com IFN-Y.

COMPOSIÇÕES DA INVENÇÃO

[0066] Em uma realização, a presente invenção prove composições que compreendem populações celulares da invenção para uso em métodos de tratamento de acordo com a presente invenção. Preferiu-se que a dita composição seja uma composição farmacêutica. Uma composição da invenção pode incluir uma população substancialmente pura de MSCs ou eMSCs, por exemplo, uma população substancialmente pura de ASCs ou eASCs, por exemplo, eASCs humanas. As MSCs, eMSCs, ASCs ou eASCs podem ser células tronco. A composição da presente invenção também pode incluir componentes de cultura celular, por exemplo, meios de cultura que incluem um ou mais dentre aminoácidos, metais e Fatores de coenzima. A composição pode incluir pequenas populações de outras células estromais. A composição também pode incluir outros componentes não celulares, os quais podem suportar o crescimento e sobrevida das MSCs em circunstâncias particulares, por exemplo, implantação, crescimento em cultura contínua ou uso como material ou composição biológica.

[0067] A concentração das MSCs e/ou eMSCs na composição da invenção pode ser pelo menos aproximadamente 1 x 104 células/mL, pelo menos aproximadamente 1 x 105 células/mL, pelo menos aproximadamente 1 x 106 células/mL, pelo menos aproximadamente 10 x 106 células/mL ou pelo menos aproximadamente 40 x 106 células/mL. Normalmente, a concentração entre aproximadamente 1 x 106 células/mL e 1 x 107 células/mL, por exemplo, entre aproximadamente 5 x 106 células/mL e 1 x 107 células/mL.

[0068] As composições da invenção compreenderão normalmente um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. Os exemplos de tais veículos e diluentes são bem conhecidos na técnica e podem incluir: açúcares, como lactose, glicose e sacarose; amidos, como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes, como, manteiga de cacau e ceras para supositórios; óleos, como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite de oliva, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, como propileno glicol; polióis, como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; ésteres, como oleato de etila e laurato de etila; agar; agentes tampão, como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água isenta de pirogênio; solução fisiológica isotônica; solução de Ringer; álcool etil; soluções tamponadas com pH; poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; e demais substâncias não tóxicas compatíveis empregadas nas formulações farmacêuticas. Normalmente, as composições da invenção compreendem DMEM como o veículo, o qual pode ser opcionalmente complementado com soro (por exemplo, HSA) a uma concentração de, por exemplo, até aproximadamente 5%, até aproximadamente 10%, até aproximadamente 15%, até aproximadamente 20%, até aproximadamente 25%, até aproximadamente 30%.

[0069] Uma composição da invenção pode ser estéril e/ou fluido na medida em que existe uma fácil saída injetável. Além disso, a composição pode ser estável em condições de manufatura e armazenamento e conservada contra ação de contaminação de microorganismos como bactérias e fungos através do uso de, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico e timerosal.

MÉTODOS DE PREPARAÇÃO

[0070] Os métodos para o isolamento e cultura das MSCs para prover eMSCs e populações celulares da invenção e composições que compreendem populações celulares da invenção são conhecidos na técnica. Normalmente, os métodos para a preparação de composições que compreendem populações celulares compreendem as etapas a seguir: (i) isolamento das MSCs a partir do tecido e seleção por aderência a uma superfície adequada, por exemplo, plástica (ii) expansão das MSCs para prover populações celulares da invenção compreendendo eMSCs. Opcionalmente, as populações celulares da invenção pode ser criopreservadas durante e/ou subsequente à etapa de expansão (ii). Opcionalmente, o fenótipo das populações celulares da invenção pode ser avaliado durante e/ou subsequente à etapa de expansão (ii). Opcionalmente, as populações celulares da invenção podem ser isoladas subsequentemente à etapa de expansão (ii) e resuspensas em um veículo e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

[0071] As MSCs para uso na invenção podem ser isoladas a partir de qualquer tecido adequado, como, entre outros, sangue periférico, medula óssea, placenta, tecido adiposo, periósteo, polpa dentária, baço, pâncreas, ligamento, pele, tendão, músculo esquelético, cordão umbilical e placenta. Em uma realização preferida, as MSCs são obtidas a partir de uma fonte de tecido conjuntivo, como a fração estromal de tecido adiposo, cartilagem hialina, medula óssea, pele, etc.

[0072] Em uma realização, as MSCs são derives de fração estromal do tecido adiposo. Em outra realização, as MSCs são derivadas de condrócitos, por exemplo, da cartilagem hialina. Em outra realização, as MSCs são obtidas da pele. Além disso, em outra realização, as MSCs são obtidas da medula óssea.

[0073] As MSCs podem ser obtidas de qualquer fonte adequada e de qualquer animal adequado, inclusive seres humanos. Normalmente, as ditas células são obtidas de tecidos conjuntivos mamíferos pós-natal.

[0074] As MSCs também podem ser isoladas de qualquer organismo de espécies iguais ou diferentes às do indivíduo. Qualquer organismo com MSCs pode ser um candidato em potencial. Em uma realização, o organismo pode ser mamífero, e em outra realização, o organismo é humano.

[0075] As MSCs derivadas de tecido adiposo podem ser obtidas por quaisquer meios padrão na técnica. Normalmente, as ditas células são obtidas dissociando as células do tecido fonte (por exemplo, lipoaspirado ou tecido adiposo), normalmente pelo tratamento do tecido com uma enzima digestiva, como colagenase. A material de tecido digerida é então normalmente filtrada por meio de um filtro entre aproximadamente 20 mícrons a 1 mm. As células são então isoladas (normalmente por centrifugação) e submetidas à cultura em uma superfície aderente (normalmente placas ou frascos de cultura tecidual). Tais métodos são conhecidos na técnica e, por exemplo, conforme revelado na patente norte- americana no 6777231. De acordo com esta metodologia, os lipoaspirados são obtidos do tecido adiposo e das células derivadas deste. No decorrer desta metodologia, as células podem ser enxaguadas para remover detritos contaminantes e hemácias, preferencialmente com PBS. As células são digeridas com colagenase (por exemplo, a 37°C por 30 minutos, 0,075% de colagenase; Tipo I, Invitrogen, Carlsbad, CA) em PBS. Para eliminar as hemácicas restantes, a amostra digerida pode ser enxaguada (por exemplo, com soro bovino fetal a 10%), tratada com 160 mmol/L de ClNH4, e finalmente suspensa em meio DMEM completo (DMEM contendo 10% de FBS, 2 mmol/L de glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina). As células podem ser filtradas através de uma malha de nylon de 40 μm.

[0076] As células são submetidas à cultura em um recipiente de cultura adequado, compreendendo uma superfície adequada para a aderência das MSCs, por exemplo, plástica. As células não aderentes são removidas, por exemplo, por enxague em um tampão adequado para prover uma população isolada de células estromais aderentes (por exemplo, MSCs). As células isoladas desta forma podem ser cultivadas (preferencialmente 2 a 3 x 104células/cm2) nos fracos de cultura tecidual e expandidas a 37°C e 5% de CO2, trocando o meio de cultura a cada 3 a 4 dias. As células são passadas preferencialmente para um novo frasco de cultura (1.000 células/cm2) quando as culturas atingem 90% de confluência.

[0077] O isolamento celular é preferencialmente realizado em condições estéreis ou de boas práticas de fabricação.

[0078] Em determinadas realizações, as células podem ser cultivadas por pelo menos aproximadamente 15 dias, pelo menos aproximadamente 20 dias, pelo menos aproximadamente 25 dias ou pelo menos aproximadamente 30 dias. Normalmente, a expansão de células na cultura melhora a homogeneidade do fenótipo celular na população celular, de modo que seja obtida uma população substancialmente pura ou homogênea.

[0079] As células são preferencialmente separadas da superfície aderente (por exemplo, por meio de tripsina) e transferidas para um novo recipiente de cultura (passagem) quando as culturas atingem aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de confluência.

[0080] Em determinadas realizações, as células são multiplicadas em cultura por pelo menos três passagens de cultura ou “passagem em pelo menos três vezes”. Em outras realizações, as células são submetidas à passagem pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos seis vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos nove vezes ou pelo menos dez vezes.

[0081] Em determinadas realizações, as células são expandidas em cultura por pelo menos três duplicações populacionais. Em determinadas realizações, as células são expandidas em cultura por pelo menos quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou 15 duplicações populacionais. Em determinadas realizações, as células são expandidas em cultura por menos de sete, oito, nove, dez ou 15 duplicações populacionais. Em determinadas realizações, as células são expandidas em cultura entre aproximadamente 5 e 10 duplicações populacionais.

[0082] As células podem ser cultivadas por qualquer técnica para a cultura de células tronco estromais. Uma discussão de diversas técnicas de cultura, bem como seu escalonamento, pode ser encontrada em Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4a Edição, Wiley-Liss 2000. As células podem ser expandidas usando frascos de cultura ou biorreatores adequados para expansão em larga escala. Os biorreatores adequados para a expansão em larga escala de células estromais mesenquimais estão comercialmente disponíveis e podem incluir biorreatores de expansão tanto 2D (ou seja, substancialmente planar) quanto 3D. Os exemplos de tais biorreatores incluem, entre outros, um biorreator pistão, um biorreator de perfusão, um biorreator de tanque de agitação contínua, um biorreator de leito fixo.

[0083] Em determinadas realizações, as células são cultivadas por cultura monocamada. Qualquer meio capaz de suportar as MSCs na cultura tecidual pode ser utilizado. As formulações de meios que suportarão o crescimento das MSCs incluem, entre outros, Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), Meio Essencial Mínimo alfa modificado (αMEM) e Meio do Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI Meio 1640). Normalmente, 0 a 20% de soro bovino fetal (FBS) será adicionado aos meios acima para suporta o crescimento das células estromais. No entanto, um meio definido poderia ser utilizado se os fatores de crescimento, citocinas e hormônios necessários no FBS para células estromais e condrócitos são identificados e providos em concentrações apropriadas no meio de crescimento. Os meios úteis nos métodos da invenção podem conter um ou mais compostos de interesse, inclusive, entre outros, antibióticos, compostos mitogênicos ou de diferenciação para células estromais. As células da invenção podem ser cultivadas a temperaturas entre 31°C e 37°C em uma incubadora umidificada. O teor de dióxido de carbono pode ser mantido entre 2% e 10% e o teor de oxigênio pode ser mantido entre 1% e 22%.

[0084] Os antibióticos que podem ser adicionados ao meio incluem, entre outros, penicilina e estreptomicina. A concentração de penicilina no meio de cultura quimicamente definido pode ser aproximadamente 10 a aproximadamente 200 unidades por mL. A concentração de estreptomicina no meio de cultura quimicamente definido pode ser aproximadamente 10 a aproximadamente 200 ug/mL.

[0085] Normalmente, as MSCs, conforme utilizadas nos métodos da presente invenção, são populações celulares expandidas, preferencialmente, as ditas células são expandidas para prover uma população substancialmente pura ou homogênea.

[0086] Em uma realização, as ditas populações celulares são expandidas até a expressão do marcador CD34 ser reduzida em comparação às células não expandidas recém isoladas. Por exemplo, a população celular é expandida até a expressão do marcador CD34 ser reduzida a um nível de menos de 50%, menos de 35%, menos de 30% ou menos de 5%, por exemplo, 35 a 5% ou 20 a 10% de células na população. Normalmente, a população celular é expandida até a expressão do marcador CD34 ser reduzida a um nível de menos de 5% de células na população. Portanto, uma população de eMSCs da invenção compreende menos de 50%, menos de 35%, menos de 30% ou menos de 5%, por exemplo, 35 a 5% ou 20 a 10% de células que expressão CD34.

[0087] Em uma realização, as ditas populações celulares são expandidas até a expressão do marcador STRO-1 ser reduzida em comparação às células não expandidas recém isoladas. Por exemplo, a população celular é expandida até a expressão do marcador STRO-1 ser reduzida a um nível de menos de 50%, menos de 35%, menos de 30% ou menos de 5%, por exemplo, 35 a 5% ou 20 a 10% de células na população. Normalmente, a população celular é expandida até a expressão do marcador STRO-1 ser reduzida a um nível de menos de 5% de células na população. Portanto, uma população de eMSCs da invenção compreende menos de 50%, menos de 35%, menos de 30% ou menos de 5%, por exemplo, 35 a 5% ou 20 a 10% de células que expressam STRO-1.

[0088] Normalmente, as populações celulares são expandidas até a expressão dos marcadores CD34 e STRO-1 ser reduzida em comparação às células não expandidas recém isoladas. Por exemplo, a população celular é expandida até a expressão dos marcadores CD34 e STRO-1 ser reduzida a um nível de menos de 50%, menos de 35%, menos de 30% ou menos de 5%, por exemplo, 35 a 5% ou 20 a 10% de células na população. Normalmente, a população celular é expandida até a expressão dos marcadores CD34 e STRO-1 ser reduzida a um nível de menos de 5% de células na população. Portanto, uma população de eMSCs da invenção compreende menos de 50%, menos de 35%, menos de 30% ou menos de 5%, por exemplo, 35 a 5% ou 20 a 10% de células que expressam CD34 e STRO-1.

[0089] As populações de MSC expandida (por exemplo, aquelas que expressam 5% ou menos de CD34 e/ou STRO- 1) são vantajosas, uma vez que apresentam uma multipotência mais baixa que as células recém isoladas, ou seja, podem ter uma capacidade menor, reduzida ou nenhuma capacidade de se diferenciar em outros fenótipos celulares em comparação às MSCs não expandidas de ocorrência natural.

[0090] Ficará evidente ao perito na técnica que o método para a preparação da composição da invenção não é limitante e que as composições da invenção preparadas de qualquer forma estão incluídas no escopo da invenção. Em uma realização, a invenção prove um método de preparação de uma composição da invenção, o qual compreende: (a) coleta de tecido a partir de um doador; (b) obtenção de uma suspensão celular por tratamento enzimático; (c) sedimentação da suspensão celular e nova suspensão das células em um meio de cultura; (d) cultura das células por pelo menos aproximadamente 5 dias ou 5 duplicações populacionais.

[0091] Em uma realização, as células podem ser criopreservadas antes da administração, por exemplo, durante e/ou subsequentemente à expansão. Portanto, a invenção também prove células criopreservadas da invenção. Os métodos para criopreservação celular são conhecidos na técnica e normalmente exigem o uso de agentes crioprotetores adequados (por exemplo, DMSO). As células podem ser criopreservadas em qualquer momento durante os estágios de isolamento e/ou expansão e descongeladas antes da administração. Normalmente, as células podem ser criopreservadas na passagem 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 ou superior, por exemplo, as células podem ser criopreservadas nas passagens 3 a 10 ou 5 a 10. Opcionalmente, as células podem ser novamente depositadas e cultivadas antes da administração.

[0092] Em uma realização, as células podem ser isoladas da criopreservação e/ou meios de cultura e novamente suspensas em um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável antes da administração (por exemplo, DMEM, opcionalmente complementadas com soro).

[0093] Em algumas realizações, as populações celulares da invenção em uma composição da invenção podem ser pré-estimuladas para potencializar um ou mais dentre a sua capacidade de proliferação, capacidade de migração, capacidade de sobrevida, efeito terapêutico e propriedades imunorreguladoras. Em algumas realizações, o pré-estímulo pode ser obtido pelo contato das MSCs com uma citocina. Em algumas realizações da invenção, o pré-estímulo pode ser obtido pelo contato das MSCs com IFN-y.

[0094] Em determinadas realizações da invenção, as MSCs podem ser pré-estimuladas usando uma concentração de IFN-Y entre 0,1 e 100 ng/ml. Em realizações adicionais, as MSCs podem ser pré-estimuladas usando uma concentração de IFN-y entre 0,5 e 85 ng/ml, entre 1 e 70 ng/ml, entre 1,5 e 50 ng/ml, entre 2,5 e 40 ng/ml ou entre 3 e 30 ng/ml. O pré- estímulo pode ocorrer ao longo do tempo de estímulo mais longo que aproximadamente 12 horas. O pré-estímulo pode ocorrer ao longo do tempo de estímulo mais longo que aproximadamente 13 horas, mais longo que aproximadamente 18 horas, mais longo que aproximadamente 24 horas, mais longo que aproximadamente 48 horas ou mais longo que aproximadamente 72 horas.

[0095] Em uma realização, as MSCs da invenção podem ser transferidas ou convertidas de forma estável ou temporária com um ácido nucleico de interesse usando uma estratégia de vetor plasmídeo, viral ou alternativo. Os ácidos nucleicos de interesse incluem, entre outros, aqueles produtos de codificação de gene que potencializam a produção de componentes de matriz extracelular encontrados no tipo tecidual a ser reparado, por exemplo, parede intestinal ou parede vaginal.

[0096] A conversão de vetores virais que transportam genes regulatórios nas células estromais pode ser realizada com vetores virais, inclusive, entre outros, adenovírus, retrovírus ou vírus adeno-associado purificado (por exemplo, por bandagem de cloreto césio) a uma multiplicidade de infecção (unidades virais:célula) entre aproximadamente 10:1 a 2000:1. As células podem ser expostas ao vírus no meio isento de soro ou contendo soro na ausência ou presença de um detergente catiônico, como polietileneimina ou Lipofectamine™ por um período de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas (Byk T. et al. (1998) Human Gene Therapy 9:2493-2502; Sommer B. et al. (1999) Calcif. Tissue Int. 64:45-49).

[0097] Outros métodos adequados para transferência de vetores ou plasmídeos em células estromais incluem complexos de lipídio/DNA, como aqueles descritos nas patentes norte-americanas no 5.578.475; 5.627.175; 5.705.308; 5.744.335; 5.976.567; 6.020.202 e 6.051.429. Os reagentes adequados incluem Lipofectamine, uma formulação de lipossomo a 3:1 (p/p) do lipídio policatiônico 2,3-dioleiloxi-N- [2(esperminecarboxi- amido)etil]-N,N-dimetil-1- trifluoroacetato de propanamínio (DOSPA) (Nome no Registro de Resumos Químicos: N-[2-(2,5-bis[(3-aminopropil)amino]-1-- oxpentil}amino) etil]-N,N-dimetil-2,3-bis(9-octadeceniloxi)- 1-trifluoroacetato de propanamínio), e a fosfatidiletanolamina dioleoil lipídica neutra (DOPE) em água filtrada por membrana. O exemplo é a formulação Lipofectamine 2000TM (disponível da Gibco/Life Technologies no 11668019) . Os demais reagentes incluem: Reagente de Transfecção FuGENETM 6 (uma mistura de lipídios na forma não lipossômica e outros compostos em 80% de etanol, obtenível da Roche Diagnostics Corp. no 1814443); e reagente de transfecção LipoTAXITM (uma formulação de lipídio da Invitrogen Corp., no 204110). A transfecção de células estromais pode ser realizada por eletroporação, por exemplo, conforme descrito em M.L. Roach e J.D. McNeish (2002) Methods in Mol. Biol. 185:1. Os sistemas vetores virais adequados para a produção de células estromais com alterações genéticas adequadas podem ser baseados em adenovírus e retrovírus, e podem ser preparadas usando os componentes de vírus comercialmente disponíveis.

[0098] A transfecção de vetores plasmídeos que transportam genes reguladores nas MSCs pode ser atingida em culturas de monocamada pelo uso de precipitação de DNA por fosfato de cálcio ou métodos com detergente catiônico (Lipofectamine™, DOTAP) ou em cultura tridimensionais pela incorporação dos vetores de DNA plasmídeos diretamente no polímero biocompatível (Bonadio J. et al. (1999) Nat. Med. 5:753-759).

[0099] Para o rastreamento e detecção das proteínas funcionais codificadas por estes genes, os vetores de DNA viral ou plasmídeo podem conter um gene de marcador facilmente detectável, como a proteína fluorescente verde ou a enzima beta-galactosidase, ambas das quais podem ser rastreadas por meios histoquímicos.

[00100] Subsequentemente à expansão, preferiu-se que as populações celulares da invenção sejam avaliadas para determinar a expressão de marcadores característicos para confirmar seu fenótipo, que pode ser realizado usando meios convencionais.

[00101] O termo “expresso” é usado para descrever a presença de um marcador em uma célula. Para ser considerado como sendo expresso, o marcador deve estar presente a um nível detectável. Por “nível detectável” se quer dizer que o marcador pode ser detectado usando uma ou mais metodologias laboratoriais padrão, como PCR, coagulação ou análise FACS. A caracterização do marcador de superfície fenotípica de uma população de MSCs pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica. Por meio de exemplos, entre outros, esta caracterização fenotípica pode ser realizada por coloração celular individual. Tal coloração pode ser atingida através do uso de anticorpos. Isto pode ser coloração direta, pelo uso de um anticorpo rotulado ou coloração indireta, usando um segundo anticorpo rotulado contra um anticorpo primário específico para o marcador celular. A ligação ao anticorpo pode ser detectada por qualquer método conhecida na técnica. A ligação ao anticorpo também pode ser detectada pela citometria de fluxo, microscopia por imunofluorescência ou radiografia.

[00102] De forma alternativa ou adicional, um gene é considerado expresso por uma célula da população da invenção se a expressão puder ser razoavelmente detectada após 30 ciclos de PCR, o que corresponde a um nível de expressão na célula de pelo menos aproximadamente 100 cópias por célula. Os termos “expresso” e “expressão” possuem significados correspondentes. Em um nível de expressão abaixo deste limiar, um marcador é considerado não sendo expresso. A comparação entre o nível de expressão de um marcador em uma célula estromal adulta da invenção e o nível de expressão do mesmo marcador em outra célula como, por exemplo, uma célula tronco embrionária, pode preferencialmente ser conduzida pela comparação de dois tipos celulares que foram isolados a partir da mesma espécie. Preferencialmente, esta espécie é um mamífero, e mais preferencialmente, esta espécie é humana. Tal comparação pode convenientemente ser conduzida usando um experimento de reação em cadeia da polimerase e transcriptase reversa (RT-PCR).

[00103] Os marcadores de superfície celular podem ser identificados por qualquer técnica convencional adequada, geralmente baseada em uma seleção positiva/negativa; por exemplo, pode-se usar anticorpos monoclonais em oposição a marcadores de superfície celular, cuja presença/ausência nas células deve ser confirmada; embora outras técnicas também possam ser usadas. Portanto, em uma realização em particular, os anticorpos monoclonais contra um, dois, três, quarto, cinco, seis, sete dentre ou todos dentre CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 e CD105 são usados a fim de confirmar a ausência dos ditos marcadores nas células selecionadas; e os anticorpos monoclonais contra um, dois, três quatro dentre ou todos dentre o Fator VIII, alfa-actina, desmina, S-100, queratina, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 e CD133 são usados para confirmar a presença destes ou níveis de expressão detectável de pelo menos um dentre, e preferencialmente todos dentre os ditos marcadores.

[00104] Em uma realização adicional, os anticorpos monoclonais contra pelo menos um, dois, três ou todos dentre CD34; CD45; CD31; CD14, por exemplo, CD31 e/ou CD34, são usados a fim de confirmar a presença ou níveis detectáveis de expressão dos ditos marcadores. Em uma realização adicional, os anticorpos monoclonais contra CD34 são usados a fim de confirmar a ausência do dito marcador nas células selecionadas. Em uma realização adicional, os anticorpos monoclonais contra STRO-1 são usados a fim de confirmar a ausência do dito marcador nas células selecionadas. Em uma realização adicional, os anticorpos monoclonais contra pelos menos um, dois, três ou todos dentre CD29; CD59; CD90; CD105, por exemplo, CD59 e/ou CD90, são usados a fim de confirmar a presença ou níveis detectáveis de expressão destes.

[00105] Os ditos anticorpos monoclonais são conhecidos, comercialmente disponíveis ou podem ser obtidos por um perito na técnica por métodos convencionais.

[00106] A atividade IDO induzível por IFN-Y nas células selecionadas pode ser determinadas por qualquer teste convencional adequado. Por exemplo, as células selecionadas podem ser estimuladas com IFN-Y e avaliadas quanto à expressão IDO; então a análise convencional de coagulação convencional de Western para expressão proteica IDO pode ser realizada e a atividade enzimática IDO após o estímulo IFN-Y das células selecionadas pode ser medido pela conversão de triptofano em quinurenina com, por exemplo, análise por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) e determinação fotométrica de concentração de quinurenina no sobrenadante como a leitura. Como as células da invenção expressam IDO em determinadas condições, qualquer técnica adequada que permite a detecção da atividade IDO após o estímulo com IFN-Y pode ser usada para selecionar as células da invenção. Um teste adequado para determinação da atividade ID induzível por IFN-Y nas células selecionadas é revelado em WO2007039150. A quantidade de IDO produzido depende do número de células por centímetro quadrado, que está preferencialmente em um nível de 5000 células/cm2 ou mais, mas não limitado a esta concentração e a concentração de IFN- Y, que de forma ideal é de 3 ng/ml ou mais, mas não limitada a esta concentração. A atividade de IDO produzido nas condições descritas resultará em uma produção detectável de quinurenina na variação de μM após 24 horas ou mais.

ADMINISTRAÇÃO

[00107] Em uma realização, uma composição da invenção pode ser preparada para a administração sistêmica (por exemplo, via retal, nasal, oral, vaginal, por meio de um reservatório implantado ou por inalação). Em outra realização, uma composição da invenção pode ser preparada para administração local. Uma composição da invenção pode ser administrada por via parenteral. Uma composição pode ser administrada por via subcutânea, intracutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrasinuvial, intraesternal, intratecal, intralesional, intralinfática e vias intracranianas. A via de administração preferida é a intravenosa. As MSCs preferidas são as ASCs.

[00108] Portanto, a invenção prove MSCs, como ASCs, para o uso no tratamento de sepse secundária à pneumonia em um paciente em que as MSCs devem ser administradas via intravenosa. Normalmente, o paciente é um ser humano.

[00109] Em uma realização, a invenção prove ASCs para o uso no tratamento de sepse secundária à pneumonia em um paciente, por exemplo, um paciente humano, em que as ASCs são administradas via sistêmica, por exemplo, via intravenosa, por exemplo, por injeção intravenosa, por exemplo, por injeção intralinfática a um órgão linfático, como um órgão linfático periférico, inclusive, entre outros, os linfonodos, mais preferencialmente um linfonodo axilar ou inguinal. Em cada uma destas realizações, as MSCs podem ser ASCs, por exemplo, eASCs. Conforme aqui utilizado, o termo “sistema linfático” deve receber seu significado habitual na técnica e se refere ao tecido linfoide, como um órgão linfático, conectado por um sistema de condução de vasos linfáticos e capilares linfáticos. O termo “órgão linfático” se refere a linfonodos, mais preferencialmente um linfonodo axilar ou inguinal. Em uma realização, as ASCs não são diretamente administradas ao pulmão ou via intratraqueal. Em uma realização, as MSCs usadas na invenção podem ser autólogas em relação ao indivíduo a ser tratado. Em uma realização adicional, as MSCs utilizadas na invenção podem ser alogênicas xenogênica em relação ao indivíduo a ser tratado. As células estromais derivadas de tecido adiposo alogênico derivadas de um doador podem, teoricamente, ser usadas para o tratamento de qualquer paciente, independente da incompatibilidade de MHC.

[00110] Em uma realização, a composição da invenção pode ser administrada por injeção ou implantação da composição em um ou mais locais alvo no indivíduo a ser tratado. Em uma realização adicional, a composição da invenção pode ser inserida em um dispositivo de administração que facilita a introdução da composição no indivíduo por injeção ou implantação. Em uma realização, o dispositivo de administração pode compreender um cateter. Em uma realização adicional, o dispositivo de administração pode compreender uma seringa.

DOSE

[00111] A dose de MSCs e de qualquer outro agente terapêutico variará dependendo dos sintomas, idade e peso corporal do paciente, a natureza e gravidade do distúrbio a ser tratado ou prevenido, a via de administração e a forma do outro agente terapêutico. As composições da invenção podem ser administradas em uma dose única ou em doses divididas. As doses apropriadas para as MSCs e qualquer outro agente terapêutico podem ser determinadas por técnicas conhecidas.

[00112] Normalmente, a dita dose é de aproximadamente 10 x 106células/kg do peso do indivíduo ou menos, é de aproximadamente 9 x 106células/kg ou menos, é de aproximadamente 8 x 106células/kg ou menos, é de aproximadamente 7 x 106células/kg ou menos, é de aproximadamente 6 x 106células/kg ou menos, é de aproximadamente 5 x 106células/kg é de aproximadamente. Em uma realização alternativa, a dita dose pode estar entre aproximadamente 0,25 x 106células/kg a aproximadamente 5 x 106células/kg; ou mais preferencialmente aproximadamente 1 x 106células/kg a aproximadamente 5 x 106células/kg. De forma adequada, em realizações alternativas adicionais, a dose pode ser de aproximadamente 0,25 x 106células/kg, 0,5 x 106 células/kg, 0,6 x 106células/kg, 0,7 x 106células/kg; 0,8 x 106células/kg; 0,9 x 106células/kg; 1,1 x 106células/kg; 1,2 x 106células/kg; 1,3 x 106células/kg; 1,4 x 106 células/kg; 1,5 x 106células/kg; 1,6 x 106células/kg; 1,7 x 106células/kg; 1,8 x 106células/kg; 1,9 x 106células/kg ou 2 x 106células/kg. Em outras realizações, a dose pode estar entre 0,1 e 1 milhão de células/kg; ou entre 1 e 2 milhões de células/kg; ou entre 2 e 3 milhões de células/kg; ou entre 3 e 4 milhões de células/kg; ou entre 4 e 5 milhões de células/kg; ou entre 5 e 6 milhões de células/kg; ou entre 6 e 7 milhões de células/kg; ou entre 7 e 8 milhões de células/kg; ou entre 8 e 9 milhões de células/kg; ou entre 9 e 10 milhões de células/kg.

[00113] Em uma realização alternativa, as células podem ser administradas ao paciente como uma dose fixa, independente do peso do paciente. Normalmente, a dita dose está entre aproximadamente 10 milhões de células e 500 milhões de células, por exemplo, a dita dose é de aproximadamente 10 x 106células, 50 x 106células, 10 x 107 células, 50 x 107células.

[00114] Portanto, em uma realização, a invenção prove MSCs, como ASCs, para o uso no tratamento de sepse secundária à pneumonia, como sepse grave secundária à pneumonia, em um indivíduo humano em que as MSCs são administradas via intravenosa, por exemplo, por injeção intravenosa, a uma dose entre aproximadamente 0,25 x 106 células/kg a aproximadamente 5 x 106células/kg do peso do indivíduo. Um dose típica é de 4 x 106células/kg do peso do indivíduo. A sepse pode ser secundária à pneumonia bacteriana (por exemplo, pneumonia Gram negativa).

[00115] Em outra realização, que pode ser opcionalmente combinada com a realização acima, a invenção prove MSCs, como ASCs, para o uso no tratamento de sepse secundária à pneumonia, como sepse grave secundária à pneumonia, em um indivíduo humano em que as MSCs são administradas repetidamente, ou seja, duas ou mais doses são administradas, por exemplo, pelo menos 3 doses, pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 doses. Em uma realização, duas doses são administradas. Em outra realização, três doses são administradas. Em uma realização adicional, quatro doses são administradas. O intervalo entre as doses pode ser de um dia, uma semana ou um mês. Normalmente, o intervalo é de um dia. As MSCs podem ser administradas ao longo de um período de não mais que 1 semana (por exemplo, com intervalos diários, como nos dias 1 e 3 ou dias 1, 3 e 5 ou dias 1, 3, 5 e 7). Em uma realização, duas doses de MSCs são administradas com intervalo de um dia, ou seja, no dia 1 e dia 3 (dia 1 indica a primeira dose das MSCs).

[00116] O tempo preciso de administração e a quantidade de qualquer agente em particular que produzirá o tratamento mais eficaz em um determinado paciente dependerá da atividade, farmacocinética e biodisponibilidade do agente, a condição fisiológica do paciente (inclusive idade, gênero, tipo e estágio da doença, condição física geral, resposta a uma determinada dose e tipo de medicação), a via de administração, etc. As informações aqui apresentadas podem ser usadas para otimizar o tratamento, por exemplo, a determinação do tempo ideal e/ou quantidade de administração, que exigirão não mais que uma experimentação de rotina, como o monitoramento do indivíduo e ajuste de e/ou tempo. Apesar de o indivíduo ser tratado, a sua saúde pode ser monitorada pela medição de um ou mais dos índices relevantes me momentos predeterminados durante um período de 24 horas. Os regimes de tratamento, inclusive doses, vezes de administração e formulações podem ser otimizados de acordo os resultados de tal monitoramento.

[00117] O tratamento pode ser iniciado com doses menores que são menores que a dose ideal. Portanto, a dose pode ser elevada por pequenos incrementos até o efeito terapêutico ideal ser obtido.

[00118] O uso combinado de diversos agentes terapêuticos pode reduzir a dose exigida para qualquer composto individual devido ao início e duração de efeito dos diferentes componentes poderem ser complementares. Em tal terapia combinada, os diferentes agentes ativos podem ser liberados juntos ou separadamente, e simultaneamente ou em momentos diferentes no período do dia.

TERAPIAS ADJUVANTES

[00119] Em uma realização, a composição farmacêutica da invenção pode conter ou, de forma alternativa, ser administrada em conjunto com um ou mais (ou dois ou mais ou três ou mais, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5) outros agentes terapêuticos.

[00120] Em algumas realizações, as MSCs e um ou mais outros agentes terapêuticos podem ser administrados ao indivíduo simultaneamente. Em outras realizações, as MSCs e um ou mais outros agentes terapêuticos podem ser administrados ao indivíduo sequencialmente. Um ou mais outros agentes terapêuticos podem ser administrados antes ou depois da administração das MSCs.

[00121] O dito agente terapêutico pode ser selecionado dentre os seguintes: um analgésico, como um anti- inflamatório não esteroidal, um agonista de opiáceo ou um salicilato; um agente anti-infeccioso, como um vermífugos, um antianaeróbio, um antibiótico, um antibiótico aminoglicosídeo, um antibiótico antifúngico, um antibiótico de amplo espectro, uma cefalosporina, um macrólido, um antibiótico β-lactâmico, penicilina, uma quinolona, uma sulfonamida, uma tetraciclina, um antimicobacteriano, um antimicobacteriano anti-tuberculose, um antiprotozoário, um antiprotozoário antimalárico, um agente antiviral, um agente antirretroviral, um escabicida, um agente anti-inflamatório, um agente anti-inflamatório corticosteroide, um antipruriginoso/anestésico local, um anti-infeccioso tópico, um anti-infeccioso tópico antifúngico, um anti-infeccioso tópico antiviral; um agente eletrolítico e renal, como um agente acidificante, um agente alcalinizante, um diurético, um diurético inibidor de anidrase carbônica, um diurético de alça, um diurético osmótico, um diurético poupador de potássio, um diurético de tiazida, uma reposição de eletrólito e um agente uricosúrico; uma enzima, como enzima pancreática e uma enzima trombolítica; um agente gastrointestinal, como um antidiarreico, um antiemético, um agente anti-inflamatório gastrointestinal, um agente anti- inflamatório gastrointestinal de salicilato, um agente antiúlcera antiácido, um agente antiúlcera inibidor de bomba de ácido gástrico, um agente antiúlcera da mucosa gástrica, um agente antiúlcera bloqueador de H2, um agente quelolitolítico, um digestivo, um emético, um laxante, e um agente procinético; um anestésico geral, como um anestésico inalatório, um anestésico inalatório halogenado, um anestésico intravenoso, um anestésico intravenoso barbitúrico, um anestésico intravenoso benzodiazepínico e anestésico intravenoso de agonista opiáceo; um hormônio ou modificador hormonal, como um abortivo, um agente suprarrenal, um agente suprarrenal corticosteroide, um andrógeno, um antiandrógeno, um agente imunobiológico, como uma imunoglobulina, um imunossupressor, um toxoide e uma vacina; um anestésico local, como um anestésico local de amida e um anestésico local de éster; um agente musculoesquelético, como um agente anti-inflamatório antigota, um agente anti-inflamatório corticosteroide, um agente anti-inflamatório de composto de ouro, um agente anti- inflamatório imunossupressor, um anti-inflamatório não esteroidal (NSAID), um agente anti-inflamatório salicílico, um mineral; e uma vitamina, como vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E e vitamina K.

[00122] Em outra realização, outro agente terapêutico pode ser um fator de crescimento ou outra molécula que afeta a proliferação ou ativação celular. Em uma realização adicional, este fator de crescimento pode induzir a diferenciação final. Em outra realização, o fator de crescimento poder uma variante ou fragmento de um fator de crescimento de ocorrência natural. Os métodos de produção destas variantes são bem conhecidos na técnica e pode incluir, por exemplo, fabricação de alterações de aminoácidos conservadores ou por mutagênese e avaliação da variante resultante para a funcionalidade exigida.

[00123] A invenção será agora mais ilustrada pelos exemplos a seguir. Estes exemplos são providos por meio de ilustrações apenas e não pretendem ser limitantes.

EXEMPLO 1 EFEITO DO TRATAMENTO COM ASC NA SEPSE ASSOCIADA À PNEUMONIA

[00124] Objetivo: Determinar o efeito das ASCs administradas 6 horas após a infecção sobre a progressão e disseminação de bactérias e sobre os níveis de citocinas pró- inflamatórias nos pulmões.

[00125] Ratos: • Ratos C57BL/6 fêmeas de oito a doze semanas de idade sem patógeno específico • Ratos foram randomizados e alojados por 7 dias antes do experimento para aclimatização • Animais no experimento foram observados duas vezes ao dia. Se extremamente doentes, exigia-se observação mais frequente (6 x) e essencial em conformidade com o Comitê de Ética Animal

[00126] Pneumonia:

[00127] A pneumonia Gram negativa foi induzida por instilação intranasal de Klebsiella pneumoniae viva sorotipo 2 (1 x 104 UFC; ATCC 43816; American Type Culture Collection). As bactérias foram cultivadas no meio de Caldo de Soja Tríptico (TSB) e placas de agar sanguíneo (BA).

[00128] Dia -1: Iniciar cultura

[00129] Uma gota de caldo de Klebsiella pneumoniae a -80oC foi colocada em 50 ml do meio TSB e cultivada durante a noite (16 horas) a 37°C.

[00130] Dia 0: Preparação do inóculo

[00131] Foi novamente suspenso 1 ml da cultura (dia -1) em 100 ml (morno) do meio TSB e cultivado até OD=1,0 (± 2,5-3 horas). A cultura de 10 ml foi enxaguada com 0,9% de NaCl (Baxter) estéril frio na centrífuga a 4000 rpm por 10 min a 4°C. O sobrenadante foi removido e enxaguado 2 vezes mais, conforme descrito acima. o grânulo foi novamente suspenso em 10 ml de NaCl, a concentração bacteriana foi de aproximadamente 0,4 x 109 UFC/ml. Isto foi diluído 2000 vezes a aproximadamente 20 x 104 UFC/ml. A concentração do inóculo foi verificada ao colocar em placa 50 μl de 102 a 104 de diluições do inóculo em três placas BA. A UFC foi novamente contada após cultura durante a noite a 37 °C (Dia 1). Os camundongos foram inoculados:

INÓCULO: 50 μL/CAMUNDONGO ^ 1 X 104 UFC CÉLULAS TRONCO:

[00132] As ASCs (1 x 106 de células tronco expandidas derivadas de tecido adiposo humano) ou placebo (solução de Ringer lactato) foram administradas via intravenosa 6 horas após a inoculação intranasal dos ratos. DESENHO DO ESTUDO T= 0 horas • Isoflurano anestésico • Todos os ratos: instilação intranasal de Klebsiella pneumoniae viva sorotipo 2 (50 μl, 1 x 104 UFC) T= 6 horas • Grupo I: (n=8) 1 x intravenoso (IV) injetado com 200 μl de placebo (Ringer lactato) • Grupo II: (n = 8) 1 x IV injetado com 1 x 106 de ASCs (em 200 μl de Ringer lactato) T= 48 horas: Sacrifício dos ratos ENDPOINTS DO ESTUDO • Cargas bacterianas nos pulmões, baço, fígado e sangue (cultura semiquantitativas) • Inflamação: citocinas (TNF-α, IL-1β, IL-6) e quimiocina (MIP-2) no homogeneizados pulmonares

[00133] Resultados:

[00134] As Figuras 1 a 8 mostram os resultados de dois experimentos independentes (rotulados A e B, respectivamente). Conforme mostrado nas Figuras 1 a 4, em comparação ao placebo, o tratamento com ASCs após 6h de infecção reduziu a carga bacteriana no sangue (Figura 1) e pulmões (Figura 2) e também reduziu as cargas bacterianas no fígado (Figura 3) ou baço (Figura 4). Além disso, conforme mostrado nas Figuras 5 a 8, os níveis de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias foram reduzidas nos homogeneizados pulmonares após o tratamento com ASCs em comparação ao placebo. Estes resultados demonstram que o tratamento com ASCs reduz a gravidade da sepse associada à pneumonia. As cargas bacterianas e níveis de citocinas/quimiocinas pró-inflamatórias foram a reduzidos em diversas questões, inclusive os órgãos alvo relevantes à pneumonia, como o sangue e os pulmões. As MSCs, como ASCs, são, portanto, surpreendentemente úteis no tratamento de sepse associada à pneumonia.

[00135] Os resultados de outro estudo são mostrados nas Figuras 9 a 12, novamente demonstrando que a administração intravenosa das ASCs na sepse associada à pneumonia reduz a carga bacteriana em diversos órgãos, como o sangue.

EXEMPLO 2

[00136] Um estudo clínico é conduzido em paciente com pneumonia grave que apresentam sepse ou choque séptico. Os pacientes foram admitidos no período de 24 horas do diagnóstico de sepse.

[00137] Aproximadamente metade dos pacientes admitidos ao estudo recebeu tratamento com um produto medicinal que consiste de uma suspensão de células estromais expandidas de tecido adiposo (eASCs) derivadas de doador (alogênico) na solução Ringer lactato. A outra metade recebe um placebo que consiste de uma suspensão da solução Ringer lactato. Os pacientes no grupo de tratamento recebe um única dose de 4 milhões de células/kg do peso corporal do paciente do produto medicinal. Os pacientes no grupo placebo recebem uma única dose do placebo. Em ambos os casos, a administração é por meio de infusão intravenosa.

[00138] O produto medicinal é uma suspensão celular em solução tampão estéril que contém células estromais derivadas de tecido adiposo (eASCs) de origem alogênica em frascos descartáveis, obtido através da lipoaspiração de indivíduos hígidos e expandido in vitro. O produto medicinal é fornecido na forma de suspensão estéril, límpida e incolor para administração intralesional, provido em frascos de 6 mL (suspensão de 10 milhões de eASCs por mL de meio Eagle modificado de Dulbecco [DMEM] com soro de albumina humana). O produto medicinal será administrado após suspensão em solução Ringer lactato a uma taxa de infusão de 4 ml/min.

[00139] O placebo do estudo é um solução Ringer lactato para administração intralesional a uma taxa de infusão de 4 ml/min. O volume correspondente de placebo (solução Ringer lactato) será administrado a cada indivíduo dos grupos placebo. O volume de placebo será calculado de acordo com o peso do indivíduo.

PREPARAÇÃO DO PRODUTO MEDICINAL

[00140] O produto medicinal de eASCs alogênico consiste de uma suspensão celular de células estromais adultas vivas extraídas do tecido adiposo subdérmico de doadores hígidos. O tecido adiposo subdérmico é retirado por lipoaspiração do doador hígido e transportado a uma instalação de fabricação com boas práticas de fabricação. A doação, fornecimento e teste são realizados de acordo com as exigências da Diretriz 2004/23/EC e, portanto, nas Diretrizes 2006/17/EC e 2006/83/EC. As ASCs são isoladas pela digestão do tecido adiposo com colagenase tipo I, seguido por centrifugação. O grânulo celular obtido é novamente suspenso e lisado em solução de lise eritrocitária e centrifugado. A fração vascular estroma, resultante do grânulo celular, é colocado em recipientes de cultura celular em meio de cultura e antibióticos, e incubado a 37°C e 5% de CO2 e em atmosfera umidificada. Após colocação em placa por 24 a 48 horas, o meio de cultura é removido para eliminar a fração celular não fixada. As ASCs que se derem às placas de cultura plásticas são expandidas em condições in vitro. A cada 3 a 4 dias, o meio de cultura é trocado após atingir 90 a 95% de confluência e as células são separadas com tripsina/EDTA, coletadas, centrifugadas e expandidas sem antibióticos para a duplicação exigida. Elas são então colhidas e criopreservadas até o uso. Antes da data de administração indicada, os frascos criopreservados suficientes são descongelados para prover a dose exigida para administração. As ASCs são recuperadas de seu estado criopreservado por colocação em placa e cultura (para confirmar viabilidade). No dia em que os frascos são preenchidos e embalados, as culturas foram enxaguadas com solução tampão de fosfato e tripsina/EDTA. As ASCs são imediatamente suspensas novamente nos excipientes selecionados (meio Eagle de modificação Dulbecco e soro de albumina humana) para formular o produto medicamentoso.

[00141] As eASCs são caracterizadas em termos de identidade (perfil fenotípico), pureza, potência, morfologia, viabilidade e cinética de crescimento celular de acordo com a Diretriz sobre Produtos Medicinais com Base Celular (EMEA/CHMP/410869/2006) e o Papel de Reflexão sobre as Células Tronco (EMA/CAT/ 571134/2009).

Claims (12)

1. USO DE CÉLULAS ESTROMAIS MULTIPOTENTES DERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO MESENQUIMAL (ASCS), caracterizado por ser na produção de um medicamento para o tratamento de sepse em um indivíduo humano, em que a sepse é secundária a uma condição pulmonar inflamatória

2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo medicamento ser administrado por uma via intravenosa.

3. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela sepse ser sepse grave.

4. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela condição pulmonar inflamatória ser pneumonia.

5. USO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela pneumonia ser causada por bactéria.

6. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelas células serem células estromais derivadas de tecido adiposo expandidas.

7. . USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelas ASCs [células estromais mesenquimais] serem alogênicas.

8. . USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo medicamento compreender entre aproximadamente 0,25 x 106células/kg a aproximadamente 5 x 106 células/kg de peso do indivíduo.

9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por pelo menos 50% das ASCs expressarem um ou mais dos marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 e CD105.

10. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por pelo menos 50% das ASCs não expressarem os marcadores Fator VIII, alfa-actina, desmina, S-100, queratina, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 e CD133.

11. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo medicamento contendo ASCs compreender adicionalmente um veículo e/ou um diluente farmaceuticamente aceitável.

12. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo medicamento contendo ASCs compreender um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

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