ES2629502T3 - Métodos y composiciones relacionados con exosomas de células madre mesenquimales - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica, que comprende una cantidad eficaz de exosomas de células madre mesenquimales (MSC) humanos aislados y un tensioactivo pulmonar, para uso en tratar a un sujeto humano que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad pulmonar, en donde el sujeto es de menos de 4 semanas de edad y en donde la composición se formula para el suministro a los pulmones.

Description

DESCRIPCION

Metodos y composiciones relacionados con exosomas de celulas madre mesenquimales INVESTIGACION PATROCINADA FEDERALMENTE

Esta invencion se realizo con el apoyo del Gobierno bajo los numeros de subvencion RO1 HL055454 y R01 5 HL085446 adjudicados por el National Heart Lung and Blood Institute. El Gobierno tiene ciertos derechos en esta

invencion.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Los bebes prematuros padecen o estan en riesgo de desarrollar determinadas enfermedades (o afecciones) pulmonares cronicas (o respiratorias) en mayor proporcion que los bebes nacidos a su debido tiempo o cerca del 10 mismo. Debido a que los pulmones y la capacidad de respiracion del bebe se ven comprometidos, estas enfermedades son a menudo letales. El aumento de las tasas de supervivencia de los bebes prematuros ha dado lugar a una incidencia incrementada de este tipo de enfermedades pulmonares. La inflamacion es una caractenstica fisiopatologica clave de multiples enfermedades pulmonares, incluyendo la hipertension pulmonar (PH o PAH), asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), fibrosis pulmonar idiopatica (IPF) y enfermedad pulmonar 15 cronica de la infancia, tambien conocidos como displasia broncopulmonar (BPD). El aumento de las tasas de supervivencia de los bebes prematuros ha dado lugar a un aumento de la incidencia de BPD y sus complicaciones asociadas, que incluyen PH secundaria, asma y aumento de la tasa de re-hospitalizacion en los primeros anos de vida. La BPD es una complicacion comun de la prematuridad (Kinsella et al, Lancet, 2006, 367:1421-1431; Stenmark y Abman, Annu Rev Physiol, 2005, 67:623-661) y en algunos estudios puede afectar hasta un 35 - 40% de los bebes 20 prematuros nacidos con < 29 semanas de gestacion. Sus causas subyacentes incluyen lesion mecanica, toxicidad del oxfgeno, infeccion e inflamacion pulmonar resultante y el dano del pulmon en desarrollo. Los intentos para controlar la BPD han implicado estrategias de ventilacion suave y el uso de agentes anti-inflamatorios tales como corticosteroides. Sin embargo, estos tratamientos tienen un exito limitado y los efectos secundarios inaceptables (Baveja y Christou, Semin Perinatol, 2006, 30:209-218). Los efectos a largo plazo de estas enfermedades 25 pulmonares cronicas son tambien una preocupacion e incluyen dano pulmonar sostenido y retraso del desarrollo neurologico. La PH es una complicacion grave de la BPD y se asocia con una alta tasa de mortalidad. Tambien se asocia con otras formas de enfermedad pulmonar tales como la COPD. Mas recientemente, la PH ha sido reconocida como una de las principales complicaciones de la esquistosomiasis a traves de mecanismos que implican inflamacion. La esquistosomiasis tiene una muy alta prevalencia en determinadas partes del mundo y esta 30 altamente vinculada con la Ph secundaria, aumentando en potencia drasticamente la incidencia de esta enfermedad vascular en todo el mundo.

SUMARIO DE LA INVENCION

El alcance de la invencion se define por las reivindicaciones y se proporciona toda informacion que no caiga dentro de las reivindicaciones se proporciona solo para informacion.

35 La invencion proporciona composiciones que comprenden exosomas derivados de celulas madre mesenquimales (MSC) y su uso en el tratamiento y/o la prevencion de la enfermedad pulmonar.

En un aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende exosomas de celulas madre

mesenquimales (MSC) aislados, formulados para la administracion intratraqueal o la administracion por inhalacion. En un aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende exosomas de celulas madre

40 mesenquimales (MSC) aislados, formulados para la administracion intravenosa.

En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende exosomas de celulas madre

mesenquimales (MSC) aislados y un agente tensioactivo pulmonar.

En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende exosomas de celulas madre

mesenquimales (MSC) aislados y un corticosteroide pulmonar. El corticosteroide pulmonar puede ser 45 metilprednisolona, aunque no esta limitado a ella.

En otros aspectos, la invencion proporciona exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) aislados aerosolizados, que comprenden exosomas de MSC aislados, aerosolizados.

En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion de exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) aislados para uso en el tratamiento o la prevencion de la enfermedad pulmonar. En otro aspecto, la invencion 50 proporciona una composicion farmaceutica para uso en el tratamiento o la prevencion de la enfermedad pulmonar que comprende exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) aislados.

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En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion de exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) aislados para su uso como un medicamento para tratar o prevenir la enfermedad pulmonar.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona un metodo que comprende administrar a un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar una enfermedad pulmonar una cantidad eficaz de exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) aislados.

En todavfa otro aspecto, la divulgacion proporciona el uso de exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) aislados para tratar o prevenir enfermedades pulmonares en un sujeto, o el uso de exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) aislados en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de una enfermedad pulmonar.

En todavfa otro aspecto, la invencion proporciona exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) aislados para uso en un metodo para tratar o prevenir la enfermedad pulmonar, que comprende administrar una cantidad eficaz de los exosomas de MSC aislados a un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar una enfermedad pulmonar.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona un metodo que comprende administrar a un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar una enfermedad pulmonar una cantidad eficaz de exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) aislados.

Diversas realizaciones son igualmente aplicables a los diversos aspectos de la invencion, tal como se describe mas adelante. En algunas realizaciones, la enfermedad pulmonar es enfermedad pulmonar inflamatoria. En algunas realizaciones, la enfermedad pulmonar inflamatoria es hipertension pulmonar, asma, displasia broncopulmonar (BPD), alergia o fibrosis pulmonar idiopatica. En algunas realizaciones, la enfermedad pulmonar es enfermedad vascular pulmonar. En algunas realizaciones, la enfermedad pulmonar es una lesion pulmonar aguda. En algunas realizaciones, la lesion pulmonar aguda se asocia con la sepsis o es el smdrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) inducida por el ventilador.

En algunas realizaciones, el sujeto tiene o es probable que desarrolle esquistosomiasis.

En algunas realizaciones, el sujeto es un recien nacido. En algunas realizaciones, el sujeto es un bebe. En algunas realizaciones, el sujeto es de entre 3-18 anos de edad. En algunas realizaciones, el sujeto es un adulto. En cualquiera de estas realizaciones, el sujeto puede ser uno que nacio prematuramente. En algunas realizaciones, el sujeto nacio en menos de 35 semanas de gestacion. En algunas realizaciones, el sujeto nacio en menos de 26 semanas de gestacion.

En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se utilizan junto con un agente secundario. En algunas realizaciones, el agente secundario es un esteroide, un antioxidante, o el oxido mtrico inhalado. En algunas realizaciones, el esteroide es un corticosteroide. En algunas realizaciones, el corticosteroide es metilprednisolona. En algunas realizaciones, el antioxidante es superoxido dismutasa.

En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se administran en el espacio de una hora del nacimiento. En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se administran en el espacio de 1 mes del nacimiento.

En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se administran por via intravenosa. En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se administran a los pulmones o la traquea del sujeto. En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se administran por inhalacion. En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se administran en un aerosol. En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se administran utilizando un nebulizador. En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se administran utilizando un tubo intratraqueal.

En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se administran o formulan con un tensioactivo pulmonar. En algunas realizaciones, el tensioactivo pulmonar es un tensioactivo que se produce de forma natural, aislado. En algunas realizaciones, el tensioactivo pulmonar se deriva de pulmon bovino o de pulmon porcino. En algunas realizaciones, el tensioactivo pulmonar es un tensioactivo sintetico.

En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se administran repetidamente al sujeto. En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se administran dos veces al sujeto. En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se administran continuamente al sujeto.

En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se derivan de MSC de sangre del cordon umbilical. En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados se derivan de MSC de la medula osea.

En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados son autologos al sujeto. En algunas realizaciones, los exosomas de MSC aislados son alogenicos para el sujeto.

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En algunas realizaciones, el sujeto no esta recibiendo un trasplante de celulas o de organos.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) humanas aislados, y un agente tensioactivo pulmonar, formulada para la administracion a los pulmones, para uso en un sujeto humano que tiene o esta en riesgo de desarrollar una enfermedad pulmonar, en donde el sujeto es de menos de 4 semanas de edad. La divulgacion proporciona de manera similar un metodo de uso de los exosomas de MSC, que comprende administrar una cantidad eficaz de exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) humanas aislados, formulada para la administracion a los pulmones, a un sujeto humano que tiene o esta en riesgo de desarrollar una enfermedad pulmonar, en donde el sujeto es de menos de 4 semanas de edad. La divulgacion proporciona de manera similar el uso de una cantidad eficaz de exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) humanas aislados y un agente tensioactivo pulmonar, formulada para la administracion a los pulmones, en un sujeto humano que tiene o esta en riesgo de desarrollar una enfermedad pulmonar, en donde el sujeto es de menos de 4 semanas de edad. En algunas realizaciones, los exosomas de MSC humanas aislados se afslan de cordon umbilical humano (p. ej., gelatina de Wharton). En algunas realizaciones, el sujeto humano nacio antes de las 37 semanas de gestacion. En algunas realizaciones, al sujeto humano se le ha administrado oxfgeno o ha sido conectado a un respirador. En algunas realizaciones, el sujeto humano tiene o esta en riesgo de desarrollar displasia broncopulmonar. En algunas realizaciones, la displasia broncopulmonar es no inflamatoria. En algunas realizaciones, los exosomas de MSC humanas aislados se administran en el espacio de 1 dfa del nacimiento. En algunas realizaciones, los exosomas de MSC humanas aislados se administran en el espacio de 1 hora del nacimiento.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona exosomas de MSC sinteticos que tienen caracteffsticas similares o identicas de exosomas de MSC aislados, composiciones que comprenden dichos exosomas de MSC sinteticos, y metodos de su uso. La divulgacion contempla que exosomas de MSC sinteticos se pueden formular y utilizar de la misma manera que exosomas de MSC aislados. Los exosomas sinteticos pueden comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o las ocho de las siguientes protemas: haptoglobina (N° de Acc. q61646), protema de union a galectina-3 (N° de Acc. q07797), trombospondina-2 (N° de Acc. q03350), lactadherina (N° de Acc. q21956), protema de union a potenciador de adipocitos 1 (N° de Acc. q640n1), vimentina (N° de Acc. p20152), subunidad alfa de proteasoma tipo 2 (N° de Acc. p49722) y la protema beta amiloide A4 (N° de Acc. pl2023). Estos exosomas se pueden formular tal como se describe en esta memoria para exosomas de MSC aislados, incluyendo los formulados para administracion intranasal o intratraqueal o inhalacion. Pueden ser formulados y/o administrados con agentes tensioactivos pulmonares u otros agentes terapeuticos.

Estos y otros aspectos y realizaciones de la invencion se describiran con mayor detalle en esta memoria.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

FIG. 1. Factores secretores de BM-MSC son anti-inflamatorios. Efectos de BM-MSC-CM sobre la infiltracion inducida por hipoxia de los macrofagos en el pulmon (A). Ratones (n > 8) a los que se inyecto vehmulo o BM-MSC-CM o MLF-CM fueron expuestos a hipoxia (8,5% de O2) durante 48 horas y se recogieron BALFs de los ratones hipoxicos, asf como de ratones control normoxicos emparejados por edades. Se conto el numero de macrofagos alveolares en BALFs mediante tincion de Kimura. Analisis de inmunotransferencia comparativo de protemas en BALFs libres de celulas de ratones control hipoxicos y normoxicos. (B). Se agruparon volumenes equivalentes de BALFs libres de celulas de raton individual en el mismo grupo (n > 8) y se analizaron protemas de volumen equivalente de BALFs agrupados mediante transferencia western utilizando anticuerpos espedficos para MCP-1 (parte superior) y HIMF/FIZZ1 (parte inferior). Intensidades relativas de MCP-1 y HIMf estan representadas por la normalizacion sobre la senal de IgA de la misma transferencia.

FIG 2. Aislamiento de exosomas de medio acondicionado con BM-MSC libre de celulas. Los exosomas en BM-MSC- CM o MLF-CM se aislaron por ultrafiltracion y cromatograffa de exclusion por tamano. 1,6% (p/p) de protemas en BM-MSC-CM fueron asociados con exosomas y los exosomas en las fracciones de la cromatograffa de exclusion por tamano se visualizaron por microscopfa electronica (B - E). Para verificar el aislamiento de exosomas de BM- MSC-CM, la fraccion en el volumen vado (ve = vo) (B) y la fraccion entre el volumen vado y el volumen total (vo < ve < vt) de la columna (C) se analizaron por microscopfa electronica de tincion negativa a 30.000 aumentos. La morfologfa y la distribucion por tamano de los exosomas aisladas de BM-MSC-CM (D) o MLF-CM (E) eran identicas. Analisis de transferencia Western frente a las protemas asociadas con exosomas (F-G). 3 |jg de protemas en cada una de las muestras se analizaron por transferencia western utilizando los anticuerpos contra CD63, 14-3-3s, moesina, factor estimulante de colonias de macrofagos (mCSF), osteopontina (OPN) y dicer. Para el control positivo, se utilizaron 35 ug de protemas lisados de celulas enteras BM-MSC.

FIG. 3. MEX suprime la inflamacion pulmonar aguda inducida por hipoxia. Ratones (n > 7) a los que se inyecto vehmulo o MEX o fraccion libre de exosomas de BM-MSC-CM o FEX se expusieron a hipoxia (8,5% de O2) durante 48 horas y se recogieron BALFs de los ratones hipoxicos y ratones normoxicos emparejados por edades. Se conto el numero de macrofagos alveolares en BALF de cada uno de los ratones mediante tincion de Kimura (A). Analisis de inmunotransferencia comparativo de protemas en BALFs libres de celulas de ratones control hipoxicos y los

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normoxicos (B). Se agrupo el volumen equivalente de BALFs libres de celulas de raton individual en el mismo grupo (n > 7) y protemas de volumen equivalente de BALFs agrupados se analizaron mediante transferencia western utilizando anticuerpos espedficos para MCP-1 (parte superior) y HIMF/FIZZ1 (parte inferior). Los niveles relativos de MCP-1 y HIMF estan representados por la normalizacion sobre la senal de IgA de la misma transferencia.

FIG. 4. Efecto en el curso del tiempo sobre la inflamacion pulmonar derivada de hipoxia por la administracion unica y multiple de MEX. Ratones a los que se inyecto vedculo (A) o MEX (B) el dfa 0 fueron expuestos a hipoxia (8,5% de O2) durante los periodos indicados. Para el experimento de inyeccion multiple, los ratones que recibieron MEX el dfa 0 fueron expuestos a hipoxia durante 4 dfas. La segunda inyeccion de la misma dosis de MEX el dfa 4 fue seguida de exposicion adicional a hipoxia los dfas indicados (C). Se recogieron BALFs en los penodos de tiempo seleccionados de acondicionamiento hipoxico y se conto el numero de macrofagos alveolares en BALF de ratones individuales. Volumenes equivalentes de BALFs libres de celulas de ratones individuales en el mismo grupo (n> 7) se agruparon y las protemas de 10% (v/v) de BALFs agrupados se analizaron mediante transferencia western utilizando anticuerpos espedficos para MCP-1 y HIMF (D).

FIG. 5. MEX suprime PAH inducida por hipoxia. A ratones (n > 7) se les inyecto una o dos veces vetnculo (el dfa 0 y el dfa 4) o MEX (el dfa 0 y/o el dfa 4), o FEX (el dfa 0 y el dfa 4) y se expusieron a hipoxia (8,5% de O2) durante penodos de 3 semanas (A). RVSP (B) y el fndice de Fulton (C) de los ratones control hipoxicos y normoxicos se midieron al final del periodo experimental. Secciones de pulmon embebidas en parafina de ratones seleccionados al azar (n = 4) en cada uno de los grupo se inmunotineron para a-SMA para resaltar paredes de los vasos de arteriolas pulmonares (D). Aumento original para imagenes: 400x. Se seleccionaron arteriolas pulmonares pequenas con 20 ~ 30 pm de diametro de cada unio de los grupos para medir el espesor de pared del vaso que se expreso como un porcentaje del area total del vaso. Los datos se expresan como media ± SEM (n = 40 ~ 50 arteriolas por grupo).

FIG. 6. Purificacion de exosomas derivados de MSC. Los exosomas se purificaron por cromatograffa en columna de filtracion en gel Sephacryl S-400. Nanopartmulas de 50 nm fluorescentes cargadas negativamente se aplicaron sobre la columna S-400 y se eluyo con una condicion identica a la purificacion del exosoma (A). A partir de la purificacion del exosoma, se separo un volumen equivalente de cada una de las fracciones tanto en gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% (B) como electroforesis en gel de agarosa al 1,2% (C). La mancha para el gel de agarosa se tino con anticuerpo anti-CD81 (D).

FIG. 7. Analisis bioqmmico comparativo de exosomas derivados de MSC y fracciones libres de exosoma. Cantidades de protema equivalentes en ambas agrupaciones de fracciones de exosoma (M) y fracciones libres de exosoma (MF) se separaron en gel de poliacrilamida desnaturalizante al 12% (A). Gel de agarosa al 1,2% cargado por cantidades de protema equivalentes en ambas agrupaciones de fracciones de exosoma y fracciones libres de exosoma asf como nanopartmulas de 50 nm en ausencia (izquierda, B) o presencia de SDS al 0,5% (derecha, B) se tineron con azul coloidal. Gel de agarosa al 1,2% cargado por cantidades de protema equivalentes en ambas agrupaciones de fracciones de exosoma y fracciones libres de exosoma se tineron con bromuro de etidio para los acidos nucleicos (izquierda, C) o azul coloidal para las protemas (derecha, C). Manchas para geles cargados con cantidades de protema equivalentes en ambas agrupaciones de fracciones de exosoma y fracciones libres de exosoma, separadas tanto en gel de agarosa al 1.2% como en gel desnaturalizante de poliacrilamida al 12%, se inmunotineron con anticuerpos anti-CD81 y anticuerpos anti-SPP-1 (D). M, agrupacion de fracciones exosomales; MF, agrupacion de las fracciones libres de exosoma; N, nanoesferas fluorescentes de 50 nm, cargadas negativamente.

FIG. 8. Secrecion inducida por hipoxia de HIMF/FIZZ-1/Retn1a en el pulmon. Ratones fueron expuestos durante los periodos de tiempo indicados a hipoxia monobarica (8,5% de O2). Las protemas en BAL normalizadas en volumen (A) y la cantidad (B) de cada uno de los ratones individuales en el mismo grupo se agruparon y se separaron en gel de poliacrilamida al 14%. Los niveles de HIMF, lisozima e IgA fueron evaluados por analisis de transferencia western utilizando anticuerpos espedficos.

FIG. 9. Exosomas derivados de MSCs suprimen la secrecion inducida por hipoxia de HIMF/FIZZ-1/Retn1a en el pulmon. Ratones a los que se inyectaron 10 pg de MEX (M) o vedculo (V) por la vena de la cola fueron expuestos durante los periodos de tiempo indicados a hipoxia monobarica (8,5% de O2). Las protemas en BAL normalizadas en volumen (A) y la cantidad (B) de cada uno de los ratones individuales en el mismo grupo se agruparon y se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida al 14%. Los niveles de HIMF, lisozima e IgA fueron evaluados por analisis de transferencia western utilizando anticuerpos espedficos.

FIG. 10. Exosomas derivados de MSCs suprimen la secrecion inducida por hipoxia de HIMF/FIZZ-1/Retn1a en el pulmon. Ratones a los que se inyectaron 10 pg de MEX (M) o vedculo (V) por la vena de la cola fueron expuestos durante los periodos de tiempo indicados a hipoxia monobarica (8,5% de O2). 10 pg de protemas BAL de cada uno de los ratones individuales se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida al 14% (A, B). Las protemas en BAL normalizadas por la cantidad de cada uno de los ratones individuales en el mismo grupo se agruparon y se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida al 14% (C). Los niveles de HIMF, lisozima e IgA fueron evaluados por analisis de transferencia western utilizando anticuerpos espedficos.

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FIG. 11. Exosomas derivados de MSCs suprimen la regulacion positiva inducida por hipoxia de HIF2a en el tejido pulmonar. Ratones a los que se inyectaron 10 |jg de MEX o vehmulo por la vena de la cola fueron expuestos durante los periodos de tiempo indicados a hipoxia monobarica (8,5% de O2). Una cantidad equivalente de protemas a partir de homogeneizado de tejido pulmonar individual se separo por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida. Los niveles de HIF2a y actina se detectaron por analisis de transferencia western utilizando anticuerpos espedficos (A, B). Las intensidades relativas para HIF2a/actina fueron evaluadas por analisis densitometrico (C). **, p <0,01 frente a normoxia (n = 4 ± DE, ANOVA de una via); ##, p <0,01 frente a vehmulo (hipoxia, 2 dfas) (n = 4 ± DE, ANOVA de una via).

FIG. 12. Exosomas derivados de MSCs suprimen la activacion inducida por hipoxia de NFkB p65 en el tejido pulmonar. Ratones a los que se inyectaron 10 jg de MEX o vehmulo por la vena de la cola fueron expuestos durante los periodos de tiempo indicados a hipoxia monobarica (8,5% de O2). Una cantidad equivalente de protemas a partir de homogeneizado de tejido pulmonar individual se separo por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida. Los niveles de p65, p65 fosforilado (S536) y actina se detectaron mediante analisis de transferencia western utilizando anticuerpos espedficos (A, B). Las intensidades relativas para P-p65/actina fueron evaluadas por analisis densitometrico (C). *, p <0,05 frente a normoxia (n = 4 ± DE, ANOVA de una via); ##, p <0,01 frente a vehmulo (hipoxia, 2 dfas) (n = 4 ± DE, ANOVA de una via).

FIG. 13. Exosomas derivados de MSCs suprimen la activacion inducida por hipoxia de STAT3 en el tejido pulmonar. Ratones a los que se inyectaron 10 jg de MEX o vehmulo por la vena de la cola fueron expuestos a hipoxia monobarica (8,5% de O2) durante 2 dfas. Una cantidad equivalente de protemas a partir de homogeneizados de tejido pulmonar individuales se separo por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida. Los niveles de STAT3, STAT3 fosforilada (Y705) y actina se detectaron por analisis de transferencia western utilizando anticuerpos espedficos (A). Las intensidades relativas para P-STAT3/STAT3 fueron evaluadas por analisis densitometrico (B). **, p <0,01 frente a normoxia (n = 4 ± DE, ANOVA de una via; ##, p <0,01 frente a vehmulo (n = 4 ± DE, ANOVA de una via).

FIG. 14. Exosomas derivados de MSCs suprimen la activacion inducida por hipoxia de STAT3 en el tejido pulmonar. Ratones a los que se inyectaron 10 jg de MEX o vehmulo por la vena de la cola fueron expuestos durante los periodos de tiempo indicados a hipoxia monobarica (8,5% de O2). Una cantidad equivalente de protemas a partir de homogeneizado de tejido pulmonar individual se separo por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida. Los niveles de STAT3 (Y705) y actina se detectaron por analisis de transferencia western utilizando anticuerpos espedficos (A, B). Las intensidades relativas para P-STAT3/actina fueron evaluadas por analisis densitometrico (C). ***, p <0,001 frente a normoxia o vehmulo (hipoxia, 7 dfas), o MEX (hipoxia, 2 y 7 dfas) (n = 4 ± DE, ANOVA de una via; ###, p <0,001 frente a vehmulo (hipoxia, 2 dfas) (n = 4 ± DE, ANOVA de una via); ns normoxia frente a MEX (hipoxia, 2 dfas) (n = 4 ± DE, ANOVA de una via).

FIG. 15. Exosomas derivados de MSCs suprimen la regulacion positiva de HIMF inducida por hipoxia en el tejido pulmonar. Ratones a los que se inyectaron 10 jg de MEX o vehmulo por la vena de la cola fueron expuestos a hipoxia monobarica (8,5% de O2) durante 7 dfas. Una cantidad equivalente de protemas a partir de homogeneizado de tejido pulmonar individual se separo por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida. Los niveles de HIMF y actina se detectaron por analisis de transferencia western utilizando anticuerpos espedficos (A). Las intensidades relativas para HIMF/actina fueron evaluadas por analisis densitometrico (B). **, p <0,01 frente a normoxia (n = 4 ± DE, ANOVA de una via; #, p <0,05 frente a vehmulo (n = 4 ± DE, ANOVA de una via). estadfsticamente no significativa entre MEX frente a normoxia (n = 4 ± DE, ANOVA de una via).

FIG. 16. Exosomas derivados de MSCs suprimen la regulacion positiva de HIMF inducida por hipoxia en el tejido pulmonar. Ratones a los que se inyectaron 10 jg de MEX o vehmulo por la vena de la cola fueron expuestos durante los periodos de tiempo indicados a hipoxia monobarica (8,5% de O2). Una cantidad equivalente de protemas a partir de homogeneizado de tejido pulmonar individual se separo por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida. Los niveles de HIMF y actina se detectaron por analisis de transferencia western utilizando anticuerpos espedficos (A, B). Las intensidades relativas para HIMF/actina fueron evaluadas por analisis densitometrico (C, D). ***, p < 0,001 frente a normoxia (n = 4 ± DE, ANOVA de una via; **, p < 0,01 frente a normoxia (n = 4 ± DE, ANOVA de una via; #, p <0,05 frente a vehmulo (n = 4 ± DE, ANOVA de una via).

FIG. 17. Exosomas derivados de MSCs protegen hipertrofia cardfaca derecha inducida por hipoxia cronica. Ratones a los que se inyectaron 10 jg de MEX (M) o vehmulo (V) por la vena de la cola fueron expuestos durante los periodos de tiempo indicados a hipoxia monobarica (8,5% de O2) durante 3 semanas (A). Corazones de ratones individuales se procesaron, a continuacion se midio la relacion de RV/(LV + S) (B). ***, p < 0,001 frente a normoxia (n = 9, ANOVA de una via); ###, p <0,001 frente a vehmulo (n = 11, ANOVA de una via); estadfsticamente no significativa entre MEX y normoxia (ANOVA de una via)

FIG.18. Perfil de alta resolucion de la purificacion de exosomas de MSC por FPLC (Cromatograffa Lfquida de Protemas Rapida). Panel superior: Cromatograffa Lfquida de Protemas Rapida de purificacion de exosomas de MSC. Matriz: HiPrep Sephracyl S-400. Fase movil Solucion Salina Tamponada con Fosfato, 300 mM. Caudal: 0,5

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ml/min. Medios acondicionados concentrados se aplicaron a la columna y la protema eluida se vigilo por A280. exosomas de MSC (MEX) aislados eluyeron a 65,5 ml. Un patron de tamano molecular de nanopartmulas de 50 nm de diametro co-eluyo con exosomas de MSC. Panel inferior: las fracciones del producto eluido se aplicaron a un gel de electroforesis de poliacrilamida nativo y posteriormente se tineron para la protema total. La fraccion MEX migro como formas de alto PM, distintas de la protema a granel en el medio acondicionado.

FIG. 19. Los MEX de origen murino o humano suprimen la activacion hipoxica de STAT3. (A) Extractos totales de protemas de los pulmones de animales individuales tratados con 10 |jg de preparaciones de MEX. Panel derecho: la exposicion a la hipoxia durante 2 dfas resulto en la activacion de STAT3 a traves de la fosforilacion en Tyr-705 (pY- STAT3) en pulmon de raton, y esto se evito por tratamiento con MEX de origen murino. Panel derecho: cuantificacion de la activacion de STAT3. Para todos los grupos, n = 4, ANOVA de una via: **, p <0,01 frente a normoxia. **, p <0,01 frente a PBS. (B) Cultivos primarios de Celulas Endoteliales la Arteria Pulmonar humanas (hPAECs) expuestas a hipoxia (1% de O2, 5 h) exhiben una activacion robusta de STAT3 que se suprime de manera eficiente en presencia de MEX secretada por las MSC del estroma del cordon umbilical humano (hUC-MEX). La fraccion agotada en microvesmulas de medios condicionados por hUC-MSCs (hUC-ExD-CM) no tiene efecto sobre la activacion de STAT3.

FIG. 20. El tratamiento con MEX suprime la induccion hipoxica de la superfamilia miR-17 de microARN y aumenta los niveles de miR-204 anti-proliferativa en el pulmon. Los niveles de microARN en pulmon total de raton de animales tratados con 10 jg de preparaciones MEX. Los niveles de miR se evaluaron mediante qPCR a los 7 dfas de la exposicion hipoxica y se presentan con relacion a la media del grupo normoxico. (A) Seleccionar miRs que representan los racimos miR-17~92, miR-106b~25 y miR-106a~363. (B) Seleccionar miRs de los que se informa que estan implicados en la senalizacion de la hipoxia. (C) Regulacion positiva de los niveles basales de miR-204 espedfica de la arteriola pulmonar tras el tratamiento MEX. Los puntos representan los niveles de expresion en los animales individuales. NRX: normoxia; HPX: hipoxia. Para todos los grupos, n = 4, ANOVA de una via: **,

, p < 0,01; p < 0,001 frente a normoxia. §, p < 0,001 frente a PBS.

FIG. 21. Esquema de una hipotesis no limitativa que sintetiza los resultados de este estudio. La hipoxia desplaza el equilibrio Th1/Th2 de inmunomoduladores en el pulmon, lo que resulta en macrofagos alveolares activados alternativos (AA-AM9) y, en la fase temprana, induce la expresion de HIMF en el epitelio pulmonar. Accion mitogenica de HIMF sobre la vasculatura requiere citoquinas Th2 tales como lL-4. Consecuencias del desplazamiento hacia la proliferacion incluyen la activacion hipoxica de la senalizacion de STAT3 y la regulacion positiva de la familia miR-17 de microARNs. El tratamiento con MEX interfiere con una senal hipoxica temprana en el pulmon, suprimiendo tanto la inflamacion y como la regulacion positiva transcripcional de HIMF. Ademas, el tratamiento con MEX puede regular directamente de forma positiva los niveles de miR-204, rompiendo asf el bucle directo de alimentacion STAT3-miR-204-STAT3, y desplazando el equilibrio a un estado anti-proliferativo.

FIG. 22. Marcadores espedficos para los exosomas de MSCs humanas de gelatina de Wharton (WJ). El analisis de transferencia Western de la fraccion de 50 nm (E1) de las siguientes fuentes: UC: medios de crecimiento de MSC no acondicionados. MPD UC: medios de cultivo agotados en micropartmulas. Marcadores exosomales en el medio de crecimiento se separan por precipitacion con polietilenglicol. hMEX: exosomas de MSCs de WJ. hFEX: exosomas de fibroblastos dermicos humanos. Tetraespaninas CD9 y CD81 estan enriquecen en las fracciones exosomales.

FIG. 23. mMEX suprime la regulacion positiva hipoxica de HIF1a y la fosforilacion de STAT3 en fibroblastos de pulmon de raton. Fibroblastos de pulmon de raton fueron expuestos a hipoxia en presencia o ausencia de exosomas derivados de MSC de medula osea de raton (mMEX), tal como se indica. La estabilizacion del factor inducible por hipoxia (HIF) y la activacion de STAT3 por fosforilacion (P-STAT3) se determinaron por transferencia western.

FIG. 24. hPAEC tratadas con exosomas de MSCs derivadas de medula osea de raton (mMEX, 1 ug/ml) o exosomas de fibroblastos de pulmon de raton (mFEX, 1 ug/ml) fueron expuestas a 1% de O2 durante 6 h. La activacion hipoxica de STAT3 (P-STAT3), STAT3 total y la estabilizacion de HIF2a se determinaron por transferencia western. NRX: normoxia. PBS: control de hipoxia.

FIG. 25. PAECs humanas tratadas con exosomas de MSCs de jalea de Wharton (hMEX, 1 ug/ml) o exosomas de fibroblastos dermicos humanos (hFEX, 1 ug/ml) fueron expuestas a 1% de O2 durante 6 h. s Stat = 3 activacion (P- STAT3) y STAT3 total de se determinaron por transferencia western. NRX: normoxia. PBS: control de hipoxia.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La invencion se basa, en parte, en el sorprendente hallazgo de que los exosomas derivados de celulas madre mesenquimales proporcionan un efecto terapeutico a determinadas enfermedades pulmonares, incluyendo, pero no limitadas a enfermedades pulmonares inflamatorias.

La invencion se define en las reivindicaciones.

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La invencion se refiere, en terminos generales, a composiciones de exosomas derivados de celulas madre mesenquimales (MSC), a los que se alude indistintamente como exosomas de celulas madre mesenquimales o exosomas de MSC, y a metodos de su uso en el tratamiento y/o la prevencion de determinadas enfermedades pulmonares, incluyendo pero no limitadas a las enfermedades pulmonares inflamatorias.

Exosomas y Preparacion de Exosomas

Los exosomas de la invencion son vesmulas de la membrana (es decir, bicapa lip^dica) que son liberados a partir de celulas madre mesenquimales. Tienen un diametro que oscila entre aproximadamente 30 nm y 100 nm. Por microscopfa electronica, los exosomas parecen tener una morfologfa en forma de copa. Se sedimentan a aproximadamente 100.000 x g y tienen una densidad de flotacion en sacarosa de aproximadamente 1,10 a aproximadamente 1,21 g/ml. A los exosomas se les puede aludir como microvesmulas o nanovesmulas.

Los exosomas pueden comprender un cierto numero de protemas y/o acidos nucleicos que incluyen especies de ARN, tales como ARNmi. Las protemas que pueden expresarse en exosomas incluyen Alix, TSG101, cD63, CD9, CD81, moesina, HSP70, Dicer, M-CSF, osteopontina, y una o mas de las protemas enumeradas en la Tabla 1 (incluyendo cualquier combinacion de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de esas protemas, junto con cualquiera de las protemas enumeradas anteriormente). En algunas realizaciones, los exosomas, incluyendo los exosomas sinteticos que se comentan mas adelante, comprenden ARNmi, Dicer, M-CSF, osteopontina y una o mas de las protemas de la Tabla 1 (incluyendo todas las protemas de la Tabla 1).

La invencion se refiere a exosomas aislados. Tal como se utiliza en esta memoria, un exosome aislado es uno que esta separado ffsicamente de su entorno natural. Un exosoma aislado puede separarse ffsicamente, en su totalidad o en parte, a partir de tejido o celulas con los que naturalmente existe, incluyendo celulas madre mesenquimales. En algunas realizaciones de la invencion, una composicion de exosomas aislados puede estar libre de celulas, tales como celulas madre mesenquimales, o puede estar libre o sustancialmente libre de medios acondicionados. En algunas realizaciones, los exosomas aislados pueden proporcionarse en una concentracion mas alta que los exosomas presentes en medios acondicionados no manipulados.

Los exosomas se pueden aislar de medios acondicionados de cultivo de celulas madre mesenquimales. Un metodo para la recogida de exosomas de celulas madre mesenquimales se proporciona en los Ejemplos. En smtesis, un metodo de este tipo implica cultivar primero celulas madre mesenquimales bajo condiciones estandares hasta que alcancen aproximadamente un 70% de confluencia, y despues cultivar las celulas en un medio libre de suero durante 24 horas, despues de lo cual los medios acondicionados se recogen y se someten a centrifugacion diferencial a 400 xg durante 10 minutos y a 12000 xg durante 10 minutos con el fin de separar las celulas y restos celulares. Los medios acondicionados clarificados se concentran a continuacion por ultrafiltracion utilizando un filtro MWCO de 100 kDa (Millipore), y despues se centrifugo de nuevo a 12000 xg durante 10 minutos. Los exosomas se afslan a continuacion, utilizando la cromatograffa de exclusion por tamano mediante la carga del medio acondicionado concentrado en una columna equilibrada con PBS Chroma S-200 (Clontech), eluyendo con PBS y recogiendo fracciones de 350-550 microlitros. Las fracciones que conteman exosomas se identifican y potencialmente se agrupan. La concentracion de protema se mide utilizando un ensayo de Bradford estandar (BioRad). Partes almuotas de las preparaciones de exosomas enriquecidos se pueden almacenar a -80°C.

Los exosomas pueden tambien ser purificados por ultracentrifugacion de medios acondicionados clarificados a 100.000 x g. Tambien pueden ser purificados por ultracentrifugacion en un colchon de sacarosa. Metodos GMP para la purificacion de exosomas de las celulas dendnticas se han descrito en J Immunol Methods. 2002; 270: 211-226.

Los exosomas tambien se pueden purificar por filtracion diferencial, a traves de filtros de membrana de nilon de tamano de poro definido. Una primera filtracion a traves de un tamano de poros grande retendra fragmentos celulares y residuos. Una filtracion posterior a traves de un tamano de poros mas pequeno retendra exosomas y los purificara de contaminantes de menor tamano.

La divulgacion tambien contempla el uso de exosomas sinteticos que tienen algunas o todas las caractensticas de los exosomas de MSC aislados descritos en esta memoria. Estos exosomas sinteticos se sintetizaran in vitro (en lugar de derivarse y aislarse de MSC o MSC-CM). Pueden ser liposomas sinteticos que tienen uno o mas, incluyendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o mas de las protemas enumeradas en la Tabla 1 o la FIG. 22. Pueden o pueden no comprender acidos nucleicos que codifican una o mas, incluyendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o mas de estas protemas. La smtesis de liposomas es conocida en la tecnica, y los liposomas se pueden adquirir de fuentes comerciales. Ha de entenderse que las diversas composiciones, formulaciones, metodos y usos descritos en esta memoria con relacion a los exosomas derivados y aislados a partir de MSC o MSC-CM tambien se contemplan en el contexto de exosomas sinteticos.

La invencion contempla el uso inmediato de exosomas o, alternativamente, el almacenamiento a corto y/o a largo plazo de los exosomas, por ejemplo, en un estado crioconservado antes de su uso. Inhibidores de proteinasa se incluyen tipicamente en medios de congelacion, ya que proporcionan la integridad de los exosomas durante el

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almacenamiento a largo plazo. No se prefiere la congelacion a -20°C, ya que se asocia con una mayor perdida de actividad de los exosomas. La congelacion rapida a -80°C es mas preferida, ya que preserva la actividad. (Vease, por ejemplo, Kidney International (2006) 69, 1471-1476). Se pueden utilizar aditivos para los medios de congelacion con el fin de potenciar la conservacion de la actividad biologica de exosomas. Este tipo de aditivos sera similar a los utilizados para la crioconservacion de celulas intactas y pueden incluir, pero no se limitan a DMSO, glicerol y polietileglicol.

Tabla 1.

Proteinas especificas y abundantes asociadas con MEX frente a FEX

Identificacion

N° Acc. Espectros MS/MS Cobertura de secuencia (%) Espectros MS/MS en FEX

Haptoglobina

q61646 166 15,9 2

Protema union a galedina-3

q07797 39 43,7 0

Trombospondina-2

q03350 36 23,5 0

Lactadherina

p21956 32 26,5 2

Protema potenciadora de union a adipocitos 1

q640n1 27 19,1 3

Vimentina

p20152 28 35,0 0

Proteasoma subunidad alfa tipo-2

p49722 26 50,9 3

Protema amiloide beta A4

p12023 26 | 27,1 2

*Los datos se presentaron cuando los aciertos totals MS/MS son >25 y la relacion de MEX/FEX en la cobertura de la secuencia es > 3 para la protema particular

Celulas Madre Mesenquimales

Una celula madre mesenquimal es una celula progenitora que tiene la capacidad de diferenciarse en celulas neuronales, adipocitos, condrocitos, osteoblastos, miocitos, tejido cardfaco, y otras celulas endoteliales y epiteliales. (Vease, por ejemplo, Wang, Stem Cells 2004;22(7);1330-7; McElreavey; 1991 Biochem Soc Trans (1); 29s; Takechi, Placenta 1993 marzo/abril; 14 (2); 235-45; Takechi, 1993; Kobayashi; Early Human Development; 1998; 10 de julio; 51 (3); 223-33; Yen; Stem Cells; 2005; 23 (1) 3-9). Estas celulas pueden ser definidas fenoffpicamente por la expresion genica o de proteinas. Estas celulas se han caracterizado para expresar (y por tanto ser positivas para) una o mas de CD13, CD29, CD44, CD49a, b, c, e, f, CD51, CD54, CD58, CD71, CD73, CD90, CD102, CD105, CD106, CDw119, CD120a, CD120b, CD123, CD124, CD126, CD127, CD140a, CD166, P75, TGF-bIR, TGF-bIIR, HLA-A, B, C, SSEA-3, SSEA-4, D7 y PD- L1. Estas celulas tambien se han caracterizado como que no expresan (y, por tanto, son negativas para) CD3, CD5, CD6, CD9, CD10, CD11a, CD14, CD15, CD18, CD21, CD25, CD31, CD34, CD36, CD38, CD45, CD49d, CD50, CD62E, L, S, CD80, CD86, CD95, CD117, CD133, SSEA-1 y ABO. Por lo tanto, las celulas madre mesenquimales se pueden caracterizar fenoffpica y/o funcionalmente de acuerdo con su potencial de diferenciacion.

Las celulas madre mesenquimales se pueden recoger de un cierto numero de fuentes, incluyendo pero no limitadas a la medula osea, la sangre, el periostio, la dermis, sangre y/o matriz del cordon umbilical (p. ej., gelatina de Wharton) y la placenta. Metodos para la recogida de celulas madre mesenquimales se describen con mayor detalle en los Ejemplos. Tambien se puede hacer referencia a la Patente de EE.Uu. N° 5486359 para otros metodos de recogida que se pueden utilizar en la presente invencion.

Las celulas madre mesenquimales y, por lo tanto, los exosomas, contemplados para uso en los metodos de la divulgacion se pueden derivar del mismo sujeto a tratar (y, por lo tanto, se las aludira como autologas al sujeto) o se pueden derivar de un sujeto diferente, preferiblemente de la misma especie (y, por lo tanto, se las aludira como alogenicas para el sujeto).

Tal como se utiliza en esta memoria, ha de entenderse que los aspectos y realizaciones de la invencion se refieren a celulas, asf como las poblaciones de celulas, a menos que se indique lo contrario. Asf, cuando se recita una celula, ha de entenderse que tambien se contempla una poblacion de celulas, a menos que se indique lo contrario.

Tal como se utiliza en esta memoria, una celula madre mesenquimal aislada es una celula madre mesenquimal que ha sido separada ffsicamente de su entorno natural, incluyendo la separacion ffsica de uno o mas componentes de su entorno natural. Por lo tanto, una celula aislada o poblacion de celulas abarca una celula o una poblacion de celulas que ha sido manipulada in vitro o ex vivo. Como un ejemplo, celulas madre mesenquimales aisladas pueden ser celulas madre mesenquimales que han sido separadas ffsicamente de al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, mas preferiblemente al menos 70% e incluso mas preferentemente al menos 80% de las celulas en el tejido del que se recogen las celulas madre mesenquimales. En algunos casos, las celulas madre mesenquimales aisladas estan presentes en una poblacion que es al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% celulas madre mesenquimales tal como se define fenoffpica y/o funcionalmente en esta memoria.

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Preferiblemente, la relacion de celulas madre mesenquimales a otras celulas se incrementa en la preparacion aislada en comparacion con la poblacion de partida de celulas.

Las celulas madre mesenquimales se pueden aislar utilizando metodos conocidos en la tecnica, p. ej., a partir de celulas mononucleares de medula osea, sangre de cordon umbilical, tejido adiposo, tejido placentario, basandose en su adherencia al plastico de cultivo de tejidos. Por ejemplo, las celulas madre mesenquimales se pueden aislar a partir de aspirados de medula osea disponibles comercialmente. El enriquecimiento de celulas madre mesenquimales dentro de una poblacion de celulas se puede lograr utilizando metodos conocidos en la tecnica que incluyen, pero no se limitan a FACS.

Medios comercialmente disponibles pueden ser utilizados para el crecimiento, el cultivo y el mantenimiento de celulas madre mesenquimales. Tales medios incluyen, pero no se limitan a medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Componentes de tales medios que son utiles para el crecimiento, el cultivo y el mantenimiento de las celulas madre mesenquimales incluyen, pero no se limitan a aminoacidos, vitaminas, una fuente de carbono (natural y no natural), sales, azucares, hidrolizados derivados de plantas, piruvato de sodio, tensioactivos, amomaco, lfpidos, hormonas o factores de crecimiento, tampones, aminoacidos no naturales, precursores de azucares, indicadores, nucleosidos y/o nucleotidos, butirato o compuestos organicos, DMSO, productos derivados de animales, inductores de genes, azucares no naturales, reguladores de pH intracelular, betama u osmoprotector, oligoelementos, minerales, vitaminas no naturales. Los componentes adicionales que pueden utilizarse para complementar un medio de cultivo tisular comercialmente disponible incluyen, por ejemplo, suero animal (p. ej., suero bovino fetal (FBS), suero de ternero fetal (FCS), suero de caballo (HS)), antibioticos (p. ej., incluyendo pero no limitados a penicilina, estreptomicina, sulfato de neomicina, anfotericina B, blasticidina, cloranfenicol, amoxicilina, bacitracina, bleomicina, cefalosporina, clortetraciclina, zeocina y puromicina) y glutamina (p. ej., L-glutamina). La supervivencia de las celulas madre mesenquimales y el crecimiento tambien dependen del mantenimiento de un entorno aerobio apropiado, pH y temperatura. Las celulas madre mesenquimales se pueden mantener utilizando metodos conocidos en la tecnica. (Vease, por ejemplo, Pittenger et al., Science, 284:143-147 (1999)).

Sujetos

Los metodos de la divulgacion se pueden realizar en cualquier sujeto que tenga probabilidades de obtener beneficios de los mismos, incluyendo sujetos humanos, animales de granja agncola (p. ej., vacas, cerdos, etc.), animales preciadas (p. ej., caballos), animales de compama (p. ej., perros, gatos, etc.), y similares. En diversos aspectos, se prefieren los sujetos humanos. En algun aspecto, se utilizan sujetos humanos y exosomas de MSC humanos.

Los sujetos pueden ser los que tienen una enfermedad (o afeccion) pulmonar, susceptibles de tratamiento utilizando los exosomas de la invencion, o pueden ser aquellos que estan en riesgo de desarrollar una enfermedad (o afeccion) de este tipo. Tales sujetos incluyen los neonatos y, en particular, los neonatos nacidos a una baja edad gestacional. Tal como se utiliza en esta memoria, un neonato humano se refiere a un ser humano desde el momento del nacimiento hasta aproximadamente 4 semanas de edad. Tal como se utiliza en esta memoria, un nifo humano se refiere a un ser humano desde aproximadamente la edad de 4 semanas a aproximadamente 3 afos de edad. Tal como se utiliza en esta memoria, baja edad gestacional se refiere al nacimiento (o parto) que se produce antes de un plazo de gestacion normal para una especie determinada. En los seres humanos, un plazo de gestacion completo es de aproximadamente 40 semanas y puede oscilar entre 37 semanas y mas de 40 semanas. Baja edad gestacional, en seres humanos, similar a un nacimiento prematuro se define como el nacimiento que se produce antes de las 37 semanas de gestacion. Por consiguiente, la invencion contempla la prevencion y/o el tratamiento de sujetos nacidos antes de las 37 semanas de gestacion, incluyendo los nacidos en plazos de gestacion incluso mas cortos (p. ej., antes de 36, antes de 35, antes de 34, antes de 33, antes de 32, antes de 31, antes de 30, antes de 29, antes de 28, antes de 27, antes de 26 o antes de 25 semanas de gestacion). Tfpicamente, tales nifos prematuros seran tratados como neonatos, sin embargo, la invencion contempla su tratamiento incluso mas alla de la etapa de neonato y en la infancia y/o la edad adulta. Determinados sujetos pueden tener una predisposicion genetica a determinadas formas de enfermedad pulmonar tales como, por ejemplo, hipertension pulmonar, y esos sujetos tambien pueden tratarse de acuerdo con la invencion.

Metodos de Prevenir y Tratar Enfermedades

La invencion contempla la prevencion y el tratamiento de determinadas enfermedades pulmonares. Prevenir una enfermedad significa reducir la probabilidad de que la enfermedad se manifieste y/o retrase la aparicion de la enfermedad. Tratar una enfermedad significa reducir o eliminar los smtomas de la enfermedad.

La invencion pretende prevenir y/o tratar un cierto numero de enfermedades de los pulmones (o pulmonares). Estas enfermedades incluyen enfermedades pulmonares inflamatorias tales como, pero no limitados a la hipertension pulmonar (PH), a la que tambien se alude como la hipertension arterial pulmonar (PAH), asma, displasia broncopulmonar (BPD), alergias, sarcoidosis y fibrosis pulmonar idiopatica. Estas enfermedades incluyen tambien enfermedades vasculares de los pulmones que pueden no tener un componente inflamatorio. Todavfa otras

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condiciones pulmonares que pueden ser tratadas de acuerdo con la invencion incluyen lesion pulmonar aguda que puede estar asociada con la sepsis o con la ventilacion. Un ejemplo de esta ultima afeccion es el smdrome de dificultad respiratoria aguda que se produce en ninos mayores y adultos.

La hipertension pulmonar es una enfermedad pulmonar caracterizada por presion arterial en la arteria pulmonar que esta muy por encima de los niveles normales. Los smtomas incluyen falta de aliento, dolor en el pecho, en particular durante la actividad ffsica, debilidad, fatiga, desmayos, ligeros mareos particularmente durante el ejercicio, mareos, ruidos cardfacos anormales y murmullos, congestion de la vena yugular, retencion de fluido en el abdomen, las piernas y los tobillos y coloracion azulada en el lecho de la una.

La displasia broncopulmonar es una afeccion que afecta a los recien nacidos a los que se ha dado oxfgeno o han estado en respiradores, o neonatos nacidos prematuramente, en particular los que han nacido muy prematuramente (p. ej., aquellos nacidos antes de las 32 semanas de gestacion). Tambien se la alude como la enfermedad pulmonar cronica neonatal. Causas de BPD incluyen lesion mecanica, por ejemplo como resultado de la ventilacion, la toxicidad del oxfgeno, por ejemplo como resultado de la terapia de oxfgeno, y la infeccion. La enfermedad puede progresar de no inflamatoria a inflamatoria con el tiempo. Los smtomas incluyen piel azulada, tos cronica, respiracion rapida y dificultad para respirar. Sujetos que tienen BPD son mas susceptibles a infecciones tales como infeccion por el virus sincitial respiratorio. Sujetos que tienen BPD pueden desarrollar la hipertension pulmonar.

El smdrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), tambien conocido como smdrome de dificultad respiratoria (RDS) o smdrome disneico del adulto es una afeccion que se produce como resultado de lesion a los pulmones o enfermedad aguda. La lesion en el pulmon puede ser el resultado de la ventilacion, trauma, quemaduras y/o aspiracion. La enfermedad aguda puede ser una neumoma o sepsis. Se considera una forma grave de lesion pulmonar aguda, y es a menudo fatal. Se caracteriza por la inflamacion pulmonar, el intercambio gaseoso deteriorado y la liberacion de mediadores inflamatorios, hipoxemia y fallo multiple de organos. El ARDS tambien se puede definir como la relacion de la tension arterial parcial de oxfgeno (PaO2) como una fraccion de oxfgeno inspirado (FO2) por debajo de 200 mm de Hg en presencia de infiltrados bilaterales en la radiograffa de torax. Una relacion PaO2/FiO2 de menos de 300 mm de Hg con infiltrados bilaterales indica lesion pulmonar aguda, que es a menudo un precursor de ARDS. Los smtomas de ARDS incluyen dificultad para respirar, taquipnea y confusion mental debido a los bajos niveles de oxfgeno.

La fibrosis pulmonar idiopatica se caracteriza por cicatrizacion o engrosamiento de los pulmones sin una causa conocida. Se presenta con mayor frecuencia en personas de 50-70 anos de edad. Sus smtomas incluyen falta de aliento, tos regular (tfpicamente una tos seca), dolor de pecho y disminucion del nivel de actividad.

La prevencion y/o el tratamiento pueden implicar en algunos casos el uso de los exosomas de MSC solo o junto con uno o mas agentes secundarios. Los sujetos tambien pueden ser sometidos a intervenciones mecanicas tales como la ventilacion con o sin la administracion de oxfgeno exogeno.

Con respecto a los neonatos y particularmente neonatos de baja edad de gestacion, la invencion contempla la administracion de los exosomas de MSC dentro de las 4 semanas, 3 semanas, 2 semanas, 1 semana, 6 dfas, 5 dfas, 4 dfas, 3 dfas, 2 dfas, 1 dfa, 12 horas, 6 horas, 3 horas o 1 hora del nacimiento. En algunos casos importantes, los exosomas de MSC se administran dentro de 1 hora del nacimiento.

La descripcion contempla, ademas, la administracion de exosomas de MSC, incluso en ausencia de smtomas indicativos de una enfermedad pulmonar tal como, pero no limitado a BPD.

La divulgacion tambien contempla la administracion repetida de exosomas de MSC, incluyendo dos, tres, cuatro, cinco o mas administraciones de exosomas de MSC. En algunos casos, los exosomas de MSC se pueden administrar de forma continua. La administracion repetida o continua se puede producir durante un penodo de varias horas (p. ej., 1-2, 1-3, 1-6, 1-12, 1-18 o 1-24 horas), varios dfas (p. ej., 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6 dfas o 1-7 dfas) o varias semanas (p. ej., 1-2 semanas, 1-3 semanas o 1-4 semanas) dependiendo de la gravedad de la afeccion que esta siendo tratada. Si la administracion se repite, pero no se continua, el tiempo entre las administraciones puede ser horas (p. ej., 4 horas, 6 horas o 12 horas), dfas (p. ej., 1 dfa, 2 dfas, 3 dfas, 4 dfas, 5 dfas o 6 dfas), o semanas (por ejemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas). El tiempo entre las administraciones puede ser el mismo o puede ser diferente. Como un ejemplo, si los smtomas de la enfermedad parecen que estan empeorando, los exosomas de MSC se pueden administrar mas frecuentemente, y luego una vez se estabilizan los smtomas o la disminucion de los exosomas de MSC puede administrarse con menos frecuencia.

En algunos casos importantes, los exosomas de MSC se administran al menos una vez dentro de las 24 horas del nacimiento y a continuacion al menos una vez mas dentro de 1 semana de nacimiento. Incluso mas preferiblemente, los exosomas de MSC se administran al menos una vez dentro de 1 hora de nacimiento y luego al menos una vez mas dentro de 3-4 dfas de nacimiento.

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En algunos casos, puede producirse la administracion repetida por via intravenosa de bajas dosis de exosomas de MSC. Se ha encontrado que cuando las dosis bajas de exosomas de MSC se administraron por via intravenosa a sujetos murinos, se alcanzo la actividad maxima cuando los exosomas de MSC se administraron cada 2-4 dfas. En estos experimented, 100 ng de exosomas de MSC se administraron a un raton de un promedio de 20 gramos, que corresponde a una dosis de 5 microgramos por kilogramo. Cuando se utilizaron dosis mas altas (p. ej., 10 microgramos por 20 gramos de raton o 0,5 miligramos por kilogramo), una sola administracion intravenosa fue suficiente para conseguir la proteccion a largo plazo. Por consiguiente, la divulgacion contempla la administracion repetida de las formas de dosificacion baja de exosomas de MSC, asf como las administraciones individuales de formas de alta dosificacion de exosomas de MSC. Formas de dosificacion baja pueden variar desde, sin limitacion, 1-50 microgramos por kilogramo, mientras que formas de dosificacion altas pueden variar desde, sin limitacion, 511000 microgramos por kilogramo. Se entendera que, dependiendo de la gravedad de la enfermedad, la salud del sujeto, y la via de administracion, entre otros, se contempla la administracion unica o repetida de exosomas de MSC dosis baja o alta.

Administradon, Composiciones Farmaceuticas, Cantidades Eficaces

Los exosomas de MSC se pueden utilizar (p. ej., administrar) en preparaciones farmaceuticamente aceptables (o composiciones farmaceuticamente aceptables), tfpicamente cuando se combinan con un soporte farmaceuticamente aceptable. Tales preparaciones pueden contener rutinariamente concentraciones farmaceuticamente aceptables de sal, agentes tampon, conservantes, soportes compatibles, y pueden comprender opcionalmente otros agentes terapeuticos (es decir, secundarios).

Un soporte farmaceuticamente aceptable es un material aceptable, composicion o vehteulo farmaceuticamente tal como una carga, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante ftquido o solido, implicado en llevar o transportar un agente activo de manera profilactica o terapeutica. Cada uno de los soportes debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulacion y no perjudicial para el sujeto. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como soportes farmaceuticamente aceptables incluyen azucares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; glicoles tales como propilenglicol; polioles tales como glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol; esteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agentes tampon tales como hidroxido de magnesio e hidroxido de aluminio; agua apirogena; solucion salina isotonica; solucion de Ringer; alcohol eftlico; soluciones tampon fosfato; y otras sustancias compatibles no toxicas empleadas en formulaciones farmaceuticas.

Agentes Terapeuticos Secundarios. Los exosomas se pueden administrar con uno o mas agentes terapeuticos secundarios. Tal como se utiliza en esta memoria, un agente terapeutico se refiere a cualquier agente que se puede utilizar en la prevencion, el tratamiento y/o la gestion de una enfermedad pulmonar tal como las comentadas en esta memoria. Estas incluyen, pero no se limitan a tensioactivos, oxido nftrico inhalado, almitrina bismesilato, inmunomoduladores y antioxidantes. Ejemplos de inmunomoduladores incluyen esteroides y corticosteroides tales como, pero no limitado a metilprednisolona. Ejemplos de antioxidantes incluyen, pero no se limitan a la superoxido dismutasa.

Determinados agentes terapeuticos secundarios utilizados en el tratamiento o la gestion de determinadas enfermedades pulmonares, incluyendo, pero no limitados a la hipertension pulmonar, incluyen oxfgeno, anticoagulantes tales como warfarina (Coumadina); diureticos tales como furosemida (Lasix®) o espironalactona (Aldactone®); bloqueadores de los canales de calcio; de potasio tal como K-dur®; agentes inotropicos tales como digoxina; vasodilatadores tales como nifedipina (Procardia®) o diltiazem (Cardizem®); antagonistas del receptor de endotelina tales como bosentan (Tracleer®) y ambrisentan (Letairis®); analogos de la prostaciclina tales como epoprostenol (Flolan®), treprostinil sodico (Remodulin®, Tyvaso®) e iloprost (Ventavis®); e inhibidores de PDE-5 tales como sildenafil (Revatio®) y tadalafil (Adcirca®).

Tensioactivos. Los exosomas de MSC se pueden administrar con agentes tensioactivos pulmonares. Un agente tensioactivo pulmonar es una mezcla de lipoprotemas util para mantener abiertas las vfas respiratorias pulmonares (p. ej., mediante la prevencion de la adhesion de las paredes alveolares entre sf). Agentes tensioactivos pulmonares pueden estar compuestos de fosfoftpidos tales como dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilcolina (PC), fosfotidilglicerol (PG); colesterol; y protemas tales como SP-A, B, C y D. Tensioactivos pulmonares pueden derivarse de fuentes que se producen de forma natural tales como tejido pulmonar bovino o porcino. Ejemplos incluyen Alveofact™ (de lavado pulmonar de vaca), Curosurf™ (de pulmon de cerdo picado), Infasurf™ (de lavado pulmonar de ternero) y Survanta™ (de pulmon de vaca picado, con componentes adicionales que incluyen DPPC, acido palmftico y tripalmitina). Los tensioactivos pulmonares tambien pueden ser sinteticos. Ejemplos incluyen Exosurf™ (compuesto de DPPC con hexadecanol y tiloxapol), Pumactant™ o Compuesto de Expansion de Pulmon Artificial (ALEC) (compuesto de DPPC y PG), KL-4 (compuesto de DPPC, palmitoil-oleoil fosfatidilglicerol, acido palmftico y peptido sintetico que imita SP-B), Venticute™ (compuesto de DPPc, PG, acido palmftico y SP-C recombinante). Tensioactivos pulmonares se pueden obtener de proveedores comerciales.

Cantidades eficaces. Las preparaciones de la invencion se administran en cantidades eficaces. Una cantidad eficaz es aquella cantidad de un agente que solo estimula el resultado deseado. La cantidad absoluta dependera de una

diversidad de factores, incluyendo el material seleccionado para la administracion, ya sea la administracion en dosis unicas o multiples, y parametros individuales del paciente, incluyendo edad, condicion f^sica, tamano, peso y la fase de la enfermedad. Estos factores son bien conocidos por los expertos ordinarios en la tecnica y pueden abordarse con no mas de experimentacion rutinaria.

5 Via de Administracion. Los exosomas de MSC se pueden administrar por cualquier via que efectue el suministro a los pulmones. Son adecuadas vfas de administracion sistemicas tales como la inyeccion intravenosa en bolo o la infusion continua. Tambien estan contempladas por la invencion v^as mas directas tales como la administracion intranasal, la administracion intratraqueal (p. ej., a traves de intubacion) y la inhalacion (p. ej., a traves de un aerosol a traves de la boca o la nariz) y en algunos casos pueden ser mas apropiadas, en particular en los casos en los que 10 es necesaria una accion rapida. Tal como se utiliza en esta memoria, un aerosol es una suspension de lfquido dispersado como pequenas partfculas en un gas, y que incluye una fina niebla o un spray que contiene tales partfculas. Tal como se utiliza en esta memoria, la aerosolizacion es el proceso de producir un aerosol mediante la transformacion de una suspension lfquida en pequenas partfculas o gotitas. Esto se puede hacer utilizando un sistema de suministro de aerosol tal como un envase presurizado o un nebulizador. Nebulizadores incluyen 15 nebulizadores de chorro de aire (es decir, neumaticos), ultrasonicos y de malla vibratoria, por ejemplo con el uso de un propulsor adecuado tal como, pero no limitado a diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas adecuado. Ademas de nebulizadores, otros dispositivos para la administracion pulmonar incluyen, pero no se limitan a los inhaladores de dosis medida (MDI) y los inhaladores de polvo seco (DPIs). Las capsulas y los cartuchos de, por ejemplo, gelatina para uso en un inhalador o insuflador se 20 pueden formular conteniendo exosomas liofilizadas y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidon.

Los exosomas, cuando es deseable suministrarlos sistemicamente, se pueden formular para la administracion parenteral por inyeccion, incluyendo, por ejemplo, mediante inyeccion en bolo o infusion continua. Las formulaciones para inyeccion pueden presentarse en forma de dosificacion unitaria, p. ej., en ampollas o en recipientes multidosis, con o sin un conservante anadido.

25 Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones solubles en agua en vehnculos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizantes y/o dispersantes. Disolventes o vehnculos lipofilicos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sesamo, o esteres de acidos grasos sinteticos tales como oleato de etilo o trigliceridos. Las suspensiones para inyeccion acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension tales como 30 carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspension tambien puede contener estabilizantes o agentes que aumentan la solubilidad adecuados. Alternativamente, los exosomas pueden estar en forma liofilizada u otro polvo o en forma solida para la constitucion con un vehnculo adecuado, p. ej., agua esteril apirogena, antes del uso.

Ha de entenderse que otros agentes a administrar a sujetos que estan siendo tratados de acuerdo con la divulgacion 35 se pueden administrar por cualquier via adecuada, incluyendo administracion oral, administracion intranasal, administracion intratraqueal, por inhalacion, administracion intravenosa, etc. Los expertos ordinarios en la tecnica conoceran las vfas habituales de administracion para tales agentes secundarios.

Kits

La divulgacion tambien abarca un producto farmaceutico envasado y etiquetado. Este artfculo de fabricacion o kit 40 incluye la forma de dosificacion unitaria apropiada en un recipiente o contenedor apropiado tal como un vial de vidrio o ampolla de plastico u otro recipiente que este hermeticamente sellado. La forma de dosificacion unitaria debe ser adecuada para la administracion pulmonar, por ejemplo por aerosol. Preferiblemente, el artfculo de fabricacion o kit comprende, ademas, instrucciones sobre como utilizar, incluyendo como administrar el producto farmaceutico. Las instrucciones pueden contener, ademas, el material informativo que informa a un practicante medico, tecnico o 45 sujeto sobre como prevenir o tratar adecuadamente la enfermedad o el trastorno en cuestion. En otras palabras, el artfculo de fabricacion incluye instrucciones que indican o sugieren un regimen de dosificacion para uso, incluyendo pero no limitado a dosis reales, procedimientos de vigilancia, y otra informacion de vigilancia.

Como con cualquier producto farmaceutico, el material de envasado y el recipiente estan disenados para proteger la estabilidad del producto durante el almacenamiento y envfo.

50 Los kits pueden incluir exosomas de MSC en suspensiones acuosas esteriles que pueden ser utilizados directamente o se pueden diluir con solucion salina normal para la inyeccion intravenosa o uso en un nebulizador, o dilucion o combinacion con un tensioactivo para la administracion intratraqueal. Los kits pueden contener, por tanto, tambien disolucion o agente diluyente tal como solucion salina o tensioactivo. El kit tambien puede incluir un dispositivo de administracion pulmonar tal como un nebulizador o componentes desechables, por tanto, tal como la 55 boquilla, boquilla nasal o una mascara.

EJEMPLOS

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SUMARIO

La hipoxia induce una respuesta inflamatoria en el pulmon que se manifiesta por la activacion alternativa de macrofagos con elevacion de mediadores pro-inflamatorios que son cnticos para el desarrollo posterior de la hipertension pulmonar hipoxica (HPH). El trasplante de celulas del estroma mesenquimales (MSC) previene la inflamacion del pulmon, la remodelacion vascular y la insuficiencia cardfaca derecha, e inhibe la HPH en modelos experimentales de enfermedad. En este estudio, los autores de la invencion tuvieron como objetivo investigar los mecanismos paracrinos mediante los cuales las MSC son protectoras en la HPH.

Fraccionaron medios acondicionados a MSC de raton para identificar el componente biologicamente activo que afecta a la senalizacion hipoxica in vivo y determinaron que los exosomas, microvesfculas de la membrana secretadas, suprimieron la afluencia pulmonar hipoxica de los macrofagos y la induccion de mediadores pro- inflamatorios y pro-proliferativos, incluyendo protema quimioatrayente de monocitos 1 y factor mitogeno inducible por hipoxia, en el modelo murino de HPH. La administracion intravenosa de exosomas de MSC (MEX) previno la remodelacion y el desarrollo vascular de HPH. Multiples administraciones de MEX de dosis baja suprimieron completamente la respuesta inflamatoria hipoxica temprana y mejoraron la hipertension pulmonar y la patologfa del ventnculo derecho. Se encontro que una sola dosis alta de MEX era suficiente para prevenir la remodelacion vascular y el desarrollo de la PH inducida por hipoxia cronica. En contraposicion, los exosomas derivados de fibroblastos y medios agotados en MEX no tuvieron efecto. MEX suprimio la activacion hipoxica de transductores de senales y activadores de la transcripcion 3 (STAT3) y la regulacion al alza de la superfamilia miR-17 de racimos de microARN, mientras que aumento los niveles pulmonares de miR-204, un microARN clave, cuya expresion esta disminuida en la PH humana. MEX producido por MSCs de cordon umbilical humano inhibia la senalizacion de STAT3 en PAECs humanas aisladas, lo que demuestra un efecto directo de MEX sobre la activacion de STAT3 hipoxica.

Este estudio indica que MEX ejerce un efecto protector pleiotropicos en el pulmon y puede prevenir la PH traves de la supresion de las vfas hiperproliferativas mediadas por STAT3 espedficas inducidas por la hipoxia.

MATERIALES Y METODOS

Aislamiento de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea. Celulas de medula osea derivadas de celulas madre mesenquimales (BM-MSCs) se aislaron a partir de los femures y las tibias de ratones de 5-7 semanas de edad FVB/s tal como se describio anteriormente. En smtesis, los extremos de cada una de las tibias y el femur se pinzaron para dejar al descubierto la medula y los huesos insertados en tubos de centnfuga adaptados. Los tubos se centrifugaron durante 1 minuto a 400 x g para recoger la medula. El sedimento se resuspendio en 3 mL medio esencial mmimo a (a-MEM) a traves de una aguja de calibre 21, seguido de filtracion a traves de un filtro de malla de nilon de 70 pm. Las celulas de la medula se estratificaron en un gradiente de densidad de Ficoll-Paque (Amersham), se centrifugaron y se sembraron. Las celulas adherentes plasticas se mantuvieron en cultivo con medios cambiados cada 2-3 dfas. Despues de 2-3 pasajes, se realizo un inmuno-agotamiento segun los protocolos publicados y las directrices de la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT)1. Las celulas se seleccionaron negativamente para los antfgenos CD11b, CD14, CD19, CD31, CD34, CD45 y CD79a utilizando los anticuerpos fluorescentes etiquetados apropiados (BD Biosciences) en un clasificador de celulas activadas por fluorescencia (MoFlo), se propagaron adicionalmente y, a continuacion, se seleccionaron positivamente para los antfgenos CD73, CD90, CD105, c-kit y Sca-1, como antes. Todos los reactivos fueron adquiridos de Sigma. Las celulas aisladas entre los pasajes 7-12 se pueden utilizar para la produccion de medio acondicionado y para el aislamiento de exosomas. Celulas aisladas y/o cultivadas tambien se pueden criopreservar antes de la produccion de medio acondicionado o exosomas.

Aislamiento de fibroblastos primarios de pulmon de raton. Cultivos de fibroblastos primarios de pulmon de raton (MLF) se derivaron de acuerdo con metodos estandares.

Preparacion de medio acondicionado de MSC (MSC-CM). MSCs crio-conservadas se sembraron con medio completo (aMEM (Invitrogen) complementado con FBS al 10% (Hyclone), suero de caballo al 10% (Hyclone) y L- glutamina 5 mM (Gibco)) seguido de incubacion en condiciones de cultivo estandares. MSC-CM libre de suero producido durante 24 h a partir del cultivo se clarifico por centrifugacion diferencial a 400 xg durante 10 min y 12000 xg durante 20 min. MSC-CM libre de suero se concentro 250 veces por ultrafiltracion con dispositivos de filtro MWCO de 100 kDa (Millipore) seguido de una clarificacion adicional por centrifugacion a 12.000 xg durante 20 min.

Purificacion de exosomas por cromatografia de filtracion en gel Sephacryl S-400. Concentrados 250 x de MSC-CM se aplicaron en la columna S-400 (14 x 300 mm, Pharmacia) pre-equilibrada con tampon PB2XS (tampon fosfato de sodio 20 mM (pH 7,4) complementado con NaCl 300 mM) y se eluyo con un caudal constante (0,4 ml/min). Se aplico un volumen equivalente de cada una de las fracciones (0,8 ml) en gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% o gel de agarosa al 1,2% nativo, seguido de inmuno-tincion con anticuerpos espedficos contra CD81 (Santa Cruz) y SPP-1 (osteopontina) (R & D Systems). Las fracciones positivas tanto para CD81 como SPP-1 con la migracion mayor en gel de agarosa nativo se agruparon y se utilizaron como una preparacion de exosomas (FIG. 1).

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Exosomas agrupados podnan utilizarse inmediatamente o se congelaron rapidamente en nitrogeno l^quido y despues se almacenaron a -80°C.

Analisis microscopico de electrones. Exosomas purificados se adsorbieron a una rejilla recubierta de carbono que se habfa vuelto hidrof^lica por una exposicion durante 30 segundos a una descarga luminiscente. El exceso de Kquido se separo y los exosomas se tineron con formiato de uranilo al 0,75% durante 30 segundos. Despues de retirar el exceso de formato de uranilo, las rejillas se examinaron en un microscopio electronico de transmision JEOL 1200EX y las imagenes se grabaron con una camara CCD 2k de AMT.

Analisis proteomico de exosomas. 30 |jg de protemas exosomales se separaron en PAGE desnaturalizante al 12% y posteriormente se digerieron con tripsina de calidad de secuenciacion (Promega). El analisis de la secuencia se realizo en las Instalaciones de Microqmmica y Analisis Proteomico de Harvard por espectrometna de masas en tandem de nano-electrospray HPLC de fase inversa microcapilar (pLC/MS/MS) en un espectrometro de masas Thermo LTQ-Orbitrap. Los espectros de MS/MS resultantes de los peptidos se correlacionaron entonces con secuencias espedficas para las especies utilizando el algoritmo SEQUEST y programas desarrollados en las Instalaciones de Microqmmica de Harvard.

Analisis de transferencia western. En experimentos de exosomas caracterizantes, 3 jg de protemas de cualquiera de las fracciones exosomales o de las fracciones libres de exosomas se separaron en electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% despues de la transferencia a membranas PVDF de 0,45 jm (Millipore). Despues de bloquear con leche desnatada al 5%, se detectaron senales espedficas utilizando anti-CD63 policlonal de cabra (Santa Cruz), anti-CD81 (Santa Cruz), anti-mCSF (R & D systems), anti-osteopontina (R & D systems), anti-moesina policlonal de conejo (Abcam), familia anti-14-3-3 (Abcam) y anti-Dicer monoclonal (Abcam) con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa apropiados. Para el control se utilizaron 35 jg de protemas de extracto BM-MSC en paralelo. Para el analisis de protemas en BALFs, volumenes equivalentes de BALF libre de celulas de raton individual en el mismo grupo se agruparon entonces despues de la precipitacion durante la noche mediante acido tricloroacetico (TCA) al 20%. Los sedimentos de protema, resuspendidos en tampon de carga de lauril sulfato de sodio (SDS) 1x, se separaron a continuacion sobre gel de tris-tricina poliacrilamida desnaturalizante. Despues de la transferencia a membranas de PVDF de 0,2 jm (Millipore), los borrones se bloquearon con leche desnatada al 5% en PBS que contema tween 20 al 0,1% (Sigma) durante 1 hora despues de incubacion con anticuerpo policlonales de protema quimioatrayente anti-monocitos 1 (MCP-1) de conejo diluida en la relacion 1:1000 (Abcam), anticuerpos de factor mitogenico anti-hipoxia inducido (HIMF/FIZZ1/Re1ma) (Abcam), anticuerpos anti-interleuquina-10 (Abcam) y anti-interleuquina-6 (IL-6) (Santa Cruz ) durante la noche a 4°C. Para detectar inmunoglobulina A de raton (IgA) como control de carga, se utilizo anticuerpo IgA anti-raton de cabra diluido en la relacion 1:5.000 (Abcam). Anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con peroxidasa (Santa Cruz) se utilizo en una dilucion 1:50.000 para visualizar las bandas inmunorreactivas ya sea por el reactivo de quimioluminiscencia potenciada (Pierce) o Lumi- LightPLUS (Roche).

Animales y exposicion hipoxica. Ratones machos FVB de 8 semanas de edad se obtuvieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) o se criaron en las Instalaciones de Animales en el Hospital Infantil de Boston. Ratones en cada uno de los grupos se expusieron a 8,5% de oxfgeno en una camara de Plexiglas (OxyCycler, BioSpherix, Redfield, NY) durante penodos experimentales variables. La ventilacion se ajusto para separar CO2 de manera que no excediera de 5.000 ppm (0,5%) (intervalo medio 1.000-3.000 ppm). El amoniaco se separo por ventilacion y filtracion de carbon vegetal activado a traves de un purificador de aire. Todos los protocolos de los animales fueron aprobados por el Comite de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil.

Modelo de raton con inflamacion pulmonar aguda inducida por hipoxia. A ratones se les inyecto a traves de las venas yugulares izquierdas medio acondicionado (40 jg/kg) o exosomas (4 jg/kg) o medio acondicionado libre de exosomas (4 jg/kg). Como control, se inyectaron 50 jl de PBS o medio de cultivo en paralelo. 3 horas despues de la inyeccion, los ratones se expusieron continuamente a hipoxia monobarica (8,5% de O2) durante los penodos experimentales senalados. En el experimento de curso en el tiempo, la inyeccion adicional de MEX se realizo en las venas yugulares derechas a los 4 dfas despues de la exposicion hipoxica.

Modelo de raton con PAH inducida por hipoxia. Ratones a los que se inyectaron exosomas o controles el dfa 0 y a los 4 dfas despues de la exposicion hipoxica fueron expuestas continuamente a hipoxia durante 3 semanas completas y luego fueron anestesiados con pentobarbital (50 mg/kg, i.p.). La presion sistolica ventricular derecha (RVSP) se midio utilizando un enfoque de torax cerrado y el sistema PowerLab (ADInstruments, Colorado Springs, CO), como se describio previamente2. Despues de las mediciones de presion, los pulmones se perfundieron con PBS y se inflaron con paraformaldeddo al 4% para fijar la arquitectura pulmonar. Los pulmones fijados fueron luego embebidos en parafina y seccionados para el analisis inmunohistoqmmico. Los corazones se analizaron inmediatamente en cuanto a las mediciones del fndice de Fulton (relacion entre el peso del ventnculo derecho y el ventnculo izquierdo mas el peso del septo, RV/[LV + S]), una evaluacion de la hipertrofia del ventnculo derecho.

Lavado broncoalveolar y recuento de macrofagos alveolares. Los animales fueron anestesiados con 2,2,2- tribromoetanol (250 mg/kg i.p.) y sus traqueas se canularon y se instalo una aguja de extremo romo. Se recogio

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fluido de lavado broncoalveolar (BALF) mediante la administracion secuencial de PBS (0,8 ml, 0,8 ml, 0,8 ml y 0,9 ml) y se recuperaron aproximadamente 3 ml de BALF individual. Las celulas en BALFs se recogieron por centrifugacion a 400 x g durante 5 minutos y se resuspendieron en solucion de tincion de Kimura para contar selectivamente los macrofagos alveolares totales en BALFs.

Analisis inmunohistoqu^mico. Secciones de tejido pulmonar se desparafinaron en xileno y se rehidrataron en rodajas. El analisis inmunohistoqmmico se realizo incubando anticuerpo monoclonal a-SMA anti-raton (Sigma) a una dilucion de 1:125 durante la noche a 4°C despues de bloquear los tejidos durante 1 hora. Despues de la inactivacion de la peroxidasa endogena con 3% de H2O2 en metanol (Sigma), anticuerpos secundarios, y la tincion con peroxidasa se realizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, CA). El espesor de la pared del recipiente se evaluo midiendo la tincion de a-SMA en vasos de menos de 30 pm de diametro dentro de secciones capturadas bajo un aumento de 400X.

Aislamiento de MSCs humanas de gelatina de Wharton del cordon umbilical humano. MSCs derivadas de gelatina de Wharton del cordon umbilical humano (hUC-MSCs) se aislaron de acuerdo con metodos publicados (Mitchell, K.E. et al., 2003, Stem Cells 21:50-60; y Penolazzi, L. et al., 2011, J Cell Physiol.) con modificaciones menores. El cordon se lavo dos veces con PBS esteril frio, se corto longitudinalmente y se separaron arterias y vena. Los tejidos de gel blandos se rasparon, se picaron finamente (2-3 mm2) y se colocaron directamente en placas de 100 mm (15 trozos por placa) con DMEM/F12 (1:1) (Invitrogen) complementado con suero bovino fetal al 10% (Hyclone), L- glutamina 2 mM y penicilina/estreptomicina, y se incubaron durante 5 dfas a 37°C en una atmosfera humidificada de 5% de CO2. Despues de separar los tejidos y medio, las placas se lavaron 3 veces con PBS, las celulas unidas se cultivaron y medio reciente se reemplazo 3 veces por semana. En el 70-80% de confluencia, se recogieron las celulas y se tineron con anticuerpos conjugados con PE para CD34 (Miltenybiotec) y CD45 (Miltenybiotec). El inmuno-agotamiento se realizo utilizando microperlas anti-PE (Miltenybiotec) y columna MSCS (Miltenybiotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las poblaciones de CD34 y CD45 negativas se propagaron adicionalmente y se seleccionaron para la expresion de marcadores de MSC (CD105, CD90, CD44 y CD73) y la ausencia de CD11b, CD19 y HLA-DR utilizando un conjunto de anticuerpos marcados de modo fluorescente espedficos para la caracterizacion de MSCs humanas (BD Biosciences) utilizando una citometna de flujo MoFlo (Beckman Coulter).

Preparacion de medios acondicionados. Para excluir la contaminacion de microvesmulas derivadas de suero, suero utilizado para la propagacion de cultivos de celulas y la recogida de medios acondicionados se clarifico por ultracentrifugacion a 100.000 x g durante 18 h. Las MSC se cultivaron en medio a-MEM complementado con suero de bovino fetal (FBS, Hyclone) al 10% (v/v) y suero de caballo (Hyclone) al 10% (v/v). MLFs se cultivaron en medio esencial mmimo de Dulbecco (DMEM, Invitrogen) complementado con FBS al 10% y L-glutamina 2 mM (GIBCO). Cultivos a 70% de confluencia se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con medio libre de suero complementado con L-glutamina 2 mM durante 24 horas bajo condiciones de cultivo estandar. Se recogieron los medios acondicionados y las celulas y los desechos se separaron por centrifugaciones diferenciales a 400 x g durante 5 min, a 2.000 x g durante 10 min, y a 13.000 x g durante 30 min. Los medios acondicionados clarificados se filtraron posteriormente a traves de una unidad de filtro de 0,2 pm y se concentraron utilizando un dispositivo de filtro centnfugo Ultracel-100K (Millipore), a un intervalo de concentraciones de protema de 0,1 - 0,5 mg/ml. Los niveles de protema en los medios acondicionados se determinaron mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad).

Hipoxia in vitro. PAECs humanas se adquirieron de GIBCO y se cultivaron en medio M200 complementado con LSGS (Invitrogen). A una confluencia de 80%, las celulas se expusieron a 1% de O2 durante 5 horas en una estacion de trabajo inVivo2 (Ruskin Technology, Bridgend, Reino Unido) en presencia o ausencia de la fraccion exosomal (1 pg/ml), o la fraccion agotada en exosomas de medios acondicionados de hUC-MSC (1 pg/ml). Las celulas fueron lisadas y las protemas en lisados de celulas enteras se separaron en electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 8%, seguido por analisis de transferencia western para fosfo-STAT3 y STAT3 (Cell Signaling).

Aislamiento de exosomas. 50 pl de medio acondicionado concentrado se aplicaron a una columna CHROMA SPIN S-1000 (Clontech) pre-equilibrada con un tampon que contema fosfato de sodio 20 mM (pH 7,4) y NaCl 300 mM. Cada una de las fracciones (0,1 ml) se recogio secuencialmente por la gravedad. Para una preparacion a gran escala, 1,5 ml de medios acondicionados clarificados y concentrados se inyectaron en una columna de 16/60 Hiprep Sephacryl S-400 HR pre-equilibrada en el tampon anterior utilizando un sistema cromatografico de purificador AKTA (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se recogieron fracciones (1 ml) a un caudal de 0,5 ml/min. Nanoesferas de poliestireno de 50 nm de diametro (Phosphorex, Fall River, MA) se utilizaron como una referencia de tamano y fracciones de elucion correspondientes al volumen de retencion de la norma se agruparon y se analizaron adicionalmente.

Extraccion de protemas e inmunotransferencia. BALF (3 ml) se centrifugo a 420 xg durante 10 min y los sobrenadantes de BALF libres de celulas se utilizaron para el analisis de protemas. Se combinaron volumenes iguales de muestras de BALF de los animales individuales del mismo grupo (1 ml) y las protemas se precipitaron durante la noche mediante acido tricloroacetico al 20% (Sigma). Una fraccion equivalente a 30% de cada uno de los sedimentos de protemas se disolvio y tampon de carga 1x lauril-sulfato de sodio (SDS) se separo en un gel de

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poliacrilamida desnaturalizante al 15%. Despues de la transferencia a membranas de 0,2 pm de PVDF (MiMipore), los borrones se bloquearon con leche desnatada al 5% y se incubaron con anticuerpo policlonal de protema quimioatrayente anti-monocitos 1 (MCP-1) de conejo diluida en la relacion 1:1.000 (Abcam), anticuerpo de factor mitogenico anti-hipoxia inducido (HIMF/FIZZ1/Re1ma) (Abcam) durante la noche a 4°C. Para detectar la inmunoglobulina A de raton, anticuerpo IgA anti-raton de cabra diluido en la relacion 1:5.000 (Abcam). Anti- anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con peroxidasa (Santa Cruz) se utilizo en una dilucion 1:20.000 para visualizar las bandas inmunorreactivas ya sea mediante el reactivo de quimioluminiscencia potenciada (Pierce) o Lumi-LightPLUS (Roche).

Para el analisis de protemas a partir de tejido pulmonar entero, tejidos pulmonares congeladas se cortaron durante 5 segundos por Polytron en PBS fno que contema fluoruro de fenilmetanosulfonilo 2 mM (Sigma) y se centrifugaron a 3.000 x g durante 3 min. Granulos de tejido picados se lavaron dos veces con PBS fno que contema PMSF 2 mM mediante centrifugacion a 3.000 xg durante 3 min cada vez y los trozos de tejido blanco limpiado fueron sometidos a lisis con tampon RIPA que contema un coctel inhibidor de proteasa (Roche) y un coctel inhibidor de fosfatasa (Thermo). 40 pg de extractos de tejido pulmonar fueron separados en gel de 10-20% de gradiente (Invitrogen). Los anticuerpos utilizados en la inmunotransferencia fueron contra MCP-1, HIMF, IL-6, factor de crecimiento endotelial vascular (Abcam), STAT3 total y fosfo-STAT3 (Y705) (Cell Signaling). Para el control de la carga, se utilizo anticuerpo de p-actina monoclonal de raton (Sigma).

Preparaciones de exosoma se separaron en gel de poliacrilamida al 12% y despues se transfirieron a membrana de PvDf de 0,45 pm (Millipore). Se utilizaron anticuerpo anti-CD63 policlonal de cabra (1:1000, Santa Cruz), anti-CD81 policlonal de conejo (1:1000, Santa Cruz) y anti-Dicer monoclonal (1:1000, Abcam), Para visualizar las bandas de protemas espedficas, se utilizaron los mismos reactivos ECL descritos anteriormente. Se utilizo el programa representado en imagenes de NIH para la cuantificacion mediante analisis densitometrico despues de sustraccion de fondo apropiada.

Cuantificacion de microARNs. ARN pulmonar total se extrajo por el metodo de Chomczynski y Sacchi (1987 Anal Biochem 162: 156-159) y 750 ng se utilizaron como molde para la transcriptasa inversa con cebadores espedficos para cada uno de los microARN diana (Kit de Transcripcion Inversa TaqMan, Applied Biosystems, Foster City, CA). Cada una de las reacciones de transcripcion inversa inclrna tambien el cebador para el pequeno ARN nuclear sno202, que se utilizo como un control interno. 37,5 ng de ADNc se utilizaron para cada 20 pl de reaccion qPCR con mezcla maestra II universal de TaqMan sin UNG (Applied Biosystems) en presencia de sondas espedficas para los microARNs indicados y el control interno (ensayo de microARN TaqMan, Applied Biosystems). La amplificacion se realizo a 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95°C durante 15 s, a 60°C durante 1 min, en una plataforma StepOne Plus (Applied Biosystems).

RESULTADOS

BM-MSC secretan factores que suprimen las respuestas inflamatorias agudas inducidas por hipoxia. Se ha observado una capacidad terapeutica de BM-MSC a partir de varios modelos animales de lesiones pulmonares. Los autores de la invencion determinaron primero que BM-MSCs eran relevantes para la inflamacion pulmonar inducida por hipoxia por su manera paracrina. La exposicion hipoxica resulta en una acumulacion pulmonar significativa de macrofagos y en una elevacion de mediadores proinflamatorios en el espacio de 2 dfas2. Para testar potenciales paracrinos de BM-MSCs en este modelo animal, los ratones que recibieron medio acondicionado con BM-MSC (BM- MSC-CM) o vehmulo o medio acondicionado con MLF (MLF-CM) se expusieron a hipoxia monobarica durante 2 dfas. En consecuencia, la afluencia pulmonar aguda derivada de hipoxia de macrofagos fue bloqueada por el tratamiento con BM-MSC-CM, mientras que los ratones a los que se inyecto vehmulo o MLF-CM mostraron una acumulacion significativa de macrofagos en el pulmon (FIG. 1A), sugiriendo que el o los factores que secretan BM- MSC suprimen las respuestas inflamatorias pulmonares derivadas de hipoxia que senalizan el reclutamiento de macrofagos en el pulmon. Dado que se ha observado que el acondicionamiento hipoxico regula al alza los niveles pulmonares de mediadores proinflamatorios, se emplearon BALFs libres de celulas de los ratones para el analisis comparativo de mediadores proinflamatorios responsables de la hipoxia, MCP-1 y HIMF/FIZZ1. En ratones a los que se inyecto vehmulo o MLF-CM, los niveles de secrecion tanto de MCP-1 como de HIMF en el pulmon se incrementaron significativamente por la exposicion hipoxica durante 48 horas. Por el contrario, la elevacion de estos mediadores por la hipoxia fue suprimida de manera efectiva en ratones tratados con BM-MSC-CM (FIG. 1B). Tomados en conjunto, el o los factores secretores de BM-MSC son agentes anti-inflamatorios que impiden el reclutamiento pulmonar de macrofagos a traves del bloqueo de la regulacion positiva inducida por hipoxia de MCP-1 y HIMF/FIZZ1 en el pulmon.

BM-MSC secretan exosomas. Los autores de la invencion aislaron pequenas vesmulas en BM-MSC-CM por un procedimiento que incluye la ultrafiltracion y cromatograffa de exclusion por tamano. La Tabla 2 muestra el grado de enriquecimiento logrado en estos experimentos. Tal como se resume en la FIG. 2, aproximadamente el 1,6% (p/p) de las protemas secretoras en BM-MSC-CM podna estar asociado con sus exosomas. Exosomas derivados de MLf (FEX) se aislaron como un control y se analizaron en paralelo. A partir del analisis microscopico de electrones, se observaron exosomas solo en la fraccion dentro del volumen vado de la columna, lo que sugiere que la

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cromatograffa de exclusion por tamano para excluir moleculas mas pequenas que 8000 kDa es altamente selectiva para enriquecer exosomas (FIGs. 2B, 2C). Ademas de ello, micrograffas electronicas de exosomas de la fraccion equivalente de BM-MSC-CM y MLF-CM confirmaron que los exosomas desprendidos de los dos tipos de celulas demostraron parametros ffsicos de exosomas tfpicos tales como la heterogeneidad en diametro que oscila entre 30 y 100 nm y caractensticas morfologicas biconcavas (FIG. 2D, 2E). Con respecto al contenido de protemas de los exosomas derivados de BM-MSC (MEX), analisis por transferencia western demostro que MEX eran positivos para protemas exosomales tfpicas tales como CD63 y moesina, y tambien que estaban altamente asociados con protemas inmunomoduladoras incluyendo el factor estimulante de colonias de monocitos (mCSF) y osteopontina (OPN/SPP1). Algunas isoformas de la familia 14-3-3, que son pequenos polipeptidos con una masa molecular de aproximadamente 30 kDa capaces de unir numerosas protemas de senalizacion funcionalmente diversas, co- purificadas con exosomas, indicando que un determinado subconjunto de isoformas 14-3-3 se asocia con MEX. Ademas de ello, Dicer, que cataliza una etapa de procesamiento critico de la maduracion de microARN en el citoplasma solo se detecto en la fraccion exosomal, apoyando fuertemente que los microARNs son otro constituyente de exosomas. Es interesante observar que mCSF y OPN, asf como CD63 y moesina se detectaron tambien abundantemente en fracciones libres de exosoma obtenidas durante el procedimiento de purificacion, lo que sugiere la presencia de sus isoformas solubles en la fraccion libre de exosomas o una debil o baja asociacion por afinidad con la superficie de exosomas (FIG. 2F). El analisis western comparativo revelo que MEX estan muy enriquecidos en CD63, Dicer, mCSF y osteopontina en comparacion con FEX, mientras que CD81 es mas abundante en FEX (FIG. 2G). En consecuencia, MEX preservan las caractensticas ffsicas de los exosomas tfpicos en terminos de tamano y morfologfa y estaban muy enriquecidos con Dicer y moduladores inmunes en comparacion con FEX. Los autores de la invencion realizaron, ademas, analisis proteomicos comparativos entre los exosomas de los dos tipos de celulas diferentes por espectrometna de masas para investigar mas a fondo los papeles fisiologicos de MEX.

Los papeles anti-inflamatorios de BM-MSC estaban mediados por sus exosomas secretores. Los autores de la invencion investigaron, ademas, si exosomas derivados de BM-MSC son fisiologicamente funcionales en el modelo experimental de inflamacion pulmonar aguda inducida por hipoxia. Ratones a los que se inyecto MEX purificada fueron expuestos a hipoxia monobarica de 8,5% de O2. Despues de la exposicion continua a hipoxia durante 48 horas, observaron que la afluencia pulmonar derivada de hipoxia de macrofagos se evita eficazmente mediante la administracion de MEX. En contraposicion, FEX o fraccion libre de exosoma de BM-MSC-CM no logro impedir la afluencia pulmonar de macrofagos (FIG. 3A). Las protemas totales de BALFs libres de celulas se estudiaron mediante analisis de inmunotransferencia. La regulacion positiva de mediadores proinflamatorios secretores tales como MCP-1 y HIMF/FIZZ-1 por la hipoxia fue completamente abrogada por la administracion de MEX, mientras que estos no fueron bloqueados por la inyeccion de vehmulo o FEX (FIG. 3B). Curiosamente, la fraccion libre de exosomas de BM-MSC-CM no pudo suprimir la regulacion positiva inducida por hipoxia de estos mediadores proinflamatorios. Habfa algunas otras diferencias en los contenidos de protemas entre la fraccion exosomal y la fraccion libre de exosoma, lo que sugiere la posibilidad de que los acidos nucleicos en exosomas pueden ser importantes en la respuesta. Estos datos ponen de manifiesto que factores secretores derivados de BM-MSC localizados espedficamente en exosomas suprimen con eficacia las respuestas inflamatorias pulmonares inducidas por hipoxia mediante el bloqueo de la senal derivada de hipoxia para regular al alza los mediadores proinflamatorios MCP-1 y HIMF/FIZZ1.

La administracion de MEX anula respuestas inflamatorias pulmonares inducidos por hipoxia. Los autores de la invencion observaron que exosomas que secretan BM-MSC anulan las senales hipoxicas para reclutar macrofagos en el pulmon, y tambien observaron que la exposicion hipoxica conduce a respuestas inflamatorias agudas en el pulmon en el espacio de 2 dfas. Ademas, investigaron la evolucion en el tiempo de los tratamientos individuales o multiples de MEX sobre las respuestas inflamatorias pulmonares hasta 7 a 11 dfas de la exposicion hipoxica. En el grupo al que se inyecto vehmulo, los ratones exhibfan una afluencia pulmonar aguda de macrofagos y una elevacion drastica del nivel pulmonar tanto de MCP-1 como de HIMF/FIZZ1 mediante 2 dfas de exposicion hipoxica resolviendo el pico inflamatorio a los 7 dfas de la exposicion hipoxica. A diferencia del numero reductor de macrofagos alveolares y del nivel pulmonar de MCP-1, se mantuvo un alto nivel de HIMF/FIZZ1 durante 7 dfas de exposicion hipoxica continua, lo que sugiere que MCP-1 esta regulando principalmente la afluencia pulmonar de macrofagos, mientras que HIMF/FIZZ1 podna desempenar distintos papeles en la respuesta a la hipoxia (FIGs 4A, 4D). Es importante destacar que una sola inyeccion de MEX no era capaz de suprimir las respuestas inflamatorias inducidas por hipoxia durante mas de 4 dfas en condiciones de hipoxia, por lo que se inicio la inflamacion pulmonar responsable de la hipoxia despues de 4 dfas de la inyeccion, alcanzo un pico a los 7 dfas y despues se resolvio a los 11 dfas (FIGs. 4B, 4D). De manera mas importante, la inyeccion adicional de MEX el 4° dfa de la exposicion hipoxica mantuvo el bloqueo de la inflamacion pulmonar en condiciones de hipoxia hasta 11 dfas (FIG. 4C). Con respecto a la regulacion al alza de HIMF/FIZZ1 por MEX, una sola inyeccion de MEX es capaz de suprimir la regulacion positiva inducida por hipoxia de HIMF/FIZZ1 durante 4 dfas de hipoxia. inyecciones adicionales de MEX no fueron capaces de anular la regulacion positiva de HIMF/FIZZ1 a los 7 dfas de hipoxia, lo que sugiere que otra via de regulacion temporal podna estar involucrada en esta respuesta. Tomados en conjunto, la inflamacion pulmonar aguda inducida por hipoxia fue suprimida temporalmente por una sola inyeccion de MEX y los efectos anti-inflamatorios capaces de neutralizar la respuesta pulmonar a la hipoxia se mantuvieron mediante la administracion secuencial y multiple.

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PAH inducida por hipoxia suprimida por exosomas derivados de BM-MSC. En este estudio, los autores de la invencion observaron que MCP-1 y HIMf fueron regulados significativamente al alza por hipoxia en el pulmon, y que la regulacion al alza inducida por hipoxia fue marcadamente atenuada por tratamiento mediante MEX. Por lo tanto, los autores de la invencion hipotetizaron que MEX podna prevenir la PAH inducida por hipoxia bloqueando los dos mediadores importantes de PAH. Para probar la hipotesis, ratones fueron expuestos a hipoxia durante 3 semanas despues de recibir MEX o FEX o PBS como control. Al final del penodo experimental, se midio RVSP y el tejido del corazon se proceso para la hipertrofia por RV. Las FIGs. 5B y 5C demostraron que todos los ratones hipoxicos exhi^an una RVSP y un fndice de Fulton elevados en comparacion con ratones normoxicos de la misma edad. En contraposicion, se observo una mejora significativa para los ratones que recibieron MEX en comparacion con los ratones que recibieron PBS o FEX. Ademas de ello, en comparacion con ratones que recibieron una inyeccion unica de MEX, los ratones que recibieron inyecciones adicionales de MEX el dfa 4 mostraron una hipertrofia por RVSP y RV significativamente reducida bajo hipoxia cronica, lo que indica que la administracion repetida de MEX mejora la presion arterial pulmonar y el espesor de la pared ventricular en respuesta a la hipoxia cronica. Para investigar si multiples tratamientos de MEX podnan atenuar la remodelacion vascular pulmonar inducida por hipoxia, secciones histologicas de los pulmones hipoxicos se analizaron morfometricamente por tincion de vasos pulmonares con el anticuerpo alfa-SMA (FIG. 5D). Se determino el porcentaje de espesor de pared del vaso medial de pequenas arteriolas pulmonares dentro de un intervalo de 20~30 pm de diametro. En comparacion con ratones de control normoxicos emparejados por edades, se observo un marcado aumento del espesor de las pequenas arteriolas pulmonares por hipoxia cronica en ratones tratados con PBS o FEX, mientras que no se observo diferencia significativa alguna para el espesor de pared del vaso entre ratones control y tratados con MEX, lo que indica que MEX son capaces de evitar el proceso de remodelacion vascular pulmonar inducida por hipoxia (FIG. 5E).

MEX comprenden una diversidad de factores inmunomoduladores. Los autores de la invencion han observado efectos drasticos de MEX tanto en la inflamacion pulmonar aguda inducida por hipoxia como en la hipertension de la arteria pulmonar por hipoxia cronica. Para investigar su mecanismo molecular, realizaron perfiles proteomicos globales tanto de MEX como de FEX mediante cromatograffa ftquida de alto rendimiento - espectrometna de masas (HPLC-MS/MS). Se identifico un total de 273 protemas con alta confianza en MEX y 35% de protemas tambien se detectaron en FEX. Para lograr una alta confianza para perfilar protemas considerables asociadas con MEX, los autores de la invencion identificaron protemas con alto (> 25) numero de espectros MS/MS y alta relacion (> 3) de MEX/FEX en la cobertura de la secuencia. 8 protemas se ajustan a este criterio y estas se enumeran en la Tabla 1. Entre estas protemas, 3 eran unicas y 5 estaban altamente enriquecidas en MEX. La protema de union a galectina-3 (LGALS3BP/MAC2BP), que es una de las protemas unicas en MEX, es una protema secretora que ha demostrado poseer actividades inmunomoduladoras mediante la inhibicion de la transcripcion de citoquina TH2 que es caractenstica del asma34. Es capaz de interactuar con una diversidad de protemas en la superficie celular y la matriz incluyendo la familia de lectina, integrinas, lamininas y fibronectina. Dado que se han implicado interacciones en la modulacion de la adhesion de celulas tumorales a protemas extracelulares35, GAL3BP en la superficie de MEX podna desempenar un papel importante para dirigir MEX infundidas a la superficie de celulas receptoras de una manera espedfica de ligando. Se sabe que otra protema unica en MEX, trombospondina-2, actua como un potente inhibidor endogeno del crecimiento de tumores y la angiogenesis36 y que suprime la produccion de citoquinas pro- inflamatorias IFN-y y TNF-a37. Se ha informado que lactadherina (MFGE8), un componente principal de exosomas derivados de celulas dendrfticas38, desempena un papel en la muerte de las celulas y la apoptosis, al reconocer espedficamente la fosfatidilserina expuesta en celulas apoptoticas y fomenta el aclaramiento fagocftico de celulas apoptoticas mediante la union a celulas que expresan integrinaav e integrin p6339,40 En la superficie de MEX, lactadherina puede estar implicada en fijar como objetivo MEX a sus tipos de celulas receptoras. Ademas de ello, se ha informado que lactadherina tambien esta implicada en el aclaramiento fagocftico de peptido amiloide beta (Abeta), que es un componente principal en las placas seniles acumuladas en la enfermedad de Alzheimer, mediante la interaccion directa protema-protema. La abundancia de Abeta en la fraccion exosomal es posiblemente debida a la interaccion directa entre lactadherina y Abeta. La protema de union a potenciador de adipocitos 1 (AEBP1), tambien denominada protema tipo carboxipeptidasa aortica (ACLP), desempena importantes papeles fisiologicos en la cicatrizacion de heridas y la homeostasis de energfa. Ratones que carecen de los exones 7-16 exhiben una cicatrizacion deficiente de las heridas y ratones AEBP1 nulos son resistentes a la obesidad inducida por la dieta41. La Tabla 1 y la FIG. 22 describen los diversos mediadores identificados en MEX de raton y humanos.

MEX de origen de raton o humano median en la supresion de la activacion de STAT3 por la hipoxia. La hipoxia temprana resulto en la activacion de STAT3 en el pulmon de raton, a traves de la fosforilacion en Tyr-705, y sin efecto alguno sobre los niveles totales de protema STAT3. Esta activacion fue suprimida de manera eficiente mediante el tratamiento con MEX (FIG. 19A). STAT3 es un factor de la transcripcion integral para senalizar vfas de muchas citoquinas y factores de crecimiento y la activacion de STAT3 desempena un papel critico en las respuestas inflamatorias epiteliales respiratorias. Es importante destacar que la activacion persistente ex vivo de STAT3 se ha relacionado con el fenotipo hiperproliferativo y resistente a la apoptosis observado en PAECs (Masri, F.A. et al., 2007, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 293: L548-554) y celulas de la musculatura lisa de la arteria pulmonar (PASMCs) (Paulin, R. et al., 2011, Circulation 123:1205-1215) de pacientes con hipertension arterial pulmonar idiopatica (IPAH). Por lo tanto, la supresion de la activacion de STAT3 hipoxica podna ser responsable de los efectos protectores pleiotropicos de tratamiento con MEX.

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Para verificar que la supresion de esta senalizacion hipoxica no es una propiedad espedfica para MEX de origen de raton, MSCs de estroma de cordon umbilical humano (hUC-MSC) (Mitchell, K.E. et al. y Penolazzi, L. et al.) fueron aisladas y fracciones enriquecidas en exosomas (hUC-MEX) y agotadas en exosomas (hUC-ExD-CM) se prepararon a partir de medios acondicionados con hUC-MSC a traves de cromatograffa de exclusion por tamano, tal como se describe en esta memoria. Como se representa en la figura FIG. 19B, la exposicion de hPAECs a hipoxia resulta en la activacion robusta de STAT3 por la fosforilacion de Tyr-705. El tratamiento con hUC-MEX anulo completamente esta respuesta, mientras que la fraccion agotada de microvesfculas no tuvo efecto alguno. Ademas de demostrar que la supresion de la activacion de STAT3 es una propiedad compartida por MEX tanto de origen humano como de raton, estos resultados sugieren fuertemente que la supresion directa de la senalizacion hipoxica en las celulas vasculares pulmonares es una funcion primaria subyacente a la proteccion conferida por tratamiento con MEX.

El tratamiento con MEX suprime la induccidn hipoxica de la superfamilia miR-17 de microARN y aumenta los niveles de miR-204 anti-proliferativa en el pulmon. Se ha informado que STAT3 (activado por VEGF o IL-6) regula directamente la transcripcion del racimo miR-17~92 de microARNs en PAECs, resultando niveles disminuidos del receptor de la protema morfogenetica osea 2 (BMPR2), una diana de miR-17 (Brock, M. et al., 2009, Circ Res 104: 1184-1191). Por lo tanto, los autores de la invencion evaluaron el efecto de la hipoxia y el tratamiento con MEX en el racimo miR-17~92 de microARNs y sus racimos paralog conservados, miR-106b~25 y miR-106a~363. Se ha postulado que estos racimos de microARN son pro-proliferativos, fijando como objetivo una serie de genes implicados en la transicion de fases G1/S (Cloonan, N. et al., 2008, Genome Biol. 9: R127) y se ha informado que desempenan un papel central en la morfogenesis embrionaria de pulmon (Carraro, G., 2009, Dev Biol 333:238-250). Los autores de la invencion encontraron que microARNs seleccionados que representan los tres racimos de la superfamilia miR-17 estan regulados al alza por la hipoxia en el pulmon, y esta activacion transcripcional fue suprimida de manera eficiente mediante el tratamiento con MEX (FIG. 20A). Curiosamente, los niveles de microARNs implicados en las redes de senalizacion hipoxicas tales como miR-199a-5p, un microARN del que se informa que estabiliza HIF1a en miocitos cardiacos (Rane, S. et al., 2009, Circ Res 104: 879-886), miR 214, que comparte el mismo gen huesped con miR-199 (Watanabe, T. et al., 2008, Dev Dyn 237:3738-3748) o miR-210, un hipoxamir bajo la regulacion directa de HIF1a (Chan, S.Y. et al., 2010, Cell Cycle 9:1072-1083), no se vieron afectados por el tratamiento con MEX (FIG. 20B), apuntando a los efectos dirigidos de MEX en vfas espedficas de senalizacion reguladas por hipoxia.

Es importante destacar que los autores de la invencion observaron que el tratamiento con MEX resulto en el aumento de los niveles pulmonares de miR-204 (FIG. 20C) un microARN enriquecido en las arterias pulmonares distales que es suprimido transcripcionalmente por STAT3, pero tambien inhibe la activacion de STAT3 en un bucle de regulacion de alimentacion directa (Courboulin, A. et al., 2011, J Exp Med 208: 535-548). El fenotipo proliferativo y anti-apoptotico de PASMCs aisladas de pacientes con IPAH esta inversamente relacionado con el nivel de miR- 204 y el suministro de miR-204 exogena a los pulmones de animales con enfermedad PH establecida mejorada. Por lo tanto, los autores de la invencion interpretan estos resultados como una indicacion de que el tratamiento con MEX, mediante la supresion de la activacion de STAT3 en las fases tempranas de la exposicion hipoxica, impide la induccion hipoxica de la superfamilia miR-17 pro-proliferativa en la vasculatura pulmonar y bloquea el bucle de alimentacion directa STAT3-miR-204-STAT3 en los vasos pulmonares distales. Esto desplaza el equilibrio hacia un estado anti-proliferativo en la vasculatura pulmonar y previene la remodelacion vascular en condiciones de hipoxia cronica. La FIG. 21 es una representacion esquematica de las vfas de senalizacion hipoxicas propuestas para ser operativas en el desarrollo de Ph que son moduladas por MEX.

En resumen, medios acondicionados con MSC se fraccionaron a traves de cromatograffa de exclusion por tamano para identificar el componente biologicamente activo que protege frente a la inflamacion pulmonar inducida por hipoxia y HPH. Se encontro que MEX son los vectores cnticos de la accion de MSC: MEX supriirna eficazmente la afluencia pulmonar hipoxica de macrofagos y bloqueaba la regulacion al alza de los mediadores pro-inflamatorios y mitogenicos tales como MCP-1, IL-6 y el factor mitogenica inducido por hipoxia (HIMF; FIZZ1/RELM-a/RETNLA) en el pulmon hipoxico. Vfas pro-proliferativas activadas en el pulmon hipoxico tambien fueron bloqueadas mediante tratamiento con MEX, tal como se evidencia por la supresion de transductores de senales y activadores de la transcripcion (STAT3). Esto resulto en niveles pulmonares incrementados de miR-204, un microARN enriquecido en las arteriolas pulmonares distales que esta regulado a la baja tanto en PH humana como en modelos experimentales de la enfermedad (Courboulin, A. et al.). Tambien se encontro que la hipoxia regula al alza miembros de la familia miR-17 de racimos de microARN en el tejido pulmonar, microARNs que muestran estar bajo el control regulador de STAT3, y que el tratamiento con MEX suprime eficientemente esta senal pro-proliferativa. MEX aislado de los medios de cultivo de MSCs derivadas del cordon umbilical humano ternan un efecto inhibitorio similar en la vfas de senalizacion proliferativas hipoxicas como el raton MEX. MEX humano inhibio significativamente la activacion de STAT3 hipoxico en hPAECs cultivadas. En contraposicion, los medios de cultivo de MSC agotados en exosomas no tuvo efecto fisiologico alguno in vivo ni en celulas cultivadas in vitro, apuntando a MEX como los efectores clave de la funcion paracrina MSC.

Tabla 2. Purificacion de exosomas derivados de MSCs

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Etapa

Volumen Concentracion Protema total (mg) Rendimiento (%)

MSCs libres de suero-acondicionadas

25 28,91 7228 100

Ultrafiltracion (MWCO de 100 kDa)

1 7.184,70 7185 99,4

cromatograffa en columna S-400

4,5 166 747 10,4

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Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion farmaceutica, que comprende una cantidad eficaz de exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) humanos aislados y un tensioactivo pulmonar, para uso en tratar a un sujeto humano que tiene o esta en riesgo de desarrollar una enfermedad pulmonar, en donde el sujeto es de menos de 4 semanas de edad y en donde la composicion se formula para el suministro a los pulmones.
2. 2. La composicion farmaceutica para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde los exosomas de MSC humanos aislados se afslan de cordon umbilical humano.
3. 3. La composicion farmaceutica para uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde el sujeto humano nacio antes de las 37 semanas de gestacion, o en donde al sujeto humano se le ha administrado oxfgeno o ha estado en un respirador.
4. 4. La composicion farmaceutica para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, 2 o 3, en donde el sujeto humano tiene o esta en riesgo de desarrollar displasia broncopulmonar, opcionalmente en donde la displasia broncopulmonar es no inflamatoria.
5. 5. Exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) humanos aislados para uso en tratar o prevenir una enfermedad pulmonar en un sujeto.
6. 6. Los exosomas de MSC aislados para uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde la enfermedad pulmonar es una enfermedad pulmonar inflamatoria, enfermedad vascular pulmonar o lesion pulmonar aguda, o en donde el sujeto tiene o es probable que desarrolle esquistosomiasis.
7. 7. Los exosomas de MSC aislados para uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde la enfermedad pulmonar inflamatoria es hipertension pulmonar, asma, displasia broncopulmonar (BPD), alergia o fibrosis pulmonar idiopatica, o en donde la lesion pulmonar aguda esta asociada con sepsis o es smdrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) inducida por el ventilador.
8. 8. Los exosomas de MSC aislados para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el sujeto es un neonato, o en donde el sujeto es un nino o en donde el sujeto es entre 3 y 18 anos de edad, o en donde el sujeto es un adulto.
9. 9. Los exosomas de MSC aislados para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde los exosomas de MSC aislados son para administracion intravenosa, o en donde los exosomas de MSC aislados son para la administracion a los pulmones o la traquea del sujeto, opcionalmente en donde los exosomas de MSC aislados son para la administracion por inhalacion o en donde los exosomas de MSC aislados son para la administracion en un aerosol o en donde los exosomas de MSC aislados se administran utilizando un nebulizador o en donde los exosomas de MSC aislados se administran utilizando un tubo intratraqueal.
10. 10. Los exosomas de MSC aislados para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde los exosomas de MSC aislados son para la administracion con un tensioactivo pulmonar, opcionalmente en el tensioactivo pulmonar es un tensioactivo aislado que se produce de forma natural, opcionalmente en donde el tensioactivo pulmonar se deriva de pulmon bovino o pulmon porcino, o en donde el tensioactivo pulmonar es un tensioactivo sintetico.
11. 11. Los exosomas de MSC aislados para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en donde los exosomas de MSC aislados son para la administracion repetida al sujeto, o en donde los exosomas de MSC aislados son para la administracion por dos veces al sujeto o en donde los exosomas de MSC aislados son para la administracion continua al sujeto.
12. 12. Los exosomas de MSC aislados para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11 precedentes, en donde los exosomas de MSC aislados se derivan de MSC de la sangre del cordon o en donde los exosomas de MSC aislados se derivan de MSC de la medula osea.
13. 13. Los exosomas de MSC aislados para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en donde los exosomas de MSC aislados son autologos al sujeto, o en donde los exosomas de MSC aislados son alogenicos para el sujeto.
14. 14. Una composicion, que comprende exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) aislados y un tensioactivo pulmonar o un corticosteroide pulmonar.
15. 15. Exosomas de celulas madre mesenquimales (MSC) aislados aerosolizados.