KR101566450B1 - 중간엽 줄기세포에서 단백질의 대량 생산 방법 - Google Patents
중간엽 줄기세포에서 단백질의 대량 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 다양한 성장인자 및 사이토카인을 포함하는 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법, 상기 생산방법으로 생산된 단백질을 다량 함유하는 중간엽 줄기세포 배양액, 상기 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물, 및 피부 재생용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량생산 방법은 기존의 배양 방법으로는 중간엽 줄기세포로부터 발현이 되지 않았거나 매우 적은 양으로만 발현되는 것으로 알려졌던 다양한 성장인자 및 단백질들의 양을 현저하게 증가시키며, 상기 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포 배양액은 다양한 종류의 사이토카인 및 성장인자를 다량 함유하므로 피부 재생 및 주름 개선에 우수한 효과가 있다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량생산 방법은 기존의 배양 방법으로는 중간엽 줄기세포로부터 발현이 되지 않았거나 매우 적은 양으로만 발현되는 것으로 알려졌던 다양한 성장인자 및 단백질들의 양을 현저하게 증가시키며, 상기 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포 배양액은 다양한 종류의 사이토카인 및 성장인자를 다량 함유하므로 피부 재생 및 주름 개선에 우수한 효과가 있다.
Description
본 발명은 다양한 성장인자 및 사이토카인을 포함하는 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법, 상기 생산방법으로 생산된 단백질을 다량 함유하는 중간엽 줄기세포 배양액, 상기 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물, 및 피부 재생용 약학 조성물에 관한 것이다.
세포 치료제(cell therapy product)는 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위(최소한 이상의 조작: more-than-minimal manipulation)를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로 정의된다. 줄기세포 치료제는 세포 치료제 중 특히 줄기세포를 포함하는 것을 의미하며, 신경질환, 심질환, 폐질환, 간질환, 암과 같이 손실된 세포의 회복과 재생이 필수적이면서도 자연 치유가 어려운 질환에 대하여 활발하게 개발이 진행되고 있다.
줄기세포는 다분화성을 가지고 있어 특정 세포로 분화될 수 있으므로 세포 치료제로서 잠재력이 크지만, 현재까지는 체내 이식 후 생존율이 높지 않고, 면역 거부반응을 일으킬 수 있어 실제 임상 적용에서 광범위하고 안정적으로 성공한 예를 찾기 어렵다.
이에 줄기세포 치료제에 대한 대안으로, 상기 줄기세포의 배양액(conditioned media)이 주목을 받고 있다. 줄기세포 배양액이라 함은 세포를 배양한 후 수득한 세포를 포함하지 않는 배지로서, 세포 성장에 필수적인 여러 가지 성분들(예컨대, 사이토카인, 성장인자 등)이 포함되어 있다. 줄기세포 배양액은 세포의 성장을 촉진시키기 위해 사용되거나, 특정 성분을 분리해내기 위해 사용되고 있으며, 이 밖에도 줄기세포 배양액 자체로 여러 가지 질환의 치료에 응용되고 있다. 예를 들어, 인간 중간엽 줄기세포 배양액의 간세포의 사멸 억제 및 간세포의 재생을 증가시키는 효능을 이용하여 급성 간 질환 치료에 적용할 수 있음이 보고되었고, 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포의 배양액은 세포 재생 및 상처 치유에 유효한 성장인자와 단백질을 함유하고 있으며 이를 상처부위에 도포하였을 경우 상처 치유를 촉진시킨다고 보고되었다. 또한, 지방에서 유래된 중간엽 줄기세포가 혈관 및 세포 재생에 관여하는 유전자 및 성장인자를 분비한다고 보고되었고, 인간 배아줄기세포에서 분화된 간세포-유사 세포와 이 세포로부터 분비된 단백질을 간이 손상된 마우스에 각각 적용하였을 경우에 모두 간 손상을 회복시킨다고 보고되었다.
하지만, 상기 연구들에 사용된 배지는 동물 유래 성분인 소 혈청과 안전성이 떨어지는 완충용액 및 지시약 성분들이 포함되어 있어 임상에 직접 적용하기 어렵다는 단점이 있다. 또한, 종래의 일반적인 세포 배양법의 경우 배지로 분비되는 성분들(예를 들어, 성장 인자 등)의 농도가 낮아 임상 적용시 환부에 줄기세포 배양액을 다량 사용하여야 하는 문제가 있으며, 또한 농도를 높이기 위해 농축 등의 조작을 하게 되면 생산 단가가 현저히 상승하여 경제성이 떨어진다는 문제가 있다.
이와 같은 문제를 극복하기 위한 다양한 시도들이 있어 왔으나 현재까지 만족스러운 결과는 보고된 바 없다. 예컨대 VEGF 등의 특정 성장인자의 함량을 높이려는 목적으로 저산소 조건에서 배양을 실시한 보고가 있었으나 수득량에는 한계가 있었다. 또한 소 혈청을 배제시키기 위하여 무혈청 배지를 사용하는 경우 줄기세포의 줄기세포성(stemness)이 유지되지 어려워, 결국 줄기세포 배양액의 생리활성이 떨어지게 되어 상기 배양액을 1 회 밖에는 얻을 수 없다는 등의 문제가 있었다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하고자, 줄기세포 배양액에서 이전의 배양 방법으로는 발현이 되지 않았거나 매우 적은 양으로만 발현되는 것으로 알려졌던 다양한 성장인자 및 단백질들을 대량 생산할 수 있는 중간엽줄기세포 배양 방법을 개발하였다. 나아가, 상기 배양 방법은 특정 성장인자를 포함하는 단백질의 함량을 높이기 위해 세포 자체에 인위적인 조작을 가하는 대신, 무혈청 배양단계에서의 다양한 배양조건을 변화시켜 성장인자를 포함하는 유용 단백질들을 대량 생산하기 위한 최적의 배양 조건을 확립한 것으로, 이를 통해 생산된 중간엽 줄기세포 배양액은 피부 재생 및 주름 개선 용도로 인체에 적용하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.
본 발명의 목적은 다양한 성장인자 및 사이토카인을 포함하는 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법, 상기 생산방법으로 생산된 단백질을 다량 함유하는 중간엽 줄기세포 배양액, 상기 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물, 및 피부 재생용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 (a) 중간엽 줄기세포를 18,000 내지 22,000 세포/cm2의 밀도로 접종하는 단계; (b) 상기 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) 배양 114 내지 126 시간 경과 후 줄기세포 배양액을 수득하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법으로, 상기 중간엽 줄기세포는 -90 내지 -70 ℃ 초저온 냉동고에서 CRYO-GOLD 용액으로 보관한 것이고, 상기 단백질은 AR, bFGF, BMP-5, BMP-7, GH, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, SCF, TGFα, TGFβ1, VEGF R3, VEGF-D, ICAM-1, IL-1a, IL-5, MIP-1a, MIP-b, MIP-d, RANTES, TNF R1, 및 TNF RII를 포함하는 것인, 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법을 제공한다.
본 발명자들은 줄기세포 배양액으로부터 사이토카인, 성장인자 등 유용한 단백질을 대량생산하기 위하여 줄기세포 배양방법을 최적화하였으며, 상기 최적화된 줄기세포 배양방법으로부터 수득된 줄기세포 배양액은 유용한 단백질을 대량 함유하고 있으며, 특히 콜라겐을 높은 수준으로 함유하고 있고, 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 향상시켜 우수한 상처 치유(wound healing) 능력을 보이는 것을 확인하였다.
이하 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산 방법의 각 단계를 상세히 설명한다.
단계 (a)는 중간엽 줄기세포를 적절한 수로 분주하여 접종하는 단계로서, 특히 18,000 내지 22,000 세포/cm2의 밀도로 접종하는 단계이다.
본 발명에서 용어, "줄기세포(stem cell)"란 적합한 환경 및 자극을 통해 각종 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있으며, 자가증식 능력을 갖추고 있는 세포를 말한다.
본 발명에서 사용되는 줄기세포는 분화 능력과 자가증식 능력을 갖춘 것이라면 그 종류가 제한되지 아니하나, 바람직하게는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간 지방, 제대혈, 골수, 양수 또는 양막 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 가장 바람직하게는 양수 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 용어, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)"란 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 지방, 양수 등 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 중간엽 줄기세포를 의미하며, 그 유래에 특별히 제한되는 것은 아니다.
중간엽 줄기세포는 생체 내에서 주변 미세 환경(stem cell niche)에 따라 세포 분열, 분화 또는 이동하는 등 행동 양상이 달라질 수 있다. 더 구체적으로는 중간엽 줄기세포는 주변 미세 환경으로부터 오는 자극에 의해 유전자 발현 양상이 달라질 수 있으며, 이에 따라 분비 단백질의 종류 및 단백질 양도 달라질 수 있다. 이러한 주변 미세 환경은 세포 주변의 물리적 환경, 즉 세포가 존재하는 조직의 특성, 세포의 위치, 부착 상태 등을 포함할 뿐만 아니라 화학적 환경, 즉 외부의 사이토카인 또는 성장인자 등을 포함한다.
이러한 경향은 생체 외 줄기세포 배양에서도 유사하게 나타나는데, 이에 따라 줄기세포를 배양하는 조건을 달리 함으로써 줄기세포에서 분비되는 단백질의 종류 및 양이 달라질 수 있다.
줄기세포의 생체 외 배양은 보관된 줄기세포, 초대 배양 세포 또는 계대 배양 세포를 배양 용기에 분주하여 접종하는 과정을 포함하는데, 이때, 접종하는 세포의 밀도가 줄기세포 분비 단백질의 종류 및 양을 달라지게 할 수 있다. 이는 직접적 또는 간접적으로 이루어지는 세포-세포 상호작용(cell-cell interaction)에 의해 줄기세포의 유전자 발현 양상이 달라지기 때문이다.
본 발명에서 접종되는 세포의 밀도는 18,000 내지 22,000 세포/cm2 밀도일 수 있고, 바람직하게는 19,000 내지 20,000 세포/cm2 밀도일 수 있으며, 보다 바람직하게는 20,000 세포/cm2 밀도일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 중간엽 줄기세포를 5,000 내지 25,000 세포/cm2의 밀도로 접종하여 분비 단백질의 농도를 확인한 결과, 20,000 세포/cm2의 밀도에서 가장 높은 농도의 단백질을 발현하는 것을 확인하였다(도 1). 특히, 25,000 세포/cm2인 경우, 오히려 세포 수가 더 많음에도 불구하고 단백질 농도가 더 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 대량생산하기 위한 최적의 세포 밀도는 약 20,000 세포/cm2임을 알 수 있었다.
다음으로 단계 (b)는 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계이다.
본 발명에서 용어, "배지(culture media)"란 인 비트로(in vitro) 상에서 줄기세포들의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지로서, 줄기세포 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium) 및 IMEM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.
특히 본 발명에 있어서, 상기 배지는 무혈청 배지(serum-free media)인 것을 특징으로 한다. 혈청(serum)은 일반적으로 생체 외에서 세포를 배양하는 경우 배양 배지에 필수적으로 첨가된다. 혈청이 첨가되지 않은 경우, 세포 주기가 G0기에 머무는 세포 주기 억제(cell cycle arrest)가 일어날 수 있으며, 이러한 상태가 지속될 경우 세포 노화(senescence)가 진행되거나 세포 사멸(apoptosis)가 일어날 수 있다. 반면에 혈청이 첨가될 경우 세포가 지속적으로 증식할 수 있게 된다.
인간 혈청(serum)을 대량으로 얻는 것은 현실적으로 어려움이 있으므로, 생체 외 배양에 있어서는 주로 소태아(fetal bovine), 말(horse), 당나귀(donkey) 등 동물의 혈청을 사용한다. 혈청에는 다양한 사이토카인과 성장인자들이 포함되어 있어 세포 증식을 가능하게 하지만, 현재까지 혈청 성분이 완전히 밝혀진 것은 아니다. 따라서, 동물 유래인 혈청은 면역반응을 유발하거나 특정 질병의 발병 원인이 될 수 있는 위험성을 가지고 있으므로, 혈청을 포함한 배지에서 배양된 세포 또는 세포 배양액을 인간에 적용하는 것에 대하여 부작용의 가능성이 계속 지적되고 있는 실정이며, 임상을 진행하는데 있어서도 어려움이 있다.
이에, 본 발명에서는 인체에 적용될 경우 안전한 세포 배양액을 수득하기 위하여 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하여 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 대량 생산하는 방법을 개발하였다.
단계 (c)는 상기 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 114 내지 126 시간 경과 후 줄기세포 배양액을 수득하는 단계이다.
상기 설명한 바와 같이 줄기세포는 배양 과정에서 외부의 자극에 따라 분비되는 단백질의 종류 및 양이 달라질 수 있으며, 이러한 외부 자극에 영향을 미치는 인자에는 배양 시간도 포함된다. 즉, 시간의 흐름에 따라 줄기세포에서 분비하는 단백질의 종류 및 양이 달라질 수 있고, 배양액 내에 존재하는 단백질의 함량도 달라질 수 있으므로, 본 발명자들은 줄기세포의 배양 시간에 따른 배양액 내의 단백질 생산량을 비교하여 중간엽 줄기세포를 배양하여 단백질을 대량 생산하기 위한 최적의 시간 조건을 확립하였다.
본 발명에서 줄기세포 배양액을 수득하기 위해 줄기세포를 배양하는 시간은 114 내지 126 시간일 수 있으며, 바람직하게는 117 내지 123 시간 일 수 있고, 보다 바람직하게는 120 시간일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 72 내지 144 시간 동안 배양하여 각각의 시간 조건에서 단백질 생산량을 비교하였다(도 2). 그 결과 중간엽 줄기세포를 약 120 시간 배양한 배양액에서 단백질 생산량이 최대가 되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 배양액을 수득하는 단계에서는 배양 용기로부터 중간엽 줄기세포에서 생산된 단백질을 포함하는 배양액을 모으는 과정을 거치며, 상기 수득 단계는 1 회 배양액을 수득한 후, 세포를 완충액으로 세척하고 다시 새로운 배지로 교체한 뒤 114 내지 126 시간 경과 후 줄기세포 배양액을 추가로 수득할 수 있다. 이러한 줄기세포 배양액 수득 과정은 수 회 반복될 수 있으며, 바람직하게는 1 회 내지 3 회 반복되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법으로 제조된 줄기세포 배양액을 순차적으로 3 회 수득하여 배양액의 단백질 농도를 확인한 결과, 수득 회차가 증가될 수록 배양액 내의 단백질 농도는 조금씩 감소하는 현상을 보였으나, 기존 방법에 의해 배양된 중간엽 줄기세포 배양액에 비해서는 현저히 많은 양의 단백질을 포함하는 것을 확인하였다(도 5). 따라서 이러한 수득 과정은 중간엽 줄기세포를 배양하는 과정에서 수 회 반복될 수 있다는 것을 알 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법은, 중간엽 줄기세포를 -90 내지 -70 ℃ 초저온 냉동고에서 CRYO-GOLD 용액으로 보관하는 것을 특징으로 한다.
생체 외에서 세포를 배양하는 경우, 초대 배양을 통해 배양한 세포를 바로 이용하는 경우가 아니라면, 세포를 보관하는 과정이 필수적일 수 있다. 줄기세포는 자가 증식이 가능하여 무한히 증식할 수 있는 세포이나, 생체 외 배양은 인위적으로 만들어진 환경으로 암 세포 및 배아줄기세포를 포함하는 몇몇의 세포를 제외하면 장기 배양시 세포가 노화되거나 세포사멸이 일어날 수 있으며, 중간엽 줄기세포의 경우에도 계대 배양의 한계가 있다. 또한, 세포 배양에는 많은 비용과 인력이 필요하므로 필요시에 세포를 배양할 수 있도록 세포 배양과정에는 세포를 보관하는 과정이 매우 중요하다.
세포는 일반적으로 동결 보존액에 세포를 혼합하고 초저온 상태에서 보관하는데, 동결 보존액은 세포가 동결되었을 때, 결정화에 의해 세포막이 파괴되는 것을 방지하는 역할을 한다. 또한, 세포를 동결 시키는 온도가 중요할 수 있는데, LN2(liquid nitrogen) 탱크에 -196 ℃에서 보관하거나 이보다 온도가 높은 초저온 냉동고에서 보관할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 중간엽 줄기세포를 보관하는 단계에서 동결 보존액의 종류에 따른 줄기세포 분비 단백질의 생산성을 확인하였다. 먼저 대조군(10 % DMSO, 20 % FBS 및 70 % cDMEM), CRYO-GOLD, CRYO-ROS, STEM-CELL BANKER 및 CellFreezer에 동결 보존되었던 세포들의 생존성을 확인하였으나, 동결 보존액에 따른 세포 생존성은 차이가 없었다(도 3). 다만 상기 세포들을 배양한 배양액의 단백질 농도를 확인한 결과 CRYO-GOLD 용액을 동결 보존액으로 사용하였을 때 단백질 농도가 가장 높게 나타나는 것을 확인함으로써, CRYO-GOLD 용액으로 세포를 보관하는 것이 줄기세포에서 단백질을 대량 생산할 수 있는 최적 조건임을 알 수 있었다(도 4).
본 발명의 구체적인 다른 일 실시예에서는 최적화된 배양 조건 또는 종래의 배양 조건에서 생산된 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포 배양액에 존재하는 단백질 농도를 확인해본 결과, 최적화된 배양 조건에서 단백질 농도가 현저하게 증가된 것을 확인하였으며(도 5), 이러한 결과는 양수 유래 중간엽 줄기세포뿐만 아니라, 지방(도 9), 골수(도 10) 및 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(도 11)의 배양액에서도 유사하게 나타났다. 따라서, 본 발명의 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법은 중간엽 줄기세포의 유래 조직에 관계 없이 적용 가능하며, 상기 방법을 이용하여 중간엽 줄기세포에서 유용한 성장인자 및 사이토카인을 포함하는 다양한 단백질들을 대량으로 생산할 수 있다.
본 발명에서는 중간엽 줄기세포를 배양하여 성장인자를 포함한 단백질을 대량 생산하는 것을 목적으로 한다. 상기 단백질은 기존에 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 것으로 알려진 단백질의 양을 증가시키는 것일 수도 있고, 기존에 분비되는 것으로 알려지지 않았으나 상기 방법에 의해 새롭게 분비되는 것일 수도 있다.
구체적으로, 본 발명의 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법에 의해 생산된 단백질은 AR, bFGF, BMP-5, BMP-7, GH, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, SCF, TGFα, TGFβ1, VEGF R3, VEGF-D, ICAM-1, IL-1a, IL-5, MIP-1a, MIP-b, MIP-d, RANTES, TNF R1, 및 TNF RII를 포함한다.
또한, 본 발명의 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법을 통해 생산된 줄기세포 배양액은 BDNF, BMP-4, b-NGF, EGF R, FGF-4, FGF-7, GDF-15, GDNF, HGF, IGFBP-6, IGF-I, Insulin, MCSF R, NGF R, NT-3, NT-4, OPG, PDGF-AA, PIGF, SCF R, VEGF, G-CSF, IL-2, IL-6, IL-8, IL-11, MCP-1, MCSF, MIG, TIMP-1, TIMP-2, TNFα, 및 TNFβ를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, FGF-7 (Fibroblast growth factor 7)은 FGF 패밀리에 속하며 배아 발달, 세포 증식, 세포 분화 조절에 중요하게 작용한다. 정상적인 조직 형성에 필요하며 각질 형성세포 (keratinocytes)의 성장인자로 작용하며 정상적인 상피세포 (epithelial cells) 증식에 대한 주요한 인자이다. 또한 상피 형성, 상처의 재상피화, 모발 발달, 폐 기관 형성에 중요하게 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, IGFBP-1 (Insulin-like growth factor-binding protein 1)은 인슐린 유사 성장인자 결합단백질로서 IGF의 반감기를 연장하여 세포 배양에서 IGF의 성장 촉진 효과를 저해 또는 자극하는 작용을 한다. 또한 세포의 이동 (migration)을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, IGFBP-3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3)은 인슐린 유사 성장인자 결합단백질로서 IGFALS (insulin-like growth factor acid-labile subunit)와 결합체를 형성하여 혈장을 순환하며 IGF의 반감기를 연장하여 세포배양 시 성장 촉진 효과를 자극하는 작용을 한다. 전립선암 등의 진행 동안 단백질 레벨이 감소한다.
본 발명에서 용어, MCSF-R(Macrophage colony-stimulating factor receptor)은 MCSF의 수용체로서, 상기 MCSF는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)가 대식세포 또는 다른 관련 세포로 분화하는데 영향을 미치고, 진핵 세포에서 바이러스 감염에 대응하여 생산되며, 태반 발달과 관련이 있다.
본 발명에서 용어, NT-4 (Neurotrophin-4)는 신경영양 인자로서 TrkB 수용체 타이로신 키나아제를 수용체로 하여 신호 전달을 하며 말초 감각 교감 신경의 생존에 필요한 인자로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, TGF-β1(Transforming growth factor-β1)은 수많은 다른 성장 인자들을 양성적 및 음성적으로 조절하며 수많은 세포 타입들에 대하여 세포 증식, 분화, 여러 기능들을 조절하는 복합기능을 갖는 단백질이다. 골모세포의 골 형성 등을 자극함으로서 골 재형성에 대하여 중요한 역할을 하며 상처 치유에 중요한 역할을 한다. 또한 면역계 조절에 중요하며 대부분의 면역세포가 TGF-β1을 분비하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, bFGF (Fibroblast growth factor 2)는 세포의 생존, 세포분열, 신생혈관형성(angiogenesis), 세포 분화 및 세포 이주 조절에 중요한 역할을 담당하며 상처 치유(wound healing)에 중요한 역할을 담당한다.
본 발명에서 용어, EGF-R (Epidermal growth factor receptor)은 상피세포성장인자 수용체이며 타이로신 카이나아제이다.
본 발명에서 용어, FGF-4 (Fibroblast growth factor 4)는 FGF 패밀리에 속하며 배아 발달, 세포 증식, 세포 분화 조절에 중요하게 작용한다. 발달 단백질, 성장 인자, 미토겐으로 작용하며, 배 발달 (embryonic development) 동안 정상적인 수족 및 심장판막의 발달에 필요한 단백질이다.
본 발명에서 용어, GDF-15 (Growth/differentiation factor 15)는 TGF-슈퍼패밀리 에 속하며 TGF-PL, MIC-1, PDF, PLAB, PTGFB 라고도 알려져 있다. 손상된 조직에서, 그리고 질병 과정 동안 염증성 및 세포사멸 경로를 조절하는 역할을 한다.
본 발명에서 용어, HGF (Hepatocyte growth factor)는 간세포 증식인자로서 여러 종류의 중간엽 세포 (mesenchymal cells)로부터 분비된다. 세포증식촉진활성, 세포운동성 촉진활성, 상피형태형성 유도활성 등이 있으며 신경영양인자 및 혈관신생인자로 작용한다. 또한 발생과정에서 상피-간엽 상호작용의 매개체로서 간, 신장, 폐 등의 내장기관, 태반, 골격계 형성에 관여하며 성체에서는 간, 신장, 폐, 소화관의 재생을 촉진하는 기관재생인자로서의 기능을 함으로써 장기질환 치료제로 기대되고 있는 물질이다.
본 발명에서 용어, IGFBP-4 (Insulin-like growth factor-binding protein 4)는 IGF와 결합하여 당화 및 비당화 형태로 혈장 내를 순환하며 IGF의 반감기를 연장하여 세포배양에서 IGF의 성장 촉진 효과를 저해 또는 자극하는 작용을 한다. 생체 내 및 생체 외에서 여러 암세포들을 저해하며 암세포에 대하여 세포 사멸 인자로 작용함으로서 전립선암, 대장암 등의 암의 증식을 감소시키는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, IGFBP-6 (Insulin-like growth factor-binding protein 6)는 단백질의 세포 표면 수용체와 IGF가 상호작용을 하여 결합하며 IGF의 반감기를 연장하여 세포배양에서 IGF의 성장 촉진 효과를 저해 또는 자극하는 작용을 한다.
본 발명에서 용어, NT-3 (Neurotrophin-3)는 신경영양인자로서 뇌 및 말초 조직에서 특히 존재하며 신경발생 (neurogenesis) 을 촉진 및 조절하는 데에 기여하는 단백질이다. 또한 내장 감각 신경세포 및 고유수용성 감각 신경세포의 생존을 증진시킨다. 모발 주기 중 퇴행기에서 FGF5, TGF-1 등과 함께 발현되는 특징을 가지는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, OPG (Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B)는 오스테오프로테그린 (Osteoprotegerin, OPG) 및 오스테오칼스토제네시스 억제 인자(OCIF) 로도 알려져 있다. 골 파괴 (골조직 흡수, osteoclastogenesis)에 대하여 상쇄 기능을 한다. 생체 외에서 파골세포 (osteoclasts) 의 활성을 저해하고 파골세포의 세포사멸을 촉진한다. 골 항상성은 TNSF11 과 TNFRSF11B 간의 국소 비율에 의존한다. 또한 동맥 석회화 (arterial calcification)를 예방하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, PDGF-AA (Platelet-derived growth factor subunit A)는 태아 발달, 세포 증식, 세포 마이그레이션, 생존, 주화성 등의 조절에 중요한 역할을 담당하는 성장인자이다. 중간엽 기원의 세포에 대하여 미토젠으로 작용하며 상처 치유에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, PIGF (Placenta growth factor)는 태반증식인자로서 신생혈관생성, 내피세포 성장, 증식 및 마이그레이션의 자극 및 활성화에 작용하는 성장인자로 작용한다.
본 발명에서 용어, VEGF (Vascular endothelial growth factor A)는 발달 단백질, 성장 인자, 미토겐으로서 신생혈관생성, 혈관생성, 내피세포 성장을 활성화하는 데에 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 내피세포 증식을 유도하고 세포 마이그레이션을 촉진하고 세포사멸을 저해하고 혈관 투과성을 증진시키는 역할을 담당한다.
본 발명에서 용어, G-CSF (Granulocyte-colony stimulating factor)는 과립구집락자극인자수용체로서 뼈(Bone)를 구성하고 혈액순환을 원활하게 해주는 역할을 한다. 또한 백혈구 생성을 촉진하고, 조직을 분화시키며 염증성 사이토카인 조절신호인 JAK를 조절하고 그 밖의 다른 사이토카인(STAT, MAPK, PI3K, Akt) 물질의 활성을 촉진 시키는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1)은 세포 간 부착분자로서 염증 세포 부착과 이동에 관여하는 염증단백질의 일종이다. 혈관 안쪽세포의 구조적 변화를 유도하며 면역 시스템 세포를 변환시킨다.
본 발명에서 용어, IL-6 (Interleukin 6)는 beta 세포의 항체생산세포로의 최종 분화를 유도하며, 근육세포의 역할을 하고 골수세포를 형성한다. 감염을 막고 박테리아에 견디는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, IL-11 (Interleukin 11)은 골수의 섬유아세포로서, 생물 활성이 다양하여 혈질세포주의 증식, B림프구의 분화, 조혈간세포의 증식과 분화, 거핵구의 증식과 성숙, 조혈계에 관한 작용, 골격, 신경계에도 영향을 미친다.
본 발명에서 용어, MCP-1 (monocyte chemoattractant protein- 1)은 CC 케모카인으로써 단핵구, 림프구, 호염구 등을 선택적으로 유도하며, IL-1a TNF-a 저밀도 지단백질(LDL) 등에 반응하여 기질세포, 사구체의내피, 세뇨관 상피세포, 모세혈관의 내피세포 및 평활근세포 등에서 생산되고 있다. 이러한 단핵구/ 다핵구의 침윤이 염증성신질환의 병태생리에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, MIP-1a(macrophage inflammatory protein 1 alpha)는 대식세포 염증성 단백질 알파1로 CC 케모카인 또는 베타 서브 패밀리의 일원이다. MIP-1 알파 단핵구, T세포, B세포 등 다양한 세포에 대한 화학 유인 물질로서 작용한다고 알려져 있다.
본 발명에서 용어, TIMP-1 (TIMP metallopeptidase inhibitor 1)은 TIMP의 구성 유전 요소이며, 구성단백질이다. MMP의 억제제 역할을 하며, 세포 사멸을 막는 기능을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, TIMP-2 (TIMP metallopeptidase inhibitor 2)는 TIMP의 구성 유전 요소이며, MITF에 의해 멜라노사이트 세포를 조절하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, TNF RI (Tumor necrosis factor - and TNF receptor I )은 종양괴사인자 전달 물질로서 대식세포에 의해 체내에서 생성되는 단백질이다. TNF 관련 사이토카인은 자가면역 질병에 관련되어 있으며 특히 T세포를 자극시키는 것으로 알려져 있다.
상기 단백질들은 모두 종래의 중간엽 줄기세포 배양방법으로는 분비되지 않았거나 극히 소량 분비되는 것들이나, 본 발명에서 최적화한 배양방법을 통해 새롭게 분비되거나 분비량이 증가되는 것을 확인하였다(표 3 및 표 4).
본 발명의 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법을 통해 상기 단백질들을 기존의 배양방법에서 분비되는 양보다 더 많은 양을 생산할 수 있다. 이와 같이 다양한 종류의 유용한 성장인자 및 사이토카인을 포함하는 단백질들을 대량 생산함으로써 원하는 표적 단백질을 생산, 정제하여 수득하는데 매우 효과적일 수 있으며, 나아가 피부 재생 및 주름 개선용 조성물로 이용될 수 있다.
상기 생산방법을 통해 수득한 분비 단백질의 총 농도는 이에 제한되는 것은 아니나 BCA 측정법으로 30 ㎍/㎖ 내지 70 ㎍/㎖일 수 있다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서, 상기 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법으로 생산된 단백질을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액을 제공한다.
중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법 및 이로부터 제조된 중간엽 줄기세포 배양액은 상기 설명한 바와 같다.
상기 줄기세포 배양액은 콜라겐을 전체 배양액의 5 내지 20 중량%로 함유하는 것일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 15 중량%로 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 줄기세포 배양액은 섬유아세포의 콜라겐 생성을 촉진 시키는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 줄기세포 배양액 내에 함유된 콜라겐 함량을 절대정량하여, 기존 방법으로 생산된 줄기세포 배양액과 비교한 결과, 총 검출된 단백질의 12.4 중량%가 콜라겐으로 검출되어 기존 방법에 비해 2 배 이상의 콜라겐 함량을 가지는 것을 확인하였다(표 6).
본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 줄기세포 배양액을 인간 섬유아세포에 처리한 결과, 섬유아세포의 콜라겐 합성 능력을 향상시키는 것을 확인하였으며(도 7), 이는 기능성 고시원료인 아데노신과 비교하여 13 배 이상의 현저한 효과를 보이는 것이다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 중간엽 줄기세포 배양액에 대하여는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 사용되는 용어, "피부 재생"은 피부 외부 및 내부 원인에 의한 손상에 대해 피부 조직의 회복 과정을 의미한다. 상기 외부 원인에 의한 손상은 자외선, 외부 오염 물질, 창상, 외상 등을 들 수 있으며, 상기 내부적 원인에 의한 손상은 스트레스 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "주름 개선"은 피부의 주름 및 탄력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 중간엽 줄기세포 배양액으로 피부 재생 및 주름 개선 능력을 평가할 수 있는 상처 치유 시험(wound healing assay)을 통하여, 기존 방법으로 배양하여 수득한 중간엽 줄기세포 배양액에 비하여 현저한 효과를 확인하였다(도 8). 이는 상기 설명한 바와 같이 본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액이 상처 치유에 효과적인 단백질들을 대량 함유하고 있기 때문이며, 이로부터 본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물이 피부 재생 및 주름 개선 용도로 활용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에서는 상기에서 기술된 중간엽 줄기세포 배양액은 상기 기술된 효과를 나타낼 수 있는 적절한 양으로 포함될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기한 중간엽 줄기세포 배양액 외에도 필요에 따라 본 발명의 효과를 저하시키지 않는 범위 내에서 피부 외용제에 일반적으로 사용하는 각종 성분, 예를 들면 수용성 성분, 분말성분, 유분, 계면활성제, 보습제, 점도조절제, 방부제, 산화방지제, 향료, 색소 등을 배합하여 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 임의로 선택할 수 있으며, 유효성분인 중간엽 줄기세포 배양액과 함께, 물, 생리식염수, 글리세롤, 유분, 계면활성제, 보습제, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 및 향료 등과 같은 기 공지된 화장료용 부형제가 혼합되어 로션제(lotiones), 액제(液劑), 유제, 에멀션제, 현탁제(懸濁劑), 정제(錠劑) 및 캡슐제(capsules) 형태를 이루는 화장료 조성물이 형성된다. 상기 화장료 조성물을 사용하여 유연 화장수, 밀크로션, 영양크림, 맛사지 크림, 에센스, 클렌싱 폼, 클렌싱 워터, 팩 또는 바디오일 등의 기초 화장료 및 파운데이션, 립스틱, 마스카라 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료를 제조할 수 있으며, 또한 세안제 및 목욕제를 제조할 수 있다.
이러한 화장료 조성물의 중간엽 줄기세포 배양액이 피부에 흡수 및 고정되는 것을 촉진하도록, 화장료용 부형제 중에서 글리세린 1~7 중량%가 포함되어 중간엽 줄기세포 배양액 함유 화장료 조성물이 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 화장료 조성물에게 항산화 기능을 제공하도록, 화장료용 부형제 중에서 선플라워 오일(sunflower oil)이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 재생용 약학 조성물을 제공한다.
상기 중간엽 줄기세포 배양액에 대하여는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 조성물은 상처 치유 시험(wound healing assay)를 통해 기존의 방법으로 배양된 중간엽 줄기세포 배양액보다 우수한 상처 치유 효능이 있으므로(도 8), 피부 재생용 약학 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 피부 재생용 약학 조성물의 처리량은 약학적으로 유효한 양이어야 한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질환의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 피부 재생용 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제 및 패치의 형태로 제형화하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량생산 방법은 기존의 방법에 비하여 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 단백질의 종류 및 양을 현저하게 증가시키며, 특히 상기 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포 배양액은 다양한 종류의 사이토카인 및 성장인자를 다량 함유하고 있으며, 피부의 주요 구성성분인 콜라겐을 다량 함유하고 있고, 콜라겐 생성 촉진 효과 또한 탁월하므로 피부 재생 및 주름 개선에 우수한 효과가 있다.
도 1은 줄기세포 분비 단백질 대량 생산을 위한 최적의 세포 접종 밀도 조건을 확인한 것이다.
도 2는 무혈청 배양 시간(12 시간 간격)에 따른 단백질 생산량을 비교한 것이다.
도 3은 중간엽 줄기세포의 냉동 보관 조건에 따른 세포 생존율을 비교한 것이다.
도 4는 세포 동결 용액 종류에 따른 줄기세포의 분비 단백질을 비교한 것이다.
도 5는 최적 무혈청 배양 및 보관조건에서 수득된 줄기세포 배양액의 단백질 총량을 비교한 것이다.
도 6은 최적 무혈청 배양 및 보관조건에서 수득된 줄기세포 배양액의 항체 어레이(Antibody array)의 스캔 이미지이다.
도 7은 최적 무혈청 배양 및 보관조건에서 수득된 줄기세포 배양액의 콜라겐 합성 효능을 확인한 것이다.
도 8은 최적 무혈청 배양조건 및 보관조건에서 수득된 줄기세포 배양액의 상처 치유 효능을 비교한 것이다.
도 9은 지방 유래 중간엽 줄기세포 배양액에서의 최적 무혈청 배양조건을 검증한 것이다.
도 10은 골수 유래 중간엽 줄기세포 배양액에서의 최적 무혈청 배양조건을 검증한 것이다.
도 11는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액에서의 최적 무혈청 배양조건을 검증한 것이다.
도 2는 무혈청 배양 시간(12 시간 간격)에 따른 단백질 생산량을 비교한 것이다.
도 3은 중간엽 줄기세포의 냉동 보관 조건에 따른 세포 생존율을 비교한 것이다.
도 4는 세포 동결 용액 종류에 따른 줄기세포의 분비 단백질을 비교한 것이다.
도 5는 최적 무혈청 배양 및 보관조건에서 수득된 줄기세포 배양액의 단백질 총량을 비교한 것이다.
도 6은 최적 무혈청 배양 및 보관조건에서 수득된 줄기세포 배양액의 항체 어레이(Antibody array)의 스캔 이미지이다.
도 7은 최적 무혈청 배양 및 보관조건에서 수득된 줄기세포 배양액의 콜라겐 합성 효능을 확인한 것이다.
도 8은 최적 무혈청 배양조건 및 보관조건에서 수득된 줄기세포 배양액의 상처 치유 효능을 비교한 것이다.
도 9은 지방 유래 중간엽 줄기세포 배양액에서의 최적 무혈청 배양조건을 검증한 것이다.
도 10은 골수 유래 중간엽 줄기세포 배양액에서의 최적 무혈청 배양조건을 검증한 것이다.
도 11는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액에서의 최적 무혈청 배양조건을 검증한 것이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예
1. 세포 접종 밀도별 최적 조건 확인
최적의 세포 접종 밀도 조건을 찾기 위해 다양한 세포 접종 밀도별로 수득된 줄기세포 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량을 BCA 측정법으로 조사하였다. 배양 용기에 각각 5,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000 세포/cm2 밀도로 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포(Human amniotic fluid derived cell, ANGIOCRINE, cat.# hAmnio-01)를 접종한 후 120 시간 동안 무혈청 배양하고 수득한 줄기세포 배양액에 대하여 총 단백질 함량을 측정하였다. 구체적인 배양 조건 및 배양 과정은 다음과 같다.
먼저, 냉동된 중간엽 줄기세포 1x106 개를 해동하여 T75 플라스크에 접종하였다. 이때의 배지는 10 % 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, Gibco, Austria origin) 및 100 ㎍/㎖ 페니실린과 스트렙토마이신 (Gibco)을 포함하는 DMEM(Low Glucose, Welgene)을 사용하였다. 그 다음 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 3일간 배양하고, 플라스크에 70 내지 90 % 정도로 세포가 증식하면 1:3 비율로 2 내지 3 회 계대배양을 실시하여 충분한 세포를 확보하였다. 각 계대배양은 플라스크에 70 %를 넘지 않을 정도로 하였고 계대배양기간은 3 내지 5일 정도 소요되었다. 상기 계대배양 후 배양용기 표면에 부착된 세포를 제외한 모든 배지를 제거하고 D-PBS로 2 내지 3 회 세척하였다. 2 ㎖ 트립신-EDTA를 넣어 세포를 배양 용기 표면으로부터 떼어내고, 15 ㎖ 튜브에 상기 세포를 옮긴 후, 1,000 rpm에서 5 분간 원심분리한 후 모든 배지성분을 제거하였다. 새로운 플라스크에 무혈청 배지인 DMEM/F12를 첨가하고 세포 밀도를 10,000 내지 25,000 세포/cm2로 접종한 후 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 120 시간 후 배양액을 수거하였다.
상기 과정에서 수거한 배양액은 BCA 정량법을 이용하여 단백질 농도를 정량하였다. 구체적인 실험 과정은 다음과 같다.
먼저, 7 ㎖의 배양액에서 단백질을 추출하였다. 1X PBS(GIBCO, NY, USA)를 20 ㎖까지 채운 후, 20 ㎖ Vivaspin 3K 필터(GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK) 를 이용하여 4 ℃에서 4000rpm으로 30 분간 4 회 원심분리하여 시료를 농축시켰다. 농축 과정은 1 x PBS를 계속 넣어주면서 진행하였다. 1 ㎖ 정도까지 농축되면, 500 ㎕ Vivaspin 3K 필터(GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK) 를 이용하여 4 ℃ 에서 14,000 rpm으로 30 분간 4 회 원심분리하여, 300 ㎕까지 농축시켰다.
다음으로 BCA정량키트(Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL USA )를 이용하여 단백질 정량준비를 하였다. 우선 2mg/㎖의 BSA(Bovine serum albumin) 앰플을 희석하여 하기 표 1의 표준 샘플을 만들었다.
| V ial |
Volume
of
Diluent
(㎕) |
Volume
and
Source
of
BSA
(㎕) |
Final
BSA
Concentration
(㎍/㎖) |
| A | 0 | 300 of Stock | 2000 |
| B | 125 | 375 of Stock | 1500 |
| C | 325 | 325 of Stock | 1000 |
| D | 175 | 175 of vial B dilution | 750 |
| E | 325 | 325 of vial B dilution | 500 |
| F | 325 | 325 of vial B dilution | 250 |
| G | 325 | 325 of vial B dilution | 125 |
| H | 400 | 100 of vial B dilution | 25 |
| I | 400 | 0 | 0 = Blank |
그 다음, 작동 시약을 준비하였다. BCA 시약 A 와 B를 상온에서 50 : 1로 섞었다. 그 다음 96-웰 플레이트에 표준 샘플과 상기 수득한 줄기세포 배양액 농축물을 25 ㎕씩 로딩한 후, 작동 시약을 200 ㎕씩 로딩하였다. 상기 과정은 세 번 반복하여 수행하였다. 샘플이 로딩된 96-웰 플레이트를 Multiskan FC(Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL USA )에 넣은 후, 37 ℃에서 30 분간 인큐베이션하였다. 30 분 후, 상온에서 식힌 후, 562 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 세포 접종 밀도에 따라 각각 22.774 ㎍/㎖, 31.831 ㎍/㎖, 41.327 ㎍/㎖, 51.933 ㎍/㎖, 및 49.711 ㎍/㎖의 단백질 농도를 확인할 수 있었다. 20,000 세포/cm2의 세포 접종 밀도에서 단백질 농도가 최대로 확인되었으며, 25,000 세포/cm2 접종 밀도에서는 오히려 20,000 세포/cm2 접종 밀도에서보다 총 단백질 함량이 감소하는 결과를 확인하였다. 결과적으로, 무혈청 배양단계에서 줄기세포로부터 분비되는 단백질의 고도 생산을 위한 최적의 줄기세포 접종 밀도는 20,000 세포/cm2 임을 확인할 수 있었다(도 1).
실시예
2. 배양 시간에 따른 단백질 생산량 비교
배양 용기에 인체 양수 유래 줄기세포를 접종 후 배양액을 수거할 때까지의 무혈청 배양 시간에 따른 줄기세포 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량을 BCA 측정법으로 조사하였다. 배양 용기에 20,000 세포/cm2의 밀도로 세포를 접종하여 무혈청 배양 후, 72 시간부터 144 시간까지 매 12 시간 간격으로 수득한 줄기세포 배양액에 대하여 단백질 농도를 측정하였다. 세포의 종류, 배양 방법 및 단백질 농도 측정 방법은 상기 실시예 1과 동일하게 수행하고, 무혈청 배양 시간을 달리하였다.
그 결과, 무혈청 배양 시간이 72 시간째부터 84 시간, 96 시간, 108 시간 및 120 시간일 때 수득한 줄기세포 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량은 각각 26.934 ㎍/㎖, 28.647 ㎍/㎖, 37.674 ㎍/㎖, 38.400 ㎍/㎖, 44.520 ㎍/㎖로 증가함을 확인할 수 있었다. 그러나 무혈청 배양 시간이 120 시간이 넘어 132 시간 및 144 시간일 때 수득한 줄기세포 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량은 각각 41.166 ㎍/㎖ 및 39.610 ㎍/㎖로 오히려 120 시간에 수득한 줄기세포 배양액보다 감소함을 확인하였다(도 2).
상기 결과에 비추어, 무혈청 배양시간이 약 120 시간일 때 줄기세포에서 분비되는 총 단백질의 함량이 최대가 됨을 확인할 수 있었다.
실시예
3.
중간엽
줄기세포의 동결 보관 조건에 따른 세포 생존율 비교
중간엽 줄기세포를 동결 보관하는 조건, 구체적으로 동결 보존액 종류에 따른 줄기세포의 생존율을 비교하여 최적의 보관 조건을 확립하였다. 일반적으로 중간엽 줄기세포를 동결 보관하기 위해서는 10 % DMSO, 20 % FBS 및 70 % cDMEM 배지를 혼합한 세포 보관 배지(cell banking media) 1 ㎖을 동결 보관용 바이알에 줄기세포 1x106 개와 같이 넣고 -196 ℃ 액체 질소 탱크에 보관하는데, 이와 함께 중간엽 줄기세포의 보관 및 세포 생존율, 및 보관된 줄기세포를 해동하여 무혈청 배양을 통해 수득한 줄기세포 분비 단백질의 생산성을 보다 향상시킬 수 있는 다양한 동결 보존액들을 비교하였다. 동일한 계대의 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포 1x106 개와 다양한 동결 보존액 1 ㎖과 같이 동결 보관용 바이알에 넣고 -80 ℃ 초저온냉장고에 2주간 보관한 후 해동하여, 세포 생존율을 측정, 비교하였으며, 사용된 동결 보존액은 CRYO-GOLD(Revive Organtech, Cat. #10003), CRYO-ROS (Revive Organtech, Cat. #10002), STEM-CELL BANKER (Zenoaq, Cat. # BLC-3) 및 CellFreezer (Genenmed, Cat. # GEN-1000-050) 4가지를 사용하였다. 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.
먼저, 냉동 보관된 세포 튜브를 꺼내어, 37 ℃ 항온 수조에 넣고 약 2 분간 계속 흔들어 주면서 녹였다. 냉동된 세포가 약 90 % 정도 녹으면 10 ㎖ 성장 배지를 담아 둔 15 ㎖ 튜브에 옮겼다. 그 다음 1,000 rpm으로 5 분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 세포 펠렛에 10 ㎖ 성장 배지를 첨가하였다. 그 다음 96-웰 플레이트에 세포 용액 20 ㎕를 넣고 0.4 % 트리판 블루 20 ㎕를 넣은 뒤 피펫팅하여 잘 혼합하였다. 그 다음 혈구계산판(hemocytometer)에 덮개 유리를 덮고 양쪽 틈에 혼합액을 10 ㎕씩 넣었다. 그 다음 현미경의 배율을 40 배로 맞추고 세포 수를 측정하였다. 이 때, 푸른색으로 염색된 죽은 세포를 먼저 세고, 염색되지 않은 살아있는 세포를 세었다. 모눈 4 개 구역을 세고 모눈 1 칸의 살아있는 세포 수를 평균 내었다. 다음의 공식에 따라 총 살아있는 세포 수를 계산하였다.
살아있는 세포 = 모눈 1 칸의 살아있는 세포 수 x 2 x 104 x 세포 용액 부피
그 다음 다음의 공식에 따라 세포 생존율(cell viability)을 계산하였다.
세포 생존율(cell viability) = 살아있는 세포 수/(살아있는 세포 수 + 죽은 세포 수) x 100
그 결과, 기존에 알려진 냉동보관방법 (대조군; 10 % DMSO + 20 % FBS + 70 % cDMEM)으로 액체 질소탱크에 2 주간 보관하였다가 해동시킨 중간엽 줄기세포는 평균 84.41 %의 세포 생존율을 보이는 것을 확인하였고, 세포 동결 보존액인 CRYO-GOLD, CRYO-ROS, STEM-CELL BANKER 및 CellFreezer와 함께 -80 ℃에서 2 주간 보관하였다가 해동시킨 중간엽 줄기세포는 각각 평균 92.25 %, 89.15 %, 91.92 % 및 86.55 %의 세포 생존율을 보이는 것을 확인하였는바, CellFreezer를 제외한 나머지 3 가지의 세포 보존액은 기존에 알려진 동결 보관방법에 비해 우수한 세포 생존율을 나타냈다(도 3).
실시예
4. 세포 동결 보존액에 따른
중간엽
줄기세포의 분비 단백질 함량 비교
상기 실시예 3에서 사용한 다양한 세포 동결 보존액에 냉동 보관되었다가 해동한 인체 양수 유래 중간엽 줄기세포를 상기 실시예 1 및 실시예 2를 통해 확립한 무혈청 배양조건, 즉 배양 용기에 20,000 세포/cm2 밀도로 세포를 접종한 후 무혈청 배양 후 120 시간째에 수거한 줄기세포 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량을 BCA 측정법으로 조사, 비교하였다.
기존의 냉동보관방법 (대조군; 10 % DMSO + 20 % FBS + 70 % cDMEM)에 의해 2 주간 액체질소탱크에서 보관된 줄기세포를 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 120 시간의 무혈청 배양 후 수거한 줄기세포 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량은 37.754 ㎍/㎖이었으며, 세포 동결 보존액인 CRYO-GOLD, CRYO-ROS, STEM-CELL BANKER 및 CellFreezer와 같이 -80 ℃에서 2 주간 보관하였다가 해동시킨 중간엽 줄기세포를 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 120 시간의 무혈청 배양 후 수거한 줄기세포 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량은 각각 51.030 ㎍/㎖, 46.229 ㎍/㎖, 33.803 ㎍/㎖ 및 20.477 ㎍/㎖ 으로, CRYO-GOLD 용액에서 보관한 줄기세포에서 가장 많은 단백질이 분비됨을 확인하였다(도 4).
상기 결과에 비추어, 기존의 액체 질소 탱크에서 보관한 중간엽 줄기세포에 비해, 다양한 CRYO-GOLD 용액에서 보관한 줄기세포의 세포 생존율 및 단백질 생산량이 가장 우수하였으며, CYRO-GOLD를 이용하여 -80 ℃에서 줄기세포를 보관하는 방법이 줄기세포 분비 단백질의 함량을 가장 증가시킬 수 있는 최적의 보관방법임을 확인할 수 있었다.
실시예
5. 최적의 배양 조건에서
수득된
줄기세포 배양액 수득 횟수 비교
다음으로, 기존에 알려진 무혈청 배양조건 및 동결 보관조건에서 수득된 줄기세포 배양액과 본 발명을 통해 확립된 최적의 무혈청 배양조건 및 동결 보관조건에서 수득된 줄기세포 배양액 내 존재하는 총 단백질 함량을 BCA 측정법으로 조사, 비교하였다. 상기 배양액은 120 시간 간격으로 총 3 회 수득하였다. 기존 배양액은 -196 ℃ 액체질소탱크에서 10 % DMSO + 20 % FBS + 70 % cDMEM 혼합 배지와 같이 보관되었던 중간엽 줄기세포를 배양 용기에 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 72 시간, 144 시간, 216 시간째에 각각 수거한 줄기세포 배양액을 의미하며, 신규 배양액은 -80 ℃ 초저온냉동고에서 CRYO-GOLD 용액과 같이 보관되었던 중간엽 줄기세포를 배양 용기에 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 120 시간, 240 시간, 360 시간째에 각각 수거한 줄기세포 배양액을 의미한다.
그 결과, 기존의 냉동보관방법(-196 ℃, 10 % DMSO + 20 % FBS + 70 % cDMEM)에서 보관되었던 중간엽 줄기세포를 배양 용기에 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 무혈청 배양조건에서 72 시간, 144 시간, 216 시간째에 수득한 줄기세포 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량은 각각 4.187 ㎍/㎖, 4.52 ㎍/㎖ 및 2.686 ㎍/㎖으로 3 회에 걸쳐 생산된 총 단백질 함량은 평균 3.6 ㎍/㎖ 수준으로 측정되었다.
반면에 새로 확립된 냉동보관방법(-80 ℃, CRYO-GOLD)에서 보관되었던 중간엽 줄기세포를 동일한 배양 용기에 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 무혈청 배양조건에서 120 시간, 240 시간, 360 시간째에 수득한 줄기세포 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량은 44.52 ㎍/㎖, 35.69 ㎍/㎖ 및 28.74 ㎍/㎖로 평균 36.3 ㎍/㎖으로, 단백질 함량이 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 5).
상기 결과에 비추어, 본 발명을 통해 확립된 최적의 세포 보관 및 무혈청 배양조건을 통해 수득된 인체 양수 유래 중간엽 줄기세포 분비 단백질의 함량이 10 배 이상 향상되었다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
6. 최적 배양 및 보관 조건에서
수득된
줄기세포 배양액 내 함유된 성장인자의 항체 어레이(
Antibody
array
)를 통한 정량 비교
상기 실시예 1 내지 실시예 5를 통해 확립된 중간엽 줄기세포의 배양 및 보관조건에서 생산된 단백질들의 종류를 정성 분석하였다.
Fullmoon BioSystems사의 Signaling Explorer Antibody Array(Cat. No. SET100)로, 총 1357가지의 단백질을 2 회 반복하여 정성분석을 수행하였다. 구체적인 시험 방법은 다음과 같다.
먼저, 단백질 시료 50 ㎍에 표지 완충액(labelling buffer)을 이용하여 총 75 ㎕로 맞춘 후 Biotin/DMF(N, N-dimethylformamide) 용액으로 바이오틴 표지를 진행하였다. 상기 표지된 단백질은 슬라이드에 프로브로서 부착된 항체와 결합하게 된다.
그 다음, 슬라이드와 단백질이 결합하는 것을 막기 위해 블록킹을 수행하며, 커플링 시약과 뭉치는 것을 막기 위해 분유로 커플링 혼합액을 만든 후, 블록킹 과정을 거친 항체 마이크로어레이 슬라이드에 커플링을 진행하였다. 상기 과정을 통해 프로브인 항체에 표지된 단백질이 결합된다.
그 다음, 상기 결합 과정을 거친 단백질은 형광을 이용하여 검출하며 이를 스캐너로 읽어 형광 정도를 수치화하였다. 스캐닝된 단백질 어레이 데이터는 데이터 분석과정을 거쳐 각각의 단백질의 발현 정도를 수치화하였다.
GenePix 400B (Agilent) 스캐너 및 GenePix Pro 6.0 (Agilent) Image Analysis를 통해 스캐닝하였으며, 전체 스팟에 대한 표준화는 Genowiz 4.0 (Ocimum Biosolutions, India) 소프트웨어를 통해 수행하였다.
도 6은 스캐닝된 항체 어레이 데이터의 사진을 나타내며, 분석 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
상기 표에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법을 통해, 종래 중간엽 줄기세포에서 생산되지 않거나 또는 미량 생산되는 것으로만 알려져 있었던 다양한 성장인자 및 사이토카인을 포함하는 단백질들이 대량 생산되었음을 확인하였다.
실시예
7. 최적 배양 및 보관 조건에서
수득된
줄기세포 배양액 내 함유된 성장인자의 성장인자 어레이(
Growth
factor
array
)를 통한 정량 비교
상기 실시예 1 내지 실시예 5를 통해 확립된 중간엽 줄기세포 배양 및 보관조건에서 생산된 단백질을 정량 분석하였다.
구체적으로 기존에 알려진 무혈청 배양조건 및 냉동보관조건에서 수득된 인체 양수 유래 줄기세포 배양액과 본 발명을 통해 확립된 최적의 무혈청 배양조건 및 냉동보관조건에서 수득된 인체 양수 유래 줄기세포 배양액 내 존재하는 성장인자의 함량을 마이크로어레이 정량법으로 조사, 비교하였다.
기존 배양액은 -196 ℃ 액체질소탱크에서 10 % DMSO + 20 % FBS + 70 % cDMEM 혼합 배지와 함께 보관되었던 중간엽 줄기세포를 배양 용기에 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 72 시간, 144 시간 및 216 시간째에 각각 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액을 의미하며, 신규 배양액은 -80 ℃ 초저온냉동고에서 CRYO-GOLD 용액과 함께 보관되었던 중간엽 줄기세포를 배양 용기에 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 120 시간, 240 시간 및 360 시간째에 각각 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액을 의미한다.
또한 상기 마이크로어레이는 Raybiotech Quantibody Human Growth Factor Array 1 (Cat. # QAH-GF-1)을 이용하였다. 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.
먼저, Quantibody Human Cytokine Antibody Array Q1000(RayBiotech, Inc.)로부터 슬라이드 글라스를 꺼내어 실온에서 건조시켰다. 그 다음 7 종류의 농도로 사이토카인 표준용액 희석액을 제조하였다. 그 다음 슬라이드 각 웰에 사이토카인 표준용액 또는 시액을 첨가하고 실온에서 1 내지 2 시간 동안 둔 뒤, 첨가된 용액을 제거하고 수세용액으로 5 회 수세하였다. 그 다음, 각 웰에 항체 복합 용액을 80 ㎕씩 첨가하고 1 내지 2 시간 동안 배양하였다. 배양 후 수세용액으로 2 회 수세한 다음 수세용액을 완전히 제거하였다. 그 다음, 시아닌 형광 염료가 결합된 스트렙타아비딘 80 ㎕를 각 웰에 첨가하고 알루미늄 호일을 덮어 빛을 차단하거나 암소 하에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후 첨가된 용액을 제거하고 수세용액으로 5 회 수세한 뒤, 각 웰로부터 수세용액을 완전히 제거하였다.
마지막으로, 마이크로어레이 레이저 스캐너를 이용하여 상기 표본을 분석하였으며, 표준용액 검출양과 비교하여 시료의 사이토카인 함유량을 계산하였다.
그 결과, 총 56개의 비교대상 성장인자 중에서 기존의 냉동보관방법(-196 ℃, 10 % DMSO + 20 % FBS + 70 % cDMEM)에서 보관되었던 인체 양수 유래 중간엽 줄기세포를 배양 용기에 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 무혈청 배양조건에서 72 시간, 144 시간, 216 시간째에 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액 내에서는 검출이 되지 않은 성장인자 중 23개의 성장인자들이 새로 확립된 냉동보관방법(-80 ℃, CRYO-GOLD)에서 보관되었던 동일한 배양 용기에 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 무혈청 배양조건에서 120 시간, 240 시간, 360 시간째에 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액 내에 존재하고 있음을 확인하였다. 또한 총 56개의 비교대상 성장인자 중 나머지 33개 성장인자들에 대해서는 최소 51 % 내지 최대 276400 %까지 성장인자의 함량이 증가함을 확인하였다(표 3).
| 순번 | 성장인자 | 기존 ( pg /㎖) | 신규 ( pg /㎖) | 증가율 (%) |
| 1 | AR | 0.0 | 104.7 | 새롭게 발현 |
| 2 | BDNF | 2.0 | 7.5 | 275 |
| 3 | bFGF | 0.0 | 84.35 | 새롭게 발현 |
| 4 | BMP-4 | 41.0 | 237.85 | 480 |
| 5 | BMP-5 | 0.0 | 983.2 | 새롭게 발현 |
| 6 | BMP-7 | 0.0 | 251.25 | 새롭게 발현 |
| 7 | b-NGF | 2.0 | 14.5 | 625 |
| 8 | EGF R | 112.0 | 1243.8 | 1011 |
| 9 | FGF-4 | 131.0 | 213.2 | 63 |
| 10 | FGF-7 | 5.0 | 407.45 | 8049 |
| 11 | GDF-15 | 1.0 | 336 | 33500 |
| 12 | GDNF | 2.0 | 50.05 | 2403 |
| 13 | GH | 0.0 | 48.9 | 새롭게 발현 |
| 14 | HGF | 7.0 | 1757.95 | 25014 |
| 15 | IGFBP-1 | 0.0 | 132.4 | 새롭게 발현 |
| 16 | IGFBP-2 | 0.0 | 54 | 새롭게 발현 |
| 17 | IGFBP-3 | 0.0 | 43691.75 | 새롭게 발현 |
| 18 | IGFBP-4 | 0.0 | 4612.25 | 새롭게 발현 |
| 19 | IGFBP-6 | 2090.0 | 40427.8 | 1834 |
| 20 | IGF-I | 85.0 | 128.2 | 51 |
| 21 | Insulin | 46.0 | 253.35 | 451 |
| 22 | MCSF R | 26.0 | 117.65 | 353 |
| 23 | NGF R | 18.0 | 46.6 | 159 |
| 24 | NT-3 | 58.0 | 104.45 | 80 |
| 25 | NT-4 | 3.0 | 16.8 | 460 |
| 26 | OPG | 6.0 | 2946.7 | 49012 |
| 27 | PDGF-AA | 32.0 | 373.9 | 1068 |
| 28 | PIGF | 6.0 | 223.25 | 3621 |
| 29 | SCF | 0.0 | 58.55 | 새롭게 발현 |
| 30 | SCF R | 156.0 | 433.75 | 178 |
| 31 | TGFa | 0.0 | 23 | 새롭게 발현 |
| 32 | TGFb1 | 0.0 | 2350.1 | 새롭게 발현 |
| 33 | VEGF | 116.0 | 4483.7 | 3765 |
| 34 | VEGF R3 | 0.0 | 37.6 | 새롭게 발현 |
| 35 | VEGF-D | 0.0 | 33.9 | 새롭게 발현 |
| 36 | G-CSF | 15 | 587 | 3913 |
| 37 | ICAM-1 | 0 | 17298 | 새롭게 발현 |
| 38 | IL-1a | 0 | 25 | 새롭게 발현 |
| 39 | IL-2 | 5 | 34 | 680 |
| 40 | IL-5 | 2 | 16 | 새롭게 발현 |
| 41 | IL-6 | 2 | 5528 | 276400 |
| 42 | IL-8 | 4 | 473 | 11825 |
| 43 | IL-11 | 323 | 14643 | 4533 |
| 44 | MCP-1 | 233 | 4256 | 1827 |
| 45 | MCSF | 589 | 1816 | 308 |
| 46 | MIG | 35 | 114 | 326 |
| 47 | MIP-1a | 0 | 7436 | 새롭게 발현 |
| 48 | MIP-1b | 0 | 193 | 새롭게 발현 |
| 49 | MIP-1d | 0 | 131 | 새롭게 발현 |
| 50 | RANTES | 0 | 141 | 새롭게 발현 |
| 51 | TIMP-1 | 87405 | 119191 | 136 |
| 52 | TIMP-2 | 102452 | 288596 | 282 |
| 53 | TNFa | 12 | 43 | 358 |
| 54 | TNFb | 26 | 95 | 365 |
| 55 | TNF R1 | 0 | 5334 | 새롭게 발현 |
| 56 | TNF RII | 0 | 658 | 새롭게 발현 |
다음으로, 기존에 알려진 무혈청 배양조건 및 냉동보관조건에서 수득된 지방 유래 중간엽 줄기세포 배양액과 본 발명을 통해 확립된 최적의 무혈청 배양조건 및 냉동보관조건에서 수득된 지방 유래 중간엽 줄기세포 배양액 내 존재하는 성장인자의 함량을 마이크로어레이 정량법으로 조사, 비교하였다. 측정시료는 기존 배양액은 -196 ℃ 액체질소탱크에서 10 % DMSO + 20 % FBS + 70 % cDMEM 혼합 배지와 함께 보관되었던 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양 용기에 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 72 시간, 144 시간, 및 216 시간째에 각각 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액을 의미하며, 신규 배양액은 -80 ℃ 초저온냉동고에서 CRYO-GOLD 용액과 함께 보관되었던 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양 용기에 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 120 시간, 240 시간 및 360 시간째에 각각 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액을 의미한다. 또한 마이크로어레이는 Raybiotech Quantibody Human Growth Factor Array 1 (Cat. # QAH-GF-1)을 이용하였다. 실험 방법은 상기 인체 양수 유래 중간엽 줄기세포에서 수행한 방법과 동일하다.
그 결과, 총 18개의 비교대상 성장인자 중에서 기존의 냉동보관방법(-196 ℃, 10 % DMSO + 20 % FBS + 70 % cDMEM)에서 보관되었던 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양 용기에 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 무혈청 배양조건에서 72 시간, 144 시간, 216 시간째에 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 내에서는 검출이 되지 않은 성장인자 중 6개의 성장인자들이 새로 확립된 냉동보관방법(-80 ℃, CRYO-GOLD)에서 보관되었던 지방 유래 중간엽 줄기세포를 동일한 배양 용기에 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 무혈청 배양조건에서 120 시간, 240 시간, 및 360 시간째에 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액 내에 존재하고 있음을 확인하였다. 또한 총 18개의 비교대상 성장인자 중 나머지 12개 성장인자들에 대해서는 최소 133 % 내지 최대 8,833 %까지 성장인자의 함량이 증가함을 확인하였다(표 4).
| 순번 | 성장인자 | 기존 | 신규 | 증가율 (%) |
| 1 | bFGF | 6.0 | 14.0 | 133.0 |
| 2 | EGF R | 187.0 | 606.0 | 224.0 |
| 3 | FGF-4 | 44.0 | 340.0 | 673.0 |
| 4 | FGF-7 | 0.0 | 159.0 | 새롭게 발현 |
| 5 | GDF-15 | 1.0 | 23.0 | 2,200.0 |
| 6 | HGF | 3.0 | 268.0 | 8,833.0 |
| 7 | IGFBP-1 | 0.0 | 7.0 | 새롭게 발현 |
| 8 | IGFBP-3 | 0.0 | 55224.0 | 새롭게 발현 |
| 9 | IGFBP-4 | 252.0 | 2537.0 | 907.0 |
| 10 | IGFBP-6 | 994.0 | 52997.0 | 5,232.0 |
| 11 | MCSF R | 0.0 | 54.0 | 새롭게 발현 |
| 12 | NT-3 | 11.0 | 55.0 | 400.0 |
| 13 | NT-4 | 0.0 | 18.0 | 새롭게 발현 |
| 14 | OPG | 134.0 | 1855.0 | 1,284.0 |
| 15 | PDGF-AA | 7.0 | 253.0 | 3,514.0 |
| 16 | PIGF | 2.0 | 55.0 | 2,650.0 |
| 17 | TGFb1 | 0.0 | 553.0 | 새롭게 발현 |
| 18 | VEGF | 591.0 | 4546.0 | 669.0 |
결론적으로 본 발명에서 확립한 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법은 기존의 방법에 비하여 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 단백질의 함량을 증가시키거나 신규한 단백질을 분비시키는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예
8. 최적의
무혈청
배양 및 보관 조건에서
수득된
줄기세포 배양액 내에 함유된 콜라겐 함량 절대정량
콜라겐은 피부 재생 및 주름 개선에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있으므로, 기존에 알려진 무혈청 배양 및 보관 조건에서 수득된 중간엽 줄기세포 배양액과 본 발명을 통해 확립된 최적의 무혈청 배양 및 보관조건에서 수득된 중간엽 줄기세포 배양액 내에 함유된 콜라겐 함량을 절대정량 방법으로 조사, 비교하였다.
기존 배양액은 -196 ℃ 액체질소탱크에서 10 % DMSO + 20 % FBS + 70 % cDMEM 혼합 배지와 함께 보관되었던 중간엽 줄기세포를 배양 용기에 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 72 시간, 144 시간 및 216 시간째에 각각 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액을 의미하며, 신규 배양액은 -80 ℃ 초저온냉동고에서 CRYO-GOLD 용액과 함께 보관되었던 중간엽 줄기세포를 배양 용기에 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 120 시간, 240 시간, 및 360 시간째에 각각 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액을 의미한다.
구체적인 실험 방법은 다음과 같다.
BCA 정량법을 이용하여 검액의 단백질을 정량하고, 이 중 100 ㎍을 취하여 동결건조를 실시하였다. 건조한 시료를 6 M 우레아 25 ㎍에 첨가하여 녹인 후, 90 ℃에서 20 분 동안 반응을 진행하였다. 10 mM 에틸렌디아민사아세트산, 4 % 도데실황산나트륨, 그리고 6 M 우레아 완충용액에 용해된 0.2 M 중탄산 암모늄 용액 25 ㎕를 넣고 37 ℃에서 30 분 동안 반응 후 아실아마이드/비스아실아마이드(40 % v/v 29:1)를 이용하여 시료에 젤을 굳혔다. 시료가 포함된 젤을 1 ㎖ 증류수를 첨가하고 1일 동안 반복하여 교체하면서 잔여 세척을 실시하였다. 50 % 아세토니트릴, 50 mM 중탄산 암모늄을 순서대로 1 ㎖을 첨가하고 각각 1일 동안 반복하여 교체하면서 잔여 세척을 실시하였다.
그 다음 건조한 시료를 50 mM 인산나트륨, pH 7.3, 100 ㎕에 녹이고 1 M 디티오트레이톨 5 ㎕를 첨가하고 잘 혼합한 뒤, 55 ℃에서 30 분 동안 반응을 진행하였다.
그 다음 이황화 결합 환원 반응을 마친 시료에 1 M 요오드아세트아미드 5 ㎕를 첨가한 뒤, 상온에서 차광한 상태로 30 분 동안 카르바미도메틸화 반응을 진행하고 완전히 건조시켰다.
그 다음 건조한 시료를 100 mM 중탄산 암모늄 용액 100 ㎕에 잘 혼합한 뒤, 트립신(1 mg/㎖) 2 ㎕를 첨가한 후 약 18 시간 동안 37 ℃에서 반응을 진행하였다. 그 다음 50 mM 중탄산암모늄 용액 200 ㎕, 0.1 %(v/v) 트리플루오로아세트산 200 ㎕, 아세토니트릴에 용해된 0.1 % 트리플루오로아세트산 100 ㎕, 및 아세토니트릴 용액 100 ㎕로 각 1 시간씩 추출하였다. 추출한 시료를 냉동 후 완전히 건조 시킨 뒤 80 ℃에서 30 분 동안 반응하여 중탄산암모늄의 분해를 진행하였다.
그 다음 상기 시료를 취해 Oasis SPE(워터스 사)의 컬럼에 넣고 진공을 이용하여 탈염을 실시하고 완전히 건조시켰다.
그 다음 표준단백질 펩타이드를 0.1 % 포름산 1 ㎖(400 nM)에 용해하여 표준단백질 펩타이드 용액을 준비하였다. 그 다음 트립신 가수분해를 수행한 시료에 2 ㎕의 상기 표준단백질 펩타이드 단백질 용액을 첨가 후(최종농도 10 nM), 0.1 % 포름산 98 ㎕를 추가로 첨가하여 최종 100 ㎕가 되도록 준비하고 질량 분석을 실시하였다. 이때의 조건은 하기와 같다.
<NANO UPLC 운용조건>
- 컬럼:
ㆍnanoAcquity BEH300 C18, 1.7 ㎛ x 150 mm
ㆍ온도: 40 ℃
- 이동상:
ㆍ이동상 A: 0.1 % v/v 포름산
ㆍ이동상 B: 0.1 % v/v 포름산, 아세토니트릴
| 시간 (분) | A(% v/v) | B(% v/v) | |
| 1 | 초기 | 97.0 | 3.0 |
| 2 | 5 | 97.0 | 3.0 |
| 3 | 300 | 65.0 | 35.0 |
| 4 | 320 | 20.0 | 80.0 |
| 5 | 340 | 20.0 | 80.0 |
| 6 | 355 | 97.0 | 3.0 |
| 7 | 360 | 97.0 | 3.0 |
ㆍ유속: 300 nL/min
ㆍ주입량: 3 ㎕
<질량 분석 운용조건>
- 장비: Synapt G2-Si HDMS(Waters, UK)
- Source: NanoLockSpray Exact Mass ionization source Positive
- 질량 분석 설정조건
ㆍ모세관 (kV): 3.0
ㆍ전압 (V): 30
ㆍ온도 (℃): 120
ㆍ스캔 시간(sec): 0.5
상기 질량 분석을 통해 얻어진 결과는 ProteinLynx Global Server(PLGS) Ver. 3.0을 이용하여 단백질 동정 및 절대정량을 실시하였다. 단백질 동정은 International Protein Index의 Human Database(Ver. 3.87)를 이용하여 실시하였으며, 절대정량은 표준 BSA(SwissProt P2769)의 질량값 정보를 바탕으로 수행하였다.
각각 총 30 ㎍의 단백질 시료에 대해서 정량한 결과, 본 발명의 최적의 무혈청 배양 및 보관 조건에서 수득된 줄기세포 배양액은 기존 배양액 대비 약 230 % 콜라겐 함량이 상승되었음을 확인하였다(표 6).
| 기존 | 신규 | |
| 총 검출된 단백질 (㎍) | 21.94 | 25.12 |
| 총 검출된 콜라겐 (㎍) | 1.18 | 3.12 |
| 콜라겐 함량 (%) | 5.42 | 12.4 |
실시예
9. 최적의
무혈청
배양 및 보관 조건에서
수득된
줄기세포 배양액의 콜라겐 합성 효능 비교
인간 섬유아세포 (CCD-98sk, human fibroblast cell)를 사용하여 본 발명을 통해 확립된 최적의 무혈청 배양 및 보관 조건에서 수득된 중간엽 줄기세포 배양액의 세포 내 콜라겐 생성시험을 수행하였다. 세포 내 콜라겐 생성시험을 위한 검액농도를 설정하기 위해 검액농도 설정 예비시험을 수행한 결과, 검액 농도 0 내지 0.5 %에서 세포독성이 유발되지 않는 것으로 확인되어 이 가운데 최대 농도인 0.5% (단백질 정량값 기준)를 세포 내 콜라겐 생성시험을 위한 검액 농도로 설정하여 수행하였으며, 양성대조물질은 주름개선 기능성 고시원료인 아데노신(Adenosine)의 고시함량인 0.04 %를 사용하였다.
세포 내 콜라겐 생성시험을 수행한 결과 양성대조군 (0.04 % Adenosine)과 비교한 결과, Adenosine에 비해 13배 이상 콜라겐 생성을 촉진시키는 결과를 확인하였다(도 7).
따라서 본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액은 콜라겐을 다량 함유하고 있을 뿐만 아니라, 섬유아세포의 콜라겐 생성을 유도하는 효능이 있으므로, 피부 재생 및 주름 개선에 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예
10. 최적의
무혈청
배양 및 보관 조건에서
수득된
줄기세포 배양액의 상처 치유(
wound
healing
) 효능 비교
기존에 알려진 무혈청 배양 및 보관 조건에서 수득된 중간엽 줄기세포 배양액과 본 발명을 통해 확립된 최적의 무혈청 배양 및 보관 조건에서 수득된 중간엽 줄기세포 배양액의 상처 치유 효능을 조사, 비교하였다.
기존 배양액은 -196 ℃ 액체질소탱크에서 10 % DMSO + 20 % FBS + 70 % cDMEM 혼합 배지와 함께 보관되었던 중간엽 줄기세포를 배양 용기에 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 72 시간, 144 시간, 및 216 시간째에 수거하여 혼합한 줄기세포 배양액을 의미하며, 신규 배양액은 -80 ℃ 초저온냉동고에서 CRYO-GOLD 용액과 함께 보관되었던 중간엽 줄기세포를 배양 용기에 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 120 시간, 240 시간, 및 360 시간째에 각각 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액을 의미한다.
인간 섬유아세포(Human Fibroblast)를 배양 용기에 7.5 x 105 개씩 접종한 후, 마이크로팁을 이용하여 상처를 준 후 사진 촬영을 통해 상처의 간격을 측정한 직후 기존 배양액과 신규 배양액을 각각 3 ㎖ 씩 처리하여 12 시간 이후 다시 사진 촬영을 하여 상처 간격을 쟀다.
그 결과, 본 발명의 최적의 무혈청 배양 및 보관 조건에서 수득된 줄기세포 배양액은 기존 배양액 대비 약 79 % 상승된 상처 치유 효과를 보여주었다(도 8).
실시예
11. 지방 유래
중간엽
줄기세포 배양액에서의 최적의
무혈청
배양 조건 검증
본 발명의 최적의 무혈청 배양조건이 다른 조직 유래의 중간엽 줄기세포에도 적용 가능한지 확인하기 위해, 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포(STEMPRO Human Adipose-Derived Stem Cells, INVITROGEN, Cat. # R7788-110)를 실시예 5에서와 동일한 방식으로 두 가지 무혈청 배양조건에서 각각 배양하여 수득된 줄기세포 배양액 내 존재하는 총 단백질 함량을 BCA 측정법으로 조사, 비교하였다.
기존 배양액은 배양 용기에 지방 유래 중간엽 줄기세포를 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 72 시간, 144 시간, 및 216 시간째에 각각 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액을 의미하며, 신규 배양액은 배양 용기에 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 120 시간, 240 시간, 및 360 시간째에 각각 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액을 의미한다.
그 결과, 배양 용기에 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포를 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 무혈청 배양조건에서 72 시간, 144 시간, 및 216 시간째에 각각 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량은 12.46 ㎍/㎖ 이었으며, 동일한 배양 용기에 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포를 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 무혈청 배양조건에서 120 시간, 240 시간 및 360 시간째에 각각 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량은 18.27 ㎍/㎖으로 50 % 이상 향상된 단백질 함량을 확인할 수 있었다(도 9).
상기 결과에 비추어, 본 발명을 통해 확립된 인체 중간엽 줄기세포 분비 단백질의 함량을 극대화할 수 있는 최적의 무혈청 배양조건은 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포 뿐만 아니라 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포에 대해서도 적용이 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예
12. 골수 유래
중간엽
줄기세포 배양액에서의 최적의
무혈청
배양 조건 검증
본 발명의 최적의 무혈청 배양조건이 다른 조직 유래의 중간엽 줄기세포에도 적용 가능한지 확인하기 위해, 인체 골수 유래 중간엽 줄기세포(Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell, SCIENCELL, Cat.# 7500)을 실시예 5에서와 동일한 방식으로 두 가지 무혈청 배양조건에서 각각 배양하여 수득된 줄기세포 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량을 BCA 측정법으로 조사, 비교하였다.
기존 배양액은 배양 용기에 골수 유래 중간엽 줄기세포를 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 72 시간, 144 시간, 및 216 시간째에 수거한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액을 의미하며, 신규 배양액은 배양 용기에 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 120 시간, 240 시간, 및 360 시간째에 각각 수거한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액을 의미한다.
그 결과, 배양 용기에 인체 골수 유래 중간엽 줄기세포를 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 무혈청 배양조건에서 72 시간, 144 시간, 및 216 시간째에 각각 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량은 28.16 ㎍/㎖이었으며, 동일한 배양 용기에 인체 골수 유래 중간엽 줄기세포를 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 무혈청 배양조건에서 120 시간, 240 시간, 및 360 시간째에 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량은 38.78 ㎍/㎖로 37 % 이상 향상된 단백질 함량을 확인할 수 있었다(도 10).
상기 결과에 비추어, 본 발명을 통해 확립된 인체 중간엽 줄기세포 분비 단백질의 함량을 극대화할 수 있는 최적의 무혈청 배양조건은 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포 뿐만 아니라 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포에 대해서도 적용이 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예
13. 골수 유래
중간엽
줄기세포 배양액에서의 최적의
무혈청
배양 조건 검증
본 발명의 최적의 무혈청 배양조건이 다른 조직 유래의 중간엽 줄기세포에도 적용 가능한지 확인하기 위해, 인체 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(Human Umblical Mesenchymal Stem Cell, SCIENCELL, Cat.# 7530)를 실시예 5에서와 동일한 방식으로 두 가지 무혈청 배양조건에서 각각 배양하여 수득된 줄기세포 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량을 BCA 측정법으로 조사, 비교하였다.
기존 배양액은 배양 용기에 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 72 시간, 144 시간, 및 216 시간째에 각각 수거한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액을 의미하며, 신규 배양액은 배양 용기에 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 후 무혈청 배양하여 120 시간, 240 시간, 및 360 시간째에 각각 수거한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액을 의미한다.
그 결과, 배양 용기에 인체 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 10,000 세포/cm2 밀도로 접종한 무혈청 배양조건에서 72 시간, 144 시간, 및 216 시간째에 각각 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량은 20.056 ㎍/㎖이었으며, 동일한 배양 용기에 인체 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 20,000 세포/cm2 밀도로 접종한 무혈청 배양조건에서 120 시간, 240 시간, 및 360 시간째에 수득한 줄기세포 배양액을 혼합한 배양액 내에 존재하는 총 단백질 함량은 38.991 ㎍/㎖로 94 % 이상 향상된 단백질 함량을 확인할 수 있었다(도 11).
상기 결과에 비추어, 본 발명을 통해 확립된 인체 중간엽 줄기세포 분비 단백질의 함량을 극대화할 수 있는 최적의 무혈청 배양조건은 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포 뿐만 아니라 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 대해서도 적용이 가능함을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명에서 확립된 최적의 무혈청 배양조건은 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 대량 생산하는 방법으로서, 양수 유래 중간엽 줄기세포 뿐만 아니라, 지방 유래, 골수 유래, 및 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 대해서도 적용이 가능하므로, 중간엽 줄기세포라면 유래에 관계 없이 적용될 수 있으며, 이를 통해 수득한 중간엽 줄기세포 배양액은 다양한 성장인자와 사이토카인을 다량 함유하므로 피부 재생 및 주름 개선용 조성물로 이용할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (12)
- (a) 중간엽 줄기세포를 18,000 내지 22,000 세포/cm2의 밀도로 접종하는 단계;
(b) 상기 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및
(c) 배양 114 내지 126 시간 경과 후 줄기세포 배양액을 수득하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법으로,
상기 중간엽 줄기세포는 -90 내지 -70 ℃ 초저온 냉동고에서 CRYO-GOLD 용액으로 보관한 것이고,
상기 단백질은 AR, bFGF, BMP-5, BMP-7, GH, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, SCF, TGFα, TGFβ1, VEGF R3, VEGF-D, ICAM-1, IL-1a, IL-5, MIP-1a, MIP-b, MIP-d, RANTES, TNF R1, 및 TNF RII를 포함하는 것인, 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 양수, 지방, 골수 또는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인 것인, 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 양수 유래 중간엽 줄기세포인 것인, 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질은 BDNF, BMP-4, b-NGF, EGF R, FGF-4, FGF-7, GDF-15, GDNF, HGF, IGFBP-6, IGF-I, Insulin, MCSF R, NGF R, NT-3, NT-4, OPG, PDGF-AA, PIGF, SCF R, VEGF, G-CSF, IL-2, IL-6, IL-8, IL-11, MCP-1, MCSF, MIG, TIMP-1, TIMP-2, TNFα, 및 TNFβ를 추가로 포함하는 것인, 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (c)는 114 내지 126 시간 간격으로 1 회 내지 3 회 줄기세포 배양액을 수득하는 것인, 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생산방법은 분비 단백질의 총 농도가 BCA 측정법으로 30㎍/㎖ 내지 70㎍/㎖인 것인, 생산방법.
- (a) 중간엽 줄기세포를 20,000 세포/cm2의 밀도로 접종하는 단계;
(b) 상기 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및
(c) 배양 120 시간 경과 후 줄기세포 배양액을 수득하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량 생산방법으로,
상기 중간엽 줄기세포는 -80 ℃ 초저온 냉동고에서 CRYO-GOLD 용액으로 보관한 것이고,
상기 단백질은 AR, bFGF, BMP-5, BMP-7, GH, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, SCF, TGFα, TGFβ1, VEGF R3, VEGF-D, ICAM-1, IL-1a, IL-5, MIP-1a, MIP-b, MIP-d, RANTES, TNF R1, 및 TNF RII를 포함하는 것인, 생산방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 생산방법으로 생산된 단백질을 포함하는, 중간엽 줄기세포 배양액.
- 제8항에 있어서, 상기 배양액은 콜라겐을 10 내지 15 중량%로 함유하는 것인, 중간엽 줄기세포 배양액.
- 제8항에 있어서, 상기 배양액은 섬유아세포의 콜라겐 생성을 촉진시키는 것인, 중간엽 줄기세포 배양액.
- 제8항의 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
- 제8항의 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 재생용 약학 조성물.
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