CN114480267A - TGF-β2与Val混合刺激因子促进间充质干细胞表达更多细胞外基质 - Google Patents

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Abstract

本发明属于间充质干细胞领域，具体涉及TGF‑β2与Val混合刺激因子促进间充质干细胞表达更多细胞外基质。通过TGF‑β2与Val刺激因子作用于间充质干细胞，促进间充质干细胞的分泌且分泌更多的细胞外基质成份；解决ECM来源不足问题，方便无排斥性能的生物支架材料的制备，同时互相放大MSCs与ECM双方的功能、促进MSCs与ECM的应用。

Description

TGF-β2与Val混合刺激因子促进间充质干细胞表达更多细胞 外基质
技术领域
本发明属于间充质干细胞领域，具体涉及TGF-β2与Val混合刺激因子促进间充质干细胞表达更多细胞外基质。
背景技术
细胞外基质（extracellular matrix, ECM）是由细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间复杂结构，由间质基质和基底膜构成。间质基质主要由细胞分泌产生，是一种以Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和多种蛋白聚糖为主要成分的松散的胶原纤维网络结构。基底膜是由IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白以及硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等构成的致密薄片状蛋白网络结构，它能够将细胞与周围的基质分开，作为物质运输的屏障发挥作用。
细胞外基质的组成决定了细胞外基质的功能，完整的细胞外基质结构为组织细胞正常生理活动提供物理支撑，为细胞再生提供一个支架的作用，现细胞外基质生物支架已被应用于组织再生和功能重建，对于受损组织、器官的修复与再生具有重大意义。细胞外基质的分子组成在时间和空间上特应性地和细胞、其它基质分子及可溶性的因子结合，其可以调节细胞的黏附，增殖和转移，分化以及细胞之间的相互作用，调节细胞的生物学功能，为细胞提供合适的微环境。近几年研究发现，细胞外基质在机体稳态和病理状态下均参与免疫反应。细胞外基质与人体的衰老有一定关系，随着年龄的增加，皮肤再生能力的下降和重塑能力降低，皮肤真皮层中的胶原蛋白和弹性蛋白的总量也会减少，导致组织成分发生质的退化，这些过程导致面部皮肤松弛、褶皱和表面变化，包括皮肤粗糙和干燥病。不同的细胞外基质成分具有不同的功能。如，胶原蛋白除了具有美容（防皱、保湿、美白、减肥、丰胸）功能外，研究显示其还具有预防骨质疏松、改善关节健康、改善血液循环、健胃、提高人体免疫力等功效。纤连蛋白（FN）能促进伤口的修复和愈合（如：烧伤、创伤等），具有无感染、无疤痕、无任何副作用优点。Herrick等人的研究指出：在糖尿病和下肢静脉溃疡中，FN含量降低。中国人民解放军第三零四医院的实验结果也证实了这一观点，即糖尿病并发的溃疡创面FN含量减少是造成慢性难愈合创面长期不愈的原因之一。
细胞外基质构成的生物支架材料目前已被广泛应用于临床治疗和体内外基础研究中，该种材料脱细胞技术的质量至关重要，不彻底的脱细胞效果会导致生物支架材料植入体内后，诱发一系列免疫排斥反应，最终导致治疗的失败。另外，细胞外基质还存在来源不足的问题。
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类能够自我更新和具有多向分化潜能、免疫调节功能的多能干细胞，能治疗心肌梗死、大脑和脊髓损伤、脑卒中、糖尿病、软骨和骨骼损伤、克罗恩病和移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮等多种疾病。人脐带来源的间充质干细胞有很多特别的优势，比如在获取过程中免去了病人的痛苦，更快的自我更新速度，低免疫原性，更少的伦理问题。化学方法检测hUCMSCs来源ECM富含层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原等化学成分。hUCMSCs来源ECM更加具有活力，更加促进细胞的分泌且分泌更多的ECM成分。促进hUCMSCs分泌更多的ECM可以解决ECM来源不足、免疫排斥问题，互相放大对方的功能、促进MSCs与ECM的应用。
发明内容
针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供TGF-β2与Val混合刺激因子促进间充质干细胞表达更多细胞外基质；通过TGF-β2与Val刺激因子作用于间充质干细胞，促进间充质干细胞的分泌且分泌更多的细胞外基质成份；解决ECM来源不足问题，方便无排斥性能的生物支架材料的制备，同时互相放大MSCs与ECM双方的功能、促进MSCs与ECM的应用。
本发明的目的是保护：TGF-β2与Val混合刺激因子促进间充质干细胞表达更多细胞外基质。
上述过程，包括以下步骤：
（1）在脐带间充质干细胞培养基中添加Val刺激因子，培养4-8 h；
（2）在步骤（1）的培养基中添加TGF-β2刺激因子，继续培养20-24 h。
优选地，步骤（1）的培养基中Val刺激因子的终浓度为1ng/mL~20ng/mL。
优选地，步骤（2）的培养基中TGF -β2终浓度为1ng/mL~10ng/mL。
优选地，TGF-β2刺激因子与Val刺激因子在培养基中终浓度的比值为：5:1-4。
本发明的有益效果
根据前期研究发现，Val、TGF-β2刺激因子作用后的间充质干细胞，上清纤维连接蛋白（FN）、I型胶原蛋白（CollagenⅠ）的获得情况不同，Val刺激因子更有利于I型胶原蛋白（CollagenⅠ）的获得；TGF-β2刺激因子更有利于上清纤维连接蛋白（FN）的获得。
由于脐带来源的脐带间充质干细胞具有获取方便、更新速度快、免疫原性低等优势，使得hUCMSCs来源ECM更加具有活力，更加促进细胞的分泌且分泌更多的ECM成分，本发明促进间充质干细胞表达、分泌更多的ECM，可以解决ECM来源不足问题，方便无排斥性能的生物支架材料的制备，同时互相放大MSCs与ECM双方的功能、促进MSCs与ECM的应用。
附图说明
图1：不同培养条件下MSCs的FN、CollagenⅠ的RNA表达水平情况（对照组为1，其他组为增长倍数）；图中aa2为添加终浓度为2ng/mL的Val刺激因子的情况；aa4为添加终浓度为4ng/mL的Val刺激因子的情况；aa8为添加终浓度为8ng/mL的Val刺激因子的情况；aa16为添加终浓度为16ng/mL的Val刺激因子的情况； TGF -β2为添加终浓度为4ng/mL的TGF -β2刺激因子的情况；
图2：不同培养条件下MSCs的FN的蛋白质表达水平情况；
图3：不同培养条件下MSCs的CollagenⅠ的蛋白质表达水平情况。
具体实施方式：
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请所用的脐带间充质干细胞培养基为：深圳市达科为生物工程有限公司生产的SurperCulture MSC专用基础培养基（GMP Grade）。
实施例1
不同浓度Val混合刺激因子促进促进间充质干细胞表达更多细胞外基质，包括以下步骤：在脐带间充质干细胞培养基中分别添加终浓度为2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL的Val刺激因子，分别作用于间充质干细胞，培养24h。
TGF-β2刺激因子促进促进间充质干细胞表达更多细胞外基质，在脐带间充质干细胞培养基中添加终浓度为5ng/mL的TGF-β2刺激因子，作用于间充质干细胞，培养24h。
消化、收集实施例1中的脐带间充质干细胞，提取RNA、采用RT-PCR方式检测细胞外基质蛋白基因RNA表达水平，提取蛋白质、采用WB方式检测细胞外基质蛋白水平，以培养基中添加TGF-β1抑制剂同样作用于间充质干细胞作为对照组，结果如下图1-3。由结果可见，本发明制备的脐带间充质干细胞的上清纤维连接蛋白（FN）、I型胶原蛋白（CollagenⅠ）的RNA水平及蛋白水平均明显提高，表达了更多的细胞外基质。
实施例2
TGF-β2与Val混合刺激因子促进促进间充质干细胞表达更多细胞外基质，包括以下步骤：
（1）在脐带间充质干细胞培养基中添加终浓度为1 ng/mL的Val刺激因子，培养4-8h；
（2）在步骤（1）的培养基中添加终浓度为10 ng/mL的TGF-β2刺激因子，继续培养20-24 h。
实施例3
TGF-β2与Val混合刺激因子促进促进间充质干细胞表达更多细胞外基质，包括以下步骤：
（1）在脐带间充质干细胞培养基中添加终浓度为20ng/mL的Val刺激因子，培养4-8h；
（2）在步骤（1）的培养基中添加终浓度为1ng/mL的TGF-β2刺激因子，继续培养20-24 h。
实施例4
TGF-β2与Val混合刺激因子促进促进间充质干细胞表达更多细胞外基质，包括以下步骤：
（1）在脐带间充质干细胞培养基中添加终浓度为2ng/mL的Val刺激因子，培养4-8h；
（2）在步骤（1）的培养基中添加终浓度为5ng/mL的TGF-β2刺激因子，继续培养20-24 h。
对比例1
TGF-β2与Val混合刺激因子促进促进间充质干细胞表达更多细胞外基质，包括以下步骤：在脐带间充质干细胞培养基中添加终浓度为2ng/mL或4ng/mL的Val刺激因子和终浓度为5ng/mL的TGF-β2刺激因子，培养4-8 h。
实施效果例
消化、收集其他实施例中的脐带间充质干细胞，提取RNA、采用RT-PCR方式检测细胞外基质蛋白基因RNA表达水平，提取蛋白质、采用WB方式检测细胞外基质蛋白水平，以相同培养基，在不添加刺激因子的前提下，得到的上清纤维连接蛋白（FN）、I型胶原蛋白（CollagenⅠ）得含量为1，其他组的增长倍数结果如下表1。
Figure RE-990215DEST_PATH_IMAGE001
综上所述，本发明提供一种能够促进间充质干细胞表达更多细胞外基质的方法，提升了间充质干细胞本身的功能，同时解决了细胞外基质来源不足问题，进一步扩大了间充质干细胞及细胞外基质的应用空间，具有很大的应用价值。

Claims (5)

1. TGF-β2与Val混合刺激因子促进间充质干细胞表达更多细胞外基质。
2.根据权利要求1所述的TGF-β2与Val混合刺激因子促进促进间充质干细胞表达更多细胞外基质，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在脐带间充质干细胞培养基中添加Val刺激因子，培养4-8 h；
（2）在步骤（1）的培养基中添加TGF-β2刺激因子，继续培养20-24 h。
3. 根据权利要求2所述的能够促进间充质干细胞表达更多细胞外基质的方法，其特征在于，步骤（1）的培养基按照终浓度为1ng/mL~20ng/mL的浓度加入Val，其作用于间充质干细胞、继续培养20-30 h。
4. 根据权利要求2所述的能够促进间充质干细胞表达更多细胞外基质的方法，其特征在于，步骤（2）的培养基中按照终浓度为1ng/mL~10ng/mL的浓度加入TGF -β2，其作用于间充质干细胞、继续培养20-30 h。
5.根据权利要求1所述的能够促进间充质干细胞表达更多细胞外基质的方法，其特征在于，TGF-β2刺激因子与Val刺激因子在培养基中终浓度的比值为：5:1-4。
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