CN111568851A - 一种利用围产期msc生产活性因子的方法及美容制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用围产期MSC生产活性因子的方法及美容制剂，包括如下步骤：低氧饥饿培养P1代围产期间充质干细胞；低氧饥饿培养P2代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P3代；低氧饥饿培养P3代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P4代；低氧饥饿培养P4代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P5代。本发明的培养方法，可以显著促进MSC分泌更多活性因子，特别是通过低温诱导处理后，可以提高活性因子的产量。其次回收的细胞因子原液经活性炭过滤后能提高美容制剂的效果。

Description

一种利用围产期MSC生产活性因子的方法及美容制剂
技术领域
本发明是一种利用围产期MSC生产活性因子的方法及美容制剂，属于生物技术领域。
背景技术
间充质干细胞(MSC，mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。并且间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性人们已经从骨髓、脂肪、外周血、胎盘、脐带和脐带血等多种组织和血液来源中成果将其分离，并且在体外大规模扩增制备。
间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
围产期组织主要是指胎盘、脐带及其所含有的血液等，被认为是天然的干细胞宝库。围产期干细胞是伴随胎儿发育的围产期组织中的干细胞，具有与胚胎干细胞和成人体内组织干细胞不同的特性，其介于胚胎干细胞和成人干细胞之间的亚全能干细胞和多能干细胞，增殖和分化能力比胚胎干细胞低，但明显高于成体干细胞。脐带间充质干细(Mesenchymal Stem Cells，MSCs) 是指存在于新生儿围产期脐带组织中的一种多功能干细胞，其细胞含量、增殖能力优于骨髓间充质干细胞，免疫原性比骨髓间充质干细胞低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，具有广阔的临床应用前景。
尽管人脐带间充质干细胞在细胞替代治疗、再生医学、组织工程学领域取得了令人瞩目的成就，但其治疗机制至今仍不完全清楚，干细胞在体内是否能定向分化为靶组织也不能确定，但是大量研究均表明人脐带间充质干细胞具有很强的自分泌/旁分泌功能，在局部能形成复杂的活性蛋白网络，其分泌的生物活性蛋白在治疗效应中发挥重要的作用。例如间充质干细胞可以通过旁分泌的形式分泌EGF、KGF、VEGF、促血管生成素-1、bFGF、IGF-1、HGF、 PDGF-BB和EPO等一系列可以促进血管生成、促进组织细胞生物合成和能量代谢的细胞活性物质，其还可以加强创面愈合。在皮肤损伤修复中发现这些细胞因子可以对调节表皮及上皮细胞生长、分化增殖、促进毛细血管生长、改善生长微环境、保持细胞活性等方面起着重要作用。同时大量的文献已经报导，EGF、FGF在极微量的作用浓度下能强烈促进皮肤细胞的增殖，从而促进人皮肤的新陈代谢和再生修复，达到减缓匍匐衰老，是皮肤重新恢复弹性和光泽。人脐带间充质干细胞另外一个无可比拟的优势就是其可以通过可溶性因子介导具有免疫抑制和抗炎症效应。可能与其特异地分泌一些细胞因子和生长因子有关，例如血小板因子1，2作为抗炎症因子，通过抑制产生促炎介导剂比如γ-干扰素和肿瘤坏死因子α，清除残存T细胞，减少单核细胞/巨噬细胞在组织的浸润。一些数据表明，前列腺素E2(PGE-2)是一种可溶性的抑炎因子。人脐带间充质干细胞可通过分泌可溶性的PGE-2发挥其免疫抑制效应。吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)是人脐带间充质干细胞表达的参与其调节免疫反应的另一个重要的胞内蛋白。它是犬尿酸途径(KP途径)的关键酶,可以促进色氧酸降解为犬尿酸,从而抑制T细胞免疫反应。人脐带来源间充质干细胞通过促进前列腺素E2(PGE-2)、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)等细胞因子的分泌，调节单核巨噬细胞、T细胞、B细胞、 NK细胞等免疫细胞的增殖、分化和功能。目前应用脐带间充质干细胞分泌可溶性的免疫调节因子治疗多种免疫疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病等已经进入临床阶段，通过细胞分泌的一系列具有免疫调节功能的细胞因子以抑制炎症反应和过敏反应取得了不错的效果。
将脐带间充质干细胞应用于美容及皮肤已经成为近年来再生医学技术用于美容的研究热点。间充质干细胞最早应用于整形外科，如用于除疤、填皱纹、增强肤质、祛色斑、修损伤、抗衰老和丰胸等，它已经成为应用较多的一种干细胞美容技术。
传统上的干细胞美容术一般是指直接注射干细胞针剂。这种注射用干细胞主要来源是异体的胎盘/脐带或者自体的脂肪/皮肤干细胞。但是这些细胞的获取纯化、培养扩增、冻存运输和注射应用都需要一些昂贵的仪器设备、严苛的GMP生产标准和熟练的专业技术人员。此外，复杂的操作流程和工艺，不易长期保存和必须快速运输，这些都极大的阻碍了干细胞的产业化和相关产品的推广和使用。
那么直接将干细胞中的有效活性成分提取出来作为一种美容产品就成为了一种有效的策略。
目前市场上的脐带间充质干细胞来源的细胞生长因子产品其主要作用方式都是高效制备和纯化回收EGF、bFGF、KGF、VEGF等一系列能够促进表皮细胞增殖和血管生成，以促进皮肤的组织细胞新成代谢的形式以达到美容抗衰的效果。
但是随着人们生活水平的不断提高，人们对于追求美丽的愿望也越来越高。随着美容市场的扩大，越来越多的消费者愿意选择激光祛斑、光子嫩肤等一系列作用方式更为激烈的美容方式。但是像皮肤激光美容术通过在人皮肤组织局部产生高能量光热作用进行皮肤治疗，通过去除和破坏组织达到美容的目的。这就难免会产生不必要的组织损伤、严重的炎症反应，以及毛细血管怒张等不良效果。研究已经表明，在皮肤损伤和修复的过程中均涉及炎症反应。而在过度的炎症反应和纤维化是不利于修复和再生的。
随着美容产品的大量使用，由此引起的皮肤疾病也大量增加，皮肤过敏就是其中极其常见的一种。皮肤过敏的原因是由于美容产品中的某些成分，对皮肤细胞产生刺激，使皮肤细胞产生抗体，从而导致过敏。目前市场上销售的化妆品很多都是用化学原料制造的，乳化剂、香料、色素、杀菌剂、防腐剂等有害添加剂对皮肤的伤害很大，从而引起皮肤的发炎和过敏。
目前市场上的干细胞来源的细胞生长因子美容产品的主要作用方式都是以高活性和高纯度的细胞生物活性成分激活皮肤组织内的增殖以激活细胞再生。但是对于美容产品而言，其抗炎症能力的提升不仅能提高其美容的能力，同时可以极大的扩大适用人群和使用范围。相关文献已有报导，细胞培养过程微环境的氧气浓度时非常重要的因素，对间充质干细胞的影响是多方面的，空气氧浓度下培养的间充质干细胞分泌的各种因子量较少。相关文献已报导采用低氧培养可对个别细胞因子在一定程度上增加其含量，但是需要长时间低氧工艺，对培养条件要求高。其次目前主要利用紫外线诱导、机械摩擦、低营养培养法、低温诱导和低氧浓度培养等方法诱导干细胞存在比较多的不足，如(1)诱导分泌的效率较低；(2)非特异性的诱导，只能通过增强多种细胞活性因子成分的分泌以提高特定几种因子的最终产量，而且没有对具有抗炎作用的几类因子进行诱导；(3)普遍对细胞本身有损伤。
其次，细胞在培养过程中的所使用的完全培养基在培养前含有较为丰富的营养成分。但是使用该完全培养基培养细胞后，细胞会代谢一大部分完全培养基中的营养成分，并且向培养环境释放各种代谢产物。这其中除了我们所需要的细胞活性因子成分以外，也包含很多的小分子代谢废物。这些小分子代谢物会引起细胞培养上清液的酸碱值的改变，不利于后续用于美容产品的生产。而且利用改变细胞的生长条件刺激其分泌细胞因子会加快细胞代谢和改变其代谢产物谱，使得回收的细胞培养上清液中无效成分更多。而且在生产中，采用高密度大规模细胞培养扩增是必要的，其细胞代谢废物的产生量也是巨大。这极大的阻碍了围产期MSC生产的活性因子未来在美容方向上的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用围产期MSC生产活性因子的方法和去除收集的培养上清原液中杂质的方法，以及基于该活性因子的美容制剂的生产方法。
本发明所采取的技术方案是：一种利用围产期MSC生产活性因子的方法，包括如下步骤：
(1)分离围产期间充质干细胞，使用完全培养基培养得到P1代围产期间充质干细胞；
(2)低氧饥饿培养P1代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P2代；
(3)低氧饥饿培养P2代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P3代；
(4)低氧饥饿培养P3代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P4代；
(5)低氧饥饿培养P4代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P5代；
(6)待P5代围产期间充质干细胞融合度达80～95％，去除培养基，冷冻破碎裂解P5代围产期间充质干细胞，收集细胞裂解液；
(7)合并培养上清液，并和收集的细胞裂解液混匀，过滤除菌、浓缩得到活性因子原液。
进一步地，按照5g每包将注射用活性炭粉末封装至密封的无纺布包内，按照收集的细胞培养上清液每500ml加入5g活性炭粉末。吸附条件为4℃密封吸附24小时。吸附完成后细胞培养上清液4000rpm离心5min后吸取回收上清液做培养上清液的成品。
进一步地，低氧饥饿培养过程中，氧的体积含量不超过5％，低氧饥饿培养的条件为：饱和湿度，37℃，5％体积分数CO2，3％体积分数氧气，92％体积分数氮气，在低氧饥饿培养过程中，使用4～10℃低温处理围产期间充质干细胞，4～10℃低温处理围产期间充质干细胞的时间为12～48h。
进一步地，完全培养基为StemRD Mgro-500MesenGro人间充质干细胞无血清培养基。
进一步地，低氧饥饿培养的培养基为加入IFN-γ的无血清成分的DMEM基础培养基，IFN-γ的添加量为40～60μg/L。
进一步地，包括如下步骤：
(1)分离围产期间充质干细胞，使用完全培养基培养得到P1代围产期间充质干细胞至细胞融合度达60～80％；
(2)低氧饥饿培养P1代围产期间充质干细胞24h，收集培养上清液后更换为完全培养基继续培养，当细胞融合度达60～80％时传代至P2代；
(3)低氧饥饿培养P2代围产期间充质干细胞24h，收集培养上清液后更换为完全培养基继续培养，当细胞融合度达60～80％时传代至P3代；
(4)低氧饥饿培养P3代围产期间充质干细胞24h，收集培养上清液后更换为完全培养基继续培养，当细胞融合度达60～80％时传代至P4代；
(5)低氧饥饿培养P4代围产期间充质干细胞24h，收集培养上清液后更换为完全培养基继续培养，当细胞融合度达60～80％时传代至P5代；
(6)收集的全部培养上清液，加入活性炭包4℃吸附24小时；
(7)吸附完成后，弃去活性炭包，细胞培养上清液4000rpm离心5分钟去除残留的活性炭粉，收集离心上清液作培养上清液成品；
(8)待P5代围产期间充质干细胞融合度达80～95％，去除培养基，冷冻破碎裂解P5代围产期间充质干细胞，收集细胞裂解液；
(9)合并培养上清液，并和收集的细胞裂解液混匀，过滤除菌、采用截留分子量为3KD的超滤膜浓缩，截留得到活性因子原液。
进一步地，低氧饥饿培养的条件为：饱和湿度，37℃，5％体积分数CO2， 3％体积分数氧气，92％体积分数氮气，培养基为添加有终浓度为50μg/L IFN- γ的无血清DMEM基础培养基，培养温度为4～8℃，完全培养基为StemRD Mgro-500MesenGro人间充质干细胞无血清培养基。
进一步地，该活性炭包内含医药用活性炭，吸附过程中用密封无纺布袋封装后浸泡于收集的细胞培养上清液原液之中，吸附过程中加入的活性炭比例为每500ml细胞培养上清液加入5g活性炭粉末，吸附的过程保持4℃，吸附24小时，吸附完成后4000rpm离心5分钟去除可能泄露的活性炭粉末，并收集培养上清液。
进一步地，一种美容制剂，其含有上述方法制备得到的活性因子。
进一步地，活性因子原液80v/v％、1wt％透明质酸、10mg/mL人血清白蛋白，余量生理盐水。
本发明的有益效果：本发明的培养方法，可以显著促进MSC分泌更多活性因子，特别是通过低温诱导处理后，可以进一步提高活性因子的产量。
本发明的培养上清纯化方法，能有效去除培养上清中的细胞代谢产物，调节pH值，可以进一步提高活性细胞因子原液的效果。
本发明方法培养得到的活性因子具有很好的生物活性，具有极好的抗衰老、改善敏感肤质等作用，可以开发为优异的美容产品。
附图说明
图1是不同制备方法获得的围产期间充质干细胞的活性因子对人皮肤成纤维细胞生长的影响；
图2是不同制备方法获得的围产期间充质干细胞活性因子成分对于淋巴细胞增殖的影响；
图3是不同制备方法获得的围产期间充质干细胞活性因子成分对分泌液纤维细胞生长的影响。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
本发明提供一种技术方案：一种利用围产期MSC生产活性因子的方法，包括如下步骤：
(1)分离围产期间充质干细胞，使用完全培养基培养得到P1代围产期间充质干细胞；
(2)低氧饥饿培养P1代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P2代；
(3)低氧饥饿培养P2代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P3代；
(4)低氧饥饿培养P3代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P4代；
(5)低氧饥饿培养P4代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P5代；
(6)待P5代围产期间充质干细胞融合度达80～95％，去除培养基，冷冻破碎裂解P5代围产期间充质干细胞，收集细胞裂解液；
(7)合并培养上清液，并和收集的细胞裂解液混匀，过滤除菌、浓缩得到活性因子原液。
进一步地，低氧饥饿培养过程中，氧的体积含量不超过5％，低氧饥饿培养的条件为：饱和湿度，37℃，5％体积分数CO2，3％体积分数氧气，92％体积分数氮气，在低氧饥饿培养过程中，使用4～10℃低温处理围产期间充质干细胞，4～10℃低温处理围产期间充质干细胞的时间为12～48h。
进一步地，按照5g每包将注射用活性炭粉末封装至密封的无纺布包内，按照收集的细胞培养上清液每500ml加入5g活性炭粉末。吸附条件为4℃密封吸附24小时。吸附完成后细胞培养上清液4000rpm离心5min后吸取回收上清液做培养上清液的成品。
进一步地，完全培养基为StemRD Mgro-500MesenGro人间充质干细胞无血清培养基。
进一步地，低氧饥饿培养的培养基为加入IFN-γ的无血清成分的DMEM基础培养基，IFN-γ的添加量为40～60μg/L。
进一步地，包括如下步骤：
(1)分离围产期间充质干细胞，使用完全培养基培养得到P1代围产期间充质干细胞至细胞融合度达60～80％；
(2)低氧饥饿培养P1代围产期间充质干细胞24h，收集培养上清液后更换为完全培养基继续培养，当细胞融合度达60～80％时传代至P2代；
(3)低氧饥饿培养P2代围产期间充质干细胞24h，收集培养上清液后更换为完全培养基继续培养，当细胞融合度达60～80％时传代至P3代；
(4)低氧饥饿培养P3代围产期间充质干细胞24h，收集培养上清液后更换为完全培养基继续培养，当细胞融合度达60～80％时传代至P4代；
(5)低氧饥饿培养P4代围产期间充质干细胞24h，收集培养上清液后更换为完全培养基继续培养，当细胞融合度达60～80％时传代至P5代；
(6)收集的全部培养上清液，加入活性炭包4℃吸附24小时；
(7)吸附完成后，弃去活性炭包，细胞培养上清液4000rpm离心去去除残留的活性炭粉，收集离心上清液作培养上清液成品；
(8)待P5代围产期间充质干细胞融合度达80～95％，去除培养基，冷冻破碎裂解P5代围产期间充质干细胞，收集细胞裂解液；
(9)合并培养上清液，并和收集的细胞裂解液混匀，过滤除菌、采用截留分子量为3KD的超滤膜浓缩，截留得到活性因子原液。
进一步地，低氧饥饿培养的条件为：饱和湿度，37℃，5％体积分数CO2， 3％体积分数氧气，92％体积分数氮气，培养基为添加有终浓度为50μg/L IFN- γ的无血清DMEM基础培养基，培养温度为4～8℃，完全培养基为StemRD Mgro-500MesenGro人间充质干细胞无血清培养基。
进一步地，按照5g每包将注射用活性炭粉末封装至密封的无纺布包内，按照收集的细胞培养上清液每500ml加入5g活性炭粉末。吸附条件为4℃密封吸附24小时。吸附完成后细胞培养上清液4000rpm离心5min后吸取回收上清液做培养上清液的成品。
进一步地，围产期间充质干细胞源自脐带组织、羊水、胎盘组织、脐带血中的至少一种。
一种美容制剂，其含有上述方法制备得到的活性因子。
进一步地，活性因子原液80v/v％、1wt％透明质酸、10mg/mL人血清白蛋白，余量生理盐水。
围产期间充质干细胞的获取：可以使用现有方法获得，或按如下方法收集：
(1)取来源无菌条件下采集的足月婴儿脐带5～10cm，生理盐水冲洗至表面无血液成分残留，去除表面羊膜、两条脐动脉血管和一条脐静脉血管后剪碎，组织块加入含有双抗的无血清完全培养基后加入细胞培养瓶内与37℃、饱和湿度、5％CO2培养约3周，期间每隔5天更换一半新鲜的含有双抗的无血清完全培养基；
待细胞融合度达70％-80％时，025％的胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化细胞后，用100μm细胞滤器过滤细胞并用生理盐水刷洗后离心回收。
干细胞的传代培养方法：
回收的人脐带间充质干细胞重悬于不含双抗的无血清完全培养基加入 T175细胞培养瓶中培养，当细胞融合度达90％时，025％的胰蛋白酶(含 0.02％EDTA)消化细胞并用生理盐水刷洗后1000rpm离心5分钟回收。按照1 瓶传3瓶的比例悬浮于无血清完全培养基，接种于T175后连续扩增1-5代。期间细胞培养于37℃、饱和湿度、5％CO2、正常含氧量的环境中。
围产期间充质干细胞的活性因子分泌液的制备：
(1)在围产期间充质干细胞连续扩增1-5代的过程中，当细胞融合度达 60～80％时，PBS轻轻刷洗2次，去除残留的完全培养基；
(2)加入基础培养基DMEM和50μg/L IFN-γ处理24小时，期间细胞处于37℃、饱和湿度、5％CO2、3％体积分数的氧气、余量氮气的低氧环境中；完成处理后收集上层培养液为围产期间充质干细胞的活性因子分泌液，分泌液优选暂存于-80℃超低温冰箱内；
(3)余下细胞更换为不含双抗的无血清完全培养基按照上述干细胞的传代培养方法继续扩增至第5代；
(4)准备活性炭(注射级)按照5g/包分装至无纺布袋内，密封后高压蒸汽湿热灭菌；
(5)将收集的活性因子分泌液复融至4℃后按照每500ml放入1个活性炭包吸附24小时，吸附条件为4℃；
(6)完成吸附后的活性因子分泌液经4000rpm离心5min，去除沉淀的可能泄露的活性炭粉末；
(7)回收的分泌液优选暂存于-80℃超低温冰箱内。
围产期间充质干细胞的活性因子提取液的制备：
(1)待第5代围产期间充质干细胞培养至融合率达到约90％后，用0.25％的胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化后细胞悬液以1000rpm离心5分钟回收，PBS 洗涤细胞2次后计数1*10^7个，重悬浮于5ml无菌超纯水中；
(2)回收的细胞置于-80℃超低温冰箱6小时后于4℃的冰箱内融化，融化后再重复以上步骤破碎细胞；
(3)完成处理后收集的细胞破碎液即为围产期间充质干细胞的活性因子提取液暂存于-80℃超低温冰箱内。
围产期间充质干细胞的活性因子成分的浓缩：
(1)4℃融化围产期间充质干细胞的活性因子提取液和分泌液，并按照分泌液体积：提取液体积＝7.5：1混匀，之后采用无菌的0.22μm滤膜过滤除菌；
(2)滤过液采用截留分子量为3KD的超滤膜浓缩至截留物为原体积的 1/10；
(3)测定总蛋白含量后，用生理盐水调整至中蛋白浓度为300μg/ml，最终制得围产期间充质干细胞的活性因子成分原液，暂存于-80℃超低温冰箱内。
围产期间充质干细胞的活性因子成分的美容复合制剂的制备：
(1)4℃融化围产期间充质干细胞成分原料(围产期间充质干细胞的活性因子成分原液)；
(2)在无菌操作的条件下加入80％细胞的活性因子成分原料、1％透明质酸、10mg/ml人血清白蛋白，余下的体积用生理盐水补足。
该美容复合制剂混匀后可用于皮肤皱纹、色斑和瘢痕等美容护肤领域，其效果明显尤其适合敏感肤质的人群。
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
以下细胞培养过程中使用的完全培养基为StemRD Mgro-500MesenGro人间充质干细胞无血清培养基。基础培养基为无血清DMEM基础培养基。
不同制备方法收集的围产期间充质干细胞活性因子分泌液：
实施方案：按照本发明所描述，从健康的人围产期组织中分离人脐带间充质干细胞，一共构建5株细胞系，培养至第1代后按照细胞数量平均分为2 组再培养至第5代。按照细胞融合度同一时间去除完全培养基开始收集细胞分泌液。
实验组1：
(1)在围产期间充质干细胞连续扩增1-5代的过程中，当细胞融合度到达60-80％时，PBS轻轻刷洗2次，去除残留的完全培养基；
(2)加入无血清基础培养基DMEM和50μg/L IFN-γ处理24小时，期间细胞处于37℃、饱和湿度、5％CO2、3％体积分数的氧气、余量氮气的低氧环境中；完成处理后收集上层培养液为围产期间充质干细胞的活性因子分泌液暂存于-80℃超低温冰箱内；
(3)余下细胞更换为不含双抗的无血清完全培养按照干细胞传代培养的方法继续扩增至第5代。收集培养过程中产生的分泌液；
(4)收集的围产期间充质干细胞的活性因子分泌液，加入活性炭包4℃吸附24小时；
(5)吸附完成后，弃去活性炭包，细胞培养上清液4000rpm离心去去除残留的活性炭粉，收集离心上清液作细胞活性因子分泌液的成品。
实验组2：
(1)在围产期间充质干细胞连续扩增1-5代的过程中，当细胞融合度到达60-80％时，PBS轻轻刷洗2次，去除残留的完全培养基；
(2)加入无血清基础培养基DMEM和50μg/L IFN-γ处理24小时，期间细胞处于4℃、饱和湿度、5％CO2、3％体积分数的氧气、余量氮气的低氧环境中；完成处理后收集上层培养液为围产期间充质干细胞的活性因子分泌液暂存于-80℃超低温冰箱内；
(3)余下细胞更换为不含双抗的无血清完全培养按照干细胞传代培养的方法继续扩增至第5代。收集培养过程中产生的分泌液；
(4)收集的围产期间充质干细胞的活性因子分泌液，加入活性炭包4℃吸附24小时；
(5)吸附完成后，弃去活性炭包，细胞培养上清液4000rpm离心去去除残留的活性炭粉，收集离心上清液作细胞活性因子分泌液的成品。
对照组1：
(1)在围产期间充质干细胞连续扩增1-5代的过程中，当细胞融合度到达60-80％时，PBS轻轻刷洗2次，去除残留的完全培养基；
(2)加入无血清基础培养基DMEM培养处理24小时，期间细胞处于37℃、饱和湿度、5％CO2、3％体积分数的氧气、余量氮气的低氧环境中；完成处理后收集上层培养液为围产期间充质干细胞的活性因子分泌液暂存于-80℃超低温冰箱内；
(3)余下细胞更换为不含双抗的无血清完全培养按照干细胞传代培养的方法继续扩增至第5代。收集培养过程中产生的分泌液；
(4)收集的围产期间充质干细胞的活性因子分泌液，加入活性炭包4℃吸附24小时；
(5)吸附完成后，弃去活性炭包，细胞培养上清液4000rpm离心去去除残留的活性炭粉，收集离心上清液作细胞活性因子分泌液的成品。
以上按照不同方案收集的细胞培养上清(细胞因子分泌液)分别标记为实验组1、实验组2和对照组1，暂存于-80℃。
不同制备方法收集的围产期间充质干细胞活性因子的提取液：
实施方案：将以上经过不同方法处理的人脐带间充质干细胞按照相同的接种密度(1瓶传代接种3瓶)分别培养扩增至P5代。根据本发明所描述的围产期间充质干细胞的活性因子提取液的制备方法破碎细胞，分别按照相同的细胞密度(1*10^7细胞悬浮于5ml无菌超纯水)冷冻破碎细胞，回收的细胞破碎液分别标记为实验组1、实验组2和对照组1暂存于-80℃。
合并围产期间充质干细胞活性因子分泌液和提取液：
实施方案：对照组1和实验组回收的细胞因子活性成分按照并按照分泌液体积：提取液体积＝7.5：1混匀，之后采用无菌的0.22μm滤膜过滤除菌暂存。
实验结果：
不同制备方法得到的围产期间充质干细胞活性因子成分的含量：
将以上收集的对照组1围产期间充质干细胞的活性因子和实验组围产期间充质干细胞的活性因子根据ELISA检测试剂盒说明书上所注明的特点波长，通过检测其吸光度按照相关的标准曲线对比不同制备方法得到的围产期间充质干细胞活性因子成分的含量，一共检测5批次的样本。结果如下表所示：
Figure RE-GDA0002576721670000151
结论：采用本发明所描述的制备方法回收的围产期间充质干细胞活性因子成分其免疫调节相关的细胞因子含量更高。低温处理可以进一步提高细胞活性因子的分泌量。
活性炭吸附对细胞因子分泌液的pH值的影响：
实施方案：按照本发明所描述，从健康的人围产期组织中分离人脐带间充质干细胞，一共构建5株细胞系，培养至第1代后按照细胞数量平均分为2 组再培养至第5代。按照细胞融合度同一时间去除完全培养基开始收集细胞分泌液。
(1)在围产期间充质干细胞连续扩增1-5代的过程中，当细胞融合度到达60-80％时，PBS轻轻刷洗2次，去除残留的完全培养基；
(2)加入无血清基础培养基DMEM和50μg/L IFN-γ处理24小时，期间细胞处于4℃、饱和湿度、5％CO2、3％体积分数的氧气、余量氮气的低氧环境中；完成处理后收集上层培养液为围产期间充质干细胞的活性因子分泌液暂存于-80℃超低温冰箱内；
(3)余下细胞更换为不含双抗的无血清完全培养按照干细胞传代培养的方法继续扩增至第5代。收集培养过程中产生的分泌液；
(4)准备活性炭(注射级)按照5g/包分装至无纺布袋内，密封后高压蒸汽湿热灭菌；
(5)将收集的活性因子分泌液复融至4℃后按照每500ml放入1个活性炭包吸附24小时，吸附条件为4℃；
(6)完成吸附后的活性因子分泌液经4000rpm离心5min，去除沉淀的可能泄露的活性炭粉末；
(7)经活性炭吸附回收的分泌液作为活性因子分泌液A,而未经活性炭吸附的作为活性因子分泌液B，均暂存于-80℃超低温冰箱内。
实验结果
使用电子pH度计检测活性因子分泌液A组和活性因子分泌液B组
pH值 细胞株1 细胞株2 细胞株3 细胞株4 细胞株5
因子分泌液A组 7.2 7.3 7.2 7.2 7.4
因子分泌液B组 6.7 6.8 6.8 6.9 7.0
结论：活性炭吸附能极为有效的调整细胞因子分泌液的ph值至中性，有利于后续在美容制剂中的应用。
活性炭吸附细胞因子分泌液对人皮肤成纤维细胞生长的影响：
实施方案：购买的人皮肤成纤维细胞按照按1×10^4/孔接种于96孔板， 6复孔接种，分为：阴性对照组、活性因子分泌液A组和活性因子分泌液B共计3组。共接种3块96孔相同规格的培养板，观察7天。每天各组检测各自的8个复孔。
阴性对照组为成纤维细胞培养液，制备的围产期间充质干细胞的活性因子分泌液(A组和B组)按体积比25％添加到成纤维细胞培养液培养液中。第二天开始检测，第一板加入MTT 20μl/孔(5mg/ml)，24小时后加入DMSO，测细胞生长数，观察细胞的生长状况。其中的成纤维细胞培养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。实验一共检测5批次的围产期间充质干细胞的活性因子成分。以570nm处吸光度代表对应的细胞数量。
结论：经过活性炭过滤的细胞因子分泌液能够更好的促进人皮肤成纤维细胞生长，意味着其用于美容制剂中能够获得更好的效果。
不同制备方法获得的围产期间充质干细胞的活性因子对人皮肤成纤维细胞生长的影响：
实施方案：购买的人皮肤成纤维细胞按照按1×10^4/孔接种于96孔板， 6复孔接种，分为：空白对照组A、对照组1中收集的围产期间充质干细胞的活性因子为B组、实验组1中收集的围产期间充质干细胞的活性因子C和实验组2中收集的围产期间充质干细胞的活性因子D四组。共接种7块96孔相同规格的培养板，观察7天。每天检测一块板。
A组空白对照组加成纤维细胞培养液，B培养基阴性对照组为成纤维细胞培养液中加入25％体积比实验对照组收集的围产期间充质干细胞的活性因子， C组和D组分别为不同工艺制备的围产期间充质干细胞的活性因子按体积比 25％添加培养液中，其中D组的。第二天开始检测，第一板加入MTT 20μl/ 孔(5mg/ml)，4小时后加入DMSO，测细胞生长数，观察细胞的生长状况。其中的成纤维细胞培养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。实验一共检测 5批次的围产期间充质干细胞的活性因子成分。以570nm处吸光度代表对应的细胞数量。
实验结果如图1所示，图中的结果代表细胞的活性和增殖速度，可见加入收集的围产期间充质干细胞的活性因子样本的细胞活性和增殖速度高于不加入活性因子的空白对照组的细胞活性和增殖速度，其中2种不同干细胞活性细胞因子制备方法的存在一定差异。采用本专利的低温和低氧制备细胞活性因子的工艺对皮肤成纤维细胞增殖的促进作用更强，应用于美容制剂中有更强的潜力。
结论：加入本发明中的围产期间充质干细胞的活性因子对于皮肤成纤维细胞的生长起促进作用，此作用能够加快细胞的新陈代谢，最终实现存进皮肤的修复与再生，延缓老化的作用。说明本发明方法制备得到的围产期间充质干细胞的活性因子具有很好的安全性，对细胞生长没有不良影响。
取健康成人外周血50ml按1:1与生理盐水混匀后缓慢加入到Ficoll淋巴细胞分离液上2000rpm离心20分钟。吸取中间雾状淋巴细胞层，生理盐水洗涤2次，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞密度为1×10^7/ml，按照1×10^6/孔接种于96孔板，加入3％植物凝集素后置37℃，5％CO2孵箱中培养，6复孔接种。
实验分组分为：培养基阴性对照组A、对照组1中收集的围产期间充质干细胞的活性因子B和实验组1中收集的围产期间充质干细胞的活性因子C三组。共接种6块96孔相同规格的培养板，观察6天。每天检测一块板。阴性对照组为200ul含10％胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液，对照组1和实验组加入制备的围产期间充质干细胞的活性因子按体积比100％添加培养液中，第二天开始检测，第一板加入MTT 20μl/孔(5mg/ml)，4小时后加入DMSO，测细胞生长数，观察细胞的生长状况。其中的成纤维细胞培养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。实验一共检测5批次的围产期间充质干细胞的活性因子成分。
实验结果如图2所示，对比可以发现用本发明中的工艺制备的围产期间充质干细胞活性细胞因子成分较已有工艺制备的活性因子成分对于淋巴细胞增殖的抑制作用更强，免疫调节作用更好。
结论：本发明制备的围产期间充质干细胞活性细胞因子抑制炎症发生的能力更强，用其生产的美容产品复合制剂更加适用于敏感肤质。
围产期间充质干细胞的活性因子成分美容复合制剂用于敏感肤质的过敏反应对比:
按照本发明所述在无菌操作的条件下加入80％细胞的活性因子成分原料、1％透明质酸、10mg/ml人血清白蛋白，余下的体积用生理盐水补足，制得美容复合制剂。进行志愿者测试以评价其在敏感肤质人群中的安全性。
实验组安排志愿者30名，年龄为30-45岁，均为敏感肤质；使用方法：用75％的医用酒精消毒皮肤，将微针浸泡在75％的医用酒精消毒液中约 15-30min。将本美容复合制剂涂抹在面部皮肤上。继而用微针按顺序由下至上滚动，每个部位约2次，然后呈米字型全脸洗一次。每隔1周使用1次，连续使用12周。出现过敏症状后立即停止使用。统计出现敏感症状的时间和人次。实验结果如下表：
Figure RE-GDA0002576721670000191
结论：本美容复合制剂致敏性低，可应用于敏感肤质。
围产期间充质干细胞的活性因子成分美容复合制剂用于敏感肤质的面部年轻化治疗效果:
按照本发明所述在无菌操作的条件下加入80％细胞的活性因子成分原料、 1％透明质酸、10mg/ml人血清白蛋白，余下的体积用生理盐水补足，制得美容复合制剂。进行志愿者测试以评价其在敏感肤质人群中的安全性。实验组安排志愿者30名，年龄为30-45岁；使用方法：用75％的医用酒精消毒皮肤，将微针浸泡在75％的医用酒精消毒液中约15-30min。将本美容复合制剂涂抹在面部皮肤上。继而用微针按顺序由下至上滚动，每个部位约2次，然后呈米字型全脸洗一次。每隔3天使用1次，连续使用2周。用后1、3、7、15、 30天用皮肤分析系统检测皮肤的唐星、水分、皱纹、斑点和毛孔大小。实验结果如下表：
用前 用后3天 用后7天 用后15天 用后30天
弹性 0 1 3 3 4
水分 0 2 3 3 2
皱纹 0 2 2 3 3
斑点 0 1 2 3 5
毛孔 0 0 1 2 2
实验结果表明本发明的美容复合制剂可以很好地改善皮肤状态，具有较为明显的抗衰老作用。
本发明公开了利用围产期MSC生产活性因子的方法及美容制剂，通过使用低氧饥饿培养刺激MSC分泌活性因子，大幅提高了活性因子的产量，制备得到的活性因子具有很好的安全性，对皮肤具有极佳的改善作用。本发明的培养方法，可以显著促进MSC分泌更多活性因子，特别是通过低温诱导处理后，可以进一步提高活性因子的产量。
其次通过活性炭过滤的方法能够有效的调节回收的MSC细胞因子分泌液的pH值，去除细胞代谢产物提高对细胞增殖的促进作用。本发明方法培养得到的活性因子具有很好的生物活性，具有极好的抗衰老、改善敏感肤质等作用，可以开发为优异的美容产品。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.一种利用围产期MSC生产活性因子的方法，包括如下步骤：
（1）分离围产期间充质干细胞，使用完全培养基培养得到P1代围产期间充质干细胞；
（2）低氧饥饿培养P1代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P2代；
（3）低氧饥饿培养P2代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P3代；
（4）低氧饥饿培养P3代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P4代；
（5）低氧饥饿培养P4代围产期间充质干细胞，收集培养上清液后更换为完全培养基传代至P5代；
（6）收集的全部培养上清液，加入活性炭包4℃吸附24小时；
（7）吸附完成后，弃去活性炭包，细胞培养上清液4000rpm离心去去除残留的活性炭粉，收集离心上清液作培养上清液成品；
（8）待P5代围产期间充质干细胞融合度达80～95%，去除培养基，冷冻破碎裂解P5代围产期间充质干细胞，收集细胞裂解液；
（9）合并培养上清液，并和收集的细胞裂解液混匀，过滤除菌、浓缩得到活性因子原液。
2.根据权利要求1所述的一种利用围产期MSC生产活性因子的方法，其特征在于：低氧饥饿培养过程中，氧的体积含量不超过5%，低氧饥饿培养的条件为：饱和湿度，37℃，5%体积分数CO2，3%体积分数氧气，92%体积分数氮气，在低氧饥饿培养过程中，使用4～10℃低温处理围产期间充质干细胞， 4～10℃低温处理围产期间充质干细胞的时间为12～48 h。
3.根据权利要求1所述的一种利用围产期MSC生产活性因子的方法，其特征在于：完全培养基为StemRD Mgro-500 MesenGro人间充质干细胞无血清培养基。
4.根据权利要求1所述的一种利用围产期MSC生产活性因子的方法，其特征在于：低氧饥饿培养的培养基为加入IFN-γ的无血清成分的DMEM基础培养基，IFN-γ的添加量为40～60μg/L。
5.根据权利要求1所述的一种利用围产期MSC生产活性因子的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）分离围产期间充质干细胞，使用完全培养基培养得到P1代围产期间充质干细胞至细胞融合度达60～80%；
（2）低氧饥饿培养P1代围产期间充质干细胞24h，收集培养上清液后更换为完全培养基继续培养，当细胞融合度达60～80%时传代至P2代；
（3）低氧饥饿培养P2代围产期间充质干细胞24h，收集培养上清液后更换为完全培养基继续培养，当细胞融合度达60～80%时传代至P3代；
（4）低氧饥饿培养P3代围产期间充质干细胞24h，收集培养上清液后更换为完全培养基继续培养，当细胞融合度达60～80%时传代至P4代；
（5）低氧饥饿培养P4代围产期间充质干细胞24h，收集培养上清液后更换为完全培养基继续培养，当细胞融合度达60～80%时传代至P5代；
（6）收集的全部培养上清液，加入活性炭包4℃吸附24小时；
（7）吸附完成后，弃去活性炭包，细胞培养上清液4000rpm离心5分钟去除残留的活性炭粉，收集离心上清液作培养上清液成品；
（8）待P5代围产期间充质干细胞融合度达80～95%，去除培养基，冷冻破碎裂解P5代围产期间充质干细胞，收集细胞裂解液；
（9）合并培养上清液，并和收集的细胞裂解液混匀，过滤除菌、采用截留分子量为3KD的超滤膜浓缩，截留得到活性因子原液。
6.根据权利要求1所述的一种利用围产期MSC生产活性因子的方法，其特征在于：低氧饥饿培养的条件为：饱和湿度，37℃，5%体积分数CO2，3%体积分数氧气，92%体积分数氮气，培养基为添加有终浓度为50μg/L IFN-γ的无血清DMEM基础培养基，培养温度为4～8℃，完全培养基为StemRD Mgro-500 MesenGro人间充质干细胞无血清培养基。
7.根据权利要求1所述的一种利用围产期MSC生产活性因子的方法，其特征在于：该活性炭包内含医药用活性炭，吸附过程中用密封无纺布袋封装后浸泡于收集的细胞培养上清液原液之中，吸附过程中加入的活性炭比例为每500ml细胞培养上清液加入5g活性炭粉末，吸附的过程保持4℃，吸附24小时，吸附完成后4000rpm离心5分钟去除可能泄露的活性炭粉末，并收集培养上清液。
8.一种美容制剂，其特征在于：其含有权利要求1-7任一项所述方法制备得到的活性因子。
9.根据权利要求8所述的一种美容制剂，其特征在于：其组成为：活性因子原液80v/v%、1wt %透明质酸、10mg/mL人血清白蛋白，余量生理盐水。
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