CN105543313B - 一种人源间充质干细胞因子及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分离纯化人源间充质干细胞因子的方法，它包括如下步骤：a、细胞培养上清液的获取：取人间充质干细胞，置于间充质干细胞无血清培养基中培养，当细胞生长到汇合度75～85％时，收集上清液；b、过滤浓缩：对步骤a的上清液先采用0.22μm滤膜过滤；然后通过50KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过1KD超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液,即可。本发明还提供了制备的间充质干细胞因子及其用途。本发明还提供了一种含有间充质干细胞因子的化妆品。本发明方法可以有效去除间充质干细胞培养液中的杂质，而且得到的细胞因子纯度高，且产量也高，应用前景良好。

Description

一种人源间充质干细胞因子及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于皮肤修复技术领域，具体涉及一种人源间充质干细胞因子及其制备方法和用途。
背景技术
近年来，随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究者们的热点。间充质干细胞可以分泌多种具有生物活性的细胞因子，这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。将细胞因子添加到美容化妆品，不仅具有一般化妆品的保湿美白功效，还能够修复受损皮肤，消除皮肤皱纹，收缩毛孔，改善面色等，越来越受到人们的关注。
含细胞因子的化妆品现已在多个国家上市，尤其是在以美容整形行业最为发达的韩国，细胞因子化妆品尤为甚行。我国亦有多家规模较大的干细胞公司开发出了细胞因子化妆品。但市面上的细胞因子化妆品一般采用干细胞培养上清液直接掺入或经冻干后掺入化妆品基质的方式制造，细胞因子含量较低，且含有大量糖分等其它杂质，使用这些化妆品后反而会造成皮肤干燥等不适感。
目前也有一些对干细胞培养上清液进行提取纯化的报道，但效果依然不佳，例如公告号为CN102600057B的专利公开了一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，对得到的细胞培养液采用单一的3000D滤膜进行超滤截留，其去掉了部分杂质，但是糖类等杂质仍未除掉，并且还导致细胞因子大量损失，修复效果不佳，而且同样也会造成皮肤干燥等不适感，实际应用价值较低。
发明内容
本发明提供了一种分离人源间充质干细胞因子的方法，它包括如下步骤：
a、细胞培养上清液的获取：取人间充质干细胞，置于间充质干细胞无血清培养基中培养，当细胞生长到汇合度75～85％时，收集上清液；
b、过滤浓缩：对步骤a的上清液先采用0.22μm滤膜过滤；然后通过50KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过1KD超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液,即可。
其中，步骤a中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；
所述脐带间充质干细胞的制备方法为：取脐带，在无菌条件下，采用组 织块法培养得到；所述取脐带为取5-10根脐带混合。
本发明还提供了上述方法制备得到的细胞因子浓缩液。
本发明还提供了一种人源间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，步骤如下：取权利要求3所述的细胞因子浓缩液，冻干，得人源间充质干细胞因子冻干粉。
其中，冻干前，先加入冻干保护剂；其中，所述冻干保护剂每100ml中含有如下组分：抗坏血酸0.3～0.8g，人白蛋白0.1～1ml,右旋糖苷2.5～4.0g、海藻糖1～2g，甘氨酸0.02～0.08g、精氨酸0.05～0.17g、氨基乙酸2g、柠檬酸钠0.26g、叔丁醇10～20ml；
进一步地，所述冻干保护剂每100ml中含有如下组分：抗坏血酸0.5g，人白蛋白0.5ml,右旋糖苷3.5g、海藻糖1.5g，甘氨酸0.04g、精氨酸0.17g、氨基乙酸2g、柠檬酸钠0.26g、叔丁醇15ml；
所述冻干的条件为：压强为10～30pa，-25～-40℃下，16～24h。
本发明还提供了上述方法制备得到的人源间充质干细胞因子冻干粉。
本发明还提供了上述细胞因子浓缩液或上述细胞因子冻干粉在制备化妆品中的用途。
化妆品包括护肤品。
本发明还提供了上述细胞因子浓缩液或上述细胞因子冻干粉在制备修复皮肤损伤的药物中的用途。
本发明还提供了一种细胞因子化妆品或药物，其中，每100ml中化妆品或药物中包含上述间充质干细胞因子冻干粉0.5～1.5g，透明质酸0.1～1g，胶原蛋白1～5ml。
进一步地，每100ml中化妆品或药物中包含间充质干细胞因子冻干粉1g，透明质酸0.5g，胶原蛋白2ml；所述透明质酸为分子量为3000D-10KD的透明质酸。
本发明分离纯化人源间充质干细胞因子的方法，可以有效去除间充质干细胞培养液中的杂质，而且得到的细胞因子纯度高，且产量很高。本发明的间充质干细胞因子能够促进表皮细胞营养代谢；促进皮下胶原细胞功能，加速皮肤胶原细胞生长，增加胶原分泌，具有预防和修复皮肤损伤，延缓衰老，抗皱及美白等功效，而且使用时无皮肤干燥等不适感。本发明的间充质干细胞因子可以添加到化妆品或药品中，尤其以0.5％～1.5％比例加入化妆品，增强其皮肤修复、抗老化、祛皱美白等美容护肤功效，具有良好的市场前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为P5代MSC细胞表面标志图。
图2大图为家兔背部皮肤激光照射后40秒钟的创面图；小图为局部放大图。
图3为照射后40秒钟的组织病理HE染色图，可见表皮坏死，真皮浅层受累，部分皮肤附属器结构破坏，血管扩张充血(×20)。
图4左图为实验第6天，模型对照组的恢复情况图，可见创面仍有厚痂壳覆盖；右图为实验第6天，模型对照组病理HE染色图，可见部分表皮再生，但仍有部分缺损，真皮浅层缺损，表皮及真皮中有较多炎症细胞浸润(×50)。
图5左图为实验第12天，模型对照组恢复情况图，可见大部分痂壳已经脱落，基底潮红，略有水肿；右图为实验第12天，模型对照组病理HE染色图，可见部分表皮再生，但仍有部分缺损，真皮浅层缺损，表皮及真皮中有较多炎症细胞浸润(×50)。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照试剂盒说明书选择。
实验试剂及仪器：
实施例1本发明间充质干细胞因子的制备
一、脐带来源
胎儿父母签署脐带捐赠知情者同意书，产前检查产妇的丙型肝炎病毒抗体、艾滋病病毒Ⅰ/Ⅱ抗体、乙型肝炎病毒抗原和梅毒螺旋体抗体。分娩的同时采集检查结果合格的脐带，脐血。脐血用于检测病毒，保证所采脐带无病毒污染。
二、制备方法
1、人脐带间充质干细胞(UC-MSC)培养上清液的获取
(1)在无菌的条件下将捐赠的10根病毒检测合格的脐带用眼科剪剪碎成1mm3大小左右的组织块后混合均匀。
(2)将混合均匀的组织块均匀平铺在直径为100mm的塑料培养皿中，加入完全培养基[90％(v/v)DMEM/F12+10％(v/v)胎牛血清]，对组织块进行培养，每隔三天换液，当P0代MSC汇合度达75～85％时，弃去含血清的上清液，收获细胞。
(3)将收获的细胞以3000个/cm2密度接种到T75培养瓶中，并采用无血清培养基培养。当细胞生长到汇合度75～85％时，收获细胞，添加10％的DMSO，将细胞量调整至1.0～10.0×106个/ml/管，用程控降温仪冻存后保存在液氮罐中作为种子库细胞(即P1代细胞)。对得到的P1代细胞进行活率测定，活率为96.9％。
(4)按需求量复苏种子库细胞，进行扩大培养，复苏细胞活率为94.5％。将种子库细胞以3000个/cm2密度接种到T75培养瓶中，并采用无血清培养体系培养。当细胞生长到汇合度75～85％，收集上清液并保存在-40℃低温冰箱内，对细胞(即P2代细胞)进行传代，再以8000个/cm2密度接种到T225培养瓶中。当细胞生长到汇合度75～85％时，收集上清液并保存在-40℃低温冰箱内，对细胞(即P3代细胞)进行传代，如此重复操作直到收获P5代细胞，按1.0～10.0×107个细胞/ml密度冻存(细胞冻存时加入10％的DMSO)，并对最后收集的细胞上清液取样，进行无菌、支原体、细菌内毒素检测。
(5)将收集的P1-P5代细胞的所有无血清培养液在37℃解冻后合并在一起得到20L液体。
2、过滤浓缩
对收集的无血清上清液先采用0.22μm滤膜过滤，去除混在上清液中的细 胞碎片；再采用分级无菌超滤分离机进行截留，此处所述分级超滤分离机，是由电磁供料泵、耐震压力表、无菌原料罐、压力表、无菌管道支架和1000D和50KD无菌有机滤膜等配件连接组成。
培养上清液通过滤膜的顺序为，先通过50KD有机滤膜，收集低于50KD的细胞因子液；然后将细胞因子液用电磁泵再次打入1000d有机滤膜，收集到1L-2L细胞因子浓缩液，根据工艺需要，通过反复浓缩可以将细胞因子体积浓缩为原培养上清液体积的1/10-1/150，既可。
三、实验结果
1、人脐带间充质干细胞的形态
取P5代细胞悬液进行流式检测，检测结果如表1，图1所示。
表1 P5代MSC细胞的免疫表型
细胞免疫表型表达 P5代MSC细胞免疫表型
CD90-FITC 100.0
CD105-PE 100
CD45-FITC 0.1
HLA-DR-FITC 0.0
FITC：代表异硫氰酸荧光素标记；PE：代表藻红蛋白标记。
由表1，图1所见，细胞高表达CD90、CD105，但不表达CD45、HLA-DR，符合人脐带间充质干细胞的表面标志特征。
2、细胞因子浓缩液中的细胞因子含量测定
用ELISA试剂盒对表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)为代表的细胞因子进行检测，试验中对3根脐带分别分离所得的培养上清液、10根混合脐带培养所得培养上清液进行细胞因子含量测定。
再对混合脐带培养所得上清液采用3000D滤膜与采用1000D与50KD联合超滤后进行含量比较，以及回收率检测。
试验均取5L细胞培养上清液，用0.22μm滤膜过滤后进行超滤，直至浓缩液为250ml为止取样进行含量的测定后比较。
检测结果见表2。
表2细胞因子含量对比
由表2可见，与现有方法相比，本发明联合滤膜超滤法得到的细胞培养上清液的细胞因子含量均较高，回收率高，尤其是EGF的回收率可从80.5％提高到91.5％；FGF的回收率可从87.9％提高到94.5％。
脐带间充质干细胞因子具有美容护肤功效，其回收率越高，美容护肤效果越好。本发明方法可以显著提高细胞因子的回收率，与现有方法相比，用于美容护肤优势明显。
而且发明中采用混合脐带得到细胞培养上清液，所得到的培养上清液中细胞因子量稳定，利于工业化生产质量控制。
实施例2本发明间充质干细胞因子的制备
1、取实施例1制备得到的细胞因子浓缩液，通过反复超滤调整细胞因子浓缩液浓度，使浓缩液中EGF含量为0.4ug/ml。
2、在细胞因子浓缩液中加入一定量的冻干保护剂，使EGF的含量为0.3ug/ml，并调节pH值为6.0。
其中，冻干保护剂每100ml中含有如下组分：抗坏血酸(VC)0.5g，人白蛋白0.5ml,右旋糖苷3.5g、海藻糖1.5g，甘氨酸0.04g、精氨酸0.17g、氨基乙酸2g、柠檬酸钠0.26g、叔丁醇15ml。
冻干条件为：温度在-25～-40℃，压强维持在10-30pa，时间为16-24h，得到细胞因子冻干粉。
3、细胞因子冻干粉的活性测定
采用EGF ELISA试剂盒测定，EGF的活性为95％。
细胞因子冻干粉水分经测定小于1.5％。
本发明的冻干保护剂可以有效保护细胞因子的活性，而且冻干时间短，生产效率较高。
实施例3本发明细胞因子化妆品或药物的制备
取实施例2制备的细胞因子冻干粉，加入透明质酸、胶原蛋白、无菌超纯水制成组合物，该组合物可以加入到常规护肤品中，也可单独作为护肤品使用。
其中100ml水溶液中含细胞因子冻干粉1.0g，低分子量(3000D-10KD)透明质酸0.5g，胶原蛋白无菌溶液2ml，水溶性氮酮5g。
实施例4本发明细胞因子化妆品或药物的制备
取实施例2制备的细胞因子冻干粉，加入透明质酸、胶原蛋白、无菌超纯水制成组合物。
其中10ml水溶液中含细胞因子冻干粉0.1g，低分子量(3000D-10KD)透明质酸0.05g，胶原蛋白无菌溶液0.2ml。
实施例5本发明细胞因子化妆品或药物的制备
取实施例2制备的细胞因子冻干粉，加入透明质酸、胶原蛋白、无菌超纯水制成组合物。
其中10ml水溶液中含细胞因子冻干粉0.05g，低分子量(3000D-10KD)透明质酸0.01g，胶原蛋白无菌溶液0.5ml。
实施例6本发明细胞因子化妆品或药物的制备
取实施例2制备的细胞因子冻干粉，加入透明质酸、胶原蛋白、无菌超纯水制成组合物。
其中10ml水溶液中含细胞因子冻干粉0.15g，低分子量(3000D-10KD)透明质酸0.1g，胶原蛋白无菌溶液0.1ml。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。
试验例1本发明间充质干细胞因子的冻干保护剂筛选
一、试验方法
1、取实施例1制备得到的细胞因子浓缩液，通过超滤调整浓度，使浓缩 液中EGF含量为0.4ug/ml。
2、在细胞因子浓缩液中加入一定量的冻干保护剂，使EGF的含量为0.3ug/ml，并调节pH值为6.0。冻干保护剂配方分别如下所示：
配方1：100ml中含有如下组分：抗坏血酸0.5g，人白蛋白0.5ml,右旋糖苷3.5g、海藻糖1.5g，甘氨酸0.04g、精氨酸0.17g、氨基乙酸2g、柠檬酸钠0.26g、叔丁醇15ml。
配方2：100ml中含有如下组分：抗坏血酸(VC)0.5g，人白蛋白0.5ml,右旋糖苷3.5g、海藻糖1.5g，甘氨酸0.04g、精氨酸0.17g、氨基乙酸2g、柠檬酸钠0.26g。
3、在压强为10～30pa，-25～-40℃下进行冻干。
二、试验结果
见表3。
表3两种冻干保护剂比较
组分 冻干时间 冻干粉所含水分(n＝3)
配方1 18h 1.3％
配方2 30h 1.6％
由表3可见，使用本发明冻干保护剂配方(配方1)可以显著降低冻干所需要的时间，而且冻干粉中水分含量低，使冻干粉更易于保存。
因此，本发明的冻干保护剂用于冻干时效果好，具有显著优势。
试验例2本发明间充质干细胞因子的应用
一、方法
选取体重2公斤左右日本大耳白兔30只，雌雄各半。经脱毛、局麻后，用波长1064nm激光、光斑直径3mm、能量密度12J/cm2、光皮距离7cm、时间30秒照射家兔背部，造成深达真皮的损伤。然后将家兔分为5组，每组6只。
第1组为模型对照组：只照激光不加药处理；
第2组为成纤维细胞生长因子(FGF)阳性对照组：将成纤维细胞生长
因子均匀喷于创面，用量为85IU/cm2/d，每日处理一次；
第3组为护肤品涂抹组：涂抹实施例3方法制备的护肤品16mg/cm2/d，
每日处理一次；
第4组为微针注射液组：微针注射实施例4方法制备的组合物20μL/cm2/d，每日处理一次；
第5组为空白对照组，不照激光不加药处理。
在第3、6、9、12天，肉眼观察创面脱痂时间和愈合时间，取皮肤组织做病理HE染色，并在以上各时间点检测白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和羟脯氨酸(HYP)。
二、结果
见表4-9和图2-5。
表4各组脱痂时间比较(天)
组号 组别 动物数 x±sd
1 模型对照 6 8.55±1.68
2 成纤维细胞生长因子 6 5.54±0.75*
3 冻干细胞因子护肤品涂抹 6 5.96±0.23*
4 冻干细胞因子微针注射 6 5.85±0.84*
与模型对照组相比，＊P<0.01。
由表4可见，与模型对照组相比，处理组2-4组的脱痂时间均显著降低(p<0.01)，其中含有间充质干细胞因子的受试组(第3组和第4组)与成纤维细胞生长因子阳性对照组没有显著性差异(P>0.05)，脱痂效果相当。
因此，使用本发明间充质干细胞因子可以显著促进受损皮肤的脱痂修复。
表5各组愈合时间比较(天)
组号 组别 动物数 x±sd
1 模型对照 6 13.05±0.76
2 成纤维细胞生长因子 6 8.78±0.80*
3 冻干细胞因子护肤品涂抹 6 9.45±2.04*
4 冻干细胞因子微针注射 6 9.34±1.86*
与模型对照组相比，＊P<0.01。
由表5可见，与模型对照组相比，处理组2-4组的愈合时间均显著降低(p<0.01)；其中含有间充质干细胞因子的受试组(第3组和第4组)与成纤维细胞生长因子阳性对照组没有显著性差异(P>0.05)，愈合时间相当 (P>0.05)。
因此，使用本发明间充质干细胞因子可以显著促进受损皮肤的愈合。
表6各组白介素IL-6浓度比较(ng/ml)
组号 组别 动物数 x±sd
1 模型对照 6 2428±293
2 成纤维细胞生长因子 6 1277±405*
3 冻干细胞因子护肤品涂抹 6 1099±672*
4 冻干细胞因子微针注射 6 1027±290*
5 空白对照 6 813±597*
与模型对照组相比，＊P<0.01。
表7各组TNF-α积分光密度比较(×108)
组号 组别 动物数 x±sd
1 模型对照 6 0.58±0.11
2 成纤维细胞生长因子 6 2.46±0.41**#
3 冻干细胞因子护肤品涂抹 6 1.49±0.61**
4 冻干细胞因子微针注射 6 2.30±0.37**#
5 空白对照 6 0.15±0.01#
与模型对照组相比，＊P<0.05，＊＊P<0.01；与冻干细胞因子护肤品涂抹组相比，#P<0.01。
表8各组SDH比活性比较(U/mg蛋白)
组号 组别 动物数 x±sd
1 模型对照 6 0.15±0.05
2 成纤维细胞生长因子 6 0.41±0.05*
3 冻干细胞因子护肤品涂抹 6 0.32±0.06*
4 冻干细胞因子微针注射 6 0.34±0.05*
5 空白对照 6 0.41±0.14*
与模型对照组相比，＊P<0.01。
表9各组HYP浓度比较(μg/mg)
组号 组别 动物数 x±sd
1 模型对照 6 3.73±0.95
2 成纤维细胞生长因子 6 6.55±1.41**
3 冻干细胞因子护肤品涂抹 6 4.93±0.77*
4 冻干细胞因子微针注射 6 5.66±0.41*
5 空白对照 6 6.61±0.36**
与模型对照组相比，＊P<0.05，＊＊P<0.01。
由表6-9可见，
与模型对照组相比，处理组2-4组的IL-6含量均显著降低(p<0.01)，其中含有间充质干细胞因子的受试组(第3组和第4组)与成纤维细胞生长因子组、空白对照组的IL-6含量相当。
处理组2-4组的TNF-α含量均显著提高(p<0.01)，其中第4组(微针注射液组)与成纤维细胞生长因子组、空白对照组的TNF-α含量相当，均高于冻干因子护肤品涂抹组。
处理组2-4组的SDH含量均显著提高(p<0.01)，其中含有间充质干细胞因子的受试组(第3组和第4组)与成纤维细胞生长因子阳性对照组、空白对照组的SDH含量相当。
处理组2-4组的HYP含量均显著提高(p<0.05)，其中第4组(微针注射液组)与成纤维细胞生长因子组、空白对照组的HYP含量相当，均高于冻干因子护肤品涂抹组。
因此，本发明的间充质干细胞因子能够促进TNF-α的合成和释放，减少IL-6的分泌，减轻局部创面炎症反应；提高创面细胞SDH活性，加快HYP合成，从而促进创面愈合。本发明的间充质干细胞因子可以显著修复皮肤损伤。
综上，本发明方法制备的间充质干细胞因子，细胞因子回收率高，质量稳定，修复皮肤损伤效果好；而且本发明方法简单易行、适合大规模生产，具有良好的市场前景。

Claims (10)

1.一种分离人源间充质干细胞因子的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、细胞培养上清液的获取：取人间充质干细胞，置于间充质干细胞无血清培养基中培养，当细胞生长到汇合度75～85%时，收集上清液；
b、过滤浓缩：对步骤a的上清液先采用0.22µm滤膜过滤；然后通过50KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过1KD超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液,即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤a中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；
所述脐带间充质干细胞的制备方法为：取脐带，在无菌条件下，采用组织块法培养得到；所述取脐带为取5-10根脐带混合。
3.权利要求1或2所述方法制备得到的细胞因子浓缩液。
4.一种人源间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤如下：取权利要求3所述的细胞因子浓缩液，冻干，得人源间充质干细胞因子冻干粉。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
冻干前，先加入冻干保护剂；其中，所述冻干保护剂每100ml中含有如下组分：抗坏血酸0.3～0.8g，人白蛋白0.1～1ml,右旋糖苷2.5～4.0g、海藻糖1～2g，甘氨酸0.02～0.08g、精氨酸0.05～0.17g、氨基乙酸2g、柠檬酸钠0.26g、叔丁醇10～20ml；
所述冻干的条件为：压强为10～30pa，-25～-40℃下，16～24h。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述冻干保护剂每100ml中含有如下组分：抗坏血酸 0.5g，人白蛋白0.5ml,右旋糖苷3.5g、海藻糖1.5g，甘氨酸0.04g、精氨酸0.17g、氨基乙酸2g、柠檬酸钠0.26g、叔丁醇15ml。
7.权利要求5所述方法制备得到的人源间充质干细胞因子冻干粉。
8.权利要求3所述细胞因子浓缩液或权利要求7所述细胞因子冻干粉在制备修复皮肤损伤的药物中的用途。
9.一种细胞因子药物，其特征在于：每100ml药物中包含权利要求7所述的间充质干细胞因子冻干粉0.5～1.5g，透明质酸0.1～1g，胶原蛋白1～5ml。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于：每100ml药物中包含间充质干细胞因子冻干粉1g，透明质酸0.5g，胶原蛋白2ml；所述透明质酸为分子量为3000D-10KD的透明质酸。
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