CN113384517B - 干细胞细胞因子的制备方法及其在制备药物或化妆品中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞细胞因子的制备方法及其在制备药物或化妆品中的用途。本发明提供了表皮干细胞高表达细胞因子的方法以及制备获得了特异性抑制酪氨酸酶的单克隆抗体，所述细胞因子能够促进成纤维细胞的增殖有利于皮肤的修复，所述单抗能够抑制黑色素瘤细胞的增殖，同时细胞因子和单抗一起能够降低黑色素的分泌，具有较好的美白应用效果。

Description

干细胞细胞因子的制备方法及其在制备药物或化妆品中的 用途

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的涉及干细胞细胞因子的制备方法及其在制备药物或化妆品中的用途。

背景技术

细胞因子是指一类由免疫细胞和相关细胞产生、分泌的高活性多功能小分子蛋白，不包括免疫球蛋白、补体和一般生理性细胞产物，具有很高的免疫调节活性。目前已发现的细胞因子已有百余种，主要包括干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、转化生长因子、神经生长因子等。细胞因子在机体免疫应答、抗病毒、抗肿瘤及炎症反应中发挥着重要作用，其不仅在疾病治疗上起着重要作用，而且是抵抗感染必不可少的物质。

细胞因子在人体内含量极少，但生物活性极高，具有很多重要的生物学效应和生理功能。它们与皮肤细胞的生长、分裂、分化、增殖和迁移有关，可以有效地与皮肤细胞发生作用，发挥突出的美容护肤功效。现有技术中已经研究了EGF(表皮生长因子)、aFGF(酸性成纤维细胞生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、KGF(角质细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)等细胞因子在美容化妆品中的应用。

EGF在体内能促进机体表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞的生长、分裂和新陈代谢，促进微血管的生长，改善细胞生长的微环境。因此它对受损皮肤、敏感皮肤、创伤皮肤以及改建性皮肤具有良好的修复、护理作用，特别是对目前美容院中流行的换肤术后局部受损皮肤的修复，还能预防术后并发症的发生。EGF还能刺激肉芽组织的形成和促进肉芽组织的上皮化，还可调节胶原降解及更新，使胶原纤维以线性方式排列，防止结缔组织异常增生，故而有缩短创伤愈合时间以及减少疤痕形成的作用，对防止和护理痤疮也有很好的效果。aFGF是一种作用极强的有丝分裂原，对来源于中胚层和神经外胚层的多种细胞具有促进分裂的作用，可用于创伤、烧伤、溃疡等的治疗。bFGF在美容中的作用可以表现在以下几个方面：1).护肤、修复作用。bFGF能够改善细胞生长的微环境，促进弹性纤维和胶原蛋白的合成，使肌肤富有弹性，使皮肤处于滑嫩的状态。2).抗皱、防衰老作用。能够促进成纤维细胞的生长发育，不断以新的细胞取代老化细胞，因此产生防皱、祛皱作用。

已有研究也分离制备了细胞因子。比如CN105543313B公开了一种分离纯化人源间充质干细胞因子的方法，它包括如下步骤：a、细胞培养上清液的获取：取人间充质干细胞，置于间充质干细胞无血清培养基中培养，当细胞生长到汇合度75～85％时，收集上清液；b、过滤浓缩：对步骤a的上清液先采用0.22μm滤膜过滤；然后通过50KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过1KD超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液。CN106701672B公开人源脂肪间充质干细胞因子的培养方法，它包括如下步骤：取人脂肪间充质干细胞，置于高辅酶无血清培养基中，培养至细胞汇合度75～85％时，收集上清液即得。

但是现有技术分离制备细胞因子的方法还不够多，制备较好的含有所述细胞因子的化妆品种类还不够多。

发明内容

本发明针对现有技术提供了技术改进，提供了一种优化的细胞因子的制备方法。

具体的，本发明提供一种干细胞细胞因子的制备方法，所述方法包括如下步骤：将表皮干细胞置于细胞培养基进行传代培养，细胞培养基为89％DMEM+10％FBS+1％双抗的干细胞培养基，培养条件为37℃，5％CO₂培养；取生长良好的干细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/mL接种于6孔板，待细胞贴壁后换液添加了50ng·mL-¹促分泌肽SEQ ID NO：1的完全培养基，培养48h其中培养是在3％O₂+5％CO₂+92％N₂条件下进行，收集细胞上清液，将上清液用1KD超滤膜超滤，去除分子量1000以下的小分子杂质，收集截留液即获得细胞因子组合物。

所述促分泌肽是发明人前期分离的能够促进干细胞增殖的小肽，所述小肽能够促进细胞因子的增强分泌。

另外，一方面，本发明提供一种抗体，或其抗原结合片段，包括：重链可变结构域(VH)包括与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列：和/或轻链可变结构域(VL)包括与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少约80％同源性的氨基酸序列。

一方面，本公开提供包含权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段的药物组合物；和至少一种药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，所述药物组合物还包含至少一种另外的治疗剂。

一方面，本公开提供了一种抑制黑色素瘤细胞增殖的方法，该方法包括给予有需要的受试者有效量的示例性药物组合物，其中抑制癌细胞的增殖。

在某些实施方案中，本公开提供了治疗受试者癌症的方法。该方法包括给予有此需要的受试者有效量的本文所述的示例性抗体。

另外一方面，本发明还提供一种美白化妆品，所述化妆品含有细胞因子和所述单克隆抗体。

本文所用的皮肤美白组分可包含可改善由黑色素色素沉着所损伤的皮肤区域的美白组分，例如衍生自天然物质如动物，植物和矿物质，氨基酸，激素和维生素的提取物，但本发明不限于此。例如，所述组分可以是一种或多种选自氢醌基化合物；维生素如烟酰胺和维生素C及其衍生物；类黄酮化合物如莫司汀和橙皮苷；白藜芦醇化合物及其衍生物；姜黄素衍生物；基于氨基酸的化合物，例如谷胱甘肽和十一碳烯酸甲酯；熊果苷，曲酸，壬二酸，-羟基酸，-没药醇，腺苷，抗坏血酸葡糖苷，抗坏血酸四异棕榈酸酯，乙基抗坏血酸基醚，富勒烯，乙酰酪氨酸，二乙酰苯甲酰山梨醇，苍术油，抗坏血酸磷酸镁，薯蓣甲素，肉豆蔻木脂素，乙酰鞘氨醇，二羟基甲氧基查耳酮，-没药醇，原儿茶醛，谷维素，甘草提取物，一种构树提取物，一种绿茶提取物，一种桑白皮提取物，一种ADLAY提取物，酵母提取物，一种白术提取物，一种小麦胚芽提取物，一种芍药提取物，一种紫草根提取物，一种人参提取物，一种红参提取物，一种三白草提取物，仙鹤草提取物，美人蕉根提取物，SASA QUELPAERTENSIS提取物，苦参根提取物，薏苡仁提取物，樱桃果实提取物，壳聚糖，聚赖氨酸，葡糖胺及其衍生物，但本发明并不限于此。

根据本发明的用于皮肤美白的化妆品组合物可以包括具有官能团的皮肤美白组分，因此可以用于皮肤美白的化妆品组合物的制剂中。皮肤产品的例子可以包括，通常，用于光滑和保护皮肤的护肤品(调色剂，血清，香精，洗剂，奶油，等)，彩色化妆品(化妆品基料，粉底，粉末，眼影，唇彩，唇膏，唇膏等)，清洁化妆品(泡沫清洁剂，清洁油，清洁洗液，清洁霜，清洁凝胶，面膜，肥皂，清洁巾等)，防晒化妆品，身体化妆品(身体洗液，沐浴露，身体霜，身体油等)。

在一些实施例中，药物组合物是胶囊，片剂，乳液和水性悬浮液，水分散物和水溶液等(但不限于这些)，可以任意口服可以以能的形式口服。

在一些实施例中，药物组合物是片剂。

在一些实施例中，药物组合物还含有赋形剂。赋形剂，例如微晶蜡，乳糖，甘露醇，乙基纤维素，山梨糖，淀粉，苏纤维素，磷酸钙，粉末状纤维素，硅化微晶纤维素，异马氏体或其混合物。在一些实施例中，赋形剂是微晶的是纤维素。

有益效果

本发明提供了表皮干细胞高表达细胞因子的方法以及制备获得了特异性抑制酪氨酸酶的单克隆抗体，所述细胞因子能够促进成纤维细胞的增殖有利于皮肤的修复，所述单抗能够抑制黑色素瘤细胞的增殖，同时细胞因子和单抗一起能够降低黑色素的分泌，具有较好的美白应用效果。

附图说明

图1促分泌肽促进细胞因子效果图

图2细胞因子促进成纤维细胞细胞增长结果图

图3肿瘤抑制率结果图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：下述实施例中所用材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径获得。

实施例1表皮干细胞的分离与培养鉴定

无菌条件下去除包皮皮片皮下脂肪层，用含青霉素、链霉素的PBS反复冲洗皮片3次，修建为大小0.2cm*0.2cm小碎块，中性蛋白酶4℃消化18h，吸弃上清，分离表皮和真皮层。剪碎表皮，使用0.25％的胰蛋白酶37℃消化15min，加入含有10％小牛血清的DMEM终止消化，吹打悬浮用200目筛网过滤。滤液经离心1000r/min 5min收集细胞。弃上清，加入K-SFM并轻柔吹打制成单细胞悬液。接种于预先铺有IV型胶原的培养瓶中，37℃孵育，黏附在IV型胶原被膜上的细胞主要为表皮干细胞，吸出细胞悬液，加入K-SFM，置于37℃，5％CO₂，置于培养箱中继续培养，每2天换液1次，当细胞接近80％融合时，0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化培养瓶内细胞，按照1:1.5传代。

取培养的细胞，PBS冲洗3次，4％多聚甲醛室温固定30min，二步免疫组化检测法分别进行细胞K19和β1整合素免疫细胞化学染色。结果显示，β1整合素、K19免疫细胞化学染色均在细胞胞浆内出现，呈棕黄色着色的阳性表达。β1和K19是表皮干细胞的标志物之一，二者高表达，表明分离得到的是表皮干细胞。

实施例2表皮干细胞细胞因子的制备

将实施例1制备的表皮干细胞置于细胞培养基进行传代培养，细胞培养基为89％DMEM+10％FBS+1％双抗的干细胞培养基，培养条件为37℃，5％CO₂培养；

取生长良好的干细胞，调整细胞浓度为1X10⁶/mL接种于6孔板，待细胞贴壁后换液，实验组分别加入含0，1，10，50mg·L-¹促分泌肽(SEQ ID NO：1)的完全培养基，对照组只加完全培养基，培养48h(其中50mg·L-¹促分泌肽培养进一步分为0％O₂+5％CO₂+94N₂和3％O₂+5％CO₂+92％N₂)后，收集各组细胞上清液，将上述两种培养上清液用1KD超滤膜超滤，去除分子量1000以下的小分子杂质，收集截留液待用。

用PBS洗细胞3次，采用Trizol法提取总RNA。PCR扩增鉴定肝细胞生长因子(HGF)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)的相对表达量。引物序列见表1。

表1引物组

结果如图1所示。

从图1的结果可以看出，采用50mg·L-¹促分泌肽能够显著的促进几种细胞因子的分泌。而且，从结果来看，对MMP-1和VEGF的促进效果更加明显。另外，在培养的过程中，添加3％的O₂能够进一步的促进细胞因子的分泌，从图中可以看出，添加了3％O₂的效果要好于O₂。因此，细胞因子的制备采用添加了50mg·L-¹促分泌肽在3％O₂的条件下培养制备。

实施例3成纤维细胞促增殖实验

将对数生长期的成纤维细胞(来源于赛业(苏州)生物科技有限公司，产品货号:HXXFB-00001)用无血清培养基DMEM+丙酮酸钠+青链霉素混合液，调整细胞浓度为4000个/200μl，到96孔板，细胞接种量为4000个/200μl/孔，将细胞因子提取物按照不同浓度(0％，0.2％，0.4％，0.6％，0.8％，1％)加到各孔中，设置三复孔，加培养基后培养箱孵育72h观测，加入CCK-8溶液继续培养2h，酶标仪测定细胞于波长450nm处的吸光度值(OD值)，以0％孔为对照孔，计算细胞增殖活性增加百分率。计算公式：(OD实验孔-OD对照孔)/OD对照孔。

结果如图2所示，添加细胞因子提取物后，成纤维细胞细胞增长率明显提高，随着细胞因子浓度增加，促增殖率逐步提高。

实施例4细胞因子对黑色素合成的抑制效果检测

将B16黑色素细胞以1×10⁵个/mL的密度接种于3个6孔板。每孔3mL,置37℃含5％CO₂孵箱中孵育24h后,弃上清液,添加待测细胞因子,每浓度3个孔,最终的细胞因子质量浓度分别为50mg/L、10mg/L、1mg/L、0mg/L。细胞因子作用3d后,弃上清液,PBS洗涤,每孔加入015mL胰酶消化细胞3min,每孔加2mL维持液终止消化。吹打混匀后,每种浓度取出0.1mL做细胞计数。其余细胞悬液以1500r/min离心10min,弃上清液,加入200μL蒸馏水和体积比为1∶1的乙醇、乙醚混合液(除去一些不透明物质),摇匀,室温放置15min,3000r/min离心5min。弃上清液,于沉淀中加入1mL含10％(质量分数)DMSO的1mol/LNaOH水溶液。80℃加热30min(具塞),选择490nm波长在酶联免疫检测仪上测吸光度值。黑色素细胞生长率＝(药物孔细胞密度÷对照孔细胞密度)×100％,黑色素合成抑制率＝[1-(药物孔吸光度值÷药物孔细胞密度)÷(对照孔吸光度值÷对照孔细胞密度)]×100％。

表2黑色素抑制率

细胞因子浓度(mg/L)	黑色素抑制率(％)
		0	0
1	20.11±1.43
		10	42.17±2.59
50	53.42±3.41

从表2的实验结果表明:细胞因子对黑色素合成的抑制效果明显，50mg/L的抑制效果可以达到了(53.42±3.41)％，抑制作用明显,浓度增加,抑制作用增加。

实施例4抑制酪氨酸酶的单抗的制备

以酪氨酸酶蛋白(KL238Po01，KALANG)作为免疫原，采用常规的杂交瘤单克隆抗体制备方法，制备获得了TYR单克隆抗体2D4.经过序列鉴定，所述单抗的轻重链可变区序列如下所示。

轻链可变区(SEQ ID NO：2)

DIVITQRPALMAASPGEKVTITCWYAMSGLTMREQWYQQKSGISPKPWIYDDETMHCGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCPHISMFDRDFGAGTKLELK

重链可变区(SEQ ID NO：3)

EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSSVCPKWIKQRPGQGLEWIGWSITECSYEKSLRWQAGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGKLHHFSGWGLGTTLAVSS

该单抗具有较好的特异性，只结合TYR蛋白，不与其他蛋白结合。并且其解离常数达到11.4nM，具有较好的结合效果。

实施例5黑色素瘤小鼠模型的制备及相应的实验

A375人黑色素瘤细胞株培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中(含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)，于37℃、体积分数为5％的CO₂孵箱中培养。约长满至80％-90％时收取细胞并计数，使用无血清的DMEM将细胞浓度调整为2×10⁶/mL，2×10⁵/只，接种于C57BL/6小鼠右侧腋窝皮下成瘤。种瘤第3天，待肿瘤体积长至100mm³时，将小鼠随机分成5组：盐水组(200μL/次，第0、3、6、9天，腹腔注射)，细胞因子组(200μg/只，第0、3、6、9、12、15天，腹腔注射)，卡博替尼对照组(15mg/kg/d，第0、3、6、9天，腹腔注射)，2D4单抗组(10mg/kg/d，第0、3、6、9天，腹腔注射)，2D4单抗(10mg/kg/d，第0、3、6、9天，腹腔注射)联合细胞因子组(200μg/只，第0、3、6、9、12、15天，腹腔注射)。第0d测量肿瘤体积，第21d天测肿瘤体积。肿瘤体积(V)＝a×b2/2(a为长径，b为短径)。采用本领域常规的肿瘤抑制率计算方法，计算肿瘤抑制率，结果如图3所示。

从图3的结果可以看出，采用细胞因子和2D4单抗联合使用，可以显著的提高肿瘤的抑制率，达到了96.1±2.56％。比对照卡博替尼的抑制效果要好，也比单独使用细胞因子和单抗的效果要好。

实施例6安全性检测

参照中国药典附录异常毒性检查法，取5只小白鼠，体质量在20g左右。试验小鼠应健康无伤，毛色光亮，活泼，雌鼠无孕。称量每只小鼠体质量，并标记。称量前小鼠饱腹。腹腔注射：一手握小鼠，用拇指与食指捏住小鼠背部，无名指及小指固定小鼠后肢和尾，腹部向上，注射器针头由小鼠腹部左侧皮下刺入，并使针头在皮下平行穿过腹部中线后，进入右侧腹腔，缓慢注入0.1g单抗和细胞因子的组合物。注射完毕后观察即时反应，并记录4h、24h、48h动物的状态、毒性表现和死亡数量。

试验动物反应指标详见表3。

表3试验动物异常毒性反应指标

结果详见表4。

表4异常毒性检查结果

小鼠编号	1	2	3	4	5
						体重量	34.2g	35.1g	35.7g	34.9g	35.8g
反应症状	无	无	无	无	无

由表4可见，该单抗和细胞因子异常毒性的限值符合规定。具有较好的安全性。

应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津汉青生物科技有限公司

<120> 干细胞细胞因子的制备方法及其在制备药物或化妆品中的用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His Gly Ser Val Asp Cys Leu Ser Ala Thr Cys Trp Ile Trp Glu Ser

1 5 10 15

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Val Ile Thr Gln Arg Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Ala Met Ser Gly Leu Thr Met

20 25 30

Arg Glu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Asp Asp Glu Thr Met His Cys Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Pro His Ile Ser Met Phe Asp

85 90 95

Arg Asp Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 3

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Ala Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Ser Val

20 25 30

Cys Pro Lys Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ser Ile Thr Glu Cys Ser Tyr Glu Lys Ser Leu Arg Trp Gln

50 55 60

Ala Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Lys Leu His His Phe Ser Gly Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Ala Val Ser Ser

115

Claims (4)

1.细胞因子和单克隆抗体在制备抑制黑色素瘤的药物组合物中的用途；其中，细胞因子是采用如下方法制备：将表皮干细胞置于细胞培养基进行传代培养，细胞培养基为89％DMEM+10％FBS+1％双抗的干细胞培养基，培养条件为37℃，5％CO₂培养；取生长良好的干细胞，调整细胞浓度为1X10⁶/mL接种于6孔板，待细胞贴壁后使用添加了50ng·mL^{- 1}促分泌肽的完全培养基进行换液，所述促分泌肽序列如SEQ ID NO：1所示；培养48 h，其中培养是在3%O₂+5%CO₂+92%N₂条件下进行，收集细胞上清液，将上清液用1KD 超滤膜超滤，去除分子量1000 以下的小分子杂质，收集截留液即获得细胞因子；

所述单克隆抗体为特异性抑制酪氨酸酶的单抗：所述抗体的轻链可变区和重链可变区分别如下所示：

轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示：

DIVITQRPALMAASPGEKVTITCWYAMSGLTMREQWYQQKSGISPKPWIYDDETMHCGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCPHISMFDRDFGAGTKLELK；

重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示：

EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSSVCPKWIKQRPGQGLEWIGWSITECSYEKSLRWQAGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGKLHHFSGWGLGTTLAVSS。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述药物组合物中进一步的含有至少一种药学上可接受的载体。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述药物组合物中还包含赋形剂。

4.细胞因子和单克隆抗体在制备美白化妆品的用途；所述化妆品中含有细胞因子和单克隆抗体，其中，细胞因子是采用如下方法制备：将表皮干细胞置于细胞培养基进行传代培养，细胞培养基为89％DMEM+10％FBS+1％双抗的干细胞培养基，培养条件为37℃，5％CO₂培养；取生长良好的干细胞，调整细胞浓度为1X10⁶/mL接种于6孔板，待细胞贴壁后使用添加了50ng·mL^{- 1}促分泌肽的完全培养基进行换液，所述促分泌肽序列如SEQ ID NO：1所示；培养48 h，其中培养是在3%O₂+5%CO₂+92%N₂条件下进行，收集细胞上清液，将上清液用1KD 超滤膜超滤，去除分子量1000 以下的小分子杂质，收集截留液即获得细胞因子；

所述单克隆抗体为特异性抑制酪氨酸酶的单抗：所述抗体的轻链可变区和重链可变区分别如下所示：

轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示：

DIVITQRPALMAASPGEKVTITCWYAMSGLTMREQWYQQKSGISPKPWIYDDETMHCGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCPHISMFDRDFGAGTKLELK；

重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示：

EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSSVCPKWIKQRPGQGLEWIGWSITECSYEKSLRWQAGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGKLHHFSGWGLGTTLAVSS。

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