CN105296419A - 促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用，经过原培养基培养、无血清培养基培养、离心浓缩、添加Exoquick-TC试剂、孵育过夜、离心、重悬、过滤，制得多因子载体exosome。本发明制备的exosome与脂肪干细胞无关，无任何细胞成分，便于运输和储存；应用离心结合试剂提取的方法得到的exosome产量更高，纯度更好，可以在冰箱中长期保存，可以作为细胞治疗的有效替代品，具有极佳的临床应用价值。

Description

促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用

技术领域

本发明涉及皮肤创伤修复的技术领域，尤其涉及一种促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞的多因子载体exosome的制备，本发明还涉及这种多因子载体制成的溶剂或针剂，以及这种多因子载体和溶剂或针剂的应用。

背景技术

皮肤软组织损伤是日常生活中常见的一种创伤；目前常用的皮肤软组织损伤治疗主要是通过全身支持治疗，创面的清理以及新型敷料和皮肤移植等方法，传统的治疗方法虽然有一定的效果但愈合时间快慢难于把握，瘢痕大小，皮源紧张和易感染的问题有待解决。

近年来，以干细胞特别是以间充质干细胞(MSC)(脂肪干细胞是间充质干细胞中的一种，相比其他间充质干细胞脂肪干细胞拥有取材方便，无伦理学限制等优势)为基础的皮肤再生医学研究得到广泛关注，研究表明MSC对组织损伤有良好的修复作用，尽管其机制尚未完全阐明，但初步结果显示可能与损伤的刺激及局部创面微环境中各种细胞因子有关，它们通过促进MSC趋化以及诱导MSC向所需要的组织或细胞分化来参与损伤组织的修复，因此在组织的修复中具有临床应用前景。然而，MSC植入体内后存在长期应用安全性问题以及储存和运输困难等问题极大的限制其临床应用。

随着研究的深入发现MSC发挥组织损伤修复的一个重要机制是旁分泌效应，在促进创面愈合过程中比细胞转分化起的作用更大。其旁分泌中最有效的活性成分是MSC分泌的exosome，在细胞信息传递中起着非常重要的作用，这一机制的提出为基于各种来源MSC的非细胞治疗奠定了重要基础。

微囊泡结构exosome是近年来发现的细胞间信号通讯的重要途径，通过细胞外多胞体(MBV)分泌到胞外，是细胞可溶性细胞因子外的重要旁分泌形式，exosome的特征主要有：(1)直径为30-100nm；(2)具有来源细胞的胞质和脂质膜成分；(3)含有来源细胞特异性蛋白以及相关蛋白如CD63，CD9，CD81等。exosome成分主要包括：microRNA、mRNA，蛋白等，研究表明不同来源的exosome的组成亦有差异，说明其功能的复杂性。由此可见，作为非细胞治疗的重要成分，exosome在促进皮肤损伤修复中具有重要作用。MSC分泌的exosome与MSC相比具有许多优势：(1)exosome通过细胞内吞作用摄入细胞，可以避免一些大分子(如蛋白质，RNA)因细胞膜通道阻挡而不易被细胞吸收的问题，具有生物活性高，作用效率高的优点；(2)exosome在-80℃长期稳定保存，携带的含有生物活性的有效成分受exosome脂质膜保护，不易被破坏，且便于运输和储存；(3)易于掌握临床应用时间，亦易于控制使用浓度、剂量及途径；(4)克服了MSC在体内存活率低及长期应用突变致瘤的潜在隐患；(5)由于其体积小避免了强烈的免疫排斥等并发症。

因此，MSC来源的exosome在组织损伤修复中的作用及机制研究就显得特别重要，特别是将脂肪干细胞分泌的exosome进行提取纯化的研究更具有重要的意义。

发明内容

针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用。

为实现上述目的，本发明公开了促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌多因子载体exosome的制备方法，该方法包括：

步骤一、取处于对数生长期的第三代到第六代的人脂肪干细胞，待细胞融合至80％后，弃去原培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗2-3遍后，换无血清培养液培养，24h后收集培养上清液；

步骤二、将步骤一中收集的上清液，在温度4℃、离心力3000g下离心15分钟，离心去除细胞碎片和悬浮细胞，离心后的上清液经0.22um孔径的无菌滤膜过滤得到脂肪干细胞条件培养液；

步骤三、将步骤二中的条件培养液放入分子量为100KDa超滤离心管中，在温度4℃、离心力1000g下离心30分钟，离心浓缩，得到含有exosome的浓缩液；

步骤四、将步骤三中的浓缩液与Exoquick-TC试剂按照5:1的体积比混合，震荡混匀后，4℃孵育过夜；

步骤五、孵育过夜后的混合液在温度4℃、离心力1500g下离心30分钟，弃去上清液保留沉淀；

步骤六、在温度4℃、离心力1500g下对沉淀离心5分钟，吸净残余液体后，用磷酸盐缓冲液重悬，经0.22um孔径的无菌滤膜过滤后-80℃保存，即得多因子载体exosome。

作为本发明的进一步改进，在步骤一中，所述原培养液内各成分的体积为：88％人脂肪干细胞专用基础培养基、10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酰胺。

作为本发明的进一步改进，在步骤一中，所述无血清培养液内各成分的体积为：98％人脂肪干细胞专用基础培养基、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酰胺。

本发明还公开了所述多基因载体exosome在促进皮肤创伤愈合中的应用。

本发明还公开了一种利用人脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome制备的溶剂或针剂，包括上述制备的多因子载体exosome；所述多因子载体溶解在磷酸盐缓冲液中制成溶剂或针剂；所述多因子载体exosome的含量与磷酸盐缓冲液的使用比例为1ug:1ul。

作为本发明的进一步改进，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2～7.4，磷酸盐缓冲液中各成分的含量为NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L。

本发明还公开了所述溶剂或针剂在促进皮肤创伤愈合中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明公开的促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用，其制备的用于治疗皮肤损伤的exosome与脂肪干细胞无关，无任何细胞成分，便于运输和储存；与目前现有的超速离心的方法相比，本发明应用离心结合试剂提取的方法得到的exosome产量更高，纯度更好，可以在冰箱中长期保存并保存活性高达1年以上，可以作为细胞治疗的有效替代品，具有极佳的临床应用价值。

附图说明

图1为本发明所述脂肪干细胞分泌的exosome的透射电镜形态学鉴定图；

图2为本发明所述脂肪干细胞分泌的exosome的标志蛋白CD63，CD9western蛋白学鉴定图；

图3A、3B为本发明所述脂肪干细胞分泌的exosome直径大小的Nanosight(纳米颗粒分析仪)鉴定图；

其中：图3A为粒子大小/浓度分布图，图3B为动态追踪视频截图；

图4A、4B为本发明皮肤成纤维细胞(FB)在不同天数不同浓度的exosome刺激下对成纤维细胞增殖速率的影响；

图5A、5B、5C为本发明中皮肤成纤维细胞(FB)在不同浓度exosome刺激下对成纤维细胞移迁速率的影响；

图6为本发明皮肤成纤维细胞(FB)在不同浓度exosome刺激72小时后对成纤维细胞中I型胶原的mRNA表达量的影响；

图7为本发明皮肤成纤维细胞(FB)在不同浓度exosome刺激72小时后对成纤维细胞中III型胶原的mRNA表达量的影响；

图8A、8B为本发明所述有脂肪层和无脂肪层创口愈合快慢以及exosome标志蛋白CD63表达情况；

图9为本发明所述脂肪干细胞分泌的exosome在小鼠皮肤创伤愈合中的体内示踪图；

图10为本发明所述脂肪干细胞分泌的exosome对小鼠皮肤创伤愈合的影响；

图11为本发明所述脂肪干细胞分泌的exosome对小鼠皮肤创口愈合快慢的直方图。

图中：

CM：培养过脂肪干细胞的条件培养液，作为本实验的一个阳性对照；*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合附图1-11对本发明做进一步的详细描述：

本发明的第一目的在于提供促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌多因子载体exosome的制备方法，该方法包括：

步骤一、取处于对数生长期的第三代到第六代的人脂肪干细胞，待细胞融合至80％后，弃去原培养液(原培养液内各成分的体积为：88％人脂肪干细胞专用基础培养基、10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酰胺)，用磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液的pH为7.2～7.4，磷酸盐缓冲液中各成分的含量为NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L)冲洗2-3遍后，换无血清培养液(无血清培养液内各成分的体积为：98％人脂肪干细胞专用基础培养基、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酰胺)培养，24h后收集培养上清液；

步骤二、将步骤一中收集的上清液，在温度4℃、离心力3000g下离心15分钟，离心去除细胞碎片和悬浮细胞，离心后的上清液经0.22um孔径的无菌滤膜过滤得到脂肪干细胞条件培养液；

步骤三、将步骤二中的条件培养液放入分子量为100KDa(厂商Millipore)超滤离心管中，在温度4℃、离心力1000g下离心30分钟，离心浓缩，得到含有exosome的浓缩液；

步骤四、将步骤三中的浓缩液与Exoquick-TC(SBI的Exoquick-TC外吐小体沉淀物试剂)试剂按照5:1的体积比混合，震荡混匀后，4℃孵育过夜；

步骤五、孵育过夜后的混合液在温度4℃、离心力1500g下离心30分钟，弃去上清液保留沉淀；

步骤六、在温度4℃、离心力1500g下对沉淀离心5分钟，吸净残余液体后，用磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液的pH为7.2～7.4，磷酸盐缓冲液中各成分的含量为NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L)重悬，经0.22um孔径的无菌滤膜过滤后-80℃保存，即得多因子载体exosome。

对制得的多因子载体exosome进行分析可知，如图1、2、3A、3B所示：

如图1可知：透射电镜显示提取的exosome符合典型的囊泡样结构，从形态学鉴定为exosome；

如图2可知：提取物表达exosome的标志蛋白CD63，CD9，符合exosome蛋白学鉴定；

如图3A、3B可知：通过nanosight可视化动态追踪exosome并对其大小直径分布的浓度进行测量发现其直径大小聚集在30-100nm大小范围内，符合exosome的形态学鉴定结果。

本发明第二目的在于提供多基因载体exosome在促进皮肤创伤愈合中的应用。

本发明第三目的在于提供一种利用人脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome制备的溶剂或针剂，采用上述方法提取的多因子载体exosome溶解在磷酸盐缓冲液中制成溶剂或针剂；多因子载体exosome的含量与磷酸盐缓冲液的使用比例为1ug:1ul；即在1ul磷酸盐缓冲液中加入1ug多因子载体exosome。

本发明第四目的在于提供溶剂或针剂在促进皮肤创伤愈合中的应用。

实施例1

脂肪干细胞分泌的exosome可以促进皮肤正常成纤维细胞的迁移增殖和对胶原合成的影响：

(1)、CCK-8增殖实验：将人成纤维细胞以2×10³接种于96孔板，3h后待细胞完全贴壁后，换无血清培养液，分别用不同浓度的exosome(0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml)以及50％培养过脂肪干细胞的条件培养液CM对细胞进行处理，每组五个复孔，连续检测五天。分别在1，2，3，4，5天取出96孔板，每孔加入10ulCCK-8溶液，37℃孵育2小时，在酶标仪下检测450nm波长的吸光度值，观察比较每孔细胞的增殖情况。结果发现，exosome随着时间的延长对其增殖有促进作用，且48h作用明显。如图4A、4B所示，图4A所示随着exosome刺激天数的增加，对成纤维细胞FB的增殖增强，且在第二天达到增殖高峰期，第三天开始进入增殖平台期；图4B所示发现在第二天增殖高峰期随着exosome刺激浓度的增加，成纤维细胞的增殖亦增强。

(2)、划痕迁移实验：将饥饿处理24小时的人成纤维细胞以1×10⁵密度接种于6孔板，4h待细胞完全贴壁后，用100ul枪头做一“+”划痕，弃去原培养液，PBS洗涤两遍后，换无血清培养液，并加入不同浓度的exosome(0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml)以及50％培养过脂肪干细胞的条件培养液CM，分别在0,6,12,24h时间点显微镜下拍照，计算细胞迁移率。结果发现exosome对FB的迁移在12h开始具有显著的促进作用。如图5A、5B、5C所示，随着exosome刺激浓度的增加，成纤维细胞的迁移能力亦增强。

(3)、RT-PCR胶原合成的影响：将细胞以1×10⁵接种于6孔板，无血清培养液饥饿处理24小时后，在培养液中加入不同浓度的exosome(0、25、50、100ug/ml),分别孵育1,2,3,4,5天后收集细胞，提取RNA，检测不同浓度刺激下，细胞中I型、III型胶原的mRNA表达量。发现exosome对I型胶原(如图6所示)、III型胶原(如图7所示)的合成有抑制作用。如图6可知，随着exosome刺激浓度的增加，I型胶原的mRNA表达量逐渐降低，说明I型胶原合成是逐渐降低的；如图7可知，随着exosome刺激浓度的增加，III型胶原的mRNA表达量逐渐降低，说明III型胶原合成是逐渐降低的。

实施例2

脂肪干细胞分泌的exosome可以归巢到皮肤创口周围参与创伤修复作用：

选取6-8周的选取6-8周龄的BALB/c雄性小鼠构建皮肤创伤模型。将小鼠麻醉后，在小鼠背部靠近尾巴(避开心脏)部位进行消毒，剃毛备皮后，做2cm×1.5cm大小的全层皮肤伤口。将建好创伤的小鼠随机分为3组：exosome实验组，染料阴性对照组，PBS阴性对照组。实验取1ml终浓度为1ug/ul的exosome悬液(exosome溶于PBS中)，向悬液中加入1ul荧光染料DIR按照的说明书对exosome进行孵育洗涤标记作为exosome实验组，取1ul荧光染料溶于1ml的PBS中作为染液阴性对照组，1mlPBS作为另一阴性对照组，所有操作均按照相同步骤避光进行。将小鼠固定，水浴加热小鼠尾巴，让血管充盈，然后三组分别取200ul液体经鼠尾静脉注射。并且在注射后第1,3,7,14,21天通过小鼠活体成像仪对其荧光分布和强度进行检测。结果表明荧光标记的exosome迁移到创口周围参与创伤愈合过程，而染料和PBS的阴性对照组则没有出现在创口周围，排除了非特异性干扰。如图9所示，发现标记的exosome通过鼠尾静脉迁移到创口周围，而作为阴性对照的染料组和PBS组则没有出现在创口周围。

实施例3

小鼠皮肤伤口的愈合修复：

(1)、选取6-8周龄的BALB/c雄性小鼠分别在其背部和腹股沟处构建皮肤创伤模型。小鼠常规处理后分别在背部和腹股沟处做1.5cm×0.5cm大小的全层皮肤创口。观察伤口愈合情况以及愈合时间，同时取创伤周围组织做HE染色，以及exosome标志蛋白CD63的免疫荧光，发现有脂肪层的创口比没有脂肪层的创口愈合快(如图8B所示)，并且有脂肪层的CD63比无脂肪层的表达明显(如图8A所示)。如图8A、8B所示，发现有脂肪层创口愈合比无脂肪层创口愈合快，且exosome标志蛋白表达明显，说明有脂肪层无脂肪层中exosome含量丰富。

(2)、选取6-8周龄的BALB/c雄性小鼠构建皮肤创伤模型。将小鼠麻醉后，对小鼠背部进行消毒、去毛，暴露皮肤，在皮肤上用无菌刀片及剪刀等器械做2cm×1.5cm大小的全层皮肤伤口。将建好创伤的小鼠随机分为2组：exosome实验组，PBS对照组。根据文献报道，我们选择的exosome的实验浓度为1ug/ul。通过鼠尾注射，每天观察不同组小鼠皮肤创伤愈合，并拍照，统计分析愈合时间快慢，发现exosome组比PBS组愈合快。如图10、11所示，如图10所示，发现脂肪干细胞来源的exosome对小鼠皮肤创伤愈合有促进作用；如图11所示，发现注射脂肪干细胞来源的exosome小鼠皮肤创伤愈合时间比阴性对照组PBS组愈合时间短。

本发明公开的促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载exosome的制备及应用，人脂肪干细胞分泌的exosome可以促进皮肤成纤维细胞的迁移和增殖，能够抑制成纤维细胞分泌I型胶原、III型胶原的mRNA表达，能够显著的促进皮肤创伤愈合减少瘢痕形成，帮助患者缩短疗程，提高美观要求，减轻痛苦；其制备的用于治疗皮肤损伤的exosome与脂肪干细胞无关，无任何细胞成分，便于运输和储存；与目前现有的超速离心的方法相比，本发明应用离心结合试剂提取的方法得到的exosome产量更高，纯度更好，可以在冰箱中长期保存并保存活性高达1年以上，可以作为细胞治疗的有效替代品，具有极佳的临床应用价值。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌多因子载体exosome的制备方法，其特征在于，该方法包括：

步骤一、取处于对数生长期的第三代到第六代的人脂肪干细胞，待细胞融合至80％后，弃去原培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗2-3遍后，换无血清培养液培养，24h后收集培养上清液；

步骤二、将步骤一中收集的上清液，在温度4℃、离心力3000g下离心15分钟，离心去除细胞碎片和悬浮细胞，离心后的上清液经0.22um孔径的无菌滤膜过滤得到脂肪干细胞条件培养液；

步骤三、将步骤二中的条件培养液放入分子量为100KDa超滤离心管中，在温度4℃、离心力1000g下离心30分钟，离心浓缩，得到含有exosome的浓缩液；

步骤四、将步骤三中的浓缩液与Exoquick-TC试剂按照5:1的体积比混合，震荡混匀后，4℃孵育过夜；

步骤五、孵育过夜后的混合液在温度4℃、离心力1500g下离心30分钟，弃去上清液保留沉淀；

步骤六、在温度4℃、离心力1500g下对沉淀离心5分钟，吸净残余液体后，用磷酸盐缓冲液重悬，经0.22um孔径的无菌滤膜过滤后-80℃保存，即得多因子载体exosome。

2.根据权利要求1所述的促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌多因子载体exosome的制备方法，其特征在于，在步骤一中，所述原培养液内各成分的体积为：88％人脂肪干细胞专用基础培养基、10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酰胺。

3.根据权利要求1所述的促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌多因子载体exosome的制备方法，其特征在于，在步骤一中，所述无血清培养液内各成分的体积为：98％人脂肪干细胞专用基础培养基、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酰胺。

4.根据权利要求1～3中任一权利要求所述的多因子载体exosome的应用，其特征在于，所述多基因载体exosome在促进皮肤创伤愈合中的应用。

5.一种利用人脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome制备的溶剂或针剂，其特征在于，包括权利要求1所述的多因子载体exosome；所述多因子载体溶解在磷酸盐缓冲液中制成溶剂或针剂；所述多因子载体exosome的含量与磷酸盐缓冲液的使用比例为1ug:1ul。

6.根据权利要求5所述的利用人脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome制备的溶剂或针剂，其特征在于，

所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2～7.4，磷酸盐缓冲液中各成分的含量为NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L。

7.根据权利要求5～6中任一项权利要求所述的溶剂或针剂的应用，其特征在于，所述溶剂或针剂在促进皮肤创伤愈合中的应用。