CN108611321A - 一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了皮肤创伤修复技术领域的一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备及应用，该制备方法的具体步骤如下：S1：取25～30岁的成年人腹部皮下脂肪组织作为人脂肪干细胞标本；S2：将分离好的脂肪组织标本移入安培瓶，用剪刀剪碎10～15min后呈乳糜状；S3：在无菌条件下从猪髂骨处抽取骨髓；S4：将步骤S2中的标本与步骤S3中的充质干细胞混合；S5：随后将塔斯品碱混入步骤S4中的混合物中；S6：过滤后的液体加入适量的干细胞培养液，于30～40°下培养3～7d，制得成品，本发明可以优化成纤维细胞的生物学性能，促进了成纤维细胞的迁移以及增殖能力，调控胶原合成，有助于缩短皮肤创伤愈合的时间，并减少瘢痕的形成，提高创伤愈合质量。

Description

一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备及应用
技术领域
本发明公开了一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备及应用，具体为皮肤创伤修复技术领域。
背景技术
皮肤软组织损伤是日常生活中常见的一种创伤，目前常用的皮肤软组织损伤治疗主要是通过全身支持治疗、创面的清理以及新型敷料和皮肤移植等方法，传统的治疗方法虽然具有一定的效果但其愈合时间的快慢难以把握，斑痕的大小、皮源紧张和易感染的问题有待解决。
近年来，以干细胞特别是以间充质干细胞为基础的皮肤再生医学研究得到广泛的关注，研究表明，间充质干细胞对组织的损伤具有良好的修复作用，尽管其机制尚未完全阐明，但初步结果显示，可能与损伤的刺激及局部创面微环境中各种细胞因子有关，它们通过促进间充质干细胞趋化以及诱导间充质干细胞向所需要的组织或细胞分化来参与皮肤创面的修复，因此，在组织的修复中具有临床应用前景。然而，间充质干细胞植入体内后存在长期应用安全性问题以及存储和运输困难等问题，极大的限制其临床应用。
微囊泡结构exosome是近年来发现的细胞间信号通讯的重要途径，通过细胞外多胞体分泌到胞外，是细胞可溶性细胞因子外的重要旁分泌形式。作为非细胞治疗的重要组成部分，exosome在促进皮肤损伤修复中具有重要的意义。现有的exosome制备工艺制出的为囊泡结构存在着长期保存过程中不稳定，且其携带的含有的生物活性的有效成分容易受到破坏。为此，我们提出了一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备及应用投入使用，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备，该制备方法的具体步骤如下：
S1：取25～30岁的成年人腹部皮下脂肪组织作为人脂肪干细胞标本，用配置好的标本液反复冲洗标本3～5次；
S2：用镊子分离脂肪标本表面的筋膜和血管，将分离好的脂肪组织标本移入安培瓶，用剪刀剪碎10～15min后呈乳糜状，放置备用；
S3：在无菌条件下从猪髂骨处抽取骨髓，经过密度梯度离心收集界面层的单个核细胞，随后用标本液冲洗2～3次，离心收集细胞，重悬于培养液中进行培养，隔日换液，弃去未贴壁的细胞，待贴壁细胞继续培养到80～90％融合时，用胰蛋白酶消化，传代培养；
S4：将步骤S2中的标本与步骤S3中的充质干细胞混合，随后用0.1～0.3％Ι型胶原酶在30～40°水浴下消化40～50min，期间不断摇匀加速消化；
S5：随后将塔斯品碱混入步骤S4中的混合物中，在离心管中离心，吸干净溶液上层脂肪细胞层和筋膜层，下层液体吹打混匀后过细胞筛；
S6：过滤后的液体加入适量的干细胞培养液，吹打混匀后，接种至培养瓶中，于30～40°下培养3～7d，制得成品。
优选的，所述步骤S1中，标本液为三氨基甲烷、蛋白质、羟脯氨酸以及纯水的混合物，其中三氨基甲烷：蛋白质：羟脯氨酸：纯水＝0.5:1.5:0.2:3。
优选的，所述步骤S2中，将安培瓶放置在振荡机上，振荡3～5min后停止。
优选的，所述步骤S3中，密度梯度离心采用氯化铯溶液作为梯度材料，其密度为1.91g/cm3。
优选的，所述步骤S3中，培养液为氨基酸和葡萄糖的混合物，其中氨基酸：葡萄糖＝1:1.3。
优选的，所述步骤S5中，离心的速度为1000～1500rpm，离心时间为5～10min，细胞筛的目数为100目。
优选的，所述步骤S5中，细胞筛的目数为100目。
优选的，所述步骤S6中，干细胞培养液由干细胞无血清培养基和干细胞无血清营养添加物按照1:1.6的比例混合而成。
优选的，一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的应用，该多因子载体制备成针剂或溶剂，并应用到促进皮肤创伤愈合的临床中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明可以优化成纤维细胞的生物学性能，促进了成纤维细胞的迁移以及增殖能力，调控胶原合成，有助于缩短皮肤创伤愈合的时间，并减少瘢痕的形成，提高创伤愈合质量。
附图说明
图1为本发明制备流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备，该制备方法的具体步骤如下：S1：取25岁的成年人腹部皮下脂肪组织作为人脂肪干细胞标本，用配置好的标本液反复冲洗标本3次，标本液为三氨基甲烷、蛋白质、羟脯氨酸以及纯水的混合物，其中三氨基甲烷：蛋白质：羟脯氨酸：纯水＝0.5:1.5:0.2:3；S2：用镊子分离脂肪标本表面的筋膜和血管，将分离好的脂肪组织标本移入安培瓶，用剪刀剪碎10min后呈乳糜状，放置备用，将安培瓶放置在振荡机上，振荡3min后停止；S3：在无菌条件下从猪髂骨处抽取骨髓，经过密度梯度离心收集界面层的单个核细胞，随后用标本液冲洗2次，离心收集细胞，重悬于培养液中进行培养，隔日换液，弃去未贴壁的细胞，待贴壁细胞继续培养到80％融合时，用胰蛋白酶消化，传代培养，培养液为氨基酸和葡萄糖的混合物，其中氨基酸：葡萄糖＝1:1.3，密度梯度离心采用氯化铯溶液作为梯度材料，其密度为1.91g/cm3；S4：将步骤S2中的标本与步骤S3中的充质干细胞混合，随后用0.1％Ι型胶原酶在30°水浴下消化40min，期间不断摇匀加速消化；S5：随后将塔斯品碱混入步骤S4中的混合物中，在离心管中离心，吸干净溶液上层脂肪细胞层和筋膜层，下层液体吹打混匀后过细胞筛，离心的速度为1000rpm，离心时间为5min，细胞筛的目数为100目；S6：过滤后的液体加入适量的干细胞培养液，吹打混匀后，接种至培养瓶中，于30°下培养3d，制得成品，干细胞培养液由干细胞无血清培养基和干细胞无血清营养添加物按照1:1.6的比例混合而成。
实施例二
一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备，该制备方法的具体步骤如下：S1：取30岁的成年人腹部皮下脂肪组织作为人脂肪干细胞标本，用配置好的标本液反复冲洗标本5次，标本液为三氨基甲烷、蛋白质、羟脯氨酸以及纯水的混合物，其中三氨基甲烷：蛋白质：羟脯氨酸：纯水＝0.5:1.5:0.2:3；S2：用镊子分离脂肪标本表面的筋膜和血管，将分离好的脂肪组织标本移入安培瓶，用剪刀剪碎15min后呈乳糜状，放置备用，将安培瓶放置在振荡机上，振荡5min后停止；S3：在无菌条件下从猪髂骨处抽取骨髓，经过密度梯度离心收集界面层的单个核细胞，随后用标本液冲洗3次，离心收集细胞，重悬于培养液中进行培养，隔日换液，弃去未贴壁的细胞，待贴壁细胞继续培养到90％融合时，用胰蛋白酶消化，传代培养，培养液为氨基酸和葡萄糖的混合物，其中氨基酸：葡萄糖＝1:1.3，密度梯度离心采用氯化铯溶液作为梯度材料，其密度为1.91g/cm3；S4：将步骤S2中的标本与步骤S3中的充质干细胞混合，随后用0.3％Ι型胶原酶在40°水浴下消化50min，期间不断摇匀加速消化；S5：随后将塔斯品碱混入步骤S4中的混合物中，在离心管中离心，吸干净溶液上层脂肪细胞层和筋膜层，下层液体吹打混匀后过细胞筛，离心的速度为1500rpm，离心时间为10min，细胞筛的目数为100目；S6：过滤后的液体加入适量的干细胞培养液，吹打混匀后，接种至培养瓶中，于40°下培养7d，制得成品，干细胞培养液由干细胞无血清培养基和干细胞无血清营养添加物按照1:1.6的比例混合而成。
实施例三
一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备，该制备方法的具体步骤如下：S1：取25岁的成年人腹部皮下脂肪组织作为人脂肪干细胞标本，用配置好的标本液反复冲洗标本3次，标本液为三氨基甲烷、蛋白质、羟脯氨酸以及纯水的混合物，其中三氨基甲烷：蛋白质：羟脯氨酸：纯水＝0.5:1.5:0.2:3；S2：用镊子分离脂肪标本表面的筋膜和血管，将分离好的脂肪组织标本移入安培瓶，用剪刀剪碎13min后呈乳糜状，放置备用，将安培瓶放置在振荡机上，振荡4min后停止；S3：在无菌条件下从猪髂骨处抽取骨髓，经过密度梯度离心收集界面层的单个核细胞，随后用标本液冲洗3次，离心收集细胞，重悬于培养液中进行培养，隔日换液，弃去未贴壁的细胞，待贴壁细胞继续培养到90％融合时，用胰蛋白酶消化，传代培养，培养液为氨基酸和葡萄糖的混合物，其中氨基酸：葡萄糖＝1:1.3，密度梯度离心采用氯化铯溶液作为梯度材料，其密度为1.91g/cm3；S4：将步骤S2中的标本与步骤S3中的充质干细胞混合，随后用0.2％Ι型胶原酶在35°水浴下消化45min，期间不断摇匀加速消化；S5：随后将塔斯品碱混入步骤S4中的混合物中，在离心管中离心，吸干净溶液上层脂肪细胞层和筋膜层，下层液体吹打混匀后过细胞筛，离心的速度为1300rpm，离心时间为7min，细胞筛的目数为100目；S6：过滤后的液体加入适量的干细胞培养液，吹打混匀后，接种至培养瓶中，于35°下培养5d，制得成品，干细胞培养液由干细胞无血清培养基和干细胞无血清营养添加物按照1:1.6的比例混合而成。
取三组雄性SD大鼠分别编号，三组大鼠体质量为200～240g，在室温22～25℃下常规饲料喂养，大鼠经腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉，剃去大鼠背中部毛，面积约4×5cm，距大鼠脊柱两侧各旁开1.5cm两个圆形创面，深至皮下，形成机械损伤动物模型，造模后大鼠伤口暴露，单笼饲养；
将三组实施例中的多因子载体材料制作成针剂或溶剂，并均匀涂覆在不同大鼠背部的表面创口上，并用纱布将大鼠创面包覆，一周后打开创面，常规换药；
术后大鼠分笼饲养，每天观察其活动和饮食情况，连续观察其创面变化、组织生长以及创面愈合等情况：所有三组实验大鼠均存活，其饮食、排便正常，没有术后感染、化脓、体液渗出等不良反应，术后一周，与本发明实施例三相对应的三号大鼠创面皮肤组织与其周边皮肤较好的融合，随着时间延长，创面的毛细血管的数量逐渐增多，上皮角化不明显；术后两周后，三号大鼠创面基本愈合，瘢痕小，上皮增厚，角化明显，真皮层细胞生长良好，毛细血管大量增生；术后三周，三号大鼠瘢痕基本愈合。
纵观其余两组大鼠，二号大鼠在三周半的时间创面基本愈合，但是其创面愈合后瘢痕明显，一号大鼠在四周左右的时间创面基本愈合，其创面瘢痕明显，综合以上所述，本发明的最佳实施例为实施例三，可以优化成纤维细胞的生物学性能，促进了成纤维细胞的迁移以及增殖能力，调控胶原合成，有助于缩短皮肤创伤愈合的时间，并减少瘢痕的形成，提高创伤愈合质量。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备，其特征在于：该制备方法的具体步骤如下：
S1：取25～30岁的成年人腹部皮下脂肪组织作为人脂肪干细胞标本，用配置好的标本液反复冲洗标本3～5次；
S2：用镊子分离脂肪标本表面的筋膜和血管，将分离好的脂肪组织标本移入安培瓶，用剪刀剪碎10～15min后呈乳糜状，放置备用；
S3：在无菌条件下从猪髂骨处抽取骨髓，经过密度梯度离心收集界面层的单个核细胞，随后用标本液冲洗2～3次，离心收集细胞，重悬于培养液中进行培养，隔日换液，弃去未贴壁的细胞，待贴壁细胞继续培养到80～90％融合时，用胰蛋白酶消化，传代培养；
S4：将步骤S2中的标本与步骤S3中的充质干细胞混合，随后用0.1～0.3％Ι型胶原酶在30～40°水浴下消化40～50min，期间不断摇匀加速消化；
S5：随后将塔斯品碱混入步骤S4中的混合物中，在离心管中离心，吸干净溶液上层脂肪细胞层和筋膜层，下层液体吹打混匀后过细胞筛；
S6：过滤后的液体加入适量的干细胞培养液，吹打混匀后，接种至培养瓶中，于30～40°下培养3～7d，制得成品。
2.根据权利要求1所述的一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备，其特征在于：所述步骤S1中，标本液为三氨基甲烷、蛋白质、羟脯氨酸以及纯水的混合物，其中三氨基甲烷：蛋白质：羟脯氨酸：纯水＝0.5:1.5:0.2:3。
3.根据权利要求1所述的一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备，其特征在于：所述步骤S2中，将安培瓶放置在振荡机上，振荡3～5min后停止。
4.根据权利要求1所述的一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备，其特征在于：所述步骤S3中，密度梯度离心采用氯化铯溶液作为梯度材料，其密度为1.91g/cm3。
5.根据权利要求1所述的一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备，其特征在于：所述步骤S3中，培养液为氨基酸和葡萄糖的混合物，其中氨基酸：葡萄糖＝1:1.3。
6.根据权利要求1所述的一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备，其特征在于：所述步骤S5中，离心的速度为1000～1500rpm，离心时间为5～10min。
7.根据权利要求1所述的一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备，其特征在于：所述步骤S5中，细胞筛的目数为100目。
8.根据权利要求1所述的一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的制备，其特征在于：所述步骤S6中，干细胞培养液由干细胞无血清培养基和干细胞无血清营养添加物按照1:1.6的比例混合而成。
9.一种促进皮肤创伤愈合的多因子载体的应用，其特征在于：该多因子载体制备成针剂或溶剂，并应用到促进皮肤创伤愈合的临床中。
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