CN111378616A - 一种采用制备干细胞冻干粉对皮肤的修复研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用制备干细胞冻干粉对皮肤的修复研究方法，包括提取充质干细胞、培育充质干细胞、制作干细胞冻干粉、皮肤创面愈合实验、数据统计分析。本发明的有益效果是：在提取充质干细胞时，利用输送泵通过导入管将储液箱中的待分离液吸出，经过滤网过滤留下所需的MSC液体，流出到培养基上，且培养套设置多个空腔能够用于容纳培养基，避免了运输过程中的感染等意外，同时也避免了互相感染的问题；充质干细胞培养的氧浓度为2‑3%，温度为37C・二氧化碳浓度为5%，在低氧浓度下，促进成体干细胞的扩増，缩短细胞倍増的周期；成体干细胞冻干粉中含有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等多肽类物质，能够修复受损的细胞，促进皮肤细胞的生长和増殖。
Description
技术领域
本发明涉及一种干细胞冻干粉研究方法，具体为一种采用制备干细胞冻干粉对皮肤的修复研究方法，属于干细胞应用技术领域。
背景技术
干细胞，是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞及组织，同时还具有免疫调节、修复、再生受损组织及衰老器官的生物学功能。研究发现，干细胞具有较高的端粒酵活性，是人体的青春活力因子，随着年齢的増长，人体内的干细胞数会不断降低，増殖分化潜能也不断的衰弱，直接导致衰老和疾病的发生发展。
皮肤老化是指皮肤功能衰老性损伤，使皮肤对机体的防护能力，调节能力等减退。皮肤的老化表现为皮肤出现小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等.随着生活水平的不断提高，人们比以往更加注重皮肤及身体的保养，对美的追求也越来越高，鉴于干细胞来源广泛，取材容易，体外增殖稳定，免疫原性低等特征，逐渐成为近年来整形美容外科的研究热点。
近年来，干细胞在抗衰老化妆品中的应用也成为了研究的热点，但是，市场上美容行业中有些所谓的干细胞针剂，其主要的干细胸来源为从产的胚胎中提取，如果没有经过配型就直接注射胚胎干细胞，容易引起免疫排斥反应、花费巨大，价格较高，需要根据个体的情况进行定制，没有普遍适用性。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种采用制备干细胞冻干粉对皮肤的修复研究方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种采用制备干细胞冻干粉对皮肤的修复研究方法，包括以下步骤：
步骤一、提取充质干细胞，利用血液中提取的成体充质干细胞进行无血清培养；
步骤二、培育充质干细胞，将提取的充质干细胞放入无血清培养基中培养，并在培养基中加入血清普代物，L-谷氮酸酰胺，核糖核音，脱氧核糖核昔，FGF和TGF-B；
其中，无血清培养基中血清曾代物的体积分数为8-10%，L-谷気酸酰胺的浓度为280-300ng/iil，核糖核苛的浓度为10・20ng/M，脱氧核糖核昔的浓度为l0-20ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为15-25ng/Bl，转化生长因子・B的浓度为15-25ng/n，维生素B5的浓度为3-5ng/ml，维生素B12的浓度为0.017.02ng/nl，锥生素C的浓度为30-50ng/ml，维生素E的浓度为0.3-0.5ng/ml。
步骤三、制作干细胞冻干粉，收集培养基中的上清液，并釆用0.2-0. 22md的无菌过滤器对收集得到的上清液进行过滤过滤、然后经过浓缩、冷冻干燥后，制得干细胞冻干粉；
步骤四、皮肤创面愈合实验，进行小鼠皮肤创面愈合的实验，在小鼠创面周围皮下注射hUCM-SCS, HE染色及免疫组化观察小鼠创面愈合情况；结合表皮生长因子治疗、常规换药和表皮生长因子联合hUCM-SCS移植治疗，观察小鼠创面愈合情况；
其中，在进行小鼠皮肤创面愈合实验时，同时进行空白实验组进行实验。
步骤五、数据统计分析，分别统计皮肤创面愈合实验组与空白实验组的小鼠创面愈合率以及愈合时间，并进行对比分析。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤一中，在提取充质干细胞时，利用输送泵通过导入管将储液箱中的待分离液吸出，经过滤网过滤留下所需的MSC液体，流出到培养基上，且培养套设置多个空腔能够用于容纳培养基。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中，充质干细胞培养的氧浓度为2-3%，温度为37C・二氧化碳浓度为5%。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中，所使用的无血清培养基以alpha-MEM培养基为基础培养基，添加血清替代物、L-谷氨酸酰胺、核糖核昔、脱氧核糖核昔、成纤維细胞生长因子和转化生长因子-8。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤三中，制备出的成体干细胞冻干粉中含有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等多肽类物质。
本发明的有益效果是：该采用制备干细胞冻干粉对皮肤的修复研究方法设计合理：
1、在提取充质干细胞时，利用输送泵通过导入管将储液箱中的待分离液吸出，经过滤网过滤留下所需的MSC液体，流出到培养基上，且培养套设置多个空腔能够用于容纳培养基，避免了运输过程中的感染等意外，同时也避免了互相感染的问题；
2、充质干细胞培养的氧浓度为2-3%，温度为37C・二氧化碳浓度为5%，在低氧浓度下，促进成体干细胞的扩増，缩短细胞倍増的周期，刺激成体干细胞中生长因子的基因表达，促进生长因子的分泌；
3、所使用的无血清培养基以alpha-MEM培养基为基础培养基，添加血清替代物、L-谷氨酸酰胺、核糖核昔、脱氧核糖核昔、成纤維细胞生长因子和转化生长因子-8，安全性能高，细胞培养过程中不易被污染，能够大大缩短成体干细胞的生长周期，提高成体干细胞的增殖速度，促进成体干细胞分泌大量的生长因子，得到的成体干细胞冻干粉纯度高，生物活性高，能够有效修复受损的细胞；
4、制备出的成体干细胞冻干粉中含有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等多肽类物质，能够修复受损的细胞，促进皮肤细胞的生长和増殖，消除皮肤皱纹，收缩毛孔，改善皮肤的状态。
附图说明
图1为本发明流程结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，一种采用制备干细胞冻干粉对皮肤的修复研究方法，包括以下步骤：
步骤一、提取充质干细胞，利用血液中提取的成体充质干细胞进行无血清培养；
步骤二、培育充质干细胞，将提取的充质干细胞放入无血清培养基中培养，并在培养基中加入血清普代物，L-谷氮酸酰胺，核糖核音，脱氧核糖核昔，FGF和TGF-B；
其中，无血清培养基中血清曾代物的体积分数为8-10%，L-谷気酸酰胺的浓度为280-300ng/iil，核糖核苛的浓度为10・20ng/M，脱氧核糖核昔的浓度为l0-20ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为15-25ng/Bl，转化生长因子・B的浓度为15-25ng/n，维生素B5的浓度为3-5ng/ml，维生素B12的浓度为0.017.02ng/nl，锥生素C的浓度为30-50ng/ml，维生素E的浓度为0.3-0.5ng/ml。
步骤三、制作干细胞冻干粉，收集培养基中的上清液，并釆用0.2-0. 22md的无菌过滤器对收集得到的上清液进行过滤过滤、然后经过浓缩、冷冻干燥后，制得干细胞冻干粉；
步骤四、皮肤创面愈合实验，进行小鼠皮肤创面愈合的实验，在小鼠创面周围皮下注射hUCM-SCS, HE染色及免疫组化观察小鼠创面愈合情况；结合表皮生长因子治疗、常规换药和表皮生长因子联合hUCM-SCS移植治疗，观察小鼠创面愈合情况；
其中，在进行小鼠皮肤创面愈合实验时，同时进行空白实验组进行实验。
步骤五、数据统计分析，分别统计皮肤创面愈合实验组与空白实验组的小鼠创面愈合率以及愈合时间，并进行对比分析。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤一中，在提取充质干细胞时，利用输送泵通过导入管将储液箱中的待分离液吸出，经过滤网过滤留下所需的MSC液体，流出到培养基上，且培养套设置多个空腔能够用于容纳培养基，避免了运输过程中的感染等意外，同时也避免了互相感染的问题。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤二中，充质干细胞培养的氧浓度为2-3%，温度为37C・二氧化碳浓度为5%，在低氧浓度下，促进成体干细胞的扩増，缩短细胞倍増的周期，刺激成体干细胞中生长因子的基因表达，促进生长因子的分泌。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤二中，所使用的无血清培养基以alpha-MEM培养基为基础培养基，添加血清替代物、L-谷氨酸酰胺、核糖核昔、脱氧核糖核昔、成纤維细胞生长因子和转化生长因子-8，安全性能高，细胞培养过程中不易被污染，能够大大缩短成体干细胞的生长周期，提高成体干细胞的增殖速度，促进成体干细胞分泌大量的生长因子，得到的成体干细胞冻干粉纯度高，生物活性高，能够有效修复受损的细胞。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤三中，制备出的成体干细胞冻干粉中含有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等多肽类物质，能够修复受损的细胞，促进皮肤细胞的生长和増殖，消除皮肤皱纹，收缩毛孔，改善皮肤的状态。
工作原理：在使用该采用制备干细胞冻干粉对皮肤的修复研究方法时，通过提取培养充质干细胞以制备干细胞冻干粉，利用干细胞冻干粉对小鼠进行创面愈合实验并同时进行空白对照组实验，对比实验中在BALB/C小鼠创面周围皮下注射hUCM-SCS，HE染色及免疫组化观察小鼠创面愈合情况，结果显示-实验组创面愈合率在各时间点均明显高于空白对照组，血管内皮细胞生长因子蛋白表达也明显增高，提示hUCM-SCS在皮肤出现创面损伤时能够分化再生新的细胞、新生血管，促进皮肤修复重建，改善皮肤损伤状况。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种采用制备干细胞冻干粉对皮肤的修复研究方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、提取充质干细胞，利用血液中提取的成体充质干细胞进行无血清培养；
步骤二、培育充质干细胞，将提取的充质干细胞放入无血清培养基中培养，并在培养基中加入血清普代物，L-谷氮酸酰胺，核糖核音，脱氧核糖核昔，FGF和TGF-B；
其中，无血清培养基中血清曾代物的体积分数为8-10%，L-谷気酸酰胺的浓度为280-300ng/iil，核糖核苛的浓度为10・20ng/M，脱氧核糖核昔的浓度为l0-20ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为15-25ng/Bl，转化生长因子・B的浓度为15-25ng/n，维生素B5的浓度为3-5ng/ml，维生素B12的浓度为0.017.02ng/nl，锥生素C的浓度为30-50ng/ml，维生素E的浓度为0.3-0.5ng/ml。
步骤三、制作干细胞冻干粉，收集培养基中的上清液，并釆用0.2-0. 22md的无菌过滤器对收集得到的上清液进行过滤过滤、然后经过浓缩、冷冻干燥后，制得干细胞冻干粉；
步骤四、皮肤创面愈合实验，进行小鼠皮肤创面愈合的实验，在小鼠创面周围皮下注射hUCM-SCS, HE染色及免疫组化观察小鼠创面愈合情况；结合表皮生长因子治疗、常规换药和表皮生长因子联合hUCM-SCS移植治疗，观察小鼠创面愈合情况；
其中，在进行小鼠皮肤创面愈合实验时，同时进行空白实验组进行实验。
步骤五、数据统计分析，分别统计皮肤创面愈合实验组与空白实验组的小鼠创面愈合率以及愈合时间，并进行对比分析。
2.根据权利要求1所述的一种采用制备干细胞冻干粉对皮肤的修复研究方法，其特征在于：所述步骤一中，在提取充质干细胞时，利用输送泵通过导入管将储液箱中的待分离液吸出，经过滤网过滤留下所需的MSC液体，流出到培养基上，且培养套设置多个空腔能够用于容纳培养基。
3.根据权利要求1所述的一种采用制备干细胞冻干粉对皮肤的修复研究方法，其特征在于：所述步骤二中，充质干细胞培养的氧浓度为2-3%，温度为37C・二氧化碳浓度为5%。
4.根据权利要求1所述的一种采用制备干细胞冻干粉对皮肤的修复研究方法，其特征在于：所述步骤二中，所使用的无血清培养基以alpha-MEM培养基为基础培养基，添加血清替代物、L-谷氨酸酰胺、核糖核昔、脱氧核糖核昔、成纤維细胞生长因子和转化生长因子-8。
5.根据权利要求1所述的一种采用制备干细胞冻干粉对皮肤的修复研究方法，其特征在于：所述步骤三中，制备出的成体干细胞冻干粉中含有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等多肽类物质。
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