CN109988742A - 自体成纤维细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种自体成纤维细胞培养方法，其特征在于依次进行皮肤标本处理步骤、酶消化法获得成纤维细胞步骤及成纤维细胞培养步骤，本发明采用获取自体皮肤来源的成纤维细胞，使用基础培养基联合自体外周血来源的富含血小板的血浆及相关的细胞生长因子，进行成纤维细胞的扩增，使用时，回输的成纤维细胞来源于自体，安全性非常高，不会出现排异反应，回输后易于成活，能迅速分泌胶原蛋白，由于机体代谢功能的调节作用，并不会出现胶原蛋白过度增生的现象，因此除皱的效果十分自然。
Description
技术领域
本发明涉及一种成纤维细胞的体外增殖方法，以及应用该细胞进行皮肤皱纹祛除的自体成纤维细胞培养方法。
背景技术
在“颜值”当道的时下，消费者对医疗美容需求大幅增长，一场由“颜值”引发的革命席卷全球，“颜值经济”持续升温。数据显示，全球“颜值经济”规模超过3万亿元。其中，中国医美市场已突破5000亿元，位列全球第三，预计两年后也就是2019年规模将达到1万亿元。
目前医美行业的突出矛盾已经转换为：消费者期望更安全、更高效的生物产品与现有的安全性一般、疗效一般的化学产品之间的矛盾，社会的进步与生活水平的提高，使消费者越来越注重生活质量的改善。皮肤作为人体最大的器官，其结构完整、美观不仅影响着心情，也体现其生活质量的高低。因此，越来越多的爱美人士渴望通过医疗技术干预皮肤老化。
皮肤从表面开始依次为表皮、真皮、皮下组织，研究表明，对人体肌肤起支撑作用的物质大部分存在于真皮层，由胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸构成的一个纤维网络对皮肤起着支撑作用，其含量的多少决定了皮肤的质地。真皮层中的成纤维细胞不断分泌胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸，保持肌肤的光泽度和质感。随着年龄的增长，成纤维细胞不断衰减，进而导致胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸的数量均下降，使皮肤出现皱纹，由此可见成纤维细胞的减少才是肌肤衰老的真正原因。
成纤维细胞减少导致的肌肤衰老，最主要的是因为胶原蛋白的含量降低。胶原蛋白是一种纤维状蛋白质，存在于皮肤、血管、肌腱、牙齿等大多数细胞中，占构成人体总蛋白的30%左右。人体由60兆个以上的细胞构成，细胞和细胞所构成的脏器，是靠细胞外基质的连接作用形成的。胶原是构成细胞外基质的一种蛋白质，作为细胞存在的场所，有助于其增殖和功能的维持。胶原蛋白含量的降低和成纤维细胞的功能降低是产生皱纹、松弛等老化现象的主要因素。
美容医学发展趋势朝着简单、微创、安全的方向发展，面部老化的治疗也从过去的手术治疗向生物制剂注射治疗转化。当前主要的生物制剂有胶原蛋白、透明质酸酶和肉毒素等。胶原蛋白和透明质酸酶是真皮组织细胞外基质的主要成分。注射这两种生物制剂可使老化皮肤逐渐减少的真皮厚度与细胞外基质得到补充，具有除皱效果明显，起效快的特点；但这些成分多数是异体或异种成分，存在免疫排斥和过敏反应的可能，且生物代谢作用使之很快降解，效果持续时间短暂是这类产品的主要缺点。肉毒素制剂可用于面部皱纹的改善；其缺点与前两者相同。上述产品的短期效果明显，但长期效果及安全性却一直备受质疑。
人体皮肤的弹性与光泽由真皮组织中成纤维细胞的数量决定，随着年龄的增长皮肤组织内的成纤维细胞逐渐减少。在皮肤组织中补充成纤维细胞可持续地增加成纤维细胞的数量，促进胶原蛋白的增生，使真皮组织的厚度增加，恢复皮肤的弹性，从而消除皮肤的皱纹或使凹陷的疤痕得到填充。
自体细胞除皱适应症广泛，不但可用于所有的皮肤皱纹的去除，而且可用于凹陷性疤痕的治疗。对于颈纹、手部皱纹、额头纹、眉间纹、鱼尾纹、口周和面部皱纹、妊娠纹以及痤疮、青春痘、天花、水痘、外伤等在面部留下的凹陷性疤痕都有明显的效果。
由于细胞取自自体，较以往的除皱手段有着截然相反的医学思路，它不是刺激肌肤病理性改变来除皱，也不是异物物理性填充来除皱。而是通过直接增强皮肤功能来达到治疗目的，因而属于生理性除皱。自体细胞非手术除皱除了可以令患者保持更久的青春外，更重要的是它的安全性。
自体细胞回输技术，其采用体外培养自体成纤维细胞一定数目及活性后，具有更高的安全性及有效性，首先，如何快速获得活性细胞在一定程度上制约了自体细胞回输技术的临床应用。
其次，人成纤维细胞的分离和培养经历了取皮肤、分离成纤维细胞、制备细胞悬液、原代细胞培养、P1代细胞培养、P2代细胞培养、细胞冻存、细胞复苏、细胞扩增等阶段。涉及人成纤维细胞的分离技术、扩增技术、传代技术、冻存技术及复苏技术等关键工艺技术。其中，人成纤维细胞的扩增技术是整个工艺的基础和关键步骤，很大程度决定了最终所得产品的有效成分含量。
最后，目前，扩增人成纤维细胞的基本方法是在培养基中加入胎牛血清。因为胎牛血清属于异种血清，所以该方法面临众多潜在的风险，包括人畜共患病、免疫排斥反应等等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种更高效、更安全的自体组织成纤维细胞培养方法，采用美容者的自体皮肤细胞，运用“组织工程技术”，进行细胞分离、纯化、培养，并扩增成足量的成纤维细胞注射液，再回输到手术者的皱纹、凹陷性疤痕等皮肤缺损部位的真皮层内。回输的成纤维细胞在真皮层内继续生长，逐步替换和补充自身已衰亡的细胞，源源不断地产生属于自己的胶原蛋白、透明质酸和弹性纤维，使皮肤真皮层的厚度和密度增加，直接修复治疗部位的皱纹和凹陷性疤痕等皮肤缺损疾病，恢复皮肤弹性，抚平皱纹，祛除凹陷性疤痕，达到预防、延缓衰老的目的。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种自体成纤维细胞培养方法，其特征在于依次进行皮肤标本处理步骤、酶消化法获得成纤维细胞步骤及成纤维细胞培养步骤：
所述皮肤标本处理步骤包括：在无菌条件下从耳后取皮或眼睑取皮；
所述酶消化法获得成纤维细胞步骤包括：在超净工作台无菌环境下，去除选取的皮肤标本的皮下组织及血管后，先加入0.25%～0.5%胰蛋白酶及0.2～0.4% EDTA进行皮肤标本的消化，再加入1～5mg/mL I型胶原蛋白酶进行消化，获得成纤维细胞；
所述成纤维细胞培养步骤包括：在DMEM/F12培养基中加入细胞生长因子KGF、PDGF及富含血小板的血浆，在35～37℃、浓度1～5%二氧化碳培养箱中培养成纤维细胞，所述细胞生长因子的浓度为：KGF活力单位为50～200U/mL，PDGF活力单位为100～500U/mL，所述富含血小板的血浆，是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，将其加入DMEM/F12培养基中，其血浆最终浓度为5～20%。
基于以上技术方案，本发明提供的自体成纤维细胞培养方法，一种较优的酶消化法获得成纤维细胞步骤包括：无菌条件下从耳后取皮或眼睑取皮，在GMP实验室的百级超净工作台上，去掉皮肤的皮下组织及血管，按体积比例10:1加入0.5%胰蛋白酶和0.2% EDTA，在37℃下消化2h，再加入1mg/mL的I型胶原蛋白酶在37℃下消化1h，将上述消化液过200目筛网，吹打过滤获得成纤维细胞。
基于以上技术方案，本发明提供的一种较优的自体成纤维细胞培养方法，包括如下步骤：
1）无菌条件下，耳后取皮或眼睑取皮，去掉皮下组织血管，按体积比例10:1加入0.5%胰蛋白酶和0.2%EDTA，在37℃下消化2h，再加入1mg/mL的I型胶原蛋白酶，在37℃下消化1h，将上述消化液过200目筛网，吹打过滤获得成纤维细胞。
2）将上述细胞悬液加入含有KGF、PDGF及PRP的DMEM/F12培养基中，在37℃、5%浓度的二氧化碳培养箱中培养48h，其中KGF活力单位为50U/mL，PDGF活力单位为100U/mL，PRP的浓度为10%。
需要说明的是，上述技术方案中，生长因子是存在于体内并对机体细胞的生长发育具有调节作用的一类细胞因子，在体内含量极微，但是生物活性极高。然而随着年龄的增长，皮肤生长因子自身分泌不断下降，作用减弱，因此外源生长因子的导入来赋予细胞新的活力成为生物美容的突破口，用DMEM/F12联合PRP的培养基可有效促进成纤维细胞的增殖，保持成纤维细胞原有细胞形态，提高细胞前期胶原蛋白表达，KGF和PDGF能促进成纤维细胞的增殖，同时促进成纤维细胞分泌胶原蛋白、弹性纤维及透明质酸，从而使肌肤富有弹性，更加嫩滑有光泽，并减少皱纹的产生，延缓皮肤的衰老。
其中富血小板血浆（PRP），是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，PRP中含有大量生长因子及蛋白质，如转化生长因子-β(TGF-β)，类胰岛素生长因子（IGF），表皮生长因子（EGF），血管内皮生长因子（VEGF）等。KGF能特异刺激成纤维细胞的新陈代谢等生理过程，包括细胞的再生、分化和迁移等。PDGF是贮存于血小板α颗粒中的一种碱性蛋白质，是低分子量促细胞分裂素。能刺激停滞于G0/G1期的成纤维细胞等多种细胞进入分裂增殖周期。
本发明采用获取自体皮肤来源的成纤维细胞，使用基础培养基联合自体外周血来源的富含血小板的血浆及相关的细胞生长因子，进行成纤维细胞的扩增，使用时，将扩增的成纤维细胞进行面部回输祛皱，使用以后，细胞适应母体需要一个周期，之后逐渐显效，潜移默化地使肌肤质地得到改善，此外，本发明实施例回输的成纤维细胞来源于自体，安全性非常高，不会出现排异反应，通过自体的成纤维细胞的体外培养、扩增，首先从数量上得到满足，而且回输后易于成活，能迅速分泌胶原蛋白，由于机体代谢功能的调节作用，并不会出现胶原蛋白过度增生的现象，因此除皱的效果十分自然。
附图说明
图1是最佳KGF浓度的筛选曲线图；
图2是最佳PDGF浓度的筛选曲线图；
图3是相同的培养条件下，不同培养基培养的成纤维细胞生长曲线图。
具体实施方式
1材料和方法
1.1材料
正常耳后取皮或眼睑取皮，均由西安丽樽整形医院提供，采用无菌手术采集0.25平方厘米的皮肤。
胰酶消化液，I型胶原蛋白、PDGF、KGF购自sigma；DMEM/F12，FBS购自Gibco；细胞计数试剂盒购自西安赫特生物科技有限公司；
成纤维细胞的无血清培养基购自STEMCELL；PRP为自体全血经离心后得到的血小板浓缩物。
1.2 结果用EXCEL统计软件分析，进行方差分析，当p＜0.05时，差异具有统计学意义。
实施例1：自体成纤维细胞培养步骤如下：在手术室内，取耳后或眼睑皮肤大约0.25平方厘米，将其保存于无菌生理盐水中，用冷链运输至实验室，在GMP实验室的百级超净工作台上，用无菌手术器械，将皮下组织及血管剥离，加入10倍体积的胰酶消化液（0.5%胰酶+0.2%EDTA），37度下消化2h，再加入1mg/mL I型胶原蛋白继续消化1h，将上述悬液过200目筛网，吹打过滤。将上述细胞悬液与培养基混合，重悬后，加入至T25细胞培养瓶中，在37度，5%二氧化碳培养箱中培养至P1代。
实施例2：将实验分为五组，A组（DMEM/F12+ 10%PRP+10U/mL KGF）、B组（DMEM/F12+10%PRP + 20U/mL KGF）、C组（DMEM/F12+ 10%PRP + 50U/mL KGF）、D组（DMEM/F12+ 10%PRP+ 100U/mL KGF）、E组（DMEM/F12+ 10%PRP + 200U/mL KGF）。
将P1代细胞，离心后，用含有10%PRP的DMEM/F12培养基重悬，调节密度至5×104个/mL，以500μL/孔接种于5块24孔板中。依据分组，在相应的孔中，加入不同浓度的KGF，每组24个孔。随后将5块24孔板放入37度，5%二氧化碳培养箱中进行培养，并在1 d、2 d、3 d、4d、5 d、6 d、7 d、8d，共8个时间点，每个时间点取各组中3个孔的细胞进行细胞计数。
图1实验结果显示，C组细胞增殖速度最快。表明KGF的最佳浓度为50U/mL。
实施例3：将实验分为五组，A组（DMEM/F12+ 10%PRP + 20U/mL PDGF）、B组（DMEM/F12+ 10%PRP + 50U/mL PDGF）、C组（DMEM/F12+ 10%PRP + 100U/mL PDGF）、D组（DMEM/F12+10%PRP + 200U/mL PDGF）、E组（DMEM/F12+ 10%PRP + 500U/mL PDGF）。
将P1代细胞，离心后，用含有10%PRP的DMEM/F12培养基重悬，调节密度至5×104个/mL，以500μL/孔接种于5块24孔板中。依据分组，在相应的孔中，加入不同浓度的PDGF，每组24个孔。随后将5块24孔板放入37度，5%二氧化碳培养箱中进行培养，并在1 d、2 d、3 d、4d、5 d、6 d、7 d、8d，共8个时间点，每个时间点取各组中3个孔的细胞进行细胞计数。
图2实验结果显示，C组细胞增殖速度最快。表明PDGF的最佳浓度为100U/mL。
实施例4：将实验分为三组，A组（成纤维细胞的无血清培养基）、B组（DMEM/F12+10%FBS）、C组（DMEM/F12+ 10%PRP + 50U/mL KGF、100U/mL PDGF）。
将P1代细胞分为三份，离心后，依据分组情况，用相应的培养基重悬，调节密度至5×104个/mL，以500μL/孔接种于3块24孔板中，每组24个孔。随后将3块24孔板放入37度，5%二氧化碳培养箱中进行培养，并在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8d，共8个时间点，每个时间点取各组中3个孔的细胞进行细胞计数。
其结果显示，培养2d后，三组细胞均开始增殖并进入对数增长期。其中B组在培养3~6d间细胞增殖稍快，而A组和C组在培养3~6d间细胞增殖稍慢，但三组细胞培养7d后，无显著性差异（p＜0.01）。
图3细胞生长曲线实验证实了，采用C组（DMEM/F12+ 10%PRP +50U/mL KGF、100U/mL PDGF）培养基可有效促进细胞的增殖，其增殖速度与A组（成纤维细胞的无血清培养基）、B组（DMEM/F12+10%FBS）相当。A组为STEMCELL公司研制的成纤维细胞的无血清培养基，引起造价过高，而无法大面积推广使用。B组培养基中含有胎牛血清，在给人输注的成纤维细胞培养中，不建议使用异源血清。细胞生长曲线实验结果表明，在含有10%PRP的DMEM/F12培养基中加入50U/mL KGF、100U/mL PDGF，进行成纤维细胞培养，其效果与加入胎牛血清相似。
实施例5：将增殖至1×108~2×108的成纤维细胞收集后，离心，用生理盐水重悬，调节其密度为2×107个/mL。选取一名志愿者，对其眼部鱼尾纹进行成纤维细胞回输。采用真皮层注射成纤维细胞。一个疗程为3次，每次间隔2周。6周后，对比志愿者的注射效果，鱼尾纹的去除效果明显。此处仅以鱼尾纹举例，不限于鱼尾纹，可用于颈纹、手部皱纹及面部皱纹的去除。
综上所述，采用酶法消化皮肤后，在含有10%PRP的DMEM/F12培养基中加入50U/mLKGF、100U/mL PDGF后，其成纤维细胞扩增效果明显。
本发明具体应用时，可在颈部、手部及面部皮肤注射成培养的成纤维细胞，注射时，注射部位可为真皮层，在真皮内注射，一个疗程注射3次，每次间隔2周，一般细胞注射的数量为2000~3000万/mL。其注射的数量根据需注射的面积而定，例如，在颈部需要注射15mL；手部需要注射10mL；面部需要注射8mL。6周后，对比志愿者的注射效果，皱纹的去除效果明显。
Claims (3)
1.一种自体成纤维细胞培养方法，其特征在于依次进行皮肤标本处理步骤、酶消化法获得成纤维细胞步骤及成纤维细胞培养步骤：
所述皮肤标本处理步骤包括：在无菌条件下从耳后取皮或眼睑处取皮；
所述酶消化法获得成纤维细胞步骤包括：在超净工作台无菌环境下，去除选取的皮肤标本的皮下组织及血管后，先加入0.25%～0.5%胰蛋白酶及0.2～0.4% EDTA进行皮肤标本的消化，再加入1～5mg/mL I型胶原蛋白酶进行消化，获得成纤维细胞；
所述成纤维细胞培养步骤包括：在DMEM/F12培养基中加入细胞生长因子KGF、PDGF及富含血小板的血浆，在35～37℃、浓度1～5%二氧化碳培养箱中培养成纤维细胞，所述细胞生长因子的浓度为：KGF活力单位为50～200U/mL，PDGF活力单位为100～500U/mL，所述富含血小板的血浆，是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，将其加入DMEM/F12培养基中，其血浆最终浓度为5～20%。
2.根据权利要求1所述的一种自体成纤维细胞培养方法，其特征在于，所述酶消化法获得成纤维细胞步骤包括：无菌条件下从耳后取皮或眼睑取皮，在GMP实验室的百级超净工作台上，去掉皮肤的皮下组织及血管，按体积比例10:1加入0.5%胰蛋白酶和0.2% EDTA，在37℃下消化2h，再加入1mg/mL的I型胶原蛋白酶在37℃下消化1h，将上述消化液过200目筛网，吹打过滤获得成纤维细胞。
3.一种自体成纤维细胞培养方法，包括如下步骤：
1）无菌条件下，耳后取皮或眼睑取皮，去掉皮下组织血管，按体积比例10:1加入0.5%胰蛋白酶和0.2%EDTA，在37℃下消化2h，再加入1mg/mL的I型胶原蛋白酶，在37℃下消化1h，将上述消化液过200目筛网，吹打过滤获得成纤维细胞；
2）将上述细胞悬液加入含有KGF、PDGF及PRP的DMEM/F12培养基中，在37℃、5%浓度的二氧化碳培养箱中培养48h，其中KGF活力单位为50U/mL，PDGF活力单位为100U/mL，PRP的浓度为10%。
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