CN110527664A - 成纤维细胞微球的制备方法及其应用 - Google Patents

成纤维细胞微球的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110527664A
CN110527664A CN201910869367.XA CN201910869367A CN110527664A CN 110527664 A CN110527664 A CN 110527664A CN 201910869367 A CN201910869367 A CN 201910869367A CN 110527664 A CN110527664 A CN 110527664A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fibroblast
microballoon
preparation
culture
skin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910869367.XA
Other languages
English (en)
Inventor
米楠
穆小生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Baier Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Nanjing Baier Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Baier Biotechnology Co Ltd filed Critical Nanjing Baier Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201910869367.XA priority Critical patent/CN110527664A/zh
Publication of CN110527664A publication Critical patent/CN110527664A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/33—Fibroblasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components

Abstract

本发明公开了一种成纤维细胞微球的制备方法及其应用，该成纤维细胞微球的制备方法包括以下步骤：步骤1，在无菌环境下取人耳后皮肤组织；步骤2，用组织贴壁方法将步骤1中的人耳后皮肤组织制备出成纤维细胞；步骤3，将所述成纤维细胞制备成单一细胞悬液；以及步骤4，使所述单一细胞悬液倒置悬浮，形成成纤维细胞微球；该成纤维细胞微球的制备过程简易快捷、耗时短、投资小，可以转化为机械化批量生产。

Description

成纤维细胞微球的制备方法及其应用
技术领域
本发明是关于成纤维细胞领域，特别是关于一种成纤维细胞微球的制备方法及其应用。
背景技术
成纤维细胞(fibroblasts)是疏松结缔组织中最主要的细胞，常附着在胶原纤维上，能合成和分泌大量的胶原蛋白。正常情况下，其处于相对静止状态，当皮肤受损时可进入增殖状态，参与组织修复，是皮肤组织受损后的主要修复细胞。它与自身分泌的胶原纤维、弹性纤维及基质成分一同构成了真皮的主体，是与皮肤质量和状态有关的重要物质，皮肤的平滑、光泽、弹性、韧性都离不开它。
从检索国内外相关文献看，自体成纤维细胞除皱技术已经广泛开展并已有相关产品销售。例如，国内的杭州安倍生物科技有限公司公开的自体组织成纤维细胞培养方法，通过体外培养自体的成纤维细胞，用于回输治疗皮肤胶原缺损性疾病或变性疾病；广州赛奕德生物技术有限公司公开的自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品中通过从自体皮肤中获取表皮细胞和培养得到成纤维细胞，并将其中一种或两种细胞添加到自体外周血富含血小板的血浆中，生产出含自体活细胞的生物美容产品，可用于白癜风祛斑、疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等美容作用；美国的法珀赛尔(Fibrocell)公司研发的LaViv技术及产品，其原理是提取自体成纤维细胞，通过“细胞增量培殖再生技术”，将该细胞进行扩容、培养，再注射回需要去除皱纹的皮肤真皮层内，达到祛除皱纹的效果。而本发明，“采用悬滴法(hanging drop)制备成纤维细胞微球”，并将成熟的细胞微球，“移植到需要除皱的面部局部真皮下，达到快速除皱并长期保持除皱效果的目的”的内容则未见相关文献报道。
此外，悬滴法制备细胞微球的研究在国内外已经开展，目前主要应用于干细胞的培养中。在其他类型细胞培养中，中国医学科学院整形外科医院研究中心开展了悬滴培养法维持瘢痕疙瘩成纤维细胞的研究；奥地利的因斯布鲁克医科大学(Med Univ Innsbruck)开展了悬滴法培养肺癌细胞的研究；瑞士苏黎世大学(Univ Zurich)在自其研究中采用悬滴法培养肾小管上皮细胞。但是，采用悬滴法培养自体成纤维细胞微球并回注面部真皮下以达到除皱目的研究则尚未开展。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成纤维细胞微球的制备方法及其应用，该成纤维细胞微球的制备过程简易快捷、耗时短、投资小，可以转化为机械化批量生产。
为实现上述目的，本发明提供了一种成纤维细胞微球的制备方法，包括以下步骤：步骤1，在无菌环境下取人耳后皮肤组织；步骤2，用组织贴壁方法将步骤1中的人耳后皮肤组织制备出成纤维细胞；步骤3，将所述成纤维细胞制备成单一细胞悬液；以及步骤4，使所述单一细胞悬液倒置悬浮，形成成纤维细胞微球。
在本发明的一实施方式中，步骤1中所取的人耳后皮肤组织的尺寸为(2-4)×(2-4)mm；取人耳后皮肤组织是用直径为2-4mm的皮肤打孔器进行取样的。
在本发明的一实施方式中，步骤2中所述组织贴壁方法包括成纤维细胞原代分离和成纤维细胞传代扩增。
在本发明的一实施方式中，所述成纤维细胞原代分离包括以下步骤：将取下的人耳后皮肤组织立即转移到生物安全柜里，用生理盐水(含2％双抗)冲洗3-5次；将用生理盐水冲洗过的人耳后皮肤组织均匀切割成6-9块皮肤组织块；以及将所述皮肤组织块均匀平铺到培养皿中，加入成纤维细胞培养基，置于37℃，5％CO2培养箱内进行原代细胞培养，每隔一天补180-220uL成纤维细胞培养基。
在本发明的一实施方式中，上述平铺皮肤组织块的培养皿的直径为3.5cm，培养皿中平铺的所述组织块之间的间隔为1-3cm，所加入的成纤维细胞培养基的体积为350-450μL。
在本发明的一实施方式中，所述成纤维细胞传代扩增包括以下步骤：待成纤维细胞从皮肤组织块中爬出，并且所述成纤维细胞汇合度达到70％-80％后，用0.05％胰蛋白酶消化，当所述成纤维细胞部分脱落，立即加入成纤维细胞培养基终止消化，然后将所述成纤维细胞收集于离心管中，离心、弃上清，用成纤维细胞培养基重悬所述成纤维细胞，按(4.5-5.5)×104个/mL接种到T75培养瓶中，将培养瓶置于37℃，5％CO2培养箱内进行传代培养，即得P1代成纤维细胞，继续传代至到P5代。
在本发明的一实施方式中，所述0.05％胰蛋白酶的使用体积为200-300μL，终止消化所使用的成纤维细胞培养基的体积为1-3mL，终止消化后的所述成纤维细胞收集于15mL离心管中，所述离心的条件为1000rp/min离心2-4min。
在本发明的一实施方式中，所述单一细胞悬液的制备方法为：将步骤2所制备出的P4代成纤维细胞用4-5mL 0.05％胰蛋白酶消化2-4min，用4-5mL成纤维细胞培养基终止消化，1000rp离心2-4min弃上清，用成纤维细胞培养基制成单一细胞悬液。
在本发明的一实施方式中，上述成纤维细胞培养基是无血清培养基。
在本发明的一实施方式中，所述成纤维细胞微球的制备方法如下：将所述单一细胞悬液以8-12μL/滴滴到培养皿的盖子上，每滴悬液含有5000-6000个细胞，小心将盖子翻转，覆盖于培养皿的基底上，让成纤维细胞细胞落到悬浮小滴的底部，于37℃、5％CO2培养箱中培养3-4天后，每个悬浮小滴中的单一成纤维细胞形成成纤维细胞微球；其中所述培养皿中加入无血清培养基以防止悬浮小滴风干，所培养皿上方再压上一个装满PBS的T75培养瓶以保持下方的悬浮小滴承受适当的压力；优选的，所述培养皿的直径为100mm。
在本发明的一实施方式中，上述成纤维细胞微球的制备方法在制备消除皱纹和瘢痕药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明制备成纤维细胞微球过程简易快捷，耗时短，投资小，可以转化为机械化批量生产；
(2)本发明中采用组织贴壁方法制备成纤维细胞对取皮面积要求低，制备效率高，取(2-4)×(2-4)mm皮肤就可以制备大量成纤维细胞；
(3)本发制备成纤维细胞微球用的是无血清培养基，应用安全，制备成纤维细胞微球可以直接用于自体皮肤注射；
(4)本发明制备成纤维细胞微球不需要添加其他生物合成材料，准确真实的细胞；
(5)本发明制备成纤维细胞微球并回注面部真皮下会替代老化细胞工作，分泌胶原蛋白，弹性蛋白，透明质酸和基质，使真皮层胶原蛋白密度和厚度增加，恢复皮肤弹性，让其生长出皮肤组织使沟纹长平，以达到消除皱纹和瘢痕的目的。
附图说明
图1是本发明实施例1中制备成纤维原代细胞(P0代)分离形态图(细胞从皮肤组织块爬出)；
图2是本发明实施例1中制备的成纤维细胞传代培养到P4代成纤维细胞形态图；
图3是本发明实施例2中台盼蓝染色法检测制备的成纤维细胞细胞活率图；
图4a是本发明实施例3中P5代成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定图；
图4b是本发明实施例3中P5代成纤维细胞CK免疫荧光鉴定图；
图5是本发明实施例4中制备成纤维细胞微球图；
图6是本发明实施例5中成纤维细胞微球凋亡检测图；
图7a是本发明实施例6中没有注射自体成纤维细胞微球时面部处的鱼尾纹。
图7b是采用自体成纤维细胞微球注射鱼尾纹部位后的效果图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
实施例1:人成纤维细胞分离与传代培养
(1)人真皮成纤维细胞分离
1)在无菌环境下用无菌皮肤打孔器(3mm)取人耳后皮肤组织3mm×3mm；
2)取下皮肤立刻转移到生物安全柜里，用生理盐水(含2％双抗)冲洗3-5次；
3)在体视镜下，用显微镊子和手术刀片将清洗后的皮肤组织均匀切割6-9小块；
4)将切割后的皮肤组织均匀平铺到3.5cm培养皿中，组织块间隔2cm；加入400μL成纤维细胞培养基(厂家：Promoce；货号：C-23010)置于37℃，5％CO2培养箱内进行原代细胞培养；每隔一天补200μL成纤维细胞培养基。
(2)细胞传代扩增
7-10天时成纤维细胞从组织块中爬出(含少量上皮细胞)，当细胞汇合度达到70％-80％后，向培养皿加入250μL 0.05％胰蛋白酶(厂家：Gibco；货号：25200-056)，将培养皿放在倒置显微镜下观察，发现成纤维细胞变圆，部分脱落，立即加入2mL成纤维细胞培养基终止消化。用枪头轻轻吹打成纤维细胞生长区域，收集细胞于15mL离心管中，1000rp/min离心3min，弃上清，用成纤维细胞培养基重悬细胞，按5×104个/mL接种到T75培养瓶中，将培养瓶置于37℃，5％CO2培养箱内继续进行传代培养。
实施例2:成纤维细胞活率检测
将实施例1中分离P1代成纤维细胞制成单个细胞悬液，取三个1.5mL EP管，分别加入50μL的0.1％的台盼蓝溶液，记为S1，S2，S3。分别取50μL细胞悬液与S1，S2，S3管中的台盼蓝溶液混合，吹吸20次混匀，然后加入到血球计数板中计数。显微镜下观察，死细胞呈淡蓝色，活细胞拒染，数据分析，细胞存活率＝(3次平均活细胞数/3次平均总细胞数)×100％。
计数结果，如下表：
实施例3:成纤维细胞免疫荧光鉴定
(1)vimentin(波形蛋白)免疫荧光鉴定
1)取实施例1中扩增得到的P5代成纤维细胞，用0.05％胰蛋白酶消化3min，用成纤维细胞培养基终止，1000rp离心3min弃上清，用成纤维细胞培养基重悬细胞。以1×105的密度接种到预铺好的Microscope Cover Glass 6孔板中，将培养板放置在37℃、5﹪CO2培养箱中培养；
2)3天后吸出上清，用PBS洗板3次(每次2min)，经10％甲醛固定30min；
3)用PBS洗3次，加3g/L TritonX-100室温封闭30min,用PBS洗3次
4)加200μL BSA室温封闭1h,去除血清，加入1:100稀释后的vimentin鼠抗单克隆抗体(厂家:中杉金桥；货号：ZM-0260)，室温孵育1.5h；
5)PBS漂洗3次，加20μL稀释后的生物素化抗小鼠IgG(厂家:中杉金桥；货号：ZB-2055)，室温孵育1h，PBS漂洗3次；
6)去除PBS，用DAPI染核，室温避光孵育15min；荧光显微镜观察。
结果如图4a显示：制备的成纤维细胞Vimentin抗原表达呈阳性反应，阳性细胞率为98％。
(2)细胞角蛋白CK(厂家:中杉金桥；货号：ZM-0069)免疫荧光鉴定实验步骤同vimentin(波形蛋白)免疫染色鉴定步骤。
结果如图4b显示：成纤维细胞不表达角质细胞标志物CK，说明制备的成纤维细胞不含上皮细胞。
实施例4:成纤维细胞微球的制备
(1)取实施例1中扩增得到的P4代成纤维细胞，用4.5mL 0.05％胰蛋白酶消化3min，用4.5mL成纤维细胞培养基终止消化，1000rp离心3min弃上清，用成纤维细胞培养基制成单一细胞混悬液。
(2)移植10μL/滴细胞悬液到100mm培养皿的盖子上，每滴悬液含有5000-6000个细胞。
(3)小心将盖子翻转，覆盖于培养皿的基底上，当盖子翻转后，每一滴细胞悬液悬浮，细胞落到悬浮小滴的底部。
(4)为防止小滴风干，培养皿中加入适量的无血清培养基,该培养皿上方再压上一个装满PBS的T75培养瓶以保持下方的悬浮小滴承受适当的压力。
(5)37℃、5％CO2恒温培养箱培养3-4天后，每个小滴中的单一细胞形成一个致密的成纤维细胞微球。
实施例5:制备成纤维细胞微球凋亡检测
(1)收集实施例4制备的成纤维细胞微球于50mL离心管中，直立静置约1-10min,以使细胞球结体沉积于离心管底部，小心吸出上清液，加入1mL0.05％胰蛋白酶消化10min，细胞微球消化成单一细胞时加入成纤维培养基终止消化，1000rp离心3min弃上清。
(2)用蒸馏水将FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(厂家BD；货号：556547)中的10×binding buffer稀释为1×，用500μL 1×binding buffer重悬细胞，细胞密度调整为1×106cells/mL。
(3)取100μL细胞悬液至4个流式管里，分别为：blank组、单染FITC-AnnexinV组、单染PI组、双染AnnexinV和PI组。
(4)照下表向各组添加抗体。
(5)轻轻涡旋混匀，室温避光孵育15min。
(6)各管加入400μL的1×binding buffer，然后在1h内上机检测。
结果如图6显示，细胞凋亡率为6.56％，所明成纤维细胞制备微球后，细胞仍然保持较高活率；
实施例6:注射自体成纤维细胞微球去除鱼尾纹的临床应用
选取有鱼尾纹求美者3例，各自取耳后皮肤组织3mm×3mm，采用本发明成纤维细胞微球的制备方法制备自体成纤维细胞微球，每人收集100个制备的成纤维细胞微球于50mL离心管中，直立静置约1-10min，以使细胞微球沉积于离心管底部，小心吸出上清液，用5mL生理盐水洗涤3次，悬浮于1mL生理盐水中，用针头注射鱼尾纹部位，共注射3次，每次间隔约2周，注射后局部不能按摩，压迫等；72小时内禁止使用香皂，化妆品等。
结果：完成注射后随访2-3月，3例鱼尾纹求美者的鱼尾纹部位有不同程度的缓解。图7a显示：没有注射自体成纤维细胞微球时面部处的鱼尾纹；图7b显示：采用自体成纤维细胞微球注射鱼尾纹部位，三个月后眉间皱纹消失。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种成纤维细胞微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，在无菌环境下取人耳后皮肤组织；
步骤2，用组织贴壁方法将步骤1中的人耳后皮肤组织制备出成纤维细胞；
步骤3，将所述成纤维细胞制备成单一细胞悬液；以及
步骤4，使所述单一细胞悬液倒置悬浮，形成成纤维细胞微球。
2.如权利要求1所述的成纤维细胞微球的制备方法，其特征在于，步骤1中所取的人耳后皮肤组织的尺寸为(2-4)×(2-4)mm；取人耳后皮肤组织是用直径为2-4mm的皮肤打孔器进行取样的。
3.如权利要求1所述的成纤维细胞微球的制备方法，其特征在于，步骤2中所述组织贴壁方法包括成纤维细胞原代分离和成纤维细胞传代扩增。
4.如权利要求3所述的成纤维细胞微球的制备方法，其特征在于，所述成纤维细胞原代分离包括以下步骤：
将取下的人耳后皮肤组织立即转移到生物安全柜里，用生理盐水冲洗3-5次；
将用生理盐水冲洗过的人耳后皮肤组织均匀切割成6-9块皮肤组织块；以及将所述皮肤组织块均匀平铺到培养皿中，加入成纤维细胞培养基，置于37℃，5％CO2培养箱内进行原代细胞培养，每隔一天补180-220μL成纤维细胞培养基。
5.如权利要求4所述的成纤维细胞微球的制备方法，其特征在于，所述培养皿的直径为3.5cm，培养皿中平铺的所述组织块之间的间隔为1-3cm，所加入的成纤维细胞培养基的体积为350-450μL。
6.如权利要求4所述的成纤维细胞微球的制备方法，其特征在于，所述成纤维细胞传代扩增包括以下步骤：
待成纤维细胞从皮肤组织块中爬出，并且所述成纤维细胞汇合度达到70％-80％后，用0.05％胰蛋白酶消化，当所述成纤维细胞部分脱落，立即加入成纤维细胞培养基终止消化，然后将所述成纤维细胞收集于离心管中，离心、弃上清，用成纤维细胞培养基重悬所述成纤维细胞，按(4.5-5.5)×104个/mL接种到培养瓶中，将培养瓶置于37℃，5％CO2培养箱内进行传代培养，即得P1代成纤维细胞，继续传代至到P5代。
7.如权利要求6所述的成纤维细胞微球的制备方法，其特征在于，所述0.05％胰蛋白酶的使用体积为200-300μL，终止消化所使用的成纤维细胞培养基的体积为1-3mL，终止消化后的所述成纤维细胞收集于15mL离心管中，所述离心的条件为1000rp/min离心2-4min。
8.如权利要求1所述的成纤维细胞微球的制备方法，其特征在于，所述单一细胞悬液的制备方法为：将步骤2所制备出的成纤维细胞用4-5mL 0.05％胰蛋白酶消化2-4min，用4-5mL成纤维细胞培养基终止消化，1000rp离心2-4min弃上清，用成纤维细胞培养基制成单一细胞悬液。
9.如权利要求1所述的成纤维细胞微球的制备方法，其特征在于，所述成纤维细胞微球的制备方法如下：
将所述单一细胞悬液以8-12uL/滴滴到培养皿的盖子上，将盖子翻转，覆盖于培养皿的基底上，让成纤维细胞落到悬浮小滴的底部，于37℃、5％CO2培养箱中培养3-4天后，每个悬浮小滴中的单一成纤维细胞形成成纤维细胞微球；优选的，所述培养皿的直径为100mm。
10.权利要求1所述的成纤维细胞微球的制备方法在制备消除皱纹和瘢痕药物中的应用。
CN201910869367.XA 2019-09-16 2019-09-16 成纤维细胞微球的制备方法及其应用 Pending CN110527664A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910869367.XA CN110527664A (zh) 2019-09-16 2019-09-16 成纤维细胞微球的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910869367.XA CN110527664A (zh) 2019-09-16 2019-09-16 成纤维细胞微球的制备方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110527664A true CN110527664A (zh) 2019-12-03

Family

ID=68668718

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910869367.XA Pending CN110527664A (zh) 2019-09-16 2019-09-16 成纤维细胞微球的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110527664A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050054100A1 (en) * 2003-09-08 2005-03-10 Rennard Stephen I. Methods for fibroblast differentiation
CN101978047A (zh) * 2008-01-18 2011-02-16 明尼苏达大学董事会 干细胞聚集体及制备和使用方法
CN108486044A (zh) * 2018-03-13 2018-09-04 北京多赢时代科技有限公司 自体成纤维细胞的制备方法和应用
CN109988742A (zh) * 2017-12-30 2019-07-09 西安洛威塔生物科技有限责任公司 自体成纤维细胞培养方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050054100A1 (en) * 2003-09-08 2005-03-10 Rennard Stephen I. Methods for fibroblast differentiation
CN101978047A (zh) * 2008-01-18 2011-02-16 明尼苏达大学董事会 干细胞聚集体及制备和使用方法
CN109988742A (zh) * 2017-12-30 2019-07-09 西安洛威塔生物科技有限责任公司 自体成纤维细胞培养方法
CN108486044A (zh) * 2018-03-13 2018-09-04 北京多赢时代科技有限公司 自体成纤维细胞的制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
于元松等: "山羊耳皮肤成纤维细胞的传代培养及活力分析 ", 《解剖学报》 *
唐艳婷等: "富勒醇对基于悬滴培养的脂肪间充质干细胞成骨分化的影响 ", 《解放军医学杂志》 *
曹蕊等: ""悬滴培养法维持瘢痕疙瘩成纤维细胞表面标志CD105的表达及其功能"", 《组织工程与重建外科杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kremer et al. Evaluation of dermal—epidermal skin equivalents (‘composite-skin’) of human keratinocytes in a collagen-glycosaminoglycan matrix (integra™ artificial skin)
CN102462864B (zh) 一种组织工程皮肤构建新方法
EP1639099B1 (en) Method of isolating cells from umbilical cord
Kinikoglu et al. Reconstruction of a full-thickness collagen-based human oral mucosal equivalent
CN101802177A (zh) 从人或动物胚胎提取间质性干细胞及提取其分泌物的方法
CN110772669A (zh) 一种用于3d打印人工皮肤的生物墨水
CN106701824B (zh) 基于人iPS细胞获取脊髓运动神经元及其功能性细胞的方法
CN104399125B (zh) 表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法
CN108486044A (zh) 自体成纤维细胞的制备方法和应用
CN109294981A (zh) 一种人皮肤成纤维细胞提取方法及其培养基
CN105219696A (zh) 一种新型的人表皮培养方法
CN105025939A (zh) 心脏或血管组织型球体
CN102631706B (zh) 低免疫原性猪真皮支架的制备方法
CN104491931B (zh) 含有皮脂腺的皮肤组织及其形成方法和用途
CN105255822A (zh) 临床治疗级细胞治疗用毛囊干细胞细胞外基质筛选培养方法
Ghanavati et al. Characterization of a three-dimensional organotypic co-culture skin model for epidermal differentiation of rat adipose-derived stem cells
EP2737055A1 (en) Micro organ comprising mesenchymal and epithelial cells
CN108066750A (zh) 干细胞及其分泌物用于治疗皮肤烧烫伤的新用途
CN107683148A (zh) 皮肤重建方法
Barbaro et al. Reconstruction of a human hemicornea through natural scaffolds compatible with the growth of corneal epithelial stem cells and stromal keratocytes
JP6839003B2 (ja) 再構成頭皮モデルおよび活性分子のスクリーニング方法
CN106282094B (zh) 人皮肤来源的前体细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的方法
CN110527664A (zh) 成纤维细胞微球的制备方法及其应用
CN105087466B (zh) 诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法
US20120276154A1 (en) Creation of hair follicles in tissue-engineered skin grafts

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20191203