CN101978047A - 干细胞聚集体及制备和使用方法 - Google Patents

干细胞聚集体及制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞聚集体的组合物以及制备和使用所述细胞聚集体的方法，其中所述聚集体包含不是胚胎干细胞但可分化为外胚层、内胚层和中胚层中至少两种的细胞类型的细胞例如干细胞。

Description

干细胞聚集体及制备和使用方法
相关申请
本申请要求2008年1月18日提交的申请号为6I/022,121的美国临时专利申请的优先权，所述临时申请以引用的方式纳入本文中。
技术领域
本发明涉及细胞聚集体的组合物以及制备和使用所述细胞聚集体的方法，其中所述聚集体包含不是胚胎干细胞但可分化为外胚层、内胚层和中胚层中至少两种细胞类型的细胞，例如干细胞。
背景技术
干细胞
干细胞的特征在于它们能够自我更新(细胞分裂但不分化)并且产生分化程度更高的后代。组织学上的典型干细胞是胚胎干(ES)细胞。ES细胞可无限自我更新。ES细胞源自胚泡的内细胞团或植入后胚胎的原始生殖细胞(胚胎生殖细胞或EG细胞)。ES和EG细胞源自小鼠、非人灵长类和人以及其他动物。当被引入到胚泡中时，ES细胞可对所有组织的形成起作用。ES细胞疗法的一个缺点是当移植到出生后的动物中时，ES和EG细胞产生畸胎瘤。
ES(和EG)细胞可通过用抗SSEAl(小鼠)和SSEA4(人)的抗体进行阳性染色而被识别。在分子水平上，ES和EG细胞表达若干对这些未分化细胞特异的转录因子。这些因子包括oct3/4和rex-1。还发现了LIF-R(在小鼠中)和转录因子sox-2和rox-1。非ES细胞也表达rox-1和sox-2。ES细胞的一个标志是端粒酶活性，该酶向这些细胞提供了体外无限自我更新的可能。参见如美国专利Nos.5,453,357；5,656,479；5,670,372；5,843,780；5,874,301；5,914,268；6,110,739；6,190,910；6,200,806；6,432,711；6,436,701，6,500,668；6,703,279；6,875,607；7,029,913；7,112,437；7,145,057；7,153,684和7,294,508，所述专利的每一篇都以引用的方式纳入本文中以教导ES细胞及其制备方法。已经以聚集体的形式培养ES细胞。当不附着在基底上培养时，ES细胞能够形成拟胚体。
Oct3/4(oct3在人中)是在原肠形成前期胚胎、卵裂早期胚胎、卵泡内细胞团细胞和胚胎癌(EC)细胞中表达的转录因子(Nichols et al.，Cell95：379-91(1998))，并在细胞被诱导分化时下调。oct3/4的表达对决定胚胎发生和分化的早期步骤起重要作用。oct3/4——连同rox-1——引起锌指蛋白rex-1的转录激活，同时也是保持未分化ES细胞所必需的(Rosfjordand Rizzino，Biochem Biophys Res Commun 203：1795-802(1997)；Ben-Shushan et al.，MoI Cell Biol 18：1866-78(1998))。此外，在ESC/EC中表达而且在其他分化程度更高的细胞中表达的sox-2，与oct3/4一起为保持未分化状态所必需的(Uwanogho et al.，Mech Dev 49：23-36(1995))。小鼠ES和原始生殖细胞的保持需要存在LIF。oct3/4基因在人中转录为至少两种剪接变体，oct3A和oct3B。oct3B剪接变体存在于许多分化细胞中，而oct3A剪接变体(以前也命名为oct3/4)据报道对未分化的ES细胞具有特异性。参见Shimozaki et al.Development 130：2505-12(2003)。
发明内容
1.本发明提供一种包含细胞聚集体的组合物，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
2.本发明还提供一种包含细胞培养中的细胞聚集体的组合物，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
3.本发明还提供一种包含可药用载体和细胞聚集体的药物组合物，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
4.本发明还提供一种包含源自细胞聚集体的细胞的组合物，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
5.本发明还提供一种包含细胞培养中的源自细胞聚集体的细胞的组合物，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
6.本发明还提供一种包含可药用载体和源自细胞聚集体的细胞的药物组合物，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
7.本发明还提供一种包含分化细胞的组合物，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
8.本发明还提供一种包含细胞培养中的分化细胞的组合物，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
9.本发明还提供一种包含可药用载体和分化细胞的药物组合物，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
10.本发明还提供一种包含分化细胞的组合物，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
11.本发明还提供一种包含细胞培养中的分化细胞的组合物，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
12.本发明还提供一种包含可药用载体和分化细胞的药物组合物，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
13.本发明还提供一种制备细胞聚集体的方法，所述方法包括将不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞置于可使所述细胞聚集的条件下。
14.本发明还提供一种制备细胞培养中的细胞聚集体的方法，所述方法包括在细胞培养中将细胞置于可使所述细胞聚集的条件下，其中制备所述聚集体的细胞不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型。
15.本发明还提供一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将可药用载体与细胞聚集体混合，所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
16.本发明还提供一种制备源自细胞聚集体的细胞的方法，所述方法包括分散细胞聚集体中的细胞，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
17.本发明还提供一种制备细胞培养组合物的方法，所述方法包括将源自细胞聚集体的细胞引入培养基中，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
18.本发明还提供一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将可药用载体与源自细胞聚集体的细胞混合，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中的至少两种细胞类型的细胞。
19.本发明还提供制备分化细胞的方法，所述方法包括将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
20.本发明还提供一种制备分化细胞的方法，所述方法包括在细胞培养中将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
21.本发明还提供一种制备细胞培养组合物的方法，所述方法包括将分化细胞与细胞培养基合并，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
22.本发明还提供一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将可药用载体与分化细胞混合，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
23.本发明还提供一种制备分化细胞的方法，所述方法包括将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
24.本发明还提供一种制备分化细胞的方法，所述方法包括在细胞培养中将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
25.本发明还提供一种制备细胞培养组合物的方法，所述方法包括将分化细胞与细胞培养基合并，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
26.本发明还提供一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将分化细胞与可药用载体混合，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可有效获得所述分化细胞表型的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
27.本发明还提供一种包括给予受试者细胞聚集体的方法，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
28.本发明还提供一种包括给予受试者药物组合物的方法，所述药物组合物包含可药用载体和细胞聚集体，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
29.本发明还提供一种包括给予受试者源自细胞聚集体的细胞的方法，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
30.本发明还提供一种包括给予受试者药物组合物的方法，所述药物组合物包含可药用载体和源自细胞聚集体的细胞，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
31.本发明还提供一种包括给予受试者分化细胞的方法，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
32.本发明还提供一种包括给予受试者药物组合物的方法，所述药物组合物包含可药用载体和分化细胞，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
33.本发明还提供一种包括给予受试者分化细胞的方法，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
34.本发明还提供一种包括给予受试者药物组合物的方法，所述药物组合物包含可药用载体和分化细胞，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
35.本发明还提供一种鉴定活性剂的方法，所述方法包括用一种试剂接触细胞聚集体并检测所述试剂对所述细胞聚集体的作用，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
36.本发明还提供一种鉴定活性剂的方法，所述方法包括在细胞培养中用一种试剂接触细胞聚集体并检测所述试剂对所述细胞聚集体的作用，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
37.本发明还提供一种鉴定活性剂的方法，所述方法包括用一种试剂接触源自细胞聚集体的细胞并检测所述试剂对所述源自细胞聚集体的细胞的作用，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
38.本发明还提供一种鉴定活性剂的方法，所述方法包括在细胞培养中用一种试剂接触源自细胞聚集体的细胞并检测所述试剂对所述源自细胞聚集体的细胞的作用，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
39.本发明还提供一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的细胞聚集体，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
40.本发明还提供一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含可药用载体和细胞聚集体，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
41.本发明还提供一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的源自细胞聚集体的细胞，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
42.本发明还提供一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含可药用载体和源自细胞聚集体的细胞，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
43.本发明还提供一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的分化细胞，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
44.本发明还提供一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含可药用载体和分化细胞，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
45.本发明还提供一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的分化细胞，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
46.本发明还提供一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含可药用载体和分化细胞，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
47.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述聚集体中的细胞和源自所述聚集体的细胞表达oct3/4、端粒酶、rex-1、rox-1、nanog、GATA6和sox-2中的一种或多种。
48.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述聚集体中的细胞和源自所述聚集体的细胞可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中全部三种细胞类型。
49.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达内胚层、外胚层和中胚层分化标志物中的一种或多种。
50.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达内胚层和外胚层分化标志物。
51.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达外胚层和中胚层分化标志物。
52.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达内胚层和中胚层分化标志物。
53.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达内胚层分化标志物。
54.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达外胚层分化标志物。
55.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达中胚层分化标志物。
56.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，其特征为选自以下的细胞：肝细胞、β胰岛细胞、神经元、成骨细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、软骨、骨、肌肉、结缔组织、成血管系膜细胞(mesangioblast)、造血干细胞、淋巴细胞、网织红细胞、骨髓细胞、肺上皮细胞和皮肤。
57.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述聚集体含有约10个细胞到约50000个或更多细胞。
58.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述聚集体含有约1000个细胞到约5000个细胞。
59.本发明还提供本文所述的组合物，其中细胞通过悬滴法或强聚法聚集。
60.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述分化细胞表型选自成骨细胞、软骨细胞、骨、脂肪细胞、软骨、成纤维细胞、骨髓基质、骨骼肌、平滑肌、心肌、眼部细胞、内皮细胞、上皮细胞、肝细胞、胰腺细胞、造血细胞、神经胶质细胞、神经元细胞和少突胶质细胞类型。
61.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述分化细胞是定形内胚层。
62.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述分化细胞是腹部前肠内胚层。
63.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述分化细胞是双能肝脏祖细胞。
64.本发明还提供本文所述的组合物，其中所述分化细胞是肝细胞样细胞。
65.本发明还提供本文所述的方法，其中所述聚集体中的细胞或源自所述聚集体的细胞表达oct3/4、端粒酶、rex-1、rox-1、nanog、GATA6和sox-2中的一种或多种。
66.本发明还提供本文所述的方法，其中所述聚集体中的细胞或源自所述聚集体的细胞可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中全部三种细胞类型。
67.本发明还提供本文所述的方法，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达内胚层、外胚层和中胚层分化标志物中的一种或多种。
68.本发明还提供本文所述的方法，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达内胚层和外胚层分化标志物。
69.本发明还提供本文所述的方法，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达外胚层和中胚层分化标志物。
70.本发明还提供本文所述的方法，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达内胚层和中胚层分化标志物。
71.本发明还提供本文所述的方法，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达内胚层分化标志物。
72.本发明还提供本文所述的方法，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达外胚层分化标志物。
73.本发明还提供本文所述的方法，其中所述分化细胞是通过分化所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而产生的，并表达中胚层分化标志物。
74.本发明还提供本文所述的方法，其中所述分化细胞表型的特征为选自以下的细胞：肝细胞、β胰岛细胞、神经元、成骨细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、软骨、骨、肌肉、结缔组织、成血管系膜细胞、造血干细胞、淋巴细胞、网织红细胞、骨髓细胞、肺上皮细胞和皮肤细胞。
75.本发明还提供本文所述的方法，其中所述聚集体含有约10个细胞到约50000个或更多细胞。
76.本发明还提供本文所述的方法，其中所述聚集体含有约1000个细胞到约5000个细胞。
77.本发明还提供本文所述的方法，其中细胞通过悬滴法或强聚法聚集。
78.本发明还提供本文所述的方法、其中所述病症为肝脏疾病或病症、GVHD、心肌梗塞、充血性心力衰竭、糖尿病、造血移植(hematopoietictransplant)、外伤性脑损伤、脊髓损伤或中风。
79.本发明还提供本文所述的方法，其中所述病症包括组织损伤，所述组织为以下组织的一种或多种：心脏组织、神经元组织、视觉组织、软骨组织、骨组织、骨骼肌组织、平滑肌组织、骨髓组织、脾脏组织、肝脏组织、肺组织、脑组织、免疫系统、结缔组织、血管、胰腺组织、中枢神经系统(CNS)、周围神经系统(PNS)和肾脏组织中的一种或多种。
80.本发明还提供本文所述的方法，其中所述分化细胞表型选自成骨细胞、软骨细胞、骨、脂肪细胞、软骨、成纤维细胞、骨髓基质、骨骼肌、平滑肌、心肌、眼部细胞、内皮细胞、上皮细胞、肝细胞、胰腺细胞、造血细胞、神经胶质细胞、神经元细胞和少突胶质细胞类型。
81.本发明还提供本文所述的方法，其中所述分化细胞是定形内胚层。
82.本发明还提供本文所述的方法，其中所述分化细胞是腹部前肠内胚层。
84.本发明还提供本文所述的方法，其中所述分化细胞是肝细胞样细胞。
在本发明的以上说明中，源自所述聚集体的细胞可保留所述聚集细胞的分化能力。
附图说明
图1示出了由单层(2D)培养的大鼠MAPC形成聚集体的悬滴法和后续分化。
图2示出了在不同培养基条件下由大鼠MAPC形成的聚集体。
图3示出了表达oct3/4的细胞的百分比。
图4示出了通过悬滴法和强聚法形成的MAPC 2D和3D培养物中数种分化标志物的QRT-PCR表达谱。
图5示出了在7天中在MAPC培养基和5％氧气的2D培养中由低oct3/4MAPC形成的低oct3/4MAPC聚集体。
图6示出了被胰蛋白酶化并被重铺板于纤连蛋白包覆培养皿的MAPC培养基和5％氧气中的高oct3/4MAPC。
图7示出了在含有2％血清的分化基础培养基中MAPC聚集体的自发多向分化。
图8示出了使用QRT-PCR对MAPC聚集体的表征。
图9示出了使用多步方案进行分化的结果。
图10示出了分化21天后聚集体的形态学。
图11示出了从大鼠MAPC株系R2old和19起始，向肝细胞(A)、内皮细胞(B)和神经前体细胞(C)的定向分化。
具体实施方式
定义
当用于本文中时，下面的术语被定义为如下含义：
“2D”指当细胞通过附着(贴附)于基底生长时的细胞培养。当这些细胞都附着在基底(所述基底不是细胞自身)上时，细胞形成单层或克隆。
“3D”指当细胞通过细胞相互缔合并且不通过与细胞自身以外的基底结合而生长为聚集体时的细胞培养。在本领域中，“3D”可指细胞在支架或基质上的生长。然而，当用于本文时，3D的含义如上所述。
在一个实施方案中，首先可使细胞在基底上生长，其中某些细胞结合(贴附)于所述基底，然而进一步的生长形成细胞-细胞结合(聚集)，所述细胞-细胞结合(聚集)不依赖于所述进一步生长的细胞与所述基底结合。细胞饲养层也被认为是一种基底。因此细胞附着于饲养层也是贴壁培养(非聚集体)的一种形式，因为所述细胞的附着不是相互的而是附着于所述饲养层中的细胞。
″一个″或″一种″指一个或多于一个。
“聚集”指细胞的结合，其中所述结合是由细胞-细胞相互作用而不是贴附于基底所引起的。在2D单层培养中，细胞通过附着于基底材料(例如塑料或表面涂层)而相互“结合”。在聚集体中，两个或多个细胞通过相互生物附着而相互结合。这可通过表面蛋白例如胞外基质蛋白而实现。
“共给药”可包括两种或多种试剂的同时或相继给药。
在没有其他限制的情况下，“包含”指必须包括所指事物，但不对其他可包括的事物进行任何限制或排除。例如，“包含x和y的组合物”包括含有x和y的任何组合物，而不管所述组合物中是否存在其他成分。同样，“包含步骤x的方法”包括其中执行x的任何方法，不管x是所述方法中的唯一步骤还是只是步骤之一，也不管存在多少其他步骤以及x与这些步骤相比是简单还是复杂。“包括”和类似的使用词根“包”的短语在本文中用作“包含”的同意词并具有相同的含义。
“细胞因子”是指诱导或增强细胞运动例如干细胞、祖细胞或分化细胞(例如骨骼肌成肌细胞、心肌成肌细胞、肌细胞等)的归巢的细胞因子。细胞因子还可刺激这些细胞分化。
“终末内皮表型”是一种不再表达oct3/4、不表达原始内胚层基因Sox7、不表达中胚层基因Flk1，但表达Soxl7、Foxa2、上皮钙粘蛋白(E-cadherin)、CXCR4和PDGF-Ra的特定细胞表型。
“分化因子”是指细胞或化学因子，优选生长因子或血管生成因子，分化因子作用于干细胞或祖细胞以使其形成高度分化的后代。
“分散体”是指源自所述聚集体并保留了以聚集体形式存在的细胞的功能的细胞，因此它们仍可分化为一种以上胚层的细胞类型。
“有效量”通常指提供合乎需要的局部或全身效果——例如提高性能——的量。例如，有效剂量是足以实现有益或合乎需要的临床结果的量。所述剂量可通过一次或多次给药而给予，并可包括任意预选量的细胞。可基于每个受试者的个人因素精确确定有效剂量，所述个人因素包括他们的身高体重、年龄、损伤和/或疾病或正在治疗的损失，以及遭受损伤或疾病开始后的时间。本领域技术人员，尤其是医生，能够确定构成有效剂量的细胞数量。
“有效量”通常指提供合乎需要的局部或全身效果的量。例如，有效量是足以实现有益或合乎需要的临床结果的量。所述有效量可以单次给药的形式一次全部提供或以多次给药的形式分成几份的量提供(所述几份的量可以提供所述有效量)。可基于每个受试者的个人因素精确确定有效剂量，所述个人因素包括他们的身高体重、年龄、损伤和/或疾病或正在治疗的损失以及遭受损伤或疾病开始后的时间。本领域技术人员能够基于这些本领域中惯常的考虑因素确定给定受试者的有效量。当用于本文时，“有效剂量”与“有效量”具有相同的含义。
“EC细胞”是在对一种叫做畸胎瘤的癌症类型的分析中发现的。1964年，研究人员注意到畸胎瘤中的单个细胞可被分离并在培养中保持不分化状态。于是这种类型的干细胞被称为胚胎癌细胞(EC细胞)。
“胚胎干细胞”是源自称为胚泡的早期胚胎的内细胞团的干细胞。它们能够分化为三种原始胚层的所有衍生细胞：外胚层、内胚层和中胚层。这些包括成人体内超过220种细胞类型的每一种。ES细胞可成为体内除胎盘外的任何组织。
“扩增”指细胞增殖而不分化。
“肝分化因子”是诱导干细胞和祖细胞分化为分化程度更高的肝细胞系细胞的化学或生物学因子。肝分化因子包括但不限于Wnt3a、活化素A(ActivinA)、bFGF、BMP4、aFGF、FGF4、FGF8b、HGF和卵泡抑素。所述原始细胞可表达oct3/4。
“成肝细胞表型”是一种共表达白蛋白、α胎蛋白和角蛋白19并在细胞膜上表达c-Met、EPCAM和Dlk1的特定细胞表型(Tanimizu et al.，JCell Sci 116：1775-1786(2003))。
“肝细胞表型”是一种表达白蛋白和角蛋白18但不表达α胎蛋白和角蛋白19的特定细胞表型；此外，肝细胞可表达TAT、MRP2、G6P、GLYS2、PEPCK、A1AT、BSEP、CX-32、NTCP、CYP7A1(大鼠)和CYP3A4(人)中的一种或多种。
术语“包括”的使用并非意图进行限制。例如，陈述干细胞“包括”IPS细胞不表示排除其他干细胞。
“诱导的多能干细胞(IPSC或IPS细胞)”是例如通过引入外源基因而被重编程的体细胞，其中所述外源基因赋予所述体细胞分化程度较低的表型。然后这些细胞可被诱导以分化为分化程度更高的后代。可使用一种首先在2006年公开的方法的改进方法获得IPC细胞(Yamanaka et al.，Cell Stem Cell 1：39-49(2007))。例如，在一个实例中，为获得IPS细胞，科学家以皮肤细胞为起始材料，通过用反转录病毒的标准实验室技术对所述皮肤细胞进行改性以将基因插入到细胞DNA中。在一个实例中，所插入的基因为Oct4、Sox2、Lif4和c-myc，已知这些基因作为天然调控因子一起作用以使细胞保持在与胚胎干细胞相似的状态。文献已对这些细胞进行了描述。参见，例如，Wernig et al.，PNAS，105：5856-5861(2008)；Jaenisch et al.，Cell 132：567-582(2008)；Hanna et al.，Cell 133：250-264(2008)；以及Brambrink et al.，Cell Stem Cell 2：151-159(2008)。这些参考文献以引用的方式纳入以教导IPSC和制备它们的方法。也可通过特定培养条件(暴露于特定试剂)获得这些细胞。
术语“分离的”指不与一种或多种细胞或一种或多种细胞组分结合的细胞，但该细胞在体内时与这些细胞或细胞组分是结合的。“富集群落”指一种合乎需要的细胞相对体内或原代培养的一种或多种其他细胞类型的数量上相对增加。
然而，当用于本文时，术语“分离的”不表示只存在一种特定的合乎需要的细胞，例如干细胞或祖细胞。而是，术语“分离的”表示细胞从其天然组织环境中被取出，并且以相对所述正常组织环境更高的浓度存在。因此，“分离的”细胞群落可进一步包括干细胞以外的细胞类型，并且可包括其他组织成分。这可用细胞加倍来表示。例如，细胞可在体外增加10、20、30、40或更多倍，从而相对其在体内或在原始组织环境(例如骨髓、外周血、脐带血、脂肪组织等)中的原始数量发生富集。
“肝定向内胚层表型”是EPCAM阳性和Dlk1阴性(Tanimizu et al，JCell Sci 116：1775-1786(2003))的特定细胞表型。
“MAPC”是“多能成体祖细胞”的首字母缩写。其指在分化时可产生全部三种胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)的细胞类型的非胚胎干细胞。与胚胎干细胞类似，人MAPC可表达端粒酶、oct3/4(即oct3A)、rex-1、rox-1、sox-2、SSEA-4中的一种或多种，并可表达nanog。MAPC中的术语“成体”是非限制性的。其指非胚胎体细胞。据报道，MAPC表达高水平的端粒酶(Jiang et al.，Nature 418：41(2002)；Exp Hematol30：896(2002)，以引用的方式纳入以教导端粒酶表达)。源自人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物的MAPC似乎是迄今为止已知的唯一即使在晚期传代细胞中也表达非常高水平端粒酶的正常、非恶性体细胞(即非生殖细胞)。端粒在MAPC中延长。MAPC的核型是正常的。
“MAPC”中的术语“多能”指在分化时产生一种以上原始胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)例如全部三种的细胞系的能力。此术语在文献中的用法不一致。
“原始内胚层表型”是可表达sox7、sox17、gata4、gata6、Cited1、Tcf2、Lamb1、Dab2、LamA1、LamA4、Lamc1、Col4a1和Nidogen2的特定细胞表型(这是一种J.Rossant报道的小鼠和大鼠MAPC、XEN细胞以及J.Rossant报道的表达Sox7的ESC的表型。也见Ulloa-Montoyaet al.，Genome Biol 8：R163(2007)；Se′guin et al.，Cell Stem Cell 3：182-195(2008)；以及Kunath et al.，Development 132：1649-1661(2005))。
可培养并刺激“原始胚胎生殖细胞”(PG或EG细胞)以产生许多分化程度较低的细胞类型。
“祖细胞”是在干细胞分化过程中产生的具有某些但其有全部最终分化后代特征的细胞。定义的祖细胞，例如“心肌祖细胞”定向到细胞系，但不定向到特异性或最终分化的细胞类型。当用于缩写″MAPC″时，术语“祖”不将这些细胞限定到特定的细胞系。
“自我更新”指复制出具有与亲代细胞相同的分化潜能的子代干细胞的能力。在本文中使用的相似的术语是“增殖”。
“干细胞”指可进行自我更新(即后代具有相同的分化潜能)并且也可产生在分化潜能受到更多限制的后代细胞的细胞。在本发明的上下文中，干细胞还可包括已经例如通过核移植、通过与更原始的干细胞融合、通过引入特异性转录因子或通过在特定条件下培养而分化的分化程度更高的细胞。参见，例如Wilmut et al.，Nature 385：810-813(1997)；Ying et al.，Nature 416：545-548(2002)；Guan et al.，Nature 440：1199-1203(2006)；Takahashi et al.，Cell 126：663-676(2006)；Okita et al.，Nature 448：313-317(2007)；以及Takahashi et al.，Cell 131：861-872(2007)。
分化也可通过给予某些化合物或置于可导致分化的体外或体内物理环境下而导致。干细胞还可源自异常组织，例如畸胎瘤，以及某些其他来源，例如拟胚体(虽然拟胚体可被认为是胚胎干细胞，因为它们源自胚胎组织，尽管不直接来自内细胞团)。
“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于人、家畜、竞技动物和宠物。需要用本发明的方法治疗的受试者包括由于物理损伤或疾病有关的损伤而患有功能丧失的受试者。
术语“治疗有效量”指确定在哺乳动物中产生任何治疗性反应的量。例如，有效量的治疗性细胞或细胞相关试剂可延长患者的存活和/或抑制明显的临床症状。具有治疗效果的治疗，在该术语用于本文时的含义下，包括改善患者生命质量的治疗，即使所述治疗未改善疾病本身的后果。这种治疗有效量由本领域普通技术人员通过例如在临床和临床前试验中常规施用于受试者群体而确定。因此，进行治疗”是指递送这一量。
“治疗”在本发明中广泛地使用，这一术语均包括预防、缓解、抑制或治愈缺陷、功能障碍、疾病或其他有害过程，包括干扰治疗和/或由治疗引起的过程。
发明人已发现非胚胎干细胞可生长为聚集体并且所述聚集体包含保留所述非胚胎干细胞的未分化表型的细胞。因此，所述聚集物能够产生具有分化程度更高的表型的子代。形成聚集体的能力对于大规模细胞生产很有用。
可用于本发明的干细胞可包括未转化的细胞或非致瘤的细胞。它们可具有正常核型。例如，已知某些细胞，例如MAPC，在体内不形成畸胎瘤并在培养中具有正常核型。
所述聚集体可通过使用任何非贴壁生长的方法例如任何本领域的任何已知方法形成。这些包括，但不限于，悬滴法(Kurosawa和Hopfl，在下面引用)、强聚法(离心分离)(Ng，在下面引用)、在非帖附塑料上培养细胞的方法、悬浮培养(静置或搅拌的)、生物反应器扩增平台以及非贴附或特殊涂层(例如温度敏感的聚合物基)的平板、控制克隆大小的微印孔和微流体设备。
本领域已知多种不同的基础培养基。使用这些培养基可加入或不加入血清(或在不同的血清浓度下，例如0.5％-20％或更高)。当无血清或血清很少时，本领域普通技术人员会知晓使用生长因子(包括但不限于EGF和/或PDGF)以补充所述基础培养基。氧气浓度可从大气压降低至1-5％、5-10％、10-15％、15-20％的范围以及之间的值。
形成所述聚集体的干细胞可源自多种组织，例如骨髓、胎盘、外周血、脐带血和组织、皮肤和脂肪。本申请中举例说明了文献中称为″MAPC″的细胞。但本申请还涵盖形成一种以上胚层细胞类型的任何非胚胎干细胞。参见，例如，U.S.7,311,905；2003/0059414；2002/0164794，这些都以引用的方式纳入以教导这些细胞及其制备方法。
此外，分化程度更低的干细胞可通过多种操作获得，例如，通过转染并在分化细胞中表达某些基因以在遗传上重编程为不分化状态；将体细胞核移植到可产生对应于分化程度比体细胞更低的表型的基因表达环境中；在足以维持多能性的培养基和培养条件(例如“MAPC培养基”和扩增方案)下生长；通过体细胞与胚胎干细胞融合的核重编程；培养诱导的重新程序化细胞的外植；以及用来自卵母细胞或多能性细胞的细胞提取物处理体细胞核(Hochedlinger and Jaenisch，Nature 441：1061-1067(2006))。
本发明适合任何物种的干细胞，特别适合哺乳动物，尤其适合人。在一个物种内，可使用同种异体细胞(例如，将细胞给予受试者)。跨种时，可使用异种细胞。在一个主题中，细胞可为自体的。
对于本发明，聚集体定义为至少10个细胞。但范围包括没有大到导致内层细胞坏死的聚集体。这可包括100-300μ及之间数值的聚集体，例如150-250μ。本领域技术人员会认识到该范围内任何可用数值。用于临床应用的聚集体的可用数值应大于50。细胞数目是变化的，可从数百到一万或更多，例如100-1000(约200、300、400、500、600、700、800、900个细胞)、1000-10000(约2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000个细胞)、10000-50000(约20000；30000；40000个细胞)或更多等。
本申请中提供的实例利用称为多能成体祖细胞(″MAPC″)的细胞。但本发明适合不是胚胎细胞但可分化为一种以上胚层(例如两或三种)的全部类型的任何或全部干细胞。
形成聚集体的另一参数是用于形成聚集体的分离干细胞群体的纯度。因此，在本发明中，聚集体可由存在于也含有其他细胞的群体中的所需干细胞构成。例如，骨髓细胞包含细胞的混合群体，其可被纯化到足以产生所需效果的程度。本领域技术人员可使用多种熟知的方法(例如荧光激活细胞分选(FACS))容易地确定所需干细胞在群体的百分比。给定干细胞的纯度也可根据群体内的基因表达谱确定。
包含给定干细胞的群体的纯度范围为约50-55％、55-60％和65-70％。其他范围包括约70-75％、75-80％、80-85％的纯度。其他范围还包括约85-90％、90-95％和95-100％的纯度。然而，也可使用更低纯度的群体，例如约25-30％、30-35％、35-40％、40-45％和45-50％。
在所述聚集体中，非胚胎细胞例如MAPC可为基本同种的或以基本不同种的形式存在。因此，所述聚集体中的纯度可如上变动。此外，可在形成所述聚集体时混合其他细胞类型。
在将所述聚集体置于分化条件下以产生本申请中讨论的某些分化细胞类型的方法中，许多——如果不是绝大多数——所述条件是本领域普通技术人员可获得的。参见，例如，Mays et al，Expert Opinion Biol Ther2：173-184(2007)以及其中关于分化方案的链接(肝细胞(J Clin Invest109：1291-302；生血的(J Exp Med 204：129-39)、平滑肌(J Clin Invest116：3139-3149(2006))。这些分化条件以引用的方式纳入本文中。许多分化条件在U.S.7,015,037和Mays et al.(见上文)中，这些方案以引用的方式纳入本文中。
形成所述聚集体的一个方案是使用低葡萄糖DMEM、MCDB、2％胎牛血清、PDGF-BB、EGF、LIF、BSA、胰岛素-硒-铁传递蛋白(ITS)、亚油酸和脂质混合物以及5％氧气。优选地使用这样的条件，所述条件将oct3/4转录因子的表达增强到例如2D(贴壁)培养的MAPC中表达的水平。
聚集方法
至少有两种形成所述聚集体的方法：(a)悬滴法(基于表面张力的方法)；和(b)强聚法(以1500rpm物理离心4分钟使细胞聚集到96孔超低吸附U底板(Corning)的底部)。尽管两种方法都可用于形成聚集体，然而悬滴法对于产生大量聚集体更经济。其他方法包括搅拌悬浮法或在非吸附的平板/烧瓶中生长。形成受控大小的聚集体的其他可能方法可为例如微接触印刷法。
下面给出的文献描述了这些方法，这些文献以引用的方式纳入本文中以教导非贴壁细胞培养方法。
Dang et al.，“Efficiency of embryoid body formation and hematopoieticdevelopment from embryonic stem cells in different culture systems”Biotechnology andBioengineering 78：442-453(2002).
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Ng et al.，：Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cellsinto embryoid bodies fosters robust，reproducible hematopoietic differentiation.Commentary”Blood 106：1601-1603(2005)[Forced aggregation method].
Kurosawa et al.，“A simple method for forming embryoid body from mouseembryonic stem cells”Journal of Bioscience and Bioengineering 96：409-411(2003).
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Hopfl et al.，“Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies”MethodsMol Biol 254：79-98(2004)[Hanging drop method].
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Wang et al.，“Scalable producing embryoid bodies by rotary cell culture systemand constructing engineered cardiac tissue with ES-derived cardiomyocytes in vitro”Biotechnol Prog 22：811-818(2006)[Rotary suspension systems].
Yang et al.，Biomacromolecules 8，9，2746-2752(2007)[Use of temperaturesensitive hydrogel].
Torisawa et al.，“Lab on a Chip”7：770-776(2007)[Use of microfluidics forefficient EB size formation].
所述聚集体可由100个以上的起始细胞构成。已经使用最多4000个细胞以4天以上的悬滴法/强聚法来构成单个聚集体。从1000个细胞起始，以悬滴法培养4天后所述聚集体具有约6600个细胞/聚集体(用台盼蓝排除法计数)的数目。因此，可用的起始范围可为每聚集体100-4000，最优值为400-2000。
干细胞
可优选地使用脊椎动物物种例如人、非人灵长类、家畜、牲畜和其他非人哺乳动物的干细胞实行本发明。
非胚胎细胞
被报道能够分化为一种以上胚层细胞类型的非胚胎细胞包括但不限于，脐带血细胞(参见美国专利公开No.2002/0164794)、胎盘(参见美国专利公开No.2003/0181269)、脐带基质(Mitchell et al.，Stem Cells，21：50-60，2003)、小胚胎样干细胞(Kucia et al.，J Physiol Pharmaco，57Suppl 5：5-18，2006)、羊水干细胞(Atala，A.，J Tissue Regen Med 1：83-96，2007)、源自皮肤的前体细胞(Toma et al.，Nat Cell Biol 3：778-784，2001)、脂肪组织(U.S.2005/0153442)、胃肠道干细胞、表皮干细胞和也被称为“卵圆细胞”的肝脏干细胞(Potten et al.，Trans R Soc Lond B Biol Sci353：821-830(1998)；Watt，F.，Trans R Soc Lond B Biol Sci 353：831(1997)；Alison et al.，Hepatology 29：678-683(1998))，以及骨髓(参见美国专利公开No.2003/0059414和2006/0147246)，上述文献的每一篇都以引用的方式纳入本文中以教导这些细胞。
再编程体细胞的方法
若干不同方法，例如核移植、细胞融合和培养诱导的再编程，已用于诱导已分化细胞转化为胚胎状态。下面引用的参考文献以引用的方式纳入以教导如何制备这些细胞并对它们进行描述。
核移植包括将体细胞核注射到去核卵母细胞中，若将所述卵母细胞转移到代孕母体中可长成克隆(“生殖性克隆”)，或者，若外植培养可长成遗传匹配的胚胎干(ES)细胞(″体细胞核移植，″SCNT)。体细胞与ES细胞的细胞融合产生具有多能ES细胞全部性质的杂种细胞。体细胞的外植培养选择可具有多能性的永生细胞系。目前，精原干细胞是可从出生后动物中得到的多能细胞的唯一来源。用限定因子转导体细胞可启动向多能状态的再编程。这些实验方法已被广泛地综述(Hochedlinger and Jaenisch，Nature 441：1061-1067(2006)和Yamanaka，S.，Cell Stem Cell 1：39-49(2007))。
核移植
核移植(NT)，也称为体细胞核移植(SCNT)，是指将供体体细胞的细胞核引入去核卵母细胞中以长成克隆动物(Wilmut et al.，Nature385：810-813(1997))。通过NT实现的活体动物的产生表明了体细胞(包括最终分化的细胞)的表观遗传状态可被再编程为胚胎状态。
体细胞和胚胎干细胞的融合
体细胞核到未分化状态的表观遗传再编程已被胚胎干细胞与体细胞的融合所证明。多种体细胞和胚胎癌细胞的杂合细胞(Solter，D.，Nat RevGenet 7：319-327(2006)、胚胎生殖细胞(EG)或ES细胞(Zwaka andThomson，Development 132：227-233(2005))与亲代胚胎细胞具有许多相同的性质，表明在这些融合产物中多能性表型是显性的。与小鼠(Tada etal.，Curr Biol 11：1553-1558(2001))一样，人ES细胞具有在融合后再编程体细胞核的潜力(Cowan et al.，Science 309：1369-1373(2005))；Yu et al.，Science 318：1917-1920(2006))。可发生沉默多能性标志物例如oct4的激活(Do and Scholer， Stem Cells 22：941-949(2004))。当与神经干细胞融合时，ES细胞中Nanog的强制过表达促进多能性(Silva et al.，Nature441：997-1001(2006))。
培养诱导的再编程
已从胚胎来源获得了多能细胞，所述胚胎来源例如胚泡的分裂球和内细胞团(ICM)、外胚层(EpiSC细胞)、原始生殖细胞(EG细胞)和出生后精原干细胞(″maGSCsm″“ES样”细胞)。多能细胞以及它们的供体细胞/组织如下：单性生殖ES细胞源自小鼠卵母细胞(Narasimha et al.，Curr Biol 7：881-884(1997))；胚胎干细胞源自分裂球(Wakayama et al.，Stem Cells 25：986-993(2007))；内细胞团细胞(来源不适用)(Eggan et al.，Nature 428：44-49(2004))；胚胎生殖细胞和胚胎癌细胞源自原始生殖细胞(Matsui et al.，Cell，70：841-847(1992))；GMCS、maSSC和MASC源自精原干细胞(Guan et al.，Nature，440：1199-1203(2006)；Kanatsu-Shinoharaet al，Cell 119：1001-1012(2004)；和Seandel et al.，Nature 449：346-350(2007))；EpiSC细胞源自上胚层(Brons et al.，Nature 448：191-195(2007)；Tesar et al.，Nature，448：196-199(2007))；单性生殖ES细胞源自人卵母细胞(Cibelli et al.，Science 295L819(2002)；Revazova et al.，Cloning StemCells 9：432-449(2007))；人ES细胞源自人胚泡(Thomson et al.，Science282：1145-1147(1998))；MAPC源自骨髓(Jiang et al.，Nature，418：41-49(2002)；Phinney and Prockop，Stem Cells 25：2896-2902(2007))；脐带血细胞(源自脐带血)(van de Ven et al.，Exp Hematol 35：1753-1765(2007))；神经球源细胞源自神经细胞(Clarke et al.，Science，288：1660-1663(2000))。已知来自生殖细胞系的供体细胞PGC或精原细胞在体内是单能性的，然而已证明可在延长体外培养后分离多能ES样细胞(Kanatsu-Shinohara et al.，Cell，119：1001-1012(2004)或maGSC(Guan etal.，Nature 440：1199-1203(2006)。尽管这些多能细胞类型中的大多数能够在体外分化并形成畸胎瘤，然而按照更严格的标准，只有ES、EG、EC和源自精原干细胞的maGCS或ES样细胞是多能性的，因为它们能够形成出生后嵌合体并形成种系。最近，从成体小鼠的睾丸精原干细胞获得了多能成体精原干细胞(MASC)，这些细胞的表达谱不同于ES细胞(Seandelet al.，Nature 449：346-350(2007))而是类似于EpiSC细胞，EpiSC细胞源自植入后小鼠胚胎的上胚层(Brons et al.，Nature 448：191-195(2007)；Tesar et al.，Nature 448：196499(2007))。
通过限定转录因子的再编程
体细胞可再编程为ES样状态(Takahashi and Yamanaka，Cell126：663-676(2006))。小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和成体成纤维细胞通过oct4、sox2、c-myc和Klf4的转导被再编程为多能ES样细胞。细胞被称为iPS(诱导的多能干)细胞。尽管遗传实验已证明Oct4和Sox2对于多能性是必需的(Chambers and Smith，Oncogene 23：7150-7160(2004)；Ivanona et al.，Nature 442：5330538(2006)；Masui et al.，Nat Cell Biol9：625-635(2007))，然而c-myc和Klf4可能是非必需的(Nakagawa et al.，Nat Biotechnol 26：191-106(2008)；Werning et al.，Nature 448：318-324(2008)；Yu et al.，Science 318：1917-1920(2007))。
MAPC
一种本发明的示例性细胞称为″MAPC″，MAPC是“多能成体祖细胞”(非ES、非EG、非生殖细胞)的首字母缩写，MAPC具有分化为全部三种原始胚层(外胚层、中胚层和内胚层)细胞类型的能力。在MAPC中也已发现在ES细胞中发现的基因(例如端粒酶、Oct 3/4、rex-1、rox-1、sox-2)。Oct 3/4(在人中为Oct 3A)似乎是ES和生殖细胞特异的。MAPC代表一种比MSC更原始的祖细胞群体，并且具有包括上皮、内皮、神经、肌原、生血、生骨、肝原、软骨形成和生脂细胞系的分化能力(Verfaillie，C.M.，Trends Cell Biol 12：502-8，2002，Jahagirdar et al.，Exp Hematol29：543-56，2001；Reyes and Verfaillie，Ann N Y Acad Sci 938：231-233，2001；Jiang et al.，Exp Hematol 30896-904，2002；Jiang et al.，Nature 418：41-9，2002)。因此MAPC具有与ES细胞类似的广泛生物可塑性特征，同时保留使非胚胎干细胞具有吸引力的其他优点(例如正常核型以及不形成畸胎瘤)。
美国专利7,015,037和专利申请No.10/467,963描述了人MAPC，所述文献关于MAPC的描述的内容以引用的方式纳入本文中。在其他哺乳动物中也已发现MAPC。MAPC可从多种来源中分离，所述来源包括但不限于骨髓、胎盘、脐带和脐带血、肌肉、大脑、肝脏、脊索、血液和皮肤。
MAPC的分离和生长
在形成聚集体之前，可使用本文和美国专利7,015,037公开的方法分离和培养MAPC，该专利关于这些方法的内容以引用的方式纳入本文中。
此外，MAPC的培养密度可从约100个细胞/cm2到约150个细胞/cm2到约10000个细胞/cm2变动，包括约200个细胞/cm2到约1500个细胞/cm2到约2000个细胞/cm2。所述密度可在物种之间变动。此外，最佳密度可根据培养条件和细胞来源而变动。为给定的培养条件和细胞确定最佳密度在本领域普通技术人员的知识范围之内。
此外，在分离、生长和分化过程中的任意时间都可使用小于约10％包括约3-5％的有效大气氧浓度。
在针对MAPC的实施方案中，添加物为可使MAPC保留分化为全部三种细胞谱系的能力的细胞因子或组分。这可通过表达未分化状态的特异性标志物来表明。例如，MAPC组成型地表达Oct 3/4(Oct 3A)并保持高水平的端粒酶。监测基因表达的测定法(例如RT-PCR)在本领域中广为人知并可使用标准方法进行。
细胞培养
细胞可在低血清或无血清的培养基中培养。美国专利7,015,037描述了用于培养MAPC的无血清培养基。已在许多低血清或无血清的培养基中培养了许多种细胞。在这种情况下，在所述培养基中添加一种或多种生长因子。常用的生长因子包括但不限于成骨蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和表皮生长因子。参见如美国专利No.7,169,610；7,109,032；7,037,721；6,617,161；6,617,159；6,372,210；6,224,860；6,037,174；5,908,782；5,766,951；5,397,706和4,657,866；所述全部专利都以引用的方式纳入本文中以教导在无血清培养基中培养细胞。
用于识别分化细胞继而将其与未分化对应细胞分离的方法可通过本领域广为人知的方法进行。可通过在使分化细胞的数量超过未分化细胞的条件下，选择性培养细胞而识别已使用本发明方法诱导以分化的细胞。类似地，分化细胞可通过形态变化和不存在于其未分化对应细胞中的特性(例如细胞大小和胞内细胞器分布的复杂度)而识别。还涵盖了通过特异性细胞表面标志物(例如细胞受体和跨膜蛋白)的表达而识别分化细胞的方法。这些细胞表面标志物的单克隆抗体可用于识别分化细胞。这些细胞的检测可通过荧光激活细胞分选(FACS)和酶联免疫吸附测定实现。从特定基因的转录上调的角度看，分化细胞经常表现出与未分化细胞不同的基因表达水平。反转录聚合酶链式反应或RT-PC也可用于监测响应分化的基因表达的变化。使用微阵列技术进行的全基因组分析也可用于识别分化细胞。
因此，一旦识别了分化细胞，在必要时就可将它们从它们的未分化对应细胞中分离出来。上面详述的识别方法也提供分离方法，例如FACS、优选的细胞培养方法、ELISA、磁珠法以及它们的组合。本发明的一个实施方案涵盖了FACS基于细胞表面抗原表达来识别和分离细胞的应用。
药物制剂
由本文所述方法产生的任何细胞都可用于临床以处理受试者。因此，可将它们制剂成药物组合物。因此，在某些实施方案中，所述细胞存在于适于给药即生理上相容的组合物中。因此，组合物通常还包括一种或多种缓冲剂(例如中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽、佐剂(例如氢氧化铝)、使所述制剂与接体的血液相比等渗、低渗或稍微高渗的溶质、助悬剂、增稠剂和/或防腐剂。
在其他实施方案中，细胞存在于适于冷冻或储藏的组合物中。
在许多实施方案中，用于给予受试者的细胞的纯度为约100％。在其他实施方案中，其为95-100％。在其他实施方式中，其为95-100％。优选地，对于与其他细胞的混合物，所述百分比可为约10-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或90％-95％。或者，分离/纯度可以细胞倍增的形式表示，其中细胞已发生例如10-20、20-30、30-40、40-50或更多倍的细胞倍增。
给定体积的细胞数量可通过广为人知的和常规的方法和仪器测定。给定体积的细胞混合物中的细胞的百分数可通过几乎一样的方法测定。可手动或通过使用自动细胞计数器容易地对细胞进行计数。给定体积的特定细胞可使用特异性染色和目测以及通过使用特异性结合试剂(一般为抗体)、荧光标记和荧光激活细胞分选器的自动化方法而测定。
倚赖多种因素选择用于为给定用途给予所述细胞的剂型。在这些因素中，重要的是受试者的物种，待治疗的病症、功能障碍或疾病的性质及其在受试者中的状态和分布，其他待给予的疗法和试剂的性质，给药的最佳途径，经过该途径的残存性，给药方案以及其他本领域技术人员明了的因素。例如，具体地，合适载体和其他添加剂的选择会倚赖给药的确切途径和特定剂型的性质。
例如，细胞存活可为基于细胞的疗法的效力的一个重要决定因素。这对于主要治疗和辅助治疗都是成立的当。目标位点不适于细胞接种和细胞生长时会产生另一个担心。这可能会阻止治疗性细胞到达该位点和/或移植到那里。本发明的多个实施方案包括增加细胞存活和/或克服因接种和/或生长屏障而引起的问题的措施。
细胞/培养基的水性悬液的最终配制一般包括将所述悬液的离子强度调节到等渗(即约0.1-0.2)以及将pH调节到生理pH(即约pH 6.8-7.5)。所述最终制剂通常还含有液体润滑剂例如麦芽糖，其必须为身体所耐受。示例性润滑剂成分包括甘油、糖原、麦芽糖等。基于有机聚合物的材料，例如聚乙二醇和透明质酸以及非纤维状胶原(优选琥珀酸化的胶原)，也可用作润滑剂。这些润滑剂通常用于在注射位置上改善所注射生物材料的注射能力、润透性和分散性，以及通过改变所述组合物的粘性来降低推动力(spiking)。最后的配制是将所述细胞限定在可药用载体中。
随后将所述细胞置于注射器或其他注射装置中以精确注射到组织缺损的位点上。术语“可注射”指所述制剂基本不需推动即可在正常压力和正常条件下以带有低至25号针头的注射器中给予。推动可导致组合物从注射器溢出而非注射到组织中。对于这一精确布置，需要细至27号(200μI.D.)甚至30号(150μI.D.)的针头。可通过这些针头挤出的最大颗粒大小是至少具有以下参数的复杂函数：颗粒最大尺寸、颗粒长宽比(长：宽)、颗粒刚性、颗粒表面粗糙度和影响颗粒之间粘性的有关因素、悬浮液的粘弹性，以及通过针头的流速。悬浮于牛顿流体种的刚性圆珠代表最简单的情况，而在粘弹性流体中的纤维性或有分支的颗粒似乎复杂得多。
所述组合物的理想等渗性可使用氯化钠或其他可药用剂例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、或其他无机或有机溶质实现。氯化钠特别优选用于含有钠离子的缓冲液。
如果需要，可使用可药用的增稠剂将所述组合物的粘性保持在选定水平上。优选甲基纤维素，因为它可方便和经济地获得并且易于使用。其他合适的增稠剂包括例如黄原胶，羧甲基纤维素，羟丙基纤维素，卡波姆等。所述增稠剂的优选浓度取决于所选择的试剂。重要的是使用量可实现选定的浓度。粘性组合物通常是通过在溶液中加入所述增稠剂而制备的。
可药用的防腐剂或稳定剂可用于增加细胞/培养基组合物的寿命。如果加入所述防腐剂，那么选择不影响所述细胞生活力或效力的组合物完全在本领域技术人员的知识范围之内。
本领域技术人员会认识到所述组合物的成分在化学上应为惰性的。这在化学和药学原理方面不对本领域技术人员构成问题。可使用本公开内容提供的信息、本文引用的和本领域通常可获得的文献，参考教科书或通过简单实验(不包括过度试验)可以容易地避免问题。
无菌可注射溶液可通过以下方式制备：根据需要，将用于实现本发明的细胞与不同量的其他成分掺入所需量的合适溶剂中。
在某些实施方案中，细胞被制成单位剂量的可注射形式，例如溶液、悬液或乳液。适于细胞注射的药物制剂通常为无菌水性溶液和分散体系。用于可注射制剂的载体可为溶剂或分散介质，含例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的合适混合物。
本领域技术人员可容易地确定将在本发明方法中给予的组合物中的细胞和可选添加剂、媒介(vehicle)和/或载体的量。通常，任何添加剂(除所述细胞以外)都以0.001-50wt％的量存在于溶液例如磷酸缓冲盐水中。所述活性组分以微克至毫克量级存在，例如约0.0001到约5wt％，优选约0.0001到约1wt％，最优选约0.0001到约0.05wt％，或者约0.001到约20wt％，优选约0.01到约10wt％，最优选0.05到约5wt％。
在某些实施方案中，将细胞封装以给药，特别是当胶囊化可提高治疗效力时或者提供处理和/或贮藏寿命上的优点时。在某些实施方案中，当胶囊化增加细胞介导的免疫抑制的效力时，它也因此降低对免疫抑制药物治疗的需要。
此外，在某些实施方案中，胶囊化提供可进一步降低受试者对所述细胞(通常在同种异体移植中不是免疫原性的或者只是微弱免疫原性的)的免疫反应的针对受试者免疫系统的屏障，从而减轻由于给予所述细胞而可能发生的任何移植排斥或炎症。
细胞可在植入前通过膜以及胶囊进行封装。应考虑到，可使用可用于细胞胶囊化的多种方法中的任意一种。在某些实施方案中，细胞被单独封装。在某些实施方案中，许多细胞被封装在同一膜内。在其中所述细胞在植入后被取出的实施方案中，一个例如在单个膜内封装许多细胞的较大尺寸的结构可提供方便的回收方法。
在微囊化细胞的多种实施方案中可使用多种材料。这些材料包括例如聚合物胶囊，藻酸盐-聚-L-赖氨酸-藻酸盐微胶囊、聚-L-赖氨酸藻酸钡胶囊、藻酸钡胶囊、聚丙烯腈/聚氯乙烯(PAN/PVC)中空纤维以及聚醚砜(PES)中空纤维。
可用于细胞给药的细胞微囊化技术为本领域技术人员已知，在例如Chang et al.，1999；Matthew et al.，1991；Yanagi et al.，1989；Cai et al.，1988；Chang，T.M.，1992以及美国专利No.5,639,275(其描述了例如用于长期维持可稳定地表达生物活性分子的细胞的生物相容胶囊)中描述了这些技术。胶囊化的其他方法见欧洲专利公开No.301,777和美国专利No.4,353,888；4,744,933；4,749,620；4,814,274；5,084,350；5,089,272；5,578,442；5,639,275和5,676,943。所有上述文献与细胞胶囊化有关内容都以引用的方式纳入本文中。
某些实施方案将细胞加入聚合物中，例如生物聚合物或合成聚合物。生物聚合物的实例包括但不限于纤维连接蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、胶原和蛋白多糖。其他因子例如上面讨论的细胞因子也可被加入所述聚合物中。在其他实施方案中，细胞可被加入三维凝胶的空隙中。大的聚合物或凝胶通常通过手术植入。可配制成足够小的颗粒或纤维的聚合物或凝胶可通过其他常规的、更方便的、非手术的途径给予。
具体地，对于治疗肝脏缺陷的情况，所述细胞可被封装在一个可植入受试者的装置中。细胞可被植入到肝脏中或肝脏附近或其他位置以取代或补充肝脏功能。细胞也可不在装置中而植入，例如现有的肝脏组织中。
给药方案
组合物可根据诸如具体患者的年龄、性别、体重和病症，以及将给药的制剂(例如固体或液体)等因素，按剂量并通过医药和兽医领域技术人员公知的技术给药。人类或其他哺乳动物的剂量可由技术人员根据本公开内容、本文引用的文献以及本领域的知识，不需过度实验而得出。
适用于本发明多个实施方案的细胞剂量取决于多种因素。其对于不同的情况可发生相当大的变动。可确定主要和辅助治疗的最佳给药剂量的参数包括下面的一些或全部：要治疗的疾病及其阶段；受试者的物种、它们的健康、性别、年龄、体重和代谢速率；受试者的免疫活性；其他正在给予的疗法；以及根据受试者的历史或基因型预测的可能并发症。所述参数还可包括：所述细胞是同基因的、自体的、同种异体的还是异种的；它们的效能(具体活性)；使所述细胞有效而必须靶向的位点和/或分布；以及所述位点的这些特性例如细胞的可达性和/或细胞的植入性。其他参数包括与其他因子(例如生长因子和细胞因子)的共给药。给定情况下的最佳剂量还要考虑将细胞制剂的方式、给予它们的方式、给药后细胞定位到靶标位点的程度。最后，最佳剂量的确定必须提供这样的有效剂量，即所述剂量既不低于最大有益效果的阈值也不高于剂量相关的有害作用超过增加剂量的益处的阈值。
对于某些实施方案，细胞的最佳剂量处在用于自体、单核骨髓移植的剂量范围内。对于非常纯的细胞制剂，在不同实施方案中，每次给药的最佳剂量可为104-108细胞/kg接受者质量。在某些实施方案中，每次给药的最佳剂量为105-107细胞/kg。在许多实施方案中，每次给药的最佳剂量为5x105-5x106细胞/kg。用于参考，前述较高的剂量与用于自体单核骨髓移植的成核细胞的剂量相似。某些较低的剂量与用于自体单核骨髓移植的CD34+细胞/kg的数量相似。
应理解，单份剂量可一次、分份或在一段时间内连续递送。也可将整份剂量递送到一个位置或分散到若干个位置。
在各种实施方案中，细胞可以一个初始剂量给药，然后通过再次给药保持。细胞可在开始通过一种方法给药，然后通过相同方法或者一种或多种不同方法给药。水平可通过继续给予所述细胞而保持。各种实施方案通过静脉注射在开始时给予所述细胞和/或保持它们在受试者中的水平。在多种实施方案中，可根据患者的病情和本文其他地方讨论的其他因素使用其他给药形式。
应注意，人类受试者接受治疗的时间通常长于实验动物，然而，治疗的长度通常与疾病过程和治疗效果的长度成比例。本领域技术人员会考虑使用在人和/或动物(诸如大鼠、小鼠、非人灵长类等)中实行的其他方法的结果，以确定用于人的合适剂量。基于这些考虑并根据本公开内容和现有技术所提供的指导的，这种确定可使技术人员不需过度实验而确定剂量。
初始给药和再次给药或连续给药的合适方案可以都相同或者可以是变化的。合适方案可由技术人员根据本公开内容、本文引用的文献以及本领域的知识，不需过度实验而得出。
治疗的剂量、频率和持续时间取决于许多因素，包括疾病的性质、受试者以及可能给予的其他疗法。因此，多种方案可用于给予所述细胞/培养基。
在某些实施方案中，将细胞以一个剂量给予受试者。在其他一些实施方案中，将细胞以一系列的两个剂量或多个剂量连续给予受试者。在其中以一个剂量、两个剂量和/或多于两个的剂量给予细胞的其他一些实施方案中，剂量可相同或不同，并且给药之间的间隔可相同或不同。
细胞可在各种不同时间内以多种频率给药。在某些实施方案中，细胞在小于1天的时间内给药。在其他实施方案中，它们在2、3、4、5、或6天的时间内给药。在某些实施方案中，细胞在数周的时间内以每周一次或多次给药。在其他实施方案中，细胞在数周的时间内给药持续一到数月。在多种实施方案中，细胞可在数月的时间内给药。在其他实施方案中，细胞可在一或数年的时间内给药。通常治疗长度是与疾病过程的长度、所用疗法的效果以及要治疗的受试者的情况和反应成比例的。
应用
有用细胞以聚集体形式或以源自所述聚集体的细胞的形式存在。大量细胞可通过聚集方法生产，然而可取出可继续使用的细胞，例如从所述聚集体解聚或分散的细胞。因此，例如，药物组合物可包含以聚集体形式存在或源自所述聚集体(例如通过分散)的细胞。同样，分化因子可用于以聚集体形式存在的细胞或源自所述聚集体的细胞。因此，药物组合物可通过将分化条件应用于所述聚集体或源自所述聚集体的细胞而形成的分化细胞制成。此外，下面描述的临床应用涉及未分化聚集体和源自所述聚集体的未分化细胞，以及所述聚集体的分化后代合源自所述聚集体的细胞的分化后代的体内应用。与它们的分化后代一样，未分化细胞也是可用的，因为它们可在体内产生那些后代(未分化细胞即使在不分化时也可用于其他有益目的例如血管发生、免疫调节、细胞发生、营养等。)
所述聚集体细胞或源自所述聚集体的细胞可具有被诱导分化以形成中胚层、神经外胚层和内胚层源的至少一种分化细胞类型的能力。例如，所述细胞可具有被诱导分化以形成至少一种选自以下的细胞的能力：成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、骨骼肌、平滑肌、心肌、内皮细胞、上皮细胞、造血细胞、神经胶质细胞、神经元细胞或少突胶质细胞类型。
本发明还提供从上述细胞获得的分化细胞，其中其后代细胞可为骨、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、骨骼肌、平滑肌、心肌、内皮细胞、上皮细胞、内分泌细胞、外分泌细胞、造血细胞、神经胶质细胞、神经元细胞或少突胶质细胞。所述分化后代细胞可为皮肤上皮细胞、肝上皮细胞、胰腺上皮细胞、胰腺内分泌细胞或岛细胞、胰腺外分泌细胞、肠上皮细胞、肾上皮细胞或上皮相关结构。
细胞或其分化后代可用于纠正遗传疾病、退化性疾病、心血管疾病、代谢贮积病、神经疾病或癌症过程。它们可用于产生用于治疗牙周病的齿龈样材料。它们可用于形成皮肤上皮组织，所述皮肤上皮组织源自可用于皮肤移植和整形手术的细胞。它们可用于例如在阴茎或心脏中强化肌肉。它们可用于产生治疗用体外血，或产生人造血细胞和/或人用出生前或出生后动物血。它们可用作治疗剂以例如在患者从癌症治疗、自身免疫疾病治疗的化疗或放疗恢复中起辅助作用，以引起接受者的耐受性。它们可用于治疗AIDS或其他传染病。
视神经细胞可用于治疗由包括但不限于视神经疾病导致的失明，所述视神经疾病由包括但不限于黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、青光眼、视网膜色素变性导致。
所述细胞或源自所述细胞的心肌细胞可用于治疗心脏病，包括但不限于心肌炎、心肌病、心力衰竭、由心脏病发作导致的损伤、高血压、动脉粥样硬化和心脏瓣膜功能不全。它们还可用于治疗涉及CNS缺陷或损伤的疾病。此外，所述干细胞或其神经元分化后代细胞可用于治疗涉及神经缺陷或退化的疾病，包括但不限于中风、阿尔茨海默氏症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、艾滋病相关痴呆、脊髓损伤、影响脑部或其他神经组织的代谢性疾病。
细胞或它们的分化后代例如基质细胞可用于支持其他细胞类型在体内或体外的生长和分化，所述其他细胞类包括但不限于造血细胞、胰腺岛细胞或β细胞、肝细胞等。所述细胞或分化软骨后代，可用于治疗关节或软骨疾病，包括但不限于软骨撕裂、软骨变薄、骨关节炎。此外，所述细胞或它们的分化成骨细胞后代可用于改善对骨具有有害效果的过程，包括但不限于骨折、骨折不愈合、骨关节炎，由扩散到骨的肿瘤(例如前列腺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤等)导致的骨“洞”。
使用合适的生长因子、趋化因子和细胞因子，细胞可被诱导以分化形成若干谱系，包括例如多种具有中胚层表型的细胞、具有神经外胚层表型的细胞(神经胶质细胞、少突胶质细胞和神经元)和具有内胚层表型的细胞。这些包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、软骨和骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、内皮细胞、造血细胞、基质细胞、神经元细胞和上皮细胞。
成骨细胞：已被诱导分化以形成骨细胞的细胞可在骨质疏松、佩吉特氏病(Paget’s disease)、骨折、骨髓炎、骨坏死、软骨发育不全、成骨不全症、遗传性多发性骨软骨瘤、多发性骨骺发育不良、玛丽安氏综合征(Marfan’s syndrome)、粘多糖贮积症、神经纤维瘤病或脊柱侧弯中用作细胞疗法或者用于组织再生，局部畸形、脊柱裂、半椎体或融合椎骨、肢体畸形的重建手术，肿瘤损伤组织的重建，以及感染(如中耳炎)后的重建。
软骨细胞：已被诱导分化以形成软骨细胞的细胞可用于与年龄有关的疾病或损伤、运动相关损伤中的组织再生，或特定疾病例如类风湿关节炎、银屑病关节炎、赖特关节炎(Reiter’s arthritis)、溃疡性结肠炎、克罗恩病(Crohn’s disease)、强直性脊柱炎、骨关节炎中的细胞疗法或者组织再生；外耳的重建手术；鼻的重建手术；以及环状软骨的重建手术。
脂肪细胞：已被诱导分化以形成脂肪细胞的细胞可用于重建或整容手术的重塑，包括但不限于，乳房切除术后的乳房重建、对因其他手术例如从脸或手上切除肿瘤造成的组织丧失进行整形、隆胸和去皱。还可用于II型糖尿病的治疗。因此衍生的脂肪细胞还可提供用于研究脂肪调节的有效体外模型系统。
成纤维细胞：源自所述细胞的成纤维细胞可用于细胞疗法或组织修复以促进伤口愈合或提供结缔组织支撑物，例如整容手术的支架。
骨骼肌：已被诱导分化以形成骨骼肌细胞的细胞可用于杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy)、贝克肌营养不良症(Beckermuscular dystrophy)、强直性肌营养不良症、骨骼肌肉病变的治疗中的组织修复，以及修复骨骼肌损伤的重建手术。
平滑肌：已被诱导分化以形成平滑肌细胞的细胞可用于胃肠系统发育异常例如食道闭锁、肠闭锁和肠套叠的治疗中的细胞疗法或组织修复，以及肠梗塞或结肠造口手术后的组织替换。平滑肌细胞还可用于膀胱或子宫重建、新血管形成、由例如动脉粥样硬化或动脉瘤造成的血管损伤的修复。平滑肌前体细胞(肾小球膜细胞)可用作肾小球疾病的体外模型或用于糖尿病性神经病中的细胞疗法或组织再生。平滑肌前体还可用于修复远曲小管或肾小球旁组织的致密斑。
心肌细胞：心肌细胞可用于治疗心肌梗塞后的、伴随充血性心力衰竭的、瓣膜置换过程中的、由先天性心脏异常引起的或者由心肌病或心内膜炎引起的心脏组织损伤的细胞疗法或组织修复。
小神经胶质细胞：小神经胶质细胞可用于治疗脊髓损伤和神经退化性障碍例如亨廷顿氏症(Huntington’s disease)、帕金森氏症、多发性硬化症和阿尔茨海默氏症，以及用于影响中枢神经系统的传染病过程中损伤组织的修复。被遗传改变以产生细胞因子的小神经胶质细胞还可用于移植以治疗通道因血脑屏障被限制的中枢神经系统中的传染病。神经胶质细胞还可产生由多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症和脑癌引起的中风后神经组织再生以及脊髓损伤后再生的生长因子或生长因子抑制因子。
基质细胞：基质细胞可用作化疗后骨髓置换和骨髓移植的移植细胞。
内皮细胞：内皮细胞可用于治疗因子VIII缺陷和用于新血管形成。内皮细胞还可提供使用血管形成抑制因子抑制肿瘤的体外模型，以及血管炎、超敏反应和凝血障碍的体外模型。
造血细胞：造血细胞可用于在高剂量化疗后再增殖骨髓。源自所述聚集体细胞的造血细胞可进一步分化以形成血细胞，以贮存在血库中，缓解输血血液不足的问题。
神经外胚层细胞：小神经胶质细胞可用于治疗脊髓损伤和神经退化性障碍例如亨廷顿氏症、帕金森氏症、多发性硬化症和阿尔茨海默氏症，以及对影响中枢神经系统的传染病中损伤组织的修复。被遗传改变以产生细胞因子的小神经胶质细胞还可用于移植，以治疗通道因血脑屏障被限制的中枢神经系统中的传染病。神经胶质细胞还可产生由多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症和脑癌引起的中风后神经组织再生以及脊髓损伤后再生的生长因子或生长因子抑制因子。被诱导形成少突胶质细胞和星形胶质细胞的细胞，例如，可用于移植到脱髓鞘组织尤其是脊髓中，在那里它们的功能是为周围神经组织加髓鞘。所述细胞还可用于细胞置换疗法和/或基因疗法以治疗先天性神经退化障碍或贮积障碍例如粘多糖贮积症、脑白质营养不良(球状细胞脑白质营养不良、卡纳文氏症(Canavan’s disease))、岩藻糖血症、GM2神经节苷脂沉积症、尼曼-皮克病(Niemann-Pick)、圣菲利波综合征(Sanfilippo syndrome)、沃尔曼氏病(Wolman’s disease)和泰-萨克斯病(Tay Sachs)。它们还可用于创伤性疾病例如中风、中枢神经系统出血和中枢神经系统创伤；用于周围神经系统疾病例如脊髓损伤或脊髓空洞症；用于视网膜疾病例如视网膜脱离、黄斑变性和其他退化性视网膜疾病，以及糖尿病性视网膜病变。
外胚层上皮细胞：细胞可用于细胞置换疗法和/或基因疗法中，以治疗或缓解皮肤病例如脱发、皮肤缺损如皮肤烧伤和白化病的症状。
内胚层上皮细胞：上皮细胞可用于细胞置换疗法和/或基因疗法中，以治疗或缓解若干器官病的症状。所述细胞可用于治疗或缓解先天性肝脏疾病，例如，贮积病如粘多糖贮积症、脑白质营养不良、GM2神经节苷脂沉积症；胆红素增加病变，例如克里格勒-纳贾尔综合征(Crigler-Najjar syndrome)；氨病，例如尿素循环的先天性障碍如鸟氨酸脱羧酶缺乏症、瓜氨酸血症和精氨酸琥珀酸尿症；氨基酸和有机酸的先天性障碍，如苯丙酮尿症，遗传性酪氨酸血症和α抗胰蛋白酶缺乏症；以及凝血障碍例如因子VIII和IX缺乏症。所述细胞还可用于治疗由病毒感染导致的获得性肝病变。所述细胞还可用于体外，例如生成人工肝脏，产生凝血因子以及产生由肝脏上皮细胞生成的蛋白或酶。所述上皮细胞还可用于细胞置换疗法和/或基因疗法，以治疗或缓解胆病例如胆汁性肝硬化和胆道闭锁的症状。所述上皮细胞还可用于细胞置换疗法和/或基因疗法，以治疗或缓解胰腺疾病例如胰腺闭锁、胰腺炎和α抗胰蛋白酶缺乏症的症状。此外，当可得到胰腺上皮细胞、神经细胞时，可生成β细胞。这些细胞可用于糖尿病的治疗(皮下植入或者胰腺内或肝脏内植入)。此外，所述上皮细胞还可用于细胞置换疗法和/或基因疗法，以治疗或缓解肠道上皮病症例如肠道闭锁、炎性肠病、肠梗塞和肠切除的症状。
细胞可用于组织修复：细胞还可用于组织修复。可将细胞植入到骨中以增强所述修复过程，以强化变弱的骨或重新覆盖关节。可将软骨细胞注射到关节中以重新覆盖关节软骨。Caplan等人(美国专利5,855,619)描述了一种生物基质植入物，包括其中已加入间叶肝细胞的收缩凝胶基质。所述植入物旨在修复组织缺陷，尤其是肌腱、韧带、半月板或肌肉的损伤。例如，软骨可通过将软骨细胞加入到由例如胶原、合成聚乙醇酸纤维或合成聚乳酸纤维制成的多孔、三维支架的周边区域而形成。发明人已经证明，本发明的细胞分化以形成软骨细胞，例如，其可沉积在胶原、合成聚乙醇酸、合成聚乳酸或其他支架材料中或周围以提供植入物以促进组织修复。
细胞可用于产生用于移植的组织或器官，Oberpenning等人(NatureBiotechnology 17：149-155(1999))报道了通过以下方式形成起作用的膀胱：培养狗膀胱外的肌肉细胞和狗膀胱内的衬细胞，由这些培养物制备组织薄片，并用肌肉细胞在外侧、用衬细胞在内侧包覆小聚合物球。然后将所述球插入狗的泌尿系统中，在那里其开始起膀胱的作用。Nicklason等人(Science 284：489-493(1999))报道了由培养的平滑肌和内皮细胞制备血管移植物材料。由培养的细胞形成组织层的其他方法为本领域技术人员已知(参见Vacanti et al.，U.S.Patent No.5,855,610)。
出于本文所述的目的，可将分化或未分化形式的且遗传改变或未改变的自体、同种异体或异种细胞通过直接注射或结合可药用载体注射到组织位点、全身或可药用基底的表面上或周围来给予患者。
用于研究分化途径的模型系统
本发明提供一种使用所述聚集体或源自所述聚集体的细胞表征对生物学或药学试剂的细胞反应的方法，包括将所述细胞与一种或多种生物学或药学试剂接触，并鉴定对一种或多种生物学或药学试剂的一种或多种细胞反应。这些试剂可具有多种活性。它们可影响分化、代谢、基因表达、生活力等。因此，所述细胞可用于例如毒性试验和鉴定分化因子。
本发明的细胞可用于进一步研究发育过程，例如Ruley等人(WO98/40468)描述了用于抑制特定基因表达的载体和方法，以及获得那些被抑制基因的DNA序列的载体和方法。本发明的细胞可用载体例如Ruley描述的那些载体处理，这抑制可被DNA序列分析鉴定的基因表达。因此所述细胞可被诱导分化，并且改变的基因型/表型的效果可被表征。
Hahn等人(Nature 400：464-468(1999))证实，例如，当将先前发现的癌症相关基因的组合引入正常人上皮纤维细胞中时，所述细胞可被诱导以进行肿瘤发生转变。
使用含有可诱导表达元件的载体控制基因表达提供了研究某些基因产物对细胞分化的作用的方法。可诱导表达系统为本领域技术人员已知。一个这种系统是No等人描述的蜕皮素可诱导系统(Proc.Natl Acad.Sci，USA 93：3346-3351(1996))。
细胞可用于研究特定基因变化、毒性物质、化疗试剂或其他试剂对发育途径的作用。本领域技术人员已知的组织培养技术使得可大量培养成百上千个来自不同个体的细胞样品，提供快速筛选被怀疑例如产生畸形或产生突变的化合物的机会。
为研究发育途径，可用特异生长因子、细胞因子或其他试剂包括被怀疑产生畸形的化学品处理细胞。还可使用本领域已知的方法和载体对细胞进行遗传改变。此外，还可使用反义技术或处理来改变细胞，将蛋白引入所述细胞以改变天然基因序列的表达。例如，信号肽序列可用于将所需的肽或多肽引入所述细胞中。Rojas等人在Nature Biotechnology 16：370-375(1998)中描述了一种用于将多肽和蛋白引入细胞中的特别有效的技术。此方法产生可引入培养基并穿过细胞膜转移到细胞内部的多肽或蛋白产物。任何数量的蛋白都可以此方式使用以确定靶标蛋白对细胞分化的效果。或者，可使用Phelan等人(Nature Biotech.16：440-443(1998))描述的技术，将疱疹病毒蛋白VP22连接于功能蛋白以进入所述细胞。
也可通过引入外源DNA或者通过沉默或剪接基因组DNA对细胞进行遗传改造，以产生带有缺陷表型的分化细胞从而检测潜在化疗试剂或遗传治疗载体的效果。
试剂盒
可将细胞置于包装有合适材料的试剂盒中而提供。例如，可将细胞作为冻存储液提供——连同分别包装的前文所述的合适因子和培养基一起——用于在未分化状态下以正常单层和/或作为聚集体培养。此外，还可提供单独包装的用于诱导分化的因子。
肝表型的分化
本发明还具体地涉及培养细胞从而使所述细胞被诱导分化为表达肝细胞表型和/或肝祖细胞表型的细胞的方法。更具体地，本发明涉及培养细胞从而使所述细胞被诱导分化为表现终末内胚层表型、肝定向内胚层表型、成肝细胞表型和肝细胞表型的细胞的方法。本发明还涉及由本发明方法制备的细胞。细胞可用于例如肝脏缺陷的治疗、肝脏代谢研究和肝脏毒理学研究等。PCT/US08/82108描述了培养方法，该专利以引用的方式纳入本文以教导这些方法。例如，具体培养条件如下面编号的说明所述。
1.一种诱导细胞分化为具有肝细胞表型的细胞的方法，包括：
(a)用约5ng/ml到约500ng/ml Wnt3a和约10ng/ml到约1000ng/ml活化素A培养细胞；
(b)然后用约1ng/ml到约100ng/ml bFGF和约5ng/ml到约500ng/ml BMP4培养步骤(a)的细胞；
(c)然后用约5ng/ml到约500ng/ml aFGF和约2.5ng/ml到约250ng/ml FGF8b培养步骤(b)的细胞；以及
(d)然后用约2ng/ml到约200ng/ml HGF和约10ng/ml到约1000ng/ml卵泡抑素培养步骤(c)的细胞。
2.说明1的方法，其中在步骤(a)中用约50ng/ml Wnt3a和约100ng/ml活化素A培养所述细胞。
3.说明1的方法，其中在步骤(b)中用约10ng/ml bFGF和约50ng/mlBMP4培养所述细胞。
4.说明1的方法，其中在步骤(c)中用约50ng/ml aFGFa、约10ng/mlFGF4和约25ng/ml FGF8b培养所述细胞。
5.说明1的方法，其中在步骤(d)中用约20ng/ml HGF和约100ng/ml卵泡抑素培养所述细胞。
6.一种用于诱导细胞分化为肝细胞表型的方法，包括：
(a)用约50ng/ml Wnt3a和约100ng/ml活化素A培养所述细胞；
(b)然后用约10ng/ml bFGF和约50ng/ml BMP4培养步骤(a)的细胞；
(v)然后用约50ng/ml aFGF、约10ng/ml FGF4和约25ng/ml FGF8b培养步骤(b)的细胞；以及
(d)然后用约20ng/ml HGF和约100ng/ml卵泡抑素培养步骤(c)的细胞。
起始细胞可具有原始内胚层表型。步骤(a)-(d)可产生分别具有终末内胚层表型、肝定向表型、成肝细胞表型和肝细胞表型的细胞。
7.上述方法，其中在一个或多个步骤中将细胞培养在含有浓度为0％到约2％的血清的培养基中。
8.说明7的方法，其中在一个或多个步骤中将细胞培养在含有浓度为约2％的血清的培养基中。
9.上述方法，其中在一个或多个步骤中将细胞培养在含有约10-4M到约10-7M的地塞米松的培养基中。
10.说明9的方法，其中在一个或多个步骤中将细胞培养在含有约10-6M的地塞米松的培养基中。
11.上述方法，其中在一个或多个步骤中将细胞培养至少4天。
12.上述说明的方法，其中将表达原始内胚层表型的细胞培养约6天，将表达终末内胚层表型的细胞培养约4天，将表达肝定向内胚层表型的细胞培养约4天，并将表达成肝细胞表型的细胞培养约7天。
因此，本发明还涉及通过将本发明细胞给予患有肝脏缺陷的受试者从而治疗肝脏缺陷的方法。这些缺陷包括但不限于，毒性肝病、代谢性肝病、急性肝坏死、醋氨酚的影响、血色素沉着病、威尔森氏症(Wilson’sdisease)、克里格勒-纳贾尔综合征、遗传性酪氨酸血症、家族性肝内胆汁淤积症3型、鸟氨酸转移酶(OTC)缺乏症和尿素循环障碍。
其他疾病包括但不限于，病毒性肝炎，甲、乙、丙型慢性病毒性肝炎，甲、乙、丙、丁、戊型急性肝炎、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒型急性肝炎；其他传染病中的肝功能障碍，例如但非限制地，弓形体病、肝脾血吸虫病、梅毒肝病，钩端螺旋体病和阿米巴病；代谢疾病，例如但非限制地，血色素沉积症、吉尔伯特综合征(Gilbert’s syndrome)、杜宾-约翰逊综合征(Dubin-Johnson syndrome)和罗托综合征(Rotor’s syndrome)；酒精性肝病，例如但非限制地，脂肪肝、纤维化、硬化症、肝硬化；以及中毒性肝病。
本发明将就下面的详细实施例进行进一步的描述。
实施例
实施例1.多能成体祖细胞(MAPC)的自组装和到肝细胞谱系的分化
背景
更早的研究已经表明原始肝细胞的球状聚集体(3D)培养物可在长期培养中保持生活力并增强肝特异性功能。从出生后大鼠、小鼠和人骨髓中分离的MAPC以2D培养中在体外扩增而不衰老，并可分化为具有肝细胞形态、表型和功能特征的细胞。发明人研究了MAPC可自组装为3D聚集体并分化为肝细胞的可能性。MAPC被成功地诱导为3D聚集体，所述聚集体具有良好生活力、形态学和基于若干内胚层标志物(如HNF3b、AFP、AAT、TTR和白蛋白)的表达的分化潜能。制备具有肝细胞表型的细胞的分化方案可用于细胞疗法中。其他应用包括用在药物毒理学研究、生物人工肝支撑物和组织学中，以及作为研究发育和疾病的模型系统。
上面描述了4步21天分化方案，该方案为从MAPC到具有肝细胞形态、表型和功能特征的细胞的有效分化而对培养基成分、氧气水平和胞外基质进行了优化。观察到了内胚层基因时间依赖的表达，所述基因包括在早期代表通向定形内胚层的进程的鹅素(Goosecoid)、CXCR4和HNF3b，然后是对应肝特化开始的AFP和转甲状腺素蛋白(transthyretin)，以及到分化末期以在胎儿肝脏中的表达水平代表成熟的白蛋白、葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)和细胞色素P450的表达。除基因表达以外，分化细胞的蛋白水平表达也可通过以下方式观察，通过HNF3b、AFP、CK18和白蛋白的免疫组织化学，以及由白蛋白ELISA和糖原贮积的PAS染色所评估的其功能性质。
在研究了MAPC在2D单层中的这种分化后，发明人又研究了MAPC自组装为3D聚集体的能力并探索了加强分化的可能性。当在“MAPC培养基”和5％氧气的条件下培养时，MAPC被成功地诱导为具有良好生活力、形态学以及未分化表型(就oct3/4的高水平表达和无分化标志物表达而言)的3D聚集体。所述聚集体保留了自发进行多谱系以及定向分化为肝细胞谱系的能力，其中转录因子HNF4a、转录因子、DPPIV、胆管蛋白以及功能性肝标志物CYP2B1和G6P在3D分化中的表达与它们在相应2D分化中的表达相比有所提高。除了获得更多功能上成熟的分化细胞以外，3D培养还提供用于研究初期3D发育的独特模型系统并可能帮助设计可被监测和控制以加强分化的可放大培养系统。
肝细胞移植和基于细胞的疗法正发展为在治疗急性、慢性和代谢肝病时代替整体器官移植治疗疗法的可行临床治疗方案。已从骨髓、外周血、脐带血、胎儿和成人肝脏以及胚胎干细胞中鉴别了若干种干细胞或祖细胞，其具有在体外或体内增殖并分化为“肝细胞样”细胞的潜力。从出生后大鼠、小鼠和人骨髓分离的多能成体祖细胞(MAPC)可在体外扩增而不衰老、在单细胞水平上在体外和体内分化为三种胚层细胞谱系的不同细胞类型。MAPC具有当移植时不形成畸胎瘤的优点，并且可选自自体骨髓而不需进行免疫抑制。
尽管MAPC已被证明在体外分化为分泌白蛋白和尿素的白蛋白+CK18+上皮细胞，然而这些“肝细胞样”细胞不是完全分化的，并且培养物仍为混合的异质细胞群体。若干研究已经表明原始肝细胞的球状聚集体(3D)培养可在长期培养中导致对肝特异性功能的增强。发明人研究了MAPC自组装为3D聚集体的能力并探索了分化为肝细胞谱系的可能性。
MAPC到肝细胞谱系的分化的发生是由于与胚胎发生过程中标准肝脏发育相似的一系列连续的独立生物学事件。可采用4个连续步骤的20天分化程序，包括：定形内胚层的形成、腹侧前肠内胚层的特化、双能肝祖细胞或成肝细胞的富集以及到功能性“肝细胞样”细胞的成熟。当将所述细胞用含有活化素A和Wnt-3a的高地塞米松且无血清分化基础培养基处理6天，在第6-10天用含有bFGF和BMP4的基础培养基处理，在第10-14天用含有aFGF、FG8b和FGF4的础培养基处理，在最后的第14-21天用含有HGF和抑卵泡素的基础培养基处理时，定形的内胚层的标志物如鹅素和CXCR4在第一阶段短暂地表达，并且在mRNA水平上观察到若干内胚层标志物包括α-胎蛋白(AFP)、转甲状腺素蛋白(TTR)、白蛋白、α-1抗胰蛋白酶(AAT)、酪氨酸转氨酶(TAT)、精氨酸酶-1和葡萄糖-6-磷酸酶的持续增加。此外，白蛋白ELISA揭示了培养基中白蛋白水平随时间增加，白蛋白、AFP和CK18的蛋白表达水平通过免疫组织化学被确认，糖原贮积通过PAS染色被观察到。还有证据表明上述方案适用于使人胚胎干细胞分化为在mRNA水平上表达AFP、TTR和的白蛋白的细胞。尽管有证据表明在所述分化培养物中存在一些具有成熟肝细胞表型的细胞，然而分化后期阶段AFP和CK19的持续表达以及中胚层转录物(如内皮-钙粘蛋白(Ve-Cadherin)(内皮细胞标志物)和SM22(平滑肌标志物))的表达表明在不同成熟阶段存在中胚层细胞类型和的“肝细胞样”细胞的混合群体。因此，发明人的目的是研究三维(3D)培养系统促进肝细胞前体成熟的可能性以及使用启动子-报告子构建体从所述异质细胞群体中筛选成熟肝细胞或不成熟前体。
因此，发明人鉴别了以3D球状聚集体形式存在的未分化MAPC的优化生长条件并评估了其分化为若干细胞类型，特别是内胚层细胞谱系的潜力。发明人发现培养中未分化MAPC形成了3D聚集体，并且发现所述3D聚集体保留了分化能力。
实验
表达高水平oct3/4的大鼠MAPC克隆用于在低和高氧条件下使用MAPC培养基、无LIF(白血病抑制因子)MAPC培养基或分化基础培养基，在超过4天的时间内使用悬聚法(表面张力驱动)或强聚法(离心)形成MAPC聚集体。在这些方法中都使用400-4000细胞/孔的起始细胞数量。根据使用流式细胞仪和定量实时聚合酶链式反应(QRT-PCR)对形成的MAPC聚集体的表征，当oct3/4mRNA表达水平在聚集体形成前后的MAPC之间相同，并且在聚集体形成之前在MAPC中表达的细胞(约79％)的几乎90％在聚集体形成之后在蛋白水平上表达oct3/4时，含有LIF的MAPC培养基和低氧气条件是最佳的。此外，oct3/4mRNA水平在使用悬滴法或强聚法形成的聚集体之间是相当的。所述聚集体还以与在MAPC中的表达水平相当的水平表达GATA6、HNF3b和鹅素，并且未显示出对分化标志物如AFP、白蛋白、AAT和TAT的任何表达。当在分化基础培养基(去掉LIF、PDGF和EGF时)中自发分化时，所述细胞聚集体进行自发分化以表达对应神经外胚层的巢蛋白(Nestin)和Pax6、对应中胚层的FIk-1和SM22以及对应内胚层的AFP和白蛋白。尽管全部上述工作都使用大鼠高oct3/4表达的MAPC，然而低oct3/4大鼠MAPC也形成具有分化为若干细胞类型的能力的聚集体。还有证据表明小鼠MAPC克隆的3D聚集体也保留有oct3/4的表达，并随后在转移至分化基础培养基时能进行自发分化。
当使用早先针对肝细胞分化进行优化的方案使大鼠高oct3/4MAPC聚集体分化时，分化结果与基于肝标志物(如白蛋白、AFP、TTR、AAT和TAT)表达同时进行的高密度2D分化相当。因此，显然所述3D聚集体能够从“MAPC样”表型起始，在显著性水平上分化为肝细胞谱系。
所述分化聚集体的功能和结构性质：用于估计白蛋白分泌速率的ELISA，用于糖原贮积的PAS染色，用于研究向底部、顶部和侧面区域的极化的免疫染色，并且使用透射电子显微镜(TEM)阐明超结构特性。此外，还探索了这些表达oct3/4的MAPC聚集体用于MAPC的可放大扩增的潜在方法的应用。
材料和方法
“MAPC培养基”
MAPC培养基含有60％(v/v)的低葡萄糖杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基(DMEM培养基)(11885，Gibco BKL，Carlsbad，CA，USA)、40％(v/v)MCDB-201(M6770，Sigma)、1％(v/v)的IX胰岛素-铁硒传递蛋白(ITS；Sigma)、1％(v/v)的IX亚油酸牛血清白蛋白(LA-BSA；Sigma)、5×10-8M的地塞米松(Sigma)、10-4M的3-磷酸抗坏血酸(Sigma)、100单位的青霉素、1000单位的链霉素、2％(v/v)胎牛血清(FBS；Hyclone，Logan，UT，USA)、10ng/ml小鼠表皮生长因子(Sigma)、10ng/ml人血小板衍生生长因子(R&D systems，Minneapolis，MN，USA)、0.54％的IX β-巯基乙醇和1000单位/ml的小鼠白血病抑制因子。将培养基用22-μm过滤器(Millipore，Billerica，MA，USA)除菌并保存在4℃下最多3-4周。
MAPC聚集体的形成
使用悬滴法或强聚法形成MAPC聚集体。在悬滴法中，将MAPC以100-4000细胞/孔接种于含有20μl/孔的MAPC培养基的60孔微量滴定板(Nunc)中。然后将板倒置于5％氧气的37℃培养箱中4-5天以形成聚集体。在强聚法中，将含有100-4000MAPC/孔的超低吸附96孔U底板(Corning)在1500rpm下离心4分钟，然后使细胞在5％氧气的37℃培养箱中聚集4-5天。
MAPC聚集体的分化
最近开发出了4步21天分化方案，该方案针对用于从MAPC有效分化为具有肝细胞形态、表型和功能特征的细胞的培养基成分、氧气水平和胞外基质进行了优化。该4步方案由以下步骤组成：(1)将MAPC用50ng/ml Wnt3a和100ng/ml活化素A培养6天；(2)然后将从步骤(1)得到的细胞用10ng/ml bFGF和50ng/ml BMP4培养4天；(3)然后将从步骤(2)得到的细胞用50ng/ml aFGF、10ng/ml FGF4和25ng/ml FGF8b培养4天；以及(4)然后将从步骤(3)得到的细胞用20ng/ml HGF和100ng/ml抑卵泡素培养7天。为分辨肝细胞样细胞或胆样细胞，用抑卵泡素抑制活化素。在所述细胞分化之前，大规模扩增未分化的MAPC直至获得几百万个细胞。然后将细胞以50000-60000细胞/cm2置于基质胶(2％)包覆的板孔中。开始时，将细胞培养在扩增培养基中直至它们在16小时后达到80-90％的汇合率。然后，将细胞用PBS洗涤两次并将培养基换为分化培养基。为确认加入细胞因子是否真具有肝细胞诱导作用，只使用基础分化培养基进行分化。全部细胞都在基础分化培养基中在低氧气条件下培养，所述基础分化培养基由DMEM(60％)、MCDB(40％)、抗坏血酸(1X)、青霉属/链霉素(1X)、β-巯基乙醇、胰岛素-铁硒传递蛋白(ITS)(0.25X)、LA-BSA(0.25X)和地塞米松(10-6M)组成。使用高浓度地塞米松是因为某些肝细胞特异性基因(即酪氨酸转氨酶、MRP2和色氨酸-2，3-双加氧酶)受到糖皮质激素的下调，因为这些基因含有糖皮质激素响应元件。在完全无血清时，会发生细胞死亡。然而，使用Wnt3时可在无血清条件下诱导分化。如果不在所述基础分化培养基中加入细胞因子，那么需加入2％血清直至第12天，然后停止。由于高浓度地塞米松与胰岛素一起可诱导脂肪形成，因此使用了较低量的胰岛素。
实施例2.大鼠MAPC谱系R2old和19在2D和3D条件下的分化的 比较
此研究的目标是证明当将MAPC以3D聚集体的形式生长和培养时其多谱系分化能力。使用大鼠MAPC的两个谱系：R2old和19并且在MAPC维持条件——含有5％氧气的MAPC培养基——下以3D聚集体的形式维持16天。在16天的最后，使3D聚集体解离并将其重铺板于纤连蛋白包覆的培养皿上，与大鼠MAPC的标准2D单层维持类似。随后，进行生长因子介导的向肝细胞、内皮细胞和神经前体细胞的分化，并将所述分化与同时在2D单层培养中维持的大鼠MAPC的分化进行比较。图11(A)、(B)和(C)中的数据示出了通过定量实时(QRT)-PCR测定的对应不同细胞类型的标志物的表达。从所述数据可看出，以3D聚集体的形式维持的细胞以与2D培养中维持的细胞相当的水平保留了进行多谱系分化的潜能。因此，可在3D培养中维持MAPC而不损失质量，从而使得这种培养可放大到生物反应器中。
本领域技术人员会理解，可对这些实施方案进行改变而不背离上述实施方案的广泛发明构思。因此，应理解，本发明不限于公开的具体实施方案，而是意图涵盖所附的权利所限定的本发明精神和范围内的改变。

Claims (84)

1.一种包含细胞聚集体的组合物，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
2.一种包含细胞培养中的细胞聚集体的组合物，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
3.一种包含可药用载体和细胞聚集体的药物组合物，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
4.一种包含源自细胞聚集体的细胞的组合物，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
5.一种包含细胞培养中的源自细胞聚集体的细胞的组合物，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
6.一种包含可药用载体和源自细胞聚集体的细胞的药物组合物，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
7.一种包含分化细胞的组合物，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
8.一种包含细胞培养中的分化细胞的组合物，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
9.一种包含可药用载体和分化细胞的药物组合物，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
10.一种包含分化细胞的组合物，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
11.一种包含细胞培养中的分化细胞的组合物，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
12.一种包含可药用载体和分化细胞的药物组合物，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
13.一种制备细胞聚集体的方法，所述方法包括将不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞置于可使所述细胞聚集的条件下。
14.一种制备细胞培养中的细胞聚集体的方法，所述方法包括在细胞培养中将细胞置于可使所述细胞聚集的条件下，其中制备所述聚集体的细胞不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型。
15.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将可药用载体与细胞聚集体混合，所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
16.一种制备源自细胞聚集体的细胞的方法，所述方法包括分散细胞聚集体中的细胞，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
17.一种制备细胞培养组合物的方法，所述方法包括将源自细胞聚集体的细胞引入培养基中，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
18.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将可药用载体与源自细胞聚集体的细胞混合，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
19.一种制备分化细胞的方法，所述方法包括将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
20.一种制备分化细胞的方法，所述方法包括在细胞培养中将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
21.一种制备细胞培养组合物的方法，所述方法包括将分化细胞与细胞培养基合并，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
22.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将可药用载体与分化细胞混合，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
23.一种制备分化细胞的方法，所述方法包括将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
24.一种制备分化细胞的方法，所述方法包括在细胞培养中将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
25.一种制备细胞培养组合物的方法，所述方法包括将分化细胞与细胞培养基合并，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
26.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将分化细胞与可药用载体混合，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可有效获得所述分化细胞表型的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
27.一种包括给予受试者细胞聚集体的方法，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
28.一种包括给予受试者药物组合物的方法，所述药物组合物包含可药用载体和细胞聚集体，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
29.一种包括给予受试者源自细胞聚集体的细胞的方法，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
30.一种包括给予受试者药物组合物的方法，所述药物组合物包含可药用载体和源自细胞聚集体的细胞，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
31.一种包括给予受试者分化细胞的方法，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
32.一种包括给予受试者药物组合物的方法，所述药物组合物包含可药用载体和分化细胞，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
33.一种包括给予受试者分化细胞的方法，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
34.一种包括给予受试者药物组合物的方法，所述药物组合物包含可药用载体和分化细胞，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生所述分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
35.一种鉴定活性剂的方法，所述方法包括用一种试剂接触细胞聚集体并检测所述试剂对所述细胞聚集体的作用，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
36.一种鉴定活性剂的方法，所述方法包括在细胞培养中用一种试剂接触细胞聚集体并检测所述试剂对所述细胞聚集体的作用，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
37.一种鉴定活性剂的方法，所述方法包括用一种试剂接触源自细胞聚集体的细胞并检测所述试剂对所述源自细胞聚集体的细胞的作用，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
38.一种鉴定活性剂的方法，所述方法包括在细胞培养中用一种试剂接触源自细胞聚集体的细胞并检测所述试剂对所述源自细胞聚集体的细胞的作用，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
39.一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的细胞聚集体，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
40.一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含可药用载体和细胞聚集体，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
41.一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的源自细胞聚集体的细胞，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中的至少两种细胞类型的细胞。
42.一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含可药用载体和源自细胞聚集体的细胞，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
43.一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的分化细胞，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
44.一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含可药用载体和分化细胞，所述分化细胞是通过将细胞聚集体置于可产生分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
45.一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的分化细胞，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
46.一种治疗需要治疗的受试者的病症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含可药用载体和分化细胞，所述分化细胞是通过将源自细胞聚集体的细胞置于可产生分化细胞的条件下而产生的，其中所述细胞聚集体包含不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞并可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中至少两种细胞类型的细胞。
47.权利要求1-12任一项的组合物，其中所述聚集体中的细胞和源自所述聚集体的细胞表达Oct3/4、端粒酶、rex-1、rox-1、nanog、GATA6和sox-2中的一种或多种。
48.权利要求1-12任一项的组合物，其中所述聚集体中的细胞和源自所述聚集体的细胞可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中全部三种细胞类型。
49.权利要求9-12任一项的组合物，其中所述分化细胞表达一种或多种内胚层、外胚层和中胚层分化标志物。
50.权利要求49的组合物，其中所述分化细胞表达内胚层和外胚层分化标志物。
51.权利要求49的组合物，其中所述分化细胞表达外胚层和中胚层分化标志物。
52.权利要求49的组合物，其中所述分化细胞表达内胚层和中胚层分化标志物。
53.权利要求49的组合物，其中所述分化细胞表达内胚层分化标志物。
54.权利要求49的组合物，其中所述分化细胞表达外胚层分化标志物。
55.权利要求49的组合物，其中所述分化细胞表达中胚层分化标志物。
56.权利要求9-12任一项的组合物，其中所述分化细胞表型的特征为选自以下的细胞：肝细胞、β胰岛细胞、神经元、成骨细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、软骨、骨、肌肉、结缔组织、成血管系膜细胞、造血干细胞、淋巴细胞、网织红细胞、骨髓细胞、肺上皮细胞和皮肤。
57.权利要求1-12任一项的组合物，其中所述聚集体含有约10个细胞到约50000个或更多细胞。
58.权利要求57的组合物，其中所述聚集体含有约1000个细胞到约5000个细胞。
59.权利要求1-12任一项的组合物，其中细胞通过悬滴法或强聚法聚集。
60.权利要求9-12任一项的组合物，其中所述分化细胞表型选自成骨细胞、软骨细胞、骨、脂肪细胞、软骨、成纤维细胞、骨髓基质、骨骼肌、平滑肌、心肌、眼部细胞、内皮细胞、上皮细胞、肝细胞、胰腺细胞、造血细胞、神经胶质细胞、神经元细胞和少突胶质细胞的细胞类型。
61.权利要求9-12任一项的组合物，其中所述分化细胞是定形内胚层。
62.权利要求9-12任一项的组合物，其中所述分化细胞是腹侧前肠内胚层。
63.权利要求9-12任一项的组合物，其中所述分化细胞是双能肝祖细胞。
64.权利要求9-12任一项的组合物，其中所述分化细胞是肝细胞样细胞。
65.权利要求13-46任一项的组合物，其中所述聚集体中的细胞和源自所述聚集体的细胞表达Oct3/4、端粒酶、rex-1、rox-1、nanog、GATA6和sox-2中的一种或多种。
66.权利要求13-46任一项的方法，其中所述聚集体中的细胞和源自所述聚集体的细胞可分化为内胚层、外胚层和中胚层胚细胞系中全部三种细胞类型。
67.权利要求19-26、31-34和43-46任一项的方法，其中所述分化细胞表达一种或多种内胚层、外胚层和中胚层分化标志物。
68.权利要求67的方法，其中所述分化细胞表达内胚层和外胚层分化标志物。
69.权利要求67的方法，其中所述分化细胞表达外胚层和中胚层分化标志物。
70.权利要求67的方法，其中所述分化细胞表达内胚层和中胚层分化标志物。
71.权利要求67的方法，其中所述分化细胞表达内胚层分化标志物。
72.权利要求67的方法，其中所述分化细胞表达外胚层分化标志物。
73.权利要求67的方法，其中所述分化细胞表达中胚层分化标志物。
74.权利要求19-26、31-34和43-46任一项的方法，其中所述分化细胞表型的特征为选自以下的细胞：肝细胞、β胰岛细胞、神经元、成骨细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、软骨、骨、肌肉、结缔组织、成血管系膜细胞、造血干细胞、淋巴细胞、网织红细胞、骨髓细胞、肺上皮细胞和皮肤。
75.权利要求13-46任一项的方法，其中所述聚集体含有约10个细胞到约50000个或更多细胞。
76.权利要求75的方法，其中所述聚集体含有约1000个细胞到约5000个细胞。
77.权利要求13-46任一项的方法，其中细胞通过悬滴法或强聚法聚集。
78.权利要求39-46任一项的方法，其中所述病症为肝脏疾病或病症、GVHD、心肌梗塞、充血性心力衰竭、糖尿病、造血移植、外伤性脑损伤、脊髓损伤或中风。
79.权利要求39-46任一项的方法，其中所述病症涉及受损的组织损伤，所述组织为以下组织的一种或多种：心脏组织、神经元组织、眼组织、软骨组织、骨组织、骨骼肌组织、平滑肌组织、骨髓组织、脾脏组织、肝组织、肺组织、脑组织、免疫系统、结缔组织、血管、胰腺组织、中枢神经系统、周围神经系统和肾脏组织。
80.权利要求19-26、31-34和43-46任一项的方法，其中所述分化细胞表型选自成骨细胞、软骨细胞、骨、脂肪细胞、软骨、成纤维细胞、骨髓基质、骨骼肌、平滑肌、心肌、眼部细胞、内皮细胞、上皮细胞、肝细胞、胰腺细胞、造血细胞、神经胶质细胞、神经元细胞和少突胶质细胞的细胞类型。
81.权利要求19-26、31-34和43-46任一项的方法，其中所述分化细胞是定形内胚层。
82.权利要求19-26、31-34和43-46任一项的方法，其中所述分化细胞是腹侧前肠内胚层。
83.权利要求19-26、31-34和43-46任一项的方法，其中所述分化细胞是双能肝祖细胞。
84.权利要求19-26、31-34和43-46任一项的方法，其中所述分化细胞是肝细胞样细胞。
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