CN104593321A - 一种复合式细胞悬浮培养基及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种复合式细胞悬浮培养基及其制备方法与应用，所述培养基由培养基部分、血清部分和增稠剂部分组成，所述血清部分为浓度10％的已灭活胎牛血清，所述增稠剂部分由羧甲基纤维素和黄原胶组成，其中，羧甲基纤维素的浓度为100mg/L-300mg/L，黄原胶的浓度为500mg/L-2000mg/L，该培养基通过各组分混合方式获得，可降低细胞沉降速率，稳定支撑细胞，进而达到细胞立体、悬浮培养的目的。

Description

一种复合式细胞悬浮培养基及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种复合式细胞悬浮培养基及其制备方法与应用。

背景技术

常规细胞培养利用其贴壁特性进行平面培养，细胞扩增到一定数量时生长即受限，只有经酶消化、传代后才可继续培养。平面培养细胞增殖较慢、密度低，而较大规模、快速培养细胞常用三维立体悬浮培养的方式。

目前临床上大多使用生物反应器进行细胞悬浮培养。而生物反应器可分为搅拌式、填充床式、气升式以及一次性生物反应器。搅拌式生物反应器通过搅拌器使细胞在培养液中分布均匀，但搅拌时会产生剪切力损害细胞。填充床式生物反应器中细胞截留在填充物中生长，细胞产率和密度较高，但细胞分布不均匀、细胞难以计数。气升式生物反应器通过气流上升带动细胞在培养液中均匀分布，可分为内循环式及外循环式，但气体流动时气泡破碎将对细胞产生损伤。一次性式生物反应器培养细胞密度高、使用方便，但仅适宜于小规模培养放大较难。

美国科学期刊《干细胞报告》网络版的报告中，记载了一种三维球状系统中通过功能性聚合物大规模培养人类多能干细胞的方法(A 3D SphereCulture System Containing Functional Polymers for Large-Scale Human PluripotentStem Cell Production)，在该报告中研究人员通过大量实验筛选出了食品添加剂中作为增稠剂使用的“结冷胶”加入培养液，发现iPS细胞不会下沉，同时再使用另一种名为“甲基纤维素”的食品添加剂，可以阻止单个细胞聚合成团块，并且在用量上整个培养系统中甲基纤维素0.3％、结冷胶0.01％–0.02％，此时iPS细胞不会因其细胞团块内部缺乏营养而死亡，并且有助于提高细胞培养效率，还降低了培养成本。但这种方法的应用，还需要使用孔径约200μm的筛网对因生长而沉降的细胞团块进行筛网网格固定，即用筛网过滤掉大的细胞团块，留下的是直径较小的细胞或细胞团，进而使细胞的沉降速度减小，并且，报道中提到，通过实验比对发现，培养环境需要使用具有气体交换能力的袋子进行，而使用培养皿则无法实现大规模的细胞增殖培养；另一方面，从实验结果来看，该方法的细胞培养过程中细胞扩增数量较现有其他细胞培养方法并不是非常突出，筛网的使用在一定程度上无疑会对细胞造成损害。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种复合式细胞悬浮培养基。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述复合式细胞悬浮培养基的制备方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述复合式细胞悬浮培养基的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种复合式细胞悬浮培养基，由培养基部分、血清部分和增稠剂部分组成，所述血清部分为浓度10％的已灭活胎牛血清，所述增稠剂部分由羧甲基纤维素和黄原胶组成，其中，羧甲基纤维素的浓度为100mg/L-300mg/L，黄原胶的浓度为500mg/L-2000mg/L。

优选的，上述复合式细胞悬浮培养基，所述羧甲基纤维素的浓度为230mg/L，黄原胶的浓度为1000mg/L。

优选的，上述复合式细胞悬浮培养基，所述培养基部分的组成和用量如下：

上述复合式细胞悬浮培养基的制备方法，具体步骤如下：

(1)将羧甲基纤维素和黄原胶各自溶解于培养基部分中；

(2)将步骤(1)所得溶液混合，使二者终浓度为羧甲基纤维素100mg/L-300mg/L、黄原胶500mg/L-2000mg/L，调节所得混合液的pH值至7.1-7.4；

(3)继续加入10％灭活胎牛血清，定容后即为复合式细胞悬浮培养基。

上述复合式细胞悬浮培养基的另一制备方法，具体步骤如下：

(1)将组方量的羧甲基纤维素和黄原胶混合后磨成细粉；

(2)将所得细粉溶解于培养基部分中，使二者终浓度为羧甲基纤维素100mg/L-300mg/L、黄原胶500mg/L-2000mg/L，调节所得混合液的pH值至7.1-7.4，加入10％灭活胎牛血清，定容后即为复合式细胞悬浮培养基。

上述复合式细胞悬浮培养基在细胞扩增方面的应用。

本发明的有益效果是：

上述复合式细胞悬浮培养基，通过将无细胞生物毒性，安全无害且成本低廉的羧甲基纤维素和黄原胶以特定比例加入到常规培养基内，通过简单物理混合即可使羟甲基纤维素和黄原胶溶解后形成一定粘弹性，可降低细胞沉降速率，稳定支撑细胞，进而达到细胞立体、悬浮培养的目的。

可见，相较于目前临床上大多使用生物反应器通过机械搅拌进行细胞悬浮培养，本发明提供的复合式细胞悬浮培养基配制方法简单，节约成本并安全无害，真正实现了细胞立体、悬浮式培养，培养细胞密度高，同时操作简单，成本低廉，安全无害，适合规模化工业生产的需要。

附图说明

图1是本发明试验例中5个实验组上层培养基内细胞数均值图；

图2是本发明试验例中5个实验组培养基内细胞总数均值图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

一种复合式细胞悬浮培养基，由培养基部分、血清部分和增稠剂部分组成，所述血清部分为浓度10％的已灭活胎牛血清，所述增稠剂部分由羧甲基纤维素和黄原胶组成，其中，羧甲基纤维素的浓度为230mg/L，黄原胶的浓度为1000mg/L。

上述复合式细胞悬浮培养基的制备方法，具体步骤如下：

(1)将羧甲基纤维素和黄原胶混合后磨成细粉；

(2)将所得细粉21.5℃条件下溶解于培养基部分中，使二者终浓度为羧甲基纤维素1230mg/L、黄原胶1000mg/L，调节所得混合液的pH值至7.24，加入10％灭活胎牛血清，定容后即为复合式细胞悬浮培养基。

实施例2

一种复合式细胞悬浮培养基，由培养基部分、血清部分和增稠剂部分组成，所述血清部分为浓度10％的已灭活胎牛血清，所述增稠剂部分由羧甲基纤维素和黄原胶组成，其中，羧甲基纤维素的浓度为300mg/L，黄原胶的浓度为1500mg/L。

上述复合式细胞悬浮培养基的制备方法，具体步骤如下：

(1)将羧甲基纤维素和黄原胶各自溶解于培养基部分中；

(2)将步骤(1)所得溶液22.3℃条件下混合，使二者终浓度为羧甲基纤维素300mg/L、黄原胶1500mg/L，调节所得混合液的pH值至7.13；

(3)继续加入10％灭活胎牛血清，定容后即为复合式细胞悬浮培养基。

实施例3

一种复合式细胞悬浮培养基，由培养基部分、血清部分和增稠剂部分组成，所述血清部分为浓度10％的已灭活胎牛血清，所述增稠剂部分由羧甲基纤维素和黄原胶组成，其中，羧甲基纤维素的浓度为100mg/L，黄原胶的浓度为500mg/L。

上述复合式细胞悬浮培养基的制备方法，具体步骤如下：

(1)将羧甲基纤维素和黄原胶各自溶解于培养基部分中；

(2)将步骤(1)所得溶液22℃条件下混合，使二者终浓度为羧甲基纤维素100mg/L、黄原胶500mg/L，调节所得混合液的pH值至7.4；

(3)继续加入10％灭活胎牛血清，定容后即为复合式细胞悬浮培养基。

实施例4

一种复合式细胞悬浮培养基，由培养基部分、血清部分和增稠剂部分组成，所述血清部分为浓度10％的已灭活胎牛血清，所述增稠剂部分由羧甲基纤维素和黄原胶组成，其中，羧甲基纤维素的浓度为250mg/L，黄原胶的浓度为2000mg/L。

上述复合式细胞悬浮培养基的制备方法，具体步骤如下：

(1)将组方量的羧甲基纤维素和黄原胶混合后磨成细粉；

(2)将所得细粉21℃条件下溶解于培养基部分中，使二者终浓度为羧甲基纤维素250mg/L、黄原胶2000mg/L，调节所得混合液的pH值至7.1，加入10％灭活胎牛血清，定容后即为复合式细胞悬浮培养基。

上述实施例1-4中的培养基部分由下述组分组成：

组方原理：

羧甲基纤维素，是一种水溶性纤维素衍生物，具有良好的水溶性、生物相容性和生物可降解性；羧甲基纤维素有良好的凝胶效应，能通过主链间氢键等非共价键形成一定粘弹性，连续呈三维网状空间；黄原胶是一种经微生物发酵产生的水溶性细胞外杂多糖，相对分子质量为2×10⁶—2×10⁷；黄原胶溶胀后，形成双螺旋的棒状结构，静置时较为稳定，可稳定支撑混悬物，并且，黄原胶具有多种优良特性：低浓度下高粘性、良好的增稠性、稳定性、生物相容性和生物粘附性。将羧甲基纤维素与黄原胶按各自特定浓度加入细胞培养基中，仅为物理混合，不会发生化学反应，二者将共同增加细胞培养基的粘稠度，降低培养集中细胞的沉降速度，同时对细胞起到立体支撑的作用，无需其他辅助材料，实现了细胞在培养皿中大规模的悬浮培养。

试验例：

培养验证过程

1对象与方法

1.1选择性培养基制备：本验证过程共设5组，分别为对照组、实施例1方案组、实施例2方案组、实施例3方案组、实施例4方案组，每组均设6份样本。对照组使用含10％胎牛血清的DMEM培养基，实施例1方案组、实施例2方案组、实施例3方案组、实施例4方案组的配方和制备方法见上实施例。

1.2培养方法:

将对照组培养基加入6孔板内，每孔2ml。再将配置好的实施例1方案组、实施例2方案组、实施例3方案组、实施例4方案组的培养基以同样方法分别加入对应的6孔板内。

将成纤维细胞以1×10⁵/ml浓度接种到5个实验组对应的6孔板中，用移液器轻柔地吹打混匀。将5组6孔板放入培养箱中进行培养，培养条件为37℃，5％CO₂湿润培养48小时。培养过程中，对照组细胞依成纤维细胞特性贴壁生长，而实施例1方案组、实施例2方案组、实施例3方案组、实施例4方案组中的细胞由于羧甲基纤维素和黄原胶的存在将悬浮生长于培养基内。

培养24小时后，自培养箱内取出5组6孔板。吸取每孔上层培养液，分别放入30个不同的EP管内并标记。对EP管内细胞进行离心，转速1000rpm离心10min。离心后，弃去管内上层清液，加入2mlDMEM培养基吹打混匀。将所得30个样本标记为A₁-A₆、B₁-B₆、C₁-C₆、D₁-D₆、E₁-E₆对此30个样本进行细胞计数，记录所得结果。所余样本留存，以备后续实验使用。离心的目的是为了将实验组中悬浮生长于培养基内的细胞沉淀，去除由于局部细胞密度不均匀和悬浮培养基对计数结果的影响。

各用2mlPBS缓冲液冲洗已除去上层培养基的6孔板各孔，使用同剂量胰酶消化细胞后，向各孔内加入2mlDMEM培养基终止消化，用移液器吹匀后取出，将所得30个样本标记为a₁-a₆、b₁-b₆、c₁-c₆、d₁-d₆、e₁-e₆。将样本以A₁+a₁、A₂+a₂……B₁+b₁、B₂+b₂……的形式一一对应混合，保证同孔培养的细胞最终混合在一起。将所得30个样本标记为A_Ⅰ-A_Ⅵ、B_Ⅰ-B_Ⅵ、C_Ⅰ-C_Ⅵ、D_Ⅰ-D_Ⅵ、E_Ⅰ-E_Ⅵ。对此30个样本进行细胞计数，记录所得结果。

1.3统计学分析:用SPSS17.0对所得数据进行统计分析。

2结果及分析

经检验5个实验组上层培养基内细胞数、培养基内细胞总数属于正态分布且方差齐，可以应用方差分析，检验水准α＝0.05。统计结果见图1-2及表1(单位1×10⁵)。

表1各组数据的方差分析结果

对5组共计30份样本的结果进行方差分析，结果显示5组上层培养基内细胞数、培养基内细胞总数均P<0.05，表示5组上层培养基内细胞数、培养基内细胞总数差异有统计学意义。再应用LSD法对5组上层培养基内细胞数和培养基内细胞总数进行多重比较，统计学结果相同。对照组与实施例1、2、3、4方案组差异有统计学意义且为减小趋势，而各实施例方案组间差异无统计学意义。

结果表明本发明实施例中复合式细胞悬浮培养基相较于传统DMEM培养基，上层培养基中生长的细胞更多，而且同样时间内细胞扩增更活跃，实现了细胞的立体、悬浮培养。

上述参照具体实施方式对该一种复合式细胞悬浮培养基及其制备方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种复合式细胞悬浮培养基，其特征在于：由培养基部分、血清部分和增稠剂部分组成，所述血清部分为浓度10％的已灭活胎牛血清，所述增稠剂部分由羧甲基纤维素和黄原胶组成，其中，羧甲基纤维素的浓度为100mg/L-300mg/L，黄原胶的浓度为500mg/L-2000mg/L。

2.根据权利要求1所述的复合式细胞悬浮培养基，其特征在于：所述羧甲基纤维素的浓度为230mg/L，黄原胶的浓度为1000mg/L。

3.根据权利要求1所述的复合式细胞悬浮培养基，其特征在于：所述培养基部分的组成和用量如下：

。

4.权利要求1所述的复合式细胞悬浮培养基的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)将羧甲基纤维素和黄原胶各自溶解于培养基部分中；

(2)将步骤(1)所得溶液混合，使二者终浓度为羧甲基纤维素100mg/L-300mg/L、黄原胶500mg/L-2000mg/L，调节所得混合液的pH值至 7.1-7.4；

(3)继续加入10％灭活胎牛血清，定容后即为复合式细胞悬浮培养基。

5.权利要求1所述的复合式细胞悬浮培养基的另一制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)将组方量的羧甲基纤维素和黄原胶混合后磨成细粉；

(2)将所得细粉溶解于培养基部分中，使二者终浓度为羧甲基纤维素100mg/L-300mg/L、黄原胶500mg/L-2000mg/L，调节所得混合液的pH值至7.1-7.4，加入10％灭活胎牛血清，定容后即为复合式细胞悬浮培养基。

6.权利要求1所述的复合式细胞悬浮培养基在细胞扩增方面的应用。