CN112813029A - 一种髓母细胞瘤细胞的3d培养方法及其在药物筛选中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种髓母细胞瘤细胞的3D培养体系及其培养方法和在药物筛选中的应用；所述髓母细胞瘤细胞的3D培养体系，包括3D羟丙基纤维素微孔支架和髓母细胞瘤3D球样体专用培养基，所述3D球样体专用培养基为基础培养基添加10％(v:v)胎牛血清和1％(v:v)非必需氨基酸；本发明3D肿瘤模型具有较佳生长优势，同时可在长时间稳定保持其球样体形态以及关键蛋白的表达，改进了平面培养体系可能导致的细胞基因、蛋白、药物易感性等各方面的缺陷，更加准确地反映体内肿瘤的状况并预测药物的药效，为临床髓母瘤治疗药物的筛选提供更准确的技术和数据支持。

Description

一种髓母细胞瘤细胞的3D培养方法及其在药物筛选中的应用
技术领域
本发明涉及一种细胞的培养方法及其应用，具体涉及一种髓母细胞瘤细胞的3D培养方法及其应用。
背景技术
髓母细胞瘤(Medulloblastoma，MB)是最常见的恶性小儿脑肿瘤。随着临床医学和基础研究的发展，手术联合放疗再辅以化药治疗的综合治疗措施成为主流的髓母细胞瘤疗法，可以帮助延长MB患者的生存期并改善其生活质量。然而，手术切除不完全导致的复发风险以及放疗对于发育期大脑的潜在损害仍然是髓母瘤临床治疗的两大痛点。因此，化疗药物仍是重要的辅助治疗手段。目前常用的化疗药物包括顺铂和长春新碱等，但二者的使用常伴有各种难以逆转的神经毒性，如腱反射丧失和听力丧失等，如何快速筛选有效且低毒的新型化疗药物是MB治疗的焦点问题。
当前常用于MB药物筛选的模型包括细胞模型、人源肿瘤异种移植模型(Patient-Derived tumor Xenograft,PDX)和基因工程小鼠模型。PDX模型和基因工程小鼠模型成本高，建模周期长，难以实现快速、高通量的药物筛选，人与动物之间的种属差异也会导致假阳性、假阴性结果的出现。因此，操作简单、成本低，结果重复性高的细胞模型，是目前最常用的MB体外模型。然而，现有细胞体外模型的培养方式是传统二维(2D)细胞培养，无法模拟细胞在体内多维生长的真实情况，更无法重现细胞间相互作用以及复杂的肿瘤微环境，在药效筛选方面有着较大的局限性，通过2D模型得到的筛选数据很难转换为临床有效的治疗方案。
三维(3D)细胞培养技术的发展使得细胞球样体模型成为一种更具有预测性的肿瘤体外药物筛选模型。现有构建髓母细胞瘤3D球样体的方法分为两类，第一类是低黏附培养法。Bassani团队将髓母细胞瘤细胞DAOY经低黏附板培养后形成的球样体用于芬维A胺的药效机制研究；Ivanov团队利用低黏附培养板将髓母细胞瘤细胞UW-228与人神经干细胞共同培养形成细胞球样体，从而模拟髓母细胞瘤术后病灶处的药物递送，但上述报道并未进行药物筛选实验。此外，由于低黏附平面不能提供支撑，随机形成的球样体难以达到均一的大小和形状，在日常的培养以及换液过程中也会导致球样体的损失，这种不确定性一定程度上限制了其应用。第二类为水凝胶基质法。Roper团队通过制备透明质酸与聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)的混合物来模拟脑部细胞外基质，并将DAOY细胞封装于上述基质中培养，得到的髓母细胞瘤3D模型用于研究药物反应，但水凝胶本身特性受分子量的影响较大，再加上天然基质中不确定成分较多，不同批次的水凝胶组成也可能存在差异，从而影响药物筛选实验的准确性和重复性。
3D羟丙基纤维素微孔支架可以很好地克服上述困难，这种细胞支架具有较好的再现性和一致性，支架中特有的孔和通道的排列可在体外高度模拟体内微环境，譬如细胞间相互作用以及营养成分、代谢废物的交换等。此外，它的多层结构可为球样体的生长提供支撑，有效提高细胞球的培养面积，从而极大地提高细胞球样体的产率。目前利用羟丙基纤维素微孔支架作为细胞支架材料的报道主要集中于肝脏模型的构建，未见用于脑肿瘤模型及药物筛选的报道。因此，本发明基于其生物相容性高、成分稳定的优点，首次利用羟丙基纤维素微孔支架作为细胞支架，构建了髓母细胞瘤的体外3D细胞模型并用于药物筛选。
发明内容
本发明的目的在于解决现有研究的不足，提供一种髓母细胞瘤3D球样体模型的制备方法和应用。所述模型由羟丙基纤维素和烯丙基异氰酸酯反应形成的具有均匀多孔结构的支架材料即羟丙基纤维素微孔支架构建，操作简单，不需要额外的设备，细胞成球率高，在21天内可以稳定维持球样体外观、细胞活力与关键蛋白表达。
本发明设计的髓母瘤球样体模型比起传统平面模型而言，能够很好的模拟肿瘤在体内的生长与相互作用，可以满足各种周期的给药需求，支架尺寸小，可以匹配各种型号的多孔板，满足高通量筛选的需要。这一模型可以很好的用于髓母瘤体外药物筛选，为临床新化疗药物的发现提供技术支持。
为了解决目前建立髓母细胞瘤体外药物筛选模型遇到的问题，本发明利用羟丙基纤维素微孔支架建立了一种新的髓母细胞瘤体外3D球样体模型，该模型可模拟体内生理条件下的肿瘤生长环境，不需要借助离心力和特殊设备的帮助即可实现细胞自发成球，操作简单方便易行，可以满足大规模的临床前药物筛选需求。
为解决上述技术问题，本发明提供了髓母细胞瘤细胞的3D培养体系及其培养方法，在该3D优化培养体系中，髓母细胞瘤细胞可以建立正常生理条件下存在的细胞与细胞以及细胞与细胞外基质的相互作用。比起2D培养体系，本发明建立的3D肿瘤模型更具有生长优势，可长时间稳定保持其球样体形态以及关键蛋白的表达，改进了平面培养体系可能导致的细胞基因、蛋白、药物易感性等各方面的缺陷，更加准确地反映体内肿瘤的状况并预测药物的药效，为临床髓母瘤治疗药物的筛选提供更准确的技术和数据支持。
为达到此目的，本发明采用如下技术方案：
一种髓母细胞瘤细胞的3D培养体系，包括3D羟丙基纤维素微孔支架(直径6mm)和髓母细胞瘤3D球样体专用培养基。所述3D球样体专用培养基为基础培养基(MEM)添加10％(v:v)胎牛血清和1％(v:v)非必需氨基酸。
较佳的，所述非必需氨基酸为890mg/l L-丙氨酸、1470mg/l L-谷氨酸、1320mg/lL-天冬酰胺、1330mg/l L-天(门)冬氨酸、1150mg/l L-脯氨酸、1050mg/l L-丝氨酸和750mg/l甘氨酸等7种非必须氨基酸的混合溶液。
上述培养基成分为实验获取的最佳组成，减少或降低血清或非必需氨基酸的浓度后，3D球样体的增长速度、成球形态均会受到负面影响，出现球样体崩解等现象，无法实现长期培养。
较佳的，所述3D羟丙基纤维素微孔支架是由羟丙基纤维素和烯丙基异氰酸酯经过一系列反应并加以胶原蛋白修饰后得到的具有均匀疏松孔状结构的聚合物，纤维素具有很好的生物相容性，惰性的羟丙基可增强细胞间的接触，促进细胞聚集成球。此材料疏松多孔的结构以及低黏附特性使得细胞接种后自发形成球样体，且球样体可以得到良好支撑。该材料与多孔板相容性好，且不容易吸收药物，是构建球样体用于药物筛选的理想载体。
本发明还提供了所述3D培养体系在药物筛选以及细胞活力检测中的应用。
一种培养髓母细胞瘤细胞的方法，包括以下步骤：使用所述髓母细胞瘤细胞的3D培养体系培养肿瘤细胞。
优选的，所述肿瘤细胞为人髓母细胞瘤DAOY细胞系，由平面扩增或冻存复苏后的DAOY细胞系制备而成。
平面扩增细胞系的处理方法：于平面扩增后的细胞培养皿中用Trypsin消化液消化细胞，低速离心后重悬于新鲜培养基中。
冻存复苏的细胞系处理方法：取出装有髓母细胞瘤细胞的冻存管，立即放入37℃中水浴加热，待冻存液完全融化后立即转移至15ml离心管中，加入10ml新鲜培养基重悬，低速离心后重悬于新鲜培养基中。
进一步的，所述培养髓母细胞瘤细胞的方法中使用的培养条件为温度37℃，CO2体积浓度为5％。
进一步的，所述培养髓母细胞瘤细胞的方法中，低速离心后的肿瘤细胞(优选DAOY细胞)接种至羟丙基纤维素微孔支架时，肿瘤细胞的接种密度为1-5×106个细胞/ml；优选为5×106个细胞/ml。初始细胞密度太低不利于细胞聚集形成球样体，细胞密度过高会影响成球效率以及生长，超过1×107个细胞/ml，细胞难以获取充足的养分，导致活力下降，成球失败。
进一步的，所述培养髓母细胞瘤细胞的方法中，细胞在羟丙基纤维素微孔支架上的接种时间为30分钟。时间过短会导致细胞悬液没有完全被支架吸收，导致成球效率低；时间过长，无法为高密度细胞悬液提供充足的营养成分，最终可能导致球样体细胞活力低，球样体崩解。
进一步的，所述培养髓母细胞瘤细胞的方法中，细胞的接种方式为取20μl细胞悬液，轻滴于预先放在48孔板中的干燥3D羟丙基纤维素微孔支架(直径6mm)细胞支架上，于培养箱中静置30分钟后，轻柔加入500μl培养基，放回培养箱培养；或取10μl密度为5×106个细胞/ml的细胞悬液，轻滴于48孔板的孔内，用镊子轻柔夹取空白的干燥支架放在上述液滴正上方，待支架平稳后，向支架上表面继续轻柔滴加10μl密度为5×106个细胞/ml的细胞悬液，于培养箱中静置30分钟后，轻柔加入500μl培养基，放回培养箱培养。
本发明的优点是：
1.本发明提供一种新的髓母细胞瘤球样体模型，模型建立、培养的方法简单易行，不需要借助外力，细胞接种于羟丙基纤维素微孔支架上即可自发稳定成球，减少了悬浮培养体系需要外加离心力可能带来的机械损伤。
2.本发明构建的球样体模型可稳定存在于支架中，可用肉眼观察生长情况，较低黏附培养而言可以避免因为日常的培养基更替以及药物筛选实验过程中的换液导致的球样体损失。
3.本发明构建的球样体模型可以匹配各种型号的多孔板，满足高通量筛选的需要。
4.本发明培养的球样体模型比起2D平面培养体系，可在体外高度还原体内生理情况，不受孔板面积的限制，球样体可以快速增殖，并维持较长时间的细胞活力，可以满足长期连续给药的需求。该模型可用于药物筛选，为其提供更可靠、真实的数据支持。
附图说明
图1为细胞支架(3D羟丙基纤维素微孔支架)的外观图，
图2为明场下观察(A)U87、(B)LN229、(C)DAOY细胞接种7天后形成的球样体，
图3为明场下观察多聚甲醛固定4h后的3D球样体，
图4为2D和3D条件下DAOY细胞的增殖曲线图，
图5为共聚焦显微镜下3D球样体的活死细胞染色图，
图6为CD44免疫荧光染色观察培养21天后的3D球样体，
图7为2D与3D球样体模型用于不同药物筛选后得到的细胞活力示意图，
图8为考察细胞接种后静置时间与溶胀比的示意图，
图9为Roper团队(Roper S J.Development of three-dimensional spheroidmodels for the analysis of medulloblastoma drug response and metastaticdissemination[D].University of Nottingham,2020.)利用透明质酸与PEGDA的混合水凝胶构建的髓母细胞瘤3D球样体(A)与本专利方法建立的髓母细胞瘤3D球样体模型(B)的对比图。
具体实施方式
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。主要试剂：MEM培养基(KeyGEN)、PBS缓冲液(KeyGEN)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(KeyGEN)、非必需氨基酸(Wisent)、胎牛血清(Wisent)、0.25％Trypsin胰酶-EDTA(Gibco)、阿尔玛蓝(Alamar Blue)细胞活力检测试剂盒(Yeasen)、钙黄绿素-碘化丙啶(Calcein-AM/PI)活死细胞染色试剂盒(Yeasen)、CD44兔多克隆抗体(Beyotime)、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)(Beyotime)。
主要材料：3D羟丙基纤维素微孔支架(3D CelluSponge-Coll，直径6mm)(Bio-Byblos Biomedical Co.,LTD)。
主要仪器：细胞培养箱(Thermo)、LSM700激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss)、超净工作台(苏净安泰)，低速台式离心机。
下面将结合附图对本发明实施例作进一步地详细描述。
实施例1：
选用DAOY细胞作为模型细胞。该细胞为人源髓母瘤细胞，来源为4岁男性患者，表型为SHH,TP53突变型，这一表型的癌细胞恶性程度高，经常复发并且预后不良。与DAOY同属一个亚型的UW228也被用于体外细胞成球研究(Ivanov D P,Parker T L,Walker D A,etal.In vitro co-culture model of medulloblastoma and human neural stem cellsfor drug delivery assessment[J].Journal of biotechnology,2015,205:3-13.)，该细胞来源为9岁女性患者，但由于UW228细胞侵袭能力和细胞分裂能力均弱于DAOY细胞系，所以本发明最终选择了恶性程度更高、历史文献引用率更高的DAOY细胞系作为模型细胞实行进一步研究。
首先将DAOY细胞接种于羟丙基纤维素微孔支架上以形成球样体模型，具体方案如下：
步骤1、将DAOY细胞于培养皿内进行扩增培养后，收集5×106个细胞/ml的DAOY细胞重悬于新鲜培养基中。培养基组成为基础培养基(MEM)添加10％(v:v)胎牛血清和1％(v:v)非必需氨基酸。非必需氨基酸为890mg/l L-丙氨酸、1470mg/l L-谷氨酸、1320mg/l L-天冬酰胺、1330mg/l L-天(门)冬氨酸、1150mg/l L-脯氨酸、1050mg/l L-丝氨酸和750mg/l甘氨酸等7种非必须氨基酸的混合溶液。
步骤2、将上述密度的细胞悬液接种于干燥的羟丙基纤维素微孔支架中，即可得到球样体模型。具体操作为：取20μl“步骤1”中得到的细胞悬液，轻滴于预先放在48孔板中的干燥支架上，于培养箱中静置30分钟后，轻柔加入500μl培养基，放回培养箱培养，条件为37℃，5％(v:v)CO2。
具体来说，利用上述支架得到3D细胞球样体的方法简便可行，且细胞球生长状况良好。
如图1所示，该支架外观为直径6mm左右的圆盘，可与各种型号的多孔板适配，适用性广泛。
实施例2
与实施例1的区别在于，3D培养体系的肿瘤细胞由DAOY细胞替换为LN229细胞，所述LN229细胞是人脑神经胶质瘤细胞，具体方案如下：
步骤1、将LN229细胞于培养皿内进行扩增培养后，收集5×106个细胞/ml的LN229细胞重悬于新鲜培养基中。培养基组成为基础培养基(H-DMEM)添加10％(v:v)胎牛血清。
步骤2、将上述密度的细胞悬液直接接种于干燥的羟丙基纤维素微孔支架中，即可得到球样体模型。具体操作为：取20μl密度为5×106个细胞/ml细胞悬液，轻滴于预先放在48孔板中的干燥支架上，于培养箱中静置30分钟后，轻柔加入500μl培养基，放回培养箱培养，条件为37℃，5％(v:v)CO2。
实施例3
与实施例1的区别在于，3D培养体系的肿瘤细胞由DAOY细胞替换为U87细胞，所述U87细胞是人神经胶质瘤细胞，具体方案如下：
步骤1、将U87细胞于培养皿内进行扩增培养后，收集5×106个细胞/ml的U87细胞重悬于新鲜培养基中。培养基组成为基础培养基(H-DMEM)添加10％(v:v)胎牛血清。
步骤2、将上述密度的细胞悬液直接接种于干燥的羟丙基纤维素微孔支架中，即可得到球样体模型。具体操作为：取20μl密度为5×106个细胞/ml细胞悬液，轻滴于预先放在48孔板中的干燥支架上，于培养箱中静置30分钟后，轻柔加入500μl培养基，放回培养箱培养，条件为37℃，5％(v:v)CO2。
结果如图2所示，培养7天后，与U87细胞和LN229细胞相比，DAOY细胞更易形成光滑致密的球样体。通过实施例1与实施例2、3比较可知，本发明提供的3D培养体系更适合于DAOY细胞的球样体生成，对于髓母细胞瘤体外模型的建立具有明显优势。
实施例4
与实施例1的区别在于，3D细胞培养体系构建方法来源于文献(Roper SJ.Development of three-dimensional spheroid models for the analysis ofmedulloblastoma drug response and metastatic dissemination[D].University ofNottingham,2020.)所述。
结果如图9所示，比起文献报道的水凝胶基质培养法，本发明所建立的球样体在外观上表现为更加致密和规则的球型，而文献中的3D模型明显松散、呈不规则球形。通过图9比较可知，本发明提供的3D培养体系在DAOY细胞球样体的培养和生成上具有明显的优势。
实施例5：效果实验
1、2D、3D条件下DAOY细胞的增殖能力
步骤1、将5×103个细胞/ml的DAOY细胞接种于96孔板中(n＝3)，之后放回培养箱培养，条件为37℃，5％(v:v)CO2。
步骤2、取20μl密度为5×106个细胞/ml的细胞悬液，轻滴于预先放于48孔板中的干燥支架上(n＝3)，于培养箱中静置30分钟后，轻柔加入500μl培养基，之后放回培养箱培养，条件为37℃，5％CO2。
步骤3、每天更换新鲜培养基，并利用阿尔玛蓝试剂盒测定细胞活力，得到细胞增殖曲线图。
如图3所示，DAOY细胞在支架内聚集形成球样体，模型建立成功。7-14天期间可明显看出细胞球的增长，说明本发明建立的球样体模型增殖能力强，且形成的球样体结构稳定。
如图4所示，比起传统平面模型培养的细胞模型(第6天开始凋亡)，本发明建立的球样体模型在接种12天后仍能维持高水平的细胞活力，说明此3D球样体在体外具有更强的生存、增殖能力，所建立的模型可满足体外长期给药的需求。
2、评估3D球样体的细胞活力—活死细胞染色
步骤1、选择培养一定时间的支架，吸出培养基，并用PBS洗涤2-3次。
步骤2、加入钙黄绿素-碘化丙啶(Calcein-AM/PI)活死细胞染色试剂盒，经过前期优化后，最终确定的钙黄绿素浓度为20μM，碘化丙啶的最终浓度为25μg/ml。
步骤3、染色30分钟后，吸去染色液，将支架转移到共聚焦专用培养皿中，在共聚焦显微镜下观察细胞荧光。其中，活细胞被钙黄绿素染色而呈现绿色荧光，死细胞被碘化丙啶染色而呈现红色荧光。
如图5所示，本发明建立的球样体模型7-14天内仍保持较高的细胞活力，绿色荧光代表的活细胞占大多数，14天只出现少量红色荧光，说明该球样体模型活力高，球样体结构稳定。
本发明设计的髓母瘤类器官模型比起传统平面模型而言，能够很好的模拟肿瘤在体内的生长与细胞间相互作用，提高药物筛选的准确性。该模型在较长的时间内可以维持稳定的球样体外观以及细胞活力，用于药物筛选可以满足长期给药等需求，使得本发明在抗髓母细胞瘤药物筛选中具有广阔的应用前景。
3、3D球样体形态学表征——免疫荧光染色
步骤1、选择培养细胞球样体21天的支架，吸出培养基，用PBS洗涤2-3次。
步骤2、加入1ml 4％的多聚甲醛固定液，固定过夜。
步骤3、按照常规程序进行脱水、石蜡包埋、切片脱蜡等步骤。
步骤4、先后用一抗CD44兔多克隆抗体、二抗Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)孵育，封片观察，其中细胞表面的CD44蛋白被二抗标记呈现绿色荧光，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染细胞核而呈现蓝色荧光。
如图6所示，球样体在21天后仍可保持稳定的球型，并高度维持细胞表面蛋白CD44的表达，此表面蛋白与髓母细胞瘤的成瘤性、侵袭性呈正相关，由此说明本发明建立的髓母瘤模型具有较高的成瘤性和侵袭性，可以很好地模拟肿瘤在体内的生长与迁徙。21天免疫荧光染色可见凋亡核心，即球样体周边的蛋白表达高于内核，此特征在均一接触培养液的2D模型中无法观察到，反映了此肿瘤模型四周细胞生长旺盛而内核细胞的生长趋于停滞，与体内真实肿瘤生长情况高度一致，说明本发明构建的髓母细胞瘤球样体模型具有与体内真实肿瘤相似的生长特性，可作为体外药物筛选的可靠模型。
4、髓母细胞瘤细胞球样体在体外药物筛选中的应用
按照实施例1中方法所述，DAOY细胞分别于2D、3D条件下接种，4天后，分别配制含有500nM紫杉醇、1μM替莫唑胺、500nM仑伐替尼以及100nM表柔比星的培养液，孵育细胞24小时后，以细胞活力作为指标评价抗癌药物的治疗效果。
如图7所示，分别使用了紫杉醇、替莫唑胺、仑伐替尼、表柔比星对3D球样体以及2D细胞进行药效筛选实验，2D与3D细胞模型的筛选结果具有明显差异。详细来说，紫杉醇以及表柔比星在3D球样体模型体现出了较强的耐药性，而2D模型表现出较强的敏感程度，说明传统的2D模型由于无法重现体内的微环境，可能出现与体内真实情况不符的结果。替莫唑胺是用于胶质瘤的经典药物，也常用于髓母细胞瘤的临床治疗，此药物在2D模型没有体现出较强的抑制作用，但3D模型表现出了与临床应用相符合的抑制行为，说明了本球样体模型可以更好的在体外重现体内生理情况，避免2D平面培养对药物筛选预测性的负面影响。仑伐替尼是新型多靶点酪氨酸激酶抑制剂，目前尚未有应用于髓母细胞瘤治疗的报道，利用本球样体模型的易感性实验可以推测该药物可能对于髓母细胞瘤具有治疗作用。上述实施例得到的结论进一步证明了本模型的建立对于髓母细胞瘤的体外药物筛选具有重要意义，同时也为老药新用以及新型抗肿瘤药物的发现提供了可靠的技术模型与参考依据。
对比例1：
与实施例1的区别在于，考察了细胞悬液加入干燥支架后的静置时间。利用高分子材料的溶胀特性，通过溶胀比实验确定最佳静置时间。
计算公式为：SR(％)＝((Wt-W0)/W0)×100％
Wt，t时刻材料的质量(g)；
W0，干燥材料的质量(g)
如图7所示，静置时间到达30分钟时，材料处于溶胀平衡的状态，由此可知，接种30分钟后加入新鲜培养基不会改变材料吸收细胞的状态。此外，通过观察接种后静置不同时间的细胞球样体状态可以看出，静置时间越短，后续细胞成球形态以及细胞活力也越佳，推测在高密度细胞接种情况下，尽早补充新鲜培养基可在最短时间内为支架内的细胞提供充足的营养。因此，30分钟被选为最佳的静置时间。
对比例2
与实施例1的区别在于，考察了不同的细胞接种方式对于DAOY细胞成球的影响。
步骤1、将DAOY细胞于培养皿内进行扩增培养后，收集5×106个细胞/ml的DAOY细胞重悬于新鲜培养基中。培养基组成为基础培养基(MEM)添加10％胎牛血清和1％非必需氨基酸。
步骤2、将上述密度的细胞悬液按照“夹心”法接种于干燥的羟丙基纤维素微孔支架中，即可得到球样体模型。具体操作为：取10μl密度为5×106个细胞/ml的细胞悬液，轻滴于48孔板的孔内，用镊子轻柔夹取空白的干燥支架放在上述液滴正上方，待支架平稳后，向支架上表面继续轻柔滴加10μl密度为5×106个细胞/ml的细胞悬液，于培养箱中静置30分钟后，轻柔加入500μl培养基，放回培养箱培养，培养条件为37℃，5％CO2。
比较后发现两种不同的接种方式不会对后续球样体的生成和维持产生显著性的影响，因此选择操作更为便捷的单层接种方式。
对比例3
与实施例1的区别在于，考察了不同的细胞接种密度对于DAOY细胞成球的影响。
步骤1、将DAOY细胞于培养皿内进行扩增培养后，收集1×107个细胞/ml的DAOY细胞重悬于新鲜培养基中。培养基组成为基础培养基(MEM)添加10％(v:v)胎牛血清和1％(v:v)非必需氨基酸。
步骤2、将上述密度的细胞悬液梯度稀释后，分别接种于干燥的羟丙基纤维素微孔支架中，即可得到初始密度不同的球样体模型：1×107个细胞/ml；5×106个细胞/ml；1×106个细胞/ml；5×105个细胞/ml；1×105个细胞/ml。具体操作为：取20μl不同组密度的细胞悬液，轻滴于预先放于48孔板中的干燥支架上(n＝3)，于培养箱中静置30分钟后，轻柔加入500μl培养基。
通过比较不同初始接种密度来看，较低的细胞密度如1×105个细胞/ml；5×105个细胞/ml也能形成球样体，但生长速度较慢，而密度最高的1×107个细胞/ml组虽然有较快的生长速度，有较多的细胞会落到支架之外，大量贴壁的细胞可能会跟球样体竞争营养成分，故最终选择了成球速度和效率均为最优的5×106个细胞/ml组作为初始接种密度。
因此，结合实施例1和对比例1、2、3分析可知，本发明优化过后的3D球样体模型的培养体系可以很好地适应髓母细胞瘤球样体模型的形成与生长需求，是体外药物筛选的理想模型，具有较高的预测性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种髓母细胞瘤细胞的3D培养体系，其特征在于，包括3D羟丙基纤维素微孔支架和髓母细胞瘤3D球样体专用培养基，所述3D球样体专用培养基为基础培养基添加10％(v:v)胎牛血清和1％(v:v)非必需氨基酸。
2.如权利要求1所述的髓母细胞瘤细胞的3D培养体系，其中，所述非必需氨基酸为890mg/l L-丙氨酸、1470mg/l L-谷氨酸、1320mg/l L-天冬酰胺、1330mg/l L-天(门)冬氨酸、1150mg/l L-脯氨酸、1050mg/l L-丝氨酸和750mg/l甘氨酸的混合溶液。
3.一种培养髓母细胞瘤细胞的方法，包括以下步骤：使用权利要求1所述髓母细胞瘤细胞的3D培养体系培养肿瘤细胞。
4.如权利要求3所述的培养髓母细胞瘤细胞的方法，所述瘤细胞为人髓母细胞瘤DAOY细胞系，由平面扩增或冻存复苏后的DAOY细胞系制备而成。
5.如权利要求3或4所述的培养髓母细胞瘤细胞的方法，其中，培养条件为温度37℃，CO2体积浓度为5％。
6.如权利要求3或4所述的培养髓母细胞瘤细胞的方法，其中，肿瘤细胞的接种密度为1-5×106个细胞/ml。
7.权利要求1所述的髓母细胞瘤细胞的3D培养体系在药物筛选和细胞活力检测的应用。
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