CN112195152A - 一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用 - Google Patents
一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112195152A CN112195152A CN202011052642.8A CN202011052642A CN112195152A CN 112195152 A CN112195152 A CN 112195152A CN 202011052642 A CN202011052642 A CN 202011052642A CN 112195152 A CN112195152 A CN 112195152A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- colorectal cancer
- human colorectal
- organoid
- culture
- tissue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 114
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 114
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 title claims abstract description 99
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 70
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 53
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 32
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 30
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims abstract description 24
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims abstract description 24
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims abstract description 22
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 claims abstract description 16
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 238000003255 drug test Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 11
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 10
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 claims description 10
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 9
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 9
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 claims description 9
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 claims description 9
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 9
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 claims description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 9
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 9
- 239000011435 rock Substances 0.000 claims description 8
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 7
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 7
- 229920000153 Povidone-iodine Polymers 0.000 claims description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 7
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 7
- 229960001621 povidone-iodine Drugs 0.000 claims description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 238000007711 solidification Methods 0.000 claims description 3
- 230000008023 solidification Effects 0.000 claims description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 abstract description 13
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 abstract description 13
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 11
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 8
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 8
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 8
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 8
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 8
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 8
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 7
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 7
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 4
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 4
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N Capecitabine Chemical compound C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N 0.000 description 2
- GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N Capecitabine Natural products C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1C1C(O)C(O)C(C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 2
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 2
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 229960004117 capecitabine Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 125000004386 diacrylate group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 2
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 2
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 2
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical class CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 4-[(1r)-1-aminoethyl]-n-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C1CC([C@H](N)C)CCC1C(=O)NC1=CC=NC=C1 IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical group CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101150017554 LGR5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940126560 MAPK inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004966 intestinal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229940069328 povidone Drugs 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 description 1
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1323—Adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种人结直肠癌组织类器官的培养方法，包括以下步骤：将人结直肠癌组织冲洗后放入转移培养液中，清洗后剪切；进一步清洗后离心、酶消化、过滤、收集细胞团；将上述细胞团与水凝胶混合，固化后加入DMEM培养液进行培养即得人结直肠癌组织类器官。本发明中采用转移培养液、消化液及培养液中加入庆大霉素、两性霉素B、primocin等抗生素可减少微生物污染，体外培养获得人结直肠癌类器官的方法简便、快速、成功率高，类器官生长状态良好。并且公开了上述人结直肠癌类器官在药物测试中的应用，可通过将人结直肠癌组织类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养模型作为一种患者个体化药物测试平台。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用。
背景技术
人源肿瘤类器官(patient derived organoid,PDO)模型是近年来兴起的一种新型的肿瘤研究模型，Hans Clevers等在2009年首次提出利用基质胶在体外培养小鼠小肠隐窝上皮细胞和Lgr5+肠干细胞，可形成类似于肠腺的微型结构模拟体内小肠的结构和功能。研究显示，PDO与肿瘤组织标本间具有高度相似的基因组特征和肿瘤分子亚型；同时揭示了在单一患者水平进行基因型-表型分析的重要性。
目前所有类器官的建立几乎全部依赖于动物源性的基质胶作为三维培养支架。由于基质胶批次间微量组成成分的异质性、免疫原性及异种来源病原体转移风险等，严重阻碍了基质胶所培养的细胞及类器官在再生医学和高通量筛选等领域的临床应用。因此，探索更安全、稳定、可精确调控的培养材料对PDO的广泛应用具有重要意义。
Brian等报道了使用硫醇化透明质酸钠(thiolated HA)和含二硫化物的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGSSDA)的水溶液成功构建基于HA的水凝胶用于前列腺癌细胞培养；该材料合成成本低，组成成分精确可控，同时具有透明、稳定和多孔性，更能同时支持肿瘤细胞与间质细胞生长；该研究成功利用此基于HA的水凝胶作为前列腺癌肿瘤细胞与基质细胞多层培养的生物材料，构建了一种高通量的药物测试平台，但是目前为止还未有关于利用水凝胶体外建立人结直肠癌(CRC)类器官的研究报道。
PDO模型中只含有上皮细胞,而不含原肿瘤组织中的间质细胞，成为PDO最重要的缺陷，导致其在某些应用中的不精确的临床反应，严重阻碍了其在免疫防御的、肿瘤转移及侵袭、微环境调控等方面的应用。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)肿瘤微环境中最重要的组成成分之一，不仅为肿瘤上皮细胞提供物理支持，而且是肿瘤免疫、转移、耐药等关键功能的调节因子。结直肠癌PDO与CAFs共培养模型的研究，将为深入探索结直肠癌发生发展和以患者为中心的个体化药物治疗带来新的突破。
发明内容
本发明的第一个目的在于，克服现有技术的不足，提供一种更加简便、快速、稳定的分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法。
本发明的第二个目的在于，提供上述人结直肠癌组织类器官在药物测试中的应用。
本发明的第三个目的在于，提供一种药物测试平台。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，包括以下步骤：
(1)人结直肠癌组织的分离：将人结直肠癌组织冲洗后放入转移培养液中，清洗后剪切；进一步清洗后离心、酶消化、过滤、收集细胞团；
(2)人结直肠癌类器官的培养：将上述细胞团与水凝胶混合；固化后加入人结直肠癌类器官培养液进行培养，获得人结直肠癌类器官。
根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(2)中所述人结直肠癌类器官培养液为含有5-15nM Gastrin、B27、N2、0.5-1.5mMn-acetyl cysteine、GlutaMAX、90-110μg/mL庆大霉素、1-1.5μg/mL两性霉素B、90-110μg/ml primocin、8-15μMSB202190、5-15μMROCK抑制剂、45-55ng/ml EGF、4-6ng/ml FGF、4-6％FBS的DMEM/F12培养液。
优选地，根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(2)中所述人结直肠癌类器官培养液为含有10nMGastrin、B27、N2、1mM n-acetyl cysteine、GlutaMAX、100μg/mL庆大霉素、1.25μg/mL两性霉素B、100μg/mlprimocin、10μMSB202190、10μM ROCK抑制剂、50ng/ml EGF、5ng/ml FGF、5％FBS的DMEM/F12培养液。
根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(1)中所述酶消化所用的消化液为：1.25-1.75mg/mL IV型胶原蛋白酶、15-25μg/ml透明质酸酶、8-12μM ROCK抑制剂、80-130μg/ml庆大霉素。
优选地，根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(1)中所述酶消化所用的消化液为：1.5mg/mL IV型胶原蛋白酶、20μg/ml透明质酸酶、10μM ROCK抑制剂、100μg/ml庆大霉素。
进一步地，根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，所述ROCK抑制剂为Y-27632。
根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(1)中所述冲洗为使用0.5-1.5％聚维碘酮进行冲洗。
优选地，根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(1)中所述冲洗为使用1％聚维碘酮进行冲洗。
根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(1)中所述转移培养液为含有0.5-1.5％FBS、400-600Μ/mL青霉素、400-600μg/mL链霉素、80-120μg/ml庆大霉素、10-15g/mL两性霉素B的DMEM培养液。
优选地，根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(1)中所述转移培养液为含有1％FBS、500Μ/mL青霉素、500μg/mL链霉素、100μg/ml庆大霉素、12.5g/mL两性霉素B的DMEM培养液。
根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(1)中所述清洗为：用预冷的DMEM将组织漂洗至上清液清澈干净；所述剪切为：将所述人结直肠癌组织剪切成2-4mm的组织块。
根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(1)中所述离心的条件为：1000-1500rpm，3-5min。
优选地，根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(1)中所述离心的条件为：1200rpm，4min。
根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(1)中所述过滤为：使用100μm的细胞滤网去除未消化的组织团块，将滤液再次经过40μm的细胞滤网过滤。
根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(2)中所述细胞团与水凝胶混合后，细胞密度为6-10×104个/每20μL水凝胶。
优选地，根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(2)中所述细胞团与水凝胶混合后，细胞密度为6×104个/每20μL水凝胶。
根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(2)中所述水凝胶由Glycosil、Gelin-S及Extralink组成。
优选地，根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(2)中Glycosil、Gelin-S和Extralink的浓度为1％。
进一步地，根据本发明第一个方面所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，步骤(2)中Glycosil、Gelin-S和Extralink的体积比为2:2:1。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述人结直肠癌来器官在药物测试中的应用。
本发明的第三个方面，提供一种药物测试平台。
根据本发明第三个方面所述的药物测试平台，所述药物测试平台由本发明第一个方面所述人结直肠癌组织类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养构建。
优选地，根据本发明第三个方面所述的药物测试平台，所述人结直肠癌组织类器官与肿瘤相关成纤维细胞的细胞数比例为(2-3):1。
本发明的有益效果是：
1.本发明采用聚维碘酮溶液冲洗取下的结直肠癌组织，再用生理盐水清洗，放入含抗生素的转移培养液DMEM中，以此初步处理组织，减少后续培养过程中出现的微生物污染几率，并且用DMEM代替PBS清洗组织，以尽可能维持细胞活性，提高类器官培养成功率。
2.本发明中消化液使用IV型胶原蛋白酶和透明质酸酶，可温和充分地解离组织，加入ROCK抑制剂Y-27632可减少因分离诱导的细胞凋亡，加入庆大霉素可减少污染。
3.本发明中的分离人结直肠癌组织的方法可获得更多细胞，细胞活性更高,体外培养获得人结直肠癌类器官的方法简便、快速、成功率高，类器官生长状态良好。
4.本发明中构建的人结直肠癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养模型，可用胰酶消化去除水凝胶上的肿瘤相关成纤维细胞，而水凝胶中的人结直肠癌类器官不受影响，以便进一步使用CCK8方法量化检测人结直肠癌类器官中细胞活性。
5.本发明中的人结直肠癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养模型中，肿瘤相关成纤维细胞的存在增强了人结直肠癌类器官对化疗药的抵抗性，更好的模拟患者体内的肿瘤环境，更能反映患者体内结直肠癌对化疗药的敏感性，可作为一种患者个体化药物测试平台。
附图说明
图1为不同硬度的水凝胶体外培养人结直肠癌类器官形态图。
图2为不同患者来源的结直肠癌组织体外培养类器官7天后的形态图。
图3为体外培养人结直肠癌类器官2天和7天后的形态图。
图4为人结直肠癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养模型构建方法的示意图。
图5为单纯人结直肠癌类器官培养与人结直肠癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养模型中人结直肠癌类器官对比的形态图。
图6为单纯人结直肠癌类器官培养与人结直肠癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养模型对化疗药的敏感性差异的对比图。其中A图为卡培他滨药物处理的敏感性差异图；B图为5-氟尿嘧啶药物处理的敏感性差异图；C图为奥沙利铂药物处理的敏感性差异图；D图为伊立替康药物处理的敏感性差异图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
IV型胶原蛋白酶购自美国Gibco公司，透明质酸酶购自美国Sigma-Aldrich公司，Y-27632(ROCK抑制剂)购自美国Selleck Chemicals公司，Gastrin(胃泌素)购自美国Sigma-Aldrich公司，B27(血清替代物)购自美国Gibco公司，N2(细胞培养添加剂)购自美国Gibco公司，n-acetyl cysteine(N-乙酰半胱氨酸)购自日本Wako公司，GlutaMAX(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽)购自美国Gibco公司，primocin(原代细胞抗生素)购自法国InvivoGen公司，SB202190(p38 MAPK抑制剂)购自美国Sigma-Aldrich公司，EGF(表皮细胞生长因子)购自美国Peprotech公司，FGF(成纤维细胞生长因子)购自美国Peprotech公司，FBS(胎牛血清)购自美国Atlanta Biologicals公司，DMEM/F12购自美国Gibco公司，Glycosil(硫醇修饰的透明质酸)购自美国ESIBIO公司，Gelin-S(巯基修饰的明胶)购自美国ESIBIO公司，Extralink(聚乙二醇二丙烯酸酯)购自美国ESIBIO公司。
一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，包括以下步骤：
(1)人结直肠癌组织的分离
S01：人结直肠癌组织的预处理：取结直肠癌组织(避免坏死区域，大小0.5-1.0cm为宜)，用0.5-1.5％聚维碘酮冲洗，再用生理盐水清洗，放入转移培养液DMEM中,转移培养液为含有0.5-1.5％FBS、400-600Μ/mL青霉素、400-600μg/mL链霉素、80-120μg/ml庆大霉素、10-15g/mL两性霉素B的DMEM培养液。
S02：用预冷DMEM将组织漂洗4次左右至上清液清澈干净，将组织置入10cm培养皿中，使用无菌眼科剪镊去除坏死组织、脂肪组织，再将其剪切成2-4mm的组织块，转移至50ml离心管中。
S03：用预冷DMEM将上述组织块漂洗4次左右至上清液清澈干净，1000-1400rmp,离心2-5min，加入15ml消化液，消化液含有1.25-1.75mg/mL IV型胶原蛋白酶、15-25μg/ml透明质酸酶、8-12μM Y-27632、80-130μg/ml庆大霉素，在37℃摇床上孵育40min，期间每隔10min快速上下颠倒数次，避免组织聚集成团影响后续细胞的收集。
S04：将上述消化液经100μm的细胞滤网去除未消化的组织团块，将滤液再次经过40μm的细胞滤网，将其置于6cm培养皿中，加入PBS，洗脱收集大于40μm的细胞团。
(2)人结直肠癌类器官的培养
S11：将Glycosil、Gelin-S、Extralink、DG Water取出恢复至室温，抽取DG water加入至Glycosil及Gelin-S中，置于37℃摇床上孵育40min使其充分溶解，抽取DG water加入至Extralink中，上下颠倒数次使其溶解，使Glycosil、Gelin-S和Extralink质量浓度均为1％。
S12：将Glycosil、Gelin-S及Extralink按2:2:1的体积量加入至细胞团中，细胞密度约为6-10×104个/每20μL水凝胶，用剪口的200μL枪头轻柔吹打重悬，待水凝胶接近凝固时再次吹打混匀，并迅速接种在96孔板中，每孔20μL。将培养板放入孵箱中孵育30min，待水凝胶凝固后，每孔加入人结直肠癌类器官培养液150μL，人结直肠癌类器官培养液为含有5-15nM Gastrin、B27、N2、0.5-1.5mM n-acetyl cysteine、GlutaMAX、90-110μg/mL庆大霉素、1-1.5μg/mL两性霉素B、90-110μg/ml primocin、8-15μMSB202190、5-15μM Y-27632、45-55ng/ml EGF、5ng/ml FGF、8-12％FBS的DMEM/F12培养液。
实施例1不同硬度的水凝胶体外培养人结直肠癌类器官
(1)人结直肠癌组织的分离
S01：分别取患者P01的手术标本约0.8cm、患者P02的手术标本约0.5cm，用1％聚维碘酮冲洗取下的结直肠癌组织，再用生理盐水清洗，放入转移培养液DMEM中，其中转移培养为含有1％FBS、500Μ/mL青霉素、500μg/mL链霉素、100μg/ml庆大霉素、12.5g/mL两性霉素B的DMEM培养液。
S02：用预冷的DMEM将组织漂洗4次至上清液清澈干净，将组织置入10cm培养皿中，使用无菌眼科剪镊去除坏死组织、脂肪组织，再将其剪切成2-4mm的组织块，转移至50ml离心管中。
S03：用预冷DMEM将上述组织块漂洗4次至上清液清澈干净，1200rmp,离心3min。加入15ml消化液，37℃摇床上孵育40min，期间每隔10min左右快速上下颠倒数次，其中消化液含有1.5mg/mL IV型胶原蛋白酶、20μg/ml透明质酸酶、10μM Y-27632、100μg/ml庆大霉素。
S04：将上述消化液经100μm的细胞滤网去除未消化的组织团块，将滤液再次经过40μm的细胞滤网，将其置于6cm培养皿中，加入PBS，洗脱收集大于40μm的细胞团。
(2)人结直肠癌类器官的培养
S11：将Glycosil、Gelin-S、Extralink、DG Water取出恢复至室温，抽取DG water加入至Glycosil及Gelin-S中，置于37℃摇床上孵育40min使其充分溶解，抽取DG water加入至Extralink中，上下颠倒数次使其溶解，保持Glycosil、Gelin-S的浓度为1％，可改变Extralink的浓度以改变水凝胶的硬度，Extralink的浓度分别为0.5％、1％和4％，可制备低硬度、中等硬度、高硬度的水凝胶。
S12：将每个患者所得细胞分为3组，分别加入低硬度、中等硬度、高硬度的水凝胶，其中具体操作为将Glycosil、Gelin-S及Extralink按2:2:1的体积量加入至细胞团中，其中患者P01的细胞密度约为9.3×104个/每20μL水凝胶，患者P02的细胞密度约为6.1×104个/每20μL水凝胶。用剪口的200μL枪头轻柔吹打重悬，待水凝胶接近凝固时再次吹打混匀，并迅速接种在96孔板中，每孔20μL。将培养板放入孵箱中孵育30min，待水凝胶凝固后，每孔加入人结直肠癌类器官培养液150μL，人结直肠癌类器官培养液为含有10nM Gastrin、B27、N2、1mM n-acetyl cysteine、GlutaMAX、100μg/mL庆大霉素、1.25μg/mL两性霉素B、100μg/ml primocin、10μMSB202190、10μM Y-27632、50ng/ml EGF、5ng/ml FGF、5％FBS的DMEM/F12培养液。培养7天后的结果见图1。从图1可以看出，在经7天的培养后，不论是来源于患者P01还是患者P02的组织进行分离后类器官培养，均是高硬度组细胞数量少、活性差、无类器官形成，低硬度组细胞较多、活性尚可，但不能维持类器官的三维立体结构，而中等硬度的水凝胶可维持细胞活性和增长，保持类器官三维结构。
实施例2不同患者来源的结直肠癌组织体外培养类器官
(1)人结直肠癌组织的分离
S01：分别取患者P03的手术标本约1.0cm、P04的手术标本约0.8cm、P05的手术标本约0.7cm、P06的手术标本约0.9cm，用1％聚维碘酮冲洗取下的结直肠癌组织，再用生理盐水清洗，放入转移培养液DMEM中，其中转移培养为含有1％FBS、500Μ/mL青霉素、500μg/mL链霉素、100μg/ml庆大霉素、12.5g/mL两性霉素B的DMEM培养液。
S02：用预冷的DMEM将组织漂洗4次至上清液清澈干净，将组织置入10cm培养皿中，使用无菌眼科剪镊去除坏死组织、脂肪组织，再将其剪切成2-4mm的组织块，转移至50ml离心管中。
S03：用预冷DMEM将上述组织块漂洗4次至上清液清澈干净，1200rmp,离心3min。加入15ml消化液，37℃摇床上孵育40min，期间每隔10min左右快速上下颠倒数次，其中消化液含有1.5mg/mL IV型胶原蛋白酶、20μg/ml透明质酸酶、10μM Y-27632、100μg/ml庆大霉素。
S04：将上述消化液经100μm的细胞滤网去除未消化的组织团块，将滤液再次经过40μm的细胞滤网，将其置于6cm培养皿中，加入PBS，洗脱收集大于40μm的细胞团。
(2)人结直肠癌类器官的培养
S11：将Glycosil、Gelin-S、Extralink、DG Water取出恢复至室温，抽取DG water加入至Glycosil及Gelin-S中，置于37℃摇床上孵育40min使其充分溶解，抽取DG water加入至Extralink中，上下颠倒数次使其溶解，使Glycosil、Gelin-S及Extralink的浓度均为1％；
S12：将Glycosil、Gelin-S及Extralink按2:2:1的体积量加入至细胞团中，其中患者P03的细胞密度约为9.6×104个/每20μL水凝胶，患者P04的细胞密度约为7.2×104个/每20μL水凝胶，患者P05的细胞密度约为6.1×104个/每20μL水凝胶，患者P06的细胞密度约为7.9×104个/每20μL水凝胶。用剪口的200μL枪头轻柔吹打重悬，待水凝胶接近凝固时再次吹打混匀，并迅速接种在96孔板中，每孔20μL。将培养板放入孵箱中孵育30min，待水凝胶凝固后，每孔加入人结直肠癌类器官培养液150μL，人结直肠癌类器官培养液为含有10nMGastrin、B27、N2、1mM n-acetyl cysteine、GlutaMAX、100μg/mL庆大霉素、1.25μg/mL两性霉素B、100μg/ml primocin、10μMSB202190、10μM Y-27632、50ng/ml EGF、5ng/ml FGF、5％FBS的DMEM/F12培养液。经7天的培养后的形态图见图2，可见在培养7天后，已经可以通过显微镜看到人结直肠癌类器官结构形成，并且所得到的人结直肠癌类器官具有三维结构。分别记录P03及P05培养2天和7天后的形态图，具体结果见图3，可以看出在培养2天后即可看到类器官结构形成，培养7天可见类器官呈结肠腺腔样结构。
实施例3一种化疗药物测试平台
一种化疗药物测试平台的构建，具体为人结直肠癌类器官与肿瘤成纤维细胞共培养进行化疗药物的筛选，包括以下步骤：
(1)人结直肠癌组织的分离
S01：人结直肠癌组织的预处理：分别取患者P03的手术标本约1.0cm、P07的手术标本约0.9cm，用1％聚维碘酮冲洗，再用生理盐水清洗，放入转移培养液DMEM中，转移培养液为含有1％FBS、500Μ/mL青霉素、500μg/mL链霉素、100μg/ml庆大霉素、12.5g/mL两性霉素B的DMEM培养液。
S02：用预冷DMEM将组织漂洗4次左右至上清液清澈干净，将组织置入10cm培养皿中，使用无菌眼科剪镊去除坏死组织、脂肪组织，再将其剪切成2-4mm的组织块，转移至50ml离心管中。
S03：用预冷DMEM将上述组织块漂洗4次至上清液清澈干净，1200rmp，离心3min。加入15ml消化液，37℃摇床上孵育40min，期间每隔10min左右快速上下颠倒数次，其中消化液含有1.5mg/mL IV型胶原蛋白酶、20μg/ml透明质酸酶、10μM Y-27632、100μg/ml庆大霉素。
S04：将上述消化液经100μm的细胞滤网去除未消化的组织团块，将滤液再次经过40μm的细胞滤网，将其置于6cm培养皿中，加入PBS，洗脱收集大于40μm的细胞团。
(2)人结直肠癌类器官的培养
S11：将Glycosil、Gelin-S、Extralink、DG Water取出恢复至室温，抽取DG water加入至Glycosil及Gelin-S中，置于37℃摇床上孵育40min使其充分溶解，抽取DG water加入至Extralink中，上下颠倒数次使其溶解，使Glycosil、Gelin-S和Extralink质量浓度均为1％。
S12：将Glycosil、Gelin-S及Extralink按2:2:1的体积量加入至细胞团中，细胞密度约为X×104/每20μL水凝胶，用剪口的200μL枪头轻柔吹打重悬，待水凝胶接近凝固时再次吹打混匀，并迅速接种在96孔板中，每孔20μL。将培养板放入孵箱中孵育30min，待水凝胶凝固后，每孔加入人结直肠癌类器官培养液150μL，人结直肠癌类器官培养液为含有10nMGastrin、B27、N2、1mM n-acetyl cysteine、GlutaMAX、100μg/mL gentamicin、1.25μg/mLamphotericin B、100μg/ml primocin、10μMSB202190、10μM Y-27632、50ng/ml EGF、5ng/mlFGF、5％FBS的DMEM/F12培养液。
(3)肿瘤相关成纤维细胞的培养
S21：将S04中经40μm滤网过滤后所得的滤液离心，然后用含2％青链霉素混合液、50μg/ml庆大霉素、1.25g/mL两性霉素B、20％FBS的DMEM培养液重悬细胞沉淀，转移至培养瓶中，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
S22：最初3天每天换液，之后换用含1％青链霉素混合液、10％FBS的DMEM培养液，每2-3天换液。
S23：当细胞融合率达80％-90％时进行传代培养。
(4)人结直肠癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养
类器官培养第2天，将肿瘤相关成纤维细胞接种在水凝胶上，每孔2-3×104，人结直肠癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞的细胞数比例为(2-3):1，以构建共培养模型，培养液成分为10nM Gastrin、B27、N2、1mM n-acetyl cysteine、GlutaMAX、100μg/ml primocin、5％FBS的DMEM/F12培养液，示意图见图4。
(5)人结直肠癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养的化疗药物测试
类器官培养第3天，分别设置化疗药物卡培他滨，5-氟尿嘧啶，奥沙利铂及伊立替康的不同浓度组(0.1μm/L，1μm/L，10μm/L，100μm/L)及对照DMSO组，每2天更换培养液。5天后，倒置显微镜拍摄记录人结直肠癌类器官的生长形态，其中对照组的生长形态见图5，可见共培养组中肿瘤相关成纤维细胞的作用增加了PDO的数量，且活性更好。接下来用胰酶消化去除共培养模型中的肿瘤相关成纤维细胞，CCK8方法检测人结直肠癌类器官细胞存活率，两组对化疗药敏感性的差异见图6，从图6可以看出肿瘤相关成纤维细胞增强了人结直肠癌类器官对化疗药物的抵抗性，人结直肠癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养构建的模型可以更好的反映患者体内肿瘤对化疗药的敏感性，因此该共培养模型可作为一种患者个体化药物测试平台。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种人结直肠癌组织类器官的培养方法，包括以下步骤：
(1)人结直肠癌组织的分离：将人结直肠癌组织冲洗后放入转移培养液中，清洗后剪切；进一步清洗后离心、酶消化、过滤、收集细胞团；
(2)人结直肠癌类器官的培养：将上述细胞团与水凝胶混合；固化后加入人结直肠癌类器官培养液进行培养，获得人结直肠癌类器官。
2.根据权利要求1所述的一种人结直肠癌组织类器官的培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述人结直肠癌类器官培养液为含有5-15nMGastrin、B27、N2、0.5-1.5mMn-acetylcysteine、GlutaMAX、90-110μg/mL庆大霉素、1-1.5μg/mL两性霉素B、90-110μg/mlprimocin、8-15μM SB202190、5-15μM ROCK抑制剂、45-55ng/mlEGF、4-6ng/ml FGF、4-6％FBS的DMEM/F12培养液；所述ROCK抑制剂优选为Y-27632。
3.根据权利要求1所述的一种人结直肠癌组织类器官的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述酶消化所用的消化液为：1.25-1.75mg/mL IV型胶原蛋白酶、15-25μg/ml透明质酸酶、8-12μM ROCK抑制剂、80-130μg/ml庆大霉素。
4.根据权利要求1所述的一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，其特征在于，步骤(1)中所述冲洗为使用0.5-1％聚维碘酮进行冲洗。
5.根据权利要求1所述的一种人结直肠癌组织类器官的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述转移培养液为含有0.5-1.5％FBS、400-600Μ/mL青霉素、400-600μg/mL链霉素、80-120μg/ml庆大霉素、10-15g/mL两性霉素B的DMEM培养液。
6.根据权利要求1所述的一种人结直肠癌组织类器官的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述过滤为：使用100μm的细胞滤网去除未消化的组织团块，将滤液再次经过40μm的细胞滤网过滤。
7.根据权利要求1所述的一种人结直肠癌组织类器官的培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述细胞团与水凝胶混合后，细胞密度为6-10×104个/每20μL水凝胶。
8.根据权利要求1所述的一种人结直肠癌组织类器官的培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述水凝胶由Glycosil、Gelin-S及Extralink组成。
9.权利要求1-8任一项所述人结直肠癌组织类器官在药物测试中的应用。
10.一种药物测试平台，其特征在于，由权利要求1-8任一所述人结直肠癌组织类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养构建。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011052642.8A CN112195152B (zh) | 2020-09-29 | 2020-09-29 | 一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011052642.8A CN112195152B (zh) | 2020-09-29 | 2020-09-29 | 一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112195152A true CN112195152A (zh) | 2021-01-08 |
| CN112195152B CN112195152B (zh) | 2023-04-07 |
Family
ID=74008006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011052642.8A Active CN112195152B (zh) | 2020-09-29 | 2020-09-29 | 一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112195152B (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113846050A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-12-28 | 中国人民解放军总医院 | 一种组织类器官的制备方法 |
| CN114134116A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-03-04 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒及其应用 |
| CN114231490A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-25 | 北京基石生命科技有限公司 | 一种可渗透水凝胶支架培养肿瘤类器官的方法 |
| CN114304066A (zh) * | 2022-01-04 | 2022-04-12 | 昆明医科大学 | 一种结直肠癌pdx模型构建的方法 |
| CN114480289A (zh) * | 2022-04-08 | 2022-05-13 | 南方医科大学南方医院 | 构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法 |
| CN114958754A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-08-30 | 重庆嘉士腾生物科技有限公司 | 用于三维培养类器官纳米纤维gc水凝胶及其应用和培养直肠癌类器官的方法 |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107058227A (zh) * | 2017-04-27 | 2017-08-18 | 复旦大学 | 一种人结直肠印戒细胞癌细胞系及其应用 |
| KR20170104077A (ko) * | 2016-03-04 | 2017-09-14 | 부산대학교 산학협력단 | 리보솜 작용 저해제를 유효성분으로 함유하는 암줄기세포로의 탈분화 유도용 조성물 |
| CN107217039A (zh) * | 2017-08-01 | 2017-09-29 | 世翱（上海）生物医药科技有限公司 | 肿瘤组织3d培养方法及培养液 |
| CN108148811A (zh) * | 2018-01-16 | 2018-06-12 | 复旦大学附属中山医院 | 一种基于温敏型生物凝胶三维培养体系建立结直肠癌患者来源的异种移植瘤模型的方法 |
| CN108396010A (zh) * | 2017-02-06 | 2018-08-14 | 王琼 | 一种结直肠癌类器官的体外培养方法 |
| US20180258403A1 (en) * | 2015-09-03 | 2018-09-13 | Ecole Polytechnique Fèdèrale De Lausanne | Three dimensional hydrogels for culturing organoids |
| JP2018201408A (ja) * | 2017-06-05 | 2018-12-27 | 国立大学法人神戸大学 | がんオルガノイドを用いた抗がん薬のスクリーニング方法 |
| CN110628864A (zh) * | 2018-06-21 | 2019-12-31 | 南昌乐悠生物科技有限公司 | 一种水凝胶包被的微组织块培养药敏检测方法 |
| CN111040997A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-21 | 北京科途医学科技有限公司 | 一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法 |
| CN111197031A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-05-26 | 复旦大学附属肿瘤医院 | 一种源于循环肿瘤细胞的肠癌类器官培养和传代方法 |
| US20200224137A1 (en) * | 2017-07-14 | 2020-07-16 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Microfluidic platform for the rapid production of organoids/spheroids for compound screening |
-
2020
- 2020-09-29 CN CN202011052642.8A patent/CN112195152B/zh active Active
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20180258403A1 (en) * | 2015-09-03 | 2018-09-13 | Ecole Polytechnique Fèdèrale De Lausanne | Three dimensional hydrogels for culturing organoids |
| KR20170104077A (ko) * | 2016-03-04 | 2017-09-14 | 부산대학교 산학협력단 | 리보솜 작용 저해제를 유효성분으로 함유하는 암줄기세포로의 탈분화 유도용 조성물 |
| CN108396010A (zh) * | 2017-02-06 | 2018-08-14 | 王琼 | 一种结直肠癌类器官的体外培养方法 |
| CN107058227A (zh) * | 2017-04-27 | 2017-08-18 | 复旦大学 | 一种人结直肠印戒细胞癌细胞系及其应用 |
| JP2018201408A (ja) * | 2017-06-05 | 2018-12-27 | 国立大学法人神戸大学 | がんオルガノイドを用いた抗がん薬のスクリーニング方法 |
| US20200224137A1 (en) * | 2017-07-14 | 2020-07-16 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Microfluidic platform for the rapid production of organoids/spheroids for compound screening |
| CN107217039A (zh) * | 2017-08-01 | 2017-09-29 | 世翱（上海）生物医药科技有限公司 | 肿瘤组织3d培养方法及培养液 |
| CN108148811A (zh) * | 2018-01-16 | 2018-06-12 | 复旦大学附属中山医院 | 一种基于温敏型生物凝胶三维培养体系建立结直肠癌患者来源的异种移植瘤模型的方法 |
| CN110628864A (zh) * | 2018-06-21 | 2019-12-31 | 南昌乐悠生物科技有限公司 | 一种水凝胶包被的微组织块培养药敏检测方法 |
| CN111040997A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-21 | 北京科途医学科技有限公司 | 一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法 |
| CN111197031A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-05-26 | 复旦大学附属肿瘤医院 | 一种源于循环肿瘤细胞的肠癌类器官培养和传代方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| D CHEN 等: "A hyaluronan hydrogel scaffold-based xeno-free culturesystem for ex vivo expansion of human corneal epithelial stem cells", 《EYE》 * |
| DANIEL ÖHLUND等: "Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer", 《J. EXP. MED.》 * |
| SHENGYONG NG等: "Mechanically and chemi- cally defined hydrogel matrices for patient-derived colorectal tumor organoid culture", 《BIOMATERIALS》 * |
| 李明等: "肿瘤相关成纤维细胞对大肠癌LoVo细胞增殖和侵袭能力的影响", 《胃肠病学和肝病学杂志》 * |
| 杨桃等: "类器官的研究进展", 《中国细胞生物学学报》 * |
| 王楚等: "肠道类器官在精准医学中的应用", 《中国科学:生命科学》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113846050A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-12-28 | 中国人民解放军总医院 | 一种组织类器官的制备方法 |
| CN113846050B (zh) * | 2021-08-30 | 2023-10-27 | 中国人民解放军总医院 | 一种组织类器官的制备方法 |
| CN114134116A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-03-04 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒及其应用 |
| CN114231490A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-25 | 北京基石生命科技有限公司 | 一种可渗透水凝胶支架培养肿瘤类器官的方法 |
| CN114231490B (zh) * | 2021-12-23 | 2024-06-04 | 北京基石生命科技有限公司 | 一种可渗透水凝胶支架培养肿瘤类器官的方法 |
| CN114304066A (zh) * | 2022-01-04 | 2022-04-12 | 昆明医科大学 | 一种结直肠癌pdx模型构建的方法 |
| CN114480289A (zh) * | 2022-04-08 | 2022-05-13 | 南方医科大学南方医院 | 构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法 |
| CN114958754A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-08-30 | 重庆嘉士腾生物科技有限公司 | 用于三维培养类器官纳米纤维gc水凝胶及其应用和培养直肠癌类器官的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112195152B (zh) | 2023-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112195152B (zh) | 一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用 | |
| CN112266898B (zh) | 结直肠癌类器官的培养方法和培养液 | |
| KR101293364B1 (ko) | 조직공학적 인간 각막 내피의 재건 방법 | |
| US20230048690A1 (en) | Scaffold with hierarchical structure, preparation method therefor and application thereof | |
| CN114317443B (zh) | 乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法 | |
| CN110475860A (zh) | 使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养 | |
| CN114292816B (zh) | 肺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法 | |
| CN106801038A (zh) | 一种利用三维细胞培养系统促进脐带血造血干细胞快速稳定增殖的细胞培养方法 | |
| CN104046589B (zh) | 一种细胞共培养诱导干细胞体外定向分化的方法 | |
| CN108300688A (zh) | 原代肝细胞分离和培养方法 | |
| CN112424333A (zh) | 用于在生物反应器中进行细胞培养的系统 | |
| CN105085938B (zh) | 白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法 | |
| CN113846016B (zh) | 一种高通量多孔阵列芯片、装置、制备方法及应用 | |
| Bhatia et al. | Introduction to animal tissue culture science | |
| CN109234230A (zh) | 一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法 | |
| CN113943755B (zh) | 构建原位原发食管癌动物模型的方法 | |
| CN116836934B (zh) | 骨肉瘤类器官培养液、培养试剂组合及培养方法 | |
| CN112852709A (zh) | 小鼠肺类器官培养方法 | |
| CN106244522A (zh) | 一种干细胞培养体系及其培养方法 | |
| CN116536265A (zh) | 一种肝癌专用的类器官培养基、培养方法与传代方法 | |
| CN112813029B (zh) | 一种髓母细胞瘤细胞的3d培养方法及其在药物筛选中的应用 | |
| CN115161261A (zh) | 一种人胆管胆囊细胞3d培养的培养基与培养方法 | |
| CN105670990A (zh) | 一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法与应用 | |
| CN102206583A (zh) | 一种细胞共培养用芯片及共培养方法 | |
| CN108118079B (zh) | 一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |