CN111040997A - 一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法 - Google Patents

一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111040997A
CN111040997A CN201911328462.5A CN201911328462A CN111040997A CN 111040997 A CN111040997 A CN 111040997A CN 201911328462 A CN201911328462 A CN 201911328462A CN 111040997 A CN111040997 A CN 111040997A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tumor
culture
mixture
organoid
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911328462.5A
Other languages
English (en)
Inventor
孙志坚
康平
李程
肖金平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Ke Ke Medical Science And Technology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Ke Ke Medical Science And Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Ke Ke Medical Science And Technology Co Ltd filed Critical Beijing Ke Ke Medical Science And Technology Co Ltd
Priority to CN201911328462.5A priority Critical patent/CN111040997A/zh
Publication of CN111040997A publication Critical patent/CN111040997A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0683—Cells of the male genital tract, e.g. prostate, epididymis; Non-germinal cells from testis, e.g. Leydig cells, Sertoli cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1157—Monocytes, macrophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本公开提供了一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养和冻存方法，该方法包括：从外周血中分离单核细胞和自体血清，用CD28抗体和IL‑2刺激单核细胞；从前列腺肿瘤组织样本中分离肿瘤细胞；将肿瘤细胞与培养基和温敏水凝胶混合后进行培养和传代，得到肿瘤类器官前体；将肿瘤类器官前体用IFNγ刺激，然后再解离为刺激后的肿瘤细胞；将刺激后的肿瘤细胞与刺激后的单核细胞混合后用PD‑1抗体刺激，然后与温敏水凝胶混合并培养；使用含有FBS和温敏水凝胶的冻存液对具有肿瘤类器官进行冻存。本公开能够低成本、大幅度地提高具有肿瘤微环境类器官培养的成功率。

Description

一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，具体的，涉及一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法。
背景技术
肿瘤类器官(Organoids)是一种来源于患者肿瘤组织，可在体外实现三维(3D)培养的细胞培养物。肿瘤类器官保存了肿瘤的异质性、组织特性及基因突变信息，可以在体外模拟癌症的发生、发展的过程，构建疾病模型，进行快速准确的癌症药物筛选，有效补充现有动物和二维(2D)细胞培养模型，为肿瘤药物快速有效研发提供了新的技术平台。
前列腺癌是当前男性恶性肿瘤中死亡率居第二的肿瘤，目前对晚期前列腺癌的常规治疗手段为抗雄激素治疗，但大部分患者会在治疗后出现耐药性，最终发展成为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。CAR-T、TIL等新兴细胞疗法也在前列腺癌等实体瘤中收效甚微，其中一个重要原因是缺乏能够模拟体内肿瘤真实性的细胞模型。目前，药物研发及发病机制研究中通常使用前列腺肿瘤细胞系来模拟前列腺癌的发生发展和药物的有效性研究。但目前成功构建的前列腺肿瘤细胞株数量小于10种，无法代表庞大的临床疾病谱。加之建立的永生化肿瘤细胞系、肿瘤异质性和瘤免疫微环境的缺失，导致临床前数据和患者真实的情况严重偏离，大量新药临床试验失败。
因此，急需建立一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官，对肿瘤精准化医疗及药物研发提供更为真实的细胞模型，并且降低临床药物研发成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有肿瘤微环境的前列腺癌类器官的建模培养及冻存方法，可低成本实现利用肿瘤类器官大规模扩增，提高建模成功率，以适应高通量药物筛选的要求。
为了实现上述目的，本公开一方面提供了一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养方法，该方法包括如下步骤：
S1、从外周血中分离出单核细胞和自体血清，并使用CD28抗体和IL-2刺激所述单核细胞，得到刺激后的单核细胞；
S2、从前列腺肿瘤组织样本中分离肿瘤细胞；
S3、将所述肿瘤细胞与第一培养基和温敏水凝胶混合得到第一混合物，将所述第一混合物进行培养和传代，得到肿瘤类器官前体；所述第一培养基含有所述自体血清；
S4、将所述肿瘤类器官前体用IFNγ刺激，然后再解离为刺激后的肿瘤细胞；
S5、将刺激后的肿瘤细胞与所述刺激后的单核细胞混合得到第二混合物，将所述第二混合物用PD-1抗体刺激，然后与温敏水凝胶混合并培养。
可选地，所述第一培养基中含有RPMI1640培养基、所述自体血清和生长因子；所述生长因子含有超谷氨酰胺I、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、Rspondin1、Y-27632、不含维生素A的B27补充剂、乙酰半胱氨酸、烟酰胺、EGF、A83-01、SB202190和前列腺素E2中的至少一种。
可选地，步骤S1中，将所述单核细胞与终浓度为3-8μg/mL的CD28抗体和140-160U/mL的所述IL-2接触8-15小时；步骤S4中，使用所述IFNγ刺激所述肿瘤类器官前体的方法包括：将所述肿瘤类器官前体与终浓度180-220ng/mL的IFNγ接触8-15小时；步骤S5中，使用所述PD-1抗体刺激所述第二混合物的方法包括：在所述第二混合物中加入终浓度为18-22μg/mL的所述PD-1抗体。
可选地，步骤S3中，所述肿瘤细胞的接种密度为1×105-3×105个/ml，所述第一培养基和所述温敏水凝胶混合的体积比为1：0.5-3；步骤S5中，所述刺激后的肿瘤细胞和所述刺激后的单核细胞的混合数量比例为1：4-6；PD-1抗体刺激后的所述第二混合物和所述温敏水凝胶混合的体积比为1：0.5-3。
可选地，步骤S2中，从前列腺肿瘤组织样本中分离所述肿瘤细胞具体包括以下步骤：
S21、将所述前列腺肿瘤组织样本经PBS溶液漂洗后使用II型胶原酶进行酶解，得到组织样本溶液；
S22、使用细胞筛过滤所述组织样本溶液，然后离心取下层沉淀。
可选地，所述肿瘤类器官前体的培养和传代具体包括以下步骤：
S31、将所述第一混合物恒温培养，得到第一培养物；
S32、使用PBS溶液清洗所述第一培养物后，解离并重悬于所述第一培养基，得到单细胞悬液；
S33、将所述单细胞悬液与所述第一培养基混合后培养。
可选地，使用稳定型胰蛋白酶替代酶TrypLETM Express进行解离。
可选地，所述培养的条件包括：于95％的空气和5％的CO2的气氛中，37℃下恒温培养。
另一方面，本公开提供了一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官的冻存方法，该方法包括将所述前列腺癌类器官与冻存液混合得到预冻存悬液，然后将所述预冻存悬液冷冻保存；所述冻存液中含有FBS和温敏水凝胶。
可选地，所述冻存液中FBS和温敏水凝胶的体积比为1-10：1；所述前列腺癌类器官加入所述冻存液配制成3×106-7×106个/ml单细胞悬液。
可选地，所述冷冻保存的条件包括：将所述预冻存悬液梯度降温至-60～-80℃后保存10-15h，然后转移至液氮中长期保存。
通过上述技术方案，本公开能够低成本、大幅度地提高具有肿瘤微环境类器官培养的成功率。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开一方面提供了一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养方法，该方法包括如下步骤：
S1、从外周血中分离出单核细胞和自体血清，并使用CD28抗体和IL-2刺激所述单核细胞，得到刺激后的单核细胞；
S2、从前列腺肿瘤组织样本中分离肿瘤细胞；
S3、将所述肿瘤细胞与第一培养基和温敏水凝胶混合得到第一混合物，将所述第一混合物进行培养和传代，得到肿瘤类器官前体；所述第一培养基含有所述自体血清；
S4、将所述肿瘤类器官前体用IFNγ刺激，然后再解离为刺激后的肿瘤细胞；
S5、将刺激后的肿瘤细胞与所述刺激后的单核细胞混合得到第二混合物，将所述第二混合物用PD-1抗体刺激，然后与温敏水凝胶混合并培养。
可选地，所述第一培养基中含有RPMI1640培养基、所述自体血清和生长因子；所述生长因子含有超谷氨酰胺I、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、Rspondin1、Y-27632、不含维生素A的B27补充剂、乙酰半胱氨酸、烟酰胺、EGF、A83-01、SB202190和前列腺素E2中的至少一种。
可选地，步骤S1中，将所述单核细胞与终浓度为3-8μg/mL的CD28抗体和140-160U/mL的所述IL-2接触8-15小时；步骤S4中，使用所述IFNγ刺激所述肿瘤类器官前体的方法包括：将所述肿瘤类器官前体与终浓度180-220ng/mL的IFNγ接触8-15小时；步骤S5中，使用所述PD-1抗体刺激所述第二混合物的方法包括：在所述第二混合物中加入终浓度为18-22μg/mL的所述PD-1抗体。
可选地，步骤S3中，所述肿瘤细胞的接种密度为1×105-3×105个/ml，所述第一培养基和所述温敏水凝胶混合的体积比为1：0.5-3；步骤S5中，所述刺激后的肿瘤细胞和所述刺激后的单核细胞的混合数量比例为1：4-6；PD-1抗体刺激后的所述第二混合物和所述温敏水凝胶混合的体积比为1：0.5-3。
根据本公开，单核细胞和自体血清可以使用常规方法从外周血中进行分离得到。例如，取新鲜抽取的外周血，于800g/min离心10min，取上层血浆灭活后离心后吸取上清，转移至离心管中备用。向血液下层沉淀中加入生理盐水，形成生理盐水血样混合液。取等体积的淋巴细胞分离液于新的离心管中，将上述生理盐水血样混合液缓慢加入至淋巴分离液上层，于18-20℃条件下800g/min离心20min，取中间的白膜层置新的离心管中，随即加入三倍体积的PBS溶液清洗两遍后，获得单核细胞。
根据本公开，步骤S5可以使用细胞培养板对PD-1抗体刺激后的第二混合物与温敏水凝胶混合的混合物进行培养。该细胞培养板可以经过3-8μg/mL的CD28抗体进行提前包被处理后用PBS溶液进行洗涤；其中，CD28抗体的包被时间可以为8-15h，包被温度可以为2-6℃。
根据本公开，在步骤S5的培养过程中，可以在将混合物静置培养20-40分钟后，吸除每孔中原培养液上清，另取IL-2、PD-1抗体和第一培养基加入原培养液上清中培养，每3天换液1次。同时，在培养过程中，可以采用流式细胞仪实时检测CTL细胞(CD3+、CD8+)占比，以CTL细胞(CD3+、CD8+)在总细胞数占比在20-30％之间时作为具有肿瘤免疫微环境的肿瘤类器官构建成功的质控点。
根据本公开，步骤S2中，从前列腺肿瘤组织样本中分离所述肿瘤细胞具体包括以下步骤：
S21、将所述前列腺肿瘤组织样本经PBS溶液漂洗后使用II型胶原酶进行酶解，得到组织样本溶液；
S22、使用细胞筛过滤所述组织样本溶液，然后离心取下层沉淀。
可选地，新鲜的前列腺肿瘤组织样本可以使用无菌器械将其置于PBS溶液中漂洗2-4次后，使用无菌器械将其切成小块后进行酶解，酶解并过筛后的组织样本溶液可以在2-6℃的低温条件中进行离心。
根据本公开，所述肿瘤类器官前体的培养和传代具体包括以下步骤：
S31、将所述第一混合物恒温培养，得到第一培养物；
S32、使用PBS溶液清洗所述第一培养物后，解离并重悬于所述第一培养基，得到单细胞悬液；
S33、将所述单细胞悬液与所述第一培养基混合后培养。
根据本公开，使用稳定型胰蛋白酶替代酶TrypLETM Express对用IFNγ刺激的肿瘤类器官前体和使用PBS溶液清洗后的第一培养物进行解离。
根据本公开，如无特殊说明，本公开所述的培养条件包括：于95％的空气和5％的CO2的气氛中，37℃下恒温培养。
另一方面，本公开提供了一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官的冻存方法，该方法包括将所述前列腺癌类器官与冻存液混合得到预冻存悬液，然后将所述预冻存悬液冷冻保存；所述冻存液中含有FBS和温敏水凝胶。
可选地，所述冻存液中FBS和温敏水凝胶的体积比为1-10：1；所述前列腺癌类器官加入所述冻存液配制成3-7×106个/ml单细胞悬液。
可选地，所述冷冻保存的条件包括：将所述预冻存悬液梯度降温至-60～-80℃后保存10-15h，然后转移至液氮中长期保存。
根据本公开，所述冻存液需要于低温环境中配制，例如置于冰上配制，配制好的冻存液需要置于2-6℃的低温条件中储存。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。本公开实施例所涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得。
其中，RPMI 1640培养基购自Gibco公司；IFNγ购自Peprotech公司；CD28抗体购自eBioscience公司；PD-1抗体购自Merus公司；温敏水凝胶购自Cosmo Bio公司。
实施例
本实施例所使用的第一培养基为加入10体积％自体血清、2mM超谷氨酰胺I、10mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸、20％Rspondin1、10μM的Y-27632、不含维生素A的B27补充剂、1.25mM乙酰半胱氨酸、10mM烟酰胺、50ng/mL EGF、500nM A83-01、3μM SB202190和10nM前列腺素E2后的RPMI 1640培养基。
1、刺激后的单核细胞的制备
取患者新鲜抽取的外周血，于800g/min离心10min，取上层血浆灭活后离心后吸取上清，转移至离心管中备用。向血液下层沉淀中加入生理盐水，形成生理盐水血样混合液。取等体积的淋巴细胞分离液于新的离心管中，将上述生理盐水血样混合液缓慢加入至淋巴分离液上层，于18-20℃条件下800g/min离心20min，取中间的白膜层置新的离心管中，随即加入三倍体积的PBS溶液清洗两遍后，获得单核细胞。将所述单核细胞与终浓度为5μg/mL的CD28抗体和150U/mL的所述IL-2接触12小时，得到刺激后的单核细胞。
2、肿瘤细胞的分离
取患者手术切除的新鲜肿瘤组织样本，将其转移至100mm2的无菌培养皿中，使用灭菌器械将其置于PBS溶液中漂洗3次。向培养皿中加入适量的1.5mg/mL的II型胶原酶，并使用无菌器械将其切成小块，置于37℃恒温培养箱中进行酶解1h。吸取酶解后溶液经100μm细胞筛过滤至新的离心管中，4℃条件下300g离心3min，去除上清，取下层沉淀物。
3、前列腺癌肿瘤类器官前体的培养与传代
在低温条件下，将分离得到的肿瘤细胞加入第一培养基中，将其制成终浓度为2×105肿瘤细胞/ml的单细胞悬液。将单细胞悬液与温敏水凝胶等体积混合得到第一混合物，随后将第一混合物小心的沿边缘轻轻的加入6孔细胞培养板中的培养孔中于37℃，5％二氧化碳培养箱培养。
观察培养箱中的第一混合物的生长状态，当第一混合物长至70％～80％孔径时，吸出培养液，使用PBS清洗两遍，随后加入TrypLETM Express解离，使其分解为单细胞后重新铺于细胞培养板中继续培养，得到前列腺癌肿瘤类器官前体。
4、肿瘤免疫微环境的前列腺癌肿瘤类器官的构建
(1)将所述肿瘤类器官前体与终浓度200ng/mL的IFNγ接触12小时，使用TrypLETMExpress解离为刺激后的肿瘤细胞，并重悬于RPMI1640完全培养基中。
(2)离心收集刺激后的肿瘤细胞，去除上清，将刺激后的肿瘤细胞与所述刺激后的单核细胞以1：5的配比方式进行混合得到第二混合物，加入20μg/mL的PD-1抗体刺激第二混合物，将刺激后的第二混合物与第一培养基制成终浓度为2×106个/ml的单细胞悬液，然后与温敏水凝胶等体积混合，取2ml混合液小心的沿边缘轻轻的加入细胞培养板，置于摇床上以60rpm的转速匀速摇晃，于37℃，5％二氧化碳培养箱中恒温培养。
其中，细胞培养板是提前用5μg/mL的CD28抗体将U型底平板包被，在4℃下放置12h的细胞培养板，使用时用PBS溶液将CD28抗体包被的细胞培养板洗涤两次。
(3)在培养过程中，将培养皿于37℃，5％二氧化碳培养箱中静置30分钟，吸除每孔中原培养液上清1ml，另取终浓度为150U/mL的IL-2、终浓度为20μg/mL的PD-1抗体和第一培养基加入原培养液上清中培养，每3天换液1次。实时采用流式细胞仪检测CTL细胞(CD3+、CD8+)占比，以CTL细胞(CD3+、CD8+)在总细胞数占比在20-30％之间时作为具有肿瘤免疫微环境的肿瘤类器官构建成功的质控点。
5、肿瘤免疫微环境的前列腺癌肿瘤类器官的冻存
预先于冰上配制冻存液，该冻存液含90％体积的FBS和10％体积的温敏水凝胶，将配制好的冻存液置于4℃下冷却。收集有肿瘤免疫微环境的肿瘤类器官细胞并加入预先预冷的冻存液制成终浓度为5×106个/ml的预冻存单细胞悬液，置于梯度降温盒中在-80℃冷冻保存12h，随即转移至液氮罐中长期保存。
对比例
按照实施例的方法进行操作，不同的是，使用肿瘤类器官和未经过CD28抗体和IL-2刺激的单核细胞共培养建立具有肿瘤免疫微环境的肿瘤类器官，培养过程中不经过IFNγ和PD-1抗体的刺激，且使用类器官通用培养基(ENR，含50ng/ml EGF、100ng/ml Noggin、500ng/ml R-spondin的DMEM培养基)。
在对比例培养得到的肿瘤类器官进行冻存时，将类器官细胞与常规冻存液(含10％体积的DMSO和90％体积的FBS)混合并进行冷冻保存。
测试例1
分别进行实施例和对比例操作实验重复5次，对冻存后的类器官于不同冻存时间点进行复苏，流式检测复苏后类器官中CD3+CD8+的比例并计算平均值，同时计算重复操作中各指标的变异系数(coefficient of variation，CV值，标准偏差与平均值之比)，结果如表1所示。
表1复苏后类器官中CD3+CD8+的比例
Figure BDA0002328984340000091
Figure BDA0002328984340000101
通过表1数据可以看出，使用本公开的培养和冻存方法对类器官培养并冻存后，复苏后类器官中CD3+CD8+的比例平均值明显高于对比例，且各指标的变异系数明显减小。
测试例2
按照实施例和对比例实验操作方法，复苏冻存的具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官，与第一培养基混合制成2×105个/ml的单细胞悬液。种植于温敏水凝胶中，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中共培养12h。
共培养12h后，向培养板中分别给予200μl不同浓度的肿瘤免疫调节药物(使用RPMI 1640完全培养基配制)，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中共培养24h。药物孵育24h后，吸取培养液置15ml离心管中；贴壁的肿瘤类器官采用胰蛋白酶消化，收集肿瘤类器官至15ml离心管中。采用细胞凋亡PI染色试剂盒对细胞进行PI染色，避光条件下室温孵育10min。经流式测定分析前列腺癌细胞凋亡率，重复4次试验技术得到CV值。结果见表2所示。
表2免疫调节药物刺激T细胞产生的抗肿瘤免疫效应
Figure BDA0002328984340000102
通过表2数据可以看出，使用免疫药物刺激并检测实施例和对比例的肿瘤类器官的免疫响应时，实施例中的前列腺癌细胞凋亡率的平均值显著高于对比例。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、从外周血中分离出单核细胞和自体血清，并使用CD28抗体和IL-2刺激所述单核细胞，得到刺激后的单核细胞；
S2、从前列腺肿瘤组织样本中分离肿瘤细胞；
S3、将所述肿瘤细胞与第一培养基和温敏水凝胶混合得到第一混合物，将所述第一混合物进行培养和传代，得到肿瘤类器官前体；所述第一培养基含有所述自体血清；
S4、将所述肿瘤类器官前体用IFNγ刺激，然后再解离为刺激后的肿瘤细胞；
S5、将刺激后的肿瘤细胞与所述刺激后的单核细胞混合得到第二混合物，将所述第二混合物用PD-1抗体刺激，然后与温敏水凝胶混合并培养。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述第一培养基中含有RPMI1640培养基、所述自体血清和生长因子；所述生长因子含有超谷氨酰胺I、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、Rspondin1、Y-27632、不含维生素A的B27补充剂、乙酰半胱氨酸、烟酰胺、EGF、A83-01、SB202190和前列腺素E2中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其中，步骤S1中，使用所述CD28抗体和所述IL-2刺激所述单核细胞的方法包括：将所述单核细胞与终浓度为3-8μg/mL的CD28抗体和140-160U/mL的所述IL-2接触8-15小时；
步骤S4中，使用所述IFNγ刺激所述肿瘤类器官前体的方法包括：将所述肿瘤类器官前体与终浓度180-220ng/mL的IFNγ接触8-15小时；
步骤S5中，使用所述PD-1抗体刺激所述第二混合物的方法包括：在所述第二混合物中加入终浓度为18-22μg/mL的所述PD-1抗体。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其中，步骤S3中，所述肿瘤细胞的接种密度为1×105-3×105个/ml，所述第一培养基和所述温敏水凝胶混合的体积比为1：0.5-3；步骤S5中，所述刺激后的肿瘤细胞和所述刺激后的单核细胞的混合数量比例为1：4-6；PD-1抗体刺激后的所述第二混合物和所述温敏水凝胶混合的体积比为1：0.5-3。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其中，步骤S2中，从前列腺肿瘤组织样本中分离所述肿瘤细胞具体包括以下步骤：
S21、将所述前列腺肿瘤组织样本经PBS溶液漂洗后使用II型胶原酶进行酶解，得到组织样本溶液；
S22、使用细胞筛过滤所述组织样本溶液，然后离心取下层沉淀。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其中，步骤S3中，所述肿瘤类器官前体的培养和传代具体包括以下步骤：
S31、将所述第一混合物恒温培养，得到第一培养物；
S32、使用PBS溶液清洗所述第一培养物后，解离并重悬于所述第一培养基，得到单细胞悬液；
S33、将所述单细胞悬液与所述第一培养基混合后培养。
7.根据权利要求1或6所述的培养方法，其中，使用稳定型胰蛋白酶替代酶TrypLETMExpress进行解离；所述培养的条件包括：于95％的空气和5％的CO2的气氛中，37℃下恒温培养。
8.一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官的冻存方法，其特征在于，所述前列腺癌类器官使用权利要求1-7任意一项权利要求所述的方法制备得到；该方法包括将所述前列腺癌类器官与冻存液混合得到预冻存悬液，然后将所述预冻存悬液冷冻保存；所述冻存液中含有FBS和温敏水凝胶。
9.根据权利要求8所述的冻存方法，其中，所述冻存液中FBS和温敏水凝胶的体积比为1-10：1；所述前列腺癌类器官加入所述冻存液配制成3×106-7×106个/ml单细胞悬液。
10.根据权利要求8所述的冻存方法，其中，所述冷冻保存的条件包括：将所述预冻存悬液梯度降温至-60～-80℃后保存10-15h，然后转移至液氮中长期保存。
CN201911328462.5A 2019-12-20 2019-12-20 一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法 Pending CN111040997A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911328462.5A CN111040997A (zh) 2019-12-20 2019-12-20 一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911328462.5A CN111040997A (zh) 2019-12-20 2019-12-20 一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111040997A true CN111040997A (zh) 2020-04-21

Family

ID=70238211

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911328462.5A Pending CN111040997A (zh) 2019-12-20 2019-12-20 一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111040997A (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111849904A (zh) * 2020-07-31 2020-10-30 北京科途医学科技有限公司 神经母细胞瘤类器官的培养基、培养方法及移植体
CN112195152A (zh) * 2020-09-29 2021-01-08 南方医科大学南方医院 一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用
CN113186163A (zh) * 2021-01-18 2021-07-30 南昌五元生物科技有限公司 一种基于p53突变筛选肿瘤类器官的培养方法
CN113881630A (zh) * 2021-09-28 2022-01-04 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种肿瘤特异性til细胞的培育分离方法
CN114958756A (zh) * 2022-06-08 2022-08-30 福建瑞庚生物科技有限公司 一种用于前列腺癌类器官培养的培养液及其制备方法
CN117050934A (zh) * 2023-10-11 2023-11-14 四川大学华西医院 小鼠前列腺类器官制备方法及原发原位前列腺癌动物模型
CN117511880A (zh) * 2024-01-08 2024-02-06 北京大橡科技有限公司 肿瘤体外原位模型的构建方法、培养基及体外应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160206717A1 (en) * 2015-01-16 2016-07-21 Batu Biologics, Inc. Stimulation of immunity to endothelial cells, endothelial-like cells, and intratumor vascular channels derived from tumor tissue
US20180119107A1 (en) * 2016-10-28 2018-05-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods to preserve tumor-stromal interactions in culture and therapeutic predictive applications thereof
WO2019122388A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-27 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Immune cell organoid co-cultures

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160206717A1 (en) * 2015-01-16 2016-07-21 Batu Biologics, Inc. Stimulation of immunity to endothelial cells, endothelial-like cells, and intratumor vascular channels derived from tumor tissue
US20180119107A1 (en) * 2016-10-28 2018-05-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods to preserve tumor-stromal interactions in culture and therapeutic predictive applications thereof
WO2019122388A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-27 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Immune cell organoid co-cultures

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JENKINS, R. W. ET AL.: "Ex vivo profiling of PD-1 blockade", 《CANCER DISCOV》 *
KRIJN K. DIJKSTRA,ET AL: "Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids", 《CELL》 *
NEAL, J. T. ET AL.: "Organoid modeling of the tumor immune microenvironment", 《CELL》 *
YOTAM E. BAR-EPHRAIM,ET AL: "Organoids in immunological research", 《NATURE REVIEWS， IMMUNOLOGY》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111849904A (zh) * 2020-07-31 2020-10-30 北京科途医学科技有限公司 神经母细胞瘤类器官的培养基、培养方法及移植体
CN112195152A (zh) * 2020-09-29 2021-01-08 南方医科大学南方医院 一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用
CN113186163A (zh) * 2021-01-18 2021-07-30 南昌五元生物科技有限公司 一种基于p53突变筛选肿瘤类器官的培养方法
CN113881630A (zh) * 2021-09-28 2022-01-04 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种肿瘤特异性til细胞的培育分离方法
CN114958756A (zh) * 2022-06-08 2022-08-30 福建瑞庚生物科技有限公司 一种用于前列腺癌类器官培养的培养液及其制备方法
CN114958756B (zh) * 2022-06-08 2023-03-14 福建瑞庚生物科技有限公司 一种用于前列腺癌类器官培养的培养液及其制备方法
CN117050934A (zh) * 2023-10-11 2023-11-14 四川大学华西医院 小鼠前列腺类器官制备方法及原发原位前列腺癌动物模型
CN117050934B (zh) * 2023-10-11 2024-01-30 四川大学华西医院 小鼠前列腺类器官制备方法及原发原位前列腺癌动物模型
CN117511880A (zh) * 2024-01-08 2024-02-06 北京大橡科技有限公司 肿瘤体外原位模型的构建方法、培养基及体外应用
CN117511880B (zh) * 2024-01-08 2024-04-19 北京大橡科技有限公司 肿瘤体外原位模型的构建方法、培养基及体外应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111040997A (zh) 一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法
Mitra et al. Technologies for deriving primary tumor cells for use in personalized cancer therapy
CN112080472B (zh) 一种培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3d模型的方法
CN112210537B (zh) 肝癌类器官及其培养方法、培养用培养基和用途
CN113278588B (zh) 一种口腔鳞癌类器官培养基以及培养方法
CN111876386A (zh) 一种乳腺癌类器官的培养方法以及和肿瘤相关成纤维细胞的共培养方法
CN111197031A (zh) 一种源于循环肿瘤细胞的肠癌类器官培养和传代方法
CN109628402A (zh) 一种胃癌肿瘤原代类器官培养方法
Chopra et al. Three-dimensional endothelial-tumor epithelial cell interactions in human cervical cancers
CN110564686A (zh) 扩增造血干细胞的组合物、扩增方法、药物组合物和用途
CN116286653A (zh) 一种患者源性唾液腺腺泡细胞癌类器官的构建方法及应用
CN111793604B (zh) 一种耐奥希替尼的人非小细胞肺癌细胞株h1975/or及其应用
CN111040996B (zh) 一种制备卵巢癌类器官的方法
CN112391348A (zh) 卵巢癌类器官3d培养方法
CN110564687B (zh) 用于扩增造血干细胞的组合物、培养基、方法和试剂盒
US7179643B2 (en) Device and a process for expansion of haemopoeitic stem cells for therapeutic use
CN110669732B (zh) 组合物在将造血祖细胞重编程为造血干细胞中的用途
CN113943755B (zh) 构建原位原发食管癌动物模型的方法
CN111321120B (zh) 小鼠肾透明细胞癌循环肿瘤细胞系和人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法
Lv et al. Construction of tumor organoids and their application to cancer research and therapy
US8969079B2 (en) Method for inducing human blood-born hematospheres through aggregate culture and expanding blood adult stem cells and progenitor cells, and stem cell prepared by the same
US20130196349A1 (en) In Vitro Tumor Metastasis Model
CN115927164A (zh) 一种血管化肿瘤类器官的培养方法及应用
CN115466716A (zh) 一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法及应用
CN114958753A (zh) 一种舌癌类器官的培养基、培养方法及鉴定方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200421