CN115466716A - 一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法及应用 - Google Patents

一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法及应用，包括步骤：配置口腔黏液表皮样癌类器官培养基，其由Advance DMEM/F12及相关功能组分组成；获取肿瘤标本，清洗后将其放入预冷的取材液中浸泡；取标本切碎，低温离心，取组织碎片沉淀通过解离酶Ⅰ和解离酶Ⅱ进行解离消化，将消化后获得的单细胞悬液进行离心，取细胞沉淀；将细胞沉淀与基质胶重悬，种板固化后加入上述培养基进行培养，定期更换类器官培养基，每10‑14天进行传代培养。该培养基重复性好、可多次传代培养，能够解决口腔黏液表皮样癌原代细胞难以培养、传代的问题，实现培养出高度保留患者来源口腔黏液表皮样癌肿瘤异质性的立体类器官的目的。

Description

一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法及应用。
背景技术
口腔黏液表皮样癌(Oral mucoepidermoid carcinoma，OMEC)是口腔唾液腺肿瘤中最常见的可行肿瘤，好发于腮腺，其次是腭部和下颌下腺，且近年来其发病率呈不断上升趋势。OMEC根据黏液细胞的比例、细胞的分化、有丝分裂像的多少，以及肿瘤的生长方式分为为低分化(高度恶性)和高分化(低度恶性)两型。高分化型MEC较多见，手术治疗预后较好。低分化型MEC病程短，生长快，具有浸润性，可伴疼痛，淋巴结转移率较高，可发生血行性转移，术后易复发，预后较差，对于晚期、出现复发或转移性疾病患者的治疗方案有限且多以姑息治疗为主。
目前用于研究OMEC的临床前模型主要以细胞系平面培养以及体内动物模型为主。细胞系多是来自经过特殊筛选和培养后的单个细胞，仅能保留原始肿瘤的少数特殊性质或标记物等遗传学特征，不能完整表达肿瘤异质性，而肿瘤异质性目前被认为是癌症治疗失败的主要原因之一。而体内动物模型则存在建模周期长，成本较高，建模成功率与肿瘤恶性程度关系密切，对于低恶性的肿瘤建模成功率较低等不足，对高通量药物筛选和大量的基因分析具有一定限制性，这均严重阻碍了对肿瘤发生发展的深入研究和创新型癌症治疗方法的研发。
患者源性肿瘤类器官(patient-derivedtumor organoid，PDTO)作为一种新兴的体外3D细胞培养技术可以解决肿瘤原代培养成功率较低的难题，同时高度保留了原发肿瘤的组织病理学特征和肿瘤异质性，并该模型在多种肿瘤的研究应用中已被证明其具有将基础实验结果向临床转化的潜力，而近年来共培养法、气液界面培养法、微流体装置和去细胞化等新技术方法与类器官培养相结合，使PDTO模型成为最可能实现重构肿瘤微环境的临床前模型。
但目前对于患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的建立及使用方法仍未见相关报道，因此亟待提供一种既能提高培养成功率又能降低成本的口腔黏液表皮样癌类器官模型的构建方法，通过建立口腔黏液表皮样癌的类器官模型可以对OMEC的发生发展机制进行深入研究，并且在肿瘤分子标志物的筛选及各类药物的毒性检测、药效评价、新药筛选等方面发挥重要作用，其药敏及放射学相关体外实验也可以为临床上选择个体化治疗方案提供了有力的数据支持，从而寻找治疗OMEC新思路。
发明内容
针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法及应用，该培养基成本低、可操作性强、重复性好，各种细胞因子及调控因子相互直接密切影响，协调配合，结合独特的消化酶和消化方法以及接种培养方法，加快类器官的扩增，缩短培养的时间，可长期冻存，经过多次传代培养的类器官仍可稳定表达，能够解决口腔黏液表皮样癌原代细胞难以培养、传代的问题，解决现有技术中口腔黏液表皮样癌类器官培养基及培养方法等问题，实现培养出能够高度保留患者来源口腔黏液表皮样癌肿瘤异质性的立体类器官的目的。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，包括以下步骤：
S1：配置口腔黏液表皮样癌类器官培养基，其由Advance DMEM/F12及相关功能组分组成；
S2：获取适宜大小新鲜肿瘤标本，清洗后将组织放入预冷的取材液中浸泡，冰上或低温下保存标本；
S3：取步骤S2中所获得的标本进行切碎，低温离心后，取组织碎片沉淀通过解离酶Ⅰ和解离酶Ⅱ进行组织解离消化，将消化后悬液进行离心，取细胞沉淀；
S4：将步骤S3中的细胞沉淀与基质胶重悬，种板固化后加入步骤S1所述的口腔黏液表皮样癌类器官培养基中进行培养，每2-3天更换类器官培养基，定期检测类器官污染及记录类器官生长状态，每10-14天进行传代培养。
进一步地，步骤S1中，培养基中相关功能组分在基础培养基中的优选浓度组成为：青霉素-链霉素-两性霉素溶液，0.5-2X；HEPES缓冲液，0.5-2X；GlutaMAXTM，0.5-2X；N2补充剂，0.5-2X；B27补充剂，0.5-2X；Human FGF-10，5-20ng/ml；Human EGF，30-100ng/ml；重组Human R-Spodin-1蛋白，0.05-0.25ug/ml；重组Human Noggin蛋白，0.05-0.2ug/ml；重组Human Wnt-3A蛋白，0.05-0.2ug/ml；N-乙酰半胱氨酸，0.5-2.5mmol/L；烟酰胺，5～30mmol/L；Prostaglandin E2，0.5-1.5umol/L；A83-01，0.2-1umol/L；Butylatedhydroxyanisole，2-8ng/ml；Gastrin I，0.01μmol/L；Rock抑制剂，5-20umol/L。
进一步地，步骤S2中，取材液为含有20X青霉素-链霉素-两性霉素溶液的DMEM培养基。步骤S2中，取材液为含有20X青霉素-链霉素-两性霉素溶液的DMEM培养基，在新鲜肿瘤标本切取后在20X青霉素-链霉素-两性霉素溶液预冷的DMEM培养基中浸泡并在其中切剪组织有利于降低后续原代类器官培养中出现污染的风险。
进一步地，步骤S3中，解离酶I：5mg/ml的Ⅰ型胶原酶和10ug/ml的DNaseⅠ以无血清的DMEM为溶剂配置；解离酶Ⅱ：0.25％胰蛋白酶-EDTA加入10ug/ml的DNaseⅠ配置。
进一步地，解离消化的具体步骤为：
S31：取步骤S2中所获得的标本，用无菌PBS清洗，在无菌培养皿中加入适量取材液，将组织切碎；
S32：将组织碎片吸至无菌离心管中，低温离心得到组织碎片沉淀；
S33：在组织碎片中加入解离酶Ⅰ，上下吹打使其混匀，37℃恒温震荡消化，低温离心后弃上清；
S34：重复步骤S33的解离酶Ⅰ消化三次后，取离心沉淀，加入解离酶Ⅱ，上下吹打使其混匀，37℃恒温震荡消化；
S35：加入含10％血清的DMEM培养基混匀，终止消化，将所获得悬液依次用细胞筛网进行过滤，低温离心后弃上清，得到细胞沉淀。
进一步地，沉淀中见较多红色沉淀，可加入红细胞裂解液吹打混匀，置37℃恒温震荡，加入PBS溶液稀释终止裂解液作用，低温离心弃上清。
进一步地，步骤S4类器官的种板及培养，具体步骤包括：
S41：取步骤S3所获细胞沉淀，加入步骤S1所述的口腔黏液表皮样癌类器官培养基，低温离心去上清液；
S42：取基质胶重悬细胞沉淀并混匀，滴入培养板中倒置培养至基质胶形成圆顶状结构后，正置放在培养箱中至基质胶完全固化后，加入口腔黏液表皮样癌类器官培养基；
S43：每2-3天更换类器官培养基，镜下检测类器官污染及拍照记录类器官生长状态，正常类器官培养至10-14天，类器官成熟，进行传代、冻存、固定及鉴定。
进一步地，传代培养步骤包括：弃掉原有培养基，加入预冷D-PBS溶液，机械破坏基质胶，移至离心管中低温离心，弃上清；加入解离酶Ⅱ重悬沉淀并混匀，37℃恒温震荡消化；加入含10％血清的DMEM培养基混匀终止消化，将所获得悬液依次用细胞筛网进行过滤，低温离心弃上清；后续种板步骤同口腔黏液表皮样癌类器官原代种板步骤。
本发明的另一个目的是提供一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法在培养口腔黏液表皮样癌类器官中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明的培养基针对于口腔黏液表皮样癌的培养生长特点选用了多种细胞因子成份，将其按照特定的比例进行复配，使所获得的培养基中含有适宜含量的细胞因子、信号通路调控因子，各种细胞因子及调控因子相互直接密切影响，协调配合，结合独特的消化酶和消化方法以及接种培养方法，提高种板时活细胞的比例，从而加快类器官的扩增，缩短培养的时间，让原代口腔黏液表皮样癌细胞能够在较短的时间内形成与原始肿瘤组织形态和特性接近的肿瘤类器官，能够解决口腔黏液表皮样癌原代细胞难以培养、传代的问题；
同时均选用商品化产品，避免了传统肿瘤类器官培养所带来的成分误差，将选用的细胞因子，并通过倒置显微镜观察、HE染色、免疫组化、免疫荧光等技术验证，所培养成熟的口腔黏液表皮样癌类器官可以在细胞形态、蛋白表达上高度保留原始口腔黏液表皮样癌的肿瘤异质性；
该培养基成本低、可操作性强、重复性好，经过多次传代培养的类器官也仍能稳定表达，依然保持类器官的细胞形态，蛋白表达接近于真实肿瘤组织，高度保留了肿瘤异质性；可长期冻存，液氮中冻存3个月以上的原代口腔黏液表皮样癌类器官细胞复苏后仍可保持细胞活性并扩增形成类器官。
以本发明提供的口腔黏液表皮样癌类器官培养基培养出能够高度保留患者来源口腔黏液表皮样癌肿瘤异质性的立体类器官，以此为基础进行药敏、放射学及免疫相关体外实验，一定程度上预测临床治疗方案的效果，选择最佳治疗方式，为实现个体化精准治疗提供有力的数据支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1(a)为口腔黏液表皮样癌类器官原代培养至第7天镜下影像：多数口腔黏液表皮样癌肿瘤干细胞呈球形生长；(b)为口腔黏液表皮样癌类器官传代后P2代培养至第7天镜下影像；(c)为口腔黏液表皮样癌类器官传代后P3代口腔黏液表皮样癌类器官培养至第7天镜下图像；
图2(a)为原代口腔黏液表皮样癌类器官切片HE染色图像；图2(b)为P4代口腔黏液表皮样癌类器官切片HE染色图像；图2(c)为患者肿瘤样本切片HE染色图像。
图3为原代口腔黏液表皮样癌类器官切片进行蛋白表达(P53，P63，C-Kit，E-cad)和细胞增殖指数Ki67表达的免疫组化图像；
图4为P4代口腔黏液表皮样癌类器官切片进行蛋白表达(P53，P63，C-Kit，E-cad)和细胞增殖指数Ki67表达的免疫组化图像；
图5为患者肿瘤样本切片进行蛋白表达(P53，P63，C-Kit，E-cad)和细胞增殖指数Ki67表达的免疫组化图像。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明所取标本来源于临床患者，需经过本医院医学伦理道德委员会批准立项。标本取自徐州市中心医院口腔科，一例29岁女性的腮腺黏液表皮样癌患者，术前结合临床表现、影像学检查及细针穿刺活检等辅助检查初步诊断，初步诊断为口腔黏液表皮样癌，术前经患者本人及家属充分知情同意后，签订知情同意书。术中快速病理及术后常规病理诊断为：黏液表皮样癌。
具体构建方法如下：
(一)组织获取与处理
1、患者肿物术中切除活检，切取约0.5cm*0.5cm*0.5cm大小，应取病变处或病变与正常组织交界处，避免肿瘤中心组织坏死区域。
2、生理盐水冲洗三次后，浸泡于取材液中，低温保存运输至实验室，浸泡1小时，冰上或低温运输至实验室；(取材液为含有20X青霉素-链霉素-两性霉素溶液的DMEM培养基(南京凯基生物科技))
3、术中快速病理回示：黏液表皮样癌；
4、在生物安全柜中取出标本，使用无菌PBS冲洗三次，在无菌培养皿(60mm*15mm)中加入适量取材液，使用无菌手术刀、组织剪将组织切碎至0.1*0.1*0.1cm大小，吸至无菌离心管中；
4、低温离心：1500rpm，4℃，5min。弃上清，取沉淀的组织碎片进行解离；
其中，口腔黏液表皮样癌处于口腔带菌环境，类器官培养过程中出现细菌、支原体乃至真菌污染的风险较高，在新鲜肿瘤标本切取后在20X青霉素-链霉素-两性霉素溶液预冷的DMEM培养基中浸泡1小时并在其中切剪组织有利于降低后续培养中出现污染的风险。
(二)组织的解离消化
1、解离酶配置为：
解离酶I：5mg/ml的Ⅰ型胶原酶和10ug/ml的DNaseⅠ以无血清的DMEM(南京凯基生物科技)为溶剂配置；
解离酶Ⅱ：0.25％胰蛋白酶-EDTA(1X)(ThermoFisher)加入10ug/ml的DNaseⅠ配置；
2、取上述离心所获得的组织碎片沉淀，加入3ml解离酶I，上下吹打几次使其混匀，置于37℃恒温水浴摇床中15min.其中摇床转速为300-400rpm，每5分钟吹打混匀一次；
3、低温离心：1500rpm，4℃，5min；弃上清，再加入3ml解离酶I，条件同步骤1，共重复三次；
4、解离酶I消化三次后，取离心沉淀，加入3ml解离酶Ⅱ，上下吹打几次使其混匀，置于37℃恒温水浴摇床中5min，其中摇床转速为300-400rpm，每2-3分钟吹打混匀一次；
5、加3ml含10％血清的DMEM培养基混匀，终止消化；
6、所获得悬液依次使用100μm、70μm的细胞筛网(BD)进行过滤；
7、低温离心：1500rpm，4℃，5min，弃上清；
8、所获沉淀中见较多红色沉淀(红细胞)，在此环节选择加入3ml红细胞裂解液(Beyotime)吹打混匀，置于37℃恒温水浴摇床中5min，其中摇床转速为300-400rpm；
9、加入10ml PBS溶液稀释终止裂解液作用，低温离心：1500rpm，4℃，5min，弃上清；
10、加2ml优选浓度的口腔黏液表皮样癌类器官培养基，轻轻吹打混匀。各相关功能组分在基础培养基DMEM/F12中的终浓度组成为：青霉素-链霉素-两性霉素溶液，2X；HEPES缓冲液，1X；GlutaMAXTM，1X；N2补充剂，1X；B27补充剂，1X；Human FGF-10，10ng/ml；Human EGF，50ng/ml；重组Human R-Spodin-1蛋白，0.15ug/ml；重组Human Noggin蛋白，0.1ug/ml；重组Human Wnt-3A蛋白，0.1ug/ml；N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine，NAC)，1.25mmol/L；烟酰胺(Nicotinamide)，10mmol/L；Prostaglandin E2，1umol/L；A83-01，0.5umol/L；Butylated hydroxyanisole，5ng/ml；Gastrin I，0.01μmol/L；Rock抑制剂(Y-27632)，10umol/L；
本发明所采用的试剂：Human FGF-10，重组Human R-Spodin-1蛋白，重组HumanNoggin蛋白，重组Human Wnt-3A蛋白，N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)，A83-01，Gastrin I购自MCE公司；
本发明所采用的试剂：Advance DMEM/F12基础培养基，HEPES缓冲液，GlutaMAXTM，B27补充剂，N2补充剂购自ThermoFisher公司；
本发明所采用的试剂：烟酰胺(Nicotinamide)，Prostaglandin E2，Butylatedhydroxyanisole购自Sigma公司；
本发明所采用的试剂：Rock抑制剂(Y-27632)购自Selleck公司；
本发明所采用的试剂：Human EGF购自Peprotech公司；
本发明所采用的试剂：青霉素-链霉素-两性霉素溶液购自Beyotime公司。
其中，由于口腔黏液表皮样癌位于口腔带菌环境，在其进行类器官培养过程中存在相对较高的污染风险，尤其是组织解离种板后的原代细胞，因此在解离消化后的原代肿瘤细胞种板后前三天所加的培养基中可以将青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的终浓度调整为2X，换液后若细胞状态正常，则恢复至1X继续培养。
本发明的培养基针对于口腔黏液表皮样癌的培养生长特点选用了多种细胞因子成份，由于本发明所使用的黏液表皮样癌肿瘤组织来源于人，因此所选用的细胞因子均为人源，同时均选用商品化产品，避免了传统肿瘤类器官培养过程中使用自行培育R-Spondin1条件培养基及Wnt 3A条件培养基提供细胞因子所带来的成分误差。
(三)类器官种板、培养
1、取分装好300ul基质胶Matrigel(Corning)冰上解冻2h；
2、37℃培养箱中预热24孔板(NEST，非TC)；
3、取所获细胞沉淀，加2ml优选浓度的口腔黏液表皮样癌类器官培养基，轻轻吹打混匀；
4、显微镜下细胞计数，取1.8*105个细胞的悬液；
5、低温离心：1500rpm，4℃，5min，弃上清；
6、使用预冷、去尖枪头取300ul解冻基质胶Matrigel重悬细胞沉淀并轻轻混匀，避免产生气泡，全程冰上操作；
7、在37℃预热后的24孔板中每孔加入50ul悬浮细胞的基质胶，倒置培养2min，至基质胶形成圆顶状结构后，正置放在培养箱中进行培养30min；
8、基质胶完全固化后，每孔加入500ul优选浓度的口腔黏液表皮样癌类器官培养基；
9、每2-3天更换类器官培养基，镜下检测类器官污染及拍照记录类器官生长状态；
每日显微镜下检测类器官污染及拍照记录类器官生长状态，正常类器官培养至10-14天，镜下测量大多数球体直径达100um左右标志着类器官成熟，可进行传代、冻存、固定及鉴定。如果镜下观察类器官形成球形结构，但生长缓慢，则培养期可再延长7-14天。
10、换液：使用1000ul移液器小心弃掉原有培养基，每孔加入1000ul预冷D-PBS溶液轻柔荡洗后，移除并加入500ul新培养基，该过程动作需轻柔小心，切勿破坏基质凝胶；
(四)传代
1、使用1000ul移液器小心弃掉原有培养基，每孔加入1000ul预冷D-PBS溶液，并使用1000ul去尖枪头吹打数次，机械破坏基质胶，移至15ml离心管中；
2、低温离心：2000rpm，4℃，5min，弃上清；
3、加入3ml解离酶Ⅱ重悬沉淀并混匀，置于37℃恒温水浴摇床中5min，其中摇床转速为300-400rpm，每2-3分钟吹打混匀一次；
4、加入3ml含10％血清的DMEM培养基混匀终止消化，将所获悬液依次通过100μm、70μm的细胞筛网进行过滤；
5、低温离心：1500rpm，4℃，5min，弃上清；
6、加入2ml优选浓度的口腔黏液表皮样癌类器官培养基，轻轻吹打混匀，镜下计数，取所需细胞数的悬液进行种板传代；
7、种板：步骤同口腔黏液表皮样癌类器官原代种板步骤。常传代比例为24孔板中1：4-6，即一个孔中的原代口腔黏液表皮样癌类器官传代至新的24孔板中的4-6个孔中，具体传代比例以实际细胞计数量为主；
8、计算剩余悬液中细胞数量进行冻存，细胞冻存液配置：90％FBS胎牛血清+10％DMSO；
9、低温离心：1500rpm,4℃，5min.弃上清；
10、加入细胞冻存液重悬混匀移至冻存管中，1*105个细胞/ml/管，梯度冻存(4℃冰箱5min→-20℃冰箱30min→-80℃冰箱过夜→液氮桶长期冻存)。
本发明提出的口腔黏液表皮样癌类器官培养基中各种细胞因子及调控因子相互直接密切影响，协调配合，结合独特的消化酶和消化方法以及接种培养方法，能够解决口腔黏液表皮样癌原代细胞难以培养、传代的问题，并通过倒置显微镜观察、HE染色、免疫组化、免疫荧光等技术验证，所培养成熟的口腔黏液表皮样癌类器官可以在细胞形态、蛋白表达上高度保留原始口腔黏液表皮样癌的肿瘤异质性。
本发明在解离消化肿瘤组织过程中，所使用的恒温消化、低温离心、轻柔吹打等操作均可在充分解离、获得单细胞悬液的同时，提高种板时活细胞的比例，从而加快类器官的扩增，缩短培养的时间。
本发明在种板后倒置培养板可以避免原代细胞在基质胶凝固前细胞沉底贴壁，并有利于基质胶与培养板的贴附。选用非TC培养板也可减少底层细胞优先贴壁生长，较TC培养板更有利于细胞3D生长成球。
(五)镜下观察口腔黏液表皮样癌形态并拍照记录：
每日在倒置显微镜镜下检测不同代数口腔黏液表皮样癌类器官的污染及观察其生长形态，并摄图记录：
图1(a)为口腔黏液表皮样癌类器官原代培养至第7天镜下影像：多数口腔黏液表皮样癌肿瘤干细胞呈球形生长；图1(b)为口腔黏液表皮样癌类器官传代后P2代培养至第7天镜下影像；图1(c)为传代后P3代口腔黏液表皮样癌类器官培养至第7天镜下图像；通过图1(a)、(b)、(c)比对。传代后口腔黏液表皮样癌类器官生长速度及形态与原代类器官相似，无明显差异。
(六)口腔黏液表皮样癌类器官的组织学鉴定：
1、将原代、P4代口腔黏液表皮样癌类器官培养至第7天后进行固定、包埋、切片；取患者肿瘤组织切片(患者肿瘤样本切片取自徐州市中心医院病理科档案库)。
将所获得切片进行HE染色比对细胞形态：
图2(a)为原代口腔黏液表皮样癌类器官切片HE染色图像；图2(b)为P4代口腔黏液表皮样癌类器官切片HE染色图像；图2(c)为患者肿瘤样本切片HE染色图像；比对结果显示原代口腔黏液表皮样癌类器官细胞形态与来源肿瘤样本相似，且传代后仍可保留其形态。
2、将所获得切片进行蛋白表达(P53，P63，C-Kit，E-cad)和细胞增殖指数Ki67表达的免疫组织化学染色：
图3为原代口腔黏液表皮样癌类器官切片免疫组化图像；图4为P4代口腔黏液表皮样癌类器官切片免疫组化图像；图5为患者肿瘤样本切片免疫组化图像。比对图3-5结果显示原代类器官蛋白表达和增殖指数表达水平与来源肿瘤样本相近，多次传代后仍可稳定表达。
目前培养到第7代，共培养83天，细胞仍可以保持良好的增长扩增活性，仍可以继续培养传代；本发明已证明，液氮中长期冻存(3个月以上)的原代口腔黏液表皮样癌类器官细胞复苏后仍可保持细胞活性并扩增形成类器官。本发明提供的口腔黏液表皮样癌类器官培养基可以此为基础，进行药敏、放射学及免疫相关体外实验，一定程度上预测临床治疗方案的效果，选择最佳治疗方式，为实现个体化精准治疗提供有力的数据支持。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (9)

1.一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：配置口腔黏液表皮样癌类器官培养基，其由Advance DMEM/F12及相关功能组分组成；
S2：获取适宜大小新鲜肿瘤标本，清洗后将组织放入预冷的取材液中浸泡，冰上或低温下保存运输标本至实验室；
S3：取步骤S2中所获得的标本进行切碎，低温离心后，取组织碎片沉淀通过解离酶Ⅰ和解离酶Ⅱ进行组织解离消化，将消化后获得的单细胞悬液进行离心，取细胞沉淀；
S4：将步骤S3中的细胞沉淀与基质胶重悬，种板固化后加入步骤S1所述的口腔黏液表皮样癌类器官培养基中进行培养，每2-3天更换类器官培养基，定期检测类器官污染及记录类器官生长状态，每10-14天进行传代培养。
2.如权利要求1所述的一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤S1中，培养基中相关功能组分在基础培养基中的优选浓度组成为：青霉素-链霉素-两性霉素溶液，0.5-2X；HEPES缓冲液，0.5-2X；GlutaMAXTM，0.5-2X；N2补充剂，0.5-2X；B27补充剂，0.5-2X；Human FGF-10，5-20ng/ml；Human EGF，30-100ng/ml；重组Human R-Spodin-1蛋白，0.05-0.25ug/ml；重组Human Noggin蛋白，0.05-0.2ug/ml；重组Human Wnt-3A蛋白，0.05-0.2ug/ml；N-乙酰半胱氨酸，0.5-2.5mmol/L；烟酰胺，5-30mmol/L；Prostaglandin E2，0.5-1.5umol/L；A83-01，0.2-1umol/L；Butylated hydroxyanisole，2-8ng/ml；Gastrin I，0.01μmol/L；Rock抑制剂，5-20umol/L。
3.如权利要求1所述的一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤S2中，取材液为含有20X青霉素-链霉素-两性霉素溶液的DMEM培养基，在新鲜肿瘤标本切取后在20X青霉素-链霉素-两性霉素溶液预冷的DMEM培养基中浸泡并在其中切剪组织有利于降低后续原代类器官培养中出现污染的风险。
4.如权利要求1所述的一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤S3中，解离酶I：5mg/ml的Ⅰ型胶原酶和10ug/ml的DNaseⅠ以无血清的DMEM为溶剂配置；解离酶Ⅱ：0.25％胰蛋白酶-EDTA加入10ug/ml的DNaseⅠ配置。
5.如权利要求4所述的一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，特征在于，解离消化的具体步骤为：
S31：取步骤S2中所获得的标本，用无菌PBS清洗，在无菌培养皿中加入适量取材液，将组织切碎；
S32：将组织碎片吸至无菌离心管中，低温离心得到组织碎片沉淀；
S33：在组织碎片中加入解离酶Ⅰ，上下吹打使其混匀，37℃恒温震荡消化，低温离心后弃上清；
S34：重复步骤S33的解离酶Ⅰ消化三次后，取离心沉淀，加入解离酶Ⅱ，上下吹打使其混匀，37℃恒温震荡消化；
S35：加入含10％血清的DMEM培养基混匀，终止消化，将所获得悬液依次用细胞筛网进行过滤，低温离心后弃上清，得到细胞沉淀。
6.如权利要求1所述的一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，其特征在于，细胞沉淀中见较多红色沉淀，可加入红细胞裂解液吹打混匀，置37℃恒温震荡，加入PBS溶液稀释终止裂解液作用，低温离心弃上清。
7.如权利要求1所述的一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤S4类器官的种板及培养，具体步骤包括：
S41：取步骤S3所获细胞沉淀，加入步骤S1所述的口腔黏液表皮样癌类器官培养基，低温离心去上清液；
S42：取基质胶重悬细胞沉淀并混匀，倒置培养至基质胶形成圆顶状结构后，正置放在培养箱中至基质胶完全固化后，加入口腔黏液表皮样癌类器官培养基；
S43：每2-3天更换类器官培养基，镜下检测类器官污染及拍照记录类器官生长状态，正常类器官培养至10-14天，类器官成熟，进行传代、冻存、固定及鉴定。
8.如权利要求1所述的一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，其特征在于，传代培养步骤包括：弃掉原有培养基，加入预冷D-PBS溶液，机械破坏基质胶，移至离心管中低温离心，弃上清；加入解离酶Ⅱ重悬沉淀并混匀，37℃恒温震荡消化；加入含10％血清的DMEM培养基混匀终止消化，将所获得悬液依次用细胞筛网进行过滤，低温离心弃上清；后续种板步骤同口腔黏液表皮样癌类器官原代种板步骤。
9.如权利要求1～8任一项所述的一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法在培养口腔黏液表皮样癌类器官中的应用。
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