CN111989569A - 免疫细胞类器官共培养物 - Google Patents

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罗伯特·格哈达斯·雅各布·弗里斯
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Abstract

本发明提供了类器官和免疫细胞的共培养物，以及使用这些共培养物来鉴定用于治疗疾病的试剂的方法。

Description

免疫细胞类器官共培养物
本文中引用的所有文献均通过引用整体并入。
技术领域
本发明涉及类器官共培养物及其在疾病研究中的用途。
背景技术
尽管用于进行此类研究的体外系统仍然是基础，但是对生理学基础疾病(如癌症和免疫疾病)的临床研究仍然是医学进展的基石。同样，用于治疗此类疾病的现代方案通常在开发过程中涉及严格的测试系统，以确保方案的功效和安全性。尽管这些领域的最新进展已经提高了研究和治疗测试系统的功效，但是需要在系统的效率、准确性和成本效益方面进行改进。理想的测试系统将在生物化学、细胞、组织、器官和生物体水平上精准确地复制患者或患者群体的生理状况，而不需要直接对患者进行测试并最小化患者样品的使用。在一个系统中必须容纳各种不同的处理试剂和时间表。
‘筛选’候选化合物需要体外模型以鉴定用于在群体水平上研究和治疗癌症和免疫疾病的新方案。此外，对‘个性化医疗’的兴趣日益增加，其中体外模型可以用于测试(有时是预先批准的)具有特定特征的患者亚组中的方案，或甚至用于来自单个患者的样品，以确定该特定亚组或患者的最佳方案。
类器官技术领域正在彻底改变我们对发育生物学的理解。类器官是通过上皮细胞的扩增获得的细胞结构，并且由通过细胞分选和空间限制的谱系保证而自组织的组织特异性细胞类型组成(Clevers,Cell.2016年6月16日；165(7):1586-1597)。现有技术中基于类器官的模型的局限性在于它们仅含有上皮细胞，因此不能完全代表含有多种细胞类型的体内组织系统。特别地，还没有描述人类癌症类器官(“类肿瘤”)和免疫细胞的‘共培养物’，当然还没有描述其中癌症和免疫细胞从同一患者获得的情况。免疫细胞提高了作为测试系统的类器官的准确性，复制了患者的生理状况，并确保免疫系统在测试系统中得以体现。
先前的尝试已经证明了鼠科动物上皮内淋巴细胞(IEL)与鼠科动物肠上皮类器官的共培养物，目的是了解IEL与肠上皮细胞的时空行为-Nozaki等人(JGastroenterol.2016年3月；51(3):206-13)和Rogoz等(J Immunol Methods.2015年6月；421:89-95)–但是没有报道开发人类类器官共培养物的进展和在研究和治疗癌症中的应用。已经从来源于结肠直肠癌患者的样品制备所谓的‘类肿瘤’(Drost等人，Nature.2015年5月7日；521(7550):43-7；van de Wetering等人，Cell.2015年5月7日；161(4):933-45)，但尚未与免疫细胞共培养以研究癌症的治疗方案。
需要用于制备类器官共培养物和类肿瘤共培养物的改进方法和用于在药物筛选(特别是其中可以利用疾病细胞和免疫细胞之间的相互作用来以高通量能力来研究一系列增加的药物的系统)中使用这些共培养物的方法。
发明概述
本发明的发明人已经开发了可用于与疾病(如癌症和免疫疾病)相关的研究(包括鉴定用于此类疾病的合适治疗)的类器官共培养物。在一些实施方案中，这涉及制备类器官和免疫细胞(特别是疾病类器官(如类肿瘤)和免疫细胞)的共培养物，其可以暴露于用于治疗疾病的候选试剂并检测用于鉴定合适的候选试剂的任何变化。
因此，本发明提供了用于鉴定适合于治疗癌症的试剂的方法，其中所述方法包括：
使类肿瘤共培养物与一种或多种候选试剂接触，其中所述类肿瘤共培养物包含免疫细胞和至少一种类肿瘤，
检测类肿瘤共培养物中是否存在指示候选试剂适合于治疗所述癌症的一种或多种变化，和
如果检测到所述类肿瘤共培养物中一种或多种所述变化的存在或不存在，则将候选试剂鉴定为适合于治疗所述癌症。
在一些实施方案中，上述方法还包括将类肿瘤共培养物的所述一种或多种变化的存在或不存在与参考类器官或参考类肿瘤进行比较，并且其中所述方法还包括：
使参考类器官共培养物或参考类肿瘤共培养物与所述一种或多种候选试剂接触，其中所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物包含免疫细胞和至少一种类器官或类肿瘤，和
检测所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物中是否存在指示候选试剂适合于治疗所述癌症的一种或多种变化。
本发明还提供了用于鉴定适合于治疗免疫疾病的试剂的方法，其中所述方法包括：
使类器官共培养物与一种或多种候选试剂接触，其中所述类器官共培养物包含患病的免疫细胞和至少一种类器官，
检测所述类器官共培养物中是否存在指示候选试剂适合于治疗所述免疫疾病的一种或多种变化，和
如果检测到所述类器官共培养物中一种或多种所述变化的存在或不存在，则将候选试剂鉴定为适合于治疗所述免疫疾病。
在一些实施方案中，上述方法还包括将所述类器官共培养物的一种或多种变化的存在或不存在与参考免疫细胞(例如来自缺乏所述免疫疾病的对照患者)进行比较，并且其中所述方法还包括：
使参考类器官共培养物与所述一种或多种候选试剂接触，其中所述参考类器官共培养物包含免疫细胞和至少一种类器官，
检测所述参考类器官共培养物中是否存在指示候选试剂适合于治疗所述免疫疾病的所述一种或多种变化。
还提供了测试CAR-T免疫疗法、TCR转基因T细胞、新抗原或检查点抑制剂用于治疗上皮癌时的功效和/或安全性的方法，所述方法包括：
任选地从同一患者提供肿瘤上皮细胞、正常上皮细胞和免疫细胞，
在类肿瘤培养基中扩增所述肿瘤上皮细胞以形成类肿瘤，并且在包含白介素的类肿瘤共培养培养基中培养所述类肿瘤与所述免疫细胞以形成类肿瘤共培养物，
在类器官培养基中扩增所述正常上皮细胞以形成类器官，并且在包含白介素的类器官共培养培养基中培养所述类器官与所述免疫细胞以形成参考类器官共培养物，
使所述类肿瘤共培养物和所述参考类器官共培养物与所述CAR-T免疫疗法、TCR转基因T细胞、新抗原或检查点抑制剂接触，检测在所述类肿瘤共培养物和所述参考类器官共培养物中是否存在一种或多种变化，其中是否存在所述一种或多种变化指示所述CAR-T免疫疗法、TCR转基因T细胞、新抗原或检查点抑制剂的功效和/或安全性，和
比较所述类肿瘤共培养物与所述参考类器官共培养物。
还提供了测试候选化合物用于治疗上皮癌时的功效和/或安全性的方法，所述方法包括：
任选地从同一患者提供肿瘤上皮细胞、正常上皮细胞和免疫细胞，在类肿瘤培养基中扩增所述肿瘤上皮细胞以形成类肿瘤，并且在包含白介素的类肿瘤共培养培养基中培养所述类肿瘤与所述免疫细胞以形成类肿瘤共培养物，
在类器官培养基中扩增所述正常上皮细胞以形成类器官，并且在包含白介素的类器官共培养培养基中培养所述类器官与所述免疫细胞以形成参考类器官共培养物，
使所述类肿瘤共培养物和所述参考类器官共培养物与所述候选化合物接触，
检测在所述类肿瘤共培养物和所述参考类器官共培养物中是否存在一种或多种变化，其中是否存在所述一种或多种变化指示所述候选化合物的功效和/或安全性，和
比较所述类肿瘤共培养物与所述参考类器官共培养物。
还提供了制备类器官免疫细胞共培养物的方法，其中所述方法包括：
任选地在类器官培养基中培养与细胞外基质接触的上皮细胞以获得类器官；
从所述类器官中去除所述细胞外基质和所述类器官培养基；
将所述类器官重悬在补充有白介素的免疫细胞培养基中；
制备免疫细胞悬浮液，所述免疫细胞悬浮液包含免疫细胞、补充有白介素的免疫细胞培养基和在所述悬浮液中浓度为至少5-10％的胶原蛋白；和
将包含免疫细胞的所述免疫细胞悬浮液与重悬的类器官混合。
还提供了制备肿瘤免疫细胞共培养物的方法，其中所述方法包括：
任选地在类肿瘤培养基中培养与细胞外基质接触的肿瘤上皮细胞以获得类器官；
从所述类肿瘤中去除所述细胞外基质和所述类肿瘤培养基；
将所述类肿瘤重悬于补充有白介素的免疫细胞培养基中；
制备免疫细胞悬浮液，所述免疫细胞悬浮液包含免疫细胞、补充有白介素的免疫细胞培养基和在所述悬浮液中浓度为至少5-10％的胶原蛋白；和
将包含免疫细胞的所述免疫细胞悬浮液与重悬的类肿瘤混合。
还提供了用于测试治疗剂的方法，其中所述方法包括：
使类器官共培养物与一种或多种候选试剂接触，其中所述类器官共培养物包含免疫细胞和至少一种类器官，
检测所述类器官共培养物中是否存在指示治疗功效的一种或多种变化，和
如果检测到在所述类器官共培养物中一种或多种所述变化的存在或不存在，则将候选试剂鉴定为治疗剂。
还提供了通过本发明的方法可获得或获得的类器官共培养物。
还提供了通过本发明的方法可获得或获得的类肿瘤共培养物。
还提供了通过本发明的方法可获得或获得的类器官群。
还提供了通过本发明的方法可获得或获得的类肿瘤群。
还提供了适合用于本发明方法的类器官共培养培养基。
还提供了适合用于本发明方法的类肿瘤共培养培养基和类器官共培养培养基。还提供了在包含白介素的培养基中的类肿瘤或类器官，任选地其中所述白介素选自IL-2、IL-7和IL-15
本发明还提供了试剂盒，其包含本发明的类肿瘤、类器官、类肿瘤共培养物或类器官共培养物。
附图简述
图1.从原发性患者组织衍生出类器官、类肿瘤和T细胞。
图1A.程序的示意图。正常结肠粘膜和肿瘤组织的活组织检查物取自结肠直肠癌患者的切除的结肠和/或直肠。在手术过程也取了外周血。用EDTA处理正常结肠粘膜以释放用于衍生正常结肠类器官的隐窝，并进一步消化以制备含有用于T细胞培养的上皮内淋巴细胞(IEL)的单细胞悬浮液。消化肿瘤组织以制备含有用于衍生类肿瘤的上皮肿瘤细胞以及用于T细胞培养的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的单细胞悬浮液。处理外周血以纯化富含外周血淋巴细胞(PBL)和T细胞的外周血单个核细胞。通过T细胞的T细胞受体(TCR)测序和免疫表型分型以及存在于正常结肠上皮和肿瘤上皮的单细胞悬浮液中的细胞的单细胞信使RNA(mRNA)测序进行初步分析。使用全基因组测序、mRNA测序和多肽组(peptidome)图谱分析类器官培养物。
图1B.来源于患者样品的正常结肠类器官和类肿瘤的代表性明场图像。将结肠隐窝包埋入基底膜提取物中(BME)，并用含有以下的培养基培养：R-脊椎蛋白1、头蛋白、Wnt3A条件培养基、不含维生素A的B27补充剂、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、EGF、TGF-β抑制剂A-83-01、胃泌素、p38MAPK抑制剂SB202190和前列腺素E2。正常结肠类器官在1周内发育，然后每周传代(上图)。将来自结肠直肠癌样品的单细胞悬浮液包埋入基底膜提取物(BME)中，并用含有以下的培养基培养：R-脊椎蛋白1、头蛋白条件培养基、不含维生素A的B27补充剂、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、EGF、TGF-β抑制剂A-83-01、胃泌素、p38MAPK抑制剂SB202190和前列腺素E2。类肿瘤在1周内形成，然后每周传代(下图)。
图1C.来源于患者样品的上皮内淋巴细胞(IEL)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)克隆生长晕的代表性明场图像(左图)。流式细胞术分析显示CD4+辅助性T(Th)细胞和CD8+细胞毒性T细胞(CTL)的稳健扩增。将来自正常结肠粘膜或结肠直肠癌组织的单细胞悬浮液维持在含有白介素-2(IL-2)的T细胞培养基中。T细胞的克隆生长晕在1-2周内是显著的(左图)。
图1在实施例1中被进一步描述。
图2.正常结肠类器官和同种异体CD3+T细胞在基底膜提取物(BME)液滴中的原理验证共培养。
图2A.程序的示意图。使用细胞回收溶液从BME液滴中释放正常结肠类器官，并在完全的高级DMEM/F12中洗涤。从培养物中收获扩增的CD3+T细胞并用绿色染料(VybrantCFDA SE细胞示踪剂)标记。将结肠类器官和标记的T细胞混合在人结肠类器官培养基中并包埋入BME液滴中。将共培养物在含有IL-2的人结肠类器官培养基中维持60小时。使用细胞回收溶液从BME中释放共培养物并固定在4％的多聚甲醛中。将固定的整个封装物(whole-mounts)用鬼笔环肽染色以标记聚合的肌动蛋白并用DAPI标记细胞核。在ProLong Gold抗淬灭封片剂中将整个封装物封装到载玻片上，并在Leica SP8X共焦显微镜上成像。
图2B.结肠类器官共培养物z堆栈(z-stack)图像的最大投影。以深灰色标记类器官中的F-肌动蛋白，而以浅灰色标记T细胞。右图中的插入图显示了浸润结肠上皮的T细胞。
图2C.正常结肠类器官和T细胞的三维重建。
图2在实施例8中被进一步描述。
图3.对类肿瘤共培养物进行活体成像以评估T细胞的最佳运动性。
图3A.程序的示意图。使用细胞回收溶液从BME液滴中释放类肿瘤，并在完全的高级DMEM/F12中洗涤。用绿色染料(Vybrant CFDA SE细胞示踪剂)标记从外周血样品中分离的同种异体CD8+T细胞。将类肿瘤和T细胞与含有IL-2和10％BME或大鼠尾I型胶原蛋白的人结肠类器官培养基混合，并在配备有活体成像室的Leica SP8X共聚焦显微镜上在37℃和5％CO2的环境下进行活体成像80小时。
图3B.类肿瘤共培养物的代表性复合图像。将明场通道和绿色荧光通道合并以产生复合图像。使用Imaris软件追踪T细胞行进路径。
图3C.在两种条件下T细胞的轨迹长度的定量显示，与在10％BME中相比，在10％胶原蛋白中共培养的T细胞的显著更长的轨迹路径。
图3在实施例10中被更详细地解释。
图4.人白细胞抗原(HLA)A2型阳性和阴性克隆性类肿瘤的产生。
图4A.程序的示意图。使用TrypLE酶消化将类肿瘤分离成单细胞。单细胞用抗HLA-A2抗体染色并基于抗HLA-A2免疫反应性纯化。将HLA-A2+ve和HLA-A2-ve肿瘤细胞包埋并维持以产生类肿瘤。
图4B.流式细胞术分析显示建立了纯的HLA-A2+ve或HLA-A2-ve类肿瘤系。对照是HLA-A2+ve JY细胞系以及与HLA-A2+ve或HLA-A2-ve类肿瘤系来源于同一患者样品的正常结肠类器官系。
图4在实施例11中被进一步解释。
图5.经历过抗原的T细胞的抗类肿瘤反应性的杀伤性测定。
图5A.程序的示意图。用HLA-A2限制性Wilms肿瘤1(WT1)肽脉冲HLA-A2+ve或HLA-A2-ve类肿瘤2小时。然后将携带有WT1肽特异性TCR的TCR转基因CD8+T细胞与用WT1肽脉冲的HLA-A2+ve或HLA-A2-ve类肿瘤共培养48小时。
图5B.48小时后共培养物的代表性明场图像显示仅用WT1肽脉冲的HLA-A2+ve类肿瘤明显死亡。所有其它情况(即未用WT1肽脉冲的HLA-A2+ve或HLA-A2-ve类肿瘤和用WT1肽脉冲的HLA-A2-ve类肿瘤)显示正常生长。
图5在实施例12中被更详细地解释。
图6.用于具有和不具有检查点抑制的经历过抗原的T细胞的抗类肿瘤反应性的细胞存活力测定。
图6A.程序的示意图。如图5A所述的进行共培养，但仅培养12小时，并与和不与抗PD1检查点抑制剂一起孵育。使用CellTiter Glo发光细胞存活力测定试剂盒(Promega)根据制造商的说明书进行细胞存活力测定。
图6B.相对于无肽对照将类肿瘤的细胞存活力归一化。
图6在实施例13中被更详细地解释。
图7.通过类器官/类肿瘤共培养物确定对T细胞激活的差异作用的测定。
图7A.程序的示意图。使用分散酶从
Figure BDA0002626202480000091
液滴中释放类肿瘤，并随后通过70μm和20μm的过滤器。从20μm的过滤器中回收类器官、计数并铺板。将类肿瘤和T细胞与含有RPMI、IL-2和5％
Figure BDA0002626202480000092
的人结肠类器官培养基混合，并在37℃和5％CO2环境中孵育。孵育24小时后，使用明场倒置显微镜对类器官成像。
图7B.类肿瘤共培养物的代表性图像。
图7C.类器官共培养物的代表性图像。
图7D.共培养物的IFN-γ水平的定量。
图7在实施例14中被进一步解释。
图8.用于评估关联性和细胞杀伤能力的类肿瘤共培养物的活体成像。
图8A.程序的示意图。使用分散酶从
Figure BDA0002626202480000093
液滴中释放类肿瘤，并随后通过70μm和20μm的过滤器。从20μm的过滤器中回收类器官、计数并铺板。用远红外染(CellVue深紫红色)标记培养的T细胞。将类肿瘤和T细胞与含有RPMI、IL-2和5％
Figure BDA0002626202480000094
的人结肠类器官培养基混合，并在配备有活体成像室的Leica SP8X共聚焦显微镜上于37℃和5％CO2的环境下进行活体成像68小时。
图8B.类肿瘤和非靶向T细胞共培养物的代表性复合图像。将明场通道和远红外荧光通道合并以生成复合图像。
图8C.类肿瘤和靶向T细胞共培养物的代表性复合图像。将明场通道和远红外荧光通道合并以生成复合图像。
图8在实施例15中被进一步描述。
图9.CRC类器官表达免疫调节分子。正常结肠和CRC类器官系以患者特异性方式产生，提取RNA并使用Affymetrix单转录微阵列分析。
图9A.正常结肠和CRC类器官系中不同免疫调节剂的平均基因表达；n.s.，不显著；*，p<0.05。
图9B.展示所选免疫调节剂基因表达的‘活体生物样本库’中个体正常结肠和CRC类器官系的分层聚类。颜色梯度代表每行(基因转录物)的z值。
图9C.经基因工程化以携带一个或多个在CRC中发现的突变的人结肠类器官系。通过定量PCR评估在稳态(对照)和用20ng/mL重组人IFN-γ刺激后在类器官系(n＝2)中的CD274(PD-L1)的表达水平。A,APCKO/KO；N.D.，未检测到；K,KRASG12D/+:P,P53KO/KO；S,SMAD4KO /KO,WT，野生型。
图9D.经基因工程化以携带在CRC中发现的一个或多个突变的人结肠类器官系。通过流式细胞术评估在稳态(对照)和用20ng/mL重组人IFN-γ刺激后在类器官系(n＝2)中的CD274(PD-L1)的表达水平。A，APCKO/KO；N.D.，未检测到；K,KRASG12D/+:P,P53KO/KO；S,SMAD4KO /KO,WT，野生型。
图10.HLA-A2在克隆性扩增的HLA-A2+和HLA-A2-CRC类器官系上的表达。该图显示了多次重复实验的代表性曲线图。在用和不用20ng/mL重组人IFN-γ刺激的正常(左图)、HLA-A2+CRC(中图)和HLA-A2-CRC(右图)系上的HLA-A2表达的流式细胞术分析。
图11.CRC类器官作为评估CD8+T细胞的抗原特异性杀伤的工具
图11A.实验方案。
图11B.克隆的HLA-A2+和HLA-A2-系中HLA-A2表达的流式细胞术分析。
图11C.与WT1肽特异性T细胞受体特异性转基因T细胞共培养48小时的CRC类器官的明场图像；比例尺：1mm。
图11D.显示在与指定的肽特异性T细胞共培养的开始和结束时的肽脉冲的HLA-A2+CRC类器官的图像；比例尺：70μm。
图11E.如通过在与用所指示的肽脉冲的HLA-A2+CRC类器官共培养18小时后收集的上清液的ELISA测量的，由WT1(上图)和EBV(下图)肽特异性T细胞产生IFN-γ。
图11F.用EBV肽脉冲的HLA-A2+CRC类器官与EBV特异性T细胞克隆共培养的18小时共培养实验的活细胞成像静止图像。
图11G.定量特异性T细胞对CRC类器官的杀伤作用。图代表用EBV肽和EBV T细胞共培养物或WT1肽和WT1 T细胞共培养物进行的多次重复实验。
图11H.如在活细胞成像实验过程中所记录的，浸润到肽脉冲的CRC类器官的T细胞的代表性投影图像(蓝色)。
图11I.在存在或不存在针对PD-1的封闭性抗体的情况下，定量特异性T细胞对IFN-γ处理的CRC类器官杀伤作用。图代表用EBV肽和EBV T细胞共培养物或WT1肽以及WT1T细胞共培养物进行的多次重复实验。
图11J.定量肽脉冲的或非脉冲的HLA-A2+类器官与抗原特异性T细胞共培养18小时后的细胞存活力。图代表肽脉冲的和非肽脉冲的条件之间的比例。
发明详述
定义
“同种异体的”是指来源于不同患者的实体(例如细胞、类肿瘤、共培养物)。在是细胞的情况下，这可以指来源于来自不同患者或健康对照的样品的细胞。合适的样品的实例包括但不限于外周血或组织活检物。
如本申请中所使用的“大约”或“约”是等同的。在本申请中所使用的具有或不具有约/大约的任何数字意味着覆盖本领域技术人员所理解的任何正常波动。如本文中所使用的，如应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”是指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，除非另有说明或从上下文中明显看出(除了此类数字将超过可能值的100％之外)，否则术语“大约”或“约”是指落入所述参考值的任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值。
“生物学活性的”是指在生物系统(特别是在生物体)中具有活性的任何试剂的特征。例如，当施用于生物体时，对该生物体具有生物学效应的试剂被认为是具有生物学活性的。
“共培养物”是指在适合于它们的共同生长的条件下维持的两种或更多种细胞类型。在本公开的上下文中，“类器官共培养物”涉及与非上皮细胞类型(特别是免疫细胞类型)一起培养的如别处所限定的上皮类器官。在一些实施方案中，共培养物中的细胞类型展现出它们不单独展现的结构、生物化学和/或现象学关联。在一些实施方案中，共培养中的细胞类型模拟在体内观察到的细胞类型之间的结构、生化和/或现象学关联。
“包含(comprise/comprises/comprising)”将被理解为意指包括所述步骤或元素、或步骤或元素的组，但不排除任何其它步骤或元素、或步骤或元素的组。
“剂量”是指在单次施用中提供的药物试剂的指定量。在某些实施方案中，剂量可以以两次或更多次的大丸剂、片剂或注射剂施用。例如，在某些期望皮下施用的实施方案中，所期望的剂量需要单次注射不容易被容纳的体积。在此类实施方案中，可以使用两次或更多次注射来实现所需的剂量。在某些实施方案中，可以以两次或更多次注射施用剂量以最小化个体中的注射位点反应。在某些实施方案中，以缓慢输注的方式施用剂量。
“免疫疾病”是指免疫系统的任何病症。免疫疾病通常具有遗传成分，并且包括自身免疫性疾病(其中免疫系统错误地作用于‘自身’成分)和免疫介导的疾病(其中免疫系统展现出过度的功能)。
“免疫疗法”是指诱导、抑制或增强患者的免疫系统以治疗疾病的任何医学干预。在一些实施方案中，免疫疗法激活患者的先天性免疫应答和/或适应性免疫应答(例如T细胞)以更有效地靶向和去除病原体或治愈疾病(如癌症或免疫疾病)。
“肠”和“肠的”是指胃肠道，其包括口、口腔、食道、胃、大肠、小肠、直肠和肛门。
“类器官”是指通过扩增成体(胚胎后)上皮干细胞(优选以Lgr5表达为特征)获得的细胞结构，并且由通过细胞分选和空间限制的谱系保证而自组织的组织特异性细胞类型组成(如在Clevers,Cell.2016年6月16日；165(7):1586-1597中所描述的，特别参见第1590页起被称为“从成体干细胞衍生的类器官(Organoids derived from adult stem cells)”的章节)。在本申请中，术语“类器官”可以被用于指正常(例如非肿瘤)类器官。当类器官被描述为“疾病”类器官时，这意味着类器官具有疾病表型，例如通常因为类器官已经衍生自具有疾病表型的一种或多种上皮干细胞，或在一些实施方案中，因为类器官已经被遗传修饰以展示疾病表型的特定特征。
“群体”是指共有共同特性的一组实体。在一些实施方案中，“群体”是指共有一组相关临床特性的患者。优选地，“群体”可以指共有相同癌症、和/或正用相同试剂治疗、和/或对用相同试剂成功治疗易感的一组患者。在治疗期间，群体可以在一个或多个特征(包括基因型和/或特异性试剂应答特征)上不同。群体也可以指共有一种或多种基因型、表型或生物化学特性的一组细胞、器官和/或共培养物。“亚群体”是指与其中亚群体的实体也被分类的较大群体相比，共有更大数量的共同特性、或更小数量的不同特性的一组实体。
“安全”是指对疾病的治疗，根据标准临床实践，所述治疗没有副作用或仅在可耐受的水平内具有副作用。
“副作用”或“有害作用”是指可归因于所期望作用以外的治疗的生理反应。
“对象”或“患者”或“个体”可指人或任何非人类动物(如任何小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。在优选的实施方案中，患者是哺乳动物，更优选为人。“人”可以指产前和/或产后形式。对象可以是患者，其是指呈现给医疗提供者用于诊断或治疗疾病的人。术语“对象”在本文中与“个体”或“患者”互换使用。患者可以患有疾病或病症或对疾病或病症易感，但可以展示或不展示疾病或病症的症状。
“患有”是指已经被诊断患有或展示疾病、病症和/或病况的一种或多种症状的患者。
“对…易感”是指未被诊断患有疾病、病症和/或病况的患者。在一些实施方案中，对疾病、病症和/或病况易感的患者可能不表现出疾病、病症和/或病况的症状。在一些实施方案中，对疾病、病症、病况或事件易感的患者的特征可以在于以下中的一种或多种：(1)与疾病、病症和/或病况的发展相关的遗传突变；(2)与疾病、病症和/或病况的发展相关的遗传多态性；(3)与疾病、病症和/或病况相关的蛋白的表达和/或活性增加和/或降低；(4)与疾病、病症和/或病况的发展相关的习惯和/或生活方式，和/或(5)已经接受、计划接受或需要移植。在一些实施方案中，对疾病、病症和/或病况易感的患者将发展成所述疾病、病症和/或病况。在一些实施方案中，对疾病、病症和/或病况易感的患者将不发展成所述疾病、病症和/或病况。
“治疗有效量”是指当向患有疾病、病症和/或病况或对疾病、病症和/或病况易感的对象施用时足以治疗、诊断、预防和/或延迟疾病、病症和/或病况的症状的发作的治疗剂的量。本领域技术人员将理解，治疗有效量通常经由包含至少一个单位剂量的给药方案施用。
“治疗(Treating/treat/treament)”是指用于部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、预防特定疾病、病症和/或病况的一种或多种症状或特征、延迟特定疾病、病症和/或病况的一种或多种症状或特征的发作、降低特定疾病、病症和/或病况的一种或多种症状或特征的严重性和/或发生率的任何方法。治疗可以施用于未表现出疾病的病征和/或仅表现出疾病的早期病征的对象，目的是降低发展成与疾病相关的病状的风险。
“类肿瘤”是指包含表现出分类为癌性的一种或多种遗传、表型或生物化学特性的细胞的类器官。在本申请中，术语“类肿瘤”包括衍生自癌组织的“类器官”。术语“类肿瘤”也可以包括肿瘤进展类器官(TPO)，它们是工程化的肿瘤类器官培养物，其中正常类器官已被工程化(例如使用Cas9技术)以含有癌症突变。
鉴定适合治疗的试剂
概要。本发明涉及类器官和免疫细胞的共培养物(‘类器官共培养物’)和/或疾病类器官(如类肿瘤)和免疫细胞的共培养物(‘疾病类器官共培养物’或更具体地‘类肿瘤共培养物’)，以及它们用于研究疾病的生理学和/或治疗疾病的候选试剂的适宜性的用途。治疗疾病的适宜性可以包括治疗疾病的功效和/或治疗疾病的安全性。特别感兴趣的疾病包括癌症和免疫疾病。
因此，本发明提供了用于鉴定适合于治疗癌症的试剂的方法，其中所述方法包括：
使类肿瘤共培养物与一种或多种候选试剂接触，其中所述类肿瘤共培养物包含免疫细胞和至少一种类肿瘤，
检测类肿瘤共培养物中是否存在指示候选试剂适合于治疗所述癌症的一种或多种变化，和
如果检测到所述类肿瘤共培养物中一种或多种所述变化的存在或不存在，则将候选试剂鉴定为适合于治疗所述癌症。
还提供了用于测试治疗剂的方法，其中所述方法包括：
使类器官共培养物与一种或多种候选试剂接触，其中所述类器官共培养物包含免疫细胞和至少一种类器官，
检测所述类器官共培养物中是否存在指示治疗剂功效的一种或多种变化，和
如果检测到在所述类器官共培养物中一种或多种所述变化的存在或不存在，则将候选试剂鉴定为治疗剂。
在一些实施方案中，所述类器官是疾病类器官(例如展示免疫疾病表型的类器官)。由于在本发明的共培养物中存在免疫细胞，所述共培养物特别适合于研究候选免疫疗法试剂的适宜性。
本发明的方法具有高通量(HTP)能力。在一些实施方案中，本发明的方法可以在96孔板和/或384孔板上进行。
接触步骤。这可能涉及将类器官共培养物暴露于已知或未知治疗剂的治疗水平。通常，将试剂溶解在溶液中至(预测的)治疗有效浓度，并通过注射(或其它适当的施用)到其中维持共培养物的容器中施用于共培养物。
检测步骤。在一些实施方案中，本发明包括检测指示候选试剂适合于治疗的类肿瘤共培养物中是否存在一种或多种变化的步骤。
原则上，可以检测共培养物中的任何生物化学、遗传、表型或现象变化。在一些实施方案中，所述一种或多种变化可以是一种或多种疾病生物标志物(如癌症生物标志物)中的变化。在一些实施方案中，所述一种或多种变化可以包括细胞存活力的降低、细胞增殖的减少、细胞死亡的增加、细胞或类器官大小的变化、细胞运动性的变化、完整/致密上皮细胞层的解离或破坏(即细胞从致密上皮细胞层解离)、共培养免疫细胞的细胞因子和细胞毒性分子的产生的变化以及一种或多种基因的表达的变化。
原则上，可以使用本领域技术人员已知的任何合适的实验室方法进行检测。在一些实施方案中，检测一种或多种变化可以包括细胞增殖测定、存活力测定、流式细胞术分析、IFN-γ(干扰素γ)的ELISA(如图8D中所进行的)、基因表达分析和/或细胞成像。
细胞存活力的降低可以通过CellTiter Glo发光细胞存活力测定试剂盒(Promega)、活性半胱天冬酶3的细胞内流式细胞术染色(BD)或死亡细胞的阳性染色来检测。死亡细胞的阳性菌株包括非细胞膜可渗透的DNA染色(如NucRed Dead 647ReadyProb)。
细胞死亡的增加可以通过明场成像来检测。
鉴定步骤。鉴定可以包括鉴定特定量级的变化，并且可以是自动化和/或高通量过程。
比较步骤。在一些实施方案中，本发明可以包括将所述类器官共培养物或类肿瘤共培养物与对照进行比较的步骤，所述对照可以与所述鉴定步骤相关或不相关。这可以涉及将类肿瘤共培养物的一种或多种变化的存在或不存在或量级与参考类器官或参考类肿瘤进行比较，并且可以还包括：
使参考类器官共培养物或参考类肿瘤共培养物与一种或多种候选试剂接触，其中所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物包含免疫细胞和至少一种类器官，和
检测所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物中是否存在指示候选试剂适合于治疗癌症的一种或多种变化。
在一些实施方案中，如果在类肿瘤共培养物中检测到变化的存在或不存在，而在参考共培养物中未测到变化的存在或不存在，则候选试剂被鉴定为合适的试剂。
在一些实施方案中，参考类器官共培养物或参考类肿瘤共培养物被用作对照(如阴性对照或阳性对照)。
选择步骤。在一些实施方案中，本发明的方法包括选择适合于治疗癌症的候选试剂的步骤。选择不同于鉴定，因为选择可以涉及考虑所提供方法的一种或多种变化的存在或不存在或量级的注意事项。例如，选择可以包括另外的注意事项(如试剂生物利用度、对患者亚群的适用性、或试剂的递送机制)，其可以在该方法中测试或不测试。
在一些实施方案中，该步骤可以是本发明方法的最后步骤。在其它实施方案中，设想了进一步的步骤。例如，本发明的方法还可以包括在治疗中使用所选择的候选试剂的步骤。
试剂。可以根据本发明的方法测试任何试剂。这包括任何生物试剂、化学试剂、物理试剂或其它试剂，或同时或依次施用的多种试剂。
进行测试治疗癌症的适宜性的试剂(或‘候选试剂’)可以选自以下治疗剂类别中的一种或多种：免疫治疗剂、肿瘤特异性肽、检查点抑制剂、烷化剂、抗代谢物、代谢激动剂、代谢拮抗剂、植物生物碱、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、放射治疗剂、化学治疗剂、抗体、光敏剂、干细胞移植物、疫苗、细胞毒性剂、细胞抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、细胞因子、干扰素、白介素、嵌入剂、靶向治疗剂、小分子药物、激素、类固醇、细胞治疗剂、病毒载体和核酸治疗剂。
优选地，试剂是肿瘤特异性肽、检查点抑制剂或免疫治疗剂。
试剂更优选地是免疫治疗剂，例如嵌合抗原受体(CAR)-T细胞治疗剂、治疗性TCR转基因T细胞或新抗原。其它试剂包括与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)相关的试剂。
环境(Context)。所要求保护的本发明的方法可以在体内、离体、体外、原位、非原位或它们的任意组合进行。优选地，所述方法在体外进行。
个性化医疗
概要。测试不同方案的一种方法可以被描述为测试的‘个性化医疗’方法。个性化医疗方法可以包括测试已知适合于治疗的一种或多种候选试剂，和/或将一种或多种候选试剂鉴定为特定患者的合适试剂。
本发明的个性化医疗应用可能要求类肿瘤共培养物和参考类器官共培养物或参考类肿瘤共培养物都来源于正在被鉴定候选试剂的治疗癌症的适宜性的特定患者。
本发明的发明人已经表明，可以从单一患者的单个组织中获得免疫细胞、正常(例如非肿瘤)上皮细胞和肿瘤上皮细胞，并且可以从这些细胞获得类器官免疫细胞共培养物和肿瘤免疫细胞共培养物。这些共培养物为测试个体患者对候选试剂的应答提供了特别有用的模型。
随后可以用如此鉴定的候选试剂治疗对于其候选试剂已被鉴定为适合于治疗癌症的患者。
筛选
概要。测试不同方案的另一种方法可以被描述为测试的‘筛选’方法。筛选方法可以涉及测试具有未知的用于治疗的适宜性的一种或多种候选试剂，和/或鉴定一种或多种候选试剂的子集作为治疗的合适试剂。
本发明的筛选应用可能需要一种或多种候选试剂具有已知的用于治疗第一种癌症的适宜性和未知的用于治疗第二种癌症的适宜性，期中筛选包括将所述一种或多种候选试剂的子集鉴定为用于治疗所述第二种癌症的合适试剂。
在一些实施方案中，筛选方法鉴定适合于在‘群体’水平而不是在亚群体水平治疗癌症的试剂。在其它实施方案中，筛选方法鉴定适合于在亚群体水平治疗癌症的试剂。在一些实施方案中，筛选方法不被用于鉴定适合于在个体患者水平治疗癌症的试剂(其通常包括在个性化医疗方法中)。
细胞类型和疾病
物种。本发明的细胞、癌症、类器官体和/或共培养物或适合与本发明方法一起使用的细胞、癌症、类器官体和/或共培养物可以主要是任何多细胞生物体，优选对癌症易感的多细胞生物体。在一些实施方案中，本发明的细胞、癌症、类器官和/或共培养物是哺乳动物(意指来源于哺乳动物)，诸如鼠科动物细胞、灵长类动物细胞或人细胞、癌症、类器官和/或共培养物。在优选的实施方案中，本发明的细胞、癌症、类器官和/或共培养物是人的(意味来源于人)。
上皮细胞。本发明的类器官和/或类器官共培养物获自上皮细胞。类器官和/或类器官共培养物可获自正常(即非疾病)上皮细胞或获自疾病上皮细胞(有时具体被称为‘疾病类器官’或‘疾病共培养物’)。本发明的类肿瘤和/或类肿瘤共培养物获自肿瘤上皮细胞。可以从其产生类器官或类肿瘤的任何上皮细胞都适用于本发明。优选的肿瘤上皮细胞和/或正常上皮细胞包括肺细胞、肝细胞、乳腺细胞、皮肤细胞、肠细胞、隐窝细胞、直肠细胞、胰腺细胞、内分泌细胞、外分泌细胞、导管细胞、肾细胞、肾上腺细胞、甲状腺细胞、垂体细胞、甲状旁腺细胞、前列腺细胞、胃细胞、食管细胞、卵巢细胞、输卵管细胞或阴道细胞。特别优选的上皮细胞是肠细胞(例如结肠直肠细胞)。上皮细胞可以是上皮干细胞，优选为以Lgr5表达为特征的上皮干细胞。
在一些实施方案中，肿瘤上皮细胞和/或正常上皮细胞获自癌症患者的样品。在具体的实施方案中，肿瘤上皮细胞和正常上皮细胞获自来自同一癌症患者的样品，任选地来自同一样品。用于获得上皮细胞的合适样品包括组织活检物，如来自结肠直肠癌或卵巢癌患者的腹水；来自肾癌患者的尿液；或来自结肠直肠癌患者的切除结肠和/或直肠的组织活检物。
免疫细胞。可以掺入共培养物的任何免疫细胞都适合与本发明的方法一起使用。优选的免疫细胞包括选自以下的一种或多种细胞类型：上皮内淋巴细胞(IEL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、外周血单个核细胞(PBMC)、外周血淋巴细胞(PBL)、T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、B细胞、NK细胞、单核吞噬细胞、α/β受体T细胞和γ/δ受体T细胞。优选的免疫细胞还包括骨髓源性抑制细胞。
免疫细胞可以从本领域可获得的已建立的细胞系(例如从ATCC或类似的细胞系文库)获得。可替代地，可以从来自对象的不纯样品中纯化免疫细胞。存在从与来自肿瘤上皮细胞的同一患者获得免疫细胞以在共培养物中获得类肿瘤相关的优势，因为由此获得的共培养物是其细胞所来源的患者的最具代表性的(因此是最可靠的模型)。这在个性化医疗的背景下是特别有用的。
可以从中获得免疫细胞的不纯免疫样品可以包括类肿瘤样品、正常(非肿瘤)结肠组织和/或外周血。在一些实施方案中，免疫细胞获自来自癌症患者的样品。在一些实施方案中，免疫细胞获自外周血样品和/或组织活检物。例如，外周血淋巴细胞(PBL)和/或T细胞可以分别从外周血样品获得；或者肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和/或上皮内淋巴细胞(IEL)分别获自肿瘤或健康组织活检物。
适合用于本发明方法的免疫细胞可以是与类肿瘤和/或类器官同种异体的。在一些实施方案中，免疫细胞与类肿瘤和/或类器官是HLA匹配的，即，免疫细胞可以与类肿瘤和/或类器官所来源的患者抗原性相容(Shiina等人(2016)，通过基于PCR的下一代测序在人和非人物种中进行MHC基因分型，下一代测序-进展、应用和挑战(MHC Genotyping inHuman and Nonhuman Species by PCRbased Next-Generation Sequencing,NextGeneration Sequencing-Advances,Applications and Challenges)，Jerzy Kulski博士(编辑)，InTech,DOI:10.5772/61842)(Choo,Yonsei Med J.2007年2月28日；48(1):11-23)。
T细胞工程化。本发明的一个重要方面是使用工程化T细胞(如嵌合抗原受体(CAR)-T细胞)(Sadelain等人，Nature.2017年5月24日；545(7655):423-431)。本发明提供了可以被用于检测不同CAR-T细胞类型对不同肿瘤表型和肿瘤微环境的适宜性的方法和共培养物。与现有方法相比，本发明是简化CAR-T细胞选择和性能增强过程的有利手段，具有改善的可扩展性和降低的成本。特别地，本发明非常适合与γδT细胞(对具有不同组织来源的广谱肿瘤具有强抗肿瘤反应性的非常规T细胞)一起使用(Sebestyen等人，CellRep.2016年5月31日；15(9):1973-85)。因此，在一些实施方案中，共培养物中的免疫细胞是工程化的T细胞(如CAR-T细胞)。
类器官和类肿瘤。可以通过在类器官培养基中培养正常上皮细胞来制备类器官。可以通过在类肿瘤培养基中培养肿瘤上皮细胞来制备类肿瘤。正常上皮细胞可以与肿瘤上皮细胞是自体同源的(即来自同一患者)。本发明的类器官/类肿瘤可以通过Lgr5表达来表征。在一些实施方案中，类器官/类肿瘤是三维细胞结构。在一些实施方案中，类器官/肿瘤包括被上皮细胞包围的管腔。在一些实施方案中，围绕管腔的上皮细胞被极化。在类肿瘤中极化可以被破坏。从中获得类器官/类肿瘤的上皮细胞优选是原代上皮细胞。
癌症类型。本发明的方法可应用于任何癌症。在一些实施方案中，癌症可以是以下中的一种或多种：腺瘤、腺瘤性息肉、肾癌、肾上腺腺瘤、甲状腺腺瘤、垂体腺瘤、甲状旁腺腺瘤、肝细胞腺瘤、纤维腺瘤、囊腺瘤、支气管腺瘤、皮脂腺腺瘤、前列腺腺瘤、腺癌、胆管癌、鳞状细胞癌、导管癌、小叶癌、癌、腺鳞状癌、间变性癌、大细胞癌、小细胞癌、梭形细胞癌、肉瘤样癌、多形性癌、癌肉瘤、基底细胞癌、血管活性肠肽瘤、革囊胃(linitis plastic)、腺样囊性癌、肾细胞癌、粘液表皮样癌、肠癌、小肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃肠癌、食管癌、直肠癌、阴道癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、小细胞肺癌、非小肺癌、乳腺癌和黑素瘤。
本发明的方法特别适用的癌症包括上皮癌，诸如胃肠癌或结肠直肠癌、胰腺癌和乳腺癌。
癌症期。本发明可应用于任何进展期的癌症。可以在几个系统中表征癌症进展。TNM(肿瘤、结节、转移)系统包括三个类别，每个类别被赋予数值程度。T是指癌症的大小以及其扩散到附近组织中的程度-它可以是1、2、3或4，其中1小且4大。N是指癌症是否已经扩散到淋巴结-它可以为0(没有含有癌细胞的淋巴结)至3(含有癌细胞的大量淋巴结)之间。M是指癌症是否已经扩散到身体的另一部分-它可以是0(癌症还没有扩散)或1(癌症已经扩散)。第二个系统是包括四期的数值分期系统。1期通常意味着癌症相对小并且包含在其开始的器官内。2期通常意指癌症还没有开始扩散到周围组织中，但是肿瘤大于1期中的肿瘤。有时2期意味着癌细胞已经扩散到靠近肿瘤的淋巴结中。这取决于特定类型的癌症。3期通常意味着癌症更大。它可能已经开始扩散到周围组织中，并且在该区域的淋巴结中存在癌细胞。4期意指癌症已经从它开始的地方扩散到另一个身体器官。这也被称为继发性或转移性癌症。分级系统是表征癌症进展程度的第三个系统。在I级中，癌细胞类似于正常细胞并且不快速生长。在II级中，癌细胞看起来不像正常细胞，并且生长比正常细胞快。在III级中，癌细胞看起来异常并且可能更积极地生长或扩散。
在本发明的方法中所测试的某些试剂(如免疫疗法)在癌症(如结肠直肠癌)的后期(转移的)更相关，因为当不存在转移时，常常手术切除就足够了。因此，本发明可应用于处于或低于III期、III级或T2 N1 M1之一的癌症。
对于不易手术切除的其它癌症，免疫疗法也可以在早期相关。此外，本发明在肿瘤进展类器官(TPO)上的使用还使得能够研究在较容易期的癌症的治疗。因此，本发明可应用于处于或低于II期、II级或T2N1 M0之一的癌症。
免疫疾病。除了癌症之外，还可以使用本发明的方法研究免疫细胞的疾病。原则上，可以在共培养中研究影响免疫细胞的免疫系统的任何病症。优选的免疫疾病包括消化和呼吸系统的免疫疾病，尤其是肠和肺。示例性的免疫疾病包括肠易激疾病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。
当使用本发明的方法测试免疫病症时，可以将类器官与来自健康对照患者的患病免疫细胞和免疫细胞分开培养。
活组织检查和样品来源。可以在手术期间从正常的粘膜和肿瘤组织中获得类器官样品和/或类肿瘤样品，例如从结肠直肠癌患者和/或健康对照患者的切除结肠、直肠、小肠和/或回肠中获取。免疫细胞可以来源于手术期间采集的外周血。
类器官、类肿瘤和共培养物
类肿瘤共培养制剂。一方面，本发明提供了制备类肿瘤免疫细胞共培养物的方法。该方法包括在体外培养中将如本文所述的类肿瘤与免疫细胞混合的步骤。混合可以包括在多孔板中将T细胞和类器官顺序分层到相同的孔中，或者可以包括将T细胞和类器官顺序移液到凝胶中。在优选的实施方案中，类肿瘤共培养物保持在如本文中所述的共培养培养基中。
在一些实施方案中，用于制备类肿瘤免疫细胞共培养物的方法还包括以下制备步骤中的一个或多个：
通过在类肿瘤培养基中培养肿瘤上皮细胞来制备所述至少一种类肿瘤；和/或
通过在免疫细胞扩增培养基中培养免疫细胞来制备免疫细胞。
在优选的实施方案中，在将至少一种类肿瘤与免疫细胞混合之前，从至少一种类肿瘤中去除类肿瘤培养基(任选地包括任何细胞外基质)。细胞外基质可以使用市售的试剂盒(如细胞回收溶液TM(Cell Recovery SolutionTM，Corning))来破坏。可替代的基质(如胶原蛋白)可以被用来代替去除的基质。
在一些实施方案中，所述方法还包括从不纯的免疫样品获得免疫细胞的步骤。从不纯的免疫样品中分离免疫细胞的方法是本领域已知的。在实施例5中描述了从单细胞悬浮液和T细胞扩增培养物中分离淋巴细胞的示例性方法。
本发明提供了通过上述方法获得的肿瘤免疫细胞共培养物。本发明还提供了所述类肿瘤免疫细胞共培养物在药物筛选、毒理学筛选、研究和试剂开发中的用途。
类肿瘤共培养物可以是异位、离体和/或体外的。它优选为体外的。
类器官共培养制剂。一方面，本发明提供了制备类器官免疫细胞共培养物的方法。该方法包括在体外培养中将如本文所述的类器官与免疫细胞混合的步骤。在优选的实施方案中，将类器官共培养物保持在如本文中所述的共培养培养基中。
在一些实施方案中，用于制备所述类器官免疫细胞共培养物的方法包括以下步骤中的一个或多个：
通过在类器官培养基中培养正常上皮细胞来制备所述至少一种类器官；和/或
在免疫细胞扩增培养基中培养免疫细胞。
在优选的实施方案中，在将至少一种类器官与免疫细胞混合之前，将类器官培养基(任选地包括任何细胞外基质，如基底膜基质‘BME’或基质胶)从至少一种类器官中去除。细胞外基质可以使用市售试剂盒(如细胞回收溶液TM(Corning))来破坏。可替代地基质(如胶原蛋白)，可以被用来代替去除的基质。
在一些实施方案中，所述方法还包括从不纯的免疫样品获得免疫细胞的步骤。从不纯的免疫样品中分离免疫细胞的方法是本领域已知的。在实施例5中描述了从单细胞悬浮液和T细胞扩增培养物中分离淋巴细胞的示例性方法。
本发明还提供了通过上述方法获得的类器官免疫细胞共培养物。本发明还提供了所述类器官免疫细胞共培养物在药物筛选、毒理学筛选、研究和药物开发中的应用。
类器官共培养物可以是异位、离体和/或体外的。它优选为在体外。
初步分析。在一些实施方案中，本发明的方法还包括一个或多个初步分析步骤。类肿瘤和/或类器官的初步分析可以包括全基因组测序、mRNA测序、多肽组图谱和/或显微镜检查。初部分析可以被用于以信息发现和/或信息验证的形式确保类肿瘤和/或类器官是均匀的和/或满足预期。例如，初级分析可以被用于测定类器官和类肿瘤之间的mRNA转录差异，以及mRNA转录的这些差异是否反映在蛋白质表达的差异中。还可以确认类器官/类肿瘤上的特异性抗原的存在，以及是否任何新的抗原仅在类肿瘤上产生。还可以研究肿瘤细胞在肿瘤微环境中的免疫抑制因子的上调。
免疫细胞可以进行一个或多个初步分析步骤。例如，免疫细胞的初步分析可以包括免疫表型分型和/或T细胞受体测序。初步分析可以被用于检查CAR-T细胞表达识别肿瘤细胞所必需的受体。还可以研究识别肿瘤的特异性受体的上调。
在具体的实施方案中，本发明的方法包括确定细胞、类器官或类肿瘤的HLA型的步骤。
还可以对共培养物进行一步或多步初步分析。类肿瘤共培养物和/或类器官共培养物的初步分析可以包括成像分析、流式细胞术分析和/或细胞因子分泌分析。初步分析可以被用于确保共培养物是均一的和/或符合预期。
类肿瘤和类器官的来源。本发明的类肿瘤和/或类器官可以包含自体细胞(即从同一患者获得的细胞)或由自体细胞(即从同一患者获得的细胞)组成。例如，可以通过培养肿瘤细胞(例如结肠直肠癌细胞)来获得类肿瘤，而可以通过培养来自同一患者的相同组织的正常(非肿瘤)细胞(例如正常结肠细胞)来获得类器官。这在参考类器官的情况下特别有用。
本发明还提供了在包含白介素(如IL-2、IL-7或IL-15)的培养基中的类肿瘤和/或类器官。在一些实施方案中，所述至少一种类肿瘤或至少一种类器官包含哺乳动物细胞(优选人细胞)或由哺乳动物细胞(优选人细胞)组成。
类肿瘤和类器官的分离。在一些实施方案中，在与免疫细胞混合之前，将类肿瘤和/或类器官分离成共享一种或多种基因型、表型和/或表观遗传标志物的群体。优选地，基因型、表型和/或表观遗传标志物有助于(i)类肿瘤和/或类器官与(ii)免疫细胞之间的相互作用。
从类肿瘤或类器官分离的群体可以共享HLA单倍型的存在或不存在，例如HLA单倍型如HLA-A2。
该分离步骤可以允许确定相关的患者组和亚组。
培养基
免疫细胞培养基。免疫细胞培养基可以被用于制备用于共培养的免疫细胞，例如，通过促进免疫细胞的生长和分裂(扩增)和/或分化以产生适合于共培养的群体。
在优选的实施方案中，免疫细胞培养基包含白介素。在一些实施方案中，白介素选自IL-2、IL-7和IL-15。在优选的实施方案中，免疫细胞培养基中的白介素是IL-2。
在一些实施方案中，白介素的浓度为2000-6000IU/mL。免疫细胞培养基中IL-2的优选浓度为50μM。
免疫细胞培养基还可以包含RPMI培养基(例如RPMI 1640，Gibco)，任选地补充有青霉素/链霉素和/或hepes和/或glutaMAXTM和/或丙酮酸钠和/或血清(例如5％人AB血清，Sigma-Aldrich)。原则上，可以使用任何哺乳动物基础细胞培养基代替RPMI培养基，如DMEM/12。
类器官和类肿瘤培养基。类肿瘤培养基和类器官培养基可以被用于制备用于共培养的类器官和类肿瘤，例如，通过促进生长、分裂(扩增)、结构组织或其它发育以产生适合于共培养的类肿瘤和/或类器官。
用于不同组织的合适的类肿瘤培养基和类器官培养基是本领域已知的(例如Clevers，Cell.2016年6月16日；165(7):1586-1597)。优选的类器官/类肿瘤培养基包含Wnt激动剂(例如R-脊椎蛋白1-4中的任一种)、促有丝分裂生长因子(例如选自EGF、FGF、HGF和BDNF)和BMP抑制剂(例如头蛋白)(例如如WO2010/090513中所述的)。在一些实施方案中，类器官/类肿瘤培养基还包含TGF-β抑制剂(例如A83-01、Tocris)(例如如WO2012/168930中所述的)。TGF-β抑制剂的添加特别适合于人细胞的培养。TGF-β抑制剂优选抑制Alk4/5/7信号传导通路。
在一些实施方案中，某些培养基组分对于类肿瘤培养基是任选的，因为某些肿瘤细胞含有组成型激活或失活通路(如Wnt通路)的突变，因此去除了对设计用于调节那些通路的外源因子的需要。因此，例如，在一些实施方案中，类肿瘤培养基不包含Wnt激动剂。
特别适合于培养结肠类器官的优选的类器官培养基包含一种或多种(或优选地全部)基础培养基(如高级DMEM/F12培养基，Gibco),Wnt配体(如Wnt-3a)、Wnt激动剂(如R脊椎蛋白1-4中的任一种)、BMP抑制剂(如头蛋白)、EGF和TGF-β抑制剂(例如A83-01、Tocris)，并且任选地还包含以下中的一种或多种(或全部)：p38 MAPK抑制剂、胃泌素、烟酰胺、前列腺素E、N-乙酰半胱氨酸、B27和/或抗微生物剂(例如原代细胞抗生素(primocin))。
特别适合用于培养结肠癌类肿瘤的优选类肿瘤培养基包含一种或多种(或优选地全部)：基础培养基(如高级DMEM/F12培养基，Gibco)、Wnt激动剂(如R脊椎蛋白1-4中的任一种)、BMP抑制剂(如头蛋白)、EGF和TGF-β抑制剂(如A83-01、Tocris)，并且任选地还包含以下中的一种或多种(或全部)：p38MAPK抑制剂、胃泌素、烟酰胺、前列腺素E、N-乙酰半胱氨酸、B27和/或抗微生物剂(例如原代细胞抗生素)。类肿瘤培养基可以任选地包含Wnt配体(例如Wnt-3a)，其对于对免疫疗法最敏感的结肠直肠肿瘤(例如通常缺少Wnt通路突变的MSI肿瘤)是特别有用的。
在一些实施方案中，在免疫细胞扩增培养基或免疫细胞扩增培养基与优选的类肿瘤或类器官培养基的混合物中培养类肿瘤或类器官。
本领域技术人员知道特异性针对其它类型的类器官和类肿瘤的培养基，并且可以相应地将本发明用于其它类器官和类肿瘤。
共培养培养基。本发明提供了用于共培养类肿瘤和免疫细胞的培养基(例如如实施例中所述的)。本发明还提供了用于共培养类器官和免疫细胞的培养基(例如如实施例中所述的)。上述免疫细胞培养基或类肿瘤/类器官培养基中的任一种可以被用作共培养培养基以培养免疫细胞-类器官/类肿瘤共培养物。
本发明的共培养培养基有利地允许免疫细胞和类器官/类肿瘤的共培养。在类肿瘤的情况下，此类共培养在不使用本发明的共培养培养基中采用的培养基适应方法的情况下是困难的或甚至是不可能的。本发明的发明人首次观察到用于在类肿瘤和免疫细胞之间共培养的培养基受益于减少的Wnt成分(相对于类器官培养基)，以保持免疫细胞功能。这可以通过在100％免疫细胞培养基中进行共培养，或者在免疫细胞培养基和类器官/类肿瘤培养基之间的混合物中进行共培养来实现。相同的培养基可以被用于类器官和免疫细胞的共培养，尽管减少的Wnt成分对于类器官共培养不是那么有益。
因此，在一些实施方案中，共培养培养基包含部分免疫细胞培养基(例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)和部分类器官/类肿瘤细胞培养基(例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)。例如，在优选的实施方案中，共培养培养基包含约50％免疫细胞培养基和约50％类肿瘤/类器官培养基。在一些实施方案中，在用于免疫细胞培养基和类器官/类肿瘤培养基之间的混合物中之前，将类肿瘤培养基中的Wnt成分耗尽。
在一些实施方案中，免疫细胞培养基(如T细胞培养基，例如RPMI1640(Gibco))被用于共培养培养基。这种培养基对于支持免疫细胞(特别是对于人免疫细胞)在共培养中的维持是特别有用的。在一些实施方案中，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的共培养培养基由免疫细胞培养基组成。
细胞外基质。细胞优选地在至少部分模拟所述细胞天然存在于其中的细胞生态位的微环境中培养。细胞生态位部分地由细胞和由所述生态位中细胞所分泌的细胞外基质(ECM)决定。通过在提供与细胞膜蛋白(如整联蛋白)相互作用的生物材料或合成材料存在下培养所述细胞，可以模仿细胞生态位。因此，如本文中所述的细胞外基质是例如通过与细胞膜蛋白(如整联蛋白)相互作用的模拟体内细胞生态位的任何生物材料或合成材料或它们的组合。可以使用任何合适的细胞外基质。
在本发明的优选方法中，细胞与ECM接触培养。“接触”意指物理的或机械的或化学的接触，这意味着为了从所述细胞外基质中分离所述得到的类器官或上皮细胞群，需要使用力。在一些实施方案中，ECM是三维基质。在一些实施方案中，细胞被包埋在ECM中。在一些实施方案中，细胞附着于ECM。本发明的培养基可以扩散到三维ECM中。
在另一个实施方案中，ECM处于悬浮状态，即细胞在悬浮系统中与ECM接触。在一些实施方案中，ECM在悬浮液中的浓度为至少1％、至少2％或至少3％。在一些实施方案中，ECM在悬浮液中的浓度为1％至约10％或1％至约5％。悬浮方法可以具有放大(upscale)方法的优点。
一种类型的ECM由上皮细胞、内皮细胞、腔壁内胚层样细胞(例如在Hayashi等人(2004)Matrix Biology 23：4762中所描述的Englebreth Holm Swarm腔壁内胚层样细胞)和结缔组织细胞分泌。这种ECM包括多种多糖、水、弹性蛋白和糖蛋白，其中糖蛋白包括胶原蛋白、巢蛋白(entactin/nidogen)、纤连蛋白和层粘连蛋白。因此，在一些实施方案中，用于本发明方法的ECM包含选自以下列表的成分中的一种或多种：多糖、弹性蛋白和糖蛋白，例如其中糖蛋白包括胶原蛋白、巢蛋白(entactin/nidogen)、纤连蛋白和/或层粘连蛋白。例如，在一些实施方案中，胶原蛋白被用作ECM。不同类型的ECM是已知的，包括含有不同类型的糖蛋白和/或不同的糖蛋白组合的不同组合物。
可商购的细胞外基质的实例包括：细胞外基质蛋白(Invitrogen)和来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的基底膜制剂(例如
Figure BDA0002626202480000291
基底膜提取物(Trevigen公司)或MatrigelTM(BD Biosciences))。
在一些实施方案中，ECM是含层粘连蛋白的ECM(如MatrigelTM(BDBiosciences))。在一些实施方案中，ECM是MatrigelTM(BD Biosciences)，其包含层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原蛋白。在一些实施方案中，ECM包含层粘连蛋白、巢蛋白、IV型胶原蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖(例如
Figure BDA0002626202480000293
2型基底膜提取物(Trevigen公司))。在一些实施方案中，ECM包含至少一种糖蛋白(如胶原蛋白和/或层粘连蛋白)。如果期望，可以使用天然产生的或合成的ECM材料的混合物。在一些实施方案中，ECM是BME(‘基底膜提取物’)，其是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肿瘤纯化的基底膜的可溶性形式(例如
Figure BDA0002626202480000292
BME)。
在另一个实施方案中，ECM可以是合成ECM。例如，可以使用合成的ECM(如ProNectin(Sigma Z378666))。在另一个实例中，ECM可以是塑料(如聚酯)或水凝胶。在一些实施方案中，可以用生物材料(例如一种或多种糖蛋白，如胶原蛋白或层粘连蛋白)包被合成基质。
三维ECM支持三维上皮类器官的培养。细胞外基质材料将通常是细胞悬浮于其中的培养皿底部的液滴。通常，当基质在37℃固化时，添加培养基并扩散到ECM中。培养基中的细胞通过与其表面结构的相互作用(例如与整联蛋白的相互作用)粘附到ECM上。
可以将培养基和/或细胞置于ECM上，包埋在ECM中或与ECM混合。
用于培养类肿瘤/类器官的优选ECM包括BME和基质胶(Matrigel)。
用于培养共培养物的优选ECM是胶原蛋白(如大鼠尾I型胶原蛋白)。大鼠尾I型胶原蛋白已经显示在共培养期间改善免疫细胞运动性-参见实施例11。胶原蛋白可以构成共培养物的至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％(v/v)。
白介素。共培养培养基可以包含白介素(IL)，任选地其中包含白介素或IL-2(浓度为100-200IU/mL)、IL-7(浓度为10-100ng/mL)和IL-15(浓度为10-100ng/mL)中的一种或多种。在共培养培养基中使用的优选的白介素浓度是25μM。这些用于共培养的浓度与用于扩增的IL浓度相反，用于扩增的IL浓度更高(例如IL-2以2000-6000IU/mL的浓度用于免疫细胞扩增)。
IL-2是用于肿瘤相关免疫细胞的优选白介素。对于其它免疫细胞或疾病(如肠易激并发症状(IBD)或溃疡性结肠炎(UC))，IL-7和/或IL-15是优选的(Rabinowitz等人，Gastroenterology，2013年3月；144(3):601-612.e1)。
在一些实施方案中，类肿瘤共培养培养基和/或类器官共培养培养基包含(a)免疫细胞扩增培养基和(b)类肿瘤培养基或类器官培养基的混合物，任选地其中培养基以50:50(v/v)的比例存在。
运动性和蛋白质浓度。在一些实施方案中，共培养和/或共培养培养基有利地赋予免疫细胞改善的运动性。如上所述的，此类共培养物和/或共培养培养基可以包含细胞外基质(ECM)。细胞外基质可以是基质胶或BME。在优选的实施方案中，细胞外基质是胶原蛋白或大鼠尾I型胶原蛋白。
本发明的发明人显示，使用胶原蛋白(特别是大鼠尾I型胶原蛋白)观察到运动的最大改善。具体地，基于BME的培养基中的免疫细胞(例如T细胞)显示43.635μm的平均轨迹长度，而基于大鼠尾I型胶原蛋白的培养基中的免疫细胞(例如T细胞)显示135.08μm的平均轨迹长度。这是运动性的3倍增加。共培养培养基可以包含至少0.15mg/(ml
Figure BDA0002626202480000311
)至0.95mg/(ml
Figure BDA0002626202480000312
)的蛋白质浓度，用于包含2％至10％的
Figure BDA0002626202480000313
的培养基。
在一些实施方案中，如使用图3和实施例10的测定所确定的，共培养物中至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的免疫细胞能够在80小时内移动至少200μM、至少250μM、至少300μM、至少350μM或至少400μM的距离。
持久性和活性持续时间。在一些实施方案中，本发明的培养基允许免疫细胞在免疫细胞扩增培养基中存留至少4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时、216小时或240小时。
在一些实施方案中，本发明的培养基允许免疫细胞在共培养形成后(即在免疫细胞与类器官/类肿瘤细胞混合的点后)保持活性至少4小时、8小时、12小时、24小时、48小时或72小时。
在一些实施方案中，本发明的培养基允许类肿瘤共培养物存留于类肿瘤共培养培养基中，或者参考类器官共培养物或参考类肿瘤共培养物存留于类器官共培养培养基中至少4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时、216小时或240小时。在一些实施方案中，共培养物可以10天或更长，或与共培养可以不经传代而保持在培养物中一样多的天数。
免疫细胞的活性可以根据细胞形态来检测(例如，圆形的缺失和细胞突起的存在表明细胞仍保持活性)。
免责声明。在一些实施方案中，IL-2未被用于要求保护的本发明的任何培养基中。
本发明的其它方法和产品
试剂盒。本发明提供了包含本发明的任何类器官、类肿瘤或共培养物的试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含以下中的一种或多种：注射器、酒精拭子、棉球、纱布垫、用于实施本发明方法的说明书。
实施例
本发明的其它特征、目的和优点在随后的实施例中是显而易见的。然而，应该理解的是，在指示本发明的实施方案的同时，这些实施例仅以说明的方式给出，而不是限制。在本发明范围内的各种变化和修改对于本领域的技术人员而言将从实施例变得显而易见。使用类肿瘤体作为疾病类器官例证本发明，但是预期其它疾病类器官，特别是与免疫疾病相关的疾病类器官可以以相同的方式使用。因此，在本公开涉及“类肿瘤”的情况下，其旨在可以用“疾病类器官”(如“免疫疾病类器官”)代替。
在实施例中使用以下培养基：
人结肠类器官培养基。
补充有50％WNT3A条件培养基(内部)、20％R-脊椎蛋白1条件培养基(内部)、10％头蛋白条件培养基(内部)、1×B27补充剂(GibcoTM)、1.25mM N-乙酰基半胱氨酸(Sigma-Aldrich)、10mM烟酰胺(Sigma-Aldrich)、50ng/mL人表皮生长因子(EGF；Peprotech)、10nM胃泌素(Sigma-Aldrich)、500nM TGF-β抑制剂A-83-01(Tocris)、3μM p38MAPK抑制剂SB202190(Sigma-Aldrich)、10nM前列腺素E2(Tocris)和100mg/mL原代细胞抗生素(Invivogen)的完全高级DMEM/F12培养基。
人结肠直肠癌类肿瘤培养基。
补充有20％R-脊椎蛋白1条件培养基、10％头蛋白条件培养基、1×B27补充剂(无维生素A)(GibcoTM)、1.25mM N-乙酰半胱氨酸、10mM烟酰胺、50ng/mL人EGF、10nM胃泌素、500nM TGF-β抑制剂A-83-01、3μM p38MAPK抑制剂SB202190、10nM前列腺素E2和100mg/mL原代细胞抗生素的完全的高级DMEM/F12培养基。
人T细胞培养基。
补充有青霉素/链霉素、5％AB血清(Sigma-Aldrich)的RPMI1640(GibcoTM)。
Ijssel培养基。
补充有青霉素/链霉素、1％人AB血清(Sigma-Aldrich)、牛血清白蛋白、胰岛素、油酸、亚油酸、转铁蛋白和乙醇胺(均为Sigma-Aldrich)的IMDM。
在以下实施例中，类器官共培养物和类肿瘤共培养物的产生和表征在实施例1-9中进行说明。在实施例10-15中举例说明了这些方法和共培养物本身的应用。
实施例1.收集来自医院的正常结肠和结肠直肠癌活组织检查物。
该实施例显示了细胞样品的分离，其在随后的实施例中被用于制备类器官、类肿瘤和免疫细胞样品。
正常结肠粘膜和肿瘤组织的活组织检查物取自结肠直肠癌患者的切除结肠和/或直肠。在手术期间也取了外周血。
具体地，将来自人结肠直肠癌组织以及正常(成人)人结肠粘膜上皮的活组织检查物组织收集在含有冰冷的10-15mL高级DMEM/F12培养基的50mL标准管中，所述培养基完全具有青霉素/链霉素(来自10,000U/mL青霉素和10KμM/mL链霉素的100×储备液)、HEPES(来自1M的100×储备液)、GlutaMAX(来自100×储备液；均为GibcoTM)和Rho激酶抑制剂Y-27632(Sigma-Aldrich)。将活组织检查物保存在冰上并立即处理，或者可以在4℃下储存长达24h，直到分离开始。
在图1A中示意性地示出了该过程。
实施例2.从正常结肠组织中分离隐窝和衍生正常结肠类器官；从正常结肠组织中分离上皮内T细胞用于T细胞培养。
该实施例显示了正常结肠样品的处理，用于类器官培养物的发育，以及用于从正常结肠样品中分离免疫细胞。
用EDTA处理正常结肠粘膜以释放用于衍生正常结肠类器官的隐窝，然后进一步消化以制备含有用于T细胞培养的上皮内淋巴细胞(IEL)的单细胞悬浮液。
从正常结肠组织中分离隐窝和衍生正常结肠类器官。
使用手术剪和镊子在解剖显微镜下去除肌肉层和脂肪。将清洁的组织切成大约1-2mm的细条。将一个条固定在4％甲醛(Sigma-Aldrich)中用于组织学分析，并且将一个条快速冷冻(在干冰或液氮中)并且储存在-80℃下用于基因和/或蛋白质分析。将剩余的条用新鲜的螯合溶液(5.6mM Na2HPO4、8.0mM KH2PO4、96.2mM NaCl、1.6mM KCl、43.4mM蔗糖和54.9mM D-山梨糖醇溶解在无菌水中；均来自Sigma-Aldrich)洗涤3次。将洗涤后的条在完全具有2mM乙二胺四乙酸(EDTA；内部)和0.5mM DL-二硫苏糖醇(DTT；Sigma-Aldrich)的螯合溶液中于4℃在旋转轮(冷室)中孵育30分钟。剧烈摇动管以将结肠隐窝从间质中释放出来。如果未见到隐窝，则用新鲜的完全螯合溶液重复温育。允许组织碎片沉降1-2分钟，并将含有隐窝的上清液转移到新管中。加入5-10mL胎牛血清(FCS；Sigma-Aldrich)，并在4℃下以300×g离心所述隐窝5分钟。将剩余的组织碎片保持在冰上用于分离上皮内T细胞。在完全的高级DMEM/F12中洗涤隐窝3次。将隐窝重悬于基底膜提取物(BME；
Figure BDA0002626202480000341
)，并将其以不同的密度铺板并置于37℃和5％CO2的湿润培养箱中30分钟。在BME固化后，加入补充有Rho激酶抑制剂Y-27632的人结肠类器官培养基并每3-4天替换。每隔7-10天传代从隐窝形成的类器官。
随后，使用全基因组测序、mRNA测序和多肽组图谱对类器官培养物进行初步分析。
从正常结肠组织中分离上皮内T细胞用于T细胞培养。
将从结肠隐窝分离保存的组织碎片置于陪替氏培养皿中，并使用镊子、剪刀和解剖刀切成非常细的片(<1mm)。将组织碎片转移到50mL标准管中并在20mL RPMI 1640培养基(GibcoTM)中洗涤3次，所述培养基完全具有10％FCS和青霉素/链霉素以去除任何剩余的EDTA和抑制。在组织片沉降到烧杯底部后，用移液管去除培养基。然后将组织片在含有1mg/mL胶原蛋白酶1A、10U/mL脱氧核糖核酸酶I(均为Sigma-Aldrich)和Rho激酶抑制剂Y-27632的10mL RPMI 1640培养基中于37℃下孵育1小时，同时振荡。将2mL FCS加入到细胞悬浮液中，并将整个悬浮液通过100μm细胞过滤器过滤。将单细胞悬浮液在4℃以300×g离心5分钟。去除上清液，并将细胞沉淀在完全RPMI 1640培养基中洗涤两次。将单细胞悬浮液在冷冻培养基(RecoveryTM细胞培养物冷冻培养基或以1∶1混合的FCS和高级DMEM/F12的10％DMSO，均为GibcoTM)中于液氮中冷冻保存或进一步处理用于T细胞培养。
实施例3.消化结肠直肠癌组织以进行肿瘤类器官细胞和T细胞培养；衍生结肠直肠癌类肿瘤。
该实施例显示了癌性结肠样品的处理，用于类肿瘤培养物的发育，以及从癌性结肠样品中分离免疫细胞。
消化肿瘤组织以制备含有上皮肿瘤细胞的单细胞悬浮液，用于衍生类肿瘤以及用于T细胞培养的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
用于肿瘤和T细胞培养的结肠直肠癌组织的消化。
将肿瘤活组织检查物切成大约1-2mm的细条。将一个条固定在4％甲醛中用于组织学分析，并且将每一条带快速冷冻(在干冰或液氮中)并且储存在-80℃下用于基因和/或蛋白质分析。使用镊子进一步切割剩余的条直至肿瘤块看起来粘稠。将肿瘤块在含有1mg/mLII型胶原蛋白酶、10μg/mL透明质酸酶和Rho激酶抑制剂Y-27632的10mL完全的高级DMEM/F12培养基中于37℃孵育1小时，同时振荡。孵育后，将2mL FCS添加到浆液肿瘤块中，并将细胞悬浮液通过100μm细胞过滤器过滤，并在4℃以300×g离心5分钟。去除上清液，并将细胞沉淀在完全的高级DMEM/F12培养基中洗涤两次。将单细胞悬浮液在在冷冻培养基(GibcoTMRecoveryTM细胞培养冷冻培养基或以1∶1混合的FCS和高级DMEM/F12的10％DMSO)中于液氮中冷冻保存，或者进一步处理以衍生结肠直肠癌类肿瘤和T细胞培养物。
衍生结肠直肠癌类肿瘤。
将一部分肿瘤单细胞悬浮液重悬于BME中，并以不同稀释度铺板。在37℃和5％CO2的湿润培养箱中使BME固化30分钟。将包埋在BME中的细胞在补充有Rho激酶抑制剂Y-27632的人结肠直肠癌类肿瘤培养基中培养。每3-4天更新培养基。每7-10天传代由单个肿瘤细胞形成的类器官。
实施例4.类器官和类肿瘤的分析。
进行明场光学显微镜用于分析，并证实成功的类器官和类肿瘤样品的单细胞悬浮液。图1B中显示了来源于患者样品的正常结肠类器官和类肿瘤的代表性明场图像。
如上所述的，将结肠隐窝包埋到正常结肠类器官培养基(基底膜提取物(BME))中，并用含有R-脊椎蛋白1、头蛋白、Wnt3A条件培养基、不含维生素A的B27补充剂、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、EGF、TGF-β抑制剂A-83-01、胃泌素、p38MAPK抑制剂SB202190和前列腺素E2的培养基培养。正常结肠类器官在1周内发育，然后每周传代(上图)。
将来自结肠直肠癌样品的单细胞悬浮液包埋到基底膜提取物(BME)中并用含有类肿瘤培养基(R-脊椎蛋白1、头蛋白条件培养基、不含维生素A的B27补充剂、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、EGF、TGF-β抑制剂A-83-01、胃泌素、p38MAPK抑制剂SB202190和前列腺素E2)的培养基培养。类肿瘤在1周内形成，然后每周传代(下图)。
如在图1B的每一个图中所见的，实现了良好分解的类器官、类肿瘤和免疫细胞的单细胞悬浮液。
实施例5.从单细胞悬液和T细胞扩增培养物中分离淋巴细胞。
该实施例显示免疫细胞的进一步处理，随后产生免疫细胞扩增培养物。
将5mL纯的Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)加入到15mL标准管中。将从正常结肠或结肠直肠癌组织的消化物中获得的单细胞悬浮液重悬于5mL完全RPMI 1640培养基中并小心地置于透明Ficoll-Paque PLUS层之上。样品在室温下以800×g离心20分钟。收集来自含有T细胞的透明Ficoll-Paque PLUS层上方的层的细胞，重悬于10mL完全RPMI 1640培养基中，并以300×g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于完全RPMI 1640培养基中并计数。将单细胞悬浮液在冷冻培养基(GibcoTM RecoveryTM细胞培养冷冻培养基或以1∶1混合的FCS和高级DMEM/F12的10％DMSO)中于液氮中冷冻保存，或立即用于扩增培养。对于T细胞扩增培养物，在37℃和5％CO2的湿润培养箱中，在1mL RPMI 1640培养基中，以1×106个总活细胞的浓度，在抗CD28(Miltenyi)包被的细胞培养塑料上培养淋巴细胞，所述RPMI 1640培养基完全具有青霉素/链霉素、5％人AB血清和6000IU重组人IL-2(Miltenyi)。在1周后更新培养基。
另外或可替代地，处理外周血以纯化富含外周血淋巴细胞(PBL)和T细胞的外周血单个核细胞。
通过T细胞受体(TCR)测序和T细胞的免疫表型分析进行初级分析(比较图1C和下面的实施例6)。)。
实施例6.分离的免疫细胞的分析。
图1C显示来源于患者样品(左图)的上皮内淋巴细胞(IEL)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的克隆生长的代表性明场图像。
流式细胞术分析显示CD4+辅助性T细胞(Th)和CD8+细胞毒性T细胞(CTL)的稳健扩增。将来自正常结肠粘膜或结肠直肠癌组织的单细胞悬浮液维持在含有白介素-2(IL-2)的T细胞培养基中。T细胞的克隆生长在1-2周内是显著的(左图)。
因此，分离的免疫细胞的分析揭示免疫细胞保持功能和生物学上的代表性。
实施例7.上皮器官和类肿瘤的传代。
该实施例证明了类器官和类肿瘤培养物的维持。
通过使用1mL体积的微量移液管(即P1000Gilson)在生长培养基上上下吸移BME滴液，破碎了(‘分离’)类器官培养物。将破碎的类器官以500×g离心5分钟。将沉淀的类器官重悬浮于TrypLE(GibcoTM)中并在水浴中于37℃下孵育5-15分钟。使用预湿的火焰抛光的玻璃巴斯德移液管将类器官分离成单个细胞。在过量的完全的高级DMEM/F12中吸取分离的类器官，并以500×g离心5分钟。将上皮单细胞以期望的密度重新铺板在BME中并置于37℃和5％CO2的潮湿湿润培养箱中。在BME固化后，添加补充有Rho激酶抑制剂Y-27632的相应培养基(人结肠类器官培养基或人结肠直肠癌类肿瘤培养基)。每3-4天更新培养基。每7-10天传代由单个肿瘤细胞形成的类器官。
通过存在于正常结肠上皮和肿瘤上皮的单细胞悬浮液中的细胞的单细胞信使RNA(mRNA)测序进行初步分析。
实施例8.类器官共培养物和类肿瘤共培养物的产生。
该实施例证明来自实施例5的类器官和类肿瘤与来自实施例4的免疫细胞培养物的共培养。
在分离后(如上述实施例7)，将5000个细胞铺板在BME中，并在人结肠培养基或人结肠直肠癌类肿瘤培养基中培养3-4天。培养后，去除培养基，在冰上孵育25分钟后，使用细胞回收溶液TM(Cell Recovery SolutionTM，Corning)破碎BME/
Figure BDA0002626202480000381
液滴。随后在与T细胞混合之前，将细胞离心(以500×g离心5分钟)并重悬于补充有100IU/mL重组人IL-2的T细胞培养基中。
计数T细胞，并在补充有100IU/mL重组人IL-2的完全T细胞培养基中达到100000细胞/mL的浓度。将100μL上皮癌类肿瘤悬浮液与100μL T细胞悬浮液在96孔板中混合。将22μL大鼠尾胶原蛋白(GibcoTM)溶解于混合物中以达到在悬浮液中10％的胶原蛋白浓度。将细胞在37℃和5％CO2下静置30分钟，以使细胞和胶原蛋白在分析之前沉降。
在图2中显示了正常结肠类器官和同种异体CD3+T细胞在基底膜提取物(BME)液滴中的原理验证共培养。
图2A显示了该程序的示意图。如上所述的，使用细胞回收溶液从BME滴中释放正常结肠类器官，并在完全的高级DMEM/F12中洗涤。从培养物中收获扩增的CD3+T细胞并用绿色染料(Vybrant CFDA SE细胞示踪剂)标记。将结肠类器官和标记的T细胞混合在人结肠类器官培养基中并包埋在BME液滴中。将共培养物在含有IL-2的人结肠类器官培养基中维持60h。使用细胞回收溶液从BME中释放共培养物并固定在4％多聚甲醛中。将固定的整个封装物用鬼笔环肽染色以标记聚合的肌动蛋白并用DAPI标记细胞核。在ProLong Gold抗淬灭封片剂中将整个封装物封装到载玻片上，并在Leica SP8X共焦显微镜上成像。
在图2B中显示了结肠类器官共培养物的z堆栈图像的最大投影。以深灰色标记类器官中的F-肌动蛋白，而以浅灰色标记T细胞。右图中的插入图显示了浸润结肠上皮的T细胞。
在图2C中显示了正常结肠类器官细和T细胞的三维重建。
如图中所示的，类器官显示了预期的结构组织水平，并与免疫细胞相互作用，与体内系统具有显著的相似性。
实施例9.通过成像、流式细胞术和细胞因子分泌分析共培养物。
该实施例分析实施例6中产生的类器官共培养物和类肿瘤共培养物，以研究共培养物成分相互作用的机制。
成像分析。
成像分析被用于测定共培养物中死亡细胞的百分比。
培养前，用细胞示踪染料(例如CFSE，分子探针TM(Molecular ProbesTM))标记T细胞。用直接缀合的小鼠抗人EPCAM(BD Bioscience)抗体或细胞示踪染料(与用于T细胞标记额染料不同)标记类器官。使用共聚焦激光扫描显微镜(例如Leica SP8X；或任何类型的活细胞成像延时荧光显微镜)在用于标记凋亡细胞的染料(NucRed DeadTM,MolecularProbes)存在下，在37℃和5％CO2下将细胞成像过夜(12-18小时)。随后，使用Imaris软件(Bitplane)分析时间推移图像，并通过评估EPCAM的共定位体素的百分比来计算死亡的类器官的百分比，并可以可视化死细胞标志物。
流式细胞仪分析
流式细胞仪分析被用于评估共培养物中存在的免疫细胞上存在的表面标志物。
在分离后(如上述实施例7中)，将5000个细胞在BME中铺板，并在人结肠培养基或人结肠直肠癌类肿瘤培养基中培养3、4天。培养后，去除培养基，在冰上孵育25分钟后，使用细胞回收溶液TM(Corning)破碎BME/
Figure BDA0002626202480000401
液滴。随后在与T细胞混合之前，将细胞离心(以500×g离心5分钟)并重悬于补充有100IU/mL重组人IL-2的T细胞培养基中。
计数T细胞，并在补充有100IU/mL重组人IL-2的完全T细胞培养基中使其浓度达到500000/mL。将100μL上皮癌类肿瘤悬浮液与100μL T细胞悬浮液在96孔板中混合。将细胞共培养过夜，收获细胞，并使用TripLE(GibcoTM)制备单细胞悬浮液。用4％多聚甲醛(Sigma-Aldrich)固定单细胞悬浮液并使用含有0.5％皂苷的缓冲液(BD Bioscience)透化。可替代地，使用市售试剂盒(例如BD Cytofix/Cytoperm Plus固定/透化试剂盒，BD Bioscience)。随后将细胞与抗CD3、EPCAM、干扰素(IFN)γ和/或肿瘤坏死因子(TNF)α的流式细胞术抗体以及识别活性半胱天冬酶-3的抗体(均为BD Bioscience)一起孵育，然后进行流式细胞术分析。
细胞因子分泌分析。
如上所述分离、铺板、培养和制备用于共培养的类器官。计数T细胞，并在补充有100IU/mL重组人IL-2的完全T细胞培养基中使其浓度达到500000/mL。将100μL上皮癌类肿瘤悬浮液与100μL T细胞悬浮液在96孔板中混合。培养开始后72h，收获上清液，用于通过ELISA评估T细胞细胞因子产生(例如IFNγ、TNFα)。将培养物上清液储存在-20℃下直至分析。
实施例10.当用大鼠尾I型胶原蛋白进行共培养时，类肿瘤共培养物的活体成像显示T细胞的运动性增加。
该实施例测试了用于发育共培养物的不同结构成分对产生的免疫细胞的运动性的影响。
图3A中显示了该程序的示意图。如上所述的，使用细胞回收溶液从BME液滴中释放类肿瘤，并在完全的高级DMEM/F12中洗涤。将从外周血样品中分离的同种异体CD8+T细胞用绿色染料(Vybrant CFDA SE细胞示踪剂)标记。
将类肿瘤和T细胞与含有IL-2和10％BME或大鼠尾I型胶原蛋白的人结肠类器官培养基混合，并在配备有活体成像室的Leica SP8X共聚焦显微镜上在37℃和5％CO2环境下活体成像80h。
图3B显示了类肿瘤共培养物的代表性复合图像。将明场通道和绿色荧光通道合并以产生复合图像。使用Imaris软件追踪T细胞行进路径。
如图3C所示的，在两种条件下T细胞的轨迹长度的定量显示，与在10％BME中相比，在10％胶原蛋白中共培养的T细胞的显著更长的轨迹路径。结果表明，在共培养中使用大鼠尾I型胶原蛋白可以开发更多的体内样系统，这产生更长的轨迹并因此保持免疫细胞的运动性。
实施例11：克隆性类肿瘤共培养物的产生。
该实施例举例说明了产生人白细胞抗原(HLA)A2型阳性和阴性的克隆性类肿瘤。
图4A中显示了该程序的示意图。使用TrypLE酶消化将类肿瘤分离成单细胞。单细胞用抗HLA-A2抗体染色并基于抗HLA-A2免疫反应性纯化。将HLA-A2+ve和HLA-A2-ve肿瘤细胞包埋并维持以产生类肿瘤。
图4B中的流式细胞术分析显示建立了纯的HLA-A2+ve或HLA-A2-ve类肿瘤系。对照是HLA-A2+ve JY细胞系以及与HLA-A2+ve或HLA-A2-ve类肿瘤系来源于同一患者样品的正常结肠类器官系。
实施例12.细胞毒性T细胞介导的抗原特异性杀伤上皮癌类肿瘤的试验。
该实施例涉及在类肿瘤共培养物上进行‘细胞杀伤试验’。这是本发明方法应用于经历过新抗原的αβT细胞以治疗癌症的实例。
如上所述的，将结肠直肠癌类肿瘤或正常组织类器官分离并保持为单细胞。在刺激αCD28抗体存在下，在人T细胞培养基和200IU/mL重组人IL-2中，将10000-50000个T细胞(TIL或PBMC衍生的)与50000个类肿瘤/类器官衍生的单细胞共培养2周。每2-3天更新培养基。随后在补充有200IU/mL重组人IL-2的完全Ijssel培养基中，在辅射的饲养细胞(1×106个/mL，来自3个不同供体的PBMC和1×105个/mL JY和/或LAZ509细胞的混合物)存在下克隆性扩增扩增的细胞。可替代地，将T细胞直接从TIL或IEL单细胞制备物中进行FACS分选到含有完全Ijssel培养基中的板中(1×106个/mL，来自3个不同供体的PBMC和1×105个/mL JY和/或LAZ509细胞的混合物)。然后如上所述的，扩增的克隆随后与新抗原脉冲的肿瘤类器官共培养。
如下将经鉴定的推定的肿瘤新抗原加载到上皮癌类器官上。通过在板中重新悬浮培养基来破碎其中培养了类器官的BME/
Figure BDA0002626202480000421
液滴。将相关的肽加入到类器官中，并将类器官在37℃和5％CO2下培养2h。然后将克隆性扩增的T细胞与自体类器官共培养，用于如上所述的成像、流式细胞术分析和/或细胞因子分泌分析。
在图5中显示了用于经历过抗原的T细胞的抗肿瘤活性的杀伤试验，并且在图5A中显示了该程序的示意图。用HLA-A2限制性Wilms肿瘤(WT)1肽脉冲HLA-A2+ve或HLA-A2-ve类肿瘤2h。然后将携带有WT1肽特异性TCR的TCR转基因CD8+T细胞与用WT1肽脉冲的HLA-A2+ve或HLA-A2-ve类肿瘤共培养48h。
图5B中显示了48h后共培养物的代表性明场图像。仅用WT1肽脉冲的HLA-A2+ve类肿瘤明显死亡。所有其它情况(即未用WT1肽脉冲的HLA-A2+ve或HLA-A2-ve类肿瘤和用WT1肽脉冲的HLA-A2-ve类肿瘤)显示正常生长。
结果表明新抗原WT1肽在用HLA-A2+ve表型杀死类肿瘤(和可能在治疗癌症中)方面是有效的，但对于其它表型则不是有效的。
实施例13.用于具有和不具有检查点抑制的经历过抗原的T细胞的抗类肿瘤活性的细胞存活力测定。
图6显示了用于具有和不具有检查点抑制的经历过抗原的αβT细胞的抗类肿瘤活性的细胞存活力测定。这是本发明方法应用于治疗癌症的化学试剂的实例。
图6A中显示了该程序的示意图。如图5A中所述的进行共培养，但仅培养12h，并与和不与抗PD1检查点抑制剂一起孵育。使用CellTiter Glo发光细胞存活力测定试剂盒(Promega)根据制造商的说明书进行细胞存活力测定。
图5B显示了相对于无肽对照将类肿瘤的细胞存活力归一化。因此，当存在HLA-A2、IL-2和抗PD1检查点抑制剂的组合时，共培养物被成功地用于显示类肿瘤的细胞存活力最低，即当应用于显示IL-2和HLA-A2癌症类型的患者亚群时，抗PD1检查点抑制剂治疗可能是最有效的。
实施例14.通过类器官/类肿瘤共培养物确定对T细胞激活的差异作用的测定。
该实施例说明γδT细胞的存在以抗原非特异性方式激活共培养物中的类肿瘤，其中其在共培养中不激活超过无T细胞基线的类器官。IFN-γ被用于测定活化。
在图7A中显示了该程序的示意图。使用分散酶从
Figure BDA0002626202480000431
液滴中释放类肿瘤，并随后通过70μm和20μm的过滤器。从20μm的过滤器中回收类器官、计数并铺板。将类肿瘤和T细胞与含有RPMI、IL-2和5％
Figure BDA0002626202480000432
的人结肠类器官培养基混合，并在37℃和5％CO2环境中孵育。孵育24h后，使用明场倒置显微镜对类器官成像。
类肿瘤共培养物和类器官共培养物的代表性明场图像(分别)显示在图7B和图7C中。
在图7D中显示了共培养物的IFN-γ水平定量。
实施例15.用于评估关联性和细胞杀伤能力的类肿瘤共培养物的活体成像。
研究T细胞的细胞杀伤能力，以及其随不同T细胞亚型和不同T细胞/肿瘤抗原组合的变化。
在图8A中显示了了该程序的示意图。使用分散酶从
Figure BDA0002626202480000441
液滴中释放类肿瘤，并随后通过70μm和20μm的过滤器。从20μm的过滤器中回收类器官、计数并铺板。用远红外染(CellVue深紫红色)标记培养的T细胞。将类肿瘤和T细胞与含有RPMI、IL-2和5％
Figure BDA0002626202480000442
的人结肠类器官培养基混合，并在配备有活体成像室的Leica SP8X共聚焦显微镜上于37℃和5％CO2的环境下进行活体成像68h。
在图8B中显示了含有非靶向T细胞的类肿瘤共培养物的代表性复合图像。将明场通道和远红外荧光通道合并以生成复合图像。
在图8C中显示了含有靶向T细胞的类肿瘤共培养物的代表性复合图像。将明场通道和远红外荧光通道合并以生成复合图像。
实施例16.使用上皮类器官培养物模拟癌症免疫调节。
在这里，我们利用类器官技术来研究免疫-癌症相互作用并评估结肠直肠癌(CRC)的免疫调节。转录谱和流式细胞术揭示，类器官维持存在于原发性肿瘤中的免疫调节分子的差异表达。最后，我们建立了使用与细胞毒性T细胞(CTL)共培养的CRC类器官体外模拟抗原特异性上皮细胞杀伤和癌症免疫调节的方法。
CRC是全世界最常见的癌症之一。尽管早期CRC是通过外科手术切除高度可治疗的，但是后期通常是不能治愈的。CRC通过来自大肠上皮的小病变的多步骤过程产生。这些病变生长成具有低级别发育不良的腺瘤，其发展成高级别发育不良，最终引起浸润性癌。在信号传导通路(如经典的Wnt信号传导通路)中的遗传突变是CRC4的分子基础。然而，肿瘤与其微环境的相互作用是另一个关键标志。癌细胞重塑其微环境(例如成纤维细胞、脉管系统和免疫细胞)以支持肿瘤生长。浸润免疫细胞(IC)(如CTL或巨噬细胞)通过产生不同的免疫应答(如抗肿瘤细胞毒性(前者)或促进肿瘤的慢性炎症(后者))而发挥关键作用。因此，从监视免疫系统中逃逸已被认为是癌症的标志之一。癌细胞例如通过防止由刺激抑制性细胞表面受体(如CTL相关抗原(CTLA)-4或程序性死亡(PD)1)的T细胞激活而经历被称为免疫编辑和沉默的抗肿瘤应答的过程。克服肿瘤细胞的这种主动免疫调节已经成为主要的治疗靶标。然而，肿瘤异质性(如不同的CTL浸润或免疫抑制因子的不同表达)可能通过介导耐药性而影响抗肿瘤药物的治功效率。因此，开发表征肿瘤与其环境的通信的离体模型系统是非常重要的。从不同上皮组织生长的类器官培养物用作研究组织体内稳态和疾病的绝佳工具。此外，已经建立了多种上皮器官系统的类器官生物样本库，并且已经成功地将肿瘤衍生的类器官用作筛选不同药物以预测患者应答的平台。这里我们描述了使用与免疫细胞共培养的类肿瘤(具体地，与CTL共培养的CRC类器官)在体外模拟抗原特异性上皮细胞杀伤和癌症免疫调节的方法的建立。
我们首先评估CRC类器官在已建立的长期扩增培养物中是否表达免疫调节分子。为此，我们使用用我们的CRC患者的‘活的类器官生物样本库’产生的转录组数据集，将CRC类器官体中T细胞特异性免疫调节剂的基因表达与正常结肠类器官中发现的表达水平进行比较(van de Wetering,M.等人，Prospective derivation of a living organoidbiobank of colorectal cancer patients.Cell 161,933-945,doi:10.1016/j.cell.2015.03.053(2015))。平均地，与正常结肠器官相比，与T细胞刺激相关的基因(如TNFSF4或TNFSF9)的转录在CRC类器官中没有改变(图9A)。然而，人白细胞抗原(HLA)基因HLA-A和HLA-C(其编码将抗原呈递给T细胞的主要组织相容性复合体(MHC)-I类分子)的表达在CRC类器官细胞中被显著下调(图9A)，在癌症中发现的充分描述的现象)。与抑制T细胞功能相关的基因的表达是显著上调的(如BTLA)，显著下调的(如CD80、CD86或LGALS9)，或者根本不改变(如CD274(编码PD-L1)、PDCD1LG2(编码PD-L2))(图9A)。当评估免疫调节分子在各类器官上的表达水平时，CRC类器官主要聚集在一起，这显示了与健康结肠类器官相比，HLA-A、HLA-C和LGALS9的异质性下调(图9B)。然而，免疫抑制基因CD274和PDCD1LG2的表达，例如，与匹配的正常结肠类器官培养物相比，在一些CRC类器官中被高度上调，这反映了先前报道的类器官中肿瘤异质性的保留(图9B)。这些分子特征为进一步研究肿瘤免疫原性及其与肿瘤其它特征的关联性提供了基础。
CRC中最常见的突变基因中的四个是APC、P53、KRAS和SMAD4，这反映了正常肠上皮向转移性癌的逐步进展。使用成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)/Cas9将这些癌症突变引入人肠类器官培养物中证明了可以在体外并在异种移植到小鼠中后模仿该过程。使用携带这些癌症突变中的一种或多种的结肠类器官，我们研究了PD-L1的上调是否与某种突变状态相关。另外，我们将突变的类器官及其野生型对照类器官系暴露于干扰素(IFN)-γ，所述干扰素(IFN)-γ由T细胞分泌并且可以触发免疫调节分子(如PD-L1)的增加的表达。随后，我们通过定量聚合酶链式反应(qPCR)和流式细胞术评估PD-L1表达(图9C-D)。在没有IFN-γ的情况下，与对照野生型类器官相比，携带三重突变(APCKO/KO、P53KO/KO、KRASG12D/+)和四重突变(APCKO/KO、P53KO/KO、KRASG12D/+和SMAD4KO/KO)的类器官显示较低的CD274基因表达(图9C)。总的来说，PD-L1在未处理的类器官细胞系中的表达低(图9C-D)。然而，在IFN-γ处理的类器官细胞中PD-L1的表达在转录物和蛋白质水平上显著上调(图9C-D)。这些数据证明CRC类器官细胞表达免疫调节剂，并且该表达以与先前对于体内组织所显示的类似方式被调节。
我们接下来旨在建立CRC类器官和CTL的共培养系统，以体外模拟肿瘤细胞的抗原特异性杀伤。为此，我们使用携带转基因T细胞受体(TCR)的αβT细胞，所述转基因T细胞受体识别HLA-A2限制性Wilms肿瘤(WT)1衍生肽。我们首先使用流式细胞术从‘活体生物样本库’中筛选出CRC类器官以及新产生的CRC类器官用于HLA-A2表达。我们发现了三种显示HLA-A2部分下调的CRC类器官系(图4B)。我们能够纯化HLA-A2+和HLA-A2-CRC类器官并成功地从两个群体中建立培养物(图11B)。我们证实了HLA-A2-CRC类器官中稳定的MHC-I的下调，因为IFN-γ刺激不触发HLA-A2再表达(图10B)。接下来，我们用WT1肽脉冲这些CRC类器官系，随后与肽特异性T细胞共培养48小时。共培养后，我们发现无论是否用肽脉冲，HLA-A2-CRC类器官都能存活(图11C)。然而，只有HLA-A2+CRC类器官在没有预先的肽孵育的情况下在共培养中存活(图11C)。肽脉冲的HLA-A2+CRC类器官被肽特异性T细胞有效地杀死，从而提供了类器官可以被用于体外研究细胞毒性T细胞的抗肿瘤应答的原理验证。为了进一步证实我们的‘杀伤’测定系统中的抗原特异性，我们改进了我们的共培养方法，通过用表达mNeonGreen标记的组蛋白H2B的构建体转染HLA-A2+CRC类器官并用CellTracker紫染色T细胞以允许两种细胞类型的长期追踪(方法，下文)。然后我们用WT1肽或EBV衍生的肽脉冲HLA-A2+CRC类器官(方法)，并将该类器官与携带WT1特异性TCR或EBV特异性TCR的T细胞共培养。这里，只有用同源肽脉冲的类器官被T细胞有效地杀死(图11D)。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)在共培养中测试T细胞的IFN-γ产生，证实了T细胞对抗原特异性类器官的杀伤(图11E)。为了更好地遵循类器官杀伤的动力学，我们应用荧光染料(NucRed Dead 647；方法)，其特异性染色凋亡细胞，并在共培养物上进行活体共聚焦成像(图11F)。然后，我们通过评估NucRed Dead染料与H2B-mNeonGreen的共定位来定量类器官杀伤(方法)。只有当肽脉冲的HLA-A2+CRC类器官与相应的肽特异性T细胞共培养时，才观察到两种标记物的显著共定位，并因此观察到类器官的杀伤(图11G)。此外，在这种共培养条件下，可以容易地检测到浸润到类器官上皮中的T细胞(图11H)。最后，我们研究了使用这种共培养系统是否可以模拟对免疫抑制性肿瘤的免疫应答的调节。实际上，添加针对PD-1(αPD-1)的封闭性抗体增强了在表达PD-L1的IFN-γ刺激的类器官中的肿瘤杀伤和IFN-γ的产生(图11I-J)。当类器官未被IFN-γ刺激且因此不表达PD-1时，未观察到这种情况。总之，T细胞以抗原特异性方式有效地杀死共培养的CRC类器官。此外，可以模拟T细胞抑制和随后使用αPD-1的这种抑制的缓解。在这里，我们已经证明上皮类器官可以用来忠实地概括肿瘤组织和免疫系统之间的相互作用。此外，使用我们的共培养测定，我们设置了在体外重建肿瘤微环境中的第一步。进一步添加这种微环境的其它成分(如成纤维细胞、自然杀伤细胞、骨髓源性抑制细胞、B细胞)可以阐明导致肿瘤免疫逃逸的不同细胞类型之间的复杂相互作用。最后，这种共培养系统可以被用作药物筛选的工具，所述药物筛选测试某些免疫疗法对不同肿瘤和不同患者的适用性，所述免疫疗法为例如嵌合抗原受体(CAR)或TCR转基因T细胞、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)诱导针对肿瘤的抗体。
方法
人类材料和知情同意书
结肠组织(正常结肠和肿瘤组织)获自荷兰乌特勒支的Diakonessenhuis医院的外科和病理科部门(the Departments of Surgery and Pathology of theDiakonessenhuis hospital)。本研究中包括的所有患者均被诊断患有CRC。知情同意书由所有被纳入的患者签署。组织的收集被Diakonessenhuis医院的医学伦理委员会(themedical ethical committee，METC)批准，符合赫尔辛基声明，并根据荷兰和欧盟的立法。
类器官生成与培养物
上皮类器官系来源于健康结肠或肿瘤组织(van de Wetering,M.等人，Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancerpatients.Cell 161,933-945,doi:10.1016/j.cell.2015.03.053(2015))。简言之，通过在补充有二硫苏糖醇(0.5mM,Sigma)和EDTA(2mM，内部)的螯合溶液(5.6mM Na2HPO4、8.0mMKH2PO4、96.2mM NaCl、1.6mM KCl、43.4mM蔗糖和54.9mM D-山梨糖醇，Sigma)中消化结肠粘膜在4℃下持续30分钟来分离健康结肠隐窝。随后将结肠隐窝铺板在基底膜提取物(BME；2型Cultrex PC BME RGF，Amsbio)，并使类器官在人肠干细胞培养基(HISC)中生长，所述人肠干细胞培养基(HISC)由补充有青霉素/链霉素、10mM HEPES和Glutamax(均为Gibco,Thermo Fisher Scientific)、50％Wnt3a条件培养基(内部)、20％R-脊椎蛋白1条件培养基(内部)、10％头蛋白条件培养基(内部)、1×B27、1.25mM N-乙酰基半胱氨酸、10mM烟酰胺、50ng/mL人EGF、10nM胃泌素、500nM A83-01、3μM SB202190、10nM前列腺素E2和100μg/mL原代细胞抗生素(Invivogen)的高级杜尔贝科改良的伊格尔培养基/F12组成。在37℃下，在振荡的同时，在补充有透明质酸酶(10μg/mL)和LY27632(10μM)的II型胶原蛋白酶(1mg/mL，Gibco，Thermo Scientific)中，将肿瘤样品消化成单细胞30分钟。将单个肿瘤细胞铺板在BME中，并且在37℃下在无HICS的Wnt条件培养基并且补充有10μM LY27632的条件培养基中培养类器官。当我们提及培养基的“内部”成分时，商业可替代品对于本领域技术人员是容易获得的(例如Wnt激动剂(ATCC CRL 2647TM)、R-脊椎蛋白(R&D,#3500-RS/CF)、头蛋白(Peprotech,#120-10C)、EDTA(Thermo fisher,#AM9260G))并且技术人员将理解，这些将实现相同或等同的效果。
类肿瘤转染
使用TrypLE将类肿瘤(具体地，CRC类器官)分离成小块，然后用H2B-mNeonGreen(pLV-H2B-mNeonGreen-ires-Puro)转导。
T细胞
产生携带识别HLA-A2限制性WT1衍生的肽的转基因TCR的αβT细胞描述于Kuball,J.等人，Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introducedinto human T cells.Blood 109,2331-2338,doi:10.1182/blood-2006-05-023069(2007)中。简言之，从升高的四聚体阳性T细胞克隆中克隆TCRα链和β链。随后，使用来自Phoenix-Ampho包装细胞的逆转录病毒上清液转导CD8+αβTCR T细胞，所述Phoenix-Ampho包装细胞用含有克隆性TCR基因的gag-pol、env和pBullet逆转录病毒构建体转染。
类肿瘤T细胞共培养和活细胞成像
在共培养前5至7天分离和消化用H2B-mNeonGreen稳定转染的类肿瘤，并以每10μLBME 5000个细胞的密度接种(在12孔细胞培养板中每孔25,000个细胞)。在共培养前两天，使T细胞匮乏IL-2。在共培养前一天，用指定浓度的IFN-γ刺激类肿瘤。
在共培养之前，根据制造商的说明书，用细胞扩增染料eFluor 450(CellProliferation Dye eFluor 450，eBioscience)对T细胞进行染色。在共培养之前，在37℃下用TCR特异性肽(ProImmune)脉冲类肿瘤2小时。收获类肿瘤和T细胞并置于补充有10％BME、100IU/mL IL-2和NucRed Dead 647(Thermo Fischer)的T细胞培养基中。在指示的情况下，将抗PD1封闭性抗体(2μg/mL)添加到共培养物中。将细胞铺在玻璃底96孔板中，并使用SP8X共聚焦显微镜(Leica)对共培养物进行成像。
流式细胞术
针对EBV衍生的HLA-2:02限制性肽FLYALALLL(ProImmune)的APCR标记的五聚体，被用于从分离自健康个体的血块黄层的PBMC中分选五聚体+CD8+CD3+T细胞。使用BD FACSAria(BD Biosciences细胞仪将细胞作为单细胞分选到96孔板中。对于流式细胞术，使用以下抗体(均为抗人的)：CD8-PE(克隆RPA-T8)、CD45-PerCP-Cy5.5(2D1)、CD274(PD-L1)-APC(MIH1)(均为BD Biosciences)、CD279(PD-1)-PE(EH12.2H7，Biolegend)、HLA-A2-PE(BB7.2，Santa Cruz)。
定量聚合酶链式反应(qPCR)
对于qPCR分析，使用RNAeasy试剂盒(QIAGEN)根据制造商的方案从类器官/类肿瘤物中分离RNA。使用SYBR Green试剂(Biorad)进行PCR分析。用每种引物的标准曲线一式两份进行PCR反应。使用NCBI引物设计工具设计引物。用于本研究的引物：GAPDH正向(GTC GGAGTC AAC GGA TT)，GAPDH反向(AAG CTT CCC GTT CTC AG)，HPRT正向(GGC GTC GTG ATTAGT GAT),HPRT反向(AGG GCT ACA ATG TGA TGG)，CD274正向(TGC AGG GCA TTC CAG AAAGAT)，CD274反向(CCG TGA CAG TAA ATG CGT TCAG)。
转录图谱分析
进行生物样本库类器官的微阵列分析描述于van de Wetering,M.等人，Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancerpatients.Cell 161,933-945,doi:10.1016/j.cell.2015.03.053(2015)。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
将培养物上清液保持在-20℃，并根据制造商的方案使用ELISA MA标准物(Biolegend)对所指示的细胞因子进行ELISA。
细胞存活力测定
根据制造商的方案，使用CellTiter-Glo发光细胞存活力测定(Promega)评估共培养后的细胞存活力。
图像分析
使用Imaris软件包(Bitplane)进行图像分析。简言之，在阴性对照上设定阳性染色的阈值。为H2B-neon和NucRed Dead 647信号建立共定位通道。将细胞死亡定量为H2B-mNeonGreen+体素与NucRed Dead信号共定位的百分比。
生物信息学分析
使用R 3.4.0版(RFoundation,https://www.r-project.org)和RStudio1.0.143版(https://www.rstudio.com)中的标准包(即gplots)执行来自微阵列实验的归一化基因表达数据的生物信息学分析(van de Wetering,M.等人，Prospective derivation of aliving organoid biobank of colorectal cancer patients.Cell 161,933-945,doi:10.1016/j.cell.2015.03.053(2015)。
统计学分析
除非另有说明，否则所有实验重复至少三次。所有数据显示为平均值±SEM。使用Graphpad Prism 6或Microsoft Excel 2010通过方差分析或双尾学生t检验分析统计学显著性。

Claims (78)

1.用于鉴定适合于治疗癌症的试剂的方法，其中所述方法包括：
使类肿瘤共培养物与一种或多种候选试剂接触，其中所述类肿瘤共培养物包含免疫细胞和至少一种类肿瘤，
检测类肿瘤共培养物中是否存在指示候选试剂适合于治疗所述癌症的一种或多种变化，和
如果检测到所述类肿瘤共培养物中一种或多种所述变化的存在或不存在，则将候选试剂鉴定为适合于治疗所述癌症。
2.如权利要求1所述的方法，其中治疗所述癌症的适宜性包括治疗所述癌症的功效和/或治疗所述癌症的安全性。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种变化是一种或多种癌症生物标志物的变化。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种变化选自：细胞存活力的降低、细胞增殖的减少、细胞死亡的增加、细胞或类器官大小的变化、细胞运动性的变化、共培养免疫细胞的细胞因子和细胞毒性分子的产生的变化、完整/致密上皮细胞层的解离或破坏和一种或多种基因表达的变化。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测包括细胞增殖测定、存活力测定、流式细胞术分析、IFN-γ的ELISA、基因表达分析和/或细胞成像。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种变化是细胞存活力的降低，例如如通过CellTiter Glo发光细胞存活力测定试剂盒(Promega)、活性半胱天冬酶3的细胞内流式细胞术染色(BD)或死亡细胞的阳性染色检测的。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种变化是细胞死亡的增加，例如如通过明场成像检测的。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法之前是以下步骤中的一个或多个：
通过在类肿瘤培养基中培养肿瘤上皮细胞来制备所述至少一种类肿瘤；
从不纯的免疫样品中分离免疫细胞并在免疫细胞扩增培养基中培养所述免疫细胞，来制备所述免疫细胞；和/或
制备所述类肿瘤共培养物，优选地通过从至少一种类肿瘤中去除类肿瘤培养基，并使所述至少一种类肿瘤与所述免疫细胞在类肿瘤共培养培养基中混合来制备所述类肿瘤共培养物。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述类肿瘤共培养物的所述一种或多种变化的存在或不存在与参考类器官或参考类肿瘤进行比较，并且其中所述方法还包括：
使参考类器官共培养物或参考类肿瘤共培养物与所述一种或多种候选试剂接触，其中所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物包含免疫细胞和至少一种类器官或类肿瘤，和
检测所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物中是否存在指示候选试剂适合于治疗所述癌症的一种或多种变化。
10.如权利要求9所述的方法，其中如果在所述类肿瘤共培养物中检测到变化的存在或不存在，而在所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物中未检测到变化的存在或不存在，则候选试剂被鉴定为合适的试剂。
11.如权利要求9-10中任一项所述的方法，其中在所述方法之前是以下步骤中的一个或多个：
通过在类器官培养基中培养正常上皮细胞来制备所述至少一种类器官；
从不纯的免疫样品中分离免疫细胞并在免疫细胞扩增培养基中培养所述免疫细胞，来制备所述免疫细胞；和/或
制备所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物，优选地通过从至少一种类肿瘤或至少一种类器官中去除所述类肿瘤培养基类器官培养基，随后将至少一种参考类器官或至少一种参考类器官与所述免疫细胞在类器官共培养培养基或类肿瘤共培养培养基中混合来制备所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物，
任选地，其中所述不纯的免疫样品是肿瘤样品、正常结肠组织和/或外周血。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述正常上皮细胞与所述肿瘤上皮细胞是自体同源的。
13.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其中所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物被用作对照，优选地其中所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物被用作阴性对照。
14.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其中(i)所述类肿瘤共培养培养基和/或(ii)所述参考类器官共培养培养基或所述参考类肿瘤共培养培养基包含细胞外基质，优选地所述细胞外基质选自胶原蛋白或任何动物来源的或合成的基底膜基质。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述胶原蛋白是大鼠尾I型胶原蛋白。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述共培养物包含至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％的胶原蛋白，优选地其中所述共培养物包含约10％(v/v)的胶原蛋白。
17.如权利要求8-16中任一项所述的方法，其中对于2％至10％的
Figure FDA0002626202470000041
浓度，(i)所述类肿瘤共培养培养基和/或(ii)所述参考类器官共培养培养基或所述参考类肿瘤共培养培养基具有0.15mg/(ml
Figure FDA0002626202470000042
)至0.95mg/(ml
Figure FDA0002626202470000043
)的蛋白质浓度。
18.权利要求8、11或14-17中任一项所述的类肿瘤共培养培养基和/或类器官共培养培养基。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述类肿瘤共培养物和/或所述参考类器官共培养物和/或所述参考类肿瘤共培养物的免疫细胞具有至少40μm/天、60μm/天、80μm/天、100μm/天、120μm/天或140μm/天的运动性。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述类肿瘤共培养物和/或所述参考类器官共培养物和/或所述参考类肿瘤共培养物中至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的所述免疫细胞能够在80小时内移动至少200μm、至少250μm、至少300μm、至少350μm或至少400μm的距离。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞保持活性至少4h、8h、12h、24h、48h或72h。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种候选试剂具有已知的用于治疗所述癌症的适宜性，并且所述方法还包括将所述一种或多种候选试剂鉴定为用于治疗特定患者的癌症的合适试剂。
23.如权利要求9-22中任一项所述的方法，其中所述类肿瘤共培养物和所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物均来源于特定患者。
24.如权利要求22-23中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用经鉴定为适合于治疗所述特定患者的癌症的所述候选试剂治疗所述患者。
25.如前述权利要求中任一项所述所述的方法，其中所述一种或多种候选试剂选自以下治疗剂类别中的一种或多种：免疫治疗剂、肿瘤特异性肽、检查点抑制剂、烷化剂、抗代谢物、代谢激动剂、代谢拮抗剂、植物生物碱、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、放射治疗剂、化学治疗剂、抗体、光敏剂、干细胞移植物、疫苗、细胞毒性剂、细胞抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、细胞因子、干扰素、白介素、嵌入剂、靶向治疗剂、小分子药物、激素、类固醇、细胞治疗剂、病毒载体和核酸治疗剂。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种候选试剂选自以下治疗剂类别中的一种或多种：肿瘤特异性肽，检查点抑制剂、嵌合抗原受体(CAR)-T细胞治疗剂、治疗性TCR转基因T细胞和新抗原。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种候选试剂是免疫治疗剂。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述免疫治疗剂是嵌合抗原受体(CAR)-T细胞治疗剂、治疗性TCR转基因T细胞或新抗原。
29.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述一种或多种候选试剂具有未知的用于治疗癌症的适宜性，并且所述方法还包括将所述一种或多种候选试剂的子集鉴定为用于治疗癌症的合适试剂。
30.如权利要求1-21或29中任一项所述的方法，其中所述一种或多种候选试剂具有已知的用于治疗第一种癌症的适宜性和未知的用于治疗第二种癌症的适宜性，并且所述方法还包括将所述一种或多种候选试剂的子集鉴定为用于治疗所述第二种癌症的合适试剂。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是上皮癌。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是胃肠道癌。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症包括处于或低于II期、II级或T2N1M0之一的癌症。
35.如权利要求8-34中任一项所述的方法，其中所述肿瘤上皮细胞和/或所述正常上皮细胞获自来自癌症患者的样品。
36.如权利要求8-35中任一项所述的方法，其中所述肿瘤上皮细胞和所述正常上皮细胞获自同一癌症患者，任选地获自同一样品。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是组织活检物。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组织活检物取自结肠直肠癌患者的经切除的结肠和/或直肠、结肠直肠癌或卵巢癌患者的腹水和/或肾癌患者的尿液。
39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤上皮细胞和/或所述正常上皮细胞选自：肺细胞、肝细胞、乳腺细胞、皮肤细胞、肠细胞、隐窝细胞、直肠细胞、胰腺细胞、内分泌细胞、外分泌细胞、导管细胞、肾细胞、肾上腺细胞、甲状腺细胞、垂体细胞、甲状旁腺细胞、前列腺细胞、胃细胞、食管细胞、卵巢细胞、输卵管细胞或阴道细胞。
40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤上皮细胞和/或所述正常上皮细胞是肠细胞，例如结肠直肠细胞。
41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤上皮细胞和/或所述正常上皮细胞是上皮干细胞，优选为以Lgr5表达为特征的上皮干细胞。
42.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包含选自以下的一种或多种细胞类型：上皮内淋巴细胞(IEL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、外周血单个核细胞(PBMC)、外周血淋巴细胞(PBL)、T细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、αβT细胞、γδT细胞、B细胞、NK细胞和单核吞噬细胞。
43.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞获自来自癌症患者的样品。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞获自外周血样品和/或组织活检物。
45.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述外周血淋巴细胞(PBL)和/或T细胞获自所述外周血样品。
46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和/或上皮内淋巴细胞(IEL)分别获自肿瘤组织活检物或正常组织活检物。
47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞与所述肿瘤上皮细胞和/或所述正常上皮细胞获自同一患者。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞与所述类肿瘤和/或所述类器官是同种异体的，任选地其中所述免疫细胞与所述类肿瘤和/或类器官来源于不同患者或健康对照的外周血或组织活检物。
49.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞与所述类肿瘤和/或所述类器官是HLA匹配的。
50.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞在所述免疫细胞扩增培养基中存留至少4h、8h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h和240h。
51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种类肿瘤和/或所述至少一种类器官包含自体细胞或由自体细胞组成。
52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在与所述免疫细胞混合之前，将所述至少一种类肿瘤和/或所述至少一种类器官分离成共享一种或多种基因型、表型和/或表观遗传标志物的群体。
53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因型、表型和/或表观遗传标志物有助于(i)所述至少一种类肿瘤和/或至少一种类器官与(ii)所述免疫细胞之间的相互作用。
54.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述群体共享HLA单倍型的存在或不存在，任选地其中所述HLA单倍型是HLA-A2。
55.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种类肿瘤或所述至少一种类器官包含哺乳动物细胞或由哺乳动物细胞组成，优选地所述哺乳动物细胞为人细胞。
56.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述至少一种类肿瘤共培养物或所述至少一种类器官共培养物(分别)在免疫细胞扩增培养基中或在免疫细胞扩增培养基和类器官培养基或类肿瘤培养基的50:50(v/v)混合物中培养。
57.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述类肿瘤共培养物存留于所述类肿瘤共培养培养基中，或者其中所述参考类器官共培养物或所述参考类肿瘤共培养物存留于所述类器官共培养培养基中至少4h、8h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h和240h。
58.如前述权利要求中任一项所述的类肿瘤或类器官，其中所述类肿瘤或所述类器官在包含白介素的培养基中，任选地其中所述白介素选自IL-2、IL-7和IL-15。
59.根据前述权利要求中任一项所述的方法制备的类肿瘤群或类器官群。
60.前述权利要求中任一项所述的类肿瘤共培养物和/或参考类器官共培养物。
61.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述类器官培养基包含以下中的一种或多种(或优选地全部)：基础培养基(如高级DMEM/F12培养基，Gibco)、Wnt配体(如Wnt-3a)、Wnt激动剂(如R脊椎蛋白1-4中的任一种)、BMP抑制剂(如头蛋白)、EGF和TGF-β抑制剂(例如A83-01、Tocris)，并且任选地还包含以下中的一种或多种(或全部)：p38 MAPK抑制剂、胃泌素、烟酰胺、前列腺素E、N-乙酰半胱氨酸、B27和/或抗微生物剂(例如原代细胞抗生素)。
62.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述类肿瘤培养基包含以下中的一种或多种(或优选地全部)：基础培养基(如高级DMEM/F12培养基，Gibco)、Wnt激动剂(如R脊椎蛋白1-4中的任一种)、BMP抑制剂(如头蛋白)、EGF和TGF-β抑制剂(如A83-01、Tocris)，并且任选地还包含以下中的一种或多种(或全部)：p38MAPK抑制剂、胃泌素、烟酰胺、前列腺素E、N-乙酰半胱氨酸、B27和/或抗微生物剂(例如原代细胞抗生素)，任选地其中所述类肿瘤培养基还包含Wnt配体(例如Wnt-3a)。
63.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞扩增培养基包含IL-2，任选地IL-2的浓度为2000-6000IU/mL，并且任选地还包含IL-7和/或IL-15。
64.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞扩增培养基还包含RPMI培养基(例如RPMI 1640,Gibco)，任选地补充有青霉素/链霉素和/或血清(例如5％的人AB血清，Sigma-Aldrich)。
65.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述类肿瘤共培养培养基和/或所述类器官共培养培养基包含IL-2，任选地IL-2的浓度为100-200IU/mL。
66.测试CAR-T免疫疗法、TCR转基因T细胞、新抗原或检查点抑制剂用于治疗上皮癌时的功效和/或安全性的方法，所述方法包括：
任选地从同一患者提供肿瘤上皮细胞、正常上皮细胞和免疫细胞，
在类肿瘤培养基中扩增所述肿瘤上皮细胞以形成类肿瘤，并且在包含白介素的类肿瘤共培养培养基中培养所述类肿瘤与所述免疫细胞以形成类肿瘤共培养物，
在类器官类培养基中扩增所述正常上皮细胞以形成类器官，并且在包含白介素的类器官共培养培养基中培养所述类器官与所述免疫细胞以形成参考类器官共培养物，
使所述类肿瘤共培养物和所述参考类器官共培养物与所述CAR-T免疫疗法、TCR转基因T细胞、新抗原或检查点抑制剂接触，
检测所述类肿瘤共培养物和所述参考类器官共培养物中是否存在一种或多种变化，其中是否存在所述一种或多种变化指示所述CAR-T免疫疗法、TCR转基因T细胞、新抗原或检查点抑制剂的功效和/或安全性，和
比较所述类肿瘤共培养物与所述参考类器官共培养物。
67.测试候选化合物用于治疗上皮癌时的功效和/或安全性的方法，所述方法包括：
任选地从同一患者提供肿瘤上皮细胞、正常上皮细胞和免疫细胞，
在类肿瘤培养基中扩增所述肿瘤上皮细胞以形成类肿瘤，并且在包含白介素的类肿瘤共培养培养基中培养所述类肿瘤与所述免疫细胞以形成类肿瘤共培养物，
在类器官培养基中扩增所述正常上皮细胞以形成类器官，并且在包含白介素的类器官共培养培养基中培养所述类器官与所述免疫细胞以形成参考类器官共培养物，
使所述类肿瘤共培养物和所述参考类器官共培养物与所述候选化合物接触，
检测在所述类肿瘤共培养物和所述参考类器官共培养物中是否存在一种或多种变化，其中是否存在所述一种或多种变化指示所述候选化合物的功效和/或安全性，和
比较所述类肿瘤共培养物与所述参考类器官共培养物。
68.制备类器官免疫细胞共培养物的方法，其中所述方法包括：
任选地在类器官培养基中培养与细胞外基质接触的上皮细胞以获得类器官；
从所述类器官中去除所述细胞外基质和所述类器官培养基；
将所述类器官重悬在补充有白介素的免疫细胞培养基中；
制备免疫细胞悬浮液，所述免疫细胞悬浮液包含免疫细胞、补充有白介素的免疫细胞培养基和在所述悬浮液中浓度为至少5-10％的胶原蛋白；和
将包含免疫细胞的所述免疫细胞悬浮液与重悬的类器官混合。
69.制备类肿瘤免疫细胞共培养物的方法，其中所述方法包括：
任选地在类肿瘤培养基中培养与细胞外基质接触的肿瘤上皮细胞以获得类器官；
从所述类肿瘤中去除所述细胞外基质和所述类肿瘤培养基；
将所述类肿瘤重悬于补充有白介素的免疫细胞培养基中；
制备免疫细胞悬浮液，所述免疫细胞悬浮液包含免疫细胞、补充有白介素的免疫细胞培养基和在所述悬浮液中浓度为至少5-10％的胶原蛋白；和
将包含免疫细胞的所述免疫细胞悬浮液与重悬的类肿瘤混合。
70.如权利要求68或69所述的方法，其中所述胶原蛋白是大鼠尾胶原蛋白。
71.如权利要求68至70中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞培养基是RPMI1640(Gibco)。
72.如权利要求68至71中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
73.如权利要求68至72中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞和所述免疫细胞获自同一对象，任选地获自同一样品。
74.如权利要求68至72中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞和所述免疫细胞是人细胞。
75.通过权利要求68或70至74中任一项所述的方法获得的类器官免疫细胞共培养物。
76.通过权利要求69至74中任一项所述的方法获得的类肿瘤免疫细胞共培养物。
77.用于测试治疗剂的方法，其中所述方法包括：
使类器官共培养物与一种或多种候选试剂接触，其中所述类器官共培养物包含免疫细胞和至少一种类器官，
检测所述类器官共培养物中是否存在指示治疗功效的一种或多种变化，和
如果检测到在所述类器官共培养物中一种或多种所述变化的存在或不存在，则将候选试剂鉴定为治疗剂。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述治疗剂适合于治疗免疫疾病，任选地其中所述免疫疾病影响肺和/或肠的组织，例如其中所述免疫疾病选自：肠易激疾病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。
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