BR112020012565A2 - método para identificar um agente adequado para tratar um câncer, meio de cocultura de tumoroide e/ou meio de cocultura de organoide, tumoroide ou organoide, população de tumoroides ou organoides, cocultura de tumoroide e/ou cocultura de organoide de referência, métodos de testar uma imunoterapia e de testar um composto candidato, métodos para preparar uma cocultura de organoide-célula imune e para preparar uma cocultura de tumoroide-célula imune, cocultura de organoide-célula imune, cocultura de tumoroide-célula imune, e, método para testar um agente terapêutico - Google Patents

método para identificar um agente adequado para tratar um câncer, meio de cocultura de tumoroide e/ou meio de cocultura de organoide, tumoroide ou organoide, população de tumoroides ou organoides, cocultura de tumoroide e/ou cocultura de organoide de referência, métodos de testar uma imunoterapia e de testar um composto candidato, métodos para preparar uma cocultura de organoide-célula imune e para preparar uma cocultura de tumoroide-célula imune, cocultura de organoide-célula imune, cocultura de tumoroide-célula imune, e, método para testar um agente terapêutico Download PDF

Info

Publication number
BR112020012565A2
BR112020012565A2 BR112020012565-2A BR112020012565A BR112020012565A2 BR 112020012565 A2 BR112020012565 A2 BR 112020012565A2 BR 112020012565 A BR112020012565 A BR 112020012565A BR 112020012565 A2 BR112020012565 A2 BR 112020012565A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
cells
organoid
tumor
cell
coculture
Prior art date
Application number
BR112020012565-2A
Other languages
English (en)
Inventor
Kai KRETZSCHMAR
Jotam Elazar Bar-Ephraim
Johannes Carolus Clevers
Sylvia Fernandez-Boj
Robert Gerhardus Jacob VRIES
Original Assignee
Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen
Stichting Hubrecht Organoid Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen, Stichting Hubrecht Organoid Technology filed Critical Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen
Publication of BR112020012565A2 publication Critical patent/BR112020012565A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464452—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
    • A61K39/464453—Wilms tumor 1 [WT1]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V20/00—Scenes; Scene-specific elements
    • G06V20/60—Type of objects
    • G06V20/69—Microscopic objects, e.g. biological cells or cellular parts
    • G06V20/698—Matching; Classification
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/50—Colon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/04—Screening or testing on artificial tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Multimedia (AREA)

Abstract

A presente invenção provê coculturas de organoides e células imunes e métodos de usar essas para identificar agentes para tratar doenças.

Description

1 / 75
MÉTODO PARA IDENTIFICAR UM AGENTE ADEQUADO PARA TRATAR UM CÂNCER, MEIO DE COCULTURA DE TUMOROIDE E/OU MEIO DE COCULTURA DE ORGANOIDE, TUMOROIDE OU ORGANOIDE, POPULAÇÃO DE TUMOROIDES OU ORGANOIDES, COCULTURA DE TUMOROIDE E/OU COCULTURA DE ORGANOIDE DE REFERÊNCIA, MÉTODOS DE TESTAR UMA IMUNOTERAPIA E DE TESTAR UM COMPOSTO CANDIDATO, MÉTODOS PARA PREPARAR UMA COCULTURA DE ORGANOIDE-CÉLULA IMUNE E PARA PREPARAR UMA COCULTURA DE TUMOROIDE-CÉLULA IMUNE, COCULTURA DE ORGANOIDE-CÉLULA IMUNE, COCULTURA DE TUMOROIDE-CÉLULA IMUNE, E, MÉTODO PARA TESTAR UM AGENTE TERAPÊUTICO
[001] Todos os documentos citados são aqui incorporados por referência em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO
[002] A presente invenção refere-se a coculturas de organoides e o seu uso na investigação de doenças.
FUNDAMENTOS
[003] A pesquisa clínica dentro da fisiologia de doenças subjacentes, tais como câncer e doenças imunes, permanece um alicerce do progresso médico, embora sistemas in vitro para realizar tais investigações permaneçam básicos. Igualmente, regimes modernos para o tratamento de tais doenças tipicamente envolvem sistemas de teste rigorosos durante o desenvolvimento, para garantir a eficácia e segurança dos regimes. Embora avanços recentes nestes campos tenham aumentado a eficácia dos sistemas de teste investigativos e terapêuticos, existe uma necessidade quanto a melhorias em termos da eficiência, precisão, e rentabilidade dos sistemas. Um sistema de teste ideal replicaria com precisão a fisiologia de um paciente ou população de paciente, aos níveis bioquímico, celular, tecidual, órgão, e organismo, sem
2 / 75 requer a execução de testes diretamente nos pacientes e minimizando o uso de amostras de paciente. Uma variedade de agentes de tratamento diferentes e cronogramas devem ser acomodados em um sistema.
[004] Modelos in vitro são necessários para ‘triar’ compostos candidatos para identificar novos regimes para investigar e tratar câncer e doenças imunes ao nível de uma população. Além disso, existe interesse crescente na ‘medicina personalizada’ em que modelos in vitro podem ser usados para testar (algumas vezes anteriormente aprovados) regimes em subgrupos de paciente com características particulares ou mesmo em amostras de um único paciente, para determinar o regime ideal para este subgrupo ou paciente em particulares.
[005] O campo da tecnologia organoide está revolucionando o nosso entendimento de biologia desenvolvimental. Um organoide é uma estrutura celular obtida pela expansão de células epiteliais e consistindo de tipos de célula específicos de tecido que se auto-organizam através da classificação de célula e envolvimento de linhagem espacialmente restrita (Clevers, Cell. 16 de junho de 2016; 165(7): 1586-1597). Uma limitação de modelos com base em organoide na técnica anterior, é que eles contêm apenas células epiteliais e assim não são totalmente representativos de um sistema tecidual in vivo que contenha tipos múltiplos de células. Em particular, ‘coculturas’ humanas de organoides cancerosos (“tumoroides”) e células imunes não foram descritas, certamente não em que o câncer e as células imunes tivessem sido obtidos do mesmo paciente. As células imunes melhoram a precisão do organoide como um sistema de teste, replicando a fisiologia do paciente e garantindo que o sistema imune fosse representado no sistema de teste.
[006] Tentativas anteriores demonstraram a cocultura de linfócitos intraepitelial de murino (IELs) com organoides epiteliais intestinais de murino, para os propósitos de entender os comportamentos espaçotemporais dos IELs com células epiteliais intestinais – Nozaki et al. (J Gastroenterol.
3 / 75 2016 Mar; 51(3): 206-13) e Rogoz et al. (J Immunol Methods. Junho de 2015; 421: 89-95 – mas a progressão para desenvolver coculturas de organoides humanas e a aplicação para investigar e tratar câncer não foram informadas. Os chamados ‘tumoroides’ foram preparados a partir de amostras derivadas de pacientes com câncer colorretal (Drost et al., Nature. 7 de maio de 2015; 521(7550): 43-7; van de Wetering et al., Cell. 7 de maio de 2015; 161(4): 933-45), mas não foram cocultivadas com células imunes para investigar regimes de tratamento para câncer.
[007] Há uma necessidade quanto a métodos melhorados para preparar coculturas de organoides e coculturas tumoroides e métodos para usar estas coculturas na triagem de fármaco, particularmente um sistema no qual a interação entre células doentes e células imunes possa ser estimulada para investigar uma gama aumentada de fármacos com capacidade de alto rendimento.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] Os inventores desenvolveram coculturas de organoides úteis para investigações relacionadas com doenças, tais como câncer e doenças imunes, incluindo a identificação de tratamentos adequados para tais doenças. Isto envolve em algumas modalidades preparar coculturas de organoides e células imunes, particularmente organoides de doença (tais como tumoroides) e células imunes, que possam ser expostos aos agentes candidatos para tratar doenças e detectar quaisquer mudanças para identificar agentes candidatos adequados.
[009] Consequentemente, a invenção provê entre outras coisas um método para identificar um agente adequado para tratar um câncer, em que o método compreende: colocar uma cocultura tumoroide em contato com um ou mais agentes candidatos, em que a cocultura de tumoroide compreende células imunes e pelo menos um tumoroide,
4 / 75 detectar a presença ou ausência de uma ou mais mudanças na cocultura de tumoroide que seja indicativa de adequabilidade de agente candidato para tratar o câncer, e identificar um agente candidato como adequado para tratar o câncer se a presença ou ausência de uma ou mais das ditas mudanças na cocultura de tumoroide forem detectadas.
[0010] Em algumas modalidades, o método acima compreende adicionalmente comparar a presença ou ausência da uma ou mais mudanças da cocultura de tumoroide com um organoide de referência ou tumoroide de referência e em que o método compreende adicionalmente: colocar uma cocultura de organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência em contato com o um ou mais agentes candidatos, em que a cocultura de organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência compreende células imunes e pelo menos um organoide ou tumoroide, e detectar a presença ou ausência da uma ou mais mudanças na cocultura de organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência que seja indicativa de adequabilidade de agente candidato para tratar o câncer.
[0011] A invenção provê adicionalmente um método para identificar um agente adequado para tratar uma doença imune, em que o método compreende: colocar uma cocultura de organoide em contato com um ou mais agentes candidatos, em que a cocultura de organoide compreende células imunes doentes e pelo menos um organoide, detectar a presença ou ausência de uma ou mais mudanças na cocultura de organoide que seja indicativa de adequabilidade de agente candidato para tratar a doença imune e identificar um agente candidato como adequado para tratar a doença imune se a presença ou ausência de uma ou mais das ditas mudanças
5 / 75 na cocultura de organoide for detectada.
[0012] Em algumas modalidades, o método acima compreende adicionalmente comparar a presença ou ausência da uma ou mais mudanças da cocultura de organoide com uma célula imune de referência (por exemplo de um paciente de controle carecendo da doença imune) e em que o método compreende adicionalmente: colocar uma cocultura de organoide de referência em contato com o um ou mais agentes candidatos, em que a cocultura de organoide de referência compreende células imunes e pelo menos um organoide, e detectar a presença ou ausência da uma ou mais mudanças na cocultura de organoide de referência que seja indicativa de adequabilidade de agente candidato para tratar a doença imune.
[0013] Também é provido um método de testar uma imunoterapia de CAR-T, células T transgênicas em TCR, neoantígeno ou inibidor de ponto de checagem, quanto à eficácia e/ou segurança quando usado para tratar câncer epitelial, o método compreendendo: opcionalmente prover do mesmo paciente células epiteliais tumorais, células epiteliais normais e células imunes, expandir as células epiteliais tumorais em meio de cultura de tumoroide para formar um tumoroide e cultivar o tumoroide com as células imunes em um meio de cocultura de tumoroide compreendendo interleucina para formar uma cocultura de tumoroide, expandir as células epiteliais normais em meio de cultura de organoide para formar um organoide e cultivar o organoide com as células imunes em um meio de cocultura de organoide compreendendo interleucina para formar uma cocultura de organoide de referência, colocar a cocultura de tumoroide e a cocultura de organoide de referência em contato com a imunoterapia de CAR-T, célula T transgênica em TCR, neoantígeno ou inibidor de ponto de checagem,
6 / 75 detectar a presença ou ausência de uma ou mais mudanças na cocultura de tumoroide e na cocultura de organoide de referência, em que a presença ou ausência de uma ou mais mudanças é indicativa da eficácia e/ou segurança da imunoterapia de CAR-T, célula T transgênica em TCR, neoantígeno ou inibidor de ponto de checagem, e comparar a cocultura de tumoroide e a cocultura de organoide de referência.
[0014] Também é provido um método de testar um composto candidato quanto à eficácia e/ou segurança quando usado para tratar câncer epitelial, o método compreendendo: opcionalmente prover do mesmo paciente células epiteliais tumorais, células epiteliais normais e células imunes, expandir as células epiteliais tumorais em meio de cultura de tumoroide para formar um tumoroide e cultivar o tumoroide com as células imunes em um meio de cocultura de tumoroide compreendendo interleucina para formar uma cocultura de tumoroide, expandir as células epiteliais normais em meio de cultura de organoide para formar um organoide e cultivar o organoide com as células imunes em um meio de cocultura de organoide compreendendo interleucina para formar uma cocultura de organoide de referência, colocar a cocultura de tumoroide e a cocultura de organoide de referência em contato com o composto candidato, detectar a presença ou ausência de uma ou mais mudanças na cocultura de tumoroide e na cocultura de organoide de referência, em que a presença ou ausência de uma ou mais mudanças é indicativa da eficácia e/ou segurança do composto candidato e comparar a cocultura de tumoroide e a cocultura de organoide de referência.
[0015] Também é provido um método para preparar uma cocultura de
7 / 75 organoide-célula imune, em que o método compreende: opcionalmente cultivar células epiteliais em contato com uma matriz extracelular em um meio de cultura de organoide para se obter um organoide; remover a dita matriz extracelular e o meio de cultura de organoide do dito organoide; recolocar em suspensão o dito organoide no meio de cultura de célula imune suplementado com interleucina; preparar uma suspensão de célula imune compreendendo células imunes, meio de cultura de célula imune suplementado com interleucina e colágeno na concentração de pelo menos 5 a 10 % na suspensão; e misturar a suspensão de célula imune compreendendo células imunes com o organoide recolocado em suspensão.
[0016] Também é provido um método para preparar uma cocultura de tumoroide-célula imune, em que o método compreende: opcionalmente cultivar células epiteliais tumorais em contato com uma matriz extracelular em um meio de cultura de tumoroide para se obter um organoide; remover a dita matriz extracelular e meio de cultura de tumoroide do dito tumoroide; recolocar em suspensão o dito tumoroide no meio de cultura de célula imune suplementado com interleucina; preparar uma suspensão de célula imune compreendendo células imunes, meio de cultura de célula imune suplementado com interleucina e colágeno na concentração de pelo menos 5 a 10 % na suspensão; e misturar a suspensão de célula imune compreendendo células imunes com o tumoroide recolocado em suspensão.
8 / 75
[0017] Também é provido um método para testar um agente terapêutico, em que o método compreende: colocar uma cocultura de organoide em contato com um ou mais agentes candidatos, em que a cocultura de organoide compreende células imunes e pelo menos um organoide, detectar a presença ou ausência de uma ou mais mudanças na cocultura de organoide que seja indicativa da eficácia terapêutica, e identificar um agente candidato como um agente terapêutico se a presença ou ausência de uma ou mais das ditas mudanças na cocultura de organoide for detectada.
[0018] Também é provida uma cocultura de organoide obtenível ou obtida pelos métodos da invenção.
[0019] Também é provida uma cocultura de tumoroide obtenível ou obtida pelos métodos da invenção.
[0020] Também é provida uma população de organoides obtenível ou obtida pelos métodos da invenção.
[0021] Também é provida uma população de tumoroides obtenível ou obtida pelos métodos da invenção.
[0022] Também é provido um meio de cocultura de organoide adequado para o uso nos métodos da invenção.
[0023] Também é provido um meio de cocultura de tumoroide e meio de cocultura de organoide adequados para o uso nos métodos da invenção. Também é provido um tumoroide ou organoide em um meio compreendendo uma interleucina, opcionalmente onde a interleucina é selecionada a partir do grupo consistindo de IL-2, IL-7 e IL-15
[0024] A invenção também provê um kit compreendendo um tumoroide, organoide, cocultura de tumoroide ou cocultura de organoide da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
9 / 75 Figura 1. Derivação de organoide, tumoroide e células T de tecido primário do paciente.
[0025] Figura 1A. Esquemático do procedimento. Biópsias de mucosa colônica normal e tecido tumoral são recolhidas de cólon ressecado e/ou reto de pacientes com câncer colorretal. Sangue periférico também é recolhida durante a cirurgia. A mucosa colônica normal é tratada com EDTA para liberar os folículos para a derivação de organoide colônico normal e adicionalmente digerido para fabricar uma suspensão de célula única contendo linfócitos intraepiteliais (IELs) para culturas de célula T. O tecido tumoral é digerido para fabricar uma suspensão de célula única contendo células de tumor epitelial para a derivação de tumoroides assim como linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) para culturas de célula T. Sangue periférico é processado para purificar células mononucleares de sangue periférico enriquecidas quanto a linfócitos de sangue periférico (PBLs) e células T. A análise primária é realizada pelo sequenciamento do receptor de célula T (TCR) e imunofenotipagem das células T e sequenciamento de RNA mensageiro (mRNA) de célula única das células presentes nas suspensões de célula única de epitélio colônico normal e epitélio tumoral. A cultura de organoides são analisadas usando sequenciamento de genoma inteiro, sequenciamento de mRNA e formação de perfil de peptidoma.
[0026] Figura 1B. Imagens de campo brilhante representativas de organoides colônicos normais e tumoroides derivados de amostras de paciente. As criptas colônicas foram embutidas dentro de extrato de membrana basal (BME) e cultivadas com meio contendo R-spondin-1, Noggin, meios condicionados com Wnt3A, suplemento B27 sem vitamina A, nicotinamida, N-acetilcisteína, EGF, inibidor de TGF-α A-83-01, gastrina, inibidor de p38 MAPK SB202190 e prostaglandina E2. Os organoides colônicos normais se desenvolveram dentro de 1 semana e foram trocados semanalmente depois disso (painel de topo). Suspensões de célula única de
10 / 75 amostras de colorretal câncer foram embutidas em extrato de membrana basal (BME) e cultivadas com meio contendo R-espondina-1, meio condicionado de Noggin, suplemento B27 sem vitamina A, nicotinamida, N- acetilcisteína, EGF, inibidor de TGF-α A-83-01, gastrina, inibidor p38 MAPK SB202190 e prostaglandina E2. Os tumoroides formados dentro de 1 semana e foram trocados semanalmente depois disso (painel de fundo).
[0027] Figura 1C. Imagens de campo brilhante representativas de crescimento clonal de linfócitos intraepiteliais (IELs) e linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) derivados de amostras de paciente (painéis esquerdos). A análise de citometria de fluxo mostra expansão robusta de células T auxiliares (Th) CD4+ e células T citotóxicas (CTLs) CD8+. Suspensões de célula única de mucosa colônica normal ou tecido de câncer colorretal foram mantidas em meio de célula T contendo interleucina-2 (IL-2). O crescimento clonal de células T foi perceptível dentro de 1 a 2 semanas (painéis esquerdos).
[0028] A Figura 1 é descrita adicionalmente no Exemplo 1. Figura 2. Cocultura de prova de princípio de organoides colônicos normais e células T CD3+ alogênicas em gotas de extrato de membrana basal (BME).
[0029] Figura 2A. Esquemático do procedimento. Organoides colônicos normais foram liberados da gota de BME usando Solução de Recuperação de Célula e lavados em DMEM/F12 avançado completo. As células T CD3+ expandidas foram colhidas da cultura e rotuladas com corante verde (Vybrant CFDA SE Cell Tracer). Os organoides colônicos e células T rotuladas foram misturados em meio de organoide colônico humano e embutido em gotas de BME. As coculturas foram mantidas em meio de organoide colônico humano contendo IL-2 durante 60 horas. As coculturas foram liberadas de BME usando Solução de Recuperação de Célula e fixadas em 4% de paraformaldeído. Montagens inteiras fixadas foram tingidas com Faloidina para fabricar actina polimerizada e DAPI para rotular núcleos.
11 / 75 Montagens inteiras foram montadas sobre lâmina em meio de montagem antidesvanecimento ProLong Gold e imageadas em um microscópio confocal Leica SP8X.
[0030] Figura 2B. Projeção máxima de imagens de pilha z de coculturas de organoides colônicos. A F-actina nos organoides é rotulada em cinza escuro e as células T são rotuladas em cinza claro. O inserto no painel direito mostra uma célula T infiltrando o epitélio colônico.
[0031] Figura 2C. Reconstrução tridimensional de um organoide colônico normal e células T.
[0032] A Figura 2 é descrita adicionalmente no Exemplo 8. Figura 3. Imageamento ao vivo de coculturas de tumoroide para avaliar a motilidade ideal de células T.
[0033] Figura 3A. Esquemático do procedimento. Os tumoroides foram liberados da gota de BME usando Solução de Recuperação de Célula e lavados em DMEM/F12 completo Advanced. As células T CD8+ alogênicas isoladas de amostras de sangue periférico foram rotuladas com corante verde (Vybrant CFDA SE Cell Tracer). Os tumoroides e as células T foram misturadas com meio de organoide colônico humano contendo IL-2 e 10% de BME ou colágeno I de cauda de rato e imageados ao vivo durante 80 horas em um microscópio confocal Leica SP8X equipado com uma câmera de imageamento ao vivo a 37°C e atmosfera a 5% de CO2.
[0034] Figura 3B. Imagens compósitas representativas da cocultura de tumoroides. O canal de campo brilhante e o canal fluorescente verde foram fundidos para gerar imagens compósitas. Os caminhos de trilha da célula T foram traçados usando software Imaris.
[0035] Figura 3C. Quantificação do comprimento da trilha de células T em ambas as condições mostra caminho de trilha significantemente mais longo de células T cocultivada em colágeno a 10% comparado com BME a 10%.
12 / 75
[0036] A Figura 3 é explicada em mais detalhes no Exemplo 10. Figura 4. Geração de tumoroides clonais positivos e negativos para antígeno leucocitário humano (HLA) tipo A2.
[0037] Figura 4A. Esquemático do procedimento. Tumoroides foram dissociados em células únicas usando digestão enzimática TrypLE. As células únicas foram tingidas com anticorpo anti-HLA-A2 e purificadas com base na imunorreatividade anti-HLA-A2. As células de tumor HLA-A2+ve e HLA- A2-ve foram embutidas e mantidas para gerar tumoroides.
[0038] Figura 4B. Análise citométrica de fluxo mostrando estabelecimento de linhagens de tumoroide HLA-A2+ve ou HLA-A2-ve puras. Os controles são a linhagem de célula HLA-A2+ve JY assim como as linhagens de organoide colônico normal derivadas das mesmas amostras de paciente como as linhagens de tumoroide HLA-A2+ve ou HLA-A2-ve.
[0039] A Figura 4 é explicada adicionalmente no Exemplo 11. Figura 5. Ensaio de extermínio para reatividade antitumoroide de células T experienciadas em antígeno.
[0040] Figura 5A. Esquemático do procedimento. Os tumoroides HLA-A2+ve ou HLA-A2-ve foram pulsados durante 2 horas com o peptídeo de tumor de Wilms 1 (WT1) restrito a HLA-A2. As células T CD8+ transgênicas em TCR abrigando um TCR específico de peptídeo WT1 foram depois cocultivadas durante 48horas com tumoroides HLA-A2+ve ou HLA- A2-ve pulsados com o peptídeo WT1.
[0041] Figura 5B. Imagens de campo brilhante representativas de coculturas depois de 48horas mostrando a morte significante de tumoroides HLA-A2+ve pulsados apenas com peptídeos WT1. Todas as outras condições, isto é, tumoroides HLA-A2+ve ou HLA-A2-ve não pulsados com peptídeos WT1 e tumoroides HLA-A2-ve pulsados com peptídeo WT1, mostram crescimento normal.
[0042] A Figura 5 é explicada em mais detalhes no Exemplo 12.
13 / 75 Figura 6. Ensaio de viabilidade celular quanto à reatividade antitumoroide de células T experienciadas em antígeno com e sem inibição do ponto de checagem.
[0043] Figura 6A. Esquemático do procedimento. A cocultura foi realizada como descrita para a Figura 5A mas apenas durante 12horas e incubadas com e sem inibidor de ponto de checagem anti-PD1. O ensaio de viabilidade celular foi realizado usando o kit de Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter Glo (Promega) de acordo com as instruções do fabricante.
[0044] Figura 6B. Viabilidade celular de tumoroides normalizados para nenhum controle de peptídeo.
[0045] A Figura 6 é explicada em mais detalhes no Exemplo 13. Figura 7. Ensaio para determinar efeito diferencial sobre a ativação de células T pelas coculturas de organoide/tumoroide.
[0046] Figura 7A. Esquemático do procedimento. Os tumoroides foram liberados da gota de Matrigel® usando Dispase e passados sobre filtros de 70 µm e 20 µm subsequentemente. Os organoides foram recuperados do filtro de 20 µm, contados e plaqueados. Os tumoroides e células T foram misturados com meio de organoide colônico humano contendo RPMI, IL-2 e 5% de Matrigel® e incubados a 37°C e atmosfera com 5% CO2. Depois de 24horas de incubação os organoides foram imageados usando um microscópio invertido de campo brilhante.
[0047] Figura 7B. Imagens representativas das coculturas de tumoroide.
[0048] Figura 7C. Imagens representativas das coculturas de organoide.
[0049] Figura 7D. Quantificação dos níveis de IFN-γ das coculturas.
[0050] A Figura 7 é explicada adicionalmente no Exemplo 14. Figura 8. Imageamento ao vivo das coculturas de tumoroide para avaliar
14 / 75 a associação e capacidade de extermínio de célula.
[0051] Figura 8A. Esquemático do procedimento. Os tumoroides foram liberados da gota de Matrigel® usando Dispase e passados sobre filtros de 70 µm e 20 µm subsequentemente. Os organoides foram recuperados do filtro de 20 µm, contados e plaqueados. As células T cultivadas foram rotuladas com corante vermelho escuro (CellVue Claret). Os tumoroides e as células T foram misturados com meio de organoide colônico humano contendo RPMI, IL-2 e 5% de Matrigel® e imageados ao vivo durante 68horas em um microscópio confocal Leica SP8X equipado com uma câmera de imageamento ao vivo a 37°C e atmosfera com 5% de CO2.
[0052] Figura 8B. Imagens compósitas representativas do tumoroide e coculturas de célula T não alvejadoras. O canal de campo brilhante e o canal de fluorescência vermelho escuro foram imagens compósitas fundidas geradas.
[0053] Figura 8C. Imagens compósitas representativas do tumoroide e coculturas de célula T alvejadora. O canal de campo brilhante e canal de fluorescência vermelho escuro foram imagens compósitas fundidas geradas.
[0054] A Figura 8 está descrita adicionalmente no Exemplo 15.
[0055] Figura 9. Os organoides de CRC expressam moléculas imunomodulatórias Cólon normal e linhagens de organoide CRC foram geradas em uma maneira específica de paciente e o RNA foi extraído e analisado usando microarranjos de transcrito único Affymetrix.
[0056] Figura 9A. Expressão gênica média de imunomoduladores diferentes em cólon normal e linhagens de organoide CRC; n.s., não significante; *, p < 0,05.
[0057] Figura 9B. Agrupamento hierárquico das linhagens de organoide de cólon normal individual e CRC no ‘biobanco vivo’ exibindo a expressão de gene de imunomoduladores selecionados. Os gradientes de cor representam z no valor de cada fileira (transcritos de gene).
15 / 75
[0058] Figura 9C. Linhagens de organoide colônico humano geneticamente engenheirados para portar uma ou mais mutações encontradas nas CRCs. Os níveis de expressão de CD274 (PD-L1) em linhagens de organoide (n = 2) no estado constante (Ctrl) e na estimulação com 20 ng/mL de IFN-γ humano recombinante avaliados pela PCR quantitativa. A, APCKO/KO; N.D., não detectado; K, KRASG12D/+: P, P53KO/KO; S, SMAD4KO/KO, WT, tipo selvagem.
[0059] Figura 9D. Linhagens de organoide colônico humano geneticamente engenheirados para portar uma ou mais mutações encontradas nas CRCs. Níveis de expressão de CD274 (PD-L1) em linhagens organoides (n = 2) no estado constante (Ctrl) e na estimulação com 20 ng/mL de IFN-γ humano recombinante avaliados pela citometria de fluxo. A, APCKO/KO; N.D., não detectado; K, KRASG12D/+: P, P53KO/KO; S, SMAD4KO/KO, WT, tipo selvagem.
[0060] Figura 10. Expressão de HLA-A2 nas linhagens de organoide CRC HLA-A2+ e HLA-A2- clonalmente expandidas. A Figura mostra uma plotagem representativa de experimentos repetidos múltiplos. A análise de citometria de fluxo de expressão de HLA-A2 nas linhagens normais (painel esquerdo), CRC HLA-A2+ (painel central) e CRC HLA-A2– (painel direito) com e sem estimulação com 20 ng/mL de IFN-γ humano recombinante. Figura 11. Organoides CRC como ferramentas para a avaliação de extermínio específico de antígeno pelas células T CD8+
[0061] Figura 11A. Esquema experimental.
[0062] Figura 11B. A análise de citometria de fluxo da expressão de HLA-A2 nas linhagens HLA-A2+ e HLA-A2– clonadas.
[0063] Figura 11C. Imagens de campo brilhante de organoides de CRC cocultivados com células T transgênicas específicas de receptor de célula T específico de peptídeo WT1 durante 48horas; barras de escala: 1 mm.
16 / 75
[0064] Figura 11D. Imagens mostrando organoides de CRC HLA- A2+ pulsados em peptídeo no começo e final da cocultura com células T específicas de peptídeo indicadas; barras de escala: 70 µm.
[0065] Figura 11E. Produção de IFN-γ pelas células T específicas de peptídeo WT1 (topo) e EBV (fundo) como medida pelo ELISA de sobrenadantes coletados depois de cocultura de 18horas com organoides de CRC HLA-A2+ pulsados com os peptídeos indicados.
[0066] Figura 11F. Fotografias de célula viva de um experimento de cocultura de 18horas com organoides de CRC HLA-A2+ pulsados com peptídeo EBV cocultivados com um clone de célula T específico de EBV.
[0067] Figura 11G. Quantificação do extermínio de organoide CRC pelas células T específicas. Os gráficos são representativos de experimentos repetidos múltiplos com coculturas de peptídeo EBV e célula T EBV ou peptídeo WT1 e célula T WT1.
[0068] Figura 11H. Imagem de projeção representativa de células T (azul) infiltrando um organoide CRC pulsado com peptídeo como registrado durante os experimentos de imageamento de célula viva.
[0069] Figura 11I. Quantificação do extermínio de organoides de CRC tratados com IFN-γ pelas células T específicas na presença ou ausência de um anticorpo bloqueador contra PD-1. Os gráficos são representativos de experimentos repetidos múltiplos com coculturas com peptídeo EBV e célula T EBV ou peptídeo WT1 e célula T WT1.
[0070] Figura 11J. Quantificação da viabilidade celular depois de coculturas de 18horas de organoides HLA-A2+ com células T específicas de antígeno pulsados ou não pulsados com peptídeo. Os gráficos representam a razão entre as condições pulsadas com peptídeo e não pulsadas com peptídeo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
[0071] “Alogênico” refere-se às entidades (por exemplo, células,
17 / 75 tumoroides, coculturas) derivadas de pacientes diferentes. No caso de células, isto pode se referir às células derivadas de uma amostra de um paciente diferente ou controle saudável. Os exemplos de amostras adequadas incluem, mas não são limitados a sangue periférico ou biópsia de tecido.
[0072] “Aproximadamente” ou “cerca de”, como usado neste pedido, são equivalentes. Quaisquer numerais usados neste pedido com ou sem cerca de/aproximadamente são intencionados a abranger quaisquer flutuações normais avaliadas pela pessoa versada na técnica. Como aqui usado, o termo “aproximadamente” ou “cerca de,” como aplicado a um ou mais valores de interesse, refere-se a um valor que seja similar a um valor de referência estabelecido. Em certas modalidades, o termo “aproximadamente” ou “cerca de” refere-se a uma faixa de valores que se situam dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos em cada direção (maior do que ou menor do que) do valor de referência estabelecido a menos que de outro modo estabelecido ou de outro modo evidente a partir do contexto (exceto onde tal número excedesse 100% de um valor possível).
[0073] “Biologicamente ativo” refere-se a uma característica de qualquer agente que tenha atividade em um sistema biológico e particularmente em um organismo. Por exemplo, um agente que, quando administrado a um organismo, tem um efeito biológico sobre este organismo, é considerado ser biologicamente ativo.
[0074] “Cocultura” refere-se a dois ou mais tipos de célula mantidos em condições adequadas para o seu crescimento mútuo. No contexto da presente descrição, uma “cocultura de organoide” refere-se a um organoide epitelial, como definido em outra parte, em cultura com um tipo de célula não epitelial, especificamente um tipo de célula imune. Em algumas modalidades, os tipos de célula em cocultura exibem uma associação estrutural, bioquímica e/ou fenomenológica que eles não exibem em isolamento. Em algumas
18 / 75 modalidades, os tipos de célula em cocultura imitam a associação estrutural, bioquímica e/ou fenomenológica observada entre os tipos de célula in vivo.
[0075] “Compreender”, “compreende” e “compreendendo” serão entendidos implicar a inclusão de uma etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos estabelecidos, mas não a exclusão de nenhuma outra etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos.
[0076] “Dose” refere-se a uma quantidade especificada de um agente farmacêutico provida em uma única administração. Em certas modalidades, uma dose pode ser administrada em dois ou mais bolos, tabletes ou injeções. Por exemplo, em certas modalidades, onde administração subcutânea é desejada, a dose desejada requer um volume não facilmente acomodado por uma única injeção. Em tais modalidades, duas ou mais injeções podem ser usadas para se alcançar a dose desejada. Em certas modalidades, uma dose pode ser administrada em duas ou mais injeções para minimizar a reação no local da injeção em um indivíduo. Em certas modalidades, uma dose é administrada como uma infusão lenta.
[0077] “Doença imune” refere-se a qualquer distúrbio do sistema imune. As doenças imunes tipicamente têm um componente genético e incluem doenças autoimunes (nas quais o sistema imune erroneamente age sobre os “próprios” componentes) e doenças imunomediadas (nas quais o sistema imune exibe função excessiva).
[0078] “Imunoterapia” refere-se a qualquer intervenção médica que induza, suprima ou realce o sistema imune de um paciente para o tratamento de uma doença. Em algumas modalidades, as imunoterapias ativam uma resposta imune inata e/ou adaptativa do paciente (por exemplo, células T) para mais eficazmente alvejar e remover um patógeno ou cura de uma doença, tal como câncer ou uma doença imune.
[0079] “Intestino” e “intestinal” referem-se ao trato gastrointestinal, incluindo a boca, cavidade oral, esôfago, estômago, intestino grosso, intestino
19 / 75 delgado, reto e ânus.
[0080] “Organoide” refere-se a uma estrutura celular obtida pela expansão de células tronco epiteliais adultas (pós-embrionária), preferivelmente distinguidas pela expressão de Lgr5 e consistindo de tipos de célula específicos de tecido que se auto-organizam através da classificação de célula e comprometimento de linhagem espacialmente restrita (por exemplo, como descrita em Clevers, Cell. 16 de junho de 2016; 165(7): 1586-1597, ver particularmente a seção chamada de “Organoids derived from adult stem cells” na página 1590 em diante). No presente pedido, o termo “organoide” pode ser usado para se referir aos organoides normais (por exemplo, não tumor). Onde organoides são descritos como organoides de “doença”, isto significa que o organoide tem um fenótipo de doença, por exemplo, tipicamente porque o organoide foi derivado de uma ou mais células tronco epiteliais tendo um fenótipo de doença ou em algumas modalidades, porque o organoide foi geneticamente modificado para demonstrar características particulares de um fenótipo de doença.
[0081] “População” refere-se a um grupo de entidades compartilhando traços comuns. Em algumas modalidades, “população” refere-se a pacientes compartilhando um conjunto de traços clínicos relevantes. Preferivelmente, uma “população” pode se referir a um grupo de pacientes compartilhando o mesmo câncer e/ou sendo tratado com o mesmo agente e/ou susceptível a tratamento bem sucedido com o mesmo agente. Uma população pode diferir em uma ou mais características, incluindo genótipo e/ou características de resposta a agente específicas durante o tratamento. Uma população pode também se referir a um grupo de células, organoides e/ou coculturas compartilhando um ou mais traços genotípicos, fenotípicos ou bioquímicos. Uma “subpopulação” refere-se a um grupo de entidades compartilhando um número maior de traços comuns ou um número menor de traços dissimilares, do que uma população maior na qual as
20 / 75 entidades da subpopulação são também classificadas.
[0082] “Seguro” refere-se a um tratamento para uma doença, que não tenha nenhum efeito colateral ou apenas tenha efeitos colaterais dentro de um nível tolerável de acordo com a prática clínica padrão.
[0083] “Efeito colateral” ou “efeito deletério” refere-se a uma resposta fisiológica atribuível a um tratamento outro que não os efeitos desejados.
[0084] “Sujeito” ou “paciente” ou “indivíduo” pode se referir a um ser humano ou qualquer animal não humano (tal como qualquer camundongo, rato, coelho, cão, gato, gado bovino, suíno, ovelha, cavalo ou primata). Em modalidades preferidas, o paciente é um mamífero, mais preferivelmente um ser humano. “Ser humano” pode se referir às formas pré- e/ou pós-natal. Um sujeito pode ser um paciente, que refere-se a um ser humano que se apresente a um médico para diagnóstico ou tratamento de uma doença. O termo “sujeito” é aqui usado intercambiavelmente com “indivíduo” ou “paciente.” Um paciente pode ser afligido com ou é susceptível a uma doença ou distúrbio, mas pode demonstrar ou não sintomas da doença ou distúrbio.
[0085] “Sofrendo de” refere-se a um paciente que foi diagnosticado com ou exibe um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio e/ou condição.
[0086] “Susceptível a” refere-se a um paciente que não foi diagnosticado com uma doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, um paciente que é susceptível a uma doença, distúrbio e/ou condição pode não exibir sintomas da doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, um paciente que é susceptível a uma doença, distúrbio, condição ou evento pode ser distinguido por um ou mais dos seguintes: (1) uma mutação genética associada com desenvolvimento da doença, distúrbio e/ou condição; (2) um polimorfismo genético associado com o desenvolvimento da doença, distúrbio e/ou condição; (3) expressão aumentada e/ou diminuída e/ou atividade de uma proteína associada com a
21 / 75 doença, distúrbio e/ou condição; (4) hábitos e/ou estilos de vida associados com o desenvolvimento da doença, distúrbio, condição e/ou (5) tendo passado, planejando passar por ou requerendo um transplante. Em algumas modalidades, um paciente que é susceptível a uma doença, distúrbio e/ou condição desenvolverá a doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, um paciente que é susceptível a uma doença, distúrbio e/ou condição não desenvolverá a doença, distúrbio e/ou condição.
[0087] “Quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico que seja suficiente, quando administrada a um sujeito que sofra de ou susceptível a um doença, distúrbio e/ou condição, para tratar, diagnosticar, prevenir e/ou retardar o início do(s) sintoma(s) da doença, distúrbio e/ou condição. Será avaliado pelo versado que uma quantidade terapeuticamente eficaz é tipicamente administrada via um regime de dosagem compreendendo pelo menos uma dose unitária.
[0088] “Tratando”, “tratar”, “tratamento” refere-se a qualquer método usado para parcial ou completamente aliviar, melhorar, mitigar, inibir, prevenir, início retardado, reduzir a severidade de e/ou reduzir a incidência de um ou mais sintomas ou traços de uma doença, distúrbio e/ou condição particular. O tratamento pode ser administrado a um sujeito que não exiba sinais de uma doença e/ou exiba apenas sinais iniciais da doença para o propósito de diminuir o risco de desenvolver a patologia associada com a doença.
[0089] “Tumoroide” refere-se a um organoide compreendendo células que exibam um ou mais traços genéticos, fenotípicos ou bioquímicos classificados como canceroso. No presente pedido, o termo “tumoroide” abrange “organoides” derivados de tecido canceroso. O termo “tumoroide” também pode abranger organoides de progressão de tumor (TPOs), que são culturas de organoide de tumor engenheirado in que um organoide normal foi engenheirado para conter mutações cancerosas, por exemplo, usando a
22 / 75 tecnologia de Cas9. Identificação de agentes adequados para tratamento
[0090] Geral. A invenção diz respeito a coculturas de organoides e células imunes (‘coculturas de organoide’) e/ou coculturas de organoides de doença (tais como tumoroides) e células imunes (‘coculturas de organoide de doença’ ou mais especificamente ‘coculturas de tumoroide’) e seu uso para investigar a fisiologia de doenças e/ou a adequabilidade de agentes candidatos para tratar doenças. A adequabilidade para tratar uma doença pode compreender a eficácia para tratar a doença e/ou segurança para tratar a doença. As doenças de interesse particular incluem câncer e doenças imunes.
[0091] Consequentemente, a invenção provê entre outras coisas um método para identificar um agente adequado para tratar um câncer, em que o método compreende: colocar uma cocultura de tumoroide em contato com um ou mais agentes candidatos, em que a cocultura de tumoroide compreende células imunes e pelo menos um tumoroide, detectar a presença ou ausência de uma ou mais mudanças na cocultura de tumoroide que seja indicativa da adequabilidade de agente candidato para tratar o câncer, e identificar um agente candidato como adequado para tratar o câncer se a presença ou ausência de uma ou mais das ditas mudanças na cocultura de tumoroide for detectada.
[0092] Também é provido um método para testar um agente terapêutico, em que o método compreende: colocar uma cocultura de organoide em contato com um ou mais agentes candidatos, em que a cocultura de organoide compreende células imunes e pelo menos um organoide, detectar a presença ou ausência de uma ou mais mudanças na cocultura de organoide que seja indicativa da eficácia terapêutica, e
23 / 75 identificar um agente candidato como um agente terapêutico se a presença ou ausência de uma ou mais das ditas mudanças na cocultura de organoide for detectada.
[0093] Em algumas modalidades, o organoide é um organoide de doença, por exemplo, um organoide exibindo um fenótipo de doença imune. Devido à presença de células imunes nas coculturas da invenção, as coculturas são particularmente adequados para investigar a adequabilidade de agentes de imunoterapia candidatos.
[0094] Os métodos da invenção têm capacidade de alto rendimento (HTP). Em algumas modalidades, os métodos da invenção podem ser realizados em placas de 96 poços e/ou em placas de 384 poços.
[0095] Etapa de Contato. Isto pode envolver expor a cocultura de organoide aos níveis terapêuticos de um produto terapêutico conhecido ou desconhecido. Tipicamente, um agente será dissolvido em solução a uma concentração terapeuticamente eficaz (prognosticada) e administrada à cocultura pela injeção (ou outra administração apropriada) em um vaso no qual a cocultura é mantida.
[0096] Etapa de detecção. Em algumas modalidades, a invenção compreende uma etapa de detectar a presença ou ausência de uma ou mais mudanças na cocultura de tumoroide que sejam indicativas da adequabilidade de agente candidato para o tratamento.
[0097] Em princípio, qualquer mudança bioquímica, genética, fenotípica ou fenomenológica na cocultura pode ser detectada. Em algumas modalidades, a uma ou mais mudanças podem estar em um ou mais biomarcadores de doença, tais como biomarcadores de câncer. Em algumas modalidades, a uma ou mais mudanças pode incluir uma redução na viabilidade da célula, uma redução na proliferação da célula, um aumento na morte de célula, uma mudança no tamanho da célula ou organoide, uma mudança na motilidade, dissociação ou rompimento de célula da camada de
24 / 75 célula epitelial intacta/compacta (isto é, células dissociadas da camada de célula epitelial compacta), mudança na produção de citocinas e moléculas citotóxicas pelas células imunes cocultivadas e uma mudança na expressão de um ou mais genes.
[0098] Em princípio, a detecção pode ser realizada usando qualquer método de laboratório adequado conhecido pela pessoa versada. Em algumas modalidades, detectar uma ou mais mudanças pode compreender um ensaio de proliferação celular, um ensaio de viabilidade, análise citométrica de fluxo, ELISA para IFN-γ (Interferon gama) (como realizada por exemplo, na Figura 8D), análise da expressão de gene e/ou imageamento celular.
[0099] Uma redução na viabilidade celular pode ser detectada pelo kit de Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter Glo (Promega), tingimento citométrica de fluxo intracelular para Caspase 3 ativa (BD) ou cepa positiva para células mortas. A cepa positiva para células mortas inclui cepas de DNA permeáveis de membrana não celular tais como NucRed Dead 647 ReadyProb.
[00100] Um aumento na morte de célula pode ser detectado pelo imageamento de campo brilhante.
[00101] Etapa de identificação. A identificação pode compreender identificar uma mudança de uma magnitude particular e pode ser um processo automatizado e/ou de alto rendimento.
[00102] Etapa de comparação. Em algumas modalidades, a invenção pode compreender uma etapa de comparar a cocultura de organoide ou cocultura de tumoroide com um controle, que pode estar associado ou não com a etapa de identificação. Isto pode envolver comparar a presença ou ausência ou magnitude de uma ou mais mudanças da cocultura de tumoroide com um organoide de referência ou tumoroide de referência e pode adicionalmente compreender: colocar um organoide de referência ou cocultura de tumoroide
25 / 75 de referência em contato com o um ou mais agentes candidatos, em que o organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência compreende células imunes e pelo menos um organoide, e detectar a presença ou ausência da uma ou mais mudanças no organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência que seja indicativa de adequabilidade de agente candidato para tratar o câncer.
[00103] Em algumas modalidades, um agente candidato é identificado como um agente adequado se a presença ou ausência de uma mudança for detectada na cocultura de tumoroide, mas não na cocultura de referência.
[00104] Em algumas modalidades, a cocultura de organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência é usada como um controle, tal como um controle negativo ou um controle positivo.
[00105] Etapa de seleção. Em algumas modalidades, o método da invenção compreende uma etapa de selecionar um agente candidato como adequado para tratar câncer. Selecionar é distinto de identificar, visto que selecionar pode envolver considerações considerando a presença ou ausência ou magnitude da uma ou mais mudanças do método provido. Por exemplo, selecionar pode compreender considerações adicionais tais como biodisponibilidade de agente, aplicabilidade a uma subpopulação de paciente ou mecanismos de liberação de agente, que pode ser testado ou não no método.
[00106] Em algumas modalidades, esta etapa pode ser a etapa final do método da invenção. Em outras modalidades, adicionalmente etapas são consideradas. Por exemplo, os métodos da invenção podem adicionalmente compreender a etapa de usar o agente candidato selecionada no tratamento.
[00107] Agentes. Qualquer agente pode ser testado de acordo com o método da invenção. Isto inclui qualquer biológico, químico, físico ou outro agente ou agentes múltiplos administrados concomitantemente ou em sequência.
26 / 75
[00108] Os agentes (ou ‘agentes candidatos’) passam por teste quanto à adequabilidade de tratar câncer, podem ser selecionados de uma ou mais das seguintes classes terapêuticas: imunoterapêuticos, peptídeos específicos de tumor, inibidores de ponto de checagem, agente alquilante, antimetabólito, agonista metabólico, antagonista metabólico, alcaloide vegetal, inibidor mitótico, antibiótico antitumor, inibidor da topoisomerase, produtos radioterapêuticos, produtos quimioterapêuticos, anticorpos, agente fotossensibilizante, transplante de célula tronco, vacina, agente citotóxico, agente citostático, inibidor da tirosina cinase, inibidor de proteassoma, citocina, interferon, interleucina, agente intercalante, agente de terapia alvejada, fármaco de molécula pequena, hormônio, esteroide, produto terapêutico celular, vetor viral e produto terapêutico de ácido nucléico.
[00109] Preferivelmente, os agentes são peptídeos específicos de tumor, inibidores de ponto de checagem ou produtos imunoterapêuticos.
[00110] Os agentes são mais preferivelmente produtos imunoterapêuticos, por exemplo, produtos terapêuticos de receptor de antígeno quimérico (CAR)-célula T, produto terapêutico de célula T transgênica em TCR ou neoantígenos. Outros agentes incluem agentes associados com citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP).
[00111] Contexto. Os métodos da invenção reivindicada podem ser realizados in vivo, ex vivo, in vitro, in situ, ex situ ou qualquer combinação dos mesmos. Preferivelmente os métodos são realizados in vitro. Medicina personalizada
[00112] Geral. Um meio de testar regimes diferentes pode ser descrito como uma abordagem de ‘medicina personalizada’ para testar. Uma abordagem de medicina personalizada pode envolver testar um ou mais agentes candidatos que sejam de adequabilidade conhecida para o tratamento e/ou identificação de um ou mais agentes candidatos como agentes adequados
27 / 75 em um paciente em particular.
[00113] As aplicações de medicina personalizada da invenção podem requerer que tanto a cocultura de tumoroide quanto a cocultura de organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência sejam derivados do paciente em particular para o qual a adequabilidade de agentes candidatos para tratar câncer esteja sendo identificada.
[00114] Os inventores mostraram que é possível derivar células imunes, células epiteliais normais (por exemplo, não tumorais) e células epiteliais tumorais de um único tecido em um único paciente e obter coculturas de organoide-célula imune e coculturas de tumoroide-célula imune a partir destas células. Estas coculturas proveem um modelo particularmente útil para testar resposta de paciente individual aos agentes candidatos.
[00115] Um paciente para o qual um agente candidato foi identificado como sendo adequado para tratar câncer, pode ser subsequentemente tratado com o agente candidato assim identificado. Triagem
[00116] Geral. Um outro meio de testar regimes diferentes pode ser descrito como uma abordagem de ‘triagem’ para testar. Uma abordagem de triagem pode envolver testar um ou mais agentes candidatos que sejam de adequabilidade desconhecida para o tratamento e/ou identificação de um subconjunto de um ou mais agentes candidatos como agentes adequados para o tratamento.
[00117] As aplicações de triagem da invenção podem requerer que o um ou mais agentes candidatos sejam de adequabilidade conhecida para tratar um primeiro câncer e adequabilidade desconhecida para tratar um segundo câncer, com triagem compreendendo identificar um subconjunto do um ou mais agentes candidatos como agentes adequados para tratar o segundo câncer.
[00118] Em algumas modalidades, a abordagem de triagem identifica
28 / 75 agentes adequados para tratar câncer ao nível de ‘população’, ao invés de ao nível de subpopulações. Em outras modalidades, a abordagem de triagem identifica agentes adequados para tratar câncer ao nível de subpopulações. Em algumas modalidades, a abordagem de triagem não é usada para identificar agentes adequados para tratar câncer ao nível de pacientes individuais (que é tipicamente abrangido em uma abordagem de medicina personalizada). Tipos de célula e doenças
[00119] Espécies. Células, cânceres, organoides e/ou coculturas da invenção ou adequados para o uso com os métodos da invenção podem ser principalmente de qualquer organismo multicelular, preferivelmente um organismo multicelular susceptível ao câncer. Em algumas modalidades, as células, cânceres, organoides e/ou coculturas da invenção são mamíferos (significando derivados de mamíferos), tais como células, cânceres, organoides e/ou coculturas de murino, primata ou ser humano. Em uma modalidade preferida, as células, cânceres, organoides e/ou coculturas da invenção são humanos (significando derivados de seres humanos).
[00120] Células epiteliais. Organoides e/ou coculturas de organoides da invenção são obtidas a partir de células epiteliais. Os organoides e/ou coculturas de organoides podem ser obtidos a partir de células epiteliais normais (isto é, não doentes) ou a partir de células epiteliais doentes (algumas vezes especificamente aludidas como ‘organoides de doença’ ou ‘coculturas de doença’). Os tumoroides e/ou cocultura de tumoroides da invenção são obtidos a partir de células epiteliais tumorais. Qualquer célula epitelial a partir da qual um organoide ou tumoroide pode ser gerado é adequada para o uso na invenção. As células epiteliais tumorais e/ou células epiteliais normais preferidas incluem células pulmonares, células hepáticas, células mamárias, células dérmicas, células intestinais, células da cripta, células retais, células pancreáticas, células endócrinas, células exócrinas, células dutais, células renais, células adrenais, células da tireoide, células pituitárias, células da
29 / 75 paratireoide, células prostáticas, células estomacais, células esofágicas, células ovarianas, células do tubo de falópio e células vaginais. As células epiteliais particularmente preferidas são células intestinais, por exemplo células colorretais. As células epiteliais podem ser células tronco epiteliais, preferivelmente distinguidas pela expressão de Lgr5.
[00121] Em algumas modalidades, as células epiteliais tumorais e/ou células epiteliais normais são obtidas de uma amostra de um paciente com câncer. Em uma modalidade particular, as células epiteliais tumorais e as células epiteliais normais são obtidas a partir de amostras do mesmo paciente com câncer, opcionalmente da mesma amostra. As amostras adequadas para a obtenção de células epiteliais incluem biópsia de tecido, tal como ascite de um paciente com câncer colorretal ou ovariano; urina de um paciente com câncer renal; ou biópsia de tecido de cólon e/ou reto ressecado de paciente com câncer colorretal.
[00122] Células imunes. Qualquer célula imune que possa ser incorporada em uma cocultura é adequada para o uso com os métodos da invenção. As células imunes preferidas incluem um ou mais tipos de célula selecionada do grupo consistindo de linfócitos intraepiteliais (IELs), linfócitos infiltrante de tumor (TILs), células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), linfócitos de sangue periférico (PBLs), células T, linfócitos T citotóxicos (CTLs), células B, células NK, fagócitos mononucleares, células T de receptor α/β e células T de receptor γ/δ. As células imunes preferidas também incluem células supressoras derivadas de mieloide.
[00123] As células imunes podem ser obtidas a partir de linhagens de célula estabelecidas disponíveis na técnica (por exemplo, da ATCC ou bibliotecas similares de linhagens de célula). Alternativamente, as células imunes podem ser purificadas a partir de uma amostra impura de um sujeito. Existem vantagens associadas com a obtenção das células imunes do mesmo paciente como as células epiteliais tumorais para derivar o tumoroide na
30 / 75 cocultura, porque a cocultura resultante é deste modo mais representativa (e assim um modelo mais fiel) do paciente a partir do qual as suas células são derivadas. Isto é particularmente útil no contexto de medicina personalizada.
[00124] Uma amostra imune impura a partir da qual as células imunes podem ser obtidas, pode incluir uma amostra de tumor, tecido colônico normal (não tumoral) e/ou sangue periférico. Em algumas modalidades, as células imunes são obtidas de uma amostra de um paciente com câncer. Em algumas modalidades, as células imunes são obtidas de uma amostra de sangue periférico e/ou uma biópsia de tecido. Por exemplo, linfócitos de sangue periférico (PBLs) e/ou células T podem ser obtidos a partir de uma amostra de sangue periférico; ou linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) e/ou linfócitos intraepiteliais (IELs) são obtidos a partir de biópsia de tecido tumoral ou saudável, respectivamente.
[00125] As células imunes adequadas para o uso nos métodos da invenção podem ser alogênicas com o tumoroide e/ou organoide. Em algumas modalidades, as células imunes são igualadas em HLA com o tumoroide e/ou organoide, isto é, as células imunes podem ser antigenicamente compatíveis com o paciente a partir do qual o tumoroide e/ou organoide são derivados (Shiina et al., (2016). MHC Genotyping in Human and Nonhuman Species by PCRbased Next-Generation Sequencing, Next Generation Sequencing - Advances, Applications and Challenges, Dr. Jerzy Kulski (Ed.), InTech, DOI: 10,5772/61842) (Choo, Yonsei Med J. 28 de fevereiro de 2007; 48(1): 11-23).
[00126] Engenheiramento de célula T. Um aspecto importante da presente invenção é o uso de células T engenheiradas, tais como células T de receptor de antígeno quimérico (CAR) (Sadelain et al., Nature. 24 de maio de 2017; 545(7655): 423-431). A invenção provê métodos e coculturas que podem ser usados para testar a adequabilidade de diferentes tipos de célula T de CAR para diferentes fenótipos de tumor e microambientes de tumor. A presente invenção é um meio vantajoso de aperfeiçoar o processo de seleção
31 / 75 de célula T de CAR e aumento de desempenho, com escalabilidade melhorada e custo reduzido comparado com os métodos existentes. Em particular, a presente invenção é altamente adequada para o uso com células T γδ – células T não convencionais com forte reatividade antitumor para um amplo espectro de tumores com diversas origens de tecido (Sebestyen et al., Cell Rep. 31 de maio de 2016; 15(9): 1973-85). Assim em algumas modalidades, as células imunes na cocultura são células T engenheirado, tais como células T de CAR.
[00127] Organoide e tumoroides. Os organoides podem ser preparados cultivando-se células epiteliais normais em um meio de cultura de organoide. Os tumoroides podem ser preparados cultivando-se células epiteliais tumorais em um meio de cultura de tumoroide. As células epiteliais normais podem ser autólogas com as células epiteliais tumorais (isto é, do mesmo paciente). Os organoides/tumoroides da invenção podem ser distinguidos pela expressão de Lgr5. Em algumas modalidades, um organoide/tumoroide é uma estrutura celular tridimensional. Em algumas modalidades, um organoide/tumoroide compreende um lúmen circundado pelas células epiteliais. Em algumas modalidades, as células epiteliais circundando o lúmen são polarizadas. A polarização pode ser rompida nos tumoroides. As células epiteliais a partir das quais organoides/tumoroides são obtidos são preferivelmente células epiteliais primárias.
[00128] Tipos de câncer. Os métodos da invenção são aplicáveis a qualquer câncer. Em algumas modalidades, o câncer pode ser um ou mais de adenoma, pólipos adenomatosos, carcinoma renal, adenoma adrenal, adenoma tireoidal, adenoma pituitário, adenoma paratireoide, adenoma hepatocelular, fibroadenoma, cistadenoma, adenoma brônquico, adenoma sebácico, adenoma prostático, adenocarcinoma, colangiocarcinoma, câncer de célula escamosa, carcinoma dutal, carcinoma lobular, carcinoma, carcinoma adenoescamoso, carcinoma anaplástico, carcinoma de célula grande, carcinoma de célula pequena, carcinoma de célula fusiforme, carcinoma sarcomatoide, carcinoma
32 / 75 pleomórfico, carcinossarcoma, carcinoma de célula basal, VIPoma, linite plástica, carcinoma cístico adenoide, carcinoma de célula renal, carcinoma mucoepidermoide, câncer intestinal, câncer do intestino delgado, câncer colônico, câncer colorretal, câncer gastrointestinal, câncer esofágico, câncer retal, câncer vaginal, câncer pancreático, câncer estomacal, câncer ovariano, câncer cervical, câncer endometrial, carcinoma pulmonar de célula não pequena, carcinoma pulmonar não pequeno, câncer mamário e melanoma.
[00129] Cânceres para os quais os métodos da invenção são particularmente aplicáveis incluem câncer epitelial, tal como câncer gastrointestinal ou câncer colorretal, câncer pancreático e câncer mamário.
[00130] Estágios de câncer. A invenção é aplicável ao câncer em qualquer estágio de progressão. A progressão do câncer pode ser distinguida em diversos sistemas. O sistema TNM (Tumor, Nódulo, Metástase) compreende três categorias, cada uma designada com um grau numérico. T refere-se ao tamanho do câncer e quão longe ele se espalhou no tecido vizinho – o mesmo pode ser 1, 2, 3 ou 4, com 1 sendo pequeno e 4 grande. N refere-se a se o câncer se espalhou para os linfônodos – o mesmo pode estar entre 0 (nenhum dos linfônodos contendo células cancerosas) e 3 (grandes quantidades de linfônodos contendo células cancerosas). M refere-se a se o câncer se espalhou para uma outra parte do corpo – o mesmo pode ser 0 (o câncer não se espalhou) ou 1 (o câncer se espalhou). Um segundo sistema é o Sistema de Estagiamento Numérico, que compreende quatro estágios. Estágio 1 usualmente significa que um câncer é relativamente pequeno e contido dentro do órgão dentro do qual o mesmo começou. Estágio 2 usualmente significa que o câncer não começou a se espalhar dentro do tecido circundante, mas o tumor é maior do que no estágio 1. Algumas vezes estágio 2 significa que as células cancerosas se espalharam nos linfônodos próximos ao tumor. Isto depende do tipo particular de câncer. Estágio 3 usualmente significa que o câncer é maior. O mesmo pode ter iniciado a se espalhar
33 / 75 dentro dos tecidos circundantes e existem células cancerosas nos linfônodos na área. Estágio 4 significa que o câncer se espalhou de onde o mesmo começou para um outro órgão do corpo. Isto também é chamado de câncer secundário ou metastático. O Sistema de graduação é um terceiro sistema de distinguir o grau de progressão de câncer. No grau I, as células cancerosas que se parecem células normais e não estão crescendo rapidamente. No grau II, as células cancerosas não se parecem com células normais e estão crescendo mais rápido do que as células normais. No Grau III, as células cancerosas se parecem anormais e podem crescer ou espalhar mais agressivamente.
[00131] Certos agentes testados nos métodos da invenção, tais como imunoterapia, são mais relevantes nos estágios posteriores (metastatizados) dos cânceres tais como cânceres colorretais, porque a resseção cirúrgica frequente é suficiente quando nenhuma metástase está presente. Consequentemente, a invenção é aplicável ao câncer no ou abaixo de um de Estágio III, Grau III ou T2 N1 M1.
[00132] Para os outros cânceres que são menos facilmente ressecados cirurgicamente, a imunoterapia também pode ser relevante nos estágios iniciais. Adicionalmente, o uso da invenção nos organoides de progressão de tumor (TPOs) também permite investigação de tratamentos para cânceres nos estágios iniciais. Consequentemente, a invenção é aplicável ao câncer no ou abaixo de um de Estágio II, Grau II ou T2 N1 M0.
[00133] Doenças imunes. Além dos cânceres, doenças de células imunes também podem ser investigadas usando os métodos da invenção. Em princípio, qualquer distúrbio do sistema imune que afete as células imunes pode ser investigado em cocultura. As doenças imunes preferidas incluem doenças imunes dos sistemas digestivos e respiratórios, especialmente dos intestinos e pulmões. As doenças imunes exemplificativas incluem doença do intestino irritável (IBD), colite ulcerativa (UC), doença pulmonar obstrutiva
34 / 75 crônica (COPD) e asma.
[00134] Quando do teste de distúrbios imunes usando os métodos da invenção, organoides podem ser separadamente cultivados com células imunes doentes e células imunes de um paciente de controle saudável.
[00135] Biópsias e aquisição de amostra. Amostras de organoide e/ou tumoroide podem ser obtidas durante a cirurgia de tecido mucósico e tumoral normal, por exemplo recolhidas de cólon ressecado, reto, intestino delgado e/ou íleo de pacientes com câncer colorretal e/ou pacientes de controle saudáveis. As células imunes podem ser derivadas de sangue periférico recolhido durante a cirurgia. Organoides, tumoroides e coculturas
[00136] Preparação de cocultura de tumoroide. Em um aspecto, a invenção provê um método para preparar uma cocultura de tumoroide-célula imune. O método compreende a etapa de misturar um tumoroide como aqui descrito com células imunes em uma cultura in vitro. A mistura pode compreender camadas sequenciais de células T e organoides no mesmo poço em uma placa de múltiplos poços ou pode compreender pipetagem sequencial de células T e organoides em um gel. Em uma modalidade preferida, a cocultura de tumoroide é mantida em um meio de cocultura como aqui descrito.
[00137] Em algumas modalidades, o método para preparar a cocultura de tumoroide-célula imune compreende adicionalmente uma ou mais das seguintes etapas de preparação: preparar o pelo menos um tumoroide cultivando-se células epiteliais tumorais em um meio de cultura de tumoroide; e/ou preparar as células imunes cultivando-se as células imunes em um meio de expansão de célula imune.
[00138] Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de tumoroide (opcionalmente incluindo qualquer matriz extracelular) é removido do pelo
35 / 75 menos um tumoroide antes de misturar o pelo menos um tumoroide com as células imunes. A matriz extracelular pode ser rompida usando kits comercialmente disponíveis, tais como Solução de Recuperação de Célula® (Corning). Uma matriz alternativa, tal como colágeno, pode ser usada no lugar da matriz removida.
[00139] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de obter as células imunes de uma amostra imune impura. Os métodos para isolar células imunes a partir de amostras imunes impuras são conhecidos na técnica. Os métodos exemplificativos para isolar linfócitos a partir de suspensões de célula única e culturas de expansão de célula T são descritos no Exemplo 5.
[00140] A invenção provê uma cocultura de tumoroide-célula imune obtida pelo método acima. A invenção também provê usos da dita cocultura de tumoroide-célula imune na triagem de fármaco, triagem de toxicologia, pesquisa e desenvolvimento de fármaco.
[00141] A cocultura de tumoroide pode ser ex situ, ex vivo e/ou in vitro. A mesma é preferivelmente in vitro.
[00142] Preparação de cocultura de organoide. Em um aspecto, a invenção provê um método para preparar uma cocultura de organoide-célula imune. O método compreende a etapa de misturar um organoide como aqui descrito com células imunes em uma cultura in vitro. Em uma modalidade preferida, a cocultura de organoide é mantida em um meio de cocultura como aqui descrito.
[00143] Em algumas modalidades, o método para preparar a cocultura de organoide-célula imune compreende uma ou mais das seguintes etapas: preparar o pelo menos um organoide cultivando-se células epiteliais normais em um meio de cultura de organoide; e/ou cultivar as células imunes em um meio de expansão de célula imune.
36 / 75
[00144] Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de organoide (opcionalmente incluindo qualquer matriz extracelular, tal como matriz de membrana basal ‘BME’ ou matrigel) é removido do pelo menos um organoide antes de misturar o pelo menos um organoide com as células imunes. A matriz extracelular pode ser rompida usando kits comercialmente disponíveis, tais como Solução de Recuperação de Célula® (Corning). Uma matriz alternativa, tal como colágeno, pode ser usada no lugar da matriz removida.
[00145] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de obter as células imunes a partir de uma amostra imune impura. Os métodos para isolar células imunes a partir de amostras imunes impuras são conhecidos na técnica. Os métodos exemplificativos para isolar linfócitos de suspensões de célula única e culturas de expansão de célula T são descritos no Exemplo 5.
[00146] A invenção também provê uma cocultura de organoide-célula imune obtida pelo método acima. A invenção também provê usos da dita cocultura de organoide-célula imune na triagem de fármaco, triagem de toxicologia, pesquisa e desenvolvimento de fármaco.
[00147] A cocultura de organoide pode ser ex situ, ex vivo e/ou in vitro. A mesma é preferivelmente in vitro.
[00148] Análise primária. Em algumas modalidades os métodos da invenção adicionalmente compreendem uma ou mais etapas de análise primária. A análise primária dos tumoroides e/ou organoides pode compreender sequenciamento genômico inteiro, sequenciamento de mRNA, formação de perfil de peptidoma e/ou microscopia. A análise primária pode ser usada para garantir que os tumoroides e/ou organoides sejam uniformes e/ou atinjam a expectativa, em uma forma de revelação de informação e/ou verificação de informação. Por exemplo, a análise primária pode ser usada para determinar diferenças de transcrição de mRNA entre organoides e
37 / 75 tumoroides e se estas diferenças na transcrição de mRNA são espelhadas nas diferenças de expressão de proteína. A presença de antígenos específicos nos organoides/tumoroides também pode ser confirmada e se quaisquer novos antígenos se desenvolvem apenas nos tumoroides. A suprarregulagem de fatores imunoinibidores no microambiente tumoral pelas células de tumor também pode ser investigada.
[00149] As células imunes podem ser submetidas a uma ou mais etapas de análise primária. Por exemplo, a análise primária das células imunes pode compreender imunofenotipagem e/ou sequenciamento de receptor de célula T. A análise primária pode ser usada para checar se as células T de CAR expressam o receptor necessário para reconhecer células tumorais. A suprarregulagem de receptores específicos reconhecendo o tumor também pode ser investigada.
[00150] Em uma modalidade particular, os métodos da invenção compreendem uma etapa de determinar o tipo HLA das células, organoides ou tumoroides.
[00151] As coculturas também podem ser submetidas a uma ou mais etapas de análise primária. A análise primária da cocultura de tumoroide e/ou cocultura de organoide pode compreender análise de imagem, análise citométrica de fluxo e/ou análise de secreção de citocina. A análise primária pode ser usada para garantir que as coculturas sejam uniformes e/ou atinjam a expectativa.
[00152] Fonte de tumoroides e organoides. Os tumoroides e/ou organoides da invenção podem compreender ou consistir de células autólogas, isto é, células obtidas do mesmo paciente. Por exemplo, o tumoroide pode ser obtido cultivando-se uma célula de tumor (por exemplo, uma célula de câncer colorretal), ao passo que o organoide pode ser obtido cultivando-se uma célula normal (não tumoral) do mesmo tecido no mesmo paciente (por exemplo, uma célula de cólon normal). Isto pode ser particularmente útil no
38 / 75 contexto de um organoide de referência.
[00153] A invenção também provê tumoroides e/ou organoides em um meio compreendendo uma interleucina, tal como IL-2, IL-7 ou IL-15. Em algumas modalidades, o pelo menos um tumoroide ou pelo menos um organoide compreende ou consiste de células de mamífero, preferivelmente células humanas.
[00154] Separação de tumoroides e organoides. Em algumas modalidades, tumoroides e/ou organoides são separados em populações compartilhando um ou mais genótipos, fenótipos e/ou marcadores epigenéticos, antes de misturar com células imunes. Preferivelmente, os genótipos, fenótipos e/ou marcadores epigenéticos contribuem para a interação entre (i) o tumoroide e/ou organoide e (ii) as células imunes.
[00155] As populações separadas do tumoroide ou organoide podem compartilhar a presença ou ausência de um haplotipo HLA, por exemplo um haplotipo HLA como HLA-A2.
[00156] Esta etapa de separação pode permitir que grupos e subgrupos de pacientes relevantes sejam determinados. Meios
[00157] Meios de cultura de célula imune. O meio de cultura de célula imune pode ser usado para preparar células imunes para cocultivo, por exemplo, pela facilitação do crescimento e divisão (expansão) e/ou diferenciação de células imunes para produzir uma população adequada para cocultura.
[00158] Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de célula imune compreende uma interleucina. Em algumas modalidades a interleucina é selecionada de IL-2, IL-7 e IL-15. Em uma modalidade preferida, a interleucina no meio de cultura de célula imune é IL-2.
[00159] Em algumas modalidades a concentração da interleucina é de 2000 a 6000 IU/mL. Uma concentração preferida de IL-2 no meio de cultura
39 / 75 de célula imune é 50 µM.
[00160] O meio de cultura de célula imune pode adicionalmente compreender um meio RPMI (por exemplo, RPMI 1640, Gibco), opcionalmente suplementado com penicilina/estreptomicina e/ou hepes e/ou glutaMAX® e/ou piruvato de sódio e/ou soro (por exemplo, 5% de soro AB humano, Sigma-Aldrich). Em princípio, qualquer meio de cultura de célula basal de mamífero pode ser usado no lugar do meio RPMI, tal como DMEM/12.
[00161] Meios organoides e tumoroides. Os meios de cultura de tumoroide e meios de cultura de organoide podem ser usados para preparar organoides e tumoroides para cocultura, por exemplo, pela facilitação do crescimento, divisão (expansão), organização estrutural ou outro desenvolvimento para produzir um tumoroide e/ou organoide adequado para cocultura.
[00162] Os meios de cultura de tumoroide adequados e meios de cultura de organoide para tecidos diferentes são conhecidos na técnica (por exemplo, Clevers, Cell. 16 de junho de 2016; 165(7): 1586-1597). Os meios de cultura de organoide/tumoroide preferidos compreendem um agonista de Wnt (por exemplo, qualquer um de R-espondina 1-4), um fator de crescimento mitogênico (por exemplo, selecionado de EGF, FGF, HGF e BDNF) e um inibidor de BMP (por exemplo, Noggin) (por exemplo, como descrito na WO2010/090513). Em algumas modalidades, o meio de cultura de organoide/ tumoroide compreende adicionalmente um inibidor de TGF-beta (por exemplo, A83-01, Tocris) (por exemplo, como descrito na WO2012/168930). A adição de um inibidor de TGF-beta é particularmente adequada para a cultura de células humanas. O inibidor de TGF-beta preferivelmente inibe o caminho da sinalização de ALK4/5/7.
[00163] Em algumas modalidades, certos componentes de meio de cultura são opcionais para o meio de cultura de tumoroide, porque certas
40 / 75 células tumorais contêm mutações que constitutivamente ativam ou inativam caminhos (tais como o caminho de Wnt) e assim remove a necessidade quanto a fatores exógenos designados para modular estes caminhos. Assim, por exemplo, em algumas modalidades, os meios de cultura de tumoroide não compreendem um agonista de Wnt.
[00164] Um meio de cultura de organoide preferido, que é particularmente adequado para cultura de organoides colônicos, compreende um ou mais (ou preferivelmente todos) de um meio basal (tal como meio DMEM/F12 Advanced, Gibco) um ligante Wnt (tal como Wnt-3a), um agonista Wnt (tal como qualquer um de Respondina 1-4), um inibidor de BMP (tal como Noggin), EGF e um inibidor de TGF-α (tal como A83-01, Tocris) e opcionalmente compreende adicionalmente um ou mais (ou todos) de um inibidor de p38 MAPK, gastrina, nicotinamida, prostaglandina E, N- acetilcisteína, B27 e/ou um antimicrobiano (tal como primocina).
[00165] Um meio de cultura de tumoroide preferido, que é particularmente adequado para a cultura de tumoroides de câncer colônico, compreende um ou mais (ou preferivelmente todos) de um meio basal (tal como meio DMEM/F12 Advanced, Gibco) um agonista de Wnt (tal como qualquer um de Respondina 1-4), um inibidor de BMP (tal como Noggin), EGF e um inibidor de TGF-α (tal como A83-01, Tocris) e opcionalmente compreende adicionalmente um ou mais (ou todos) de um inibidor de p38 MAPK, gastrina, nicotinamida, prostaglandina E, N-acetilcisteína, B27 e/ou um antimicrobiano (tal como primocina). O meio de cultura de tumoroide pode opcionalmente compreender um ligante Wnt (tal como Wnt-3a), que é especialmente útil para os tumores colorretais mais sensíveis à terapia imune (por exemplo, os tumores MSI que normalmente carecem das mutações do caminho de Wnt).
[00166] Em algumas modalidades, tumoroides ou organoides são cultivados em meio de expansão de célula imune ou uma mistura de meio de
41 / 75 expansão de célula imune e um meio de cultura de tumoroide ou organoide preferido.
[00167] O versado está ciente dos meios de cultura específicos para outros tipos de organoide e tumoroide e pode adaptar a invenção para o uso com outros organoides e tumoroides consequentemente.
[00168] Meios de cocultura. A invenção provê meios (por exemplo, como descritos nos exemplos) para a cocultura de tumoroides e células imunes. A invenção também provê meios (por exemplo, como descritos nos exemplos) para a cocultura de organoides e células imunes. Qualquer um dos meios de cultura de célula imune ou o meio de cultura de tumoroide/ organoide descrito acima podem ser usados como um meio de cocultura para a cultura da cocultura de célula imune-organoide/tumoroide.
[00169] Os meios de cocultura da invenção vantajosamente permitem a cocultura de células imunes e organoides/tumoroides. No caso de tumoroides, tal cocultura é difícil ou mesmo impossível sem usar as adaptações de meios utilizados nos meios de cocultura da invenção. Os inventores observaram pela primeira vez que os meios para cocultura entre tumoroides e células imunes se beneficiam de um componente de Wnt reduzido (em relação ao meio de cultura de organoide), para preservar a função de célula imune. Isto pode ser obtido realizando-se a cocultura em 100% de meio de cultura de célula imune ou em uma mistura entre meio de cultura de célula imune e meio de cultura de organoide/tumoroide. Os mesmos meios podem ser usados para a cocultura de organoides e células imunes, embora um componente Wnt reduzido não seja tão benéfico para a cocultura de organoide.
[00170] Consequentemente, em algumas modalidades, o meio de cocultura compreende parte do meio de cultura de célula imune (por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%) e parte do meio de cultura de célula de organoide/tumoroide (por
42 / 75 exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%). Por exemplo, em modalidades preferidas, o meio de cocultura compreende cerca de 50% de meio de cultura de célula imune e cerca de 50% de meio de cultura de tumoroide/organoide. Em algumas modalidades, o meio de cultura de tumoroide é esgotado de componente Wnt antes do uso na mistura entre meio de cultura de célula imune e o meio de cultura de organoide/tumoroide.
[00171] Em algumas modalidades, um meio de cultura de célula imune (tal como um meio de célula T, por exemplo, RPMI 1640 (Gibco)) é usado para o meio de cocultura. Este meio de cultura é particularmente útil para sustentar a manutenção das células imunes na cocultura, particularmente para células humanas imunes. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% do meio de cocultura consiste de um meio de cultura de célula imune.
[00172] Matriz extracelular. As células são preferivelmente cultivadas em um microambiente que imita pelo menos em parte um nicho celular no qual as ditas células naturalmente residem. Um nicho celular é em parte determinado pelas células e por uma matriz extracelular (ECM) que é secretada pelas células no dito nicho. Um nicho celular pode ser imitado cultivando-se as ditas células na presença de biomateriais ou materiais sintéticos que proveem a interação com proteínas de membrana celular, tais como integrinas. Uma matriz extracelular como aqui descrita é, portanto, qualquer biomaterial ou material sintético ou combinação dos mesmos que imite o nicho celular in vivo, por exemplo, pela interação com proteínas de matriz celular, tais como integrinas. Qualquer matriz extracelular adequada pode ser usada.
[00173] Em um método preferido da invenção, as células são
43 / 75 cultivadas em contato com uma ECM. “Em contato” significa um contato físico ou mecânico ou químico, que significa que para separar o dito organoide resultante ou população de células epiteliais da dita matriz extracelular uma força precisa ser usada. Em algumas modalidades, a ECM é uma matriz tridimensional. Em algumas modalidades, as células são embutidas na ECM. Em algumas modalidades, as células são fixadas a uma ECM. Um meio de cultura da invenção pode ser espalhado dentro de uma matriz tridimensional ECM.
[00174] Em outras modalidades, a ECM está em suspensão, isto é, as células estão em contato com a ECM em um sistema de suspensão. Em algumas modalidades, a ECM está na suspensão em uma concentração de pelo menos 1%, pelo menos 2% ou pelo menos 3%. Em algumas modalidades, a ECM está na suspensão em uma concentração de 1% a cerca de 10% ou de 1% a cerca de 5%. O método de suspensão pode ter vantagens para métodos sofisticados.
[00175] Um tipo de ECM é secretado pelas células epiteliais, células endoteliais, células tipo endoderma parietal (por exemplo, Células Tipo Endoderma Parietal de Englebreth Holm Swarm descritas em Hayashi et al. (2004) Matrix Biology 23: 47-62) e células de tecido conectivo. Esta ECM compreende de uma variedade de polissacarídeos, água, elastina e glicoproteínas, em que as glicoproteínas compreendem colágeno, entactina (nidogênio), fibronectina e laminina. Portanto, em algumas modalidades, a ECM para o uso nos métodos da invenção compreende um ou mais dos componentes selecionados da lista: polissacarídeos, elastina e glicoproteínas, por exemplo, em que as glicoproteínas compreendem colágeno, entactina (nidogênio), fibronectina e/ou laminina. Por exemplo, em algumas modalidades, colágeno é usado como o ECM. Tipos diferentes de ECM são conhecidos, compreendendo composições diferentes incluindo tipos diferentes de glicoproteínas e/ou combinação diferente de glicoproteínas.
44 / 75
[00176] Os exemplos de matrizes extracelulares comercialmente disponíveis incluem: proteínas de matriz extracelular (Invitrogen) e preparações de membrana de base de células de sarcoma de camundongo de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) (por exemplo, Extrato de membrana basal Cultrex® (Trevigen, Inc.) ou Matrigel® (BD Biosciences)).
[00177] Em algumas modalidades a ECM é uma ECM contendo laminina tal como Matrigel® (BD Biosciences). Em algumas modalidades, a ECM é Matrigel® (BD Biosciences), que compreende laminina, entactina e colágeno IV. Em algumas modalidades, a ECM compreende laminina, entactina, colágeno IV e sulfato de heparina proteoglicano (por exemplo, Extrato de membrana basal Cultrex® Tipo 2 (Trevigen, Inc.)). Em algumas modalidades, a ECM compreende pelo menos uma glicoproteína, tal como colágeno e/ou laminina. Misturas de materiais de ECM naturalmente produzidos ou sintéticos podem ser usadas, se desejado. Em algumas modalidades, a ECM é BME (‘extrato de membrana basal’), que é uma forma solúvel de membrana de base purificada a partir do tumor de Engelbreth- Holm-Swarm (EHS) (por exemplo, BME da Cultrex®).
[00178] Em uma outra modalidade, a ECM pode ser uma ECM sintética. Por exemplo, uma ECM sintética, tal como ProNectina (Sigma Z378666) pode ser usada. Em um exemplo adicional, a ECM pode ser um plástico, por exemplo, um poliéster ou um hidrogel. Em algumas modalidades, uma matriz sintética pode ser revestida com biomateriais, por exemplo, uma ou mais glicoproteínas, tais como colágeno ou laminina.
[00179] Uma ECM tridimensional sustenta o cultivo de organoides epiteliais tridimensionais. O material de matriz extracelular normalmente será uma gota no fundo da placa na qual as células são colocadas em suspensão. Tipicamente, quando a matriz solidifica a 37ºC, o meio é adicionado e se espalha na ECM. As células no meio grudam à ECM pela interação com a sua estrutura superficial, por exemplo interação com integrinas.
45 / 75
[00180] O meio de cultura e/ou células pode ser colocado na, embutido na ou misturada com a ECM.
[00181] As ECM’s preferidas para cultivar tumoroides/organoides incluem BME e Matrigel.
[00182] Uma ECM preferida para cultivar coculturas é colágeno, tal como colágeno I de cauda de rato. O colágeno I de cauda de rato foi mostrado melhorar a motilidade da célula imune durante a cocultura – ver o Exemplo
11. O colágeno pode constituir pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9% ou pelo menos 10% (v/v) da cocultura.
[00183] Interleucina. Os meios de cocultura podem compreender uma interleucina (IL), opcionalmente em que a interleucina ou uma ou mais de IL- 2 (em uma concentração de 100 a 200 IU/mL), IL-7 (em 10 a 100 ng/mL) e IL-15 (em uma concentração de 10 a 100 ng/mL). Uma concentração de interleucina preferida usada em meios de cocultura é 25 µM. Estas concentrações para cocultura contrasta com as concentrações de IL usadas em expansão, que são maiores (por exemplo, IL-2 é usada em uma concentração de 2000 a 6000 IU/mL para a expansão de célula imune).
[00184] IL-2 é a interleucina preferida para o uso com células imunes associadas com tumor. Para outras células ou doenças imunes, tais como síndrome do intestino irritável (IBD) ou colite ulcerativa (UC), IL-7 e/ou IL- 15 são preferidas (Rabinowitz et al., Gastroenterology. mar de 2013; 144(3): 601-612.e1).
[00185] Em algumas modalidades, o meio de cocultura de tumoroide e/ou meio de cocultura de organoide compreendem uma mistura de (a) o meio de expansão de célula imune e (b) o meio de cultura de tumoroide ou meio de cultura de organoide, opcionalmente em que os meios estão presentes em uma razão de 50:50 (v/v).
[00186] Motilidade e concentração de proteína. Em algumas modalidades, a cocultura e/ou meio de cocultura vantajosamente confere
46 / 75 motilidade melhorada sobre as células imunes. Tais coculturas e/ou meios de cocultura podem compreender uma matriz extracelular (ECM), como descrita acima. A matriz extracelular pode ser Matrigel ou BME. Em uma modalidade preferida a matriz extracelular é colágeno ou colágeno I de cauda de rato.
[00187] Os inventores mostraram que as maiores melhorias na motilidade são observadas usando colágeno, particularmente colágeno I de cauda de rato. Em particular, as células imunes (por exemplo, células T) nos meios com base em BME exibem um comprimento de trilha médio de 43,635 µm, enquanto as células imunes (por exemplo, células T) nos meios com base em colágeno I de cauda de rato exibem um comprimento de trilha médio de 135,08 µm. Este é um aumento de 3 vezes na motilidade. O meio de cocultura pode compreender uma concentração de proteína de pelo menos 0,15 mg/(ml de Matrigel®) a 0,95 mg/(ml de Matrigel®) para um meio compreendendo 2% a 10% de Matrigel®.
[00188] Em algumas modalidades, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% das células imunes em uma cocultura são capazes de mover uma distância de pelo menos 200 µM, pelo menos 250 µM, pelo menos 300 µM, pelo menos 350 µM ou pelo menos 400 µM em 80 horas, como determinado usando o ensaio da Figura 3 e Exemplo 10.
[00189] Persistência e duração de atividade. Em algumas modalidades, os meios da invenção permitem que as células imunes persistam no meio de expansão de célula imune durante pelo menos 4horas, 8horas, 24horas, 48horas, 72horas, 96horas, 120horas, 144horas, 168horas, 192horas, 216horas ou 240horas.
[00190] Em algumas modalidades, os meios da invenção permitem que as células imunes permaneçam ativas durante pelo menos 4horas, 8horas, 12horas, 24horas, 48horas ou 72horas depois da formação de cocultura (isto é, depois do ponto de misturar as células imunes com células organoide/ tumoroide).
47 / 75
[00191] Em algumas modalidades, os meios da invenção permitem que as coculturas de tumoroide persistam no meio de cocultura de tumoroide ou a cocultura de organoide de referência ou a cocultura de tumoroide de referência persistam no meio de cocultura de organoide, durante pelo menos 4horas, 8horas, 24horas, 48horas, 72horas, 96horas, 120horas, 144horas, 168horas, 192horas, 216horas ou 240horas. Em algumas modalidades, as coculturas podem persistir durante 10 dias ou mais ou durante tantos dias como a cocultura possa permanecer em cultura sem ser trocada.
[00192] A atividade de células imunes pode ser detectada de acordo com a morfologia celular (por exemplo, a ausência de formato redondo e presença de projeções celulares indicam que as células permanecem ativas).
[00193] Aviso Legal. Em algumas modalidades, IL-2 não é usada em nenhum meio da invenção reivindicada. Métodos Adicionais e Produtos da Invenção
[00194] Kits. A invenção provê kits compreendendo qualquer organoide, tumoroide ou cocultura da invenção.
[00195] Em algumas modalidades, o kit compreende um ou mais dos seguintes: seringa, zaragatoa com álcool, bola de algodão, compressa de gaze, instruções para realizar os métodos da invenção.
EXEMPLOS
[00196] Outros traços, objetivos e vantagens da presente invenção estão evidentes nos exemplos que seguem. Deve ser entendido, entretanto, que os exemplos, embora indiquem as modalidades da presente invenção, são dados apenas por via de ilustração, não por limitação. Várias mudanças e modificações dentro do escopo da invenção tornar-se-ão evidentes para aqueles versados na técnica a partir dos exemplos. A invenção é exemplificada usando tumoroides como organoides de doença, mas é esperado que outros organoides de doença, particularmente organoides de doença referentes às doenças imunes, seriam usados do mesmo modo.
48 / 75 Portanto, onde a descrição refere-se a “tumoroides” é pretendido que este possa ser substituído com “organoide de doença”, tal como “organoide de doença imune”.
[00197] Os seguintes meios são usados nos Exemplos: Meio de organoide colônico humano.
[00198] Meio DMEM/F12 Advanced Completo (Gibco®) suplementado com 50% de meio condicionado com WNT3A (interno), 20% de meio condicionado R-espondina-1 (interno), 10% de meio condicionado Noggin (interno), 1× suplemento B27 (Gibco®), 1,25 mM de N-acetilcisteína (Sigma-Aldrich), 10 mM de nicotinamida (Sigma-Aldrich), 50 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano (EGF; Peprotech), 10 nM de gastrina (Sigma-Aldrich), 500 nM de inibidor de TGF-β A-83-01 (Tocris), 3 μM de inibidor p38 MAPK SB202190 (Sigma-Aldrich), 10 nM de prostaglandina E2 (Tocris) e 100 mg/mL de Primocin (InvivoGen). Meio tumoroide de câncer colorretal humano.
[00199] Meio DMEM/F12 Advanced completo suplementado com 20% de meio condicionado de R-espondina-1, 10% de meio condicionado Noggin, 1× suplemento B27 sem vitamina A (Gibco®), 1,25 mM de N- acetilcisteína, 10 mM de nicotinamida, 50 ng/mL de EGF humano, 10 nM de gastrina, 500 nM de inibidor de TGF-β A-83-01, 3 μM de inibidor p38 MAPK SB202190, 10 nM de prostaglandina E2 e 100 mg/mL de Primocin. Meio de célula T humana.
[00200] RPMI1640 (Gibco®) suplementado com penicilina/ estreptomicina, 5% de soro AB humano (Sigma-Aldrich). Meio de Ijssel.
[00201] IMDM suplementado com penicilina/estreptomicina, 1% de soro AB humano (Sigma-Aldrich), albumina sérica bovina, insulina, ácido oléico, ácido linoléico, transferrina e etanolamina (todos Sigma-Aldrich).
[00202] Nos seguintes exemplos, a geração e caracterização de
49 / 75 coculturas de organoide e coculturas de tumoroide são ilustradas através dos Exemplos 1 a 9. A aplicação destes métodos e as coculturas propriamente ditas são ilustradas nos Exemplos 10 a 15. Exemplo 1. Coleta de biópsias câncer colônico e colorretal normal do hospital.
[00203] Este exemplo mostra o isolamento de amostras de célula, que são usadas para a preparação de amostras organoide, tumoroide e célula imune em exemplos subsequentes.
[00204] As biópsias de mucosa colônica normal e tecido tumoral são recolhidas do cólon ressecado e/ou reto de pacientes com câncer colorretal. O sangue periférico também é recolhido durante a cirurgia.
[00205] Especificamente, as biópsias de tecido de câncer colorretal humano assim como epitélio de mucosa de cólon humano (adulto) normal e foram coletadas em 50 mL de tubos canônicos contendo 10 a 15 mL de meio DMEM/F12 Advanced gelado completado com Penicilina/Estreptomicina (de estoque 100× a 10.000 U/mL de Penicilina e 10K μM/mL de Estreptomicina), HEPES (de 100× estoque a 1M), GlutaMAX (de estoque 100×; todos da Gibco®) e inibidor da Rho cinase Y-27632 (Sigma-Aldrich). As biópsias mantidas em gelo e imediatamente processadas ou podem ser armazenadas durante até 24h a 4°C até o início do isolamento.
[00206] O processo é mostrado esquematicamente na Figura 1A. Exemplo 2. Isolamento de criptas de tecido de cólon normal e derivação de organoides colônicos normais; isolamento de células T intraepiteliais de tecido colônico normal para cultura de célula T.
[00207] Este exemplo mostra o processamento de amostras de cólon normal, para o desenvolvimento de culturas de organoide, assim como para o isolamento de células imunes a partir de amostras de cólon normal.
[00208] A mucosa colônica normal é tratada com EDTA para liberar os folículos para a derivação de organoide colônico normal, depois
50 / 75 adicionalmente digerido para fabricar uma suspensão de célula única contendo linfócitos intraepiteliais (IELs) para culturas de célula T. Isolamento de criptas de tecido de cólon normal e derivação de organoides colônicos normais.
[00209] A camada muscular e a gordura usando tesouras cirúrgicas e fórceps são removidas sob um microscópio de dissecação. O tecido limpo é cortado em tiras finas de aproximadamente 1 a 2 mm. Uma tira é fixada em 4% de formaldeído (Sigma-Aldrich) para análise histológica e uma tira é rapidamente congelada (em gelo seco ou nitrogênio líquido) e armazenada a – 80°C para a análise de gene e/ou proteína. As tiras remanescentes foram lavadas 3 vezes com solução de quelação fresca (5,6 mM de Na2HPO4, 8,0 mM de KH2PO4, 96,2 mM de NaCl, 1,6 mM de KCl, 43,4 mM de sacarose e 54,9 mM de D-sorbitol dissolvidos em água estéril; todos da Sigma-Aldrich). As tiras lavadas foram incubadas em solução de quelação completada com 2 mM de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA; interno) e 0,5 mM de DL- ditiotreitol (DTT; Sigma-Aldrich) durante 30 minutos a 4°C em uma roda giratória (ambiente frio). Os tubos foram vigorosamente agitados para liberar as criptas colônicas fora da mesênquima. Se nenhuma cripta foi visível, a incubação foi repetida com solução de quelação completa fresca. Fragmentos de tecido foram deixados sedimentar durante 1 a 2 minutos e o sobrenadante contendo os folículos foi transferido para um novo tubo. 5 a 10 mL de soro de bezerro fetal (FCS; Sigma-Aldrich) foram adicionados e os folículos foram centrifugados a 300×g durante 5 minutos a 4°C. Os fragmentos de tecido remanescentes foram mantidos sobre gelo para o isolamento de células T intraepiteliais. As criptas foram lavadas 3 vezes em DMEM/F12 Advanced completo. As criptas foram recolocadas em suspensão em extrato de membrana basal (BME; Cultrex®) e plaqueadas em densidades diferentes e colocadas durante 30 minutos dentro de uma incubadora umidificada a 37°C e 5% de CO2. Na solidificação do BME inibidor Rho cinase Y-27632
51 / 75 suplementado com meio de organoide colônico humano foi adicionado e substituído a cada 3 a 4 dias. Os organoides formados a partir dos folículos foram trocados a cada 7 a 10 dias.
[00210] Subsequentemente, a cultura de organoides passou pela análise primária usando sequenciamento de genoma inteiro, sequenciamento de mRNA e formação de perfil de peptidoma. Isolamento de células T intraepiteliais a partir de tecido de cólon normal para cultura de célula T.
[00211] Os fragmentos de tecido mantidos do isolamento da cripta colônica foram colocados dentro de uma placa de Petri e cortados em pedaços muito finos (< 1 mm) usando fórceps, tesouras e bisturi. Os fragmentos de tecido foram transferidos para dentro de um tubo canônico de 50 mL e lavados 3 vezes em 20 mL de meio RPMI 1640 (Gibco®) completado com 10% de FCS e Penicilina/Estreptomicina para remover qualquer EDTA remanescente e inibir. O meio foi removido com uma pipeta depois que os pedaços de tecido sedimentaram até o fundo do béquer. Os pedaços de tecido foram depois incubados em 10 mL de meio RPMI 1640 contendo 1 mg/mL de colagenase 1A, 10 U/mL de DNase I (todos da Sigma-Aldrich) e inibidor da Rho cinase Y-27632 durante 1 hora a 37°C sob agitação. 2 mL de FCS foram adicionados à suspensão de célula e a suspensão inteira foi filtrada através de uma peneira de célula de 100 μm. A suspensão de célula única foi centrifugada a 300×g durante 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi removido e a pelota de célula foi lavada duas vezes em meio RPMI 1640 completo. A suspensão de célula única foi criopreservada em nitrogênio líquido em meio de congelamento (Meio de Congelamento de Cultura de Célula Recovery® ou 10% de DMSO em uma mistura 1:1 de FCS e DMEM/F12 Advanced, todos da Gibco®) ou adicionalmente processada para a cultura de célula T. Exemplo 3. Digestão de tecido de câncer colorretal para tumor organoide e culturas de célula T; derivação de tumoroides de câncer colorretal.
52 / 75
[00212] Este exemplo mostra o processamento de amostras cólon canceroso, para o desenvolvimento de culturas tumoroides, assim como o isolamento de células imunes a partir de amostras de cólon cancerosas.
[00213] O tecido tumoral é digerido para fabricar uma suspensão de célula única contendo células de tumor epitelial para a derivação de tumoroides assim como linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) para culturas de célula T. Digestão de tecido de câncer colorretal para culturas de tumor e célula T.
[00214] As biópsias de tumor foram cortadas em tiras finas de aproximadamente 1 a 2 mm. Uma tira é fixada em formaldeído a 4% para análise histológica e cada tira é rapidamente congelada (em gelo seco ou nitrogênio líquido) e armazenada a –80°C para a análise de gene e/ou proteína. As tiras remanescentes foram adicionalmente cortadas usando fórceps até que a massa tumoral pareceu viscosa. A massa tumoral foi incubada e 10 mL de meio DMEM/F12 Advanced completo contendo 1 mg/mL de Colagenase II, 10 μg/mL de hialuronidase e inibidor da Rho cinase Y-27632 durante 1 hora a 37°C sob agitação. Depois da incubação, 2 mL de FCS foram adicionados à pasta fluida de massa tumoral e a suspensão de célula foi filtrada através de uma peneira de célula de 100 μm e centrifugada a 300×g durante 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi removido e a pelota de célula foi lavada duas vezes em meio DMEM/F12 Advanced completo. A suspensão de célula única foi criopreservada em nitrogênio líquido em meio de congelamento (Meio de Congelamento de Cultura de Célula Recovery® da Gibco® ou 10% de DMSO em uma mistura 1:1 de FCS e DMEM/F12 Advanced) ou adicionalmente processada para a derivação de tumoroides de câncer colorretal e cultura de célula T. Derivação de tumoroides de câncer colorretal.
[00215] Uma fração da suspensão de tumor de célula única foi recolocada em suspensão em BME e plaqueada em diluições diferentes. BME
53 / 75 foi deixado solidificar durante 30 minutos em um incubador umidificado a 37°C e 5% de CO2. As células embutidas em BME foram cultivadas em meio tumoroide de câncer colorretal humano suplementado com Inibidor da Rho cinase Y-27632. O meio foi renovado a cada 3 a 4 dias. Organoides formando a partir da célula única de tumor foram trocados a cada 7 a 10 dias. Exemplo 4. Análise de organoides e tumoroides.
[00216] A microscopia de campo brilhante foi realizada para a análise e confirmou suspensão de célula única bem sucedida das amostras organoides e tumoroides. As imagens de campo brilhante representativas de organoides e tumoroides colônicos normais derivados de amostras de paciente são mostradas na Figura 1B.
[00217] Como descrito acima, as criptas colônicas foram embutidas dentro de meio organoide colônico normal (extrato de membrana basal (BME) e cultivados com meio contendo R-espondina-1, Noggin, meio condicionado Wnt3A, suplemento B27 sem vitamina A, nicotinamida, N- acetilcisteína, EGF, inibidor de TGF-β A-83-01, gastrina, inibidor de p38 MAPK SB202190 e prostaglandina E2). Os organoides colônicos normais desenvolveram dentro de 1 semana e foram trocados semanalmente depois disso (painel de topo).
[00218] As suspensões de célula única de amostras de câncer colorretal foram embutidas dentro de extrato de membrana basal (BME) e cultivadas com meio contendo meio tumoroide (R-espondina-1, Meio condicionado de Noggin, suplemento B27 sem vitamina A, nicotinamida, N-acetilcisteína, EGF, inibidor de TGF-β A-83-01, gastrina, inibidor p38 MAPK SB202190 e prostaglandina E2). Os tumoroides formados dentro de 1 semana e foram trocados semanalmente depois disso (painel de fundo).
[00219] Como pode ser observado em cada painel da Figura 1B, a suspensão de célula única de organoide, tumoroide e células imunes bem resolvida é obtida.
54 / 75 Exemplo 5. Isolamento de linfócitos a partir de suspensões de célula única e culturas de expansão de célula T.
[00220] Este exemplo mostra o processamento adicional de células imunes, seguido pela geração de culturas de expansão de célula imune.
[00221] 5 mL de Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) puro foram adicionados aos tubos canônicos de 15 mL. As suspensões de célula única obtidas a partir de digestões de cólon normal ou tecido de câncer colorretal foram recolocadas em suspensão em 5 mL de meio RPMI 1640 completo e cuidadosamente colocadas no topo da camada de Ficoll-Paque PLUS clara. As amostras foram centrifugadas a 800×g durante 20 minutos na temperatura ambiente. As células da camada acima da camada de Ficoll-Paque PLUS clara contendo células T foram coletadas, recolocadas em suspensão em 10 mL de meio RPMI 1640 completo e centrifugadas a 300×g durante 5 minutos. A pelota de célula foi recolocada em suspensão em meio RPMI 1640 completo e contada. A suspensão de célula única foi criopreservada em nitrogênio líquido em meio congelante (Meio Congelante de Cultura de Célula Gibco® Recovery® ou 10% de DMSO em uma mistura 1:1 de FCS e DMEM/F12 Advanced) ou imediatamente usada para culturas de expansão. Para culturas de expansão de célula T, os linfócitos foram cultivados sobre plástico de cultura de célula revestido com anti-CD28 (Miltenyi) em uma concentração de 1 × 106 células viáveis totais em 1 mL de meio RPMI 1640 completado com Penicilina/Estreptomicina, 5% de soro AB humano e 6000 IU de IL-2 humana recombinante (Miltenyi) em um incubador umidificado a 37°C e 5% de CO2. O meio foi renovado depois de 1 semana.
[00222] Além disso ou alternativamente, O sangue periférico é processado para purificar as células mononuclear de sangue periférico enriquecidas quanto aos linfócitos de sangue periférico (PBLs) e células T.
[00223] Análise primária é realizada pelo sequenciamento de receptor de célula T (TCR) e imunofenotipagem das células T (conforme a Figura 1C e
55 / 75 Exemplo 6 abaixo). Exemplo 6. Análise de células imunes isoladas.
[00224] A Figura 1C mostra imagens de campo brilhante representativas de crescimento clonal de linfócitos intraepiteliais (IELs) e linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) derivados de amostras de paciente (painéis esquerdos).
[00225] A análise de citometria de fluxo mostra a expansão robusta de células T auxiliares CD4+ (Th) e células T citotóxicas CD8+ (CTLs). As suspensões de célula única da mucosa colônica normal ou tecido de câncer colorretal foram mantidas em meio de célula T contendo interleucina-2 (IL- 2). O crescimento clonal das células T foi perceptível dentro de 1 a 2 semanas (painéis esquerdos).
[00226] Consequentemente, a análise de células imunes isoladas revela que as células imunes permanecem funcionais e biologicamente representativas. Exemplo 7. Passagem de organoides e tumoroides epiteliais.
[00227] Este exemplo demonstra a manutenção de culturas organoides e tumoroides.
[00228] As culturas de organoide foram rompidas (‘divididas’) pela pipetagem de gotas de BME para cima e para baixo o meio de crescimento usando uma micropipeta de 1 mL de volume (isto é, P1000 Gilson). Os organoides rompidos foram centrifugados a 500×g durante 5 minutos. Os organoides pelotizados foram recolocados em suspensão em TrypLE (Gibco®) e incubados durante 5 a 15 minutos a 37°C em um banho de água. Os organoides foram dissociados em células únicas usando pipetas de Pasteur de vidro polidas em chama pré-umedecidas.
[00229] Os organoides dissociados foram recolhidos em um excesso de DMEM/F12 Advanced completo e centrifugados a 500×g durante 5 minutos. As células epiteliais únicas foram replaqueadas em BME a uma densidade
56 / 75 desejada e colocadas em incubadora umidificada a 37°C e 5% de CO2. Na solidificação de BME, o respectivo meio de cultura (meio de organoide colônico humano ou meio tumoroide de câncer colorretal humano) suplementado com inibidor da Rho cinase Y-27632 foi adicionado. O meio foi renovado a cada 3 a 4 dias. Os organoides formando a partir da célula única de tumor foram trocados a cada 7 a 10 dias.
[00230] A análise primária é realizada pelo sequenciamento de RNA mensageiro (mRNA) de célula única das células presentes nas suspensões de célula única de epitélio colônico normal e epitélio tumoral. Exemplo 8. Geração de coculturas de organoide e coculturas de tumoroide.
[00231] Este exemplo demonstra a cocultura de organoides e tumoroides do Exemplo 5 com culturas de célula imune do Exemplo 4.
[00232] Na divisão, (como no Exemplo 7 acima), 5000 células foram plaqueadas em BME e cultivadas durante 3 a 4 dias em meio de cólon humano ou meio tumoroide de câncer colorretal humano. Na cultura, o meio foi removido e gotas de BME/Matrigel® foram rompidas usando Solução de Recuperação de Célula® (Corning) a seguir de 25 minutos de incubação em gelo. As células são subsequentemente centrifugadas (5 minutos a 500×g) e recolocadas em suspensão em meio de célula T suplementado com 100 IU/mL de IL-2 humano recombinante antes de misturar com células T.
[00233] As células T foram contadas e levadas a uma concentração de 100000 células/mL em meio de célula T completo suplementado com 100 IU/mL de IL-2 humana recombinante. 100 μL de suspensão de tumoroide de câncer epitelial foram misturados com 100 μL de suspensão célula T em uma placa de 96 reservatórios. 22 μL de colágeno de cauda de rato (Gibco®) foram dissolvidos na mistura para atingir uma concentração de 10% de colágeno na suspensão. As células foram repousadas a 37°C e 5% de CO2 durante 30 minutos para deixar as células e colágeno sendimentarem antes da análise.
57 / 75
[00234] Uma cocultura de prova de princípio de organoides colônicos normais e células T CD3+ alogênicas em gotas de extrato de membrana basal (BME) é mostrada na Figura 2.
[00235] A Figura 2A mostra um esquemático do procedimento. Como descrito acima, organoides colônicos normais foram liberados da gota de BME usando Solução de Recuperação de Célula e lavados em DMEM/F12 Advanced completado. As células T CD3+ expandidas foram colhidas da cultura e rotuladas com corante verde (Traçador de Célula Vybrant CFDA SE). Os organoides colônicos e células T rotuladas foram misturados em meio de organoide colônico humano e embutidos na gota e BME. As coculturas foram mantidas em meio de organoide colônico humano contendo IL-2 durante 60 h. As coculturas foram liberadas de BME usando Solução de Recuperação de Célula e fixadas em paraformaldeído a 4%. As montagens inteiras fixadas foram tingidas com Faloidina para marcar a actina polimerizada e DAPI para rotular os núcleos. Montagens inteiras foram montadas sobre lâmina em meio de montagem antiesmaecimento ProLong Gold e imageadas em um microscópio confocal Leica SP8X.
[00236] A projeção máxima de imagens de pilha z de coculturas de organoides colônicos é mostrada na Figura 2B. F-actina em organoides é rotulada em cinza escuro e as células T são rotuladas em cinza claro. O inserto no painel direito mostra uma célula T infiltrando o epitélio colônico.
[00237] Uma reconstrução tridimensional de um organoide colônico normal e células T é mostrado na Figura 2C.
[00238] Como observado na Figura, o organoide mostra o nível esperado de organização estrutural e interage com células imunes com similaridade perceptível a um sistema in vivo. Exemplo 9. Análise de coculturas pelo imageamento, citometria de fluxo e secreção de citocina.
[00239] Este exemplo analisa coculturas de organoides e cocultura de
58 / 75 tumoroides produzidas no Exemplo 6, para investigar os mecanismos pelos quais os componentes da cocultura estão interagindo. Análise de imagem.
[00240] A análise de imagem é usada para determinar a porcentagem de tingimento de células nas coculturas.
[00241] Antes da cultura, as células T foram rotuladas com corante traçador de célula (por exemplo, CFSE, Molecular Probes®). Os organoides foram rotulados com anticorpos EPCAM anti-ser humano de camundongo diretamente conjugados (BD Bioscience) ou corante traçador de célula (diferente daquele para a rotulação de célula T). As células foram imageadas durante a noite (12 a 18horas) a 37°C e 5% de CO2 usando um microscópio de varredura a laser confocal (por exemplo, Leica SP8X; ou qualquer tipo de microscópio de fluorescência com lapso de tempo de imageamento de célula viva) na presença de um corante para marcar as células apoptóticas (por exemplo, NucRed Dead®, Molecular Probes). Subsequentemente, as imagens com lapso de tempo foram analisadas usando software Imaris (Bitplane) e a porcentagem de organoides corados foi calculada pela avaliação da porcentagem de voxéis onde a colocalização do EPCAM e marcador de célula morta podem ser visualizados. Análise citométrica de fluxo
[00242] A análise citométrica de fluxo é usada para avaliar os marcadores de superfície presentes nas células imunes presentes nas coculturas.
[00243] Na divisão (como no Exemplo 7 acima), 5000 células foram plaqueadas em BME e cultivadas durante 3, 4 dias no meio de cólon humano ou meio tumoroide de câncer colorretal humano. Na cultura, o meio foi removido e gotas de BME/Matrigel® foram rompidas usando Solução de Recuperação de Célula® (Corning) a seguir de 25 minutos de incubação em gelo. As células são subsequentemente centrifugadas (5 minutos a 500×g) e
59 / 75 recolocadas em suspensão em meio de célula T suplementado com 100 IU/mL de IL-2 humana recombinante antes de misturar com as células T.
[00244] As células T foram contadas e levadas para uma concentração de 500000/mL em meio de célula T completo suplementado com 100 IU/mL de IL-2 humana recombinante. 100 μL de suspensão de tumoroide de câncer epitelial foram misturados com 100 μL de suspensão de célula T em uma placa de 96 poços. As células foram cocultivadas durante a noite, colhidas e as suspensões de célula única foram fabricadas usando TripLE (Gibco®). As suspensões de célula única foram fixadas com 4% de paraformaldeído (Sigma-Aldrich) e permeabilizadas usando um tampão contendo 0,5% de saponina (BD Bioscience). Alternativamente, kits comercialmente disponíveis (por exemplo, BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Kit, BD Bioscience) foram usados. As células foram subsequentemente incubadas com anticorpos para citometria de fluxo contra CD3, EPCAM, interferon (IFN)γ e/ou fator de necrose de tumor (TNF)α, junto com um anticorpo reconhecendo Caspase-3 ativa (todos da BD Bioscience) seguido pela análise citométrica de fluxo. Análise de secreção de citocina.
[00245] Os organoides foram divididos, plaqueados, cultivados e preparados para cocultura como descrito acima. As células T foram contadas e levadas a uma concentração de 500000/mL em meio de célula T completo suplementado com 100 IU/mL de IL-2 humana recombinante. 100 μL de suspensão de tumoroide de câncer epitelial foram misturados com 100 μL de suspensão de célula T em uma placa de 96 poços. 72h depois do início da cultura o sobrenadante foi colhido para avaliação da produção de citocina pela célula T (por exemplo, IFNγ, TNFα) pelo ELISA. O sobrenadante de cultura foi armazenado a –20°C até a análise. Exemplo 10. Imageamento ao vivo de cocultura de tumoroide mostra motilidade aumentada de células T quando as coculturas são feitas com
60 / 75 colágeno I de cauda de rato.
[00246] Este exemplo testa o efeito de componentes estruturais diferentes usados no desenvolvimento de coculturas, sobre a motilidade das células imunes que resultam.
[00247] Um esquemático do procedimento é mostrado na Figura 3A. Como descrito acima, tumoroides foram liberados da gota de BME usando Solução de Recuperação de Célula e lavados em DMEM/F12 Advanced completo. As células T CD8+ alogênicas isoladas de amostras de sangue periférico foram rotuladas com corante verde (Traçador de Célula Vybrant CFDA SE).
[00248] Os tumoroides e células T foram misturados com meio de organoide colônico humano contendo IL-2 e BME a 10% ou colágeno I de cauda de rato e imageados ao vivo durante 80 h em um microscópio confocal Leica SP8X equipado com uma câmera de imageamento ao vivo a 37°C e atmosfera de 5% de CO2.
[00249] A Figura 3B mostra imagens compósitas representativas das coculturas de tumoroide. O canal de campo brilhante e o canal fluorescente verde foram imagens compósitas fundidas geradas. O caminho de trilha da célula T foi traçada usando software Imaris.
[00250] A quantificação do comprimento de trilha de células T em ambas as condições, como representado graficamente na Figura 3C, mostra caminho de trilha significantemente mais longo de células T cocultivadas em colágeno a 10% comparado com BME a 10%.
[00251] Os resultados sugerem que um sistema tipo mais in vivo pode ser desenvolvido usando-se colágeno I de cauda de rato na cocultura, que produz trilhas mais longas e assim preserva a motilidade da célula imune. Exemplo 11: Geração de cocultura clonais de tumoroides.
[00252] Este exemplo ilustra a geração de tumoroides clonais positivos e negativos quanto ao antígeno leucocitário humano (HLA) tipo A2.
61 / 75
[00253] Um esquemático do procedimento é mostrado na Figura 4A. Os tumoroides foram dissociados em células únicas usando a digestão enzimática TrypLE. As células únicas foram tingidas com anticorpo anti- HLA-A2 e purificadas com base na imunorreatividade anti-HLA-A2. As células tumorais HLA-A2+ve e HLA-A2-ve foram embutidas e mantidas para gerar tumoroides.
[00254] A análise citométrica de fluxo na Figura 4B mostrou o estabelecimento de linhagens de tumoroides HLA-A2+ve ou HLA-A2-ve puras. Os controles são a linhagem de célula HLA-A2+ve JY assim como as linhagens de organoide colônico normal derivadas das mesmas amostras de paciente como as linhagens de tumoroide HLA-A2+ve ou HLA-A2-ve. Exemplo 12. Ensaio para o extermínio específico de antígeno mediado pela célula T citotóxica de tumoroides de câncer epitelial.
[00255] Este exemplo envolve realizar um ‘ensaio de extermínio de célula’ em uma cocultura de tumoroide. Este é um exemplo do método da invenção aplicado às células T αβ experienciadas com neoantígeno para tratar câncer.
[00256] Os tumoroides de câncer colorretal ou organoides de tecido normal foram divididos e mantidos como células únicas como descrito acima. 10000 a 50000 células T (TILs ou derivadas de PBMC) foram cocultivadas com 50000 células únicas derivadas de tumoroide/organoide na presença de estimulação com anticorpos αCD28 durante 2 semanas em meio de célula T humana e 200 IU/mL de IL-2 humana recombinante. O meio foi renovado a cada 2 a 3 dias. As células expandidas foram subsequentemente clonalmente expandidas na presença de células alimentadoras irradiadas (1 × 106/mL, mistura de PBMCs de 3 doadores diferentes e 1 × 105/mL de células JY e/ou LAZ509) em meio completo de Ijssel suplementado com 200 IU/mL de IL-2 humana recombinante. Alternativamente, as células T foram classificadas por FACS diretamente das placas de prep de célula única TIL ou IEL nas placas
62 / 75 contendo (1 × 106/mL, mistura de PBMCs de 3 doadores diferentes e 1 × 105/mL de células JY e/ou LAZ509) em meio completo de Ijssel. Os clones expandidos foram depois subsequentemente cocultivados com organoides de tumor pulsados com neoantígeno como descrito acima.
[00257] Os neoantígenos de tumor putativos identificados foram carregados nos organoides de câncer epitelial como segue. Gotas de BME/Matrigel® nas quais organoides foram cultivados foram rompidas recolocando-se em suspensão o meio nas placas. Os peptídeos relevantes foram adicionados aos organoides e os organoides foram cultivados durante 2 h a 37°C e 5% de CO2. As células T clonalmente expandidas foram depois cocultivadas com organoides autólogos para imageamento, análise citométrica de fluxo e/ou análise de secreção de citocina como descritas acima.
[00258] Um ensaio de extermínio para reatividade antitumoroide das células T experienciadas em antígeno é mostrado na Figura 5 e um esquemático do procedimento é mostrado na Figura 5A. Os tumoroides HLA-A2+ve ou HLA-A2-ve foram pulsados durante 2 h com o peptídeo do tumor de Wilms (WT)1 restringido por HLA-A2. As células T CD8+ transgênicas em TCR abrigando um TCR específico de peptídeo WT1 foram depois cocultivadas durante 48h com tumoroides HLA-A2+ve ou HLA-A2-ve pulsados com peptídeo WT1.
[00259] As imagens de campo brilhante representativas de coculturas depois de 48h são mostradas na Figura 5B.
[00260] A morte significante é observada para tumoroides HLA-A2+ve pulsados apenas com peptídeos WT1. Todas as outras condições, isto é, tumoroides HLA-A2+ve ou HLA-A2-ve não pulsados com peptídeos WT1 e tumoroides HLA-A2-ve pulsados com peptídeo WT1, mostraram crescimento normal.
[00261] Os resultados sugerem que o peptídeo de neoantígeno WT1 é eficaz em exterminar tumoroides (e possivelmente em tratar cânceres) com
63 / 75 um dos fenótipos HLA-A2+ve, mas não para outros fenótipos. Exemplo 13. Ensaio de viabilidade celular quanto à reatividade antitumoroide de células T experienciadas em antígeno com e sem a inibição do ponto de checagem.
[00262] Um ensaio de viabilidade celular quanto à reatividade antitumoroide de células T αβ experienciadas com antígeno com e sem inibição do ponto de checagem é mostrado na Figura 6. Este é um exemplo do método da invenção aplicado a um agente químico para tratar câncer.
[00263] Um Esquemático do procedimento é mostrado na Figura 6A. A cocultura foi realizada como descrita na Figura 5A mas apenas durante 12h e incubada com e sem inibidor de ponto de checagem anti-PD1. O ensaio de viabilidade celular foi realizado usando o kit de Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter Glo (Promega) de acordo com as instruções do fabricante.
[00264] A Figura 5B mostra a viabilidade celular de tumoroides normalizada para os controles de peptídeo. As coculturas foram portanto usadas com êxito para mostrar que a viabilidade celular de tumoroides foi mais baixa quando uma combinação de HLA-A2, IL-2 e inibidor de ponto de checagem anti-PD1 foram presentes, isto é, que o tratamento com o inibidor de ponto de checagem anti-PD1 pode ser mais potente quando aplicado às subpopulações de paciente exibindo tipos IL-2 e HLA-A2 de câncer. Exemplo 14. Ensaio para determinar efeito diferencial sobre a ativação de células T pela coculturas de organoide/tumoroide.
[00265] Este exemplo ilustra que a presença de células T γδ ativa tumoroides em cocultura em uma maneira não específica de antígeno, onde as mesmas não ativam organoides em cocultura além de uma linha de base de nenhuma célula T. IFN-γ foi usado para determinar a ativação.
[00266] Um esquemático do procedimento é mostrado na Figura 7A. Os tumoroides foram liberados da gota de Matrigel® usando Dispase e
64 / 75 passados sobre filtros de 70 µm e 20 µm subsequentemente. Os organoides foram recuperados do filtro de 20 µm, contados e plaqueados. Os tumoroides e células T foram misturadas com meio de organoide colônico humano contendo RPMI, IL-2 e 5% de Matrigel® e incubados a 37°C e atmosfera de 5% de CO2. Depois de 24h de incubação os organoides foram imageados usando um microscópio invertido de campo brilhante.
[00267] As imagens de campo brilhante representativas das coculturas de tumoroide e coculturas de organoides são mostradas nas Figuras 7B e 7C (respectivamente).
[00268] Os níveis de quantificação de IFN-γ das coculturas é mostrado na Figura 7D. Exemplo 15. Imageamento ao vivo de cocultura de tumoroides para avaliar a associação e a capacidade de extermínio de célula.
[00269] As células T foram investigadas quanto à sua capacidade de exterminar células e a sua variação com diferentes subtipos de célula T e para diferentes combinações de célula T/antígeno de tumor.
[00270] Um esquemático do procedimento é mostrado na Figura 8A. Os tumoroides foram liberados da gota de Matrigel® usando Dispase e passados em filtros de 70 µm e 20 µm subsequentemente. Os organoides foram recuperados do filtro de 20 µm, contados e plaqueados. As células T cultivadas rotulada com corante vermelho escuro (CellVue Claret). Os tumoroides e células T foram misturados com meio de organoide colônico humano contendo RPMI, IL-2 e 5% de Matrigel® e imageados ao vivo durante 68h em um microscópio confocal Leica SP8X equipado com uma câmera de imageamento ao vivo a 37°C e 5% de atmosfera de CO2.
[00271] As imagens compósitas representativas das coculturas de tumoroide contendo células T não alvejadoras são mostradas na Figura 8B. O canal de campo brilhante e canal de fluorescência vermelho escuro foram fundidos para gerar imagens compósitas.
65 / 75
[00272] As imagens compósitas representativas das coculturas de tumoroides contendo células T alvejadoras são mostradas na Figura 8C. O canal de campo brilhante e o canal de fluorescência vermelho escuro foram fundidos para gerar imagens compósitas. Exemplo 16. Modelagem da imunomodulação de câncer usando cultura de organoides epiteliais.
[00273] Aqui utilizamos tecnologia organoide para estudar interações imune-câncer e avaliar a imunomodulação pelo câncer colorretal (CRC). A formação de perfil transcricional e citometria de fluxo revelou que organoides mantém expressão diferencial de moléculas imunomodulatórias presentes em tumores primários. Finalmente, estabelecemos um método para modelar o extermínio de célula epitelial específica de antígeno e imunomodulação de câncer in vitro usando organoides de CRC cocultivados com células T citotóxicas (CTLs).
[00274] CRC está entre os cânceres mais comuns no mundo todo. Embora estágios iniciais de CRC sejam altamente tratáveis pela remoção cirúrgica, os estágios avançados são usualmente incuráveis. CRC surge através de um processo de etapas múltiplas a partir de lesões pequenas do epitélio do intestino grosso. Estas lesões crescem em adenomas com baixo grau de displasia que progridem em displasia de grau alto, eventualmente dando origem a carcinomas infiltrantes. As mutações genéticas nos caminhos de sinalização tais como o caminho de sinalização canônico Wnt são a base molecular de CRC4. Entretanto, a interação do tumor com o seu microambiente é uma outra marca crítica. As células cancerosas remodelam o seu microambiente (por exemplo, fibroblastos, a vasculatura e células imunes) para sustentar o crescimento do tumor. Infiltrar células imunes (ICs) tais como CTLs ou macrófagos desempenha um papel crucial pela geração de respostas imunes diferentes tais como citotoxicidade antitumor (o primeiro) ou inflamação crônica na promoção de tumor (o último). Como tal, escapar do
66 / 75 sistema imune vigilante foi reconhecido como uma das marcas de câncer. As células cancerosas passam por um processo chamado de imunoedição e respostas antitumor silenciosas, por exemplo, pela prevenção da ativação de célula T através da estimulação de receptores superficiais de célula inibidora tais como antígeno associado a CTL (CTLA)-4 ou morte programada (PD)1. Superando esta imunomodulação ativa pelas células tumorais tem se tornado um alvo terapêutico principal. Entretanto, a heterogeneidade tumoral, tal como infiltração de CTL diferencial ou expressão diferencial de fatores imuno inibidores, influenciaria a eficiência terapêutica de fármacos antitumor pela mediação da resistência a fármaco. Desenvolver sistemas modelos ex vivo para distinguir a comunicação do tumor com o seu ambiente é, portanto, de enorme importância.
[00275] A cultura de organoides cultivados a partir de tecidos epiteliais diferentes serve como uma excelente ferramenta para estudar homeostase e doença teciduais. Adicionalmente, biobancos de organoides de sistemas de órgão epitelial múltiplos foram estabelecidos e organoides derivados de tumor foram usados com êxito como plataformas para triagens de fármacos diferentes para prognosticar a resposta de paciente. Aqui, descrevemos o estabelecimento de um método para modelar o extermínio de célula epitelial específica de antígeno e imunomodulação de câncer in vitro usando tumoroides cocultivados com células imunes (especificamente, organoides de CRC cocultivadas com CTLs).
[00276] Primeiro avaliamos se organoides de CRC expressaram moléculas imunomoduladoras em culturas expandidas de longa duração estabelecidas. Para esta finalidade, comparamos a expressão de gene de imunomoduladores específicos de célula T em organoides de CRC aos níveis de expressão encontrados em organoides colônicos normais usando um conjunto de dados de transcriptoma gerados usando nosso ‘biobanco de organoide vivo’ de pacientes com CRC (van de Wetering, M. et al.
67 / 75 Prospective derivation of a living organoid biobank of coloretal cancer patients. Cell 161, 933-945, doi:10.1016/j.cell.2015.03.053 (2015)). Em média, a transcrição de genes associados com a estimulação de célula T tais como TNFSF4 ou TNFSF9 não foi alterado nos organoides de CRC comparados aos organoides colônicos normais) Figura 9A. Entretanto, a expressão de genes de antígeno leucocitário humano (HLA) HLA-A e HLA-C, codificando as moléculas da classe do complexo de histocompatibilidade principal (MHC)-I que apresentam antígenos para as células T, foram significantemente infrarreguladas em organoides de CRC Figura 9A, um fenômeno bem descrito encontrados em cânceres. A expressão de genes associados com a inibição da função de célula T foi significantemente suprarregulada tal como BTLA, significantemente infrarregulada tal como CD80, CD86 ou LGALS9 ou não alterada de modo algum tal como CD274 (codificando PD-L1), PDCD1LG2 (codificando PD-L2) Figura 9A. Quando da avaliação de níveis de expressão de moléculas imunomodulatórias nos organoides individuais, organoides de CRC amplamente agruparam juntos mostrando a infrarregulagem heterogênea de HLA-A, HLA-C e LGALS9 comparados aos organoides colônicos saudáveis Figura 9B. Entretanto, a expressão de genes imunoinibidores CD274 e PDCD1LG2, por exemplo, foi altamente suprarregulada em alguns organoides de CRC em comparação com a cultura de organoides colônicos normal emparelhados, refletindo a preservação previamente informada da heterogeneidade tumoral em organoides Figura 9B. Estas assinaturas moleculares proveem uma base para investigação adicional da imunogenicidade tumoral e a sua associação com outras características do tumor.
[00277] Quatro dos genes mais habitualmente mutados no CRC são APC, P53, KRAS e SMAD4, refletindo a progressão escalonada do epitélio intestinal normal em um carcinoma metastático. A introdução destas mutações cancerosas dentro das culturas de organoide intestinal humano
68 / 75 usando repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas agrupadas (CRISPR)/Cas9 demonstraram que este processo pode ser imitado in vitro e no xenotransplante em camundongos. Usando organoides colônicos portando uma ou mais destas mutações cancerosas, investigamos se a suprarregulagem de PD-L1 foi associada com uma certa situação mutacional. Adicionalmente, expusemos organoides mutantes e a sua linhagem de organoide de controle do tipo selvagem ao interferon (IFN)-γ, que é secretado pelas células T e pode deflagrar a expressão aumentada de moléculas imunomoduladoras tais como PD-L1. Subsequentemente, avaliamos a expressão de PD-L1 pela reação da cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e citometria de fluxo Figura 9C-D. Na ausência de IFN-γ, organoides carregando mutações triplas (APCKO/KO, P53KO/KO, KRASG12D/+) e quádruplas (APCKO/KO, P53KO/KO, KRASG12D/+ e SMAD4KO/KO) mostraram expressão de gene CD274 mais baixa em comparação com organoides de controle do tipo selvagem Figura 9C. Em toda parte, a expressão de PD-L1 foi baixa nas linhagens de organoide não tratado Figura 9C-D. Entretanto, a expressão de PD-L1 foi dramaticamente suprarregulada em organoides tratados com IFN-γ tanto ao nível de transcrito quanto ao de proteína Figura 9C-D. Estes dados demonstram que os organoides de CRC expressam imunomoduladores e que esta expressão é regulada em um modo similar como anteriormente mostrado para tecido in vivo.
[00278] Em seguida, visamos estabelecer um sistema de cocultura para organoides de CRC e CTLs para modelar o extermínio específico de antígeno de células tumorais in vitro. Para isto, usamos células T αβ, portando, um receptor de célula T (TCR) transgênico reconhecendo um peptídeo derivado de tumor de Wilms (WT)1 restrito a HLA-A2. Primeiro triamos organoides de CRC do ‘biobanco vivo’ assim como organoides de CRC recém-gerados para a expressão de HLA-A2 usando citometria de fluxo. Verificamos três linhagens de organoide CRC que mostraram infrarregulagem parcial de HLA-
69 / 75
A2 Figura 4B.
Fomos capazes de purificar os organoides de CRC HLA-A2+ e HLA-A2– e estabelecemos com êxito culturas de ambas as populações Figura 11B.
Confirmamos a infrarregulagem estável de MHC-I em organoides de CRC HLA-A2–, visto que a estimulação com IFN-γ não deflagrou a re- expressão de HLA-A2 Figura 10B.
Em seguida, pulsamos estas linhagens de organoide CRC com peptídeo WT1 e, subsequentemente, as cocultivamos durante 48horas com células T específicas de peptídeo.
A seguir da cocultura, verificamos que os organoides de CRC HLA-A2– sobreviveram independente de se pulsados com o peptídeo ou não Figura 11C.
Entretanto, apenas os organoides de CRC HLA-A2+ sem incubação de peptídeo anterior sobreviveram à cocultura Figura 11C.
Os organoides de CRC HLA-A2+ pulsados com peptídeo foram eficazmente mortos pelas células T específicas de peptídeo para prover uma prova de princípio de que os organoides podem ser utilizados para estudar respostas antitumor pelas células T citotóxicas in vitro.
Para confirmar adicionalmente a especificidade de antígeno em nosso sistema de ensaio de ‘extermínio’, melhoramos o nosso método de cocultura pela transfecção de organoides de CRC HLA-A2+ com uma construção expressando histona H2B rotulada com mNeonGreen e tingindo as células T com violeta CellTracker para permitir o rastreamento de longa duração de ambos os tipos de célula (Métodos, abaixo). Depois pulsamos os organoides de CRC HLA-A2+ com o peptídeo WT1 ou com um peptídeo derivado de EBV (Métodos) e cocultivamos os organoides com células T carreando um TCR específico de WT1 ou um de EBV.
Aqui, apenas organoides pulsados com o peptídeo cognato foram eficientemente exterminados pelas células T Figura 11D.
Testando quanto à produção de IFN-γ pelas células T na cocultura usando ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) confirmamos o extermínio de organoide específico de antígeno pelas células T Figura 11E . De modo a melhor seguir a cinética do extermínio de organoide, aplicamos um corante fluorescente (NucRed Dead 647; Métodos),
70 / 75 que especificamente tinge células apoptóticas e realizamos o imageamento confocal vivo na cocultura Figura 11F.
Depois quantificamos o extermínio de organoide pela avaliação da colocalização do corante NucRed Dead com H2B-mNeonGreen (Métodos). A colocalização significante de ambos os rótulos e, consequentemente, o extermínio de organoide, foi apenas observada quando organoides de HLA-A2+ pulsados com peptídeo foram cocultivados com as respectivas células T específicas de peptídeo Figura 11G.
Adicionalmente, as células T infiltrando dentro do epitélio dos organoides seriam prontamente detectadas nesta condição de cocultura Figura 11H.
Finalmente, investigamos se usando esta cocultura a modulação do sistema de resposta imune aos tumores imunossupressivo poderia ser modelada.
De fato, a adição de um anticorpo bloqueador contra PD-1 (αPD-1) realçou o extermínio do tumor e a produção de IFN-γ em organoides estimulados por IFN-γ expressando PD-L1 Figura 11I a J.
Isto não foi observado quando os organoides não foram estimulados com IFN-γ e, consequentemente, não expressaram PD-1. Em conclusão, as células T eficientemente exterminaram organoides de CRC cocultivados em uma maneira específica de antígeno.
Além disso, a inibição de célula T e o alívio subsequente desta inibição usando αPD-1 seriam modelados.
Aqui, demonstramos que os organoides epiteliais podem ser usados para recapitular fielmente a interação entre tecido tumoral e o sistema imune.
Também, usando nosso ensaio de cocultura, ajustamos uma primeira etapa na reconstrução do microambiente tumoral in vitro.
Adicionalmente a adição de outros componentes deste microambiente (tais como fibroblastos, células exterminadoras naturais, células suppressoras derivadas de mieloide, células B) pode esclarecer sobre as interações complexas entre os tipos diferentes de célula levando à evasão imune do tumor.
Por último, este sistema de cocultura pode ser usado como uma ferramenta para triagens de fármaco que testem a aplicabilidade de certas imunoterapias, por exemplo, célula T de receptor de antígeno quimérico
71 / 75 (CAR) ou transgênica em TCR, anticorpos indutores da citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) direcionados ao tumor, para tumores diferentes e pacientes diferentes. Métodos Material humano e consentimento informado
[00279] Os tecidos colônicos (tanto cólon normal quanto tecido tumoral) foram obtidos do Departments of Surgery and Pathology of the Diakonessenhuis Hospital, Utrecht, Países Baixos. Todos os pacientes incluídos neste estudo foram diagnosticados com CRC. O consentimento informado foi assinado por todos os pacientes incluídos. A coleta de tecido foi aprovada pelo comitê de ética médica (METC) do Diakonessenhuis Hospital, de acordo com a declaração de Helsinki e de acordo com a legislação holandesa e da União Europeia. Geração e culturas de Organoide
[00280] Linhagens de organoide epitelial foram derivados de cólon saudável ou tecido tumoral (van de Wetering, M. et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorretal cancer patients. Cell 161, 933-945, doi:10.1016/j.cell.2015.03.053 (2015)). Em resumo, as criptas colônicas saudáveis foram isoladas pela digestão da mucosa colônica em solução de quelação (5,6 mM de Na2HPO4, 8,0 mM de KH2PO4, 96,2 mM de NaCl, 1,6 mM de KCl, 43,4 mM de Sacarose e 54,9 mM de D-Sorbitol, Sigma) suplementado com ditiotreitol (0,5 mM, Sigma) e EDTA (2 mM, interno), durante 30 minutos a 4°C. As criptas colônicas foram subsequentemente plaqueadas em extrato de membrana basal (BME; Cultrex PC BME RGF tipo 2, Amsbio) e os organoides foram cultivados em meio de célula tronco intestinal humana (HISC), que é composto de meio de Eagle modificado de Dulbecco Advanced/F12 suplementado com penicilina/estreptomicina, 10 mM de HEPES e Glutamax (todos da Gibco, Thermo Fisher Scientific) com
72 / 75 50% de meio condicionado Wnt3a (interno), 20% de meio condicionado R- Spondin1 (interno), 10% de meio condicionado de Noggin (interno), 1 x B27, 1,25 mM n-acetil cisteína, 10 mM de nicotinamida, 50 ng/mL de EGF humano, 10 nM de Gastrina, 500 nM de A83-01, 3 μM de SB202190, 10 nM de prostaglandina E2 e 100 μg/mL de Primocina (Invivogen). Os espécimes de tumor foram digeridos para células únicas em colagenase II (1 mg/mL, Gibco, Thermo Scientific), suplementado com hialuronidase (10 μg/mL) e LY27632 (10 μM) durante 30 minutos a 37°C sob agitação. Células tumorais únicas foram plaqueadas em BME e os organoides foram cultivados em meio condicionado de HICS menos Wnt e suplementado com 10 μM de LY27632 a 37°C. Onde fazemos referência a componentes “internos” dos meios, alternativas comerciais são facilmente disponíveis para a pessoa versada na técnica (por exemplo, agonista Wnt (ATCC CRL 2647®), R-espondina (R&D, #3500-RS/CF), Noggin (Peprotech, #120-10C), EDTA (Thermo fisher, #AM9260G)) e o versado entenderia que alcançariam o mesmo ou um efeito equivalente. Transfecção de Tumoroide
[00281] Tumoroides (especificamente, organoides de CRC) foram dissociadas em pequenos pedaços usando TrypLE e depois transduzidos com H2B-mNeonGreen (pLV-H2B-mNeonGreen-ires-Puro). Células T
[00282] A geração de células T αβ carregando um TCR transgênico reconhecendo um peptídeo derivado de WT1 restrito a HLA-A2 foi descrita em Kuball, J. et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into humans cells T. Blood 109, 2331-2338, doi:10,1182/blood-2006-05-023069 (2007). Em resumo, as cadeias TCRα e β foram clonadas a partir de clones de célula T positivas em tetrâmero elevado. Subsequentemente, as células T CD8+ αβ TCR foram transduzidas usando sobrenadante retroviral das células de empacotamento Phoenix-Ampho que
73 / 75 foram transfectadas com as construções retrovirais gag-pol, env e pBullet contendo os genes de TCR clonados. Cocultura de tumoroide-célula T e imageamento de célula viva
[00283] Tumoroides estavelmente transfectados com H2B- mNeonGreen foram divididos e digeridos de 5 a 7 dias antes da cocultura e semeados em uma densidade de 5000 células por 10 μL de BME (25.000 células por poço em uma placa de cultura de célula de 12 poços). Dois dias antes da cocultura, as células T foram privadas de IL-2. Um dia antes da cocultura, os tumoroides foram estimulados com IFN-γ nas concentrações indicadas.
[00284] Antes de cocultivar, as células T foram tingidas com Corante de Proliferação Celular eFluor 450 (eBioscience) de acordo com as instruções do fabricante. Os tumoroides foram pulsados com peptídeo específico de TCR (ProImune) durante 2 horas a 37°C antes da cocultura. Os tumoroides e as células T foram colhidas e recolhidas em meio de célula T, suplementado com 10% de BME, 100 IU/mL de IL-2 e NucRed Dead 647 (Thermo Fischer). Onde indicado, anticorpos bloqueadores anti-PD1 (2 μg/mL) foram adicionados à cocultura. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços com fundo de vidro e as coculturas foram imageadas usando um microscópio confocal SP8X (Leica). Citometria de fluxo
[00285] Os pentâmeros rotulados com APC para o peptídeo derivado de EBV, restringido com HLA-2:02 FLYALALLL (ProImmune) foram usados para classificar células T CD8+ CD3+ pentaméricas+ a partir das PBMCs isoladas das camadas leucoplaquetárias de indivíduos saudáveis. As células foram classificadas como células únicas em placas de 96 poços usando um citômetro BD FACS Aria (BD Biosciences). Para a citometria de fluxo, os seguintes anticorpos foram usados (todos anti-ser humano): CD8–PE (clone RPA-T8), CD45–PerCP-Cy5,5 (2D1), CD274 (PD-L1)–APC (MIH1) (todos
74 / 75 da BD Biosciences), CD279 (PD-1)–PE (EH12,2H7, Biolegend), HLA-A2– PE (BB7,2, Santa Cruz). Reação cadeia da polimerase quantitativa (qPCR)
[00286] Para a análise de qPCR, o RNA foi isolado de organoides/ tumoroides usando o kit RNAeasy (QIAGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. A análise de PCR foi realizada usando o SYBR Green Reagent (Biorad). As reações de PCR foram realizadas em duplicata com uma curva padrão para cada iniciador. Os iniciadores foram planejados usando a ferramenta de planejamento de iniciador NCBI. Os iniciadores usados neste estudo: GAPDH avançado (GTC GGA GTC AAC GGA TT), GAPDH reverso (AAG CTT CCC GTT CTC AG), HPRT avançado (GGC GTC GTG ATT AGT GAT), HPRT reverso (AGG GCT ACA ATG TGA TGG), CD274 avançado (TGC AGG GCA TTC CAG AAA GAT), CD274 reverso (CCG TGA CAG TAA ATG CGT TCAG). Formação de perfil transcricional
[00287] A análise de microarranjo de organoides de biobanco foi realizada como descrita em van de Wetering, M. et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorretal cancer patients. Cell 161, 933-945, doi:10.1016/j.cell.2015.03.053 (2015). Ensaios imunossorvente ligados à enzima (ELISA)
[00288] Os sobrenadantes de cultura foram mantidos a –20°C e ELISA foi realizado para as citocinas indicadas usando ELISA MA Standard (Biolegend) de acordo com o protocolo do fabricante. Ensaio de viabilidade celular
[00289] A viabilidade celular depois das coculturas foi avaliada usando ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo (Promega), de acordo com o protocolo do fabricante. Análise de imagem
[00290] A análise de imagem foi feita usando o pacote de software
75 / 75 Imaris (Bitplane). Em resumo, o limiar para o tingimento positivo foi ajustado nos controles negativos. Um canal de colocalização foi fabricado para os sinais de H2B-neon e NucRed Dead 647. A morte da célula foi quantificada como porcentagem de voxéis de H2B-mNeonGreen+ colocalizando com sinal de NucRed Dead. Análise de bioinformática
[00291] A análise de bioinformática de dados normalizados da expressão de gene de experimentos de microarranjo (van de Wetering, M. et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorretal cancer patients. Cell 161, 933-945, doi:10.1016/j.cell.2015.03.053 (2015)) foi realizada usando pacotes padrão (isto é, gplots) na versão R 3.4.0 (R Foundation, https://www.r-project.org) e versão RStudio 1.0.143 (https://www.rstudio.com). Análise estatística
[00292] Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes a menos que de outro modo indicado. Todos os dados foram mostrados como média ± SEM. A significância estatística foi analisada pelo ANOVA ou teste t de Student de duas caudas usando Graphpad Prism 6 ou Microsoft Excel
2010.

Claims (78)

1 / 16 REIVINDICAÇÕES
1. Método para identificar um agente adequado para tratar um câncer, caracterizado pelo fato de que o método compreende: colocar uma cocultura de tumoroide em contato com um ou mais agentes candidatos, em que a cocultura de tumoroide compreende células imunes e pelo menos um tumoroide, detectar a presença ou ausência de uma ou mais mudanças na cocultura de tumoroide que seja indicativa da adequabilidade de agente candidato para tratar o câncer, e identificar um agente candidato como adequado para tratar o câncer se a presença ou ausência de uma ou mais das ditas mudanças na cocultura de tumoroide for detectada.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a adequabilidade para tratar o câncer compreende eficácia para tratar o câncer e/ou segurança para tratar o câncer.
3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais mudanças são uma mudança em um ou mais biomarcadores do câncer.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais mudanças são selecionadas de uma redução na viabilidade celular, uma redução na proliferação celular, um aumento na morte celular, uma mudança no tamanho da célula ou organoide, uma mudança na motilidade celular, mudança na produção de citocinas e moléculas citotóxicas pelas células imunes cocultivadas, dissociação ou rompimento da camada de célula epitelial intacta/compacta e uma mudança na expressão de um ou mais genes.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende um ensaio de proliferação celular, um ensaio de viabilidade, análise citométrica de fluxo,
2 / 16 ELISA para IFN-γ, análise da expressão de gene e/ou imageamento celular.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais mudanças é uma redução na viabilidade celular, por exemplo como detectada pelo kit de Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter Glo (Promega), tingimento citométrico de fluxo intracelular para Caspase 3 ativa (BD) ou cepa positiva para células mortas.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais mudanças é um aumento na morte celular, por exemplo como detectada pelo imageamento de campo brilhante.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método é precedido por uma ou mais das seguintes etapas: preparar o pelo menos um tumoroide cultivando-se células epiteliais tumorais em um meio de cultura de tumoroide; preparar as células imunes separando-se células imunes de uma amostra imune impura e cultivar as células imunes em um meio de expansão de célula imune; e/ou preparar a cocultura de tumoroide, preferivelmente pela remoção do meio de cultura de tumoroide do pelo menos um tumoroide e misturar o pelo menos um tumoroide com as células imunes em um meio de cocultura de tumoroide.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método compreende comparar a presença ou ausência da uma ou mais mudanças da cocultura de tumoroide com um organoide de referência ou tumoroide de referência e em que o método compreende adicionalmente: colocar uma cocultura de organoide de referência ou cocultura
3 / 16 de tumoroide de referência em contato com o um ou mais agentes candidatos, em que a cocultura de organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência compreende células imunes e pelo menos um organoide ou tumoroide, e detectar a presença ou ausência da uma ou mais mudanças na cocultura de organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência que seja indicativa de adequabilidade de agente candidato para tratar o câncer.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que um agente candidato é identificado como um agente adequado se a presença ou ausência de uma mudança for detectada na cocultura de tumoroide, mas não na cocultura de organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência.
11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o método é precedido por uma ou mais das seguintes etapas: preparar o pelo menos um organoide cultivando-se células epiteliais normais em um meio de cultura de organoide; preparar as células imunes pela separação das células imunes de uma amostra imune impura e cultivar as células imunes em um meio de expansão de célula imune; e/ou preparar a cocultura de organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência, preferivelmente pela remoção do meio de cultura de tumoroide meio de cultura de organoide do pelo menos um tumoroide ou pelo menos um organoide e subsequentemente misturar o pelo menos um organoide de referência ou pelo menos um organoide de referência com as células imunes em um meio de cocultura de organoide ou um meio de cocultura de tumoroide, opcionalmente em que a amostra imune impura é uma amostra de tumor, tecido de cólon normal e/ou sangue periférico.
4 / 16
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que as células epiteliais normais são autólogas com as células epiteliais tumorais.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a cocultura de organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência é usada como um controle, preferivelmente em que a mesma é usada como um controle negativo.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que (i) o meio de cocultura de tumoroide e/ou (ii) o meio de cocultura de organoide de referência ou meio de cocultura de tumoroide de referência, compreende matriz extracelular, preferivelmente selecionada de colágeno ou qualquer matriz de membrana basal derivada de animal ou sintética.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o colágeno é colágeno I de cauda de rato.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a cocultura compreende pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9% ou pelo menos 10% de colágeno, preferivelmente, em que a cocultura compreende cerca de 10% (v/v) de colágeno.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 16, caracterizado pelo fato de que (i) o meio de cocultura de tumoroide e/ou (ii) o meio de cocultura de organoide de referência ou meio de cocultura de tumoroide de referência tem uma concentração de proteína de 0,15 mg/(ml de Matrigel®) a 0,95 mg/(ml de Matrigel®) para uma concentração de Matrigel® de 2% a 10%.
18. Meio de cocultura de tumoroide e/ou meio de cocultura de organoide, caracterizado pelo fato de ser de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 11 ou 14 a 17.
5 / 16
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células imunes da cocultura de tumoroide e/ou cocultura de organoide de referência e/ou cocultura de tumoroide de referência têm uma motilidade de pelo menos 40 µm/dia, 60 µm/dia, 80 µm/dia, 100 µm/dia, 120 µm/dia ou 140 µm/dia.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% das células imunes na cocultura de tumoroide e/ou cocultura de organoide de referência e/ou cocultura de tumoroide de referência são capazes de mover uma distância de pelo menos 200 µm, pelo menos 250 µm, pelo menos 300 µm, pelo menos 350 µm ou pelo menos 400 µm em 80 horas.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células imunes permanecem ativas durante pelo menos 4h, 8h, 12h, 24h, 48h ou 72h.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes candidatos são de adequabilidade conhecida para tratar câncer e o método compreende adicionalmente identificar o um ou mais agentes candidatos como agentes adequados para tratar câncer em um paciente em particular.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 22, caracterizado pelo fato de que tanto a cocultura de tumoroide quanto a cocultura de organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência são derivadas do paciente em particular.
24. Método de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente tratar o paciente com o agente candidato identificado como adequado para tratar câncer no paciente em particular.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações
6 / 16 anteriores, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes candidatos são selecionados de uma ou mais das seguintes classes terapêuticas: imunoterapêuticas, peptídeos específicos de tumor, inibidores de ponto de checagem, agente alquilante, antimetabólito, agonista metabólico, antagonista metabólico, alcaloide vegetal, inibidor mitótico, antibiótico antitumor, inibidor da topoisomerase, produtos radioterapêuticos, produtos quimioterapêuticos, anticorpos, agente fotossensibilizante, transplante de célula tronco, vacina, agente citotóxico, agente citostático, inibidor da tirosina cinase, inibidor de proteassoma, citocina, interferon, interleucina, agente intercalante, agente de terapia alvejada, fármaco de molécula pequena, hormônio, esteroide, produto terapêutico celular, vetor viral e produto terapêutico de ácido nucléico.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes candidatos são selecionados de uma ou mais das seguintes classes terapêuticas: peptídeos específicos de tumor, inibidores de ponto de checagem, produto terapêutico de célula T do receptor de antígeno quimérico (CAR), células T transgênicas em TCR terapêutica e neoantígeno.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes candidatos são um produto imunoterapêutico.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o produto imunoterapêutico é um produto terapêutico de célula T do receptor de antígeno quimérico (CAR), célula T transgênica em TCR terapêutica ou um neoantígeno.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes candidatos é de adequabilidade desconhecida para tratar câncer e o método compreende adicionalmente identificar um subconjunto do um ou mais agentes candidatos
7 / 16 como agentes adequados para tratar câncer.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou 29, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes candidatos é de adequabilidade conhecida para tratar um primeiro câncer e adequabilidade desconhecida para tratar um segundo câncer e o método adicionalmente compreendendo identificar um subconjunto do um ou mais agentes candidatos como agentes adequados para tratar o segundo câncer.
31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer epitelial.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer gastrointestinal.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer colorretal.
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o câncer compreende câncer no ou abaixo de um de Estágio II, Grau II ou T2 N1 M0.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 34, caracterizado pelo fato de que a célula epitelial tumoral e/ou célula epitelial normal são obtidas de uma amostra de um paciente com câncer.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 35, caracterizado pelo fato de que a célula epitelial tumoral e a célula epitelial normal são obtidas do mesmo paciente com câncer, opcionalmente da mesma amostra.
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma biópsia de tecido.
38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a biópsia de tecido é recolhida do cólon ressecado e/ou reto de pacientes com câncer colorretal, de ascite de
8 / 16 pacientes com câncer colorretal ou ovariano e/ou da urina de pacientes com câncer renal.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células epiteliais tumorais e/ou células epiteliais normais são selecionadas a partir do grupo consistindo de células pulmonares, células hepáticas, células mamárias, células dérmicas, células intestinais, células da cripta, células retais, células pancreáticas, células endócrinas, células exócrinas, células ductais, células renais, células adrenais, células tireoidais, células pituitárias, células paratireóidicas, células prostáticas, células estomacais, células esofágicas, células ovarianas, células do tubo de falópio ou células vaginais.
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células epiteliais tumorais e/ou células epiteliais normais são células intestinais, por exemplo, células colorretais.
41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células epiteliais tumorais e/ou células epiteliais normais são células tronco epiteliais, preferivelmente distinguidas pela expressão de Lgr5.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células imunes compreendem um ou mais tipos de célula selecionados do grupo consistindo de linfócitos intraepiteliais (IELs), linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), linfócitos de sangue periférico (PBLs), células T e linfócitos T citotóxicos (CTLs), células T αβ, células T γδ, células B, células NK e fagócitos mononucleares.
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células imunes são obtidas de uma amostra de um paciente com câncer.
9 / 16
44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células imunes são obtidas de uma amostra de sangue periférico e/ou uma biópsia de tecido.
45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os linfócitos de sangue periférico (PBLs) e/ou as células T são obtidos da amostra de sangue periférico.
46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) e/ou linfócitos intraepiteliais (IELs) são obtidos a partir da biópsia de tumor ou de tecido normal, respectivamente.
47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células imunes são obtidas do mesmo paciente como a célula epitelial tumoral e/ou célula epitelial normal.
48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células imunes são alogênicas) com o tumoroide e/ou organoide, opcionalmente em que as células imunes e tumoroide e/ou organoide são derivados de sangue periférico ou biópsia de tecido de um paciente diferente ou controle saudável.
49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células imunes são igualadas em HLA com o tumoroide e/ou organoide.
50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células imunes persistem no meio de expansão de célula imune durante pelo menos 4h, 8h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h, 192h, 216h e 240h.
51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um tumoroide e/ou pelo menos um organoide compreende ou consiste de células autólogas.
52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações
10 / 16 anteriores, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um tumoroide e/ou pelo menos um organoide são separados em populações compartilhando um ou mais genótipos, fenótipos e/ou marcadores epigenéticos, antes de misturar com as células imunes.
53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os genótipos, fenótipos e/ou marcadores epigenéticos contribuem para a interação entre (i) o pelo menos um tumoroide e/ou pelo menos um organoide e (ii) as células imunes.
54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as populações compartilham a presença ou ausência de um haplotipo HLA, opcionalmente em que o haplotipo HLA é HLA-A2.
55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um tumoroide ou pelo menos um organoide compreende ou consiste de células de mamífero, preferivelmente células humanas.
56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma cocultura de tumoroide ou pelo menos uma cocultura de organoide é cultivada em meio de expansão de célula imune ou em uma mistura 50:50 (v/v) de meio de expansão de célula imune e meio de cultura de organoide ou meio de cultura de tumoroide (respectivamente).
57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a cocultura de tumoroide persiste no meio de cocultura de tumoroide ou em que a cocultura de organoide de referência ou cocultura de tumoroide de referência persiste no meio de cocultura de organoide, durante pelo menos 4h, 8h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h, 192h, 216h e 240h.
58. Tumoroide ou organoide como definido em qualquer uma
11 / 16 das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o tumoroide ou organoide está em um meio compreendendo uma interleucina, opcionalmente em que a interleucina é selecionada a partir do grupo consistindo de IL-2, IL- 7 e IL-15.
59. População de tumoroides ou organoides, caracterizada pelo fato de ser preparada de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.
60. Cocultura de tumoroide e/ou cocultura de organoide de referência, caracterizada pelo fato de ser como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores.
61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de organoide compreende um ou mais (ou preferivelmente todos) de um meio basal (tal como meio DMEM/F12 Advanced, Gibco) um ligante Wnt (tal como Wnt- 3a), um agonista de Wnt (tal como qualquer um de Respondina 1-4), um inibidor de BMP (tal como Noggin), EGF e um inibidor de TGF-β (tal como A83-01, Tocris) e opcionalmente compreende adicionalmente um ou mais (ou todos) de um inibidor de p38 MAPK, gastrina, nicotinamida, prostaglandina E, N-acetilcisteína, B27 e/ou um antimicrobiano (tal como primocina).
62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de tumoroide compreende um ou mais (ou preferivelmente todos) de um meio basal (tal como meio DMEM/F12 Advanced, Gibco) um agonista de Wnt (tal como qualquer um de Respondina 1-4), um inibidor de BMP (tal como Noggin), EGF e um inibidor de TGF-β (tal como A83-01, Tocris) e opcionalmente compreende adicionalmente um ou mais (ou todos) de um inibidor de p38 MAPK, gastrina, nicotinamida, prostaglandina E, N-acetilcisteína, B27 e/ou um antimicrobiano (tal como primocina), opcionalmente em que o meio de cultura de tumoroide compreende adicionalmente um ligante Wnt (tal como
12 / 16 Wnt-3a).
63. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o meio de expansão de célula imune compreende IL-2, opcionalmente em uma concentração de 2000 a 6000 IU/mL e opcionalmente adicionalmente compreendendo IL-7 e/ou IL-15.
64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o meio de expansão de célula imune compreende adicionalmente um meio RPMI (por exemplo, RPMI 1640, Gibco), opcionalmente suplementado com penicilina/estreptomicina e/ou soro (por exemplo, 5% de soro AB humano, Sigma-Aldrich).
65. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o meio de cocultura de tumoroide e/ou meio de cocultura de organoide compreende IL-2, opcionalmente em uma concentração de 100 a 200 IU/mL.
66. Método de testar uma imunoterapia de receptor de antígeno quimérico de células T (CAR-T), célula T transgênica em receptor de células T (TCR), neoantígeno ou inibidor de ponto de checagem, para eficácia e/ou segurança quando usado para tratar câncer epitelial, o método caracterizado pelo fato de que compreende: opcionalmente prover do mesmo paciente células epiteliais tumorais, células epiteliais normais e células imunes, expandir as células epiteliais tumorais em meio de cultura de tumoroide para formar um tumoroide e cultivar o tumoroide com as células imunes em um meio de cocultura de tumoroide compreendendo interleucina para formar uma cocultura de tumoroide, expandir as células epiteliais normais em meio de cultura de organoide para formar um organoide e cultivar o organoide com as células imunes em um meio de cocultura de organoide compreendendo interleucina para formar uma cocultura de organoide de referência,
13 / 16 colocar a cocultura de tumoroide e a cocultura de organoide de referência em contato com a imunoterapia de CAR-T, células T transgênicas em TCR, neoantígeno ou inibidor de ponto de checagem, detectar a presença ou ausência de uma ou mais mudanças na cocultura de tumoroide e na cocultura de organoide de referência, em que a presença ou ausência de uma ou mais mudanças é indicativa da eficácia e/ou segurança da imunoterapia de CAR-T, células T transgênicas em TCR, neoantígeno ou inibidor de ponto de checagem, e comparar a cocultura de tumoroide e a cocultura de organoide de referência.
67. Método de testar um composto candidato quanto à eficácia e/ou segurança quando usado para tratar câncer epitelial, caracterizado pelo fato de que o método compreende: opcionalmente prover do mesmo paciente células epiteliais tumorais, células epiteliais normais e células imunes, expandir as células epiteliais tumorais em meio de cultura de tumoroide para formar um tumoroide e cultivar o tumoroide com as células imunes em um meio de cocultura de tumoroide compreendendo interleucina para formar uma cocultura de tumoroide, expandir as células epiteliais normais em meio de cultura de organoide para formar um organoide e cultivar o organoide com as células imunes em um meio de cocultura de organoide compreendendo interleucina para formar uma cocultura de organoide de referência, colocar a cocultura de tumoroide e a cocultura de organoide de referência em contato com o composto candidato, detectar a presença ou ausência de uma ou mais mudanças na cocultura de tumoroide e na cocultura de organoide de referência, em que a presença ou ausência de uma ou mais mudanças é indicativa de eficácia e/ou segurança do composto candidato, e
14 / 16 comparar a cocultura de tumoroide e a cocultura de organoide de referência.
68. Método para preparar uma cocultura de organoide-célula imune, caracterizado pelo fato de que o método compreende: opcionalmente cultivar células epiteliais em contato com uma matriz extracelular em um meio de cultura de organoide para se obter um organoide; remover a dita matriz extracelular e meio de cultura de organoide do dito organoide; recolocar em suspensão o dito organoide no meio de cultura de célula imune suplementado com interleucina; preparar uma suspensão de célula imune compreendendo células imunes, meio de cultura de célula imune suplementado com interleucina e colágeno na concentração de pelo menos 5 a 10 % na suspensão; e misturar a suspensão de célula imune compreendendo células imunes com o organoide recolocado em suspensão.
69. Método para preparar uma cocultura de tumoroide-célula imune, caracterizado pelo fato de que o método compreende: opcionalmente cultivar células epiteliais tumorais em contato com uma matriz extracelular em um meio de cultura de tumoroide para se obter um organoide; remover a dita matriz extracelular e meio de cultura de tumoroide do dito tumoroide; recolocar em suspensão o dito tumoroide no meio de cultura de célula imune suplementado com interleucina; preparar uma suspensão de célula imune compreendendo células imunes, meio de cultura de célula imune suplementado com interleucina e colágeno na concentração de pelo menos 5 a 10% na suspensão;
15 / 16 e misturar a suspensão de célula imune compreendendo células imunes com o tumoroide recolocado em suspensão.
70. Método de acordo com a reivindicação 68 ou 69, caracterizado pelo fato de que o colágeno é colágeno de cauda de rato.
71. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 70, caracterizado pelo fato de que o meio de célula imune é RPMI1640 (Gibco).
72. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 71, caracterizado pelo fato de que as células imunes são células T.
73. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 72, caracterizado pelo fato de que as células epiteliais e células imunes são obtidas do mesmo sujeito, opcionalmente da mesma amostra.
74. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 72, caracterizado pelo fato de que as células epiteliais e células imunes são células humanas.
75. Cocultura de organoide-célula imune, caracterizada pelo fato de ser obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 68 ou 70 a 74.
76. Cocultura de tumoroide-célula imune, caracterizada pelo fato de ser obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 69 a 74.
77. Método para testar um agente terapêutico, caracterizado pelo fato de que o método compreende: colocar uma cocultura de organoide em contato com um ou mais agentes candidatos, em que a cocultura de organoide compreende células imunes e pelo menos um organoide, detectar a presença ou ausência de uma ou mais mudanças na cocultura de organoide que seja indicativa da eficácia terapêutica, e
16 / 16 identificar um agente candidato como um agente terapêutico se a presença ou ausência de uma ou mais das ditas mudanças na cocultura de organoide for detectada.
78. Método de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é adequado para o tratamento de uma doença imune, opcionalmente em que a doença imune afeta tecidos do pulmão e/ou intestino, por exemplo, em que a doença imune é selecionada a partir do grupo consistindo de doença do intestino irritável (IBD), colite ulcerativa (UC), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e asma.
Figura 1
Petição 870200076768, de 19/06/2020, pág. 104/125 pacientes resseção cirúrgica organóides e células T análise câncer colorretal tumoróides sequenciamento de TCR peptidoma cólon normal 1/20 organóides sangue periférico sequenciamento de DNA (célula única) sequenciamento de mRNA
Figura 1 culturas de organoide culturas de célula T análise de fluxo
Petição 870200076768, de 19/06/2020, pág. 105/125 2/20 organoides (N18)
tumoróides (T18)
Figura 2 organóides IELs halogênicos cocultura de 60h fixação & microscópio montagem confocal
Figura 3 em BME a 10 % em colágeno I a 10 %
tumoróides cocultura imageamento ao vivo de 80h comprimento de trilha colágeno I
Figura 4
Petição 870200076768, de 19/06/2020, pág. 108/125 tumoróides tingimento com anticorpo HLA-A2 e 5/20 classificação de fluxo semeadura de clones HLA-A2+ve e HLA-A2-ve tumoróides clonais
Figura 4
Petição 870200076768, de 19/06/2020, pág. 109/125 linhagem de célula HLA-A2+ve de controle (JY)
organóides HLA-A2+ve (N40) tumoróides HLA-A2-ve 6/20
(clone T40-) tumoróides HLA-A2+ve (clone T40+)
organóides HLA-A2+ve (N41) tumoróides HLA-A2-ve (clone T41-) tumoróides HLA-A2+ve (clone T41+)
Figura 5 células T tumoróides pulsados cocultura de 48h imageamento transgênicas em peptídeo em TCR tumoróides HLA-A2-ve tumoróides HLA-A2+ve nenhum peptídeo peptídeo
Figura 6
Petição 870200076768, de 19/06/2020, pág. 111/125 viabilidade celular tumoróides pulsados células T transgênicas em peptídeo em TCR 8/20 cocultura de 12h normalizado para nenhum peptídeo ensaio de viabilidade celular
Figura 7 organóides células T cocultura de 24h imagens de campo brilhante
-células T +células T
-células T +células T
Organóide
Tumoróide -células T
+células T
Figura 8 organóides células T cocultura imageamento ao vivo
Figura 9
Petição 870200076768, de 19/06/2020, pág. 114/125 cólon normal câncer colônico 11/20 escore z da fileira câncer cólon normal colônico
Figura 9
Petição 870200076768, de 19/06/2020, pág. 115/125 controle controle controle controle controle 12/20 controle controle controle controle
Figura 10
Petição 870200076768, de 19/06/2020, pág. 116/125 13/20 controle (nenhuma estimulação) estimulação de IFN-γ
Figura 11
Petição 870200076768, de 19/06/2020, pág. 117/125 14/20 organóides de CRC organóides CRC células T que pulsados com peptídeo reconhecem peptídeo cocultura
Figura 11
Petição 870200076768, de 19/06/2020, pág. 118/125 organóides HLA-A2- organóides HLA-A2+ 15/20 sem peptídeo com peptídeo organóides HLA-A2- organóides HLA-A2+ peptídeo EBV Figura 11 peptídeo WT1 organóides/células T célula T WT1 EBV nenhuma células T células T
Figura 11
Petição 870200076768, de 19/06/2020, pág. 120/125 células T WT1 sem peptídeo 17/20 células T EBV com peptídeo nenhum peptídeo peptídeo EBV peptídeo WT1 organóides/células T/células apoptóticas
Figura 11
Petição 870200076768, de 19/06/2020, pág. 121/125 18/20 colocalização de 488+ nenhum peptídeo nenhum peptídeo/nenhuma célula T peptídeo EBV peptídeo EBV/nenhuma célula T
Figura 11
Petição 870200076768, de 19/06/2020, pág. 122/125 peptídeo EBV/células T EBV/anti-PD1 peptídeo EBV/células T EBV/nenhum anticorpo 19/20 nenhum peptídeo/ células T EBV/anti-PD1 colocalização de 488+ organóides/células T nenhum peptídeo/células T EBV/nenhum anticorpo
Figura 11 razão com peptídeo vs. sem peptídeo controle
BR112020012565-2A 2017-12-21 2018-12-21 método para identificar um agente adequado para tratar um câncer, meio de cocultura de tumoroide e/ou meio de cocultura de organoide, tumoroide ou organoide, população de tumoroides ou organoides, cocultura de tumoroide e/ou cocultura de organoide de referência, métodos de testar uma imunoterapia e de testar um composto candidato, métodos para preparar uma cocultura de organoide-célula imune e para preparar uma cocultura de tumoroide-célula imune, cocultura de organoide-célula imune, cocultura de tumoroide-célula imune, e, método para testar um agente terapêutico BR112020012565A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1721615.1A GB201721615D0 (en) 2017-12-21 2017-12-21 Immune cell organoid co-cultures
GB1721615.1 2017-12-21
PCT/EP2018/086716 WO2019122388A1 (en) 2017-12-21 2018-12-21 Immune cell organoid co-cultures

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020012565A2 true BR112020012565A2 (pt) 2020-11-24

Family

ID=61131463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020012565-2A BR112020012565A2 (pt) 2017-12-21 2018-12-21 método para identificar um agente adequado para tratar um câncer, meio de cocultura de tumoroide e/ou meio de cocultura de organoide, tumoroide ou organoide, população de tumoroides ou organoides, cocultura de tumoroide e/ou cocultura de organoide de referência, métodos de testar uma imunoterapia e de testar um composto candidato, métodos para preparar uma cocultura de organoide-célula imune e para preparar uma cocultura de tumoroide-célula imune, cocultura de organoide-célula imune, cocultura de tumoroide-célula imune, e, método para testar um agente terapêutico

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20210208131A1 (pt)
EP (1) EP3729084A1 (pt)
JP (2) JP2021508249A (pt)
KR (1) KR20200105852A (pt)
CN (1) CN111989569A (pt)
AU (2) AU2018390960B2 (pt)
BR (1) BR112020012565A2 (pt)
CA (1) CA3086290A1 (pt)
GB (1) GB201721615D0 (pt)
IL (1) IL275354A (pt)
NZ (1) NZ765695A (pt)
SG (1) SG11202005891TA (pt)
WO (1) WO2019122388A1 (pt)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2795322B1 (en) 2011-12-19 2015-12-09 UMC Utrecht Holding B.V. A rapid quantitative assay to measure cftr function in a primary intestinal culture model
EP3143126A1 (en) 2014-05-16 2017-03-22 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Improved culture method for organoids
GB201421092D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture medium
GB201603569D0 (en) 2016-03-01 2016-04-13 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Improved differentiation method
US10395772B1 (en) * 2018-10-17 2019-08-27 Tempus Labs Mobile supplementation, extraction, and analysis of health records
CN109536444B (zh) * 2018-12-11 2022-06-28 吉林省拓华生物科技有限公司 一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法
JP2022534778A (ja) * 2019-05-28 2022-08-03 シリン・シェン 患者由来ミクロオルガノスフェアのための方法及び装置
US20220356452A1 (en) * 2019-09-30 2022-11-10 University Of Delaware Indirect three-dimensional co-culture of dormant tumor cells and uses thereof
JPWO2021075528A1 (pt) * 2019-10-17 2021-04-22
WO2021092226A1 (en) * 2019-11-05 2021-05-14 Em-O-Em Diagnostics, Inc. Embryo transfer outcome prediction using endometrial organoids and spent embryo culture medium
US20210139857A1 (en) * 2019-11-13 2021-05-13 New York University Intestinal organoid co-culture systems and methods for treating or preventing a disease or disorder associated with immune response-mediated tissue injury
CN111040997A (zh) * 2019-12-20 2020-04-21 北京科途医学科技有限公司 一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法
CN111089977A (zh) * 2019-12-30 2020-05-01 浙江科途医学科技有限公司 一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法
CN111411084A (zh) * 2020-04-28 2020-07-14 江苏信安佳医疗科技有限公司 一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基及培养方法
US20230212510A1 (en) * 2020-05-04 2023-07-06 City Of Hope Methods for organoids production
KR102578640B1 (ko) * 2020-08-14 2023-09-15 주식회사 넥스트앤바이오 미세유체 칩을 활용한 오가노이드의 제조 방법
CN112143699A (zh) * 2020-09-11 2020-12-29 上海市第十人民医院 一种结直肠癌类器官免疫微环境重构的方法
KR102571223B1 (ko) * 2020-09-28 2023-08-29 연세대학교 산학협력단 인간 편도 유래 오가노이드와 면역세포 3차원 공배양 방법
US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
AU2021353004A1 (en) 2020-09-30 2023-04-13 Nobell Foods, Inc. Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
WO2022072847A1 (en) * 2020-10-02 2022-04-07 The Johns Hopkins University Methods for identifying modulators of natural killer cell interactions
EP4103697A4 (en) * 2020-11-03 2023-08-09 Iscaff Pharma AB USES OF PATIENT DERIVED SCAFFOLDS
CN112481193A (zh) * 2020-11-26 2021-03-12 海西纺织新材料工业技术晋江研究院 三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基及培养方法
CN112553289A (zh) * 2020-12-17 2021-03-26 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) 一种评价car-t细胞有效性的方法
US20240069011A1 (en) * 2020-12-29 2024-02-29 2cureX A/S Predicting efficacy of or resistance to treatment of colon cancer
WO2022194760A1 (en) * 2021-03-15 2022-09-22 Universiteit Antwerpen Method for screening potential therapeutic agents
EP4060552A1 (en) * 2021-03-15 2022-09-21 Universiteit Antwerpen Label-free analysis of brightfield microscope images
GB202109913D0 (en) 2021-07-09 2021-08-25 Stichting Hubrecht Organoid Tech Organoid-derived monolayers and uses thereof
KR102511633B1 (ko) * 2022-08-09 2023-03-20 오가노이드사이언스 주식회사 M1 마크로파지 및 m2 마크로파지 혼합물을 이용한 항암제 효능 평가 방법
KR102478897B1 (ko) * 2021-09-17 2022-12-20 오가노이드사이언스 주식회사 T세포 및 마크로파지를 이용한 항암제 효능 평가 방법
KR102527911B1 (ko) * 2022-08-02 2023-05-02 오가노이드사이언스 주식회사 조절 t 세포의 약물 스크리닝 용도
WO2023043278A1 (ko) * 2021-09-17 2023-03-23 오가노이드사이언스 주식회사 항암제 효능 평가 또는 스크리닝 방법
KR102511632B1 (ko) * 2022-07-26 2023-03-20 오가노이드사이언스 주식회사 암 오가노이드 및 til 포함 종양 미세환경을 이용한 항암제 효능 평가 방법
KR102527906B1 (ko) * 2022-07-29 2023-05-02 오가노이드사이언스 주식회사 수지상 세포의 약물 효능평가 용도
CN113749052A (zh) * 2021-09-24 2021-12-07 北京艾德摩生物技术有限公司 用于消化道肿瘤药物筛选的腹水肿瘤模型、构建方法、应用
CN113881630B (zh) * 2021-09-28 2022-05-31 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种肿瘤特异性til细胞的培育分离方法
CN115521898A (zh) * 2021-11-04 2022-12-27 上海万何圆生物科技有限公司 肝癌类器官与nk细胞共培养的免疫细胞治疗方法及应用
CN115521912A (zh) * 2021-11-04 2022-12-27 上海万何圆生物科技有限公司 一种以类器官与t细胞共培养的免疫细胞治疗方法及应用
CN115537395A (zh) * 2021-11-04 2022-12-30 上海万何圆生物科技有限公司 一种肝癌类器官与TILs细胞共培养的治疗方法及其应用
WO2023102120A1 (en) * 2021-12-01 2023-06-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Organoid co-cultures and methods of use thereof
CN114921411A (zh) * 2022-03-08 2022-08-19 闫书印 一种nk细胞的培育方法及应用
LU501820B1 (en) 2022-04-08 2023-10-10 Care For Rare Found Stiftung Buergerlichen Rechts Bone marrow organoids produced from induced pluripotent stem cells and uses of these organoids
CN115247148B (zh) * 2022-06-14 2023-08-11 吉林省拓华生物科技有限公司 用于培养免疫细胞的培养基及细胞的培养方法
KR102511631B1 (ko) * 2022-06-15 2023-03-20 오가노이드사이언스 주식회사 Pbmc 유래 세포독성 t 세포의 신규 용도
CN115011548B (zh) * 2022-07-11 2023-10-13 中国人民解放军总医院 细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法
CN115418353A (zh) * 2022-08-17 2022-12-02 复旦大学附属肿瘤医院 一种结直肠腹膜转移癌类器官移瘤模型构建及其应用
CN115466716A (zh) * 2022-10-24 2022-12-13 徐州市中心医院 一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法及应用
CN115386550A (zh) * 2022-10-26 2022-11-25 成都诺医德医学检验实验室有限公司 一种评价免疫细胞抗癌有效性的方法
CN116515938A (zh) * 2023-07-04 2023-08-01 天津市肿瘤医院空港医院 基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2696339C (en) * 2007-08-22 2017-12-19 Probiogen Ag Culture system and method for immunogenicity and immunofunction testing in vitro
AU2015264315B2 (en) * 2014-05-19 2018-08-02 Transgenex Nanobiotech, Inc. Formation of multicellular tumoroids and uses thereof
US11760977B2 (en) * 2016-05-25 2023-09-19 Salk Institute For Biological Studies Compositions and methods for organoid generation and disease modeling
US20190309264A1 (en) * 2016-08-15 2019-10-10 Organovo, Inc. Three Dimensional Bioprinted Tumor Models for Drug Testing

Also Published As

Publication number Publication date
NZ765695A (en) 2024-01-26
CN111989569A (zh) 2020-11-24
IL275354A (en) 2020-07-30
JP2021508249A (ja) 2021-03-04
EP3729084A1 (en) 2020-10-28
US20210208131A1 (en) 2021-07-08
JP2024045127A (ja) 2024-04-02
CA3086290A1 (en) 2019-06-27
AU2023203677A1 (en) 2023-07-13
GB201721615D0 (en) 2018-02-07
AU2018390960B2 (en) 2023-03-16
KR20200105852A (ko) 2020-09-09
WO2019122388A1 (en) 2019-06-27
SG11202005891TA (en) 2020-07-29
AU2018390960A1 (en) 2020-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112020012565A2 (pt) método para identificar um agente adequado para tratar um câncer, meio de cocultura de tumoroide e/ou meio de cocultura de organoide, tumoroide ou organoide, população de tumoroides ou organoides, cocultura de tumoroide e/ou cocultura de organoide de referência, métodos de testar uma imunoterapia e de testar um composto candidato, métodos para preparar uma cocultura de organoide-célula imune e para preparar uma cocultura de tumoroide-célula imune, cocultura de organoide-célula imune, cocultura de tumoroide-célula imune, e, método para testar um agente terapêutico
US11952592B2 (en) Systems and methods for growth of intestinal cells in microfluidic devices
US9151744B2 (en) Lung tissue model
US20180231526A1 (en) Human Trophoblast Stem Cells and Uses Thereof
AU2010244121B2 (en) Lung tissue model
BR112019023076A2 (pt) expansão de células t gama delta, composições e métodos de uso das mesmas
KR20180094883A (ko) 대식세포 분화 및 면역의 변형 방법
EP2716298A1 (en) A nod2-dependant pathway of cytoprotection of stem cells
Su et al. Administration of embryonic stem cell-derived thymic epithelial progenitors expressing MOG induces antigen-specific tolerance and ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis
US20230042917A1 (en) Direct reprogramming of somatic cells into myogenic cells
Nishikawa et al. Migration and differentiation of transplanted enteric neural crest-derived cells in murine model of Hirschsprung’s disease
Bar-Ephraim et al. Modelling cancer immunomodulation using epithelial organoid cultures
Chowdhury et al. Forces in stem cells and cancer stem cells
US20230070866A1 (en) Method for producing human professional antigen-presenting cells
JP2022535274A (ja) セリアック病の診断、スクリーニング、および治療のための患者由来腸オルガノイドの使用
Liu et al. Aging of stem cells: intrinsic changes and environmental influences
Nishikawa et al. Migration and differentiation of transplanted enteric neural crest-derived cells in murine model of Hirschsprung’s

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]