KR102511631B1 - Pbmc 유래 세포독성 t 세포의 신규 용도 - Google Patents
Pbmc 유래 세포독성 t 세포의 신규 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102511631B1 KR102511631B1 KR1020220073120A KR20220073120A KR102511631B1 KR 102511631 B1 KR102511631 B1 KR 102511631B1 KR 1020220073120 A KR1020220073120 A KR 1020220073120A KR 20220073120 A KR20220073120 A KR 20220073120A KR 102511631 B1 KR102511631 B1 KR 102511631B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cancer
- cells
- organoids
- cytotoxic
- efficacy
- Prior art date
Links
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 97
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 240
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 210
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 claims abstract description 130
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims abstract description 91
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 86
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 59
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims description 31
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 claims description 17
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 claims description 12
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 10
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 8
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 claims description 8
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 229940125648 antineoplastic drug candidate Drugs 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 4
- -1 antibody Proteins 0.000 claims description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 4
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 4
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 claims description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007659 Fibroadenoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000821 Parathyroid Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010046431 Urethral cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010046458 Urethral neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 201000009036 biliary tract cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020790 biliary tract neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003149 breast fibroadenoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026045 malignant tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002314 small intestine cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 claims 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 claims 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 12
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 229960003852 atezolizumab Drugs 0.000 description 28
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 22
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 210000004544 dc2 Anatomy 0.000 description 5
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000002952 image-based readout Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 3
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 description 2
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 2
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000013210 evaluation model Methods 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 102100023990 60S ribosomal protein L17 Human genes 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102100023387 Endoribonuclease Dicer Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000907904 Homo sapiens Endoribonuclease Dicer Proteins 0.000 description 1
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000015607 signal release Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
- G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 PBMC(peripheral blood mononuclear cell) 및 암 오가노이드의 혼합물을 사용한 항암제의 효능 평가 방법, 항암제 스크리닝 방법, 항암제의 효능 평가 시스템 또는 항암제의 스크리닝 시스템에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 PBMC로부터 분화된 세포독성 T 세포 및 암 오가노이드의 혼합물을 사용한 항암제의 효능 평가 방법, 항암제 스크리닝 방법, 항암제의 효능 평가 시스템 또는 항암제의 스크리닝 시스템에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항암제의 효능 평가 방법, 스크리닝 방법, 효능 평가 시스템 또는 스크리닝 시스템은 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세환경을 매우 유사하게 재현할 수 있다. 또한, 정상 개체에서 유래한 PBMC를 암 환자 특이적인 세포독성 T 세포로 분화시켜 사용하므로, 암 환자에게서 혈액, 조직 등의 생물학적 시료를 채취하는 부담을 경감시킬 수 있고, 항암제의 효능을 높은 정확도로 평가할 수 있다.
본 발명에 따른 항암제의 효능 평가 방법, 스크리닝 방법, 효능 평가 시스템 또는 스크리닝 시스템은 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세환경을 매우 유사하게 재현할 수 있다. 또한, 정상 개체에서 유래한 PBMC를 암 환자 특이적인 세포독성 T 세포로 분화시켜 사용하므로, 암 환자에게서 혈액, 조직 등의 생물학적 시료를 채취하는 부담을 경감시킬 수 있고, 항암제의 효능을 높은 정확도로 평가할 수 있다.
Description
본 발명은 PBMC(peripheral blood mononuclear cell) 및 암 오가노이드의 혼합물을 사용한 항암제의 효능 평가 방법, 항암제 스크리닝 방법, 항암제의 효능 평가 시스템 또는 항암제의 스크리닝 시스템에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 PBMC로부터 분화된 세포독성 T 세포 및 암 오가노이드의 혼합물을 사용한 항암제의 효능 평가 방법, 항암제 스크리닝 방법, 항암제의 효능 평가 시스템 또는 항암제의 스크리닝 시스템에 관한 것이다.
오가노이드는 조직 또는 기관에서 유래한 세포를 3차원 배양하여 제조한 장기 유사체이다. 오가노이드는 장기배양, 동결보존이 가능하고 조작과 관찰이 용이하다는 장점을 가진다. 동시에 불멸화가 필요 없어 그에 따른 세포의 본래 특성이 유지됨은 물론 생체 내에서만 볼 수 있었던 세포 계층적, 조직학적 구조를 재현함으로써 세포보다 한 단계 높은 차원의 생리현상을 연구할 수 있는 실험모델이다. 이러한 특성으로 인해 오가노이드는 세포의 내재적 특성이 변화된 불멸화된 세포주, 또는 인체와 구조가 다른 동물 모델에 비해 높은 정확도로 약물 평가를 할 수 있고, 특히 환자 유래 조직을 이용하므로, 사람을 대상으로 한 임상에 앞서 약물의 안전성은 물론 효능까지 미리 확인할 수 있는 장점이 있다. 다만, 기존에 약물 평가 모델로서 개발된 암 오가노이드는 종양 미세환경을 반영하지 못하는 한계점을 지니고 있었던바, 다양한 종양 미세환경을 갖춘 오가노이드를 개발하고, 이를 약물 평가 모델로서 사용하기 위한 노력이 수행될 필요가 있다.
종양 미세환경은 암세포 주위에 혈관, 면역세포, 섬유아세포(fibroblast), 림프구, 신호전달분자, 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 등이 둘러 싸여 있는 세포환경이다. 종양 미세환경에서 암세포는 세포외 신호 방출, 암세포 신생혈관 촉진, 말초 면역관용 등을 유도하여 미세환경에 영향을 준다. 따라서 암세포는 미세환경을 변화시키기도 하고 미세환경이 암세포의 성장 또는 전이에 영향을 미치기도 하는데, 특히 림프구 등과 관련된 종양 미세환경은 암의 발생 및 전이 뿐만 아니라, 항암제에 의한 치료 반응에 영향을 미친다고 알려져 있다.
예를 들어, 종양 미세환경에 존재하는 CD8+ T 세포는 세포독성 T 세포로 분화하여 종양 미세환경으로 이동하며, 종양 세포를 사멸시키는 등의 종양 면역에 중요한 역할을 수행한다(Kota Iwahori, Adv Exp Med Biol., 2020, 1224:53-62).
이에, 본 발명자들은 종양 미세환경을 갖춘 암 오가노이드를 개발하고, 이를 약물 평가 또는 약물 스크리닝의 플랫폼으로 사용하기 위한 다양한 연구를 진행하였다. 그 결과, 종양 미세환경을 구성하는 다양한 세포 중에서도, 세포독성 T 세포를 사용하여 암 오가노이드와 공배양하는 시스템을 확립하였다.
특히, 상기 세포독성 T 세포는 정상 개체에서 유래한 PBMC를 암 환자 특이적인 세포독성 T 세포로 분화시킨 것이므로, 이를 통해 암 환자에게서 혈액, 조직 등의 생물학적 시료를 채취하는 부담을 경감시킬 수 있으며, 상기 세포독성 T 세포는 공배양이 장기간 진행되어도 생존이 유지됨에 따라 약물의 효능을 높은 정확도로 장기간 평가할 수 있음을 실험적으로 입증하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다. 또한, 문맥상 특별히 정의하지 않은 경우라면, 단수는 복수를 포함하며, 복수는 단수를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태는 하기 단계를 포함하는, 항암제의 효능 평가 방법을 제공한다:
(a) PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 암 오가노이드와 혼합하여 공배양하여, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)를 획득하는 단계;
(b) 상기 a단계에서 획득한 세포독성 T 세포를 암 오가노이드와 혼합하여 공배양하는 단계;
(c) 상기 b단계의 세포독성 T 세포 및 암 오가노이드 혼합물에 항암제를 처리하는 단계; 및
(d) 상기 c단계의 항암제가 처리된 군이 항암제 미처리군 또는 양성 대조군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 항암제는 항암 효능이 있는 것으로 판단하는 단계.
구체적으로, 상기 a단계는 PBMC 및 암 오가노이드를 혼합하여 공배양하는 단계로서, PBMC를 세포독성 T 세포로 분화시켜 세포독성 T 세포를 획득하는 단계이다. 또한, 상기 a단계는 정상 개체에서 유래한 PBMC를 암 환자 특이적인 세포독성 T 세포로 분화시켜 세포독성 T 세포를 획득하는 단계이다. 또한, 상기 a단계는 정상 개체에서 유래한 PBMC로부터 분화된 암 환자 특이적인 세포독성 T 세포가 암 환자의 암세포 또는 암 오가노이드를 자기(self) 세포로 인식하도록 학습시키는 단계이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "PBMC(peripheral blood mononuclear cell)"는 "말초 혈액 단핵세포"로 불리며, T 세포, B 세포, NK 세포 등의 림프구와 단핵구로 구성되는 세포의 집단을 의미한다. PBMC 집단에서는 나이브(naive) T 세포가 약 45 내지 70%로서 대부분을 차지하며, 이외에 도움 T 세포(helper T cell, CD4+ T cell)가 25 내지 60%, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell, CD8+ T cell)가 5 내지 30%, B 세포가 5 내지 10%, NK 세포가 10 내지 30%, 단핵구가 5 내지 10%, 수지상 세포가 1 내지 2%의 비율로 존재한다고 알려져 있다.
본 발명에 따른 PBMC는 암이 발병된 개체(암 환자), 암이 발병되지 않은 정상 개체, 또는 암이 발병된 후 완치된 정상 개체로부터 유래한 것일 수 있고, 바람직하게는 암이 발병되지 않은 정상 개체, 또는 암이 발병된 후 완치된 정상 개체로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서, 상기 PBMC는 "분화 전 T 세포"와 혼용되어 명명될 수 있고, 상기 "유래한"은 "분리된" 또는 "획득된"과 혼용되어 명명될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "개체"는 암이 발병된 적이 없는 개체, 발병될 가능성이 있는 개체, 발병된 개체, 또는 발병된 후 완치된 개체를 모두 포함하며, 인간 또는 임의의 비인간 동물 등을 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 비인간 동물은 척추동물, 예컨대 영장류, 개, 소, 말, 돼지, 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 등일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 "개체"는 "대상체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "생물학적 시료"는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 또는 세포 배양 상등액일 수 있으며, 바람직하게 전혈일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)"는 항원 특이적 후천 면역(acquired immunity, adaptive immunity)을 수행하는 림프구를 의미한다. 세포독성 T 세포는 암세포, 바이러스, 박테리아 등의 병원체에 감염된 세포 등을 사멸시키고, TNF-α, IFN-γ 등의 사이토카인을 생성한다. 본 발명에 따른 세포독성 T 세포는 PBMC로부터 분화된 것일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 세포독성 T 세포는 "분화된 T 세포", "분화 후 T 세포" 또는 "CD8+ T 세포"와 혼용되어 명명될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "오가노이드"는 3차원 입체구조를 가지는 세포의 덩어리를 의미하며, 기관 또는 조직에서 분리한 세포를 3차원 배양을 통해 제조한 장기 유사체를 의미한다. 오가노이드는 기관 또는 조직을 구성하는 특이적 세포 집단들을 포함하고 있고, 실제 조직 또는 기관과 유사한 형태로 구조적 조직화가 이루어져 있으므로, 각 조직 또는 기관이 갖는 특수한 형태 및 기능을 재현할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "암 오가노이드"는 종양에서 분리한 세포(종양 세포 또는 암세포)로부터 제조된 오가노이드를 의미한다. 본 발명에 따른 암 오가노이드는 암이 발병된 개체(암 환자)로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 a단계의 PBMC 및 암 오가노이드는 15 : 1 내지 25 : 1의 세포 수 비율, 바람직하게 20 : 1의 세포 수 비율로 혼합되는 것일 수 있다. 또한, 상기 a단계의 공배양은 1 내지 42일 동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 PBMC 및 암 오가노이드가 상기 비율로 혼합되어 상기 기간 동안 공배양되는 경우, 정상 개체에서 유래한 PBMC가 암 환자 특이적 세포독성 T 세포로 분화되고, 분화되는 비율 또한 높아지므로, 암 환자에게서 혈액, 조직 등의 생물학적 시료를 채취하는 부담을 경감시킬 수 있다.
또한, 상기 b단계는 상기 a단계에서 획득한 세포독성 T 세포 즉, PBMC로부터 분화된 세포독성 T 세포)를 암 오가노이드와 혼합하여 공배양하는 단계로서, 생체 내 종양 미세환경을 인비트로(in vitro)에서 재현하는 단계이다. 또한, 상기 b단계는 정상 개체에서 유래한 PBMC로부터 분화된 암 환자 특이적인 세포독성 T 세포가 자기(self) 세포로 인식한 암 환자의 암세포 또는 암 오가노이드를 공격하고, 사멸시키는 단계이다.
이때, 상기 a단계에서 사용되는 암 오가노이드와 상기 b단계에서 사용되는 암 오가노이드는 동일한 암 환자에서 유래한 것일 수 있다.
또한, 상기 a단계 및 b단계는 동일한 배양공간에서 연속하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 a단계 및 b단계는 동일한 1개의 배양 플레이트에서 연속하여 수행될 수 있다.
본 발명에서, 상기 b단계의 세포독성 T 세포 및 암 오가노이드는 15 : 1 내지 25 : 1의 세포 수 비율, 바람직하게 20 : 1의 세포 수 비율로 혼합되는 것일 수 있다. 상기 세포독성 T 세포는 장기간 배양 시에도 사멸하지 않으므로 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세환경을 장기간 모사할 수 있으며, 이에 따라 항암제의 효능을 더욱 긴 시간 동안 높은 정확도로 평가할 수 있다.
또한, 상기 c단계는 상기 b단계의 세포독성 T 세포 및 암 오가노이드 혼합물에 항암제를 처리하는 단계로서, 구체적으로 상기 a단계에서 획득한 세포독성 T 세포(즉, PBMC로부터 분화된 세포독성 T 세포) 및 암 오가노이드의 혼합물에 항암제를 처리하는 단계이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항암제"는 암의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 물질로서, 구체적으로 암세포, 암 오가노이드 또는 종양 등을 사멸시키거나, 또는 이의 성장을 억제할 수 있는 물질을 의미한다.
본 명세서에서, 상기 "항암제"는 "약물"과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 또한 상기 "처리"는 "첨가" 또는 "투여"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 항암제는 PBMC, PBMC로부터 분화된 세포독성 T 세포, 세포독성 T 세포 및/또는 암 오가노이드를 타겟하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 항암제는 암 오가노이드만을 타겟하는 것이거나, 세포독성 T 세포만을 타겟하는 것이거나, 암 오가노이드 및 세포독성 T 세포를 동시에 타겟하는 것일 수 있다. 예를 들어, 암 오가노이드를 타겟하는 항암제는 아테졸리주맙(atezolizumab)일 수 있고, 세포독성 T 세포를 타겟하는 항암제는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)일 수 있다.
바람직하게, 상기 항암제는 화합물, 단백질, 융합 단백질, 화합물-단백질 복합체, 약물-단백질 복합체, 항체, 화합물-항체 복합체, 약물-항체 복합체, 아미노산, 펩티드, 바이러스, 탄수화물, 지질, 핵산, 추출물, 분획물 등을 제한 없이 포함한다.
예를 들어, 상기 항암제는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 융합 단백질, 항체, 앱타머, 항체-약물 복합체(ADC; Antibody Drug Conjugate) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게, 상기 항암제는 항체이거나, 또는 면역항암제일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항체"는 단일클론 항체, 다클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체를 포함하며, 신규 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지되거나 시판되는 항체들도 포함된다. 상기 항체는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하는 전체 길이의 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편은 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 여기에는 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "펩티드 미메틱스(Peptide Mimetics)"는 호르몬, 사이토카인, 효소 기질, 바이러스 또는 다른 생물학적 분자의 활성 리간드를 생물학적으로 모사하는 펩티드, 또는 변형된 펩티드를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "앱타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미한다.
또 다른 예를 들어, 상기 항암제는 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "안티센스 핵산"은 특정 mRNA의 서열에 대해 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA, RNA, 또는 이들의 단편 또는 유도체를 의미하며, mRNA의 서열에 상보적으로 결합 또는 혼성화하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "siRNA(small interfering RNA)"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통해 RNAi(RNA interference)를 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. siRNA는 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 갖는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 갖는 안티센스 RNA 가닥을 포함한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있으므로, 유전자 넉다운 방법 또는 유전자치료 방법 등에 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "shRNA(short hairpin RNA)"는 단일가닥 RNA로서 수소결합에 의해 이중가닥 부분을 형성하는 줄기(stem) 부분과 고리 형태를 띄는 루프(loop) 부분으로 구분되는 RNA를 의미한다. 다이서(Dicer) 등의 단백질에 의해 프로세싱되어 siRNA로 변환되고 siRNA와 동일한 기능을 수행할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "miRNA(micro RNA)"는 표적 RNA의 분해를 촉진시키거나 또는 이들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23 nt의 비코딩 RNA를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "리보자임(ribozyme)"은 특정 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 구성된다.
본 발명의 방법에 따라 효능이 평가되거나 스크리닝되는 항암제는 예를 들면, 담도암, 위암, 폐암, 간암, 대장암, 결장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 자궁암, 자궁경부암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암, 백혈병, 림프종, 섬유선종 등을 예방 또는 치료하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 d단계는 상기 c단계의 항암제가 처리된 군이 항암제 미처리 군 또는 양성 대조군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 항암제는 항암 효능이 있는 것으로 판단하는 단계이다.
용어, "양성 대조군"은 당업계에서 항암제로 사용되고 있는 약물을 처리한 군을 의미한다.
구체적으로, 상기 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸은 암 오가노이드의 체적, 면적 또는 세포 수 증감을 통해 확인하는 것일 수 있다. 또한, 상기 암 오가노이드의 체적, 면적 또는 세포 수가 감소하는 경우, 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가된 것으로 판단할 수 있다. 상기 암 오가노이드의 체적, 면적 또는 세포 수 증감은 당업계에 공지된 방법으로 확인할 수 있으며, 예로서 HCS(High-Content Screening), 유세포 분석(Flow-cytometer) 등의 분석 방법을 통해 확인할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 하기 단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) PBMC를 암 오가노이드와 혼합하여 공배양하여, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)를 획득하는 단계;
(b) 상기 a단계에서 획득한 세포독성 T 세포를 암 오가노이드와 혼합하여 공배양하는 단계;
(c) 상기 b단계의 세포독성 T 세포 및 암 오가노이드 혼합물에 항암제 후보물질을 처리하는 단계; 및
(d) 상기 c단계의 항암제 후보물질이 처리된 군에서 항암제 후보물질 미처리군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 후보물질을 항암제로 결정하는 단계.
본 발명에 따른 항암제의 스크리닝 방법에서, 특별히 달리 언급되지 않는 한, 관련 용어들은 앞서 설명된 용어들과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해된다.
구체적으로, 상기 a단계는 PBMC 및 암 오가노이드를 혼합하여 공배양하는 단계로서, PBMC를 세포독성 T 세포로 분화시켜 세포독성 T 세포를 획득하는 단계이다. 또한, 상기 a단계는 정상 개체에서 유래한 PBMC를 암 환자 특이적인 세포독성 T 세포로 분화시켜 세포독성 T 세포를 획득하는 단계이다. 또한, 상기 a단계는 정상 개체에서 유래한 PBMC로부터 분화된 암 환자 특이적인 세포독성 T 세포가 암 환자의 암세포 또는 암 오가노이드를 자기(self) 세포로 인식하도록 학습시키는 단계이다.
본 발명에서, 상기 a단계의 PBMC 및 암 오가노이드는 15 : 1 내지 25 : 1의 세포 수 비율, 바람직하게 20 : 1의 세포 수 비율로 혼합되는 것일 수 있다. 또한, 상기 a단계의 공배양은 1 내지 42일 동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 PBMC 및 암 오가노이드가 상기 비율로 혼합되어 상기 기간 동안 공배양되는 경우에는 정상 개체에서 유래한 PBMC이더라도 암 환자 특이적 세포독성 T 세포로 분화될 수 있으며, 분화되는 비율 또한 높아지므로, 암 환자에게서 혈액, 조직 등의 생물학적 시료를 채취하는 부담을 경감시킬 수 있다.
또한, 상기 b단계는 상기 a단계에서 획득한 세포독성 T 세포(즉, PBMC로부터 분화된 세포독성 T 세포)를 암 오가노이드와 혼합하여 공배양하는 단계로서, 생체 내 종양 미세환경을 인비트로(in vitro)에서 재현하는 단계이다. 또한, 상기 b단계는 정상 개체에서 유래한 PBMC로부터 분화된 암 환자 특이적인 세포독성 T 세포가 자기(self) 세포로 인식한 암 환자의 암세포 또는 암 오가노이드를 공격하고, 사멸시키는 단계이다.
이때, 상기 a단계에서 사용되는 암 오가노이드와 상기 b단계에서 사용되는 암 오가노이드는 동일한 암 환자에서 유래한 것일 수 있다.
또한, 상기 a단계 및 b단계는 동일한 배양공간에서 연속하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 a단계 및 b단계는 동일한 1개의 배양 접시에서 연속하여 수행될 수 있다.
본 발명에서, 상기 b단계의 PBMC 및 암 오가노이드는 15 : 1 내지 25 : 1의 세포 수 비율, 바람직하게 20 : 1의 세포 수 비율로 혼합되는 것일 수 있다. 상기 세포독성 T 세포는 장기간 배양 시에도 사멸하지 않으므로 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세환경을 장기간 모사할 수 있으며, 이에 따라 항암제의 효능을 더욱 긴 시간 동안 높은 정확도로 평가할 수 있다.
또한, 상기 c단계는 상기 b단계의 세포독성 T 세포 및 암 오가노이드 혼합물에 항암제 후보물질을 처리하는 단계로서, 구체적으로 상기 a단계에서 획득한 세포독성 T 세포(즉, PBMC로부터 분화된 세포독성 T 세포) 및 암 오가노이드의 혼합물에 항암제 후보물질을 처리하는 단계이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항암제 후보물질"은 암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 것으로 예상되는 물질을 의미하며, 구체적으로 암세포, 암 오가노이드 또는 종양 등을 사멸시키거나, 또는 이의 성장을 억제할 것으로 예상되는 물질을 의미한다.
본 명세서에서, 상기 '항암제 후보물질'은 '약물'과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 또한 상기 '처리'는 '첨가' 또는 '투여'와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
바람직하게, 상기 항암제 후보물질은 화합물, 단백질, 융합 단백질, 화합물-단백질 복합체, 약물-단백질 복합체, 항체, 화합물-항체 복합체, 약물-항체 복합체, 아미노산, 펩티드, 바이러스, 탄수화물, 지질, 핵산, 추출물, 분획물 등을 제한 없이 포함한다.
예로서, 상기 항암제 후보물질은 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 융합 단백질, 항체, 앱타머, 항체-약물 복합체(ADC; Antibody Drug Conjugate) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게, 상기 항암제 후보물질은 항체이거나, 또는 면역항암제일 수 있다.
또한, 상기 d단계는 상기 c단계의 항암제 후보물질이 처리된 군에서 항암제 후보물질 미처리군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 후보물질을 항암제로 결정하는 단계이다.
구체적으로, 상기 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸은 암 오가노이드의 체적, 면적 또는 세포 수 증감을 통해 확인하는 것일 수 있다. 또한, 상기 암 오가노이드의 체적, 면적 또는 세포 수가 감소하는 경우, 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가된 것으로 판단할 수 있다. 상기 암 오가노이드의 체적, 면적 또는 세포 수 증감은 당업계에 공지된 방법으로 확인할 수 있으며, 예로서 HCS(High-Content Screening), 유세포 분석(Flow-cytometer) 등의 분석 방법을 통해 확인할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 항암제의 효능 평가 방법을 사용하기 위한 항암제의 효능 평가 시스템으로서, PBMC 및 암 오가노이드를 포함하는 항암제의 효능 평가 시스템을 제공한다.
본 발명에 따른 항암제의 효능 평가 시스템에서, 특별히 달리 언급되지 않는 한, 관련 용어들은 앞서 설명된 용어들과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해된다.
본 발명에 따른 항암제의 효능 평가 시스템은 PBMC 및 암 오가노이드를 포함하는데, 상기 PBMC는 정상 개체에서 유래한 것이더라도 암 환자 특이적 세포독성 T 세포로 분화되는 특징을 나타낸다. 따라서, 암 환자에게서 혈액, 조직 등의 생물학적 시료를 채취하는 부담을 경감시킬 수 있다. 또한, 상기 PBMC로부터 분화된 세포독성 T 세포는 암 오가노이드와 장기간 배양 시에도 사멸하지 않으므로 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세환경을 장기간 모사할 수 있다. 따라서, 항암제가 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있고, 나아가 항암제의 효능을 더욱 긴 시간 동안 높은 정확도로 평가할 수 있으므로, 항암제의 효능 평가에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 항암제의 스크리닝 방법을 사용하기 위한 항암제의 스크리닝 시스템으로서, PBMC 및 암 오가노이드를 포함하는 항암제의 스크리닝 시스템을 제공한다.
본 발명에 따른 항암제의 스크리닝 시스템에서, 특별히 달리 언급되지 않는 한, 관련 용어들은 앞서 설명된 용어들과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해된다.
본 발명에 따른 항암제의 스크리닝 시스템은 PBMC 및 암 오가노이드를 포함하는데, 상기 PBMC는 정상 개체에서 유래한 것이더라도 암 환자 특이적 세포독성 T 세포로 분화되는 특징을 나타낸다. 따라서, 암 환자에게서 혈액, 조직 등의 생물학적 시료를 채취하는 부담을 경감시킬 수 있다. 또한, 상기 PBMC로부터 분화된 세포독성 T 세포는 암 오가노이드와 장기간 배양 시에도 사멸하지 않으므로 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세환경을 장기간 모사할 수 있다. 따라서, 항암제가 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있고, 항암제의 효능을 더욱 긴 시간 동안 높은 정확도로 평가할 수 있으므로, 항암제의 스크리닝에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 항암제의 효능 평가 방법, 스크리닝 방법, 효능 평가 시스템 또는 스크리닝 시스템은 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세환경을 매우 유사하게 재현할 수 있다. 또한, 정상 개체에서 유래한 PBMC를 암 환자 특이적인 세포독성 T 세포로 분화시켜 사용하므로, 암 환자에게서 혈액, 조직 등의 생물학적 시료를 채취하는 부담을 경감시킬 수 있고, 항암제의 효능을 높은 정확도로 평가할 수 있다.
도 1은 제1단계에 따라 암 오가노이드와 공배양된 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)에 대한 FACS 분석 결과로서, A는 매칭(Matching) 조건, B는 논매칭(Non-matching) 조건, C는 노멀(Normal) 조건에 관한 크로마토그램이다. CD56+CD3+에 대한 gating 이후 CD8+에 대하여 gating을 수행하였다.
도 2는 제1단계에 따른 공배양 시작 이후 14일차에 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 결과로서, 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프이다. 대조군은 미처리군, 실험군은 아테졸리주맙 10 nM 처리군을 의미한다.
도 3은 제1단계에 따른 공배양 시작 이후 28일차에 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 결과로서, 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프이다. 대조군은 미처리군, 실험군은 아테졸리주맙 10 nM 처리군을 의미한다.
도 4는 제1단계에 따른 공배양 시작 이후 42일차에 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 결과로서, 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프이다. 대조군은 미처리군, 실험군은 아테졸리주맙 10 nM 처리군을 의미한다.
도 5는 제1단계에 따른 공배양 시작 이후 14일차, 28일차 또는 42일차에 각각 아테졸리주맙을 처리한 결과로서, 아테졸리주맙의 전반적인 효능(Overall efficiency)을 보여주는 그래프이다.
도 6은 제1단계에 따른 공배양 시작 이후 14일차, 28일차 또는 42일차에 각각 아테졸리주맙을 처리한 결과로서, 아테졸리주맙의 전반적인 효능(Overall efficiency)을 보여주는 그래프이다. A는 대조군 및 실험군 1 내지 3에 대한 결과, B는 대조군 및 실험군 4 내지 6에 대한 결과에 관한 것이다.
도 2는 제1단계에 따른 공배양 시작 이후 14일차에 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 결과로서, 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프이다. 대조군은 미처리군, 실험군은 아테졸리주맙 10 nM 처리군을 의미한다.
도 3은 제1단계에 따른 공배양 시작 이후 28일차에 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 결과로서, 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프이다. 대조군은 미처리군, 실험군은 아테졸리주맙 10 nM 처리군을 의미한다.
도 4는 제1단계에 따른 공배양 시작 이후 42일차에 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 결과로서, 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프이다. 대조군은 미처리군, 실험군은 아테졸리주맙 10 nM 처리군을 의미한다.
도 5는 제1단계에 따른 공배양 시작 이후 14일차, 28일차 또는 42일차에 각각 아테졸리주맙을 처리한 결과로서, 아테졸리주맙의 전반적인 효능(Overall efficiency)을 보여주는 그래프이다.
도 6은 제1단계에 따른 공배양 시작 이후 14일차, 28일차 또는 42일차에 각각 아테졸리주맙을 처리한 결과로서, 아테졸리주맙의 전반적인 효능(Overall efficiency)을 보여주는 그래프이다. A는 대조군 및 실험군 1 내지 3에 대한 결과, B는 대조군 및 실험군 4 내지 6에 대한 결과에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1. 항암제 효능 평가 및 스크리닝 시스템 확립
암이 생체 내 존재하고 있는 종양 미세환경을 유사하게 재현함으로써, 약물이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있는 인비트로(in vitro) 효능 평가 및 스크리닝 시스템을 확립하고자 하였다.
구체적으로, 암 오가노이드 및 T 세포가 공존하는 공배양(co-culture) 시스템을 이용하였다. 상기 암 오가노이드 및 T 세포는 암이 발병된 개체(암 환자), 암이 발병되지 않은 정상 개체, 또는 암이 발병된 후 완치된 정상 개체 등의 다양한 개체로부터 유래할 수 있다. 이들의 출처에 따라 공배양 시스템은 매칭(Matching), 논매칭(Non-matching) 및 노멀(Normal) 조건으로 구분할 수 있다. 매칭 조건은 암 오가노이드 및 T 세포가 동일한 암 환자에서 유래한 것을 사용하며, 예를 들어 암 환자 A에서 유래한 암 오가노이드 및 암 환자 A에서 유래한 T 세포를 사용한다. 논매칭 조건은 암 오가노이드 및 T 세포가 서로 다른 암 환자에서 유래한 것을 사용하며, 예를 들어 암 환자 A에서 유래한 암 오가노이드 및 암 환자 B에서 유래한 T 세포를 사용한다. 노멀 조건은 암 오가노이드는 암 환자에서 유래한 것, T 세포는 정상 개체에서 유래한 것을 사용하며, 예를 들어 암 환자 A에서 유래한 암 오가노이드 및 정상 개체 C에서 유래한 T 세포를 사용한다.
상기 매칭 및 논매칭 조건은 암 오가노이드와 T 세포 모두가 이미 암이 발병된 개체에서 유래한다는 점에서 생체 내 종양 미세환경을 인비트로에서 더욱 유사하게 재현해낼 수 있는 장점이 있다. 다만, T 세포를 분리해내기 위해서는 개체로부터 혈액 시료를 채취하는 과정 등이 필요한데, 암 환자에게서 혈액 시료를 채취하는 것은 암 환자들의 병세가 호전되는 것에 부정적인 영향을 미친다.
따라서, 암 환자에게서 혈액, 조직 등의 생물학적 시료를 채취하는 부담을 경감시키기 위한 목적으로, 매칭 또는 논매칭 조건과 유사하거나 더 우수한 정도로 종양 미세환경을 재현해낼 수 있는 노멀 조건의 공배양 시스템을 확립하였다.
구체적으로, 상기 노멀 조건의 시스템은 정상 개체 유래 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)와 암 환자 유래 암 오가노이드를 공배양하여 PBMC를 T 세포로 분화시키는 제1단계; 상기 분화된 T 세포를 환자 유래 암 오가노이드와 공배양하는 제2단계를 거쳐 제조하였다.
더욱 구체적으로, 정상 개체로부터 분리한 PBMC는 나이브(naive) T 세포가 대부분을 차지하며, 암세포를 공격할 수 있는 분화된 형태의 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)는 매우 낮은 비율로 존재한다. 이에, 생체 내 종양 미세환경을 모사하기 위하여, 암 오가노이드를 PBMC의 항원(antigen)으로 제공함으로써 PBMC를 세포독성 T 세포로 분화시켰다. 아울러, 정상 개체에서 유래한 PBMC에 대해서는 암 환자에서 유래한 암 오가노이드를 항원으로 제공함으로써 PBMC를 세포독성 T 세포로 분화시키고, 동시에 정상 개체에서 유래한 세포독성 T 세포가 암 환자에서 유래한 암 오가노이드를 자기(self) 세포로 인식할 수 있도록 하였다.
이는, 폐암 오가노이드와 PBMC을 공배양하는 제1단계를 통해 수행하였다. 암 오가노이드 및 PBMC는 다음과 같은 방법으로 제조 및 준비하였다.
암 오가노이드의 종류로는 폐암 오가노이드를 이용하였다. 환자에서 얻은 폐암 조직을 단일 세포(single cell)로 분리하여 이를 ECM(extracellular matrix)과 함께 배양함으로써 3D 구조를 갖는 오가노이드를 제조하였다. 형성된 폐암 오가노이드는 병리 분석을 통해 종양임을 확인하였고, Tryp-LE 사용을 통해 단일 세포로 분리한 후 사용하였다.
PBMC는 기증자로부터 얻은 혈액에 대하여 Ficoll을 이용하여 분리하였으며, 분리 후 사용 전까지는 질소탱크에 보관하였고, 사용 직전에 해동하여 하루 동안 안정화를 거친 다음 사용하였다.
이후, 단일 세포의 폐암 오가노이드와 PBMC를 1 : 20의 세포 수 비율로 혼합하고(7.5x103 cell/well : 1.5x105/well), 0 내지 42일간 배양함으로써 제1단계를 수행하였다. 배양기간은 세포독성 T 세포의 발현이 10% 이상 나올때까지 Flow cytometer를 이용하여 확인하며 진행하였다. 이후, 상기의 방법으로 세포독성 T 세포에 암 환자 유래 암 오가노이드를 1 : 20의 세포 수 비율로 혼합하여 추가적으로 배양함으로써 제2단계를 수행하였고, 이를 통해 세포독성 T 세포가 암 오가노이드를 사멸시키는 생체 내 종양 미세환경을 모사하는 시스템을 확립하였다.
실시예 2. 항암제 효능 평가 및 스크리닝 시스템 검증
실시예 2.1. 세포독성 T 세포 마커 발현 확인
상기 실시예 1에서 확립한 시스템이 약물 효능 평가 및 스크리닝에 적절히 사용될 수 있는지 여부를 검증하기 위하여, 제1단계 수행에 의한 PBMC의 세포독성 T 세포로의 분화가 잘 이루어지는지 분석하였다.
구체적으로, 세포독성 T 세포 마커로서 CD56, CD3 및 CD8 단백질을 세포 표면에 발현하는 세포의 비율을 분석하였다. 각각의 매칭, 논매칭 및 노멀 조건에서 제1단계에서 공배양된 PBMC에 대하여 FACS 분석을 수행하였고, 상기 PBMC 집단에 존재하는 CD56+CD3+CD8+ T 세포의 비율을 분석하였다.
| Day 0 | Day 14 | Day 28 | Day 42 | |
| 매칭 | 12.8% | 42.5% | 60.4% | 13.1% |
| 논매칭 | 12.6% | 46.4% | 53.7% | 44.5% |
| 노멀 | 0.3% | 9.6% | 50.8% | 62.4% |
그 결과, 상기 표 1 및 도 1에서 볼 수 있듯이, 매칭 조건에서는 세포독성 T 세포가 제1단계의 공배양 시작 0일차 ~ 28일차까지 급격하게 증가하였고, 28일차에는 약 60.4% 정도의 세포독성 T 세포가 존재하였다. 그러나, 42일차 이후의 장기간 공배양 시에는 세포독성 T 세포가 대부분 사멸하여 공배양 시작 0일차와 동일한 수준인 13.1% 정도로 되돌아감을 확인하였다.
논매칭 조건에서는 세포독성 T 세포가 제1단계의 공배양 시작 0일차 ~ 28일차까지 급격하게 증가하였고, 28일차에는 약 53.7% 정도의 세포독성 T 세포가 존재하였다. 42일차 이후의 장기간 공배양 시에도 세포독성 T 세포는 약 44.5% 정도의 낮지 않은 분화 수준을 유지함을 확인하였다.
노멀 조건에서는 제1단계의 공배양 시작 0일차 ~ 14일차까지는 세포독성 T 세포가 거의 존재하지 않았다. 그러나, 28일차부터 세포독성 T 세포가 급격하게 증가하여 50% 정도의 높은 수준을 유지하였다. 특히, 42일차 이후의 장기간 공배양 시 세포독성 T 세포는 약 62.4% 정도의 현저히 높은 수준을 나타내었으며, 이는 매칭 조건에서의 최대치(28일차의 60.4%)보다 더 높으며, 42일차의 13.1%보다는 약 4.7배 이상 높은 수준임을 확인하였다.
이러한 결과는, 상기 실시예 1의 방법에 따라 PBMC를 세포독성 T 세포로 분화시키고(제1단계), 및 상기 세포독성 T 세포를 사용하여 종양 미세환경을 모사한 인비트로 시스템을 제조하는 경우(제2단계), 정상 개체에서 분리한 PBMC도 암 환자에서 분리한 PBMC와 유사한 수준으로 세포독성 T 세포로 분화될 수 있음을 시사하며, 이에 따라 약물 스크리닝, 효능 평가 등에 사용될 시스템을 효율적인 방법으로 생체 내 종양 미세환경과 더욱 유사하게 제조할 수 있음을 시사한다.
실시예 2.2. ICP(interferon-producing cell) 마커 발현 확인
상기 실시예 1에서 확립한 시스템이 약물 효능 평가 및 스크리닝에 적절히 사용될 수 있는지 여부를 검증하기 위하여, 제1단계 수행에 의한 PBMC의 세포독성 T 세포로의 분화가 잘 이루어지는지 분석하였다.
구체적으로, 세포독성 T 세포에서는 ICP (ImmuneCheck Point Protein)를 발현하는데 사람에 따라 발현량이 다른것으로 알려져 있으며, 상기 세포독성 T 세포에서 ICP 마커가 발현이 매칭조건과 노멀에서 분화되는 조건에서 동일하게 발현되는지 분석하였다. 상기 실시예 1.1에 따라 분화 및 분리가 완료된 세포독성 T 세포에 대하여 FACS 분석을 수행하였고, 상기 세포독성 T 세포 중에서 ICP 마커로 알려진 LAG3, TIM3, PD-1, Light, 4-1BB 또는 BTLA를 세포 표면에 발현하는 세포독성 T 세포의 비율(하기 표 2에서, %로 나타냄) 및 수(하기 표 2에서, 괄호 안에 기재함)를 분석하였다.
| 매칭 | 논매칭 | 노멀 | |
| LAG3 | 96.0% (499) | 94.5% (431) | 95.7% (367) |
| TIM3 | 98.1% (986) | 98.0% (1007) | 97.7% (976) |
| PD-1 | 94.5% (465) | 92.2% (172) | 92.8% (92) |
| Light | 99.1% (2062) | 98.3% (2378) | 98.8% (1875) |
| 4-1BB | 97.8% (301) | 95.5% (405) | 96.8% (186) |
| BTLA | 98.8% (202) | 98.2% (250) | 98.8% (181) |
그 결과, 상기 표 2에서 볼 수 있듯이, 각각의 매칭, 논매칭 및 노멀 조건에서, 세포독성 T 세포는 모두 ICP 마커가 비슷한 수준으로 발현하였다.
이러한 결과는, 상기 실시예 1의 방법에 따라 PBMC를 세포독성 T 세포로 분화시키고(제1단계), 및 상기 세포독성 T 세포를 사용하여 시스템을 제조하는 경우(제2단계), 정상 개체에서 분리한 PBMC도 암 환자에서 분리한 PBMC와 유사한 수준으로 세포독성 T 세포로 분화될 수 있음을 시사하며, 이에 따라 약물 스크리닝, 효능 평가 등에 사용될 시스템을 효율적인 방법으로 생체 내 종양 미세환경과 더욱 유사하게 제조할 수 있음을 시사한다.
실시예 2.3. 면역항암제 효능 평가
실시예 2.3.1. 배양 기간에 따른 효능 평가
상기 실시예 1에서 확립한 시스템이 효능 평가 및 약물 스크리닝에 적절히 사용될 수 있는지 여부를 검증하기 위하여, 제1단계 및 제2단계 수행에 따라 제조된 시스템에 예시 약물로서 아테졸리주맙(atezolizumab)을 처리하여 이의 암 오가노이드 사멸능을 확인하였다. 아테졸리주맙은 현재 폐암 치료제로 시판되어 사용되고 있는 약물이다.
구체적으로, 상기 시스템은 제1단계의 공배양을 42일 동안 수행하였는데, 공배양 시작 14일차, 28일차, 42일차에 각각 아테졸리주맙 10 nM을 처리하였고, 72시간 동안 약물처리에 따른 효능을 확인하였다. 이후, 암 오가노이드의 성장률을 아테졸리주맙 처리 0시간, 12시간, 24시간 및 72시간째에 각각 측정하여 아테졸리주맙의 암 오가노이드의 성장 저해(암 오가노이드의 사멸) 효과와 전반적인 효능(Overall efficacy)을 분석하였다. 상기 전반적인 효능은 약물 처리 72시간 후 약물 미처리군의 오가노이드 면적에 대비하여, 약물 처리군의 면적 변화를 산출함으로써 약물의 효능을 평가하였다.
그 결과, 도 2 내지 4에서 볼 수 있듯이,
제1단계의 공배양 시작 14일차에는 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 성장 저해(암 오가노이드의 사멸) 효과가 매칭 조건에서 가장 우수하게 나타났으며, 논매칭 조건에서는 매칭 조건보다 낮은 효과를 나타내었고, 노멀 조건에서는 효과가 거의 나타나지 않아 대조군과 유사한 정도의 성장률을 보였다(도 2).
반면, 제1단계의 공배양 시작 28일차에는 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 성장 저해(암 오가노이드의 사멸) 효과가 매칭 조건에서 가장 우수하게 나타났으나, 논매칭 또는 노멀 조건 또한 상기 매칭 조건과 유사한 정도의 효과를 나타내었다(도 3).
특히, 제1단계의 공배양 시작 42일차에는 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 성장 저해(암 오가노이드의 사멸) 효과가 매칭 조건에서 가장 낮았으며, 노멀 조건에서 현저히 우수한 효과를 나타내었다. 논매칭 조건의 효과는 노멀 조건보다 낮은 정도였다(도 4).
이를 종합하면, 도 5에서 볼 수 있듯이,
매칭 조건에서는 아테졸리주맙의 전반적인 효능이 제1단계의 공배양 시작 0일차 ~ 28일차까지 약 35 내지 36% 정도로 유지되나, 42일차 이후의 장기간 배양 시에는 그 효과가 절반 수준인 약 16% 정도로 급격히 감소하였다.
논매칭 조건에서는 아테졸리주맙의 전반적인 효능이 제1단계의 공배양 시작 0일차 ~ 42일차까지 약 26 내지 33% 정도로 유사하게 유지되었다.
노멀 조건에서는 제1단계의 공배양 시작 0일차 ~ 14일차까지는 아테졸리주맙의 전반적인 효능이 약 3% 정도로 거의 나타나지 않았으나, 28일차부터 약 32% 정도로 급격하게 증가하여 42일차 이후의 장기간 공배양 시에는 그 효과가 약 35% 정도로 더욱 향상되었다. 또한, 이러한 효과는 논매칭 조건의 최대 효과(약 33%)보다 우수하며, 매칭 조건의 최대 효과(약 36%)와 유사하였다.
이러한 결과는, 상기 실시예 1에 따른 방법으로 제조된 시스템은 종양 미세환경을 모사하므로, 약물 스크리닝, 효능 평가 등에 유용하게 사용될 수 있으며,
특히, 노멀 조건은 정상 개체의 PBMC를 암 환자 특이적인 세포독성 T 세포로 분화시켜 사용하는데, 이는 암 환자로부터 추가적인 생물학적 시료를 채취하지 않아도 되는 장점이 있고, 장기간의 공배양 시에도 약물의 효능을 높은 정확도로 평가할 수 있으므로, 반감기가 증가된 신규 약물에 대한 스크리닝 및 효능 평가 등에 유용하게 활용될 수 있음을 시사한다.
실시예 2.3.2. 노멀 조건에서의 효능 평가
상기 실시예 1에서 확립한 노멀 조건의 공배양 시스템이 약물 효능 평가 및 약물 스크리닝에 적절히 사용될 수 있는지 검증하였다.
구체적으로, 서로 다른 암 환자(환자 A, 환자 B)로부터 유래된 암 오가노이드를 사용하여, 정상인(정상 개체 C) 유래 PBMC를 각각 세포독성 T 세포로 분화시켰다(제1단계). 각 실험군에 사용한 PBMC 및 암 오가노이드의 유래를 정리하면 하기 표 3과 같다.
| PBMC 유래 | 암 오가노이드 유래 | 비고 | |
| 대조군 | - | 환자 A | - |
| 실험군 1 | 환자 A | 환자 A | 매칭 조건 |
| 실험군 2 | 환자 B | 환자 A | 논매칭 조건 |
| 실험군 3 | 정상 개체 C | 환자 A | 노멀 조건 |
| 실험군 4 | 환자 A | 환자 B | 논매칭 조건 |
| 실험군 5 | 환자 B | 환자 B | 매칭 조건 |
| 실험군 6 | 정상 개체 C | 환자 B | 노멀 조건 |
각 실험군에서 분화된 세포독성 T 세포를 환자 A로부터 유래된 암 오가노이드와 혼합하여 공배양하였으며(제2단계), 상기 공배양물에 상기 실시예 2.3.1.에 따른 방법으로 아테졸리주맙을 처리하였고, 이의 효능을 평가하였다.
그 결과, 도 6의 A에서 볼 수 있듯이,
실험군 1 내지 3의 경우(제1단계 및 제2단계에서 동일한 암 환자 A 유래의 암 오가노이드를 사용함), 암 오가노이드만 존재하는 대조군에 비하여 아테졸리주맙의 전반적인 효능이 최대 약 5배 높은 것을 확인하였다. 특히, 실험군 3(정상 개체 C 유래 PBMC를 환자 A에 대한 세포독성 T 세포로 분화시킨 노멀 조건)의 경우, 제1단계의 공배양 시작 15일차부터 아테졸리주맙의 전반적인 효능이 급격하게 증가하여 약 35% 정도에 이르렀으며, 42일차 이후의 장기간 공배양 시에도 그 효과가 약 30% 정도로 높게 유지됨을 확인하였다.
반면, 실험군 4 내지 6의 경우(제1단계 및 제2단계에서 서로 다른 암 환자 유래의 암 오가노이드를 사용함. 즉, 제1단계는 암 환자 B 유래의 것, 제2단계는 암 환자 A 유래의 것을 사용함), 아테졸리주맙의 전반적인 효능이 암 오가노이드만 존재하는 대조군과 유사함을 확인하였다. 특히, 실험군 6(정상 유래 PBMC를 세포독성 T 세포로 분화시킨 노멀 조건)의 경우에도, 아테졸리주맙의 전반적인 효능이 대조군과 비교 시 유의적인 차이가 나지 않음을 확인하였다.
이러한 결과는, 동일한 정상 개체 유래 PBMC를 이용한 공배양 조건이더라도, 제1단계와 제2단계에서 사용하는 암 오가노이드가 동일한 암 환자에서 유래한 것일 때만 상기 시스템이 약물 스크리닝, 효능 평가 등에 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다.
Claims (11)
- 하기 단계를 포함하는, 항암제의 효능 평가 방법:
(a) 정상 개체에서 유래한 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 암 환자에서 유래한 암 오가노이드와 혼합하여 공배양하여, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)를 획득하는 단계;
(b) 상기 a단계에서 획득한 세포독성 T 세포를 암 오가노이드와 혼합하여 공배양하는 단계;
(c) 상기 b단계의 세포독성 T 세포 및 암 오가노이드의 혼합물에 항암제를 처리하는 단계; 및
(d) 상기 c단계의 항암제가 처리된 군이 항암제 미처리군 또는 양성 대조군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 항암제는 항암 효능이 있는 것으로 판단하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법:
(a) 정상 개체에서 유래한 PBMC를 암 환자에서 유래한 암 오가노이드와 혼합하여 공배양하여, 세포독성 T 세포를 획득하는 단계;
(b) 상기 a단계에서 획득한 세포독성 T 세포를 암 오가노이드와 혼합하여 공배양하는 단계;
(c) 상기 b단계의 세포독성 T 세포 및 암 오가노이드의 혼합물에 항암제 후보물질을 처리하는 단계; 및
(d) 상기 c단계의 항암제 후보물질이 처리된 군에서 항암제 후보물질 미처리군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 후보물질을 항암제로 결정하는 단계. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 a단계의 암 오가노이드와 상기 b단계의 암 오가노이드는 동일한 암 환자에서 유래한 것인, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 a단계의 공배양은 14일 내지 42일 동안 수행되는 것인, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 항암제는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 융합 단백질, 항체, 앱타머, 항체-약물 복합체(ADC; Antibody Drug Conjugate), DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, siRNA, shRNA, miRNA 및 리보자임으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 암은 담도암, 위암, 폐암, 간암, 대장암, 결장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 자궁암, 자궁경부암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암, 림프종 및 섬유선종으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 d단계의 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸은 암 오가노이드의 체적, 면적 또는 세포 수 증감을 통해 확인하는 것인, 방법. - 제1항에 따른 항암제의 효능 평가 방법을 사용하기 위한 항암제의 효능 평가 시스템으로서, PBMC 및 암 오가노이드를 포함하는 항암제의 효능 평가 시스템.
- 제2항에 따른 항암제의 스크리닝 방법을 사용하기 위한 항암제의 스크리닝 시스템으로서, PBMC 및 암 오가노이드를 포함하는 항암제의 스크리닝 시스템.
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220073120A KR102511631B1 (ko) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | Pbmc 유래 세포독성 t 세포의 신규 용도 |
| PCT/KR2023/008325 WO2023244055A1 (ko) | 2022-06-15 | 2023-06-15 | Pbmc 유래 세포독성 t 세포의 신규 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220073120A KR102511631B1 (ko) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | Pbmc 유래 세포독성 t 세포의 신규 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102511631B1 true KR102511631B1 (ko) | 2023-03-20 |
Family
ID=85796396
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220073120A KR102511631B1 (ko) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | Pbmc 유래 세포독성 t 세포의 신규 용도 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102511631B1 (ko) |
| WO (1) | WO2023244055A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023244055A1 (ko) * | 2022-06-15 | 2023-12-21 | 오가노이드사이언스 주식회사 | Pbmc 유래 세포독성 t 세포의 신규 용도 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200105852A (ko) * | 2017-12-21 | 2020-09-09 | 코닌클리즈케 네덜란드세 아카데미 반 베텐샤펜 | 면역세포 오가노이드 공-배양물 |
| WO2021075528A1 (ja) * | 2019-10-17 | 2021-04-22 | 公立大学法人横浜市立大学 | 薬物毒性評価方法 |
| US20220064597A1 (en) * | 2018-12-18 | 2022-03-03 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Generation of organoid-primed T (opT) cells with memory phenotype |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102511631B1 (ko) * | 2022-06-15 | 2023-03-20 | 오가노이드사이언스 주식회사 | Pbmc 유래 세포독성 t 세포의 신규 용도 |
-
2022
- 2022-06-15 KR KR1020220073120A patent/KR102511631B1/ko active IP Right Grant
-
2023
- 2023-06-15 WO PCT/KR2023/008325 patent/WO2023244055A1/ko unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200105852A (ko) * | 2017-12-21 | 2020-09-09 | 코닌클리즈케 네덜란드세 아카데미 반 베텐샤펜 | 면역세포 오가노이드 공-배양물 |
| US20220064597A1 (en) * | 2018-12-18 | 2022-03-03 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Generation of organoid-primed T (opT) cells with memory phenotype |
| WO2021075528A1 (ja) * | 2019-10-17 | 2021-04-22 | 公立大学法人横浜市立大学 | 薬物毒性評価方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Dijkstra et al., Cell, Vol. 174, 2018, pp. 1586-1598.* * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023244055A1 (ko) * | 2022-06-15 | 2023-12-21 | 오가노이드사이언스 주식회사 | Pbmc 유래 세포독성 t 세포의 신규 용도 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023244055A1 (ko) | 2023-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Boucherit et al. | 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies | |
| JP7451468B2 (ja) | 非造血組織常在性γδ Ｔ細胞の増幅および該細胞の使用 | |
| JP6899333B2 (ja) | 汎用キラーｔ細胞 | |
| JP7093302B2 (ja) | がん適応症のためのマルチモーダル治療用細胞系に関連する組成物および方法 | |
| Wagner et al. | Tumor-derived lactic acid contributes to the paucity of intratumoral ILC2s | |
| JP6813514B2 (ja) | 患者由来異種移植片を用いた非ｈｌａマッチヒト化ｎｓｇマウスモデル | |
| JP2016509839A (ja) | 濃縮された腫瘍反応性ｔ細胞集団を腫瘍から作製する方法 | |
| AU2011351445A1 (en) | SiRNA against Cbl-b and optionally IL2 und IL12 for use in the treatment of cancer | |
| KR102511631B1 (ko) | Pbmc 유래 세포독성 t 세포의 신규 용도 | |
| US20230357722A1 (en) | Methods for identifying modulators of natural killer cell interactions | |
| WO2023102120A1 (en) | Organoid co-cultures and methods of use thereof | |
| Wang et al. | PD-1/PD-L1 Checkpoint Inhibitors Are Active in the Chicken Embryo Model and Show Antitumor Efficacy In Ovo | |
| CN109432429A (zh) | Pd1分子抑制剂在t淋巴细胞白血病治疗中的应用 | |
| CN110358737B (zh) | 一种利用外泌体制备嵌合抗原受体t淋巴细胞的方法 | |
| Chen et al. | A paracrine circuit of IL-1β/IL-1R1 between myeloid and tumor cells drives glioblastoma progression | |
| CN108700566A (zh) | 免疫原性调节的方法 | |
| KR102527906B1 (ko) | 수지상 세포의 약물 효능평가 용도 | |
| Krautwald et al. | Ectopic expression of CCL19 impairs alloimmune response in mice | |
| KR102527911B1 (ko) | 조절 t 세포의 약물 스크리닝 용도 | |
| KR102511633B1 (ko) | M1 마크로파지 및 m2 마크로파지 혼합물을 이용한 항암제 효능 평가 방법 | |
| KR102511632B1 (ko) | 암 오가노이드 및 til 포함 종양 미세환경을 이용한 항암제 효능 평가 방법 | |
| US20220213439A1 (en) | Systems and methods for modulating a cell phenotype | |
| JP2023548106A (ja) | 修飾された免疫細胞およびその用途 | |
| JP2023526804A (ja) | Ｎｋ細胞の活性化及び増幅のために遺伝的に操作された細胞株、及びその用途 | |
| KR102478897B1 (ko) | T세포 및 마크로파지를 이용한 항암제 효능 평가 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |