JP7093302B2 - がん適応症のためのマルチモーダル治療用細胞系に関連する組成物および方法 - Google Patents

がん適応症のためのマルチモーダル治療用細胞系に関連する組成物および方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１６年１月１１日に出願された米国特許出願第６２／２７７１３０号明細書、２０１６年７月７日に出願された米国特許出願第６２／３５９４４８号明細書、２０１６年８月４日に出願された米国特許出願第６２／３７０９１５号明細書、２０１６年１１月１１日に出願された米国特許出願第６２／４２０９７３号明細書の優先権を主張する。
配列表
本出願は、その内容全体が参照により援用される、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含む。２０１７年１月５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｒ２０８１－７０２０ＷＯ＿ＳＬ．ｔ×ｔと命名され、サイズは２４，８００バイトである。
赤血球は、例えば、毒性代謝物を分解するための、または生体異物を不活性化するための、および他の生物医学的用途における、薬物送達系としての使用が検討されている。
本発明は、マルチモーダル療法に関連する組成物および方法を含む。この療法は、例えば、がんを治療するために有用である。本明細書に記載のマルチモーダル治療は、例えば、がんを有する対象などのそれを必要とする対象に治療効果を提供するために、協調様式で機能する複数の薬剤を提供および／または投与する。一般に、本明細書に記載のマルチモーダル療法は、協調様式（例えば、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性）で機能する、複数の作用剤（例えば、ポリペプチド）（例えば、発現しまたはそれを含有する）を含む、例えば、除核赤血球などの遺伝子操作赤血球製剤の対象への投与を含む。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、第１の外因性ポリペプチド、第２の外因性ポリペプチド、および第３の外因性ポリペプチドなどの複数のポリペプチド（例えば、外因性ポリペプチド）などの複数の薬剤を含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、複数の外因性ポリペプチドを含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球を提供し、複数の第１および第２の外因性ポリペプチドは、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性の活性を有する。
いくつかの態様では、本開示は、第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドを含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球を提供し、
ａ）第１および第２の外因性ポリペプチドは同一標的に作用し、任意選択的に、標的は細胞表面受容体および／または内因性ヒトタンパク質であり；
ｂ）第１の外因性ポリペプチドは第１の内因性ヒトタンパク質に、第２の外因性ポリペプチドは第２の内因性ヒト標的タンパク質に、例えば、５００、２００、１００、５０、２０、１０、５、２、または１ｎＭ未満のＫｄで結合し；
ｃ）第１の外因性ポリペプチドは第１の標的に作用し（例えば、結合し）、第２の外因性ポリペプチドは第２の標的に作用し（例えば、結合し）、第１および第２の標的は同一生物学的経路の構成要素であり、任意選択的に、標的は、細胞表面受容体、内因性ヒトタンパク質、またはその双方であり；
ｄ）第１の外因性ポリペプチドは第１のアポトーシス促進ポリペプチドを含み、第２の外因性ポリペプチドは第２のアポトーシス促進ポリペプチド、例えば、ＴＲＡＩＬ受容体リガンド、例えば、ＴＲＡＩＬポリペプチドを含み；
ｅ）第１および第２の外因性ポリペプチドは互いに近接しており、少なくとも１、２、５、１０、３０、または６０秒間；１、２、５、１０、３０、または６０分間、または１、２、３、６、１２、または１４時間にわたり、例えば、１０、７、５、４、３、２、１、０．５、０．２、または０．１ｎｍ未満の間隔であり；
ｆ）第１および第２の外因性ポリペプチドは、互いに５００、２００、１００、５０、２０、１０、５、２、または１ｎＭ未満のＫｄを有し；
ｇ）第１の外因性ポリペプチドは、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子などのＭＨＣ分子である抗原提示ポリペプチドを含み、第２の外因性ポリペプチドは、抗原、例えば、がん抗原を含み；
ｈ）第１および第２の外因性ポリペプチドは異なる標的に作用し、任意選択的に、標的の少なくとも１つは、細胞表面受容体および／または内因性ヒトタンパク質であり、例えば、がん細胞などの第１の細胞型に結合する第１の外因性ポリペプチド、および例えば、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞などの第２の細胞型に結合する第２の外因性ポリペプチドであり；
ｉ）第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドは、重量基準またはコピー数基準で、約１：１、約２：１～１：２、約５：１～１：５、約１０：１～１：１０、約２０：１～１：２０、約５０：１～１：５０、約１００：１～１：１００の存在比を有し；
ｊ）第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドは、それぞれ、約１：１、約２：１～１：２、約５：１～１：５、約１０：１～１：１０、約２０：１～１：２０、約５０：１～１：５０、約１００：１～１：１００の比率で、第１の標的および第２の標的に対するＫｄを有し；
ｋ）第１の外因性ポリペプチドは第１の標的に対する第１の活性（例えば、結合）を有し、第２の外因性ポリペプチドは第１の標的に対する第２の活性（例えば、結合）を有し、例えば、第１および第２の外因性ポリペプチドは単一標的に結合し；
ｌ）第１の外因性ポリペプチドは第１の標的に作用し（例えば、結合し）、第２の外因性ポリペプチドは第２の標的に作用し（例えば、結合し）、第１および第２の標的は同一経路の部分であり、任意選択的に、第１の外因性ポリペプチドは第１の標的に作用し、同時に第２の外因性ポリペプチドは第２の標的に作用し；
ｍ）第１の外因性ポリペプチドは第１の標的に作用し（例えば、結合し）、第２の外因性ポリペプチドは第２の標的に作用し（例えば、結合し）、第１および第２の標的は異なる経路の部分であり、任意選択的に、第１および第２の経路はどちらも所与の細胞性応答を促進するように作用し；
ｎ）第１の外因性ポリペプチドは、除核赤血球を例えば、ヒト細胞などの所望の部位に局在させ、第２の外因性ポリペプチドは、例えば、Ｔ細胞活性化活性または抗原提示活性などの免疫調節活性などの治療活性を有し（例えば、がんワクチン）；
ｏ）第１の外因性ポリペプチドは第１の標的、例えば、第１の細胞、例えば、がん細胞に結合し、第２の外因性ポリペプチドは第２の標的、例えば、第２の細胞、例えば、第２の細胞型、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に結合し；
ｐ）第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドは、非ヒトタンパク質であり；
ｑ）第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドはどちらも、例えば、生合成酵素などの酵素であり；
ｒ）第１の外因性ポリペプチドは中間分子の形成を促進し、第２の外因性ポリペプチドは中間分子に作用し；または
ｓ）第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドは、経路の連続的段階に作用する。
本明細書の態様のいずれでも、例えば、上記の態様は、本明細書の１つまたは複数の実施形態、例えば、以下の実施形態によって特徴付けられ得る。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは相乗的活性を有する。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは相加的活性を有する。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは近接依存性活性を有する。標的部分または部分群との相互作用の前、最中または後において、複数のポリペプチド間の近接性は、生体内または生体外で、そのような近接性の非存在下では見られない特性または結果を与えてもよい。
いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、標的細胞（例えば、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞）上の例えば、第１の標的細胞ポリペプチドなどの第１の標的部分と相互作用し、例えば、結合し、第２の外因性ポリペプチドは、標的細胞上の例えば、第２の標的細胞ポリペプチドなどの第２の標的部分と相互作用する（例えば、第１および第２の標的細胞ポリペプチドの結合が、標的細胞の生物学的特性を変化させる）。一実施形態では、第１および第２の標的は、標的細胞上の多量体複合体のサブユニットである。
いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、赤血球と標的細胞との融合を促進し、第２の外因性ポリペプチドは、表１、表２、または表３のいずれかのポリペプチドである（例えば、表１、表２、表３、または表４のいずれかのヒトポリペプチド、例えば、ヒト野生型ポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチド）。
いくつかの実施形態では、第１および第２の外因性ポリペプチドは、相互に作用し、例えば、第１のものは、例えば、切断またはリン酸化によって第２のものを修飾し、または第１および第２のものは、二量体もしくは多量体タンパク質を形成する。
いくつかの実施形態では、除核赤血球は、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なる外因性ポリペプチドを含む。一実施形態では、異なる外因性ポリペプチドの複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）または全部は、例えば、互いに少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％の配列同一性など、互いに予め選択された相同性レベルを有する。一実施形態では、異なる外因性ポリペプチドの複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）または全部は、例えば、参照配列（ポリペプチド配列全体または例えば、予め選択されたドメインなどのその一部を含む参照配列）との少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％、または１００％の配列同一性など、参照配列と予め選択された相同性レベルを有し、例えば、異なる外因性ポリペプチドの複数または全部は、抗体または抗体分子である。いくつかの実施形態では、参照配列は、抗体配列またはその断片である。いくつかの実施形態では、参照配列は、重鎖定常領域またはその一部、軽鎖定常領域またはその断片、重鎖可変領域またはその一部、軽鎖可変領域またはその断片、または前述の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、除核赤血球は、少なくとも２つであるが、５、６、７、８、９、または１０以下の異なる外因性ポリペプチド、例えば、除核赤血球によって保持されない１つまたは複数の外因性核酸によってコードされる外因性ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、除核赤血球によって保持されない１つまたは複数の外因性核酸によってコードされる。
いくつかの実施形態では、第１、第２、および任意選択的に第３の外因性ポリペプチドの１つまたは複数（例えば、２つまたは３つ）は、膜貫通ポリペプチドまたは表面アンカー型ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは標的細胞上の部分と相互作用し、例えば、結合し、第２の外因性ポリペプチドは、標的細胞の特性を変化させ、例えば、標的細胞を、殺滅または活性化する。
いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドは、重量基準またはコピー数基準で、約１：１、約２：１～１：２、約５：１～１：５、約１０：１～１：１０、約２０：１～１：２０、約５０：１～１：５０、約１００：１～１：１００の存在比を有する。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、どちらも化学量論的作用様式を有するか、またはどちらも触媒作用機序を有し、どちらも例えば、約１：１または約２：１～１：２などの類似存在量で存在する。いくつかの実施形態では、重量またはコピー数基準で、第１の外因性ポリペプチドは、第２の外因性ポリペプチドより、少なくとも約１０％、２０％、３０％、５０％、または２、３、４、５、１０、２０、５０、または１００倍豊富である（任意選択的に、１０倍または１００倍に至る）。いくつかの実施形態では、重量またはコピー数基準で、第２の外因性ポリペプチドは、第１の外因性ポリペプチドより、少なくとも約１０％、２０％、３０％、５０％、または２、３、４、５、１０、２０、５０、または１００倍豊富である（任意選択的に、１０倍または１００倍に至る）。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは化学量論的作用機序を有し、第２のポリペプチドは触媒作用機序を有し、第１のポリペプチドは第２のポリペプチドよりも豊富である。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは化学量論的作用機序を有し、第１のポリペプチドは触媒作用機序を有し、第２のポリペプチドは第１のポリペプチドよりも豊富である。
いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、標的化部分を含む
いくつかの実施形態では、除核赤血球は、以下の特徴の１つ以上を有する：
ａ）０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％のＮａＣｌでの５０％未満の細胞溶解の浸透圧脆性；
ｂ）約１０～２００ｆＬの細胞容積、または約１ミクロン～約２０ミクロン、約２ミクロン～約２０ミクロン、約３ミクロン～約２０ミクロン、約４ミクロン～約２０ミクロン、約５ミクロン～約２０ミクロン、約６ミクロンおよび～約２０ミクロン、約５ミクロン～約１５ミクロン、または約１０ミクロン～約３０ミクロンの細胞の直径；
ｃ）１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％を超える胎児ヘモグロビン；または少なくとも約２０、２５、または３０ｐｇ／細胞のヘモグロビン；または
ｄ）アネキシンＶ染色による測定で、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の細胞表面側のホスファチジルセリン含有量。
いくつかの実施形態では、複数の外因性ポリペプチドの少なくとも１つ、例えば、全部がグリコシル化される。いくつかの実施形態では、複数の外因性ポリペプチドの少なくとも１つ、例えば、全部がリン酸化される。
いくつかの実施形態では、除核赤血球は網状赤血球である。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドまたはポリペプチド群は、ＬＰＸＴＧ（配列番号１７）などのソルターゼ転写（すなわち、ソルターゼ反応によって生じ得る配列）を欠く。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載の網状赤血球などの除核赤血球を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、本明細書に記載の疾患または病状を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、がん、例えば、本明細書に記載されるがんである。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の網赤血球などの赤核赤血球を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、例えば、膜貫通受容体などの第１および第２の細胞表面部分を接近させる方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載の網状赤血球などの赤核細胞を提供するステップを含む、複数の近接依存性分子を送達、提示、または発現させる方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、赤血球前駆体と、外因性ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸とを接触させて、核除去ができる条件に細胞を置くことを提供する、例えば、本明細書に記載の網状赤血球などの除核赤血球を生産する方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、少なくとも１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２個で、例えば、本明細書に記載の網状赤血球などの複数の除核赤血球を含む、例えば、医薬品などの調製品を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、網状赤血球などの除核赤血球である遺伝子操作された赤血球（ＲＢＣ）と、例えば、生体外または生体内複合体である標的細胞との細胞複合体を提供し、複合体形成は、外因性ポリペプチドの１つによって媒介される。いくつかの実施形態では、細胞複合体は、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、５０、または１００個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞複合体は、遺伝子操作されたＲＢＣに加えて、例えば、がん細胞および免疫エフェクター細胞などの少なくとも２つの細胞型を含む。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、網状赤血球などの除核赤血球などの遺伝子操作されたＲＢＣと、例えば、本明細書に記載のマルチモーダル対をコードする、１つまたは複数の核酸分子などの核酸とを含む、反応混合物を立証する。いくつかの実施形態では、核酸は、赤血球中で活性である少なくとも１つのプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載の（例えば、表１、表２、および表３の）少なくとも２つのタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、第３の外因性ポリペプチドをコードする。
いくつかの態様では、本開示は、標的細胞または対象に関する情報を提供する、例えば、受信するステップと、その情報に応答して複数の外因性ポリペプチドを選択するステップと、外因性ポリペプチドをコードする核酸をＲＢＣまたはＲＢＣ前駆体に導入するステップとを含む、本明細書に記載の遺伝子操作されたＲＢＣ（例えば、網状赤血球などの赤血球）を生産する方法を含む。
いくつかの局面では、本発明は、候補赤血球系細胞、例えば、ＲＢＣを提供するステップと、例えば、外因性ポリペプチドのマルチモーダル対などの複数の外因性ポリペプチドをコードする核酸が、存在するかどうかを判定するステップとを含む、遺伝子操作された赤血球系細胞、例えば、ＲＢＣ（例えば、網状赤血球などの除核ＲＢＣ）を評価する方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、例えば、ＲＢＣなどの候補赤血球系細胞を提供するステップと、例えば、タンパク質検出によって、例えば、外因性ポリペプチドのマルチモーダル対などの複数の外因性ポリペプチドが存在するかどうかを判定するステップとを含んでなる、例えば、ＲＢＣ（例えば、網状赤血球などの除核ＲＢＣ）などの遺伝子操作された赤血球系細胞を評価する方法を含んでなる。
本開示は、いくつかの態様では、
標的と相互作用する第１の外因性ポリペプチドと、
標的を修飾する第２の外因性ポリペプチドと
を含む除核赤血球系細胞を提供し、
（ａ）第２の外因性ポリペプチドは、例えば、ＩｄｅＳポリペプチドなどであり、例えば、ヒンジ領域で、ＣＨ２領域で、またはヒンジとＣＨ２領域との間で抗体を切断する部分を含み；
（ｂ）第２の外因性ポリペプチドは、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、（例えば、特異的に）結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを標的に付着させる、酵素（例えば、プロテアーゼ）を含み、；
（ｃ）第２の外因性ポリペプチドは、ポリペプチド、例えば、酵素、例えば、標的の二次、三次、または四次構造を修飾するプロテアーゼを含み、いくつかの実施形態では、標的が、例えば、第１の外因性ポリペプチドまたは第１の外因性ポリペプチド以外の分子などの別の分子と相互作用する能力を変化させ、例えば、減少または増加させ、任意選択的に、標的は抗体または補体因子を含み；
（ｄ）第２の外因性ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドなどの標的を、例えば、第１の基質に結合する第１の標的ドメインおよび第２の基質に結合する第２の標的ドメインなどの、第１の標的ドメインおよび第２の標的ドメインの間で切断する、酵素（例えば、プロテアーゼ）などのポリペプチドを含み；
（ｅ）標的は、ポリペプチド；炭水化物（例えば、グリカン）、脂質（例えば、リン脂質）、または核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり；
（ｆ）第１の外因性ポリペプチドは、例えば、抗体などの標的と結合するが切断せず、第２の外因性ポリペプチドは、例えば、抗体中の共有結合などの共有結合などの結合を切断し；
（ｇ）標的は抗体（例えば、抗薬物抗体）を含み、第１の外因性ポリペプチドは抗体標的の可変領域に結合し；
（ｈ）標的は抗体（例えば、抗薬物抗体）を含み、第１の外因性ポリペプチドは抗体標的の定常領域に結合し；
（ｉ）第１の外因性ポリペプチドは、約１～２ｐＭ、２～５ｐＭ、５～１０ｐＭ、１０～２０ｐＭ、２０～５０ｐＭ、５０～１００ｐＭ、１００～２００ｐＭ、２００～５００ｐＭ、５００～１０００ｐＭ、１～２ｎＭ、２～５ｎＭ、５～１０ｎＭ、１０～２０ｎＭ、２０～５０ｎＭ、５０～１００ｎＭ、１００～２００ｎＭ、２００～５００ｎＭ、５００～１０００ｎＭ、１～２μＭ、２～５μＭ、５～１０μＭ、１０～２０μＭ、２０～５０μＭ、または５０～１００μＭの標的親和性を有し；
（ｊ）第２の外因性ポリペプチドは、約１０－１～１０－７Ｍ、１０－１～１０－２Ｍ、１０－２～１０－３Ｍ、１０－３～１０－４Ｍ、１０－４～１０－５Ｍ、１０－５～１０－６Ｍ、または１０－６～１０－７ＭのＫＭを有し；
（ｋ）標的に対する第２の外因性ポリペプチドのＫＭ（Ｍ単位で測定）で除した、標的に対する第１の外因性ポリペプチドのＫｄ（Ｍ単位で測定）の比率は、約１×１０－９～２×１０－９、２×１０－９～５×１０－９、５×１０－９～１×１０－８、１×１０－８～２×１０－８、２×１０－８～５×１０－８、５×１０－８～１×１０－７、１×１０－７～２×１０－７、２×１０－７～５×１０－７、５×１０－７～１×１０－６、１×１０－６～２×１０－６、２×１０－６～５×１０－６、５×１０－６～１×１０－５、１×１０－５～２×１０－５、２×１０－５～５×１０－５、５×１０－５～１×１０－４、１×１０－４～２×１０－４、２×１０－４～５×１０－４、５×１０－４～１×１０－３、１×１０－３～２×１０－３、２×１０－３～５×１０－３、５×１０－３～１×１０－２、１×１０－２～２×１０－２、２×１０－２～５×１０－２、５×１０－２～１×１０－１、１×１０－１～２×１０－１、２×１０－１～５×１０－１、または５×１０－１～１であり；
（ｌ）標的を修飾する第２の外因性ポリペプチドの観察された反応速度は、その他の点では類似した反応条件下において、類似しているが第１の外因性ポリペプチドを欠く除核細胞の反応速度より高く；
（ｍ）赤血球系細胞上の第２の外因性ポリペプチドの平均数に対する、赤血球系細胞上の第１の外因性ポリペプチドの平均数の比率は、約５０：１、２０：１、１０：１、８：１、６：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、１：１０、１：２０、または１：５０であり；
（ｎ）標的に対する第１の外因性ポリペプチドの親和性は、修飾された（例えば、切断された）標的に対する第１の外因性ポリペプチドの親和性より高く；
（ｏ）除核赤血球系細胞の治療有効用量は、投与時における対象の末梢血中の標的の量に対する化学量論比より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）；
（ｐ）有効用量中の除核赤血球系細胞数は、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的分子などの標的数より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）；
（ｑ）第２の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量または生体外有効量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく；
（ｒ）第１の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量または生体外有効量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく；
（ｓ）第１の外因性ポリペプチドの数および第２の外因性ポリペプチドの数は、例えば、有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、除核赤血球系細胞は、それぞれ標的に対する基準値より少なく、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく；
（ｔ）第２の外因性ポリペプチドは、少なくとも１０－１Ｍ、１０－２Ｍ、１０－３Ｍ、１０－４Ｍ、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、または１０－７ＭのＫＭで標的を修飾し（例えば、切断し；
（ｕ）第２の外因性ポリペプチドは、シャペロンを含み；
（ｖ）第１の外因性ポリペプチドは表面露出部分を含み、第２の外因性ポリペプチドは表面露出部分を含み；または
（ｗ）除核赤血球系細胞の有効量は、第２の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球系細胞の有効量より少ない（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少ない）
の１つまたは複数である。
いくつかの実施形態では、（ｂ）第２の外因性ポリペプチドは、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、（例えば、特異的に）結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを標的に付着させる、酵素（例えば、プロテアーゼ）を含み、標的は任意選択的に、抗体、例えば、抗薬物抗体である。いくつかの実施形態では、修飾は、例えば、第１の外因性ポリペプチドまたは第１の外因性ポリペプチド以外の分子である別の分子と相互作用する標的の能力を変化させ、例えば、増大または低下させる。
いくつかの実施形態では、（ｄ）第２の外因性ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドなどの標的を、例えば、第１の基質に結合する第１の標的ドメインおよび第２の基質に結合する第２の標的ドメインなどの、第１の標的ドメインおよび第２の標的ドメインの間で切断する、例えば、酵素（例えば、プロテアーゼ）などのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第１の標的ドメインは、第２の標的ドメインから放出される。いくつかの実施形態では、切断は、第１の基質に対する第１の標的ドメインの親和性、および第２の基質に対する第２の標的ドメインの片方または双方を変化させる。一実施形態では、標的は抗体を含み、第１の標的ドメインは１つ以上のＣＤＲを含み、第２の標的ドメインは例えば、Ｆｃ領域である定常領域の一部を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）～（ｗ）の少なくとも２つ（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ａ）および（ｅ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ａ）および（ｉ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ａ）および（ｊ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ａ）および（ｍ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ａ）および（ｑ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ａ）および（ｒ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ａ）および（ｓ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｅ）および（ｉ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｅ）および（ｊ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｅ）および（ｍ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｅ）および（ｑ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｅ）および（ｒ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｅ）および（ｓ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｉ）および（ｊ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｉ）および（ｍ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｉ）および（ｑ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｉ）および（ｒ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｉ）および（ｓ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｊ）および（ｍ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｊ）および（ｑ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｊ）および（ｒ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｊ）および（ｓ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｍ）および（ｑ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｍ）および（ｒ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｍ）および（ｓ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｑ）および（ｒ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｑ）および（ｓ）が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも（ｒ）および（ｓ）が存在する。
いくつかの実施形態では、少なくとも、
（ａ）および（ｂ）、（ａ）および（ｃ）、（ａ）および（ｄ）、（ａ）および（ｅ）、（ａ）および（ｆ）、（ａ）および（ｇ）、（ａ）および（ｈ）、（ａ）および（ｉ）、（ａ）および（ｊ）、（ａ）および（ｋ）、（ａ）および（ｌ）、（ａ）および（ｍ）、（ａ）および（ｎ）、（ａ）および（ｏ）、（ａ）および（ｐ）、（ａ）および（ｑ）、（ａ）および（ｒ）、（ａ）および（ｓ）、（ａ）および（ｔ）、（ａ）および（ｕ）、（ａ）および（ｖ）、（ａ）および（ｗ）、
（ｂ）および（ｃ）、（ｂ）および（ｄ）、（ｂ）および（ｅ）、（ｂ）および（ｆ）、（ｂ）および（ｇ）、（ｂ）および（ｈ）、（ｂ）および（ｉ）、（ｂ）および（ｊ）、（ｂ）および（ｋ）、（ｂ）および（ｌ）、（ｂ）および（ｍ）、（ｂ）および（ｎ）、（ｂ）および（ｏ）、（ｂ）および（ｐ）、（ｂ）および（ｑ）、（ｂ）および（ｒ）、（ｂ）および（ｓ）、（ｂ）および（ｔ）、（ｂ）および（ｕ）、（ｂ）および（ｖ）、（ｂ）および（ｗ）、
（ｃ）および（ｄ）、（ｃ）および（ｅ）、（ｃ）および（ｆ）、（ｃ）および（ｇ）、（ｃ）および（ｈ）、（ｃ）および（ｉ）、（ｃ）および（ｊ）、（ｃ）および（ｋ）、（ｃ）および（ｌ）、（ｃ）および（ｍ）、（ｃ）および（ｎ）、（ｃ）および（ｏ）、（ｃ）および（ｐ）、（ｃ）および（ｑ）、（ｃ）および（ｒ）、（ｃ）および（ｓ）、（ｃ）および（ｔ）、（ｃ）および（ｕ）、（ｃ）および（ｖ）、（ｃ）および（ｗ）、
（ｄ）および（ｅ）、（ｄ）および（ｆ）、（ｄ）および（ｇ）、（ｄ）および（ｈ）、（ｄ）および（ｉ）、（ｄ）および（ｊ）、（ｄ）および（ｋ）、（ｄ）および（ｌ）、（ｄ）および（ｍ）、（ｄ）および（ｎ）、（ｄ）および（ｏ）、（ｄ）および（ｐ）、（ｄ）および（ｑ）、（ｄ）および（ｒ）、（ｄ）および（ｓ）、（ｄ）および（ｔ）、（ｄ）および（ｕ）、（ｄ）および（ｖ）、（ｄ）および（ｗ）、
（ｅ）および（ｆ）、（ｅ）および（ｇ）、（ｅ）および（ｈ）、（ｅ）および（ｉ）、（ｅ）および（ｊ）、（ｅ）および（ｋ）、（ｅ）および（ｌ）、（ｅ）および（ｍ）、（ｅ）および（ｎ）、（ｅ）および（ｏ）、（ｅ）および（ｐ）、（ｅ）および（ｑ）、（ｅ）および（ｒ）、（ｅ）および（ｓ）、（ｅ）および（ｔ）、（ｅ）および（ｕ）、（ｅ）および（ｖ）、（ｅ）および（ｗ）、
（ｆ）および（ｇ）、（ｆ）および（ｈ）、（ｆ）および（ｉ）、（ｆ）および（ｊ）、（ｆ）および（ｋ）、（ｆ）および（ｌ）、（ｆ）および（ｍ）、（ｆ）および（ｎ）、（ｆ）および（ｏ）、（ｆ）および（ｐ）、（ｆ）および（ｑ）、（ｆ）および（ｒ）、（ｆ）および（ｓ）、（ｆ）および（ｔ）、（ｆ）および（ｕ）、（ｆ）および（ｖ）、（ｆ）および（ｗ）、
（ｇ）および（ｈ）、（ｇ）および（ｉ）、（ｇ）および（ｊ）、（ｇ）および（ｋ）、（ｇ）および（ｌ）、（ｇ）および（ｍ）、（ｇ）および（ｎ）、（ｇ）および（ｏ）、（ｇ）および（ｐ）、（ｇ）および（ｑ）、（ｇ）および（ｒ）、（ｇ）および（ｓ）、（ｇ）および（ｔ）、（ｇ）および（ｕ）、（ｇ）および（ｖ）、（ｇ）および（ｗ）、
（ｈ）および（ｉ）、（ｈ）および（ｊ）、（ｈ）および（ｋ）、（ｈ）および（ｌ）、（ｈ）および（ｍ）、（ｈ）および（ｎ）、（ｈ）および（ｏ）、（ｈ）および（ｐ）、（ｈ）および（ｑ）、（ｈ）および（ｒ）、（ｈ）および（ｓ）、（ｈ）および（ｔ）、（ｈ）および（ｕ）、（ｈ）および（ｖ）、（ｈ）および（ｗ）、
（ｉ）および（ｊ）、（ｉ）および（ｋ）、（ｉ）および（ｌ）、（ｉ）および（ｍ）、（ｉ）および（ｎ）、（ｉ）および（ｏ）、（ｉ）および（ｐ）、（ｉ）および（ｑ）、（ｉ）および（ｒ）、（ｉ）および（ｓ）、（ｉ）および（ｔ）、（ｉ）および（ｕ）、（ｉ）および（ｖ）、（ｉ）および（ｗ）、
（ｊ）および（ｋ）、（ｊ）および（ｌ）、（ｊ）および（ｍ）、（ｊ）および（ｎ）、（ｊ）および（ｏ）、（ｊ）および（ｐ）、（ｊ）および（ｑ）、（ｊ）および（ｒ）、（ｊ）および（ｓ）、（ｊ）および（ｔ）、（ｊ）および（ｕ）、（ｊ）および（ｖ）、（ｊ）および（ｗ）、
（ｋ）および（ｌ）、（ｋ）および（ｍ）、（ｋ）および（ｎ）、（ｋ）および（ｏ）、（ｋ）および（ｐ）、（ｋ）および（ｑ）、（ｋ）および（ｒ）、（ｋ）および（ｓ）、（ｋ）および（ｔ）、（ｋ）および（ｕ）、（ｋ）および（ｖ）、（ｋ）および（ｗ）、
（ｌ）および（ｍ）、（ｌ）および（ｎ）、（ｌ）および（ｏ）、（ｌ）および（ｐ）、（ｌ）および（ｑ）、（ｌ）および（ｒ）、（ｌ）および（ｓ）、（ｌ）および（ｔ）、（ｌ）および（ｕ）、（ｌ）および（ｖ）、（ｌ）および（ｗ）、
（ｍ）および（ｎ）、（ｍ）および（ｏ）、（ｍ）および（ｐ）、（ｍ）および（ｑ）、（ｍ）および（ｒ）、（ｍ）および（ｓ）、（ｍ）および（ｔ）、（ｍ）および（ｕ）、（ｍ）および（ｖ）、（ｍ）および（ｗ）、
（ｎ）および（ｏ）、（ｎ）および（ｐ）、（ｎ）および（ｑ）、（ｎ）および（ｒ）、（ｎ）および（ｓ）、（ｎ）および（ｔ）、（ｎ）および（ｕ）、（ｎ）および（ｖ）、（ｎ）および（ｗ）、
（ｏ）および（ｐ）、（ｏ）および（ｑ）、（ｏ）および（ｒ）、（ｏ）および（ｓ）、（ｏ）および（ｔ）、（ｏ）および（ｕ）、（ｏ）および（ｖ）、（ｏ）および（ｗ）、
（ｐ）および（ｑ）、（ｐ）および（ｒ）、（ｐ）および（ｓ）、（ｐ）および（ｔ）、（ｐ）および（ｕ）、（ｐ）および（ｖ）、（ｐ）および（ｗ）、
（ｑ）および（ｒ）、（ｑ）および（ｓ）、（ｑ）および（ｔ）、（ｑ）および（ｕ）、（ｑ）および（ｖ）、（ｑ）および（ｗ）、
（ｒ）および（ｓ）、（ｒ）および（ｔ）、（ｒ）および（ｕ）、（ｒ）および（ｖ）、（ｒ）および（ｗ）、
（ｓ）および（ｔ）、（ｓ）および（ｕ）、（ｓ）および（ｖ）、（ｓ）および（ｗ）、
（ｔおよび（ｕ）、（ｔ）および（ｖ）、（ｔ）および（ｗ）、
（ｕ）および（ｖ）、（ｕ）および（ｗ）、または
（ｖ）および（ｗ）
が存在する。
いくつかの実施形態では、標的は、例えば、細菌成分、ウイルス成分、真菌成分、または寄生成分などの感染成分以外のものである。いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、標的結合ドメインを含んでなる。いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドの表面露出部分は、標的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドの表面露出部分は、例えば、プロテアーゼ活性などの酵素活性を含んでなる。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドの表面露出部分は、標的を酵素的に修飾し、例えば、切断する。いくつかの実施形態では、標的は、抗薬物抗体と、抗薬物抗体がそれに結合するポリペプチドを含んでなる第１の外因性ポリペプチドと、抗薬物抗体を切断してＦａｂ部分およびＦｃ部分を生じるプロテアーゼを含んでなる第２の外因性ポリペプチドとを含んでなる。いくつかの実施形態では、除核赤血球は、第２の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球より、迅速な速度で対象の身体から標的を排除できる。いくつかの実施形態では、除核赤血球は、標的と、または例えば、切断中に標的に作用する第２の外因性タンパク質の反応生成物と、複合体形成する。
本開示はまた、特定の態様では、膜貫通ドメインと、抗薬物抗体に結合できる表面露出ポリペプチドとを含む第１の外因性ポリペプチド、および
膜貫通ドメインと、表面露出ＩｄｅＳポリペプチドとを含む第２の外因性ポリペプチド
を含む除核赤血球系細胞を提供する。
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば、ＩｄｅＳポリペプチドなどの抗体を切断し得るプロテアーゼと、例えば、Ｉ型またはＩＩ型赤血球膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインなどの膜アンカードメインとを含む、ポリペプチドも提供する。本開示はまた、前記ポリペプチドをコードする核酸も提供する。
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば、ＩｄｅＳポリペプチドなどの抗体を切断し得るプロテアーゼをコードする第１の配列、
例えば、膜貫通ドメインなどの膜アンカードメインをコードする第２の配列、および
任意選択的に、赤血球系細胞において活性なプロモーター配列
を含む核酸も提供し、
第１および第２の配列は作動可能に連結されて融合タンパク質を形成する。
本開示はまた、いくつかの態様では、
例えば、本明細書に記載の第１の外因性ポリペプチドなどの、標的と相互作用する第１の外因性ポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
例えば、本明細書に記載の第２の核酸配列などの、標的を修飾する第２の外因性ポリペプチドをコードする第２の核酸配列、および
任意選択的に、赤血球系細胞において活性なプロモーター配列
を含む核酸組成物も提供する。
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列および第２の核酸配列は連続しているか、または別個の分子（例えば、混合分子または別個の容器内）である。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、同一オープンリーディングフレームの一部であり、それらの間に位置するプロテアーゼ切断部位を有する。いくつかの実施形態では、第１の核酸は第１のプロモーターと作動可能に連結され、第２の核酸は第２のプロモーターと作動可能に連結される。
本開示は、いくつかの態様では、
（Ａ）（Ａ－ｉｉ）例えば、膜貫通ドメインなどの膜アンカードメインに融合された、（Ａ－ｉ）複数の結合部分（例えば、抗体分子、例えば、ｓｃＦｖドメイン）をコードする核酸、および
（Ｂ）任意選択的に、（Ｂ－ｉｉ）例えば、膜貫通ドメインなどの膜アンカードメインに融合された、（Ｂ－ｉ）複数の酵素（例えば、プロテアーゼ）をコードする核酸
を含むキットを提供し、
（Ａ－ｉ）および（Ａ－ｉｉ）は、赤血球系細胞における発現を誘導する核酸と作動可能に連結され、（Ｂｉ）および（Ｂ－ｉｉ）は、赤血球系細胞において発現を誘導する核酸と作動可能に連結される。
本開示は、いくつかの態様では、標的ポリペプチドを本明細書に記載の赤血球系細胞に接触させるステップを含む、例えば、標的ポリペプチドなどの標的の断片を生産する方法、例えば、第１の標的ドメインを含む標的の断片を生産する方法、例えば、可変領域断片を生産する方法、または定常領域含有断片を生産する方法を提供する。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは標的を切断して断片を提供する。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは例えば、抗薬物抗体などの抗体である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドの断片は、免疫応答および／または炎症を活性化しない。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、赤血球系細胞を、標的ポリペプチドを含む対象に投与するステップを含む。
本開示はまた、特定の態様では、例えば、阻害剤（標的）の前駆体を本明細書に記載の赤血球系細胞に接触させるステップを含む、例えば、競合阻害剤などの阻害剤を生産する方法も提供する。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、標的と相互作用し、例えば、標的を切断する。いくつかの実施形態では、阻害剤は、抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片）である。いくつかの実施形態では、標的は抗体であり、それは切断されて、例えば、Ｆａｂ断片である抗体断片である阻害剤が生じる。いくつかの実施形態では、阻害剤は、免疫応答および／または炎症を活性化しない。いくつかの実施形態では、阻害剤の前駆体は、例えば、抗薬物抗体などの抗体である。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、赤血球系細胞を阻害剤の前駆体を含む対象に投与するステップを含む。
本開示はまた、いくつかの態様では、ポリペプチドを本明細書に記載の赤血球系細胞に接触させるステップを含む、例えば、プロドラッグを薬物に変換するなど、例えば、ポリペプチドなどの標的を変換しまたは活性化する方法も提供する。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、標的（例えば、プロドラッグ）と相互作用し、例えば、標的を切断する。いくつかの実施形態では、プロドラッグは、例えば、抗薬物抗体などの抗体である。いくつかの実施形態では、薬物は、例えば、Ｆａｂ断片などの抗体断片である。いくつかの実施形態では、薬物は、免疫応答および／または炎症を活性化しない。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、赤血球系細胞を例えば、プロドラッグなどのポリペプチドを含む対象に投与するステップを含む。
本開示はまた、いくつかの態様では、内因性ポリペプチドを本明細書に記載の赤血球系細胞に接触させるステップを含む、第１の活性状態から第２の活性状態に（例えば、不活性状態から活性状態に、または活性状態から不活性状態に）、内因性ポリペプチドを変換する方法も提供する。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは標的と相互作用し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、標的を切断し、またはそれが別の分子と相互作用する能力、例えば、結合する能力を変化させる。いくつかの実施形態では、内因性ポリペプチドは、例えば、抗薬物抗体などの抗体である。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、赤血球系細胞を、内因性ポリペプチドを含む対象に投与するステップを含む。
本開示は、いくつかの態様では、本明細書に記載の赤血球系細胞を対象に投与するステップを含む、対象において標的（例えば、抗体、例えば、抗薬物抗体）のレベルを低下させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは標的と相互作用し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、標的を切断し、またはそれが別の分子と相互作用する能力、例えば、結合する能力を変化させる。本開示はまた、特定の態様では、本明細書に記載の赤血球細胞を対象に投与するステップを含む、対象において抗体の阻害性断片（例えば、Ｆａｂ断片）を生成する方法も提供する。本開示は、本明細書に記載の赤血球系細胞を対象に投与するステップを含む、対象において例えばがんなどの疾患を治療する方法をさらに提供する。
例えば、上述の方法のいずれかの実施形態などのいくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、
標的と相互作用する第１の外因性ポリペプチド、および
標的を修飾する第２の外因性ポリペプチドを含み、
（ａ）第２の外因性ポリペプチドは、例えば、ＩｄｅＳポリペプチドなどであり、例えば、ヒンジ領域で、ＣＨ２領域で、またはヒンジとＣＨ２領域との間で抗体を切断する部分を含み；
（ｂ）第２の外因性ポリペプチドは、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、（例えば、特異的に）結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを標的に付着させる、酵素（例えば、プロテアーゼ）を含み、標的は任意選択的に、抗体であり；
（ｃ）第２の外因性ポリペプチドは、ポリペプチド、例えば、酵素、例えば、標的の二次、三次、または四次構造を修飾するプロテアーゼを含み、いくつかの実施形態では、標的が、例えば、第１の外因性ポリペプチドまたは第１の外因性ポリペプチド以外の分子などの別の分子と相互作用する能力を変化させ、例えば、減少または増加させ、任意選択的に、標的は抗体または補体因子を含み；
（ｄ）第２の外因性ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドなどの標的を、例えば、第１の基質に結合する第１の標的ドメインおよび第２の基質に結合する第２の標的ドメインなどの、第１の標的ドメインおよび第２の標的ドメインの間で切断する、酵素（例えば、プロテアーゼ）などのポリペプチドを含み；
（ｅ）標的は、ポリペプチド；炭水化物（例えば、グリカン）、脂質（例えば、リン脂質）、または核酸（例えば、ＤＮＡ、またはＲＮＡ）であり；
（ｆ）第１の外因性ポリペプチドは、例えば、抗体などの標的と結合するが切断せず、第２の外因性ポリペプチドは、例えば、抗体中の共有結合などの共有結合などの結合を切断し；
（ｇ）標的は抗体を含み、第１の外因性ポリペプチドは抗体標的の可変領域に結合し；
（ｈ）標的は抗体を含み、第１の外因性ポリペプチドは抗体標的の定常領域に結合し；
（ｉ）第１の外因性ポリペプチドは、約１～２ｐＭ、２～５ｐＭ、５～１０ｐＭ、１０～２０ｐＭ、２０～５０ｐＭ、５０～１００ｐＭ、１００～２００ｐＭ、２００～５００ｐＭ、５００～１０００ｐＭ、１～２ｎＭ、２～５ｎＭ、５～１０ｎＭ、１０～２０ｎＭ、２０～５０ｎＭ、５０～１００ｎＭ、１００～２００ｎＭ、２００～５００ｎＭ、５００～１０００ｎＭ、１～２μＭ、２～５μＭ、５～１０μＭ、１０～２０μＭ、２０～５０μＭ、または５０～７μＭの標的親和性を有し；
（ｊ）第２の外因性ポリペプチドは、約１０－１～１０－７Ｍ、１０－１～１０－２Ｍ、１０－２～１０－３Ｍ、１０－３～１０－４Ｍ、１０－４～１０－５Ｍ、１０－５～１０－６Ｍ、または１０－６～１０－７ＭのＫＭを有し；
（ｋ）標的に対する第２の外因性ポリペプチドのＫＭ（Ｍ単位で測定）で除した、標的に対する第１の外因性ポリペプチドのＫｄ（Ｍ単位で測定）の比率は、約１×１０－９～２×１０－９、２×１０－９～５×１０－９、５×１０－９～１×１０－８、１×１０－８～２×１０－８、２×１０－８～５×１０－８、５×１０－８～１×１０－７、１×１０－７～２×１０－７、２×１０－７～５×１０－７、５×１０－７～１×１０－６、１×１０－６～２×１０－６、２×１０－６～５×１０－６、５×１０－６～１×１０－５、１×１０－５～２×１０－５、２×１０－５～５×１０－５、５×１０－５～１×１０－４、１×１０－４～２×１０－４、２×１０－４～５×１０－４、５×１０－４～１×１０－３、１×１０－３～２×１０－３、２×１０－３～５×１０－３、５×１０－３～１×１０－２、１×１０－２～２×１０－２、２×１０－２～５×１０－２、５×１０－２～１×１０－１、１×１０－１～２×１０－１、２×１０－１～５×１０－１、または５×１０－１～１であり；
（ｌ）標的を修飾する第２の外因性ポリペプチドの観察された反応速度は、その他の点では類似した反応条件下において、類似しているが第１の外因性ポリペプチドを欠く除核細胞の反応速度より高く；
（ｍ）赤血球系細胞上の第２の外因性ポリペプチドの平均数に対する、赤血球系細胞上の第１の外因性ポリペプチドの平均数の比率は、約５０：１、２０：１、１０：１、８：１、６：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、１：１０、１：２０、または１：５０であり；
（ｎ）標的に対する第１の外因性ポリペプチドの親和性は、修飾された（例えば、切断された）標的に対する第１の外因性ポリペプチドの親和性より高く；
（ｏ）除核赤血球系細胞の治療有効用量は、投与時における対象の末梢血中の標的の量に対する化学量論比より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）；
（ｐ）有効用量中の除核赤血球系細胞数は、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的分子などの標的数より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）；
（ｑ）第２の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく；
（ｒ）第１の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく；
（ｓ）第１の外因性ポリペプチドの数および第２の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、それぞれ標的に対する基準値より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく；
（ｔ）第２の外因性ポリペプチドは、少なくとも１０－１Ｍ、１０－２Ｍ、１０－３Ｍ、１０－４Ｍ、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、または１０－７ＭのＫＭで標的を修飾し（例えば、切断し）；
（ｕ）第２の外因性ポリペプチドは、シャペロンを含み；
（ｖ）第１の外因性ポリペプチドは表面露出部分を含み、第２の外因性ポリペプチドは表面露出部分を含み；または
（ｗ）除核赤血球系細胞の有効量は、第２の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球系細胞の有効量より少ない（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少ない）
の１つまたは複数である。
例えば、融合タンパク質などの外因性ポリペプチドが関与する、本明細書に記載の組成物および方法のいずれかのいくつかの実施形態では、
ｉ）赤血球系細胞表面の融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％が、同一配列を有し；
ｉｉ）融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％が、同一膜貫通領域であり；
ｉｉｉ）融合タンパク質は完全長内因性膜タンパク質を含まず、例えば、完全長内因性膜タンパク質のセグメントを含み、このセグメントは、完全長内因性膜タンパク質の少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、または５００個のアミノ酸を欠き；
ｉｖ）融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％は、１、２、３、４、５、１０、２０、または５０個のアミノ酸を超えて互いに異ならず；
ｖ）外因性ポリペプチドは、ソルターゼ移入シグネチャを欠き；
ｖｉ）外因性ポリペプチドは、１、２、３、４、または５個未満の配列の異なる融合ポリペプチド上に存在する部分を含み；
ｖｉｉ）外因性ポリペプチドは、単一の融合ポリペプチドとして存在し；
ｖｉｉｉ）融合タンパク質は、内因性膜貫通タンパク質と部分との接合部にＧｌｙ－Ｇｌｙを含有せず；
ｉｘ）融合タンパク質はＧｌｙ－Ｇｌｙを含有せず、または融合タンパク質はＧｌｙ－Ｇｌｙを含有せず、または細胞外領域にＧｌｙ－Ｇｌｙを含有せず、膜貫通部分の１、２、３、４、５、１０、２０、５０、または１００個のアミノ酸内の細胞外領域にＧｌｙ－Ｇｌｙを含有せず；またはそれらの組み合わせである。
本明細書に記載の細胞系は、細胞系の一部ではない別の（１つまたは複数の）抗増殖性、抗新生物性または抗腫瘍性の薬物または治療と組み合わせて使用されてもよい。このような薬物または治療としては、例えば、細胞毒性薬（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、コルチコステロイド）などの化学療法薬；チロシンキナーゼ阻害剤およびプロテアソーム阻害剤などのがん増殖遮断薬；Ｔ細胞療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法）（例えば、ＰＭＩＤ：２６６１１３５０を参照されたい）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞免疫調節（例えば、ＰＭＩＤ：２６６９７００６を参照されたい）；およびがんワクチン（ＰＭＩＤ：２６５７９２２５）；Ｌ－アスパラギナーゼおよびボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））などのその他の化学薬品が挙げられる。例えば、ホルモン感受性がんのために、ホルモン療法（または抗ホルモン療法）が使用され得る。
本明細書に記載の細胞系は、外科手術、放射線療法、または寒冷療法などのがんのための非薬物治療と組み合わせて使用されてもよい。場合によっては、本発明の治療方法は、２つまたはそれ以上のその他の治療法または薬物と組み合わされた本明細書に記載の細胞系を含んでもよく、例えば、乳がんは、外科手術または放射線療法と組み合わせた本明細書に記載の細胞系と、化学療法カクテルまたは生物学的製剤（例えば、抗ＨＥＲ２抗体）との組み合わせで治療されてもよい。
本開示は、前述の態様および／または実施形態の任意の１つまたは複数の全ての組み合わせ、ならびに詳細な説明および実施例に記載される実施形態の任意の１つまたは複数との組み合わせを検討する。
本明細書に記載されるものと同様のまたは同等の方法および材料が、本発明でまたは本発明の試験で用いられ得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献（例えば、配列データベース参照番号）は、その全体が参照により援用される。例えば、本明細書において、例えば、本明細書中の任意の表において参照される全てのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、およびＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により援用される。別段の指定がない限り、本明細書中の任意の表を含む本明細書で特定される配列受入番号は、２０１６年１月１１日現在のデータベース入力項目を参照する。１つの遺伝子またはタンパク質が複数の配列受入番号を参照する場合、配列変異型の全てが包含される。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
複数の第１および第２の外因性ポリペプチドが、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性活性を有する、複数の外因性ポリペプチドを含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球。
（項目２）
第１の外因性ポリペプチド、第２の外因性ポリペプチド、および第３の外因性ポリペプチドを含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球。
（項目３）
第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドを含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球であって、
ａ）前記第１および第２の外因性ポリペプチドが同一標的に作用し、任意選択的に、前記標的が細胞表面受容体および／または内因性ヒトタンパク質であり；
ｂ）前記第１の外因性ポリペプチドが第１の内因性ヒトタンパク質に、前記第２の外因性ポリペプチドが第２の内因性ヒト標的タンパク質に、例えば、５００、２００、１００、５０、２０、１０、５、２、または１ｎＭ未満のＫｄで結合し；
ｃ）前記第１の外因性ポリペプチドが第１の標的に作用し（例えば、結合し）、前記第２の外因性ポリペプチドが第２の標的に作用し（例えば、結合し）、前記第１および第２の標的が同一生物学的経路の構成要素であり、任意選択的に、前記標的が細胞表面受容体、内因性ヒトタンパク質、またはその双方であり；
ｄ）前記第１の外因性ポリペプチドが第１のアポトーシス促進ポリペプチドを含み、前記第２の外因性ポリペプチドが第２のアポトーシス促進ポリペプチド、例えば、ＴＲＡＩＬ受容体リガンド、例えば、ＴＲＡＩＬポリペプチドを含み；
ｅ）前記第１および第２の外因性ポリペプチドが互いに近接しており、少なくとも１、２、５、１０、３０、または６０秒間；１、２、５、１０、３０、または６０分間、または１、２、３、６、１２、または１４時間にわたり、例えば、１０、７、５、４、３、２、１、０．５、０．２、または０．１ｎｍ未満の間隔であり；
ｆ）前記第１および第２の外因性ポリペプチドが、互いに５００、２００、１００、５０、２０、１０、５、２、または１ｎＭ未満のＫｄを有し；
ｇ）前記第１の外因性ポリペプチドが、抗原提示ポリペプチド、例えば、ＭＨＣ分子、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、前記第２の外因性ポリペプチドが、抗原、例えば、がん抗原を含み；
ｈ）前記第１および第２の外因性ポリペプチドが異なる標的に作用し、任意選択的に、前記標的の少なくとも１つが細胞表面受容体および／または内因性ヒトタンパク質であり、例えば、前記第１の外因性ポリペプチドが第１の細胞型、例えば、がん細胞に結合し、前記第２の外因性ポリペプチドが第２の細胞型、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に結合し；
ｉ）前記第１の外因性ポリペプチドおよび前記第２の外因性ポリペプチドが、重量基準またはコピー数基準で、約１：１、約２：１～１：２、約５：１～１：５、約１０：１～１：１０、約２０：１～１：２０、約５０：１～１：５０、約１００：１～１：１００の存在比を有し；
ｊ）前記第１の外因性ポリペプチドおよび前記第２の外因性ポリペプチドが、それぞれ、約１：１、約２：１～１：２、約５：１～１：５、約１０：１～１：１０、約２０：１～１：２０、約５０：１～１：５０、約１００：１～１：１００の比率で、第１の標的および第２の標的に対するＫｄを有し；
ｋ）前記第１の外因性ポリペプチドが第１の標的に対する第１の活性（例えば、結合）を有し、前記第２の外因性ポリペプチドが第１の標的に対する第２の活性（例えば、結合）を有し、例えば、前記第１および第２の外因性ポリペプチドが単一標的に結合し；
ｌ）前記第１の外因性ポリペプチドが第１の標的に作用し（例えば、結合し）、前記第２の外因性ポリペプチドが第２の標的に作用し（例えば、結合し）、前記第１および第２の標的は同一経路の部分であり、任意選択的に、前記第１の外因性ポリペプチドが第１の標的に作用し、同時に前記第２の外因性ポリペプチドが第２の標的に作用し；
ｍ）前記第１の外因性ポリペプチドが第１の標的に作用し（例えば、結合し）、第２の外因性ポリペプチドが第２の標的に作用し（例えば、結合し）、前記第１および第２の標的が様々な経路の部分であり、任意選択的に、前記第１および第２の経路がどちらも所与の細胞性応答を促進するように作用し；
ｎ）前記第１の外因性ポリペプチドが、除核赤血球を例えば、ヒト細胞などの所望の部位に局在させ、前記第２の外因性ポリペプチドが、例えば、Ｔ細胞活性化活性、例えば、Ｔ細胞阻害活性または抗原提示活性などの免疫調節活性などの治療活性を有し；
ｏ）前記第１の外因性ポリペプチドが例えば、第１の細胞型、例えばがん細胞などの第１の細胞に結合し、前記第２の外因性ポリペプチドが例えば、第２の細胞型、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞などの第２の細胞に結合し；
ｐ）前記第１の外因性ポリペプチドおよび前記第２の外因性ポリペプチドが、非ヒトタンパク質であり；
ｑ）前記第１の外因性ポリペプチドおよび前記第２の外因性ポリペプチドがどちらも、例えば、生合成酵素などの酵素であり；
ｒ）前記第１の外因性ポリペプチドが中間分子の形成を促進し、前記第２の外因性ポリペプチドが中間分子に作用し；または
ｓ）前記第１の外因性ポリペプチドおよび前記第２の外因性ポリペプチドが、経路の連続的段階に作用する、除核赤血球。
（項目４）
前記第１および第２の外因性ポリペプチドが薬剤相加的活性を有する、項目１～３のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目５）
前記第１のポリペプチドが（例えば、抗ＥＰＣＡＭ分子を含んでなる）がん細胞に結合し、前記第２の外因性ポリペプチドが（例えば、抗ＣＤ４５抗体分子を含んでなる）がん細胞に結合する、項目４に記載の除核赤血球。
（項目６）
前記第１および第２の外因性ポリペプチドが薬剤相乗的活性を有する、項目１～３のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目７）
前記第１の外因性ポリペプチドが、アポトーシスを媒介する第１の細胞受容体に対するリガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ受容体に対するリガンドであり、例えば、ＴＲＡＩＬポリペプチドを含む）を含み、前記第２の外因性ポリペプチドが、アポトーシスを媒介する第１の細胞受容体に対するリガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ受容体に対するリガンドであり、例えば、ＴＲＡＩＬポリペプチドを含む）を含む、項目６に記載の除核赤血球。
（項目８）
前記第１および第２の外因性ポリペプチドが乗法的活性を有する、項目１～３のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目９）
前記第１の外因性ポリペプチドが、表２のＴ細胞活性化リガンドまたはそのＴ細胞活性化変異型（例えば、断片）を含んでなり、前記第２の外因性ポリペプチドが、表２の第２のＴ細胞活性化リガンドまたはそのＴ細胞活性化変異型（例えば、断片）を含んでなる、項目８に記載の除核赤血球。
（項目１０）
前記第１の外因性ポリペプチドが、表３の阻害性リガンドの阻害剤またはその阻害性断片もしくは変異型を含んでなり、前記第２の外因性ポリペプチドが、表３の阻害性リガンドの第２の阻害剤またはその阻害性断片もしくは変異型を含んでなる、項目８に記載の除核赤血球。
（項目１１）
前記第１および第２の外因性ポリペプチドが独立機能活性を有する、項目１～３のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目１２）
前記第１の外因性ポリペプチドが第１のサイトカインに結合し、前記第２の外因性ポリペプチドが第２のサイトカインに結合する、項目１１に記載の除核赤血球。
（項目１３）
前記第１および第２の外因性ポリペプチドが局在ベース活性を有する、項目１～３のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目１４）
前記第１の外因性ポリペプチドが、がん細胞にまたはその近くに結合する（例えば、腫瘍新生血管に結合する）標的化部分を含み、前記第２の外因性ポリペプチドが、抗がん機能（例えば、酵素、血管新生阻害剤、免疫賦活性分子、またはアポトーシス促進剤を含んでなる）を有する、項目１３に記載の除核赤血球。
（項目１５）
前記第１および第２の外因性ポリペプチドが近接依存性活性を有する、項目１～３のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目１６）
標的部分または部分群との相互作用の前、最中、または後において、複数のポリペプチド間の近接性が、生体内または生体外でこのような近接性の非存在下では見られない性質または結果を与える、項目１５項に記載の除核赤血球。
（項目１７）
前記第１の外因性ポリペプチドが、例えば、標的細胞（例えば、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞）上の第１の標的細胞ポリペプチドなどの第１の標的部分と相互作用し、例えば、結合し、前記第２の外因性ポリペプチドが、例えば、前記標的細胞（例えば、その中で前記第１および第２の標的細胞ポリペプチドの結合が、前記細胞の生物学的特性を変化させる）上の第２の標的細胞ポリペプチドなどの第２の標的部分と相互作用し、例えば、結合する、項目１５に記載の除核赤血球。
（項目１８）
前記第１および第２の外因性ポリペプチドがスキャフォールドベース活性を有する、項目１～３のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目１９）
前記第１のポリペプチドががん細胞の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ４５、ＥＧＦＲ、またはＨＥＲ２）に結合し、前記第２のポリペプチドが免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＤ３）の細胞表面マーカーに結合する、項目１８に記載の除核赤血球。
（項目２０）
前記第１および第２の外因性ポリペプチドが多量体ベース活性を有する、項目１～３のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目２１）
前記第１の外因性ポリペプチドがＭＨＣＩＩα鎖を含み、前記第２の外因性ポリペプチドがＭＨＣＩＩβ鎖ポリペプチドを含む、項目２０に記載の除核赤血球。
（項目２２）
前記第１および第２の外因性ポリペプチドが代償性活性を有する、項目１～３のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目２３）
前記第１の外因性ポリペプチドが治療用タンパク質であり、前記第２の外因性ポリペプチドが第１の外因性ポリペプチドの阻害剤であり、例えば、前記第１の外因性ポリペプチドが前記第２の外因性ポリペプチドに結合するよりも、前記第１の外因性ポリペプチドが前記標的により強力に結合する、項目２２に記載の除核赤血球。
（項目２４）
前記第１の外因性ポリペプチドが抗ＣＤ４０抗体分子を含んでなり、前記第２の外因性ポリペプチドがＣＤ４０またはその断片もしくは変異型を含んでなる、項目２２に記載の除核赤血球。
（項目２５）
前記第１の外因性ポリペプチドが、前記赤血球の標的細胞との融合を促進し、前記第２の外因性ポリペプチドが、表１、表２、または表３のいずれかのポリペプチドである、項目１～２４のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目２６）
前記第１および第２の外因性ポリペプチドが相互に作用し、例えば、前記第１の外因性ポリペプチドが例えば、切断またはリン酸化によって前記第２の外因性ポリペプチドを修飾する、項目１～２５のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目２７）
前記第１および第２の外因性ポリペプチドが、二量体または多量体タンパク質を形成する、項目１～２６のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目２８）
少なくとも２つであるが、５、６、７、８、９、または１０以下の異なる外因性ポリペプチド、例えば、前記除核赤血球によって保持されない１つまたは複数の外因性核酸によってコードされる外因性ポリペプチドを含む、項目１～２７のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目２９）
前記外因性ポリペプチドが、前記除核赤血球によって保持されない１つまたは複数の外因性核酸によってコードされる、項目１～２８のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目３０）
前記第１、第２、および任意選択的に、第３の外因性ポリペプチドの１つまたは複数（例えば、２または３つ）が、膜貫通ポリペプチドまたは表面アンカー型ポリペプチドである、項目１～２９のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目３１）
前記第１の外因性ポリペプチドが、標的細胞上の部分と相互作用し、例えば、結合し、前記第２の外因性ポリペプチドが前記標的細胞の特性を変化させ、例えば、前記標的細胞を殺滅しまたは活性化する、項目１～３０のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目３２）
前記第１の外因性ポリペプチドおよび前記第２の外因性ポリペプチドが、重量基準またはコピー数基準で、約１：１、約２：１～１：２、約５：１～１：５、約１０：１～１：１０、約２０：１～１：２０、約５０：１～１：５０、または約１００：１～１：１００の存在比を有する、項目１～３１のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目３３）
前記第１および第２のポリペプチドの双方が化学量論的作用機序を有するか、またはその双方が触媒作用機序を有し、どちらも例えば、約１：１または約２：１～１：２などの同様の存在量で存在する、項目１～３２のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目３４）
前記第１の外因性ポリペプチドが、前記第２の外因性ポリペプチドよりも、重量またはコピー数基準で少なくとも約１０％、２０％、３０％、５０％、または２、３、４、５、１０、２０、５０、または１００倍豊富である（任意選択的に１０倍または１００倍に至る）、項目１～３３のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目３５）
前記第１のポリペプチドが化学量論的作用機序を有し、前記第２のポリペプチドが触媒作用機序を有し、前記第１のポリペプチドが前記第２のポリペプチドよりも豊富である、項目１～３４のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目３６）
ａ）０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％のＮａＣｌでの５０％未満の細胞溶解の浸透圧脆性；
ｂ）約１０～２００ｆＬの細胞容積、または約１ミクロン～約２０ミクロン、約２ミクロン～約２０ミクロン、約３ミクロン～約２０ミクロン、約４ミクロン～約２０ミクロン、約５ミクロン～約２０ミクロン、約６ミクロン～約２０ミクロン、約５ミクロン～約１５ミクロン、または約１０ミクロン～約３０ミクロンの細胞の直径；
ｃ）１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％を超える胎児ヘモグロビン；または少なくとも約２０、２５、または３０ｐｇ／細胞のヘモグロビン；または
ｄ）アネキシンＶ染色による測定で、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の細胞表面側のホスファチジルセリン含有量
の１つまたは複数の特性を有する、項目１～３５のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目３７）
複数の外因性ポリペプチドの少なくとも１つ、例えば、全部が、グリコシル化されている、項目１～３６のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目３８）
網状赤血球である、項目１～３７のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目３９）
前記外因性ポリペプチドまたはポリペプチド群が、ＬＰＸＴＧ（配列番号１７）などのソルターゼ移入シグネチャを欠く、項目１～３８のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目４０）
例えば、融合タンパク質などの外因性ポリペプチドが、
ｉ）赤血球系細胞表面の前記融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％が同一配列を有し；
ｉｉ）前記融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％が、同一膜貫通領域であり；
ｉｉｉ）前記融合タンパク質が完全長内因性膜タンパク質を含まず、例えば、完全長内因性膜タンパク質のセグメントを含み、このセグメントが、完全長内因性膜タンパク質の少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、または５００個のアミノ酸を欠き；
ｉｖ）前記融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％が、１、２、３、４、５、１０、２０、または５０個のアミノ酸を超えて互いに異ならず；
ｖ）前記外因性ポリペプチドは、ソルターゼ移入シグネチャを欠き；
ｖｉ）前記外因性ポリペプチドが、１、２、３、４、または５未満の配列の異なる融合ポリペプチド上に存在する部分を含み；
ｖｉｉ）前記外因性ポリペプチドが、単一の融合ポリペプチドとして存在し；
ｖｉｉｉ）前記融合タンパク質が、内因性膜貫通タンパク質と前記部分との接合部にＧｌｙ－Ｇｌｙを含有せず；
ｉｘ）前記融合タンパク質がＧｌｙ－Ｇｌｙを含有せず、または前記融合タンパク質がＧｌｙ－Ｇｌｙを含有せず、または細胞外領域にＧｌｙ－Ｇｌｙを含有せず、膜貫通部分の１、２、３、４、５、１０、２０、５０、または１００個のアミノ酸内の細胞外領域にＧｌｙ－Ｇｌｙを含有せず；
またはそれらの組み合わせである、項目１～３９のいずれか一項に記載の除核赤血球。
（項目４１）
標的と相互作用する第１の外因性ポリペプチド、および
標的を修飾する第２の外因性ポリペプチド
を含む除核赤血球系細胞であって、
（ａ）前記第２の外因性ポリペプチドが、例えば、ＩｄｅＳポリペプチドなどであり、例えば、ヒンジ領域で、ＣＨ２領域で、またはヒンジとＣＨ２領域との間で抗体を切断する部分を含み；
（ｂ）前記第２の外因性ポリペプチドが、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、（例えば、特異的に）結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを前記標的に付着させる、酵素（例えば、プロテアーゼ）を含み、前記標的が任意選択的に、抗体であり；
（ｃ）前記第２の外因性ポリペプチドが、ポリペプチド、例えば、酵素、例えば、前記標的の二次、三次、または四次構造を修飾するプロテアーゼを含み、いくつかの実施形態では、前記標的が、例えば、前記第１の外因性ポリペプチドまたは前記第１の外因性ポリペプチド以外の分子などの別の分子と相互作用する能力を変化させ、例えば、減少または増加させ、任意選択的に、前記標的が抗体を含み；
（ｄ）前記第２の外因性ポリペプチドが、例えば、ポリペプチドなどの標的を、例えば、第１の基質に結合する第１の標的ドメインおよび第２の基質に結合する第２の標的ドメインなどの、第１の標的ドメインおよび第２の標的ドメインの間で切断する、酵素（例えば、プロテアーゼ）などのポリペプチドを含み；
（ｅ）前記標的が、ポリペプチド；炭水化物（例えば、グリカン）、脂質（例えば、リン脂質）、または核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり；
（ｆ）前記第１の外因性ポリペプチドが、例えば、抗体などの標的と結合するが切断せず、前記第２の外因性ポリペプチドが、例えば、抗体中の共有結合などの共有結合などの結合を切断し；
（ｇ）前記標的が抗体を含み、前記第１の外因性ポリペプチドが前記抗体標的の可変領域に結合し；
（ｈ）前記標的が抗体を含み、前記第１の外因性ポリペプチドが抗体標的の定常領域に結合し；
（ｉ）前記第１の外因性ポリペプチドが、約１～２ｐＭ、２～５ｐＭ、５～１０ｐＭ、１０～２０ｐＭ、２０～５０ｐＭ、５０～１００ｐＭ、１００～２００ｐＭ、２００～５００ｐＭ、５００～１０００ｐＭ、１～２ｎＭ、２～５ｎＭ、５～１０ｎＭ、１０～２０ｎＭ、２０～５０ｎＭ、５０～１００ｎＭ、１００～２００ｎＭ、２００～５００ｎＭ、５００～１０００ｎＭ、１～２μＭ、２～５μＭ、５～１０μＭ、１０～２０μＭ、２０～５０μＭ、または５０～１００μＭの標的親和性を有し；
（ｊ）前記第２の外因性ポリペプチドが、前記標的に対して約１０ －１ ～１０ －７ Ｍ、１０ －１ ～１０ －２ Ｍ、１０ －２ ～１０ －３ Ｍ、１０ －３ ～１０ －４ Ｍ、１０ －４ ～１０ －５ Ｍ、１０ －５ ～１０ －６ Ｍ、または１０ －６ ～１０ －７ ＭのＫ Ｍ を有し；
（ｋ）前記標的に対する前記第２の外因性ポリペプチドのＫ Ｍ （Ｍ単位で測定）で除した、前記標的に対する前記第１の外因性ポリペプチドのＫ ｄ （Ｍ単位で測定）の比率が、約１×１０ －９ ～２×１０ －９ 、２×１０ －９ ～５×１０ －９ 、５×１０ －９ ～１×１０ －８ 、１×１０ －８ ～２×１０ －８ 、２×１０ －８ ～５×１０ －８ 、５×１０ －８ ～１×１０ －７ 、１×１０ －７ ～２×１０ －７ 、２×１０ －７ ～５×１０ －７ 、５×１０ －７ ～１×１０ －６ 、１×１０ －６ ～２×１０ －６ 、２×１０ －６ ～５×１０ －６ 、５×１０ －６ ～１×１０ －５ 、１×１０ －５ ～２×１０ －５ 、２×１０ －５ ～５×１０ －５ 、５×１０ －５ ～１×１０ －４ 、１×１０ －４ ～２×１０ －４ 、２×１０ －４ ～５×１０ －４ 、５×１０ －４ ～１×１０ －３ 、１×１０ －３ ～２×１０ －３ 、２×１０ －３ ～５×１０ －３ 、５×１０ －３ ～１×１０ －２ 、１×１０ －２ ～２×１０ －２ 、２×１０ －２ ～５×１０ －２ 、５×１０ －２ ～１×１０ －１ 、１×１０ －１ ～２×１０ －１ 、２×１０ －１ ～５×１０ －１ 、または５×１０ －１ ～１であり；
（ｌ）前記標的を修飾する前記第２の外因性ポリペプチドの観察された反応速度が、その他の点では類似した反応条件下において、類似しているが前記第１の外因性ポリペプチドを欠く除核細胞の反応速度より高く；
（ｍ）前記赤血球系細胞上の前記第２の外因性ポリペプチドの平均数に対する、前記赤血球系細胞上の前記第１の外因性ポリペプチドの平均数の比率が、約５０：１、２０：１、１０：１、８：１、６：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、１：１０、１：２０、または１：５０であり；
（ｎ）前記標的に対する前記第１の外因性ポリペプチドの親和性が、前記修飾された（例えば、切断された）標的に対する前記第１の外因性ポリペプチドの親和性より高く；
（ｏ）前記除核赤血球系細胞の治療有効用量が、投与時における対象の末梢血中の前記標的の量に対する化学量論比より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）；
（ｐ）有効用量中の前記除核赤血球系細胞数が、例えば、投与時における前記対象の末梢血中の標的分子などの前記標的の数より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）；
（ｑ）前記第２の外因性ポリペプチドの数が、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量または生体外有効量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）、例えば、投与時における前記対象の末梢血中の前記標的の数より少なく；
（ｒ）前記第１の外因性ポリペプチドの数が、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量または生体外有効量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）、例えば、投与時における前記対象の末梢血中の前記標的の数より少なく；
（ｓ）前記第１の外因性ポリペプチドの数および前記第２の外因性ポリペプチドの数が、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、それぞれ標的に対する基準値より少なく（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少なく）、例えば、投与時における前記対象の末梢血中の前記標的の数より少なく；
（ｔ）前記第２の外因性ポリペプチドが、少なくとも１０ －１ Ｍ、１０ －２ Ｍ、１０ －３ Ｍ、１０ －４ Ｍ、１０ －５ Ｍ、１０ －６ Ｍ、または１０ －７ ＭのＫ Ｍ で標的を修飾し（例えば、切断し）；
（ｕ）前記第２の外因性ポリペプチドが、シャペロンを含み；
（ｖ）前記第１の外因性ポリペプチドが表面露出部分を含み、前記第２の外因性ポリペプチドが表面露出部分を含み；または
（ｗ）前記除核赤血球系細胞の有効量が、前記第２の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球系細胞の有効量より少ない（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少ない）
の１つまたは複数である、除核赤血球系細胞。
（項目４２）
（ｂ）前記第２の外因性ポリペプチドが、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、（例えば、特異的に）結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを前記標的に付着させる、酵素（例えば、プロテアーゼ）を含み、前記標的は任意選択的に、例えば、抗薬物抗体などの抗体である、項目４１に記載の除核赤血球系細胞。
（項目４３）
前記修飾が、前記標的が、例えば、前記第１の外因性ポリペプチドまたは前記第１の外因性ポリペプチド以外の分子などの別の分子と相互作用する能力を変化させ、例えば、増加または減少させる、項目４１または４２に記載の除核赤血球系細胞。
（項目４４）
（ｄ）前記第２の外因性ポリペプチドが、例えば、ポリペプチドなどの前記標的を、例えば、第１の基質に結合する第１の標的ドメインおよび第２の基質に結合する第２の標的ドメインなどの、第１の標的ドメインおよび第２の標的ドメインの間で切断する、酵素（例えば、プロテアーゼ）などのポリペプチドを含む、項目４１～４３のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目４５）
前記第１の標的ドメインが前記第２の標的ドメインから放出される、項目４４に記載の除核赤血球系細胞。
（項目４６）
切断が、前記第１の基質に対する前記第１の標的ドメインの親和性、および前記第２の基質に対する前記第２の標的ドメインの親和性の片方または双方を変化させる、項目４４または４５に記載の除核赤血球系細胞。
（項目４７）
前記標的が抗体を含み、前記第１の標的ドメインが１つまたは複数のＣＤＲ含み、前記第２の標的ドメインが例えば、Ｆｃ領域などの定常領域の一部を含む、項目４１～４６のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目４８）
前記標的が、感染成分以外の、例えば、細菌成分、ウイルス成分、真菌成分、または寄生成分以外のものである、項目４１～４７のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目４９）
前記第１の外因性ポリペプチドが、標的結合ドメインを含む、項目４１～４８のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目５０）
前記第１の外因性ポリペプチドの表面露出部分が、前記標的に結合する、項目４１～４９のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目５１）
前記第２の外因性ポリペプチドの表面露出部分が、例えば、プロテアーゼ活性などの酵素活性を含む、項目４１～５０のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目５２）
前記第２の外因性ポリペプチドの表面露出部分が、前記標的を酵素的に修飾し、例えば、切断する、項目４１～５１のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目５３）
前記標的が抗薬物抗体を含み、前記第１の外因性ポリペプチドがそれに対して抗薬物抗体が結合するポリペプチドを含み、前記第２の外因性ポリペプチドが抗薬物抗体を切断してＦａｂ部分およびＦｃ部分を生じるプロテアーゼを含む、項目４１～５２のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目５４）
前記除核赤血球が、前記第２の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球よりも速い速度で、対象の身体から前記標的を排除できる、項目４１～５３のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目５５）
前記除核赤血球が、前記標的と、または例えば、切断中に前記標的に作用する前記第２の外因性タンパク質の反応生成物と、複合体形成する、項目４１～５４のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目５６）
膜貫通ドメインと、抗薬物抗体に結合できる表面露出ポリペプチドとを含む第１の外因性ポリペプチド、および
膜貫通ドメインおよび表面露出ＩｄｅＳポリペプチドを含む第２の外因性ポリペプチドを含む除核赤血球系細胞。
（項目５７）
例えば、少なくとも１０ ８ 、１０ ９ 、１０ １０ 、１０ １１ 、または１０ １２ 個の細胞などの項目１～５６のいずれか一項に記載の複数の細胞を含む医薬品などの製剤。
（項目５８）
がんを治療するための、項目１～５６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目５９）
前記がんが、（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、原発不明がん（ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｒｉｍａｒｙ）、骨転移がん、脳転移がん、肝臓転移がん、肺転移がん、カルチノイド、子宮頸がん、絨毛がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、妊娠性絨毛腫瘍（ＧＴＴ）、有毛細胞白血病、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、黒色腫皮膚がん、中皮腫、男性がん、奇胎妊娠、口腔および中咽頭がん、骨髄腫、鼻および洞がん、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、前立腺がん、希少がん、直腸がん、唾液腺がん、二次がん、皮膚がん（非黒色腫）、軟部組織肉腫、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣がん、甲状腺がん、原発不明がん（ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、子宮がん、膣がん、および外陰部がんから選択される、項目５８に記載の細胞。
フローサイトメトリーを通じて測定された、ラジアポトーシスアッセイの結果を示す一連のグラフである。ラジ細胞は、ＣＦＳＥ標識され、非形質導入（対照）であるか、単一または複数のＴＲＡＩＬ変異型で形質導入された赤血球分化細胞と共培養され、または２つの異なる単一形質導入細胞と共培養される。％アポトーシスは、ラジ（ＣＦＳＥ＋）とアネキシンＶ＋である細胞のパーセントによって判定される。（上）様々な条件のＣＦＳＥおよびアネキシンＶ染色のフローサイトメトリープロット。（下）様々な条件の％アポトーシスのグラフ。 ５時間のインキュベーションの前後における、抗ウサギＦｃフルオロフォア標識抗体で標識された、対照赤血球系細胞（ＵＮＴ）またはＩｄｅＳ発現赤血球系細胞（ＩＤＥＳ）からの平均蛍光強度を示す棒グラフである。 対照細胞（ＵＮＴ）またはＩｄｅ－Ｓ発現細胞（ＩｄｅＳ－ＲＣＴ）からの上清中の、標的抗体の非損傷重鎖または重鎖断片を示すウェスタンブロットである。矢印は、重鎖（Ｈｃ）、重鎖断片（Ｈｃ断片）、および軽鎖（Ｌｃ）を示す。 第１の外因性ポリペプチド（白色）、第２の外因性ポリペプチド（網掛け）、および第３の外因性ポリペプチド（クロスハッチング（ｃｌｏｓｅ ｈａｔｃｈｉｎｇ））を含む、赤血球系細胞の概略図であり、各外因性ポリペプチドは、例えば、望ましくない標的などの標的を捕捉できる、捕捉剤を含む。赤血球系細胞は二重捕捉に関与し得て、それは２つ以上の外因性ポリペプチドを用いて、単一または複数の可溶性因子に結合する。 第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドを含む赤血球系細胞の概略図であり、各外因性ポリペプチドは、例えば望まれない抗体、例えば抗薬物抗体などの抗体を捕捉できる。 例えば、抗体、例えば望まれない抗体、例えば抗薬物抗体などの標的に結合する第１の外因性ポリペプチドと、標的を修飾する、例えば、標的を切断する、第２の外因性ポリペプチドとを含む赤血球系細胞の概略図である。第２の外因性ポリペプチドは、ＩｄｅＳなどのプロテアーゼを含み得る。 薬物による治療に対する反応において対象によって産生された、例えば、望まれない抗薬物抗体などの標的に結合する第１の外因性ポリペプチドと、標的を切断する第２の外因性ポリペプチドと、例えば、対象がそれに対して抗薬物抗体を産生した薬物の代替物などの治療用タンパク質を含む任意選択の第３の外因性ポリペプチドと含む、赤血球系細胞の概略図である。 治療活性を有する第１の外因性ポリペプチド（例えば、抗ＣＤ４０抗体分子）、第１の外因性ポリペプチドを阻害する第２の外因性ポリペプチド（例えば、ＣＤ４０またはその断片もしくは変異型）、および任意選択的に、例えば、抗ＣＤ２０抗体分子などの標的化剤を含んでなる第３の外因性ポリペプチドを含んでなる赤血球系細胞の概略図である。 第１の標的化剤を有する第１の外因性ポリペプチドと、第２の標的化剤を有する第２の外因性ポリペプチドとを含んでなる赤血球系細胞の概略図である。 拮抗薬および／または作動薬を含む、赤血球系細胞の概略である。 標的化剤（例えば、抗ＣＤ４抗体分子）および内部ペイロード（例えば、ＩＤＯ）を含む、概略図または赤血球系細胞（ｄｉａｇｒａｍ ｏｒ ａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｃｅｌｌ）である。 標的化剤を含む第１の外因性ポリペプチドと、標的の作動薬を含む第２の外因性ポリペプチドとを含む、赤血球系細胞の概略図である。 標的化剤（例えば、抗ＢＣＭＡ抗体分子）を含む第１の外因性ポリペプチドと、捕捉剤を含む第２の外因性ポリペプチドとを含む、赤血球系細胞の概略図である。 標的化剤を含む第１の外因性ポリペプチドと、例えば、アポトーシスなどの所与の活性を促進する第２の外因性ポリペプチド（例えば、ＴＲＡＩＬ）とを含む、赤血球系細胞の概略図である。
定義
本明細書の用法では、「抗体分子」という用語は、例えば、免疫グロブリン鎖または少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域配列を含むその断片などのタンパク質を指す。「抗体分子」という用語は、抗体および抗体断片を包含する。一実施形態では、抗体分子は、例えば、二重特異性抗体分子などの多特異性抗体分子である。抗体分子の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、直鎖抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのどちらか）などの単一ドメイン抗体、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結する２つのＦａｂ断片を含む二価の断片などの抗体断片から形成される多特異性抗体、抗体から単離されたエピトープ結合断片、マキシ抗体、ミニ抗体、ナノボディ、細胞内抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、ｖ－ＮＡＲ、およびｂｉｓ－ｓｃＦｖが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書の用法では、「併用療法」または「組み合わせ投与」は、特定の疾患または病状に対する治療レジメンの一部として、２つ（以上）の異なる薬剤または治療法が対象に投与されることを意味する。治療レジメンは、各薬剤の投与の用量および周期性を含み、その結果、対象に対する別個の薬剤の効果が重複する。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤の送達は同時でありまたは並行し、薬剤は共配合されてもよい。その他のいくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤は共配合されずに、規定レジメンの一部として逐次様式で投与される。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤または治療法の組み合わせ投与の結果、症状またはその他の障害関連パラメータの低下は、１つの薬剤または治療法が単独で、または他の薬剤の不存在下で与えられる場合に観察されるであろうものを上回る。２つの治療法の効果は、部分的に相加的、完全に相加的であり得て、または相加的を上回り得る（例えば、相乗的）。各治療薬の逐次投与または実質的に同時の投与は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を介する直接吸収をはじめとするが、これに限定されるものではない、任意の適切な経路によってもたらされ得る。治療薬は、同一経路によってまたは異なる経路によって投与され得る。例えば、組み合わせの第１の治療薬が静脈内注射によって投与されてもよい一方で、組み合わせの第２の治療剤は経口的に投与されてもよい。
用語「協調された」または「協調様式」は、複数の薬剤が一緒に作用して治療上の利益を提供することを意味する。協調活性のタイプとしては、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォール－ベース、多量体ベース、および代償性活性が挙げられる。一実施形態では、同一除核ＲＢＣ中で送達される複数の外因性ポリペプチドによってもたらされる治療効果のレベルは、複数のポリペプチドのそれぞれが異なる除核ＲＢＣから送達される場合に見られるものより高い。
本明細書の用法では、「除核」とは、例えば、成熟赤血球への分化によってその核を失った細胞などの核を欠く細胞を指す。
本明細書の用法では、「外因性ポリペプチド」という用語は、そのタイプの野生型細胞によって産生されず、または外来ポリペプチドを含有する細胞よりも野生型細胞においてより低いレベルで存在するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、細胞に導入された核酸によってコードされるポリペプチドであり、その核酸は任意選択的に細胞によって保持されない。
本明細書の用法では、「マルチモーダル療法」という用語は、協調機能（例えば、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性活性）を有する複数の（例えば、２、３、４または５またはそれ以上の）外因性薬剤（例えば、ポリペプチド）を提供する、例えば、除核赤血球療法などの療法を指す。
本明細書の用法では、「経路」または「生物学的経路」という用語は、逐次様式で一緒に作用する、例えば、ポリペプチドなどの複数の生物学的分子を指す。経路の例としては、シグナル伝達カスケードが挙げられる。いくつかの実施形態では、経路は、細胞外シグナルの検出で始まり、標的遺伝子の転写の変化で終わる。いくつかの実施形態では、経路は、細胞質シグナルの検出で始まり、標的遺伝子の転写の変化で終わる。経路は、線状または分枝状であり得る。分枝状の場合、それは、複数の入力（収束）または複数の出力（発散）を有し得る。
本明細書の用法では、「近接依存性」分子は、単独よりも第２の分子と近接している場合に、例えば、より大きいなど、異なる活性を有する第１の分子を指す。いくつかの実施形態では、１対の近接依存性リガンドは、それらが互いに離れている場合よりも近接している場合に、下流因子をより強く活性化する。
明細書の用法では、「受容体成分」は、それ自体が、または複合体の一部として、受容体として機能するポリペプチドを指す。したがって受容体成分は、ポリペプチド受容体と、受容体複合体の一部として機能するポリペプチドとを包含する。
「相乗作用」または「相乗的」という用語は、それら個々の効果と比較して、２つ以上の薬剤（例えば、除核赤血球の一部であるポリペプチド）の組み合わせの相加効果を超えることを意味する。特定のいくつかの実施形態では、相乗的活性は、第１のポリペプチドを含む除核赤血球および第２のポリペプチドを含む除核赤血球の効果と比較して、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む除核赤血球の相加効果を上回る。いくつかの実施形態では、相乗的活性は、第１の薬剤が検出可能な出力Ｘレベルを生じ、第２の薬剤が検出可能な出力Ｘレベルを生じて、第１および第２の薬剤が一緒になって出力Ｘの加算値を超えるレベルを生じる場合に存在する。
本明細書の用法では、ポリペプチドの「変異型」という用語は、そのポリペプチドと比較して、例えば、１つまたは複数の置換、挿入または欠失などの少なくとも１つの配列の相違を有するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、変異型は、そのポリペプチドと、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。変異型には、断片も含まれる。いくつかの実施形態では、断片は、完全長ポリペプチドと比較して、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその双方で（それぞれ独立して）、１、２、３、４、５、１０、２０、または１００個のアミノ酸を欠く。
例示的外因性ポリペプチドおよびその使用
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球治療薬は、例えば、外因性ポリペプチド、脂質、または小分子などの、１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５、６、１０またはそれ以上の）異なる外因性薬剤を含む。いくつかの実施形態では、赤血球治療薬は、本明細書に記載の２つ以上の異なるタンパク質を含む外因性融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、例えば、網状赤血球などの除核赤血球は、本明細書に記載の２つ以上の異なる外因性ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の（例えば、全部の）外因性ポリペプチドは、ヒトポリペプチドまたはその断片もしくは変異型である。
いくつかの実施形態では、２つ以上のポリペプチドは同一標的に作用し、その他のいくつかの実施形態では、それらは２つ以上の異なる標的に作用する。いくつかの実施形態では、単一の標的または複数の標的は、内因性ヒトタンパク質または可溶性因子（例えば、ポリペプチド、小分子、または無細胞核酸）から選択される。
外因性タンパク質の１つまたは複数は、例えば、ヒト細胞である哺乳類細胞などの真核細胞に特徴的な、翻訳後修飾を有してもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５またはそれ以上の）外因性タンパク質は、グリコシル化され、リン酸化され、またはその双方である。糖タンパク質の生体外検出は、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）法の変法を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロット上で慣例的に達成される。糖タンパク質の細胞局在化は、当該技術分野で公知のレクチン蛍光コンジュゲートを利用して達成されてもよい。リン酸化は、ホスホ特異的抗体を用いてウェスタンブロットによって評価されてもよい。
翻訳後修飾としてはまた、疎水性基へのコンジュゲーション（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、またはＧＰＩ化）、補因子へのコンジュゲーション（例えば、リポイル化、フラビン部分（例えば、ＦＭＮまたはＦＡＤ）、ヘムＣ、ホスホパンテテイニル化、またはレチニリデンシッフ塩基形成）、ジフタミド形成、エタノールアミンホスホグリセロール付着、ヒプシン形成、アシル化（例えば、Ｏ－アシル化、Ｎ－アシル化、またはＳ－アシル化）、ホルミル化、アセチル化、アルキル化（例えば、メチル化またはエチル化）、アミド化、ブチリル化、γ－カルボキシル化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ＡＤＰ－リボース化などのヌクレオチド付加、酸化、リン酸エステル（Ｏ結合型）またはホスホロアミダート（Ｎ結合）形成、（例えば、リン酸化またはアデニリル化）、プロピオニル化、ピログルタミン酸形成、Ｓ－グルタチオン付加、Ｓ－ニトロシル化、スクシニル化、硫酸化、ＩＳＧ化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、ＮＥＤＤ化、またはアミノ酸の化学修飾（例えば、シトルリン化、脱アミド、脱離（ｅｌｉｍｉｎｙｌａｔｉｏｎ）、またはカルバミル化）、ジスルフィド架橋の形成、ラセミ化（例えば、プロリン、セリン、アラニン、またはメチオニンのラセミ化）も挙げられる。いくつかの実施形態では、グリコシル化としては、糖タンパク質を生じる、アルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、スレオニン、チロシン、またはトリプトファンへのグリコシル基の付加が挙げられる。いくつかの実施形態では、グリコシル化は、例えば、Ｏ結合型グリコシル化またはＮ結合グリコシル化を含む。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリペプチドは融合タンパク質であり、例えば、内因性赤血球タンパク質またはその断片との、例えば、膜貫通タンパク質との、例えば、ＧＰＡまたはその膜貫通断片との融合体である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリペプチドは、例えば、任意選択的に二量体化ドメインを含む、第２の融合外因性ポリペプチドなどの、二量体化または多量体化を促進するドメインと融合する。いくつかの実施形態では、二量体化ドメインは、例えば、ＦｃドメインまたはＣＨ３ドメインなどの、抗体分子の一部を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の二量体化ドメインは、ノブ・イン・ホール変異（例えば、Ｔ３６６ＹノブおよびＹ４０７Ｔホール）を含み、ヘテロ二量体化を促進する。
例えば、表１～４のいずれかから選択されるヒトポリペプチドなどの例示的なヒトポリペプチドとしては、以下が挙げられる。
ａ）例えば、疾患状態に関連しない天然に存在する形態のヒトポリペプチドなどのヒトポリペプチドの天然に存在する形態；
ｂ）例えば、２０１７年１月１１日付けのＧｅｎＢａｎｋデータベースなどのデータベースに現れる配列を有する、疾病状態に関連しないヒトポリペプチドの天然に存在する形態などの、例えば、２０１７年１月１１日付けのＧｅｎＢａｎｋデータベースなどのデータベースに現れる配列を有する、ヒトポリペプチド；
ｃ）ａ）またはｂ）の配列と、１、２、３、４、５または１０個以下のアミノ酸残基が異なる配列を有する、ヒトポリペプチド；
ｄ）ａ）またはｂ）の配列と、１、２、３、４、５または１０％以下が異なる配列を有する、ヒトポリペプチド；
ｅ）ａ）またはｂ）の配列と実質的に異ならない配列を有する、ヒトポリペプチド；または
ｆ）ａ）またはｂ）の配列を有するヒトポリペプチドと、例えば、酵素活性（例えば、特異性または代謝回転）または結合活性（例えば、結合特異性または親和性）などの生物学的活性において実質的に異ならない、ｃ）、ｄ）、またはｅ）の配列を有するヒトポリペプチド。ｆ）に記載の候補ペプチドは、作製され、本明細書に記載のような類似の活性についてスクリーニングされ得て、本明細書に記載のような除核ＲＢＣで発現される場合には、同等である）。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、例えば、先行する段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、またはｆ）のヒトポリペプチドの全部または断片などのヒトポリペプチドまたはその断片を含む。一実施形態では、外因性ポリペプチドは、先行する段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、またはｆ）のヒトポリペプチドの全部または断片と、追加的なアミノ酸配列とを含む融合ポリペプチドを含む。一実施形態では、追加的なアミノ酸配列は、異なるヒトポリペプチドについての先行する段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、またはｆ）のヒトポリペプチドの全部または断片を含む。
本発明は、その機能的断片もしくは変異型（例えば、表１～４に列挙される抗原のリガンド結合断片またはその変異型）が作製され、本明細書に記載のような類似の活性についてスクリーニングされ得て、本明細書に記載のような除核ＲＢＣで発現される場合には、同等である）ことを検討する。
いくつかの実施形態では、２つ以上の外因性薬剤（例えば、ポリペプチド）は、本明細書に記載のような薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性である関連機能を有する。いくつかの実施形態では、これらの記述子のうちの２つ以上が、所与のＲＢＣに適用される。
薬剤相加的構成
２つ以上の薬剤（例えば、ポリペプチド）が薬剤相加的である場合、一緒に作用する薬剤の効果は、いずれかの薬剤が単独で作用する効果よりも大きい。一実施形態では、２つの薬剤は、ＲＢＣにおいて（例えば、ＲＢＣ表面で）異なる（例えば、相補的）機能を有し、一緒に作用して（単独で作用する薬剤のいずれかと比較して）、例えば、標的に対するより高い結合親和性、または例えば、単一の標的などの標的によるシグナル伝達のより大きな程度の調節などの、より強い作用を有する。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤は、それぞれ、例えば、同一標的タンパク質内の異なるエピトープなどの同一標的に結合する。
一実施形態では、薬剤は互いに結合し、例えば、ヘテロ二量体複合体の構成員である。一実施形態では、薬剤は、単独で作用する場合よりも一緒に作用する場合に、標的に対するより大きい結合活性を有する。
いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤は、いずれかの薬剤単独よりも標的へのより密接な結合ができるようにする。いくつかの実施形態では、例えば、サイトカイン受容体成分、例えば、ＩＬ－１受容体成分、例えば、インターロイキン受容体成分などの受容体成分のヘテロ二量体は、いずれかの受容体成分単独よりも高い親和性で標的（例えば、ＩＬ－１）に結合する。多くのシグナル伝達分子は、細胞表面にヘテロ二量体またはヘテロ多量体を形成して、そのリガンドに結合する。サイトカイン受容体は、例えば、ヘテロ二量体またはヘテロ多量体であり得る。例えば、ＩＬ－２受容体は、ＩＬ２Ｒａ、ＩＬ２Ｒｂ、およびＩＬ２Ｒｇの３つの異なる分子を含む。ＩＬ－１３受容体は、ＩＬ１３ＲａおよびＩＬ４Ｒのヘテロ二量体である。ＩＬ－２３受容体は、ＩＬ２３ＲおよびＩＬ１２Ｒｂ１のヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ＴＮＦα受容体は、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２のヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリペプチドは、表１のサイトカイン、またはサイトカイン受容体結合断片もしくはその変異型を含んでなる。発現されるサイトカインは、典型的に野生型ヒト受容体配列またはその変異型または断片を有し、それは、その標的受容体を通じて結合してシグナル伝達できる。サイトカインおよびそれらの受容体の表は、本明細書で表１として提供される。サイトカインは、ＲＢＣの表面に存在し得る。
Figure 0007093302000001
Figure 0007093302000002
いくつかの実施形態では、薬剤は、循環中の抗体、例えば、抗薬物抗体を捕捉するための、例えば、Ｆｃ結合分子などの異なる抗体結合分子である。いくつかの実施形態では、薬剤は互いに非競合的であり、個々の抗体またはオプソニン化粒子のより高い親和性結合を可能にする。例えば、いくつかの実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、タンパク質Ａ、Ｆｃ受容体１（ＦｃＲ１）、ＦｃＲ２ａ、ＦｃＲ２ｂ、ＦｃＲ３、ＦｃＲ４、ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）またはその抗体結合断片もしくは変異型から選択される。
いくつかの実施形態では、標的は、例えば、がん性Ｂ細胞、Ｔ細胞、リンパ系細胞、または循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの循環がん細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された赤血球（例えば、網状赤血球）を用いて、がん細胞を捕捉し、それを循環から除去する。例えば、１つまたは複数の薬剤は、細胞表面の異なるタンパク質に結合して、治療の特異性を高める。例えば、薬剤は、ＣＴＣを捕捉するための抗ＥＰＣＡＭおよび抗ＣＤ４５抗体分子、またはＢ細胞系急性白血病細胞を捕捉するための抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体分子を含んでなる。
除核赤血球は、標的（例えば、抗薬物抗体）と相互作用する第１の外因性ポリペプチドと、標的を修飾する第２の外因性ポリペプチド（例えば、ＩｄｅＳなどのプロテアーゼ）とを含んでなり得る。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、例えば、本明細書に記載のがんなどのがんを有する対象などの対象に投与される。
いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドを含む除核赤血球系細胞の有効量は、第１の外因性ポリペプチドを欠くまたは第２の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球系細胞の有効量より少ない（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９９％少ない）。いくつかの実施形態では、予め選択された量は、除核赤血球系細胞の有効量または生体外有効量である。いくつかの実施形態では、予め選択された量（例えば、有効量）は、アッセイにおいて、例えば、１、２、３、４、５、または６時間などの予め選択された時間内に、例えば、基質の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０５、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を生成物（ｐｒｏｄｕｃｅ）に変換するのに有効な量である。いくつかの実施形態では、予め選択された量（例えば、生体外有効量）は、５時間以内に標的抗体の少なくとも５０％を切断するのに有効である。アッセイは、例えば、溶液中の可溶性の非修飾（例えば、非切断）標的のレベルの減少を測定してもよい。
いくつかの実施形態では、標的の基準値は、投与時における対象の末梢血中の標的の数である。いくつかの実施形態（例えば、生体外有効量の細胞が関与する実施形態）では、標的の基準値は、アッセイのための反応混合物中の標的の数である。
第１の外因性ポリペプチド（例えば、結合剤）
第１の外因性ポリペプチドは、標的に結合し得る。いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、例えば、抗薬物抗体などの抗体を認識する結合ドメインを含んでなる。
いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、結合ドメインおよび膜アンカードメイン（例えば、Ｉ型またはＩＩ型赤血球膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、膜アンカードメインは修飾因子（例えプロばテアーゼ）ドメインのＣ末端またはＮ末端である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、例えば、本明細書中の配列番号９に記載されるような、またはその膜貫通部分、または前述のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドなどである、ＧＰＡまたはその膜貫通部分を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＡポリペプチドは結合ドメインのＣ末端である。
いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００７０３０７０８号パンフレットの例えば、３４～４５頁に掲載されるアドレス部分または標的化部分を含む。
第１の外因性ポリペプチドとしての使用に適切に適合され得るタンパク質のその他の例としては、標的が受容体リガンドである場合などの、受容体のリガンド結合ドメインが挙げられる。逆に、第１の外因性ポリペプチドは、標的が受容体である、受容体リガンドを含み得る。標的リガンドは、ポリペプチドまたは小分子リガンドであり得る。
さらなるいくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ヒトフィブロネクチン（「Ｆｎ３」）の第１０のＩＩＩ型ドメインのような免疫グロブリン様折り畳みを有するポリペプチドに由来するドメインを含み得る。米国特許第６，６７３，９０１号明細書；米国特許第６，４６２，１８９号明細書を参照されたい。Ｆｎ３は小型であり（約９５残基）、モノマー性、可溶性、および安定性である。それはジスルフィド結合を有さず、還元環境における安定性を改善する。構造は、Ｆｎ３が９個でなく７個のβ鎖を有すること以外は、Ａｂ ＶＨドメインのものと同様のβサンドイッチとして記述されてもよい。Ｆｎ３の両端には３つのループがあり；これらのループの３つの位置は、ＶＨドメインのＣＤＲ１、２、および３の位置に対応する。Ｆｎ３の９４個のアミノ酸の配列は、次のとおりである：
Figure 0007093302000003
ＣＤＲ様のアミノ酸位置は、残基２３～３０（ＢＣループ）、５２～５６（ＤＥループ）、および７７～８７（ＦＧループ）として定義される。したがって、ＣＤＲ様ループの１つまたは複数を修飾またはランダム化して結合ドメインのライブラリーが作成されてもよく、それは次に、所望のアドレス結合部位への結合についてスクリーニングされてもよい。国際公開第０２３２９２５号パンフレットもまた参照されたい。Ｆｎ３は、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）の大きなサブファミリーの一例である。Ｆｎ３ファミリーには、細胞接着分子、細胞表面ホルモン、およびサイトカイン受容体、シャペロニン、および炭水化物結合ドメインが含まれ、これらはまた全て、結合剤としての使用のために適合されてもよい。さらに、転写因子ＮＦ－ｋＢのＤＮＡ結合ドメインの構造もまた、Ｆｎ３折り畳みと密接に関連しており、これもまた結合剤としての使用のために適合されてもよい。同様に、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンは、標的化部分としての使用に適合させ得る免疫グロブリン様折り畳みを含有する。
さらに他のいくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、その動態およびアドレス部位への結合の選択性に基づいて選択された、例えば、合成進化された、遺伝子操作されたポリペプチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドの配列は、例えば、ファージディスプレイまたは酵母ツーハイブリッドスクリーニングなどのスクリーニングまたは選択方法を用いて設計される。
いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、可溶性受容体（および任意選択的に可溶性受容体を含む標的）のペプチドリガンド、標的に結合する合成ペプチド、補体制御領域（および任意選択的に補体因子を含む標的）、または細胞表面受容体（および任意選択的に細胞表面受容体を含む標的）のリガンドを含む。
第２の外因性ポリペプチド（例えば、プロテアーゼ）
いくつかの実施形態では、（標的を修飾する）第２の外因性ポリペプチドは、表４に記載される因子である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、表４に記載されるプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、細菌プロテアーゼ、ヒトプロテアーゼ、または植物プロテアーゼ、またはその断片もしくは変異型である。
いくつかの実施形態では、（標的を修飾する）第２の外因性ポリペプチドはプロテアーゼである。例示的プロテアーゼとしては、アミノペプチダーゼ；ジペプチダーゼ；ジペプチジルペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼ；ペプチジルジペプチダーゼ；セリン型カルボキシペプチダーゼ；メタロカルボキシペプチダーゼ；システイン型カルボキシペプチダーゼ；オメガペプチダーゼ；セリンプロテイナーゼ；システインプロテイナーゼ；アスパラギン酸プロテイナーゼ；メタロプロテイナーゼ；または未知の機序のプロテイナーゼに分類されるものが挙げられる。
アミノペプチダーゼとしては、細胞質ゾルアミノペプチダーゼ（ロイシルアミノペプチダーゼ）、メンブレンアラニルアミノペプチダーゼ、シスチニルアミノペプチダーゼ、トリペプチドアミノペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、アルギニルアミノペプチダーゼ、グルタミルアミノペプチダーゼ、ｘ－ｐｒｏアミノペプチダーゼ、細菌ロイシルアミノペプチダーゼ、好熱性アミノペプチダーゼ、クロストリジウムアミノペプチダーゼ、細胞質ゾルアラニルアミノペプチダーゼ、リシルアミノペプチダーゼ、ｘ－ｔｒｐアミノペプチダーゼ、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、ｄ－立体特異的アミノペプチダーゼ、およびアミノペプチダーゼが挙げられる。ジペプチダーゼとしては、ｘ－ｈｉｓジペプチダーゼ、ｘ－ａｒｇジペプチダーゼ、ｘ－メチル－ｈｉｓジペプチダーゼ、ｃｙｓ－ｇｌｙジペプチダーゼ、ｇｌｕ－ｇｌｕジペプチダーゼ、ｐｒｏ－ｘジペプチダーゼ、ｘ－ｐｒｏジペプチダーゼ、ｍｅｔ－ｘジペプチダーゼ、非立体特異的ジペプチダーゼ、細胞質ゾル非特異的ジペプチダーゼ、メンブレンジペプチダーゼ、およびβ－ａｌａ－ｈｉｓジペプチダーゼが挙げられる。ジペプチジルペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼとしては、ジペプチジルペプチダーゼＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、ジペプチジルジペプチダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、およびトリペプチジルペプチダーゼＩＩが挙げられる。ペプチジルジペプチダーゼとしては、ペプチジルジペプチダーゼＡおよびペプチジルジペプチダーゼＢが挙げられる。セリン型カルボキシペプチダーゼとしては、リソソームｐｒｏ－ｘカルボキシペプチダーゼ、セリン型Ｄ－ａｌａ－Ｄ－ａｌａカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＣ、およびカルボキシペプチダーゼＤが挙げられる。メタロカルボキシペプチダーゼとしては、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、リジン（アルギニン）カルボキシペプチダーゼ、ｇｌｙ－Ｘカルボキシペプチダーゼ、アラニンカルボキシペプチダーゼ、ムラモイルペンタペプチドカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＨ、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＭ、ムラモイルテトラペプチドカルボキシペプチダーゼ、亜鉛Ｄ－ａｌａ－Ｄ－ａｌａカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ２、メンブレンｐｒｏ－ｘカルボキシペプチダーゼ、チューブリニル－ｔｙｒカルボキシペプチダーゼ、およびカルボキシペプチダーゼＴが挙げられる。オメガペプチダーゼとしては、アシルアミノアシルペプチダーゼ、ペプチジルグリシンアミダーゼ、ピログルタミルペプチダーゼＩ、β－アスパルチルペプチダーゼ、ピログルタミルペプチダーゼＩＩ、ｎ－ホルミルメチオニルペプチダーゼ、プテロイルポリ－［γ］－グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、γ－ｇｌｕ－Ｘカルボキシペプチダーゼ、およびアシルムラモイル－ａｌａペプチダーゼが挙げられる。セリンプロテイナーゼとしては、キモトリプシン、キモトリプシンＣ、メトリジン、トリプシン、トロンビン、凝固第Ｘａ因子、プラスミン、エンテロペプチダーゼ、アクロシン、α溶菌プロテアーゼ、グルタミル、エンドペプチダーゼ、カテプシンＧ、凝固第ＶＩＩａ因子、凝固第ＩＸａ因子、ククミシン（ｃｕｃｕｍｉｓｉ）、プロリルオリゴペプチダーゼ、凝固第ＸＩａ因子、ブラキウリン、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、膵臓エラスターゼ、白血球エラスターゼ、凝固第ＸＩＩａ因子、キマーゼ、補体成分ｃｌｒ５５、補体成分ｃｌｓ５５、古典的補体経路ｃ３／ｃ５コンバターゼ、補体因子Ｉ、補体因子Ｄ、－経路ｃ３／ｃ５コンバターゼ、セレビシン、ヒポデルミンＣ、リシルエンドペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ１ａ、γレニン（γ－ｒｅｎｉ）、ベノンビンＡＢ、ロイシルエンドペプチダーゼ、トリプターゼ、スクテラリン、ケキシン、サブチリシン、オリジン、エンドペプチダーゼＫ、テルモミコリン、テルミターゼ、エンドペプチダーゼＳＯ、Ｔ－プラスミノーゲンアクチベーター、タンパク質Ｃ、膵臓エンドペプチダーゼＥ、膵臓エラスターゼＩＩ、ＩＧＡセリンエンドペプチダーゼ、Ｕ－プラスミノーゲン、アクチベーター、ベノンビンＡ、フューリン、ミエロブラスチン、セメノゲラーゼ、グランザイムＡまたは細胞毒性Ｔリンパ球プロテイナーゼ１、グランザイムＢまたは細胞毒性Ｔリンパ球プロテイナーゼ２、ストレプトグリシンＡ、ストレプトグリシン（ｔｒｅｐｔｏｇｒｉｓｉｎ）Ｂ、グルタミルエンドペプチダーゼＩＩ、オリゴペプチダーゼＢ、リムルス凝固因子Ｃ、リムルス凝固因子、リムルス凝固酵素、オンプチン、リプレッサーＬｅｘＡ、細菌リーダーペプチダーゼＩ、およびトガビリン、フラビリンが挙げられる。システインプロテイナーゼとしては、カテプシンＢ、パパイン、フィシン、キモパパイン、アスクレパイン、クロストリパイン、ストレプトペイン、アクチニド、カテプシン１、カテプシンＨ、カルパイン、カテプシンＴ、グリシル、エンドペプチダーゼ、がんプロコアグラント、カテプシンＳ、ピコルナイン３Ｃ、ピコルナイン２Ａ、カリカイン、アナナイン、ステムブロメライン、果実ブロメライン、レグマイン、ヒストリサイン、およびインターロイキン１－β変換酵素が挙げられる。アスパラギン酸プロテイナーゼとしては、ペプシンＡ、ペプシンＢ、ガストリクシン、キモシン、カテプシンＤ、ネオペンテシン、レニン、レトロペプシン、ｐｒｏ－オピオメラノコルチン変換酵素、アスペルギロペプシンＩ、アスペルギロペプシンＩＩ、ペニシロペプシン、リゾプスペプシン、エンドチアペプシン、ムコロペプシン、カンジダペプシン、サッカロペプシン、ロドトルラペプシン、フィサロペプシン、アクロシリンドロペプシン、ポリポロペプシン、ピクノポロペプシン、シタリドペプシンＡ、シタリドペプシンＢ、キサントモナペプシン、カテプシンＥ、バリエルペプシン、細菌リーダーペプチダーゼＩ、シュードモナペプシン、およびプラスメプシンが挙げられる。メタロプロテイナーゼとしては、アトロリシンＡ、微生物コラゲナーゼ、ロイコリシン、間質内コラゲナーゼ、ネプリリシン、エンベリシン、ＩｇＡ－特異的メタロエンドペプチダーゼ、プロコラーゲンＮ－エンドペプチダーゼ、チメトオリゴペプチダーゼ、ニューロリシン、ストロメライシン１、メプリンＡ、プロコラーゲンＣ－エンドペプチダーゼ、ペプチジル－ｌｙｓメタロエンドペプチダーゼ、アスタシン、ストロメライシン２、マトリリシンゼラチナーゼ、アエロモノリシン、シュードリシン、サーモリシン、バシロリシン、アウレオリシン、コッコリシン、ミコリシン、β－溶解メタロエンドペプチダーゼ、ペプチジル－ａｓｐメタロエンドペプチダーゼ、好中球コラゲナーゼ、ゼラチナーゼＢ、レイシュマノリシン、サッカロリシン、オートリシン、ジュウテロリシン、セラリシン、アトロリシンＢ、アトロリシンＣ、アトロキサーゼ、アトロリシンＥ、アトロリシンＦ、アダマリシン、ホリリシン、ルベルリシン、ボトロパシン、ボトロリシン、オフィオリシン、トリメレリシンＩ、トリメレリシンＩＩ、ムクロリシン、ピトリリシン、インスリシン、Ｏ－シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼ、ルッセリシン、ミトコンドリア、中間体、ペプチダーゼ、ダクチルイシン、ナルジリシン、マグノリシン、メプリンＢ、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ、マクロファージエラスターゼ、コリオリシン、およびトキシリシンが挙げられる。未知の機序のプロテアーゼとしては、サーモプシンおよび多触媒性エンドペプチダーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、前述のいずれかの断片もしくは変異型を含む。
いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、ＩｄｅＳポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＩｄｅＳポリペプチドは、配列番号８として下に記載される配列、または配列番号８の配列のタンパク質分解活性断片（例えば、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、または３００アミノ酸の断片）、または前述のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含む核酸が関与するいくつかの実施形態では、核酸は、配列番号８として下に記載する配列を有するＩｄｅＳポリペプチド、またはそのタンパク質分解性活性断片、または前述のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列をコードする。
ＩｄｅＳポリペプチド：
Figure 0007093302000004
いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、修飾因子ドメイン（例えば、ＩｄｅＳポリペプチドなどのプロテアーゼドメイン）および膜アンカードメイン（例えば、Ｉ型またはＩＩ型赤血球膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、膜アンカードメインは修飾因子（例えプロばテアーゼ）ドメインのＣ末端またはＮ末端である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＧＰＡまたはその膜貫通部分を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＡポリペプチドは、
Figure 0007093302000005
 の配列、またはその膜貫通部分、または前述のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドを有する。いくつかの実施形態では、ＧＰＡポリペプチドは、修飾因子（例えば、プロテアーゼ）ドメインのＣ末端である。
いくつかの実施形態では、例えば、グリシン－セリンリンカー、例えば、ＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号１０）および／またはＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１１）の配列を含むリンカーなどのリンカーは、ＩｄｅＳポリペプチドと膜貫通ポリペプチドとの間に配置される。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチド、例えば、第２の外因性ポリペプチド、例えば、プロテアーゼ、例えば、ＩｄｅＳポリペプチドは、リーダー配列、例えば、ＧＰＡリーダー配列、例えば、ＭＹＧＫＩＩＦＶＬＬＬＳＥＩＶＳＩＳＡ（配列番号１２）を含む。
いくつかの実施形態では、例えば、第２の外因性ポリペプチドなどの外因性ポリペプチドは、例えば、ＨＡタグまたはＦＬＡＧタグなどのタグをさらに含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ（例えば、免疫グロブリン分解酵素、例えば、免疫グロブリンＧ分解酵素、例えば、ＩｄｅＳ）は、ヒンジ領域で、ＣＨ２領域で、またはヒンジ領域とＣＨ２領域との間で、免疫グロブリンを切断する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、例えば、以下の配列中の２つのイタリック体のグリシンの間、またはイタリック体のアラニンとグリシンの間などの、以下の配列の１つで免疫グロブリンを切断する。
Figure 0007093302000006
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ（例えば、細菌プロテアーゼ）は、例えば、ＩｄｅＳまたはＩｇＡプロテアーゼなどのＩｇＧを切断する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ（例えば、パパインなどのパパインファミリープロテアーゼ）は、例えば、重鎖の２２４位と２２５位との間のヒスチジン－スレオニン結合および／または重鎖の２３３位と２３４位との間のグルタミン酸－ロイシン結合などのＦｃとＦａｂ領域との間で、免疫グロブリンを切断する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼまたはその他の修飾因子は、表４に列挙される標的に作用する。
いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００７０３０７０８号パンフレットの例えば、４５～４６頁に記載される触媒部分を含む。
第２の外因性ポリペプチドは、標的に作用して化学変化を誘発し、それによりその活性を調節し得る部分、例えば、標的内の反応を触媒し得る部分を含み得る。第２の外因性ポリペプチドは、天然に存在する酵素、その活性な（例えば、触媒的に活性な）断片、または酵素活性を有するように遺伝子操作されたタンパク質、例えば、セリンプロテアーゼ活性モチーフを含有するように設計されたタンパク質などの遺伝子操作された酵素を含み得る。第２の外因性ポリペプチドの触媒領域は、標的中に所望の化学変化を誘発するのに有効なアミノ酸配置を含み得る。それらは、天然酵素、変異型、チモーゲン、または完全球形ドメインのＮ末端またはＣ末端切断バージョンであってもよい。
第２の外因性ポリペプチドは、単独では乱交雑性で、多くの異なる生体分子上でそれが認識する切断部位に結合し、反応動態が比較的芳しくないこともある、酵素的に活性な部位を含み得る。いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、第２の外因性ポリペプチドの近くの標的の局所濃度を増加させることによって特異性を提供または改善する。
第２の外因性ポリペプチドは、いくつかの実施形態では、標的が別の酵素（例えば、既に対象中に存在する酵素）によって認識され作用を受けるように、それを修飾し得る。一実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、その活性が阻害または上方制御されるように、標的の構造を変化させる部分を含む。多くの天然に存在する酵素はその他の酵素を活性化し、これらは本明細書に記載の組成物および方法に従って活用され得る。
第２の外因性ポリペプチドは、プロテアーゼ；グリコシダーゼ；リパーゼ；またはその他のヒドロラーゼ；アミダーゼ（例えば、Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ、ＰＧＲＰ－Ｌアミダーゼ）；またはイソメラーゼ、トランスフェラーゼ（キナーゼなど）、リアーゼ、酸化還元酵素、オキシダーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、グリコシダーゼ、トランスフェラーゼなどをはじめとするその他の酵素活性を含み得る。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、ヒトリゾチーム、ヒトリゾチームの機能部分、ヒトＰＧＲＰ－Ｌ、ヒトＰＧＲＰ－Ｌの機能部分、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＡ２の機能部分、またはＭＭＰ－２（ゼラチナーゼＡ）またはＭＭＰ－９（ゼラチナーゼＢ）などのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）細胞外酵素を含む。
いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、例えば、キモトリプシン、トリプシンまたはエラスターゼまたはカリクレインなどの哺乳類酵素をはじめとするキモトリプシンファミリー、またはサブチリシンなどの細菌酵素をはじめとするサブチリシン（ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ）ファミリーなどのセリンプロテイナーゼである。一般的三次元構造は、２つのファミリーで異なるが、それらは同一活性部位配置を有し、同一機序を通じて触媒作用が進行する。セリンプロテイナーゼは、基質残基と相互作用する様々な酵素のサブサイトにおける、アミノ酸置換に関連する異なる基質特異性を示す。触媒三つ組を形成する、Ｈｉｓ－５７、Ａｓｐ－１０２、およびＳｅｒ－１９５（キモトリプシノーゲン番号付与）の３つの残基は、触媒プロセスにおいて重要である。
いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、パパインまたはアクチニジンまたはブロメラインなどの植物プロテアーゼ、いくつかの哺乳類リソソームカテプシン、細胞質ゾルカルパイン（カルシウム活性化）、およびいくつかの寄生性プロテアーゼ（例えば、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ））をはじめとする、システインプロテイナーゼである。パパインは典型であり、最も良く研究されたファミリーの一員である。セリンプロテイナーゼと同様に、触媒作用は共有結合型中間体の形成を通じて進行し、システインおよびヒスチジン残基が関与する。必須のＣｙｓ－２５およびＨｉｓ－１５９（パパイン番号付与）は、それぞれＳｅｒ－１９５およびＨｉｓ－５７と同じ役割を果たす。求核剤は、ヒドロキシル基ではなくチオレートイオンである。チオレートイオンは、Ｈｉｓ－１５９の隣接するイミダゾリウム基とのイオン対の形成を通じて安定化される。攻撃する求核試薬は、双方のステップにおいてチオレート－イミダゾリウムイオン対であり、水分子は要求されない。
あるいくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドはアスパラギン酸プロテイナーゼであり、その大部分はペプシンファミリーに属する。ペプシンファミリーとしては、ペプシンおよびキモシンならびにリソソームカテプシンＤ、レニンなどのプロセッシング酵素、および特定の真菌プロテアーゼ（ペニシロペプシン、リゾプスペプシン、エンドチアペプシン）などの消化酵素が挙げられる。第２のファミリーは、レトロプロプシンとも呼ばれるエイズウイルス（ｖｉｍｓ）（ＨＩＶ）由来のプロテアーゼなどのウイルスプロテイナーゼを含む。セリンおよびシステインプロテイナーゼとは対照的に、アスパラギン酸プロテイナーゼによる触媒作用は、共有結合型中間体が関与しないが、四面体中間体が存在する。求核攻撃は、水分子から２つのカルボキシル基の２つのダイアドへの１つのプロトン移動と、同時のＣＯ－ＮＨ結合切断を伴う基質のカルボニル酸素への第２のプロトン移動の２つによって達成される。「プッシュプル」機序と称されることがあるこの一般的な酸塩基触媒は、非共有結合型中性四面体中間体の形成をもたらす。
いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、細菌、真菌ならびに高等生物中に見いだされ得るメタロプロテイナーゼである。それらは配列およびその構造が大きく異なるが、大多数の酵素は触媒的に活性な亜鉛（Ｚｎ）原子を含有する。場合によっては、亜鉛は、活性を失うことなく、コバルトまたはニッケルなどの別の金属によって置換されてもよい。細菌サーモリシンは特徴がよく分かっており、その結晶学的構造は、亜鉛が、２つのヒスチジンおよび１つのグルタミン酸によって結合されていることを示唆する。多くの酵素は、亜鉛の２つのヒスチジンリガンドを提供する配列ＨＥＸＸＨを含有するのに対して、第３のリガンドはグルタミン酸（サーモリシン、ネプリライシン、アラニルアミノペプチダーゼ）またはヒスチジン（アスタシン）のどちらかである。その他のファミリーは、Ｚｎ原子の異なる結合様式を示す。触媒機序は、切断可能な結合のカルボニル基への亜鉛結合水分子の攻撃の後に、非共有結合型四面体中間体の形成をもたらす。この中間体は、グルタミン酸プロトンの脱離基への移行によってさらに分解される。
いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、イソメラーゼ（例えば、切断して化学結合を形成するか、または立体構造変化を触媒するイソメラーゼ）を含む。いくつかの実施形態では、イソメラーゼは、ラセミ化酵素（例えば、アミノ酸ラセミ化酵素）、エピメラーゼ、シス－トランスイソメラーゼ、分子内酸化還元酵素、分子内トランスフェラーゼ、または分子内リアーゼである。
いくつかの実施形態では、第２の外因性プロテアーゼは、シャペロンを含む。例えば、シャペロンは、一般的シャペロン（例えば、ＧＲＰ７８／ＢｉＰ、ＧＲＰ９４、ＧＲＰ１７０）、レクチンシャペロン（例えば、カルネキシンまたはカルレティキュリン）、非古典的分子シャペロン（例えば、ＨＳＰ４７またはＥＲｐ２９）、折り畳みシャペロン（例えば、ＰＤＩ、ＰＰＩ、またはＥＲｐ５７）、細菌または古細菌シャペロン（例えば、Ｈｓｐ６０、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ複合体、Ｈｓｐ７０、ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、ＨｔｐＧ、Ｈｓｐ１００、Ｃｌｐファミリー（例えば、ＣｌｐＡおよびＣｌｐＸ）、Ｈｓｐ１０４）であり得る。いくつかの実施形態では、除核赤血球は、例えば、イムノフィリン、Ｓｔｉ１、ｐ５０（Ｃｄｃ３７）、またはＡｈａ１などのコシャペロンを含む。いくつかの実施形態では、分子シャペロンはシャペロニンである。
第２の外因性タンパク質（標的を改変する）の候補は、それらの活性に基づいてスクリーニングされ得る。試験される各分子の比活性に応じて、その分子に適したアッセイが用いられ得る。例えば、第２の外因性タンパク質がプロテアーゼである場合、プロテアーゼをスクリーニングするために使用されるアッセイは、例えば、クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動に基づくアッセイなどのプロテアーゼによって生成される切断産物を検出するアッセイであり得る。
一例では、第２の外因性ポリペプチドは、キナーゼ活性を有してもよい。キナーゼ活性のアッセイは、目的の標的に共有結合的に取り込まれたリン酸塩の量を測定し得る。例えば、目的の標的に組み込まれたリン酸塩は、シンチレーションカウンターを用いて放射線の放出を測定することによって定量化され得る、リン酸塩の放射性同位体であり得る。
標的および適応症
いくつかの実施形態では、標的は、表４に列挙される標的である。
いくつかの実施形態では、標的は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦβから選択される免疫チェックポイント分子である。いくつかの実施形態では、標的は表３に列挙される阻害性リガンドであり、第１の外因性ポリペプチドは、任意選択的に、表３の対応する標的受容体由来の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、標的は表３の標的受容体であり、第１の外因性ポリペプチドは、任意選択的に、表３の対応する阻害性リガンド由来の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、免疫チェックポイント分子（例えば、トリプシン）を切断するプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、例えば、がんを治療するために、Ｔ細胞は、例えば、その受容体（例えば、表３の受容体）をＴ細胞阻害をブロックする分子と接触させることによって、活性化され、または不活性化が防止される。
いくつかの実施形態では、標的は、例えば、ヒト抗体などの抗体である。
本明細書に記載の遺伝子操作された赤血球系細胞はまた、薬剤に対する抗体を有する対象（例えば、図７を参照されたい）を治療するために使用され得る。赤血球系細胞は、対象において抗薬物抗体のレベルを低下させ得て、任意選択的に、その疾患を治療する治療用タンパク質をさらに含み得る。例えば、赤血球系細胞は、例えば、標的が抗薬物抗体である、標的に結合する第１の外因性ポリペプチドを含む。赤血球系細胞は、標的を不活性化する（例えば、切断する）第２の外因性ポリペプチド（例えば、ＩｄｅＳ）をさらに含み得る。赤血球系細胞は、任意選択的に、例えば、対象がそれに対して抗薬物抗体を産生した以前の治療薬と同じまたは異なる治療用タンパク質などである、例えば、対象がそれに対して抗体を産生した以前の治療薬と同じ疾患を治療する、治療用タンパク質などの第３の外因性ポリペプチドをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、対象は、抗ＣＤ２０抗体分子、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体分子、抗ＨＥＲ２抗体分子、フィルグラスチムなどのＧ－ＣＳＦ類似体、抗ＥＧＦＲ抗体分子（例えば、セツキシマブ）、例えば、エポエチンなどのエリスロポエチン、または例えば、ＩＦＮβ１ａまたはＩＦＮβ１ｂなどのインターフェロンに対する抗薬物抗体を含んでなる。このような治療方法では、患者は、本明細書に記載の遺伝子操作された赤血球系細胞の投与前、投与中および／または投与後に、例えば、中和抗薬物抗体の存在などの、抗薬物抗体の存在について試験されてもよい。
薬剤相乗的構成
２つ以上の薬剤（例えば、ポリペプチド）が薬剤相乗的である場合、薬剤は、単一経路内の２つ以上の異なる標的に作用する。一実施形態では、２つ以上の薬剤を合わせた作用は、個々の薬剤のいずれかの作用よりも大きい。例えば、第１および第２のポリペプチドは、同一下流標的にシグナル伝達する、細胞受容体のリガンドである。例えば、第１の外因性ポリペプチドは第１の標的細胞受容体のリガンドを含み、第２の外因性ポリペプチドは第２の標的細胞受容体のリガンドを含み、例えば、その第１および第２の標的細胞受容体は、同一下流標的にシグナル伝達する。いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは第１の標的に作用し、同時に第２の外因性ポリペプチドは第２の標的に作用し、例えば、第１の外因性ポリペプチドの第１の標的への結合と、第２の外因性ポリペプチドの第２の標的への結合には、いくらかの一時的な重複がある。いくつかの実施形態では、同時作用は、どちらかの標的が単独作用するまたは隔離されている場合に予期されるよりも大きな規模の相乗的応答を生じる。
一実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、アポトーシスを媒介する第１の細胞受容体および第２の細胞受容体のリガンドである。一実施形態では、薬剤は、例えば、野生型または変異型ＴＲＡＩＬポリペプチド、またはＴＲＡＩＬ受容体に結合して、例えば、がん細胞などの標的細胞でアポトーシスを誘導する抗体分子などの２つ以上のＴＲＡＩＬ受容体リガンドを含んでなる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体リガンドを含んでなる除核ＲＢＣが使用されて、ＮＳＣＬＣが治療される。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体リガンドを含むＲＢＣは、例えば、本明細書に記載の標的化部分などの標的化部分をさらに含む。一実施形態では、第１の標的および第２の標的は、例えば、基質タンパク質などの同一基質と相互作用する。一実施形態では、第１の標的および第２の標的は、異なる基質と相互作用する。
ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）は、アポトーシスを誘導するＴＮＦファミリーのメンバーである。ＴＲＡＩＬは、ＴＲＡＩＬ Ｒ１およびＴＲＡＩＬ Ｒ２の少なくとも２つの受容体を有する。ＴＲＡＩＬ受容体作動薬、例えば、受容体の１つまたは複数に結合するＴＲＡＩＬの変異体、またはＴＲＡＩＬＲ１またはＴＲＡＩＬＲ２の片方または双方に結合する抗体分子（例えば、Ｇａｓｐａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ２００９ Ｊｕｎ １４（６）、Ｂｕｃｈｓｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ ２００７ Ａｕｇ３（４）を参照されたい）は、広範ながんの臨床療法として開発されている。ＴＲＡＩＬ受容体作動薬の臨床試験は、いくつかの理由の中でも特に、多くの原発性がんが単一の受容体を通じたシグナル伝達に感受性ではなく、むしろ双方の受容体が細胞毒性を誘発する必要があるという事実のために失敗した（Ｍａｒｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１３）４，ｅ８６３）。一実施形態では、遺伝子操作された血液細胞上に発現される薬剤は、組み合わせでＴＲＡＩＬ受容体に双方のＴＲＡＩＬ受容体を同時に作用させる単一受容体特異的ＴＲＡＩＬ作動薬であり、したがって標的がん細胞のアポトーシスの相乗的誘導をもたらす。したがって、いくつかの実施形態では、除核赤血球（例えば、網状赤血球）は、その表面に、ＴＲＡＩＬ Ｒ１に結合する第１のポリペプチドとＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合する第２のポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチドは、ＴＲＡＩＬ Ｒ１またはＴＲＡＩＬ Ｒ２に対して、その他の受容体のＫｄよりも２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、または５００倍強力なＫｄを有する。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、ＴＲＡＩＬ Ｒ１特異的リガンドおよびＴＲＡＩＬ Ｒ２特異的リガンドを含む除核赤血球は、ほぼ同じ親和性でＴＲＡＩＬ Ｒ１およびＴＲＡＩＬ Ｒ２に結合するリガンドを含む除核赤血球よりも、より良好なＴＲＡＩＬ Ｒ１およびＴＲＡＩＬ Ｒ２のヘテロ二量体化を促進する。
いくつかの実施形態では、１つ、２つ、またはそれ以上の外因性ポリペプチドは、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、細胞死受容体ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）の片方または双方に結合する。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ／ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ／ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ／ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ／ＴＲＡＩＬＲ４、またはＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ／ＯＰＧの１つまたは複数に結合する。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、ＭＡＰＫ８／ＪＮＫ、カスパーゼ８、およびカスパーゼ３の１つまたは複数を活性化する。
いくつかの実施形態では、ＴＲＡＩＬポリペプチドは、本明細書の配列番号１～５のいずれかの配列、またはそれに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を有するＴＲＡＩＬ作動薬である。配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ（基本的局所アライメント検索ツールツール）によって測定される。配列番号１～５は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｍｏｈｒ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣＣａｎｃｅｒ（２０１５）１５：４９４）にさらに記載される。
配列番号：１
可溶性ＴＲＡＩＬ変異型ＤＲ４－１
Figure 0007093302000007
 配列番号２
可溶性ＴＲＡＩＬ変異型ＤＲ４－２
Figure 0007093302000008
 配列番号３
可溶性ＴＲＡＩＬ変異型ＤＲ４－３
Figure 0007093302000009
 配列番号４
可溶性ＴＲＡＩＬ変異型ＤＲ５－１
Figure 0007093302000010
 配列番号５
可溶性ＴＲＡＩＬ変異型ＤＲ５－２
Figure 0007093302000011
ＴＲＡＩＬ受容体リガンドの全ての組み合わせが想定される。いくつかの実施形態では、第１および第２の薬剤は、配列番号１および配列番号２；配列番号１および配列番号３；配列番号１および配列番号４；配列番号１および配列番号５；配列番号２および配列番号３；配列番号２および配列番号４；配列番号２および配列番号５；配列番号３および配列番号４；配列番号３および配列番号５；または配列番号４および配列番号５、または前述のいずれかの断片もしくは変異型を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体リガンドは、抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、抗体分子は、ＴＲＡＩＬ Ｒ１およびＴＲＡＩＬ Ｒ２の片方または双方を認識する。抗体分子は、例えば、マパツムマブ（ヒト抗ＤＲ４ ｍＡｂ）、チガツズマブ（ヒト化抗ＤＲ５ ｍＡｂ）、レキサツムマブ（ヒト抗ＤＲ５ ｍＡｂ）、コナツムマブ（ヒト抗ＤＲ５ ｍＡｂ）、またはアポマブ（ヒト抗ＤＲ５ ｍＡｂ）であってもよい。いくつかの実施形態では、除核赤血球（例えば、網状赤血球）は、ＴＲＡＩＬ受容体に結合する、２つ以上（例えば、３、４、５またはそれ以上）の異なる抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、除核赤血球（例えば、網状赤血球）は、ＴＲＡＩＬ受容体と少なくとも１つのＴＲＡＩＬポリペプチドとに結合する、少なくとも１つの抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、薬剤は、例えば、同時に、経路の上流および下流段階を標的化することで、薬剤相乗的に作用する、多段階合成経路の修飾因子である。
乗法的構成
２つ以上の薬剤（例えば、ポリペプチド）が乗法的である場合、第１の薬剤は第１の経路の一部である第１の分子に作用し、第２の薬剤は第２の経路の一部である第２の分子に作用し、それらの経路は所望の応答に向けて協力して作用する。
いくつかの実施形態では、所望の応答は、例えば、がん細胞などの細胞死である。理論による拘束は望まないが、がん治療において、例えば、腫瘍または腫瘍微小環境のために、アネルギー性でありまたは別の様式で非機能性である、内因性または外因性の抗腫瘍Ｔ細胞を活性化することは有益であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、複数のＴ細胞活性化経路を始動させ、抗がん免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された赤血球系細胞は、Ｔ細胞増殖を促進する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数（例えば、２、３、４、または５またはそれ以上）のＴ細胞活性化リガンドは、表２のリガンドまたはそのＴ細胞活性化変異型（例えば、断片）を含んでなる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数（例えば、２、３、４、または５またはそれ以上）のＴ細胞活性化リガンドは、表２の標的受容体またはそのＴ細胞活性化変異型（例えば、断片）に結合する、抗体分子を含んでなる。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、例えば、ＣＤ８０、４１ＢＢ－リガンド、ＣＤ８６、またはそれらの任意の組み合わせなどの異なるＴ細胞活性化リガンドを含んでなり、Ｔ細胞を刺激して免疫腫瘍学の設定においてアネルギーを克服する。いくつかの実施形態では、除核赤血球（例えば、網状赤血球）は、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、およびＣＤ４０Ｌ、またはその断片もしくは変異型を含んでなる。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質は、相補的活性化経路を通じてシグナル伝達する。いくつかの実施形態では、リガンドは、活性化サイトカイン、インターフェロン、または例えば、ＩＦＮａ、ＩＬ２、またはＩＬ６などのＴＮＦファミリーメンバー（例えば、表１の）、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、薬剤は、上記クラスの分子の組み合わせである。薬剤は、標的受容体に対する内因性リガンドまたは抗体分子に由来し得る。
Figure 0007093302000012
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ６またはＴＮＦａ抗体分子は、本明細書の配列番号６または７のどちらかの配列、またはそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
配列番号６
抗ＩＬ６ ｓｃＦｖ
Figure 0007093302000013
 配列番号７
抗ＴＮＦα ｓｃＦｖ
Figure 0007093302000014
別の例として、第１および第２のポリペプチドは、Ｔ細胞活性化リガンドと、免疫腫瘍学の設定において、例えば、ＣＤ８０および抗ＰＤ１などの免疫阻害分子（例えば、免疫阻害受容体）を阻害する薬剤とを含んでなる。別の実施形態では、１つの薬剤は、活性化４－１ＢＢＬ、またはその断片もしくは変異型であり、第２の薬剤は、ＰＤ１シグナル伝達を遮断する抗体分子（例えば、ＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１に対する抗体分子）である。したがって、いくつかの実施形態では、標的Ｔ細胞は、活性化され、また阻害も防止される。免疫阻害分子を阻害する薬剤の例としては、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦβ、またはその機能的変異型（例えば、断片）の阻害剤（例えば、それに結合する抗体分子）が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫阻害分子を阻害する薬剤は、表３の阻害性リガンドの阻害剤、またはその阻害性断片もしくは変異型である。いくつかの実施形態では、免疫阻害分子を阻害する薬剤は、表３の標的受容体またはその断片もしくは変異型に結合する、抗体分子である。
Figure 0007093302000015
いくつかの実施形態では、がんを治療するための薬剤の１つは、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、または表１の別の活性化サイトカイン、またはその断片もしくは変異型などの活性化サイトカインを含んでなる。
いくつかの実施形態では、目的は、Ｔ細胞を活性化または阻害することである。本明細書に記載の活性化レセプターまたは阻害レセプターのどちらかを発現してもよいその他の免疫細胞よりも優先的に、Ｔ細胞が標的化されることを確実にするために、赤血球（例えば、網状赤血球）上の薬剤の１つは、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または別のＴ細胞マーカーに結合する抗体分子などの標的化部分を含み得る。標的化部分は、本明細書の「局在化構成」と題されたセクションでより詳細に記載される。いくつかの実施形態では、特異的Ｔ細胞サブタイプまたはクローンは増強されてもよく（抗腫瘍特異性を有するＴ細胞）、または阻害されてもよい。いくつかの実施形態では、赤血球（例えば、網状赤血球）上の１つまたは複数の薬剤は、抗原特異的様式でＴ細胞受容体に選択的に結合するペプチド－ＭＨＣ分子である。
いくつかの実施形態では、複数の薬剤は、例えば、腫瘍細胞などの複合標的に由来する複数の抗原を含んでなり、それに対して、複数の特異性を有する複雑な免疫応答を起こすことが望ましい。
いくつかの実施形態では、第１および第２の外因性ポリペプチドは、いくつかの実施形態では、抗原および共刺激分子を含んでなり、例えば、赤血球系細胞はＡＰＣとして、例えば、がんワクチン接種のために機能し得る。
いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドを含む除核赤血球（例えば、網状赤血球）は、第１の標的および第２の標的を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、第１の標的に作用し（例えば、結合し）、第２の外因性ポリペプチドは第２の標的に作用する。任意選択的に、除核赤血球は第３の外因性ポリペプチドを含み、患者は第３の標的を含む。いくつかの実施形態では、第３の外因性ポリペプチドは、第３の標的に作用する。
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、第１の経路における第１の標的の作動薬または拮抗薬である第１の外因性ポリペプチドを含み、第２の経路における第２の標的の作動薬または拮抗薬である第２の外因性ポリペプチドをさらに含み、第１および第２の経路は、所望の応答に向けて協調して作用する。第１および第２の外因性ポリペプチドは、どちらも作動薬であり得て；どちらも拮抗薬であり得て；または１つは作動薬であり得てもう１つは拮抗薬であり得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリペプチドは、免疫チェックポイント作動薬または拮抗薬である。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、標的化剤をさらに含む。
独立機能構成
２つ以上の薬剤（例えば、ポリペプチド）が独立機能関係を有する場合、薬剤は２つの異なる（例えば、相補的な）機能を有する。例えば、第１の薬剤は第１の標的に結合し、第２の薬剤は第２の標的に結合する。患者は、第１または第２の標的を欠いていてもよい。任意選択的に、第１および第２の薬剤は異なる経路にある。
敗血症、腫瘍溶解症候群、およびサイトカインストームによって特徴付けられるその他の状態では、障害は炎症性サイトカインの多様な混合物によって駆動される。１つのサイトカインに対する既存の単独療法は、これらの急性状態を治療するにはしばしば不十分である。さらに、サイトカインストームの駆動機構を測定して、間に合うように臨床的障害を予防することは、時には不可能であり得る。一実施形態では、第１および第２のペプチドは、２つの異なるサイトカインに結合する分子（例えば、抗体分子）である。いくつかの実施形態では、薬剤は異なるサイトカインに結合して中和し、したがって遺伝子操作された赤血球製品は、サイトカインストームからの多面的な保護を提供する。
いくつかの実施形態では、サイトカインは、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ０２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、またはＩＬ－３６などのインターロイキンを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、表１のサイトカインまたはその断片もしくは変異型である。いくつかの実施形態では、第１のサイトカインはＴＮＦａであり、第２のサイトカインは例えば、ＩＬ－６などのインターロイキン、または前述のいずれかの断片もしくは変異型である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＴＮＦａ、抗ＩＬ－６、または抗ＩＦＮｇ抗体分子、またはそれらの任意の組み合わせ、前述のいずれかの断片もしくは変異型を含む。
いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドを含む除核赤血球（例えば、網状赤血球）は、第１の標的を有するが第２の標的を有しない対象に投与され、または患者は第１の標的または第２の標的を有しないと思われている。いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは第１の標的に作用（例えば、結合）し、第２の外因性ポリペプチドは実質的に結合しないままである。任意選択的に、除核赤血球は第３の外因性ポリペプチドを含み、患者は第３の標的を欠き、または第３の標的を有しないと思われている。いくつかの実施形態では、除核赤血球は複数の外因性ポリペプチドを含み、患者は複数の外因性ポリペプチドの１つまたはサブセットの標的を有せず、または有しないと思われている。
独立機能構成の例は、図４に示される。図４の赤血球系細胞は、第１の外因性ポリペプチド（白色）、第２の外因性ポリペプチド（網掛け）、および任意選択の第３の外因性ポリペプチド（クロスハッチング（ｃｌｏｓｅ ｈａｔｃｈｉｎｇ））を含む。第１の外因性ポリペプチドは、例えば、サイトカインＡなどの第１の標的に結合し得て、第２の外因性ポリペプチドは、例えば、サイトカインＢなどの第２の標的に独立して結合する。この遺伝子操作された赤血球系細胞は、双方のサイトカインが対象に存在する場合、どちらも補足して除去する。サイトカインの１つのみが対象に存在する場合、遺伝子操作された赤血球系細胞は、そのサイトカインを除去し得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数（例えば、２つまたは全部）の外因性ポリペプチドは、例えば、ｓｃＦｖなどの抗体分子を含み、任意選択的に、膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的は、複数のサイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせを含む。
局在化構成
２つ以上の薬剤（例えば、ポリペプチド）が局在化関係を有する場合、第１の薬剤は、作用部位に局在化していない場合のそれらの活性と比較して、第２のまたはその他の薬剤または薬剤群の活性を増強する作用部位に、ＲＢＣを局在化させる（例えば、第１の薬剤のその標的への結合によって、その標的の領域における第２の薬剤の局所濃度の増加がある）。いくつかの実施形態では、１つの薬剤は、赤血球（例えば、網状赤血球）を作用部位に標的化する役割を果たし、１つまたは複数の薬剤は治療効果を有する。一実施形態では、第１の薬剤の結合は、例えば、ポリペプチドなど、第２の薬剤によって結合された実体の活性を増加させる。一実施形態では、第１の薬剤は、例えば、第２の薬剤によって結合されたポリペプチドなどの実体の基質または生成物に結合する。ＲＢＣを局在化させる薬剤は、例えば、標的細胞上の受容体に対するリガンドであっても、または標的細胞上の細胞表面分子に結合する抗体であってもよい。
図９に示されるように、細胞は、１つまたは複数の標的化剤を含み得る。標的化剤は、外因性ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、２つの標的化剤を含んでなる赤血球系細胞は、標的化剤の１つのみを含んでなるその他の点では類似した赤血球系細胞と比較して、その標的に結合する赤血球系細胞の特異性および／または親和性および／または結合活性を増加させてもよい。赤血球系細胞は、任意選択的に、例えば、抗がん活性などの治療活性を有する、外因性ポリペプチドをさらに含んでなる。治療活性を有する外因性ポリペプチドは、酵素、捕捉試薬、作動薬、または拮抗薬を含んでなり得る。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、受容体またはその断片もしくは変異型を含んでなる。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ｓｃＦｖなどの抗体分子を含んでなる。
別の例として、標的化剤は、例えば、固形腫瘍細胞などのがん細胞にまたはその近くに結合し、第２の薬剤（例えば、第２のポリペプチド）は抗がん機能を有する。いくつかの実施形態では、作用部位は腫瘍血管系である。いくつかの実施形態では、標的化剤は、血管新生マーカーに結合し、例えば、ａｖＢ１、ａｖＢ３、またはａｖＢ５、またはａ４ｂ１インテグリンなどのインテグリン、例えば、合成ペプチドノッチン（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，ＪＡＣＳ ２０１６，１３７（１））、または例えば、エキスタチン、ＲＧＤ、ＥＥＴＩ２．５Ｆ、またはＶＣＡＭ－１などの内因性または天然リガンドに結合し、または血管新生に際しても豊富に見られる前立腺特異的膜抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的化剤は、（例えば、多発性骨髄腫細胞において発現される）ＣＤ２６９、または（例えば、ＡＬＭ細胞において発現される）ＣＤ１２３、（例えば、Ｔ細胞において発現され；ＣＤ８０／ＣＤ８６によって結合され得る）ＣＤ２８、（例えば、卵巣がんにおいて発現される）ＮＹ－ＥＳＯ－１などのがん細胞マーカーに結合する。
治療剤は、例えば、いくつかのストラテジーがある、抗がん効果を有してもよい。例えば、治療剤は、例えば、腫瘍細胞によって増殖のために選択的に要求される代謝産物を分解する、アスパラギナーゼ、メチオニンγリアーゼ（ＭＧＬ）、セリンデヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｒｏｄｇｅｎａｓｅ）、またはその断片もしくは変異型などの酵素であってもよい。治療剤は、例えば、血管増殖を防止するためのアンギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｔｉｎ）の阻害剤、またはＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲの阻害剤などの血管新生の阻害剤であってもよい。治療剤は、サイトカインまたはＴ細胞活性化リガンド（例えば、表１および表２を参照されたい）のどちらかの、Ｔ細胞を活性化するための免疫刺激分子であってもよい。治療剤は、例えば、Ｔ細胞または炎症性マクロファージなどの免疫エフェクター細胞に結合し、エフェクター細胞を捕捉して腫瘍の近傍に持ち込んでもよい。治療剤は、例えば、ＴＲＡＩＬまたはＦＡＳ－Ｌまたは他のデスリガンド、または毒素などの細胞死の直接的なメディエーターであり得る。いくつかの実施形態では、治療剤は、例えば、作動性抗体分子などのＴＲＡＩＬ受容体の作動薬を含んでなる。いくつかの実施形態では、治療剤はアポトーシス促進剤である。いくつかの実施形態では、治療剤はアジュバントを含んでなる。これらの治療剤のいずれについても、最終結果は、腫瘍部位に局在する赤血球治療剤であり、したがってその抗腫瘍効果をその効能を高める場所に集中させる。
いくつかの実施形態では、例えば、Ｂ細胞がんを治療するために、第１の外因性ポリペプチドは、細胞をがん細胞に標的化し得る、表面露出抗ＣＤ２０抗体分子を含んでなり、第２の外因性ポリペプチドは、がん細胞を阻害（例えば、殺滅）し得る、表面露出抗ＣＤ４０抗体分子を含んでなる。赤血球系細胞は、例えば、図８に示される、抗ＣＤ４０抗体分子の阻害剤をさらに含んでなり得る。
第１の外因性ポリペプチドは標的化剤を含んでなり得て、第２の外因性ポリペプチドは酵素を含んでなり得る（例えば、図１１）。例えば、がんの治療などのいくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、がん細胞に結合する標的化剤を含んでなる第１のポリペプチドと、がん細胞を阻害する（例えば、殺滅し、アネルギーを誘発し、増殖を阻害する）第２のポリペプチドとを含んでなる。例えば、標的化剤は、例えば、がん性Ｔ細胞などのＴ細胞表面のＣＤ４に結合する、抗ＣＤ４抗体を含んでなり得る。第２のポリペプチドは、表面に露出し得るまたは細胞内にあり得る酵素を含んでなり得て、例えば、酵素は細胞内であり膜結合性でない。酵素は、トリプトファンを枯渇させて、がん性Ｔ細胞またはＡＤＡまたはその断片もしくは変異型にアネルギーを誘発し得る、ＩＤＯまたはその断片もしくは変異型であってもよい。酵素は、プロテアーゼであってもよい。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、例えば、ヘルパーＴ細胞などのＴ細胞などの免疫細胞および／または疾患細胞である。標的化剤は、例えば、ｓｃＦｖなどの抗体分子を含んでもよい。
第１の外因性ポリペプチドは標的化剤を含んでなり得て、第２の外因性ポリペプチドは標的の作動薬を含んでなり得る（例えば、図１２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、標的化剤は、受容体またはその断片もしくは変異型、抗体分子、リガンドまたはその断片もしくは変異型、サイトカインまたはその断片もしくは変異型を含んでなる。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、アテニュエーター、アクチベーター、細胞殺傷剤、または細胞毒性分子（例えば、小分子、タンパク質、例えば、アンチセンスＲＮＡなどのＲＮＡ、またはＴＬＲリガンド）を含んでなる。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは細胞内であり例えば、膜結合性でなく、いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは表面に露出している。
赤血球系細胞は、標的化剤および捕捉剤を含んでなり得る（例えば、図１３）。例えば、第１の外因性ポリペプチドは、例えば、抗ＢＣＭＡ抗体分子などの形質細胞に結合する標的化剤を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、標的が内因性受容体と相互作用するのを妨げるように、例えば、受容体結合部位と重なる部分で標的に結合するように標的に結合する。いくつかの実施形態では、標的化部分は、疾患部位で受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化剤は、リガンドまたはサイトカインまたはその断片もしくは変異型、または例えば、ｓｃＦｖなどの抗体分子を含んでなる。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、受容体またはその断片もしくは変異型、または例えば、ｓｃＦｖなどの抗体分子を含んでなる。いくつかの実施形態では、リガンドは、望まれないサイトカインまたはケモカインである。
標的化剤は、赤血球系細胞を細胞の特定のサブタイプに誘導し得る。細胞は、例えば、細胞死を軽減、活性化または誘導し得るなど、標的細胞内の所与の活性または経路を促進する、第２の外因性ポリペプチドをさらに含んでなり得る。例えば、図１４は、標的細胞に結合し得る第１の外因性ポリペプチドを含んでなる、赤血球系細胞を描写する。赤血球系細胞は、がん細胞を阻害する（例えば、殺滅し、または増殖を阻害する）、第２の外因性ポリペプチドをさらに含んでなり得る。例えば、第２の外因性ポリペプチドは、例えば、アポトーシス促進剤、例えば、がん細胞にアポトーシスを誘発するＴＲＡＩＬポリペプチドなどの細胞殺傷剤を含んでなり得る。赤血球系細胞は、表面に露出したまたは細胞内にある、標的化剤およびアテニュエーターまたはアクチベーターを含んでいてもよい。例えば、細胞は、標的化剤と、ＩＤＯまたはＡＤＡまたはその断片もしくは変異型などの酵素とを含んでなり得る。
近接性ベースの構成
２つ以上の薬剤（例えば、ポリペプチド）が近接性ベースの関係を有する場合、２つの薬剤はより強く機能し、例えば、それらが物理的に分離している場合よりも互いに近接している場合に、より顕著な効果を発揮する。いくつかの実施形態では、２つの薬剤は、それらが互いに直接結合している場合、それらが複合体の一部である場合（例えば、第３の因子によって連結される場合）、それらが同一細胞膜上に存在する場合、またはそれらが細胞膜の同一サブセクション上に存在する場合（例えば、脂質ラフト内、脂質ラフトの外側、または細胞骨格構成要素などの細胞内構造に直接的または間接的に結合する場合）に、近接している。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは第１の標的分子に結合し、第２のポリペプチドは第２の標的分子に結合し、この結合は、第１の標的分子および第２の標的分子を互いにより近く移動させ、例えば、互いに結合させる。いくつかの実施形態では、第１および第２の標的分子は、標的細胞上の細胞表面受容体である。
近接性ベースの構成の一例は、図４に示される。図４の赤血球系細胞は、任意選択の第１の外因性ポリペプチド（白色）、第２の外因性ポリペプチド（薄いグレー）、および第３の外因性ポリペプチド（濃いグレー）を含む。第２および第３の外因性ポリペプチドは、例えば、サイトカインＢなどの標的の同一ポリペプチド鎖内の異なるエピトープに結合する。赤血球上に載った第２および第３の外因性ポリペプチドは、第２および第３の外因性ポリペプチドが遊離ポリペプチドである場合よりも、高い結合活性で標的に結合する。例として、２つ以上の外因性ポリペプチドは、同一標的上の異なる部位に結合し得て、標的はサイトカイン、酵素、または抗体である。
スキャフォールド構成
２つ以上の薬剤（例えば、ポリペプチド）が骨格関係を有する場合、薬剤は２つ以上の標的を一緒にして、標的が互いに相互作用する可能性を高める。一実施形態では、第１および第２の薬剤は、ＲＢＣの表面で互いに結合する（スキャフォールドを形成する）、例えば、２つの複合ポリペプチドである。一実施形態では、赤血球（例えば、網状赤血球）は、例えば、表１、表２、および表３のいずれかなどの本明細書に記載の１つまたは複数（例えば、２つ）のタンパク質を認識する抗体分子などの、二重特異性抗体分子を含む。
標的は、例えば、タンパク質、細胞、小分子、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。一実施形態では、第１および第２の標的はタンパク質である。一実施形態では、第１および第２の標的は細胞である。
別の例として、ＲＢＣは、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）とがん細胞を互いに近傍に持ち込んで、免疫エフェクター細胞によるがん細胞の殺滅を促進する。したがって、いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドはがん細胞の細胞表面マーカーに結合し、第２のポリペプチドは免疫エフェクター細胞の細胞表面マーカーに結合する。第１および第２のポリペプチドは、例えば、抗体分子を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、がん細胞マーカーは、ＣＤ１９（例えば、Ｂ細胞急性白血病において発現される）、ＥｐＣＡＭ（例えば、ＣＴＣにおいて発現される）、ＣＤ２０（例えば、Ｂ細胞急性白血病において発現される）、ＣＤ４５（例えば、ＣＴＣにおいて発現される）、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（例えば、乳がん細胞において発現される）から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞マーカーはＣＤ３である。
いくつかの実施形態では、ＲＢＣは、免疫エフェクター細胞を別の免疫細胞の近傍に持ち込んで、例えば、がんワクチンのために、例えば、抗原提示を促進する（例えば、１つの細胞が抗原提示細胞であり、もう１つの細胞がＴ細胞である場合）。
いくつかの実施形態では、ＲＢＣは、第１の抗体分子ドメインおよび第２の抗体分子ドメインを含む外因性融合ポリペプチドを発現し、外因性ポリペプチドは、二重特異性抗体として機能し、例えば、第１の抗体分子ドメインは、第１の細胞上の第１の標的に結合し、第２の抗体分子ドメインは、例えば、異なる細胞型などの第２の細胞上の第２の標的に結合する。
多量体構成
２つ以上の薬剤（例えば、ポリペプチド）が多量体構成を有する場合、薬剤は、互いに組み合わさって、例えば、互いに結合して、標的上で機能または活性を有する複合体を形成する。一実施形態では、薬剤は、例えば、ＭＨＣＩなどの細胞表面複合体のサブユニットであり、機能はペプチドに結合することである。一実施形態では、薬剤はＭＨＣＩＩのサブユニットであり、機能はペプチドに結合することである。一実施形態では、薬剤は、例えば、ＭＨＣＩなどの細胞表面分子のサブユニット、および例えば、ＭＨＣＩ分子上に負荷されたペプチドなどのペプチドであり、機能はペプチドを提示することである。一実施形態では、薬剤は、ＭＨＣＩＩのサブユニット、例えば、ＭＨＣＩＩ分子に負荷されたペプチドなどのペプチドであり、機能はペプチドを提示することである。一実施形態では、複合体は機能的ＭＨＣＩであり、薬剤はＭＨＣＩ（α鎖１～３）およびβ－２ミクログロブリン、またはその断片もしくは変異型である。一実施形態では、複合体はＭＨＣＩＩであり、薬剤はＭＨＣＩＩα鎖およびＭＨＣＩＩβ鎖、またはその断片もしくは変異型である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、例えば、ＭＨＣＩＩαサブユニットおよびＭＨＣＩＩβサブユニット、または双方のサブユニットを含む融合分子またはその抗原提示断片などの、ヒトＭＨＣクラスＩまたはＩＩを含む。これらの２つのポリペプチドを有するＲＢＣは、いくつかの実施形態では、免疫誘導または抗原提示のために使用される。いくつかの実施形態では、ＲＢＣは、例えば、一本鎖ペプチド－ＭＨＣコンストラクトなどのＭＨＣ分子と抗原との間の融合物である、単一のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、例えば、ペプチドまたはβ－２ミクログロブリンなどの複合体の非膜係留構要素は、表面への輸送に先だって、細胞内の別の薬剤と共にアセンブルされ、細胞によって分泌され、次に、多量体の膜係留構成要素によって表面で捕捉されるか、または精製形態で遺伝子操作された赤血球に添加される。
抗原は、いくつかの実施形態では、例えば、がんワクチンなどのがん抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、または３５アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、複合体は、異なるポリペプチド鎖に由来する複数のサブドメインを含み、複合体が活性であるためには、その全てが発現されなくてはならない。
代償性構成
２つ以上の薬剤（例えば、ポリペプチド）が代償性関係を有する場合、第１の薬剤は、第２の薬剤の望ましくない特性を低下させる。例えば、いくつかの実施形態では、第２の薬剤は所与のレベルの免疫原性を有し、第１の薬剤は、例えば、免疫細胞に負にシグナル伝達することによって（表３を参照されたい）、または第２の薬剤の抗原性エピトープを遮蔽することによって、免疫原性を低下させる。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は所定の半減期を有し、第１の薬剤は第２の薬剤の半減期を延長する。例えば、第１の薬剤は、シャペロンまたはその断片もしくは変異型を含み得る。
除核赤血球系細胞は、治療用タンパク質およびその阻害剤を同時発現し得る（例えば、図８）。阻害剤は、体内の所望の位置で放出されて（例えば、治療薬への結合を止めるが細胞表面に残留する）、治療タンパク質を活性化し得る。
例えば、いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、治療活性を有する第１の外因性ポリペプチド（例えば、抗ＣＤ４０抗体分子）と、第１の外因性ポリペプチドを阻害する第２の外因性ポリペプチド（例えば、ＣＤ４０またはその断片もしくは変異型）とを含む。第２のポリペプチド（例えば、ＣＤ４０）は、赤血球系細胞が、例えば、がん細胞などの所望の位置にあるまで、例えば、オフターゲット効果を制限するまで、第１の外因性ポリペプチド（例えば、抗ＣＤ４０またはその変異型）の活性を阻害してもよい。第２の外因性ポリペプチド（例えば、ＴＮＦα）は、第１の外因性ポリペプチド（例えば、抗ＴＮＦα）が結合する、標的の変異型（例えば、内因性ＣＤ４０）を含み得る。例えば、変異型は、標的の存在下で競合する弱結合性変異型であり得る。いくつかの実施形態では、第１の外因性ポリペプチドの第２の外因性ポリペプチドに対するＫｄは、第１の外因性ポリペプチドのその標的に対するＫｄよりも少なくとも２、３、５、１０、２０、５０、または１００倍高い。赤血球系細胞は、任意選択的に、標的化剤、例えば、抗ＣＤ２０抗体分子を含む第３の外因性ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、対象の所望の部位で薬物（例えば、インスリン）になるプロドラッグ（例えば、プロインスリン）を含む。
３つ以上の薬剤（例えば、ポリペプチド）を含む除核赤血球
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球（例えば、網状赤血球）は、例えば、少なくとも４、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００などの３つまたはそれ以上の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球集団は、例えば、少なくとも４、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、または５０００などの３つまたはそれ以上の薬剤を含み、例えば、集団中の異なるＲＢＣは異なる薬剤を含み、または集団中の異なるＲＢは異なる複数の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、ＲＢＣ中のまたはＲＢＣ集団中の２つ以上の（例えば、全部の）薬剤は、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性活性を有する。
いくつかの実施形態では、ＲＢＣは、ＲＢＣ前駆細胞を、薬剤をコードする複数のｍＲＮＡに接触させることによって産生される。
真核生物提示スクリーニング。一実施形態では、例えば、生体外または生体内結合アッセイにおける使用のために、コンビナトリアルな高多様性の細胞プールが作製される。細胞表面タンパク質をコードするコンビナトリアルな高多様性の核酸ライブラリーが、作製され得る。このようなライブラリーは、例えば、完全に可変性の配列からなるか、または高度に可変性のコンビナトリアル配列に融合された固定配列を含み得る。これらは、電気穿孔、形質移入またはウイルス形質導入などの方法を用いて、混合物としてまたは個別に、赤血球前駆細胞に導入され得る。一実施形態では、引き続いて、所望の成熟度まで細胞を分化培地中で増殖させる。一実施形態では、細胞は、高度に多重化された生体外アッセイのために使用される。細胞は、マイクロタイタープレート内で、生物学的サンプルと共にインキュベートされる。ウェルは、所望のレベルのストリンジェンシーで、細胞適合性緩衝液を用いて洗浄される。残留する細胞が単離され、特異的配列の濃縮について分析される。一実施形態では、分析は、例えば、質量分析を用いてタンパク質レベルで実施され、結合された集団において富化されたアミノ酸モチーフが同定される。一実施形態では、分析が核酸レベル（ＲＮＡまたはＤＮＡ）で実施され、結合集団が豊富な対応するアミノ酸モチーフを同定する核酸配列が同定される。一実施形態では、高多様性細胞集団が（健常または病的のどちらかの）動物モデルに注射される。一実施形態では、細胞は蛍光標識されて、生体内での分布または局在が視覚化される。次に、動物の様々な組織が採取され、対応するアミノ酸モチーフを同定する特定のアミノ酸モチーフまたは核酸配列の相対的な富化について分析され得る。
発現最適化。多数の変異型は、個々の細胞に同時に形質移入され、それらの相対的転写または翻訳能力が評価され得る。いくつかの実施形態では。タンパク質コード配列のライブラリーは、多様な５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、コドン表現、アミノ酸変化、およびその他の配列の相違をもって、設計および合成される。これのライブラリーは、電気穿孔、形質移入またはウイルス形質導入などの方法を用いて、混合物としてまたは個別に、赤血球前駆細胞に導入される。一実施形態では、引き続いて、所望の成熟度まで細胞を分化培地中で増殖させる。
除核赤血球の物理的特性
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＢＣ（例えば、網状赤血球）は、例えば、浸透圧脆弱性、細胞サイズ、ヘモグロビン濃度またはホスファチジルセリン含有量などの、本明細書に記載の１つまたは複数（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の物理的特徴を有する。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、外因性タンパク質を発現する除核ＲＢＣは、野生型の未処理ＲＢＣに似た物理的特性を有する。対照的に、低浸透圧性に負荷されたＲＢＣは、時には、浸透圧の脆弱性の増加、細胞サイズの変化、ヘモグロビン濃度の減少、または細胞膜の細胞表面側の単分子上のホスファチジルセリンレベルの増加などの異常な物理的特徴を示す。
いくつかの実施形態では、除核ＲＢＣは、細胞によって保持されないか、精製されていないか、またはＲＢＣの外部に完全に存在しなかった、外因性核酸によってコードされる外因性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＲＢＣは、安定剤を欠く組成物中にある。
浸透圧脆弱性
いくつかの実施形態では、除核赤血球は、外因性ポリペプチドを含まない単離された未培養赤血球系細胞と実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を示す。いくつかの実施形態では、除核赤血球の集団は、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％のＮａＣｌで、５０％未満の細胞溶解の浸透圧脆弱性を有する。浸透圧脆弱性は、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットの実施例５９の方法を用いてアッセイされ得る。
細胞サイズ
いくつかの実施形態では、除核ＲＢＣは、ほぼ野生型の未処理のＲＢＣの直径または容積を有する。
いくつかの実施形態では、ＲＢＣ集団は約４、５、６、７、または８ミクロンの平均直径を有し、任意選択的に、集団の標準偏差は１、２、または３ミクロン未満である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＲＢＣは、約４～８、５～７、または約６ミクロンの直径を有する。いくつかの実施形態では、ＲＢＣの直径は、約１ミクロン未満、約２０ミクロンを超える、約１ミクロン～約２０ミクロン、約２ミクロン～約２０ミクロン、約３ミクロン～約２０ミクロン、約４ミクロン～約２０ミクロン、約５ミクロン～約２０ミクロン、約６ミクロン～約２０ミクロン、約５ミクロン～約１５ミクロンまたは約１０ミクロン～約３０ミクロンである。細胞の直径は、いくつかの実施形態では、Ａｄｖｉａ １２０血液検査システムを用いて測定される。
いくつかの実施形態では、ＲＢＣの平均赤血球容積の容積（ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｖｏｌｕｍｅ）は、１０ｆＬ、２０ｆＬ、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬを超え、または１５０ｆＬを超える（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ．．．ｏｒ ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ）。一実施形態では、ＲＢＣの平均赤血球容積は、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬ、１６０ｆＬ、１７０ｆＬ、１８０ｆＬ、１９０ｆＬ、２００ｆＬ未満であり、または２００ｆＬ未満である（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ．．．ｏｒ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ）。一実施形態では、ＲＢＣの平均赤血球容積は、８０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、または４００～５００フェムトリットル（ｆＬ）である。いくつかの実施形態では、ＲＢＣ集団は、本段落に記載される平均赤血球容積を有し、集団の標準偏差は、５０、４０、３０、２０、１０、５、または２ｆＬ未満である。平均赤血球容積は、いくつかの実施形態では、例えば、コールターカウンターなどの血液学的分析装置を用いて測定される。
ヘモグロビン濃度
いくつかの実施形態では、除核ＲＢＣは、野生型未処理ＲＢＣと同様のヘモグロビン含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＲＢＣは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％を超え、または１０％を超える胎児ヘモグロビンを含む。いくつかの実施形態では、ＲＢＣは、少なくとも約２０、２２、２４、２６、２８、または３０ｐｇの、任意選択的に、約３０ｐｇに至る、総ヘモグロビンを含む。ヘモグロビンレベルは、いくつかの実施形態では、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットの実施例３３のドラブキン試薬法を用いて判定される。
ホスファチジルセリン含有量
いくつかの実施形態では、除核ＲＢＣは、その細胞膜の細胞表面側の単分子層上に、野生型の未処理ＲＢＣとほぼ同じホスファチジルセリン含有量を有する。ホスファチジルセリンは、主に、野生型の未処理ＲＢＣの細胞膜の細胞質側の単分子層上にあり、低張負荷は、ホスファチジルセリンを細胞表面側の単分子層に分布させ、免疫応答を始動し得る。いくつかの実施形態では、ＲＢＣの集団は、アネキシンＶ染色について陽性である約３０、２５、２０、１５、１０、９、８、６、５、４、３、２、または１％未満の細胞を含む。ホスファチジルセリン曝露は、いくつかの実施形態では、例えば、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットの実施例５４の方法を用いて、ＰＳに優先的に結合するアネキシン－Ｖ－ＦＩＴＣについて染色し、フローサイトメトリーによってＦＩＴＣ蛍光を測定することで評価される。
その他の特性
いくつかの実施形態では、ＲＢＣの集団は、ＧＰＡに対して陽性である、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％（任意選択的に、９０または１００％に至る）の細胞を含む。ＧＰＡの存在は、いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳを用いて検出される。
いくつかの実施形態では、ＲＢＣは、対象において少なくとも３０、４５、または９０日間の半減期を有する。
いくつかの実施形態では、ＲＢＣを含む細胞の集団は、約１０、５、４、３、２または１％未満の棘状赤血球を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＢＣは除核され、例えば、本明細書に記載の治療製剤として使用されるＲＢＣを含む細胞集団は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％を超えて除核される。いくつかの実施形態では、例えば、ＲＢＣなどの細胞は、例えば、不活性化されている、非機能性核を含有する。
除核赤血球の製造方法
外因性薬剤（例えば、ポリペプチド）を含む（例えば、発現する）除核赤血球（例えば、網状赤血球）の製造方法は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１５３１０２号パンフレットに記載される。
いくつかの実施形態では、例えば、ＣＤ３４＋造血前駆細胞などの造血前駆細胞を、１つまたは複数の外因性ポリペプチドをコードする核酸または核酸群と接触させ、細胞が培養中で増殖して分化できるようにする。
いくつかの実施形態では、２つ以上のポリペプチドが、例えば、単一ベクターなどの単一核酸内でコードされる。いくつかの実施形態では、単一ベクターは各遺伝子のための別個のプロモーターを有して、引き続くタンパク質分解処理により２つのタンパク質が得られるように、中央にプロテアーゼ切断部位を有する単一のポリペプチドに最初に転写される２つのタンパク質を有し、または任意のその他の適切な構成を有する。いくつかの実施形態では、２つ以上のポリペプチドは、２つ以上の核酸でコードされ、例えば、各ベクターは、ポリペプチドの１つをコードする。
核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。例えば、レトロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ１）などのレンチウイルス、および泡沫状ウイルスなどのスプマウイルスをはじめとするいくつかのウイルスが、遺伝子移入ビヒクルとして使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第２０１４／１８３０７１号パンフレットまたは国際公開第２０１４／１８３０６６号パンフレットに記載されるような、Ｓｏｒｔａｇ技術を用いて作製される。
いくつかの実施形態では、ＲＢＣは、少なくとも１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、または１００，０００倍に（任意選択的に、１００，０００、２００，０００、または５００，０００倍に至るまで）増殖される。細胞数は、いくつかの実施形態では、自動細胞計数器を使用して測定される。
いくつかの実施形態では、ＲＢＣ集団は、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９８％の（任意選択的に、約８０、９０、または１００％に至る）除核ＲＢＣを含む。いくつかの実施形態では、ＲＢＣの集団は、１％未満の生存除核細胞を含有し、例えば、検出可能な生存除核細胞を含有しない。核除去は、いくつかの実施形態では、核染色を用いるＦＡＣＳによって測定される。いくつかの実施形態では、集団中の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０％の（任意選択的に、約７０、８０、９０、または１００％に至る）ＲＢＣは、１つまたは複数（例えば、２、３、４またはそれ以上）の外因性ポリペプチドを含む。ポリペプチドの発現は、いくつかの実施形態では、ポリペプチドに対する標識抗体を用いて、ＦＡＣＳによって測定される。いくつかの実施形態では、集団中の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０％の（任意選択的に、約７０、８０、９０、または１００％に至る）ＲＢＣは核除去され、１つまたは複数（例えば、２、３、４またはそれ以上）の外因性ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＢＣ集団は、約１×１０９～２×１０９、２×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～２×１０１０、２×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、１×１０１１～２×１０１１、２×１０１１～５×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～２×１０１２、２×１０１２～５×１０１２、または５×１０１２～１×１０１３個の細胞を含む。
物理的に近接した相乗的薬剤
いくつかの態様では、本開示は、互いに物理的に近接した第１の薬剤および第２の薬剤を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、互いに物理的に近接している場合には相乗的に作用するが、離れている場合には相乗的に作用しない。いくつかの実施形態では、第１および第２の薬剤は、共有結合しており、例えば、融合タンパク質の一部であるか、または一緒に化学的に共役している。いくつかの実施形態では、第１および第２の薬剤は非共有結合的に連結し、例えば、互いに直接結合し、またはスキャフォールドに結合している。いくつかの実施形態では、第１および第２の薬剤は、ナノ粒子（例えば、１～１００、１００～２，５００、または２，５００～１０，０００ｎｍの直径）リポソーム、小胞、ビーズ、ポリマー、移植片、またはポリペプチド複合体の一部である（例えば、連結している）。
いくつかの実施形態では、組成物は、互いに物理的に近接している（例えば、共有結合的にまたは非共有結合的に連結する）、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なる薬剤を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載される１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）の薬剤、例えば、本明細書に記載の外因性ポリペプチド、例えば、表１、表２、または表３のいずれかのポリペプチド、またはその断片もしくは変異型、またはそれに対する抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数（例えば、２、３、またはそれ以上）の外因性ポリペプチドは、サイトカイン、インターロイキン、サイトカイン受容体、Ｆｃ結合分子、Ｔ細胞活性化リガンド、Ｔ細胞受容体、免疫阻害分子、共刺激分子、ＭＨＣ分子、ＡＰＣ結合分子、毒素、標的化剤、抗がん剤、がん細胞マーカー、がん細胞マーカー結合薬剤、またはＴＲＡＩＬ受容体リガンドを含んでなる。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数（例えば、２、３、またはそれ以上）の外因性ポリペプチドは、ＴＲＡＩＬ受容体リガンド、例えば、本明細書の配列番号１～５のいずれかの配列、またはそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列、またはＴＲＡＩＬ受容体に結合する抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、第１の薬剤は、例えば、ＴＲＡＩＬ－ＲＩなどの第１のＴＲＡＩＬ受容体に結合し、第２の薬剤は、例えば、ＴＲＡＩＬ－ＲＩＩなどの第２のＴＲＡＩＬ受容体に結合する。いくつかの実施形態では、近接する２つのＴＲＡＩＬ受容体リガンドは、どちらかのＴＲＡＩＬ受容体リガンドだけと比較して、標的細胞において相乗的な程度のアポトーシスを提供する。本明細書の実施例１は、がん細胞が、（例えば、除核赤血球の表面の）近接した２つのＴＲＡＩＬ受容体リガンドを含む組成物で処理された場合における、相乗的活性を実証する。
１つまたは複数の薬剤を含む遺伝子操作された赤血球
いくつかの態様では、本開示は、外因性薬剤を含む遺伝子操作された赤血球（例えば、網状赤血球）を提供する。より具体的には、いくつかの態様では、本開示は、外因性ポリペプチドを含む除核赤血球（例えば、網状赤血球）を提供する。赤血球は、任意選択的に、第２の異なる外因性ポリペプチドをさらに含む。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチド（例えば、任意選択的に第２の外因性ポリペプチドをさらに含む、赤血球を構成する外因性ポリペプチド）は、本明細書に記載の外因性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、表１、表２、または表３のいずれか、またはその断片もしくは変異型、またはそれに対する抗体分子から選択される。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチド（例えば、任意選択的に、第２の外因性ポリペプチドをさらに含んでなる、赤血球を構成する外因性ポリペプチド）は、例えば、がんの治療のために、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４１ＢＢＬ、またはそれらの任意の組み合わせなどの刺激性リガンドを含んでなる。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、例えば、多発性骨髄腫などのがんの治療のために、ＣＤ２６９などのがん細胞抗原を含んでなる。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチド（例えば、任意選択的に、第２の外因性ポリペプチドをさらに含んでなる、赤血球を構成する外因性ポリペプチド）は、免疫チェックポイント分子を阻害する。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、（例えば、膜貫通部分および表面露出部分を含んでなる）遺伝子操作された赤血球の表面に位置し、免疫チェックポイント分子に結合する。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦβである。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチド（例えば、任意選択的に第２の外因性ポリペプチドをさらに含んでなる、赤血球を構成する外因性ポリペプチド）は、免疫チェックポイント分子を阻害する。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、阻害抗体分子（例えば、単一特異性抗体、モノクローナル抗体、または一本鎖抗体などの抗体）である。抗体分子は、例えば、ヒト化または完全ヒトであってもよい。その他の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、例えば、Ｆｃ－受容体融合タンパク質などの融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質と相互作用する抗体分子などの薬剤である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、免疫チェックポイント受容体のリガンドと相互作用する抗体分子などの薬剤である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＣＴＬＡ－４（例えば、イピリムマブ／ヤーボイまたはトレメリムマブなどの抗ＣＴＬＡ４抗体）の阻害剤（例えば、阻害抗体または小分子阻害剤）である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ／Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）；ペンブロリズマブ／Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）；ピジリズマブ／ＣＴ－０１１）の阻害剤（例えば、阻害抗体または小分子阻害剤）である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１（例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ７４４６；ＭＥＤＩ４７３６；ＭＳＢ００１０７１８Ｃ；ＢＭＳ９３６５５９）の阻害剤（例えば、阻害抗体または小分子阻害剤）である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＰＤＬ２（例えば、ＡＭＰ２２４などのＰＤＬ２／Ｉｇ融合タンパク質）の阻害剤（例えば、阻害抗体またはＦｃ融合物または小分子阻害剤）である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、Ｂ７－Ｈ３（例えば、ＭＧＡ２７１）、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、Ｂ－７ファミリーリガンド、またはそれらの組み合わせの阻害剤（例えば、阻害抗体または小分子阻害剤）である。
免疫チェックポイント分子の阻害剤は、少なくとも４つの主要なカテゴリーに分類され得る：ｉ）Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で直接、阻害経路を遮断する抗体分子などの薬剤（例えば、ニボルマブおよびペンブロリズマブのようなＰＤ－１標的化抗体、ＴＩＭ－３を標的化する抗体、およびＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＣＤ１６０、Ａ２ａＲ、ＢＴＬＡ、ＣＧＥＮ－１５０４９またはＫＩＲを標的化する抗体）、ｉｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞上で直接、刺激経路を活性化する抗体などの薬剤（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、または４－１ＢＢを標的化する抗体）、ｉｉｉ）免疫細胞上で抑制経路を遮断するか、または抗体依存性細胞毒性に頼って免疫細胞の抑制的集団を枯渇させる、抗体分子などの薬剤（例えば、イピリムマブなどのＣＴＬＡ－４標的化抗体、ＶＩＳＴＡを標的化する抗体、およびＰＤ－Ｌ２、Ｇｒ１、またはＬｙ６Ｇを標的化する抗体）、およびｉｖ）がん細胞上で直接、抑制経路を遮断するか、または抗体依存性細胞毒性に頼ってがん細胞に対する細胞毒性を増強する、抗体分子などの薬剤（例えば、リツキシマブ、ＰＤ－Ｌ１を標的化する抗体、およびＢ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｇａｌ－９、またはＭＵＣ１を標的化する抗体）。本明細書に記載されているこのような薬剤は、例えば、当該技術分野で公知の従来の方法によって設計および製造され得る（例えば、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５；Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２０１２）。
本明細書に記載のポリペプチドのビヒクル
本明細書の多くのいくつかの実施形態では、１つまたは複数（例えば、２つ以上）の外因性ポリペプチドが、赤血球上またはその中に位置する一方で、本明細書に記載の任意の外因性ポリペプチドまたは外因性ポリペプチドの組み合わせは、別のビヒクル上またはその中にもまた位置し得る。ビヒクルは、例えば、細胞、赤血球系細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、またはエキソソームを含み得る。例えば、いくつかの態様では、本開示は、例えば、その表面に本明細書に記載の１つまたは複数の薬剤を含む、ビヒクル（例えば、細胞、赤血球系細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、またはエキソソーム）を提供する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、ＰＤ－１に結合するポリペプチド（例えば、ＰＤ－１に結合する抗体分子またはＰＤ－Ｌ１などのＰＤ－１の作動薬）、ＰＤ－Ｌ１に結合するポリペプチド（例えば、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体分子）、ＣＤ２０に結合するポリペプチド（例えば、ＣＤ２０に結合する抗体分子）、またはＴＲＡＩＬ受容体に結合するポリペプチド（例えば、ＴＲＡＩＬ受容体の作動薬）を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、選択された薬剤、表１、表２、または表３のいずれかのポリペプチド、またはその断片もしくは変異型、またはその作動薬または拮抗薬、またはそれに対する抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、ビヒクルは、例えば、本明細書に記載の任意の薬剤対などの本明細書に記載の２つ以上の薬剤を含む。
いくつかの実施形態では、ビヒクルは赤血球系細胞を含む。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、有核赤血球、赤血球前駆体、または除核赤血球である。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、脾臓コロニー形成（ＣＦＵ－Ｓ）細胞、共通骨髄系前駆（ＣＭＰ）細胞、未分化胚芽細胞コロニー成形細胞、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ－Ｅ）、巨核球－赤血球前駆（ＭＥＰ）細胞、赤血球コロニー形成単位（ＣＦＵ－Ｅ）、網状赤血球、赤血球、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多染性正赤芽球、正染性正赤芽球、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、不死胞または不死化細胞である。
膜内カプセル化細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の除核赤血球系細胞またはその他のビヒクルは、例えば、半透膜などの膜内にカプセル化される。いくつかの実施形態では、膜は、例えば、アニオン性アルギン酸多糖類などの多糖類を含む。いくつかの実施形態では、半透膜は、細胞を通過させないが、例えば、代謝産物、タンパク質またはＤＮＡなどの小分子または巨大分子の通過を許す。いくつかの実施形態では、膜は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｌｉｅｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ：ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５，９５－１０７（２０１４）に記載されるものである。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、膜は、細胞を免疫系から保護しおよび／または複数の細胞を近接して保持し、互いの相互作用または互いの産物の相互作用を促進する。
例えば、除核赤血球などの本明細書中の組成物による治療法
外因性薬剤（例えば、ポリペプチド）を含む（例えば、発現する）除核赤血球（例えば、網状赤血球）の投与方法は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１５３１０２号パンフレットに記載される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の除核赤血球は、例えば、ヒトなどの哺乳動物などの対象に投与される。治療され得る例示的哺乳類としては、限定されるものではないが、ヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、および実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）が挙げられる。本明細書に記載の方法は、ヒト治療および獣医学用途の双方に応用可能である。
いくつかの実施形態では、ＲＢＣは、１、２、３、４、５または６ヶ月毎に患者に投与される。
いくつかの実施形態では、ＲＢＣの１用量は、約１×１０９～２×１０９、２×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～２×１０１０、２×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、１×１０１１～２×１０１１、２×１０１１～５×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～２×１０１２、２×１０１２～５×１０１２、または５×１０１２～１×１０１３個の細胞を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＢＣは、患者の血流中において投与されたＲＢＣの機能が、２週間～１年間にわたって、例えば、１ヶ月間～１年間以上にわたって、例えば、少なくとも２週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月間、６ヶ月間、１年間、２年間にわたって、維持されるのに十分な投薬レジメン（投与の用量および周期性）で、患者に投与される。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載の除核赤血球（例えば、網状赤血球）などの本明細書に記載される組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、本明細書に記載の疾患または病状を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患または病状はがんである。いくつかの態様では、本開示は、例えば、がんなどの本明細書に記載の疾患または病状を治療するための、例えば、本明細書に記載の赤血球などの赤血球系細胞の使用を提供する。いくつかの態様では、本開示は、例えば、がんなどの本明細書に記載の疾患または病状を治療する薬剤を製造するための、例えば、本明細書に記載の赤血球などの赤血球系細胞の使用を提供する。
がん型としては、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、原発不明がん（ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｒｉｍａｒｙ）、骨転移がん、脳転移がん、肝臓転移がん、肺転移がん、カルチノイド、子宮頸がん、絨毛がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、妊娠性絨毛腫瘍（ＧＴＴ）、有毛細胞白血病、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、黒色腫皮膚がん、中皮腫、男性がん、奇胎妊娠、口腔および中咽頭がん、骨髄腫、鼻および洞がん、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、前立腺がん、希少がん、直腸がん、唾液腺がん、二次がん、皮膚がん（非黒色腫）、軟部組織肉腫、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣がん、甲状腺がん、原発不明がん（ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、子宮がん、膣がん、および外陰部がんが挙げられる。
Figure 0007093302000016
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実施例１．表面で２つの異なるＴＲＡＩＬ受容体リガンドを発現するｅＲＢＣの薬剤相乗的活性
ＴＲＡＩＬ受容体作動薬ＤＲ４．２（配列番号２）およびＤＲ５．２（配列番号５）の遺伝子を合成した。遺伝子を、ヒトグリコフォリンＡの遺伝子の上流のレンチウイルスベクター（ＳＢＩ）にクローニングし、１２アミノ酸Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１９））可撓性リンカーとＨＡエピトープタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹ（配列番号２０））とをコードする配列によって隔てた。
正常なヒトドナー由来の動員末梢血細胞に由来するヒトＣＤ３４＋細胞をＡｌｌＣｅｌｌｓ Ｉｎｃ．から凍結状態で購入した。細胞を、１％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で解凍した。次に、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＣＣ１００サイトカインミックス添加ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地中で、１Ｅ５細胞／ｍＬの密度で細胞を培養した。培地は、５日目に分化培地に交換した。
ウイルス生成プロトコルは以下のように行った。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質移入の２４時間前に播種した。パッケージングプラスミドと共にコンストラクトを含有するレンチウイルスベクターで、細胞を形質移入した。形質移入の２４時間後に培地交換を行い、形質移入の７２時間後にウイルスを採取した。解凍後６日目に、１：１の細胞容積対ウイルス容積比の各ウイルスの等容積で細胞を形質導入し、５～１０μｇ／ｍｌのポリブレンと共に、１．５時間にわたり８４５×ｇでスピノキュレーションした。
形質導入細胞は、Ｈｕ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ １８ Ａｐｒｉｌ ２０１３ Ｖｏｌ １２１の方法に従って、合成培地中で、赤血球系細胞および成熟した除核網状赤血球に分化させた。手短に述べると、細胞培養手順は３つの段階から構成された。基礎培地の組成は、イスコフ改変ダルベッコ培地、２％ヒト末梢血漿、３％ヒトＡＢ血清、２００ｍｇ／ｍＬホロフマントランスフェリン、３ＩＵ／ｍＬヘパリン、および１０ｍｇ／ｍＬインスリンであった。第１相（０日目～６日目）では、１０＾５／ｍＬの濃度のＣＤ３４１細胞を、１０ｎｇ／ｍＬ幹細胞因子、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、および３ＩＵ／ｍＬエリスロポエチンの存在下で培養した。第２相（７日目～１１日目）では、培地からＩＬ－３を省いた。２１日目まで持続した第３相では、細胞濃度を１１日目に１０＾６／ｍＬに調節し、１５日目に５×１０＾６／ｍＬに調節した。この相の培地は、基礎培地＋３ＩＵ／ｍＬエリスロポエチンであり、トランスフェリンの濃度は１ｍｇ／ｍＬに調節した。
導入遺伝子の発現は、相補的蛍光色素フルオレセインおよびＤｙＬｉｇｈｔ ６５０と化学的にコンジュゲートされた可溶性ＴＲＡＩＬ Ｒ１およびＴＲＡＩＬ Ｒ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．から購入）で標識し、フローサイトメトリーで染色することによってモニターした。ＤＲ４．２およびＤＲ５．２の双方のリガンドの発現レベルを、フローサイトメトリーを通じて確認した。
腫瘍細胞株アポトーシスアッセイは、Ｍａｒｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１３の修正バージョンに従って実施した。要約すると、ＤＲ４．２およびＤＲ５．２を発現する完全に成熟した除核網状赤血球を、ＣＦＳＥ標識ラジ細胞と１：１の比率で２４時間インキュベートした。その後、細胞をアネキシンＶで染色し、フローサイトメトリーで分析した。アポトーシス百分率は、アネキシンＶに対しても陽性に染色されたＣＦＳＥ陽性ラジ細胞から判定した。
図１に示されるように、ＣＦＳＥ標識ラジ細胞を、非形質導入、ＤＲ４．２形質導入培養網状赤血球、ＤＲ５．２形質導入培養網状赤血球、またはＤＲ４．２形質導入培養網状赤血球とＤＲ５．２形質導入養網状赤血球との混合物と共にインキュベートした場合、バックグラウンドに対して最小の細胞死が観察された。しかし、ＣＦＳＥ標識ラジ細胞を、ＤＲ４．２およびＤＲ５．２の双方で同時に形質導入され、したがって双方のタンパク質を同時に発現する培養網状赤血球と共にインキュベートした場合、有意な量の細胞死が観察された（ラジ細胞を用いたこのアッセイで達成可能なＴＲＡＩＬ誘発アポトーシスの最大量に相当する－例えば、Ｍａｒｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１３を参照されたい）。このデータは、単一のＴＲＡＩＬ受容体作動薬を発現する細胞と比較して、そしてそれぞれが異なるＴＲＡＩＬ受容体作動薬を発現する細胞の混合物と比較してさえも、単一の遺伝子操作された赤血球の表面のＴＲＡＩＬ受容体作動薬の協調作用が、相乗的な様式で細胞殺滅を誘導できることを示唆する。
細胞集団は、ＡＳ－３添加剤溶液中で製剤化し、バーキットリンパ腫に罹患している患者に静脈内投与してもよい。患者は、リンパ節の大きさの縮小、肝脾腫の改善、および／または悪心および嘔吐の軽減によって判定されるように、症状の改善を示すことが期待される。
実施例２．敗血症の治療で使用するための５つのサイトカインを含む捕捉ｅＲＢＣの生成
抗ＴＮＦａ（配列番号７）、抗ＩＬ６（配列番号６）、ＣＤ１４（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０８５７１）、ＩＦＮＧＲ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号１５２６０）、およびＩＬ１２Ｒ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４２７０１）の遺伝子は、市販業者によって合成される。遺伝子をヒトグリコフォリンＡの遺伝子の上流のレンチウイルスベクター（ＳＢＩ）にクローニングして、１２アミノ酸Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１９））可撓性リンカーとＨＡエピトープタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹ（配列番号２０））とをコードする配列によって隔てる。
実施例１に記載されるように、ヒトＣＤ３４＋細胞を培養し得て、ウイルスを生成し得る。形質導入された細胞は、本明細書に記載のように分化させる。
導入遺伝子の発現を評価するために、細胞を、リガンドＴＮＦａ、ＩＬ－６、ＩＦＮｇ、およびＩＬ－１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入された）、ならびに相補的蛍光色素に化学的にコンジュゲートされたリポ多糖（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で同時に標識する。細胞をフローサイトメトリーにより分析して、（ａ）薬剤が全て細胞の表面で発現され、（ｂ）薬剤がそれらの標的リガンドに結合できることを確認する。
細胞集団をＡＳ－３添加剤溶液中で製剤化し、敗血症を発症している患者に静脈内投与する。患者は、循環サイトカインレベルの減少、血管漏出症候群の軽減または予防、および生存率の改善によって判定されるように、患者は症状の改善を示すことが期待される。
実施例３．がんワクチンとして使用するための腫瘍抗原のコンビナトリアルライブラリーを含んでなるｅＲＢＣ
ヒトＣＤ３４＋細胞は、実施例１に記載のように培養し得る。細胞は、本明細書に記載されるような赤血球系細胞に分化する。
黒色腫がん細胞のサンプルは、生検によって患者から単離する。細胞を溶解し、シリカカラム精製（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、吸光度分光法によってＲＮＡ含有量を定量し、－８０Ｃで保存する。
赤血球培養物の最終分化の４日前に、細胞を回収し、無血清ＩＭＤＭで２回洗浄し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中に１０－４０×１０＾６細胞／ｍＬの最終濃度で再懸濁する。引き続いて、０．５ｍＬの細胞懸濁液を２０μｇのｍＲＮＡと混合し、Ｅａｓｙｊｅｃｔ Ｐｌｕｓ装置（ＥｑｕｉＢｉｏ，Ｋｅｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて３００Ｖおよび１５０ｕＦの条件で、０．４ｃｍキュベット内で電気穿孔する。電気穿孔後、新鮮な赤血球成熟培地を細胞懸濁液に添加し、５％ＣＯ２を補給した加湿雰囲気中において３７℃で、細胞をさらにインキュベートする。
完全に成熟した網状赤血球は、細胞溶解物の質量分析によってタンパク質発現について特性決定する。ＲＮＡの代わりにＰＢＳを投与された、非電気穿孔細胞および電気穿孔細胞を対照として使用して、外因性がん由来タンパク質に由来する内因性網状赤血球タンパク質を同定する。
細胞集団をＡＳ－３添加剤溶液中で製剤化し、黒色腫に罹患している患者に静脈内投与する。患者は、次に、ＣＴスキャンによる転移塊の減少、および黒色腫皮膚病変の消散によって測定判定される、黒色腫抗原に対する免疫応答を示すことが期待される。
実施例４：非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対する抗腫瘍療法としての赤血球の遺伝子操作
ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１（ＲＣＴ－抗ＰＤ－１およびＲＣＴ－抗ＰＤ－Ｌ１）に対する抗体をその表面に発現する赤血球を作製し、これらの細胞が、それぞれの標的に結合して強固な免疫応答を活性化し得るかどうかを評価した。フローサイトメトリーを用いて、それぞれＲＣＴ－抗ＰＤ－１およびＲＣＴ－抗ＰＤ－Ｌ１の組換えＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１への結合が判定され、非常に特異的であることが示された。Ｎ末端からＣ末端方向に、イピリムマブベースの抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖ抗体ドメイン、エピトープ標識、および完全長ＧＰＡ（細胞外、膜貫通、および細胞質ドメインを含んでなる、融合タンパク質をそれらの表面に発現する赤血球もまた生成した。抗ＣＴＬＡ４ポリペプチドの強力な発現がフローサイトメトリーアッセイで観察され、９５．２％を超える細胞が、抗ＣＴＬＡ４をコードするベクターでの形質移入後に抗ＣＴＬＡ４を発現した。
生体外ジャーカット細胞ＩＬ－２分泌アッセイを用いて、機能活性を試験した。このアッセイでは、ジャーカット細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８四量体による刺激によって誘導されるＰＤ－Ｌ１を発現するＮＨＬ細胞（Ｚ１３８）と共にインキュベートすることで、ＩＬ－２分泌を阻害する。ＩＬ－２分泌は、ジャーカット細胞およびＺ１３８細胞をＲＣＴ－抗ＰＤ－１またはＲＣＴ－抗ＰＤ－Ｌ１と共に培養することでレスキューされたが、対照ＲＣＴではレスキューされなかった。ＲＣＴ－抗ＣＴＬＡ４もまた、Ｔ細胞ＩＬ－２分泌のレスキューおよび回復を示した。
これらの遺伝子操作された赤血球が、標準的な抗原免疫復活アッセイにおいて、活性化を誘発する能力をアッセイした。抗原免疫復活アッセイにおいて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のインターフェロンγ分泌の強固な４～６倍の増加が実証された。ドナーＰＢＭＣを一般的な流感ウイルス抗原で刺激した。免疫チェックポイント阻害に感受性である記憶Ｔ細胞を、対照ＰＢＭＣまたは対照ＲＣＴと比較して、ＲＣＴ－抗ＰＤ－１またはＲＣＴ－抗ＰＤ－Ｌ１と共培養することで、活性化およびγインターフェロン分泌について試験した。
これらの実験は、赤血球が特定の細胞－細胞相互作用に関与でき、免疫チェックポイントに関与し得することを示す。
さらに、それらの表面に、抗ＣＤ２０一本鎖可変断片を発現する赤血球（ＲＣＴ－抗ＣＤ２０）を作製した。生体外でＣＤ２０＋リンパ腫細胞を結合する、それらの能力を評価した。この実験は、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡法を用いて、ＲＣＴ－抗ＣＤ２０の標的細胞への効率的かつ特異的結合を実証した。ＲＣＴ－抗ＣＤ２０細胞を、ＤｏＨＨ２（濾胞性リンパ腫）、Ｒａｍｏｓ（バーキットリンパ腫）、Ｇｒａｎｔａ－５１９（マントル細胞リンパ腫）、およびＳＵ－ＤＨＬ－４（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）のリンパ腫亜型に相当するＣＤ２０＋ヒトリンパ腫細胞株のパネルと共培養することによって、この相互作用がアポトーシスを誘導し得るかどうかもまた評価した。全ての場合において、ＲＣＴ－抗ＣＤ２０共培養は、ＲＣＴまたは可溶性リツキシマブモノクローナル抗体単独と比較して、アポトーシスの増加をもたらした。生体外における直接腫瘍細胞殺滅は、リンパ腫細胞上のＣＤ２０の過架橋のためにモノクローナル抗体単独よりも有効であると仮定される。この効果は、受容体クラスター形成の原位置実証と、アポトーシス経路の刺激の双方によって示された。これらの知見は、したがって、ＲＣＴ上に発現されるタンパク質の新しい生物学を実証し、リンパ腫腫瘍生体内に対する影響の試験の根拠となった。
実施例５：標的タンパク質の捕捉および修飾
本実施例では、遺伝子組換え除核赤血球系細胞を用いて標的タンパク質を捕捉および修飾した。対照細胞および実験細胞はそれぞれ、それらの膜に内因性グリコフォリンＡ（ＧＰＡ）を含み、これを使用して標的タンパク質に結合させた。実験細胞は、膜アンカーとして、ＧＰＡに融合した表面露出ＩｄｅＳを含む外因性タンパク質を発現した。ＩｄｅＳは抗体を切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片を生成できる。標的タンパク質は、ＦＩＴＣで蛍光標識された抗ＧＰＡ抗体である。標的抗体の定常領域および可変領域はどちらもＦＩＴＣ標識されているので、抗体が切断された場合、双方の断片を検出し得た。
最初に、対照細胞およびＩｄｅＳ発現細胞を、抗ＧＰＡ抗体に結合する能力についてＦＡＣＳによって試験した。対照およびＩｄｅＳ発現細胞はどちらも、ＦＩＴＣと細胞との会合によって測定されるように、抗体に結合した（データ未掲載）。さらに、対照およびＩｄｅＳ発現細胞はどちらも、蛍光標識抗ウサギＦｃ抗体を用いた第２の検出法によって、またはそれを用いて測定されるように、抗体に結合した（データ未掲載）。これらの測定は、細胞をインキュベートして標的抗体のＩｄｅＳ媒介切断ができるようにする前の初期の時点で行った。
対照的に、ＩｄｅＳ発現細胞のみが標的抗体を切断できた。これは、対照またはＩｄｅＳ発現細胞を標的抗体と共にインキュベートして、抗体切断ができるようにすることによって示された。赤血球系細胞の表面の非損傷抗体を検出するために、蛍光標識抗ウサギＦｃ抗体を反物に添加した。ＩｄｅＳ発現細胞は、細胞との抗ウサギＦｃの会合の減少を示し（図２）、これは、対照細胞と比較して、ＩｄｅＳ発現細胞の表面の低レベルのＦｃを示唆した。対照細胞またはＩｄｅＳ発現細胞に会合する直接ＦＩＴＣ標識標的抗体の量の減少はなく、これは標的抗体の少なくともＦＩＴＣ標識可変領域が、依然としてＩｄｅＳ発現細胞および対照細胞に結合していることを示唆した。この結果は、ウェスタンブロットによって確認され、抗ウサギ重鎖および抗ウサギ軽鎖抗体を用いて、対照またはＩｄｅＳ発現細胞の上清中の非損傷抗体および切断抗体を検出した。実験は、対照赤血球系細胞でなくＩｄｅＳ発現赤血球系細胞が抗ＧＰＡ抗体を切断し、重鎖断片の出現をもたらすことを示した（図３）。
したがって、対照細胞は標的抗体に結合できたが、ＩｄｅＳ発現細胞のみが標的抗体に結合して切断できた。
実施例６：ＲＣＴ－抗ＰＤ－Ｌ１はＴ細胞増殖を促進する
この実施例は、ＰＢＭＣ単独と比較した場合、ＲＣＴ－抗ＰＤ－Ｌ１とのインキュベーション後におけるＴ細胞の総数の４．４倍の増加に基づいて、ＲＣＴ－抗ＰＤ－Ｌ１とＰＢＭＣとの共培養が、Ｔ細胞増殖の増強をもたらしたことを実証する。
実施例７：共刺激タンパク質を発現するＲＣＴ
別の角度からＴ細胞活性化にアプローチして、ＲＣＴが、抗原提示細胞上で発現されてＴ細胞上の４１－ＢＢ受容体（ＲＣＴ－４１－ＢＢ－Ｌ）に結合する共刺激タンパク質である、４１－ＢＢ－Ｌを発現するように設計した。ＲＣＴ－４１－ＢＢ－Ｌの組換え４１－ＢＢへの結合を、フローサイトメトリーを用いて判定した。ＰＢＭＣとＲＣＴ－４１－ＢＢ－Ｌとの共培養は、ＰＢＭＣ単独と比較してＴ細胞増殖の１．７倍の増加を示した。最終的に、ＲＣＴ－４１－ＢＢ－Ｌを、４１－ＢＢおよびＮＦｋＢ－Ｌｕｃ２Ｐを過剰発現するジャーカット細胞と共にインキュベートすると、ＮＦｋＢ媒介性ルシフェラーゼ発現の活性化は対照と比較して３０倍増加した。
実施例８：抗ＣＤ２０およびＴＲＡＩＬリガンドを同現現する赤血球治療薬
抗ＣＤ２０ならびにＴｒａｉｌリガンド（アポトーシス誘導剤）を同時現するように、赤血球系細胞を遺伝子操作した場合、Ｒａｍｏｓ細胞のＲＣＴ－抗ＣＤ２０、ＲＣＴ－Ｔｒａｉｌ、およびＲＣＴ－抗ＣＤ２０＋Ｔｒａｉｌ（同時発現）との共培養は、４８時間後にそれぞれ３２％、４７％および７６％のアポトーシスを与え、同時発現ＲＣＴの相乗的な細胞死滅効果が示唆された。
ＴＲＡＩＬリガンドおよび抗ＣＤ２０部分を含んでなる細胞集団は、ＡＳ－３添加剤溶液中で製剤化して、例えば、がんに罹患している患者などの患者に静脈内投与してもよい。

Claims (15)

  1. ４－１ＢＢＬ、または４－１ＢＢに結合してＴ細胞を活性化する４－１ＢＢＬの断片もしくは変異型を含む第１の外因性ポリペプチドを含む、除核赤血球系細胞であって、ここで：
    前記第１の外因性ポリペプチドが、前記除核赤血球系細胞の表面に存在し；
    前記第１の外因性ポリペプチドが、ソルターゼ移入シグネチャを欠き；そして、
    前記除核赤血球系細胞が、以下：
    前記第１の外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸を有核赤血球またはその前駆体に導入するステップ；および
    前記有核赤血球またはその前駆体を、核除去および前記第１の外因性ポリペプチドの産生に適切な条件下で培養するステップ、
    を含む方法で産生されたものである、
    除核赤血球系細胞。
  2. 前記第１の外因性ポリペプチドが、膜貫通ポリペプチドまたは表面アンカー型ポリペプチドを含む、請求項１に記載の除核赤血球系細胞。
  3. 前記第１の外因性ポリペプチドが、膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の除核赤血球系細胞。
  4. （ｉ）前記膜貫通ドメインが、Ｉ型またはＩＩ型赤血球膜貫通ドメインである；および／または（ｉｉ）前記膜貫通ドメインが、グリコフォリンＡ（ＧＰＡ）を含む、請求項３に記載の除核赤血球系細胞。
  5. 前記除核赤血球系細胞が、第２の外因性ポリペプチドをさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の除核赤血球系細胞。
  6. 前記除核赤血球系細胞が、第３の外因性ポリペプチドをさらに含む、請求項５に記載の除核赤血球系細胞。
  7. 前記第２の外因性ポリペプチドが、ＩＬ－１２、またはＩＬ－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）に結合して免疫細胞を活性化するＩＬ－１２の断片もしくは変異型を含む、請求項５に記載の除核赤血球系細胞。
  8. 前記第２の外因性ポリペプチドが、ＩＬ－１５、またはＩＬ－１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）に結合して免疫細胞を活性化するＩＬ－１５の断片もしくは変異型を含む、請求項５に記載の除核赤血球系細胞。
  9. 請求項１～８のいずれかに記載の複数の除核赤血球系細胞を含む、医薬組成物。
  10. 対象においてがんを治療する方法における使用のための、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 請求項１に記載の除核赤血球系細胞を作製する生体外での方法であって、前記方法は、
    前記第１の外因性ポリペプチドをコードする前記外因性核酸を有核赤血球またはその前駆体に導入するステップ；および
    前記有核赤血球またはその前駆体を、核除去および前記第１の外因性ポリペプチドの産生に適切な条件下で培養するステップ
    を含む、方法。
  12. 対象においてがんを治療する方法における使用のための、除核赤血球系細胞を含む組成物であって、前記除核赤血球系細胞が、４－１ＢＢＬ、または４－１ＢＢに結合してＴ細胞を活性化する４－１ＢＢＬの断片もしくは変異型を含む第１の外因性ポリペプチドを含み、ここで：
    前記第１の外因性ポリペプチドが、前記除核赤血球系細胞の表面に存在し；
    前記第１の外因性ポリペプチドが、ソルターゼ移入シグネチャを欠き；そして、
    前記除核赤血球系細胞が、以下：
    前記第１の外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸を有核赤血球またはその前駆体に導入するステップ；および
    前記有核赤血球またはその前駆体を、核除去および前記第１の外因性ポリペプチドの産生に適切な条件下で培養するステップ、
    を含む方法で産生されたものである、組成物。
  13. 前記除核赤血球系細胞が、第２の外因性ポリペプチドをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記第２の外因性ポリペプチドが、ＩＬ－１２、またはＩＬ－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）に結合して免疫細胞を活性化するＩＬ－１２の断片もしくは変異型を含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記第２の外因性ポリペプチドが、ＩＬ－１５、またはＩＬ－１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）に結合して免疫細胞を活性化するＩＬ－１５の断片もしくは変異型を含む、請求項１３に記載の組成物。
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