CN115969987A - 与免疫适应症的多模式治疗性细胞体系有关的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明包括与多模式疗法有关的组合物和方法，例如用于治疗免疫病症。本文所述的多模式疗法提供和/或给予多种药剂，这些药剂以协调方式起作用以向有需要的受试者(例如，患有自身免疫性疾病或炎性疾病的受试者)提供治疗益处。

Description

与免疫适应症的多模式治疗性细胞体系有关的组合物和方法

本申请是申请日为2017年1月11日，申请号：201780006086.0，发明名称为“与免疫适应症的多模式治疗性细胞体系有关的组合物和方法”的中国发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年1月11日提交的美国序列号62/277130、2016年7月7日提交的美国序列号62/359448、2016年8月4日提交的美国序列号62/370915以及2016年11月11日提交的美国序列号62/420973的优先权，将其内容通过引用以其全文并入本文。

序列表

本申请包含一份已经以ASCII格式电子递交的序列表并且将该序列表通过引用以其全文特此结合。创建于2017年1月5日的所述ASCII副本被命名为R2081-7013WO_SL.txt，并且大小是24,800字节。

背景技术

已经考虑将红细胞用作药物递送系统，例如以降解毒性代谢物或灭活异生物质，以及用于其他生物医学应用。

发明内容

本发明包括与多模式疗法有关的组合物和方法。这些疗法可用于例如治疗免疫病症，例如自身免疫性或炎性疾病。本文所述的多模式疗法提供和/或给予多种药剂，这些药剂以协调方式起作用以向有需要的受试者(例如，患有自身免疫性或炎性疾病的受试者)提供治疗益处。总体上，本文所述的多模式疗法包括向受试者给予包含(例如，表达或含有)多种药剂(例如，多肽)的工程化红细胞(例如，去核红细胞)的制剂，这些药剂以协调方式(例如，药剂加和、药剂协同、倍增、独立功能、基于定位、邻近依赖、基于支架、基于多聚体、或补偿)起作用。

在一些方面，本披露提供了去核红细胞，例如网织红细胞，其包含多种药剂，例如多种多肽(例如，外源性多肽)，例如第一外源性多肽、第二外源性多肽、和第三外源性多肽。

在一些方面，本披露提供了包含多种外源性多肽的去核红细胞，例如网织红细胞，其中所述多种多肽中的第一和第二外源性多肽具有药剂加和、药剂协同、倍增、独立功能、基于定位、邻近依赖、基于支架、基于多聚体、或补偿活性。

在一些方面，本披露提供了包含第一外源性多肽和第二外源性多肽的去核红细胞，例如网织红细胞，其中：

a)第一和第二外源性多肽作用于相同的靶标，其中任选地靶标是细胞表面受体和/或内源性人蛋白；

b)第一外源性多肽与第一内源性人蛋白结合并且第二外源性多肽与第二内源性人靶蛋白结合，例如以小于500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM、5nM、2nM、或1nM的Kd；

c)第一外源性多肽作用于(例如，结合)第一靶标，并且第二外源性多肽作用于(例如，结合)第二靶标，其中第一和第二靶标是相同生物学途径的成员，其中任选地靶标是细胞表面受体、内源性人蛋白或两者；

d)第一外源性多肽包含第一促凋亡多肽，并且第二外源性多肽包含第二促凋亡多肽，例如TRAIL受体配体，例如TRAIL多肽；

e)第一和第二外源性多肽彼此非常接近，例如相距小于10nm、7nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.5nm、0.2nm、或0.1nm持续至少1秒、2秒、5秒、10秒、30秒或60秒，1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、30分钟、或60分钟，或1小时、2小时、3小时、6小时、12小时或14小时的持续时间；

f)第一和第二外源性多肽彼此具有小于500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM、5nM、2nM、或1nM的Kd；

g)第一外源性多肽包含抗原呈递多肽，例如MHC分子，例如MHC II类分子，并且第二外源性多肽包含抗原；

h)第一和第二外源性多肽作用于不同的靶标，其中任选地这些靶标中的至少一种是细胞表面受体和/或内源性人蛋白，例如第一外源性多肽结合第一细胞类型，例如免疫效应细胞，并且第二外源性多肽结合第二细胞类型，例如免疫效应细胞，例如T细胞；

i)第一外源性多肽和第二外源性多肽具有按重量计或按拷贝数计约1:1、从约2:1至1:2、从约5:1至1:5、从约10:1至1:10、从约20:1至1:20、从约50:1至1:50、从约100:1至1:100的丰度比；

j)第一外源性多肽和第二外源性多肽分别对第一靶标和第二靶标具有如下Kd，其比率为约1:1、从约2:1至1:2、从约5:1至1:5、从约10:1至1:10、从约20:1至1:20、从约50:1至1:50、从约100:1至1:100；

k)第一外源性多肽对第一靶标具有第一活性(例如，结合)，并且第二外源性多肽对第一靶标具有第二活性(例如，结合)，例如第一和第二外源性多肽结合单个靶标；

l)第一外源性多肽作用于(例如，结合)第一靶标，并且第二外源性多肽作用于(例如，结合)第二靶标，并且第一和第二靶标是相同途径的一部分，其中任选地第一外源性多肽作用于第一靶标，并且第二外源性多肽同时作用于第二靶标；

m)第一外源性多肽作用于(例如，结合)第一靶标，并且第二外源性多肽作用于(例如，结合)第二靶标，并且第一和第二靶标是不同途径的一部分，其中任选地第一和第二途径二者起作用以促进给定的细胞应答；

n)第一外源性多肽将去核红细胞定位于所需位点，例如人细胞，并且第二外源性多肽具有治疗活性，例如免疫调节活性，如T细胞抑制活性或抗原呈递活性；

o)第一外源性多肽结合第一靶标，例如第一细胞，例如第一细胞类型，例如免疫效应细胞，并且第二外源性多肽结合第二靶标，例如第二细胞，例如第二细胞类型，例如免疫效应细胞，例如T细胞；

p)第一外源性多肽和第二外源性多肽是非人蛋白；

q)第一外源性多肽和第二外源性多肽都是酶，例如生物合成酶；

r)第一外源性多肽促进中间体分子的形成，并且第二外源性多肽作用于中间体分子；或

s)第一外源性多肽和第二外源性多肽作用于途径的连续步骤。

本文中的任何方面(例如，以上方面)可以由本文中的一个或多个实施例(例如，以下实施例)来表征。

在一些实施例中，外源性多肽具有协同活性。在一些实施例中，外源性多肽具有加和活性。

在一些实施例中，外源性多肽具有邻近依赖活性。在与一个或多个靶标部分相互作用之前、期间或之后所述多种多肽之间的接近可以赋予在体内或体外不存在这种接近时不会看到的特性或结果。

在一些实施例中，第一外源性多肽与靶细胞(例如，免疫效应细胞，例如T细胞)上的第一靶标部分(例如，第一靶细胞多肽)相互作用(例如，结合)，并且第二外源性多肽与靶细胞上的第二靶标部分(例如，第二靶细胞多肽)相互作用(例如，结合)(例如，其中第一和第二靶细胞多肽的结合改变靶细胞的生物学特性)。在一个实施例中，第一和第二靶标是靶细胞上的多聚体复合物的亚单位。

在一些实施例中，第一外源性多肽促进红细胞与靶细胞的融合，并且第二外源性多肽是表1、表2、表3或表4任一个中的多肽(例如，表1、表2、表3或表4任一个中的人多肽，例如具有人野生型多肽的氨基酸序列的多肽)。

在一些实施例中，第一和第二外源性多肽彼此相互作用，例如第一外源性多肽例如通过切割或磷酸化来修饰第二外源性多肽，或第一和第二外源性多肽形成二聚体或多聚体蛋白。

在一些实施例中，去核红细胞包含3、4、5、6、7、8、9或10种不同的外源性多肽。在一个实施例中，多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10种)或全部不同的外源性多肽彼此具有预选水平的同源性，例如彼此至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性。在一个实施例中，多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10种)或全部不同的外源性多肽与参考序列具有预选水平的同源性，例如，与参考序列具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性(该参考序列包括完整的多肽序列或其部分，例如预选结构域)，例如多种或全部不同的外源性多肽是抗体或抗体分子。在一些实施例中，参考序列是抗体序列或其片段。在一些实施例中，参考序列包含重链恒定区或其部分、轻链恒定区或其片段、重链可变区或其部分、轻链可变区或其片段、或前述的任何组合。在实施例中，去核红细胞用于治疗免疫缺陷受试者，例如，作为IVIG疗法的替代物(或与其联合)。

在一些实施例中，去核红细胞包含至少2种但不超过5、6、7、8、9或10种不同的外源性多肽，例如由一种或多种未被去核红细胞保留的外源性核酸编码的外源性多肽。

在一些实施例中，外源性多肽由一种或多种未被去核红细胞保留的外源性核酸编码。

在一些实施例中，第一、第二和任选地第三外源性多肽中的一种或多种(例如，两种或三种)是跨膜多肽或表面锚定多肽。

在一些实施例中，第一外源性多肽与靶细胞上的部分相互作用，例如结合，并且第二外源性多肽改变靶细胞的特性，例如杀死、激活、失活或诱导靶细胞中的耐受性或无反应性。

在一些实施例中，第一外源性多肽和第二外源性多肽具有按重量计或按拷贝数计约1:1、从约2:1至1:2、从约5:1至1:5、从约10:1至1:10、从约20:1至1:20、从约50:1至1:50、或从约100:1至1:100的丰度比。在一些实施例中，第一和第二多肽都具有化学计量作用模式，或两者都具有催化作用模式，并且两者都以相似的丰度存在，例如约1:1或从约2:1至1:2。在一些实施例中，第一外源性多肽比第二外源性多肽按重量计或按拷贝数计更丰富至少约10％、20％、30％、50％，或2、3、4、5、10、20、50或100倍(并且任选地高达10或100倍)。在一些实施例中，第二外源性多肽比第一外源性多肽按重量计或按拷贝数计更丰富至少约10％、20％、30％、50％，或2、3、4、5、10、20、50或100倍(并且任选地高达10或100倍)。在一些实施例中，第一多肽具有化学计量作用模式，并且第二多肽具有催化作用模式，并且第一多肽比第二多肽更丰富。在一些实施例中，第二多肽具有化学计量作用模式，并且第一多肽具有催化作用模式，并且第二多肽比第一多肽更丰富。

在一些实施例中，第一外源性多肽包含靶向部分。

在一些实施例中，去核红细胞具有以下特征中的一个或多个：

a)渗透脆性为在0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％NaCl下小于50％的细胞裂解；

b)细胞容积为约10-200fL，或细胞直径在约1微米和约20微米之间、在约2微米和约20微米之间、在约3微米和约20微米之间、在约4微米和约20微米之间、在约5微米和约20微米之间、在约6微米和约20微米之间、在约5微米和约15微米之间、或在约10微米和约30微米之间；

c)大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的胎儿血红蛋白；或至少约20、25或30pg/细胞的血红蛋白；或

d)外叶的磷脂酰丝氨酸含量小于30％、25％、20％、15％、10％或5％，如通过膜联蛋白V染色所测量的。

在一些实施例中，所述多种外源性多肽中的至少一种(例如，全部)被糖基化。在一些实施例中，所述多种外源性多肽中的至少一种(例如，全部)被磷酸化。

在一些实施例中，去核红细胞是网织红细胞。

在一些实施例中，所述一种或多种外源性多肽缺乏分选酶转移标记(即，可通过分选酶反应产生的序列)，如LPXTG(SEQ ID NO:17)。

在一些方面，本披露提供了治疗本文所述的疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者给予本文所述的去核红细胞，例如网织红细胞。在一些实施例中，疾病或病症是炎性疾病或自身免疫性疾病。

在一些方面，本披露提供了使第一和第二细胞表面部分(例如，跨膜受体)接近的方法，该方法包括向有需要的受试者给予本文所述的去核红细胞，例如网织红细胞。

在一些方面，本披露提供了递送、呈递或表达多种邻近依赖分子的方法，该方法包括提供本文所述的去核红细胞，例如网织红细胞。

在一些方面，本披露提供了产生本文所述的去核红细胞(例如，网织红细胞)的方法，该方法包括使红细胞前体与编码外源性多肽的一种或多种核酸进行接触，并将细胞置于允许发生去核的条件下。

在一些方面，本披露提供了制剂，例如药物制剂，其包含本文所述的多个去核红细胞，例如网织红细胞，例如至少10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²个细胞。

在一些方面，本披露提供了工程化红细胞(RBC)(例如，去核红细胞，例如网织红细胞)和靶细胞的细胞复合物，例如体外或体内复合物，该复合物由外源性多肽之一介导。在一些实施例中，细胞复合物包含至少2、3、4、5、10、20、50或100个细胞。

在一些方面，本披露提供了反应混合物，其包含工程化RBC(例如，去核红细胞，例如网织红细胞)和编码本文所述的多模对的核酸(例如，一种或多种核酸分子)。在一些实施例中，核酸包含至少一种在红细胞中有活性的启动子。在一些实施例中，核酸编码本文所述的至少两种蛋白质(例如，在表1、表2、表3和表4中)。在一些实施例中，核酸编码第三外源性多肽。

在一些方面，本披露包括制备本文所述的工程化RBC(例如，去核红细胞，例如网织红细胞)的方法，该方法包括：提供(例如，接收)关于靶细胞或受试者的信息，响应该信息选择多种外源性多肽，并且将编码外源性多肽的核酸引入RBC或RBC前体中。

在一些方面，本发明包括评估工程化RBC(例如，去核RBC，例如网织红细胞)的方法，该方法包括提供候选RBC，并且确定编码多种外源性多肽(例如，多模对的外源性多肽)的核酸是否存在。

在一些方面，本披露提供了去核类红细胞，其包含：

与靶标相互作用的第一外源性多肽，和

修饰靶标的第二外源性多肽；

其中以下中的一个或多个：

(a)第二外源性多肽包含切割抗体的部分，例如在铰链区、CH2区或在铰链和CH2区之间切割的部分，例如IdeS多肽；

(b)第二外源性多肽包含修饰靶标(例如，对靶标上的位点有特异性，例如与靶标上的位点结合)、结合(例如，特异性地)并修饰(例如，共价修饰，例如切割)靶标、或去除靶标或将部分连接至靶标的酶(例如，蛋白酶)，其中靶标任选地是抗体或补体因子；

(c)第二外源性多肽包含修饰靶标的二级、三级或四级结构，并且在实施例中，改变(例如，降低或增加)靶标与另一分子(例如，第一外源性多肽或不同于第一外源性多肽的分子)相互作用的能力的多肽，例如酶，例如蛋白酶，其中任选地靶标包含抗体或补体因子；

(d)第二外源性多肽包含在第一靶结构域和第二靶结构域(例如，结合第一底物的第一靶结构域和结合第二底物的第二靶结构域)之间切割靶标(例如，多肽)的多肽，例如酶(例如，蛋白酶)；

(e)靶标是多肽(例如，自身抗体或补体因子)；碳水化合物(例如，聚糖)，脂质(例如，磷脂)或核酸(例如，DNA或RNA)；

(f)第一外源性多肽结合靶标(例如，抗体)但不切割键，例如共价键，例如抗体中的共价键，并且第二外源性多肽切割键，例如共价键，例如抗体中的共价键；

(g)靶标包含抗体并且第一外源性多肽结合抗体靶标的可变区；

(h)靶标包含抗体并且第一外源性多肽结合抗体靶标的恒定区；

(i)第一外源性多肽对靶标的亲和力为约1-2pM、2-5pM、5-10pM、10-20pM、20-50pM、50-100pM、100-200pM、200-500pM、500-1000pM、1-2nM、2-5nM、5-10nM、10-20nM、20-50nM、50-100nM、100-200nM、200-500nM、500-1000nM、1-2μM、2-5μM、5-10μM、10-20μM、20-50μM或50-100μM；

(j)第二外源性多肽对靶标的K_M为约10^-1-10^-7M、10^-1-10^-2M、10^-2-10^-3M、10^-3-10^-4M、10^-4-10^-5M、10^-5-10^-6M或10^-6-10^-7M；

(k)第一外源性多肽对靶标的K_d(以M测量)除以第二外源性多肽对靶标的K_M(以M测量)的比率为约1x10^-9–2x10^-9、2x10^-9–5x10^-9、5x10^-9–1x10^-8、1x10^-8–2x10^-8、2x10^-8–5x10^-8、5x10^-8–1x10^-7、1x10^-7–2x10^-7、2x10^-7–5x10^-7、5x10^-7–1x10^-6、1x10^-6–2x10^-6、2x10^-6–5x10^-6、5x10^-6–1x10^-5、1x10^-5–2x10^-5、2x10^-5–5x10^-5、5x10^-5–1x10^-4、1x10^-4–2x10^-4、2x10^-4–5x10^-4、5x10^-4–1x10^-3、1x10^-3–2x10^-3、2x10^-3–5x10^-3、5x10^-3–1x10^-2、1x10^-2–2x10^-2、2x10^-2–5x10^-2、5x10^-2–1x10^-1、1x10^-1–2x10^-1、2x10^-1–5x10^-1或5x10^-1–1；

(l)观察到的修饰靶标的第二外源性多肽的反应速率大于在其他方面类似的反应条件下相似但缺乏第一外源性多肽的去核细胞的反应速率；

(m)类红细胞上第一外源性多肽的平均数与类红细胞上第二外源性多肽的平均数的比率为约50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:20或1:50；

(n)第一外源性多肽对靶标的亲和力大于第一外源性多肽对修饰的(例如，切割的)靶标的亲和力；

(o)去核类红细胞的治疗有效剂量小于给予时在受试者外周血中的靶标的量的化学计量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(p)有效剂量的去核类红细胞的数量小于给予时在受试者外周血中的靶标(例如，靶分子)的数量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(q)由预选量(例如，有效剂量)的去核类红细胞或体外有效量的去核类红细胞包含的第二外源性多肽的数量小于靶标的参考值，例如小于给予时在受试者外周血中的靶标的数量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(r)由预选量(例如，有效剂量)的去核类红细胞或体外有效量的去核类红细胞包含的第一外源性多肽的数量小于靶标的参考值，例如小于给予时在受试者外周血中的靶标的数量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(s)由预选量的去核类红细胞(例如，有效剂量的去核类红细胞)包含的第一外源性多肽的数量和第二外源性多肽的数量各自小于靶标的参考值，例如小于给予时在受试者外周血中的靶标的数量；

(t)第二外源性多肽以至少10^-1M、10^-2M、10^-3M、10^-4M、10^-5M、10^-6M或10^-7M的K_M修饰(例如切割)靶标；

(u)第二外源性多肽包含伴侣蛋白；

(v)第一外源性多肽包含表面暴露部分，并且第二外源性多肽包含表面暴露部分；或

(w)去核类红细胞的有效量小于在其他方面类似的缺乏第二外源性多肽的去核类红细胞的有效量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)。

在实施例中，(b)第二外源性多肽包含修饰靶标(例如，对靶标上的位点有特异性，例如与靶标上的位点结合)、结合(例如，特异性地)并修饰(例如，共价修饰，例如切割)靶标、或去除靶标或将部分连接至靶标的酶(例如，蛋白酶)，其中靶标任选地是抗体或补体因子。在实施例中，修饰改变(例如，增加或降低)靶标与另一分子(例如，第一外源性多肽或不同于第一外源性多肽的分子)相互作用的能力。

在实施例中，(d)第二外源性多肽包含在第一靶结构域和第二靶结构域(例如，结合第一底物的第一靶结构域和结合第二底物的第二靶结构域)之间切割靶标(例如，多肽)的多肽，例如酶(例如，蛋白酶)。在实施例中，第一靶结构域从第二靶结构域中释放出来。在实施例中，切割改变第一靶结构域对第一底物的亲和力和第二靶结构域对第二底物的亲和力中的一者或两者。在一个实施例中，靶标包含抗体，并且第一靶结构域包含一个或多个CDR，并且第二靶结构域包含恒定区的一部分，例如Fc区。

在实施例中，存在(a)-(w)中的至少两项(例如，至少3、4、5、6、7、8、9或10项)。在实施例中，存在至少(a)和(e)。在实施例中，存在至少(a)和(i)。在实施例中，存在至少(a)和(j)。在实施例中，存在至少(a)和(m)。在实施例中，存在至少(a)和(q)。在实施例中，存在至少(a)和(r)。在实施例中，存在至少(a)和(s)。在实施例中，存在至少(e)和(i)。在实施例中，存在至少(e)和(j)。在实施例中，存在至少(e)和(m)。在实施例中，存在至少(e)和(q)。在实施例中，存在至少(e)和(r)。在实施例中，存在至少(e)和(s)。在实施例中，存在至少(i)和(j)。在实施例中，存在至少(i)和(m)。在实施例中，存在至少(i)和(q)。在实施例中，存在至少(i)和(r)。在实施例中，存在至少(i)和(s)。在实施例中，存在至少(j)和(m)。在实施例中，存在至少(j)和(q)。在实施例中，存在至少(j)和(r)。在实施例中，存在至少(j)和(s)。在实施例中，存在至少(m)和(q)。在实施例中，存在至少(m)和(r)。在实施例中，存在至少(m)和(s)。在实施例中，存在至少(q)和(r)。在实施例中，存在至少(q)和(s)。在实施例中，存在至少(r)和(s)。

在实施例中，存在至少：

(a)和(b)、(a)和(c)、(a)和(d)、(a)和(e)、(a)和(f)、(a)和(g)、(a)和(h)、(a)和(i)、(a)和(j)、(a)和(k)、(a)和(l)、(a)和(m)、(a)和(n)、(a)和(o)、(a)和(p)、(a)和(q)、(a)和(r)、(a)和(s)、(a)和(t)、(a)和(u)、(a)和(v)、(a)和(w)，

(b)和(c)、(b)和(d)、(b)和(e)、(b)和(f)、(b)和(g)、(b)和(h)、(b)和(i)、(b)和(j)、(b)和(k)、(b)和(l)、(b)和(m)、(b)和(n)、(b)和(o)、(b)和(p)、(b)和(q)、(b)和(r)、(b)和(s)、(b)和(t)、(b)和(u)、(b)和(v)、(b)和(w)，

(c)和(d)、(c)和(e)、(c)和(f)、(c)和(g)、(c)和(h)、(c)和(i)、(c)和(j)、(c)和(k)、(c)和(l)、(c)和(m)、(c)和(n)、(c)和(o)、(c)和(p)、(c)和(q)、(c)和(r)、(c)和(s)、(c)和(t)、(c)和(u)、(c)和(v)、(c)和(w)，

(d)和(e)、(d)和(f)、(d)和(g)、(d)和(h)、(d)和(i)、(d)和(j)、(d)和(k)、(d)和(l)、(d)和(m)、(d)和(n)、(d)和(o)、(d)和(p)、(d)和(q)、(d)和(r)、(d)和(s)、(d)和(t)、(d)和(u)、(d)和(v)、(d)和(w)，

(e)和(f)、(e)和(g)、(e)和(h)、(e)和(i)、(e)和(j)、(e)和(k)、(e)和(l)、(e)和(m)、(e)和(n)、(e)和(o)、(e)和(p)、(e)和(q)、(e)和(r)、(e)和(s)、(e)和(t)、(e)和(u)、(e)和(v)、(e)和(w)，

(f)和(g)、(f)和(h)、(f)和(i)、(f)和(j)、(f)和(k)、(f)和(l)、(f)和(m)、(f)和(n)、(f)和(o)、(f)和(p)、(f)和(q)、(f)和(r)、(f)和(s)、(f)和(t)、(f)和(u)、(f)和(v)、(f)和(w)，

(g)和(h)、(g)和(i)、(g)和(j)、(g)和(k)、(g)和(l)、(g)和(m)、(g)和(n)、(g)和(o)、(g)和(p)、(g)和(q)、(g)和(r)、(g)和(s)、(g)和(t)、(g)和(u)、(g)和(v)、(g)和(w)，

(h)和(i)、(h)和(j)、(h)和(k)、(h)和(l)、(h)和(m)、(h)和(n)、(h)和(o)、(h)和(p)、(h)和(q)、(h)和(r)、(h)和(s)、(h)和(t)、(h)和(u)、(h)和(v)、(h)和(w)，

(i)和(j)、(i)和(k)、(i)和(l)、(i)和(m)、(i)和(n)、(i)和(o)、(i)和(p)、(i)和(q)、(i)和(r)、(i)和(s)、(i)和(t)、(i)和(u)、(i)和(v)、(i)和(w)，

(j)和(k)、(j)和(l)、(j)和(m)、(j)和(n)、(j)和(o)、(j)和(p)、(j)和(q)、(j)和(r)、(j)和(s)、(j)和(t)、(j)和(u)、(j)和(v)、(j)和(w)，

(k)和(l)、(k)和(m)、(k)和(n)、(k)和(o)、(k)和(p)、(k)和(q)、(k)和(r)、(k)和(s)、(k)和(t)、(k)和(u)、(k)和(v)、(k)和(w)，

(l)和(m)、(l)和(n)、(l)和(o)、(l)和(p)、(l)和(q)、(l)和(r)、(l)和(s)、(l)和(t)、(l)和(u)、(l)和(v)、(l)和(w)，

(m)和(n)、(m)和(o)、(m)和(p)、(m)和(q)、(m)和(r)、(m)和(s)、(m)和(t)、(m)和(u)、(m)和(v)、(m)和(w)，

(n)和(o)、(n)和(p)、(n)和(q)、(n)和(r)、(n)和(s)、(n)和(t)、(n)和(u)、(n)和(v)、(n)和(w)，

(o)和(p)、(o)和(q)、(o)和(r)、(o)和(s)、(o)和(t)、(o)和(u)、(o)和(v)、(o)和(w)，

(p)和(q)、(p)和(r)、(p)和(s)、(p)和(t)、(p)和(u)、(p)和(v)、(p)和(w)，

(q)和(r)、(q)和(s)、(q)和(t)、(q)和(u)、(q)和(v)、(q)和(w)，

(r)和(s)、(r)和(t)、(r)和(u)、(r)和(v)、(r)和(w)，

(s)和(t)、(s)和(u)、(s)和(v)、(s)和(w)，

(t)和(u)、(t)和(v)、(t)和(w)，

(u)和(v)、(u)和(w)，或

(v)和(w)。

在实施例中，靶标不是感染性组分，例如不是细菌组分、病毒组分、真菌组分或寄生组分。在实施例中，第一外源性多肽包含自身抗原。在实施例中，第一外源性多肽的表面暴露部分结合靶标。在实施例中，第二外源性多肽的表面暴露部分包含酶活性，例如蛋白酶活性。在实施例中，第二外源性多肽的表面暴露部分酶促修饰(例如，切割)靶标。在实施例中，靶标包含自身抗体，第一外源性多肽包含自身抗原，并且第二外源性多肽包含切割自身抗体以产生Fab部分和Fc部分的蛋白酶。在实施例中，去核红细胞能够以比在其他方面类似的缺乏第二外源性多肽的去核红细胞更快的速率从受试者的身体中清除靶标。在实施例中，去核红细胞与靶标或作用于靶标的第二外源性蛋白的反应产物(例如，在切割期间)进行复合。

在某些方面，本披露还提供了去核类红细胞，其包含：

第一外源性多肽，其包含跨膜结构域和能够结合自身抗体的表面暴露自身抗原，和

第二外源性多肽，其包含跨膜结构域和表面暴露IdeS多肽。

在一些方面，本披露还提供了多肽，其包含可以切割抗体的蛋白酶(例如，IdeS多肽)和膜锚定结构域(例如，跨膜结构域，例如I型或II型红细胞跨膜结构域)。本披露还提供了编码所述多肽的核酸。

在一些方面，本披露还提供了核酸，其包含：

编码可以切割抗体的蛋白酶(例如，IdeS多肽)的第一序列，

编码膜锚定结构域(例如，跨膜结构域)的第二序列，其中第一和第二序列可操作地连接以形成融合蛋白；以及

任选地，在类红细胞中有活性的启动子序列。

在一些方面，本披露还提供了核酸组合物，其包含：

编码与靶标相互作用的第一外源性多肽(例如，本文所述的第一外源性多肽)的第一核酸序列，

编码修饰靶标的第二外源性多肽的第二核酸序列，例如本文所述的第二核酸序列，以及

任选地，在类红细胞中有活性的启动子序列。

在实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列是连续的或者是分开的分子(例如，混合的分子或在分开的容器中)。在实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列是同一开放阅读框的一部分并且具有位于其间的蛋白酶切割位点。在实施例中，第一核酸可操作地连接至第一启动子，并且第二核酸可操作地连接至第二启动子。

在一些方面，本披露提供了试剂盒，其包含：

(A)编码与(A-ii)膜锚定结构域(例如，跨膜结构域)融合的(A-i)多个结合部分(例如，抗体分子，例如scFv结构域)的核酸，其中(A-i)和(A-ii)与指导在类红细胞中的表达的核酸可操作地连接；以及

(B)编码任选地与(B-ii)膜锚定结构域(例如，跨膜结构域)融合的(B-i)多种酶(例如，蛋白酶)的核酸，其中(B-i)和(B-ii)与指导在类红细胞中的表达的核酸可操作地连接。

在一些方面，本披露提供了制备靶标片段(例如，靶多肽)的方法，例如制备包含第一靶结构域的靶标片段的方法，例如制备可变区片段的方法，或制备含恒定区的片段的方法，该方法包括使靶多肽与本文所述的类红细胞进行接触。在实施例中，第二外源性多肽切割靶标以提供片段。在实施例中，靶多肽是抗体，例如自身抗体。在实施例中，靶多肽的片段结合自身抗原而不激活免疫应答和/或炎症。在实施例中，接触包括向包含靶多肽的受试者给予类红细胞。

在某些方面，本披露还提供了制备抑制剂(例如，竞争性抑制剂)的方法，该方法包括例如使抑制剂的前体(靶标)与本文所述的类红细胞进行接触。在实施例中，第二外源性多肽与靶标相互作用，例如切割靶标。在实施例中，抑制剂是抗体片段(例如，Fab片段)。在实施例中，靶标是被切割以产生抑制剂的抗体，该抑制剂是抗体片段(例如，Fab片段)。在实施例中，抑制剂结合自身抗原而不激活免疫应答和/或炎症。在实施例中，抑制剂的前体是抗体，例如自身抗体。在实施例中，接触包括向包含抑制剂的前体的受试者给予类红细胞。

在一些方面，本披露还提供了转化或激活靶标(例如，多肽)，例如将前药转化成药物的方法，该方法包括使多肽与本文所述的类红细胞进行接触。在实施例中，第二外源性多肽与靶标(例如，前药)相互作用，例如切割靶标。在实施例中，前药是抗体，例如自身抗体。在实施例中，药物是抗体片段，例如Fab片段。在实施例中，药物结合自身抗原而不激活免疫应答和/或炎症。在实施例中，接触包括向包含多肽(例如，前药)的受试者给予类红细胞。

在一些方面，本披露还提供了将内源性多肽从第一活性状态转换到第二活性状态(例如，从无活性状态转换到活性状态，或活性状态转换到无活性状态)的方法，该方法包括使内源性多肽与本文所述的类红细胞进行接触。在实施例中，第二外源性多肽与靶标相互作用，例如共价修饰(例如，切割)靶标，或改变其与另一分子相互作用(例如，结合)的能力。在实施例中，内源性多肽是抗体，例如自身抗体。在实施例中，接触包括向包含内源性多肽的受试者给予类红细胞。

在一些方面，本披露提供了降低受试者中靶标(例如，抗体，例如自身抗体)的水平的方法，该方法包括向受试者给予本文所述的类红细胞。在实施例中，第二外源性多肽与靶标相互作用，例如共价修饰(例如，切割)靶标，或改变其与另一分子相互作用(例如，结合)的能力。在某些方面，本披露还提供了在受试者中产生抗体的抑制性片段(例如，Fab片段)的方法，该方法包括向受试者给予本文所述的红细胞。另外，本披露提供了治疗受试者的自身免疫性疾病的方法，该方法包括向受试者给予本文所述的类红细胞。

在实施例(例如，上述任何方法的实施例)中，类红细胞包含：

与靶标相互作用的第一外源性多肽，和

修饰靶标的第二外源性多肽；

其中以下中的一个或多个：

(a)第二外源性多肽包含切割抗体的部分，例如在铰链区、CH2区或在铰链和CH2区之间切割的部分，例如IdeS多肽；

(b)第二外源性多肽包含修饰靶标(例如，对靶标上的位点有特异性，例如与靶标上的位点结合)、结合(例如，特异性地)并修饰(例如，共价修饰，例如切割)靶标、或去除靶标或将部分连接至靶标的酶(例如，蛋白酶)，其中靶标任选地是抗体或补体因子；

(c)第二外源性多肽包含修饰靶标的二级、三级或四级结构，并且在实施例中，改变(例如，降低或增加)靶标与另一分子(例如，第一外源性多肽或不同于第一外源性多肽的分子)相互作用的能力的多肽，例如酶，例如蛋白酶，其中任选地靶标包含抗体或补体因子；

(d)第二外源性多肽包含在第一靶结构域和第二靶结构域(例如，结合第一底物的第一靶结构域和结合第二底物的第二靶结构域)之间切割靶标(例如，多肽)的多肽，例如酶(例如，蛋白酶)；

(e)靶标是多肽(例如，自身抗体或补体因子)；碳水化合物(例如，聚糖)，脂质(例如，磷脂)或核酸(例如，DNA或RNA)；

(f)第一外源性多肽结合靶标(例如，抗体)但不切割键，例如共价键，例如抗体中的共价键，并且第二外源性多肽切割键，例如共价键，例如抗体中的共价键；

(g)靶标包含抗体并且第一外源性多肽结合抗体靶标的可变区；

(h)靶标包含抗体并且第一外源性多肽结合抗体靶标的恒定区；

(i)第一外源性多肽对靶标的亲和力为约1-2pM、2-5pM、5-10pM、10-20pM、20-50pM、50-100pM、100-200pM、200-500pM、500-1000pM、1-2nM、2-5nM、5-10nM、10-20nM、20-50nM、50-100nM、100-200nM、200-500nM、500-1000nM、1-2μM、2-5μM、5-10μM、10-20μM、20-50μM或50-100μM；

(j)第二外源性多肽对靶标的KM为约10^-1-10^-7M、10^-1-10^-2M、10^-2-10^-3M、10^-3-10^{- 4}M、10^-4-10^-5M、10^-5-10^-6M或10^-6-10^-7M；

(k)第一外源性多肽对靶标的K_d(以M测量)除以第二外源性多肽对靶标的K_M(以M测量)的比率为约1x10^-9–2x10^-9、2x10^-9–5x10^-9、5x10^-9–1x10^-8、1x10^-8–2x10^-8、2x10^-8–5x10^-8、5x10^-8–1x10^-7、1x10^-7–2x10^-7、2x10^-7–5x10^-7、5x10^-7–1x10^-6、1x10^-6–2x10^-6、2x10^-6–5x10^-6、5x10^-6–1x10^-5、1x10^-5–2x10^-5、2x10^-5–5x10^-5、5x10^-5–1x10^-4、1x10^-4–2x10^-4、2x10^-4–5x10^-4、5x10^-4–1x10^-3、1x10^-3–2x10^-3、2x10^-3–5x10^-3、5x10^-3–1x10^-2、1x10^-2–2x10^-2、2x10^-2–5x10^-2、5x10^-2–1x10^-1、1x10^-1–2x10^-1、2x10^-1–5x10^-1或5x10^-1–1；

(l)观察到的修饰靶标的第二外源性多肽的反应速率大于在其他方面类似的反应条件下相似但缺乏第一外源性多肽的去核细胞的反应速率；

(m)类红细胞上第一外源性多肽的平均数与类红细胞上第二外源性多肽的平均数的比率为约50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:20或1:50；

(n)第一外源性多肽对靶标的亲和力大于第一外源性多肽对修饰的(例如，切割的)靶标的亲和力；

(o)去核类红细胞的治疗有效剂量小于给予时在受试者外周血中的靶标的量的化学计量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(p)有效剂量的去核类红细胞的数量小于给予时在受试者外周血中的靶标(例如，靶分子)的数量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(q)由预选量的去核类红细胞(例如，有效剂量的去核类红细胞)包含的第二外源性多肽的数量小于靶标的参考值，例如小于给予时在受试者外周血中的靶标的数量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(r)由预选量的去核类红细胞(例如，有效剂量的去核类红细胞)包含的第一外源性多肽的数量小于靶标的参考值，例如小于给予时在受试者外周血中的靶标的数量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(s)由预选量的去核类红细胞(例如，有效剂量的去核类红细胞)包含的第一外源性多肽的数量和第二外源性多肽的数量各自小于靶标的参考值，例如小于给予时在受试者外周血中的靶标的数量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(t)第二外源性多肽以至少10^-1M、10^-2M、10^-3M、10^-4M、10^-5M、10^-6M或10^-7M的K_M修饰(例如切割)靶标；

(u)第二外源性多肽包含伴侣蛋白；

(v)第一外源性多肽包含表面暴露部分，并且第二外源性多肽包含表面暴露部分；或

(w)去核类红细胞的有效量小于在其他方面类似的缺乏第二外源性多肽的去核类红细胞的有效量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)。

在本文所述的涉及外源性多肽(例如，融合蛋白)的任何组合物和方法的一些实施例中：

i)在类红细胞表面上的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白具有相同的序列，

ii)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白具有相同的跨膜区，

iii)融合蛋白不包括全长内源性膜蛋白，例如包含全长内源性膜蛋白的区段，该区段缺少全长内源性膜蛋白的至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、200或500个氨基酸；

iv)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白彼此之间相差不超过1、2、3、4、5、10、20或50个氨基酸，

v)外源性多肽缺乏分选酶转移标记，

vi)外源性多肽包含存在于少于1、2、3、4或5种序列不同的融合多肽上的部分；

vii)外源性多肽作为单一融合多肽而存在；

viii)融合蛋白在内源性跨膜蛋白和部分的连接处不含有Gly-Gly；

ix)融合蛋白不含有Gly-Gly，或融合蛋白不含有Gly-Gly或不含有胞外区中的Gly-Gly，不含有在跨膜区段的1、2、3、4、5、10、20、50或100个氨基酸内的胞外区中的Gly-Gly；或其组合。

本文所述的细胞体系可以与另一种(一种或多种)自身免疫疗法或抗炎剂组合使用。这样的疗法和药剂包括类固醇，例如皮质类固醇(例如，甲泼尼龙、泼尼松龙、氢化可的松、可的松、地塞米松、倍他米松、曲安西龙)；或干扰素，例如干扰素β-1。

本披露考虑了任何一个或多个前述方面和/或实施例的所有组合，以及在具体实施方式和实例中提出的任何一个或多个实施例的组合。

尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但是在下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考(例如，序列数据库参考号)通过引用以其全文而结合。例如，本文提及的所有GenBank、Unigene和Entrez序列(例如，在本文的任一表中)均通过引用而结合。除非另外指明，否则本文指定的序列登录号(包括本文任一表中)是指截至2016年1月11日的数据库条目。当一个基因或蛋白质参考多个序列登录号时，涵盖所有的序列变体。

附图说明

图1是显示通过流式细胞术测量的拉吉(Raji)细胞凋亡测定结果的一组图。将拉吉细胞进行CFSE标记并与未经转导的(对照)和经单个或多个TRAIL变体转导的分化的类红细胞共培养或与两种不同的单转导细胞共培养。通过作为拉吉(CFSE+)和膜联蛋白V+的细胞的百分比确定细胞凋亡百分比。(顶部)各种条件的CFSE和膜联蛋白V染色的流式细胞术图。(底部)各种条件的细胞凋亡百分比图。

图2是显示在孵育5小时之前或之后，来自对照类红细胞(UNT)或用抗兔Fc荧光标记抗体标记的表达IdeS的类红细胞(IDES)的平均荧光强度的条形图。

图3是显示来自对照细胞(UNT)或表达Ide-S的细胞(IdeS-RCT)的上清液中的靶抗体的完整重链或重链片段的蛋白质印迹。箭头表示重链(Hc)、重链片段(Hc片段)和轻链(Lc)。

图4是包含第一外源性多肽(白色)、第二外源性多肽(画影线)和第三外源性多肽(封闭画影线)的类红细胞的图，其中每种外源性多肽包含能够诱捕靶标(例如，不需要的靶标)的捕获剂。类红细胞可以进行双重诱捕，在它使用多于一种外源性多肽来结合单个或多个可溶性因子的情况下。

图5是包含第一外源性多肽和第二外源性多肽的类红细胞的图，其中每种外源性多肽能够诱捕抗体，例如不需要的抗体。

图6是包含结合靶标(例如，抗体，例如不需要的抗体)的第一外源性多肽和修饰靶标(例如，切割靶标)的第二外源性多肽的类红细胞的图。第二外源性多肽可以包含蛋白酶，如IdeS。

图7是包含结合靶标(例如，对药物治疗做出反应由受试者产生的不需要的抗药物抗体)的第一外源性多肽、切割靶标的第二外源性多肽和包含治疗性蛋白(例如，受试者对其产生抗药物抗体的药物的替代物)的任选的第三外源性多肽的类红细胞的图。

图8是包含具有治疗活性的第一外源性多肽、抑制第一外源性多肽的第二外源性多肽和任选地包含靶向剂(例如，抗CD20抗体分子)的第三外源性多肽的类红细胞的图。

图9是包含具有第一靶向剂(例如，抗VCAM抗体分子)的第一外源性多肽和具有第二靶向剂(例如，抗E-选择素抗体分子)的第二外源性多肽的类红细胞的图。第一或第二外源性多肽中的一者或两者可用于将类红细胞靶向发炎组织。

图10是包含拮抗剂和/或激动剂的类红细胞的图。

图11是包含靶向剂(例如，抗CD4抗体分子)和内部有效载荷(例如，IDO)的类红细胞的图。

图12是包含含有靶向剂(例如，抗MAdCAM-1抗体分子)的第一外源性多肽和含有靶标的激动剂(例如，其中激动剂包含IL10并且靶标包含IL10受体)的第二外源性多肽的类红细胞的图。

图13是包含含有靶向剂(例如，抗BCMA抗体分子)的第一外源性多肽和含有捕获剂的第二外源性多肽的类红细胞的图。

图14是包含含有靶向剂(例如，AQP4表位)的第一外源性多肽和促进给定活性(例如，细胞凋亡)的第二外源性多肽(例如，TRAIL)的类红细胞的图。

具体实施方式

定义

如本文所用，术语“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如双特异性抗体分子。抗体分子的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、由抗体片段形成的多特异性抗体(如包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)、抗体的分离表位结合片段、大型抗体(maxibody)、迷你抗体(minibody)、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv。

如本文所用，“组合疗法”或“组合地给予”意指将两种(或更多种)不同药剂或治疗给予受试者作为特定疾病或病症的治疗方案的一部分。治疗方案包括给予每种药剂使得独立药剂对受试者的效果重合的剂量和周期。在一些实施例中，同时或并行递送这两种或更多种药剂，且这些药剂可以共同配制。在其他实施例中，这两种或更多种药剂不是共同配制，而是按顺序方式给予作为规定方案的一部分。在一些实施例中，组合地给予两种或更多种药剂或治疗，使得症状或与障碍相关的其他参数的下降大于单独递送一种药剂或治疗或没有另一者将观察到的结果。两种治疗的效果可以部分累加、完全累加或大于累加(例如，协同)。顺序或基本上同时给予各治疗剂可以通过包括但不限于口服途径、静脉内途径、肌肉内途径以及通过粘膜组织直接吸收的任何适当途径来实现。可以通过相同途径或通过不同途径给予治疗剂。例如，可以通过静脉注射给予该组合的第一治疗剂，同时可以口服地给予该组合的第二治疗剂。

术语“协调的”或“协调方式”意指多种药剂一起工作以提供治疗益处。协调活性的类型包括药剂累加、药剂协同、倍增、独立功能、基于定位、邻近依赖、基于支架、基于多聚体和补偿活性。在一个实施例中，由在相同的去核RBC中递送的多种外源性多肽赋予的治疗益处的水平大于如果所述多种多肽中的每一种从不同的去核RBC中递送将会看到的水平。

如本文所用，“去核的”是指缺乏核的细胞，例如，通过分化成成熟红细胞而失去其核的细胞。

如本文所用，术语“外源性多肽”是指不由该类型的野生型细胞产生或以在野生型细胞中比在含有外源性多肽的细胞中更低的含量存在的多肽。在一些实施例中，外源性多肽是由被引入细胞的核酸编码的多肽，该核酸任选地不被该细胞保留。

如本文所用，术语“多模式疗法”是指提供多种(例如，2、3、4或5种或更多种)具有协调功能(例如，药剂累加、药剂协同、倍增、独立功能、基于定位、邻近依赖、基于支架、基于多聚体、或补偿活性)的外源性药剂(例如，多肽)的疗法，例如去核红细胞疗法。

如本文所用，术语“途径”或“生物途径”是指以顺序方式一起起作用的多种生物分子，例如多肽。途径的实例包括信号转导级联和补体级联。在一些实施例中，途径从检测到胞外信号开始，并以靶基因转录的变化结束。在一些实施例中，途径从检测到胞质信号开始，并以靶基因转录的变化结束。途径可以是线性或分支的。如果是分支的，则可以具有多个输入(会聚)或多个输出(发散)。

如本文所用，“邻近依赖”分子是指当与第二分子接近时比单独时具有不同(例如，更大)活性的第一分子。在一些实施例中，一对邻近依赖配体在配体邻近时比当它们彼此远离时更强烈地激活下游因子。

如本文所用，“受体组分”是指单独或作为复合物的一部分起到作为受体的作用的多肽。因此，受体组分涵盖多肽受体和起到作为一部分受体复合物的作用的多肽。

术语“协同”或“协同的”意指两种或更多种药剂(例如，作为去核红细胞的一部分的多肽)的组合相比于其单独作用的高于累加的效应。在某些实施例中，与包含第一多肽的去核红细胞和包含第二多肽的去核红细胞的作用相比，协同活性是包含第一多肽和第二多肽的去核红细胞的高于累加的效应。在一些实施例中，当第一药剂产生可检测水平的输出X，第二药剂产生可检测水平的输出X并且第一和第二药剂一起产生高于累加水平的输出X时，存在协同活性。

如本文所用，术语多肽的“变体”是指与该多肽相比具有至少一个序列差异的多肽，例如一个或多个取代、插入或缺失。在一些实施例中，变体与该多肽具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体包括片段。在一些实施例中，与全长多肽相比，片段在N-末端、C-末端或二者(各自独立地)上缺少多达1、2、3、4、5、10、20或100个氨基酸。

示例性外源性多肽及其用途

在实施例中，本文所述的红细胞治疗剂包含一种或多种(例如，2、3、4、5、6、10种或更多种)不同的外源性药剂，例如外源性多肽、脂质或小分子。在一些实施例中，红细胞治疗剂包含含有本文所述的两种或更多种不同蛋白质的外源性融合多肽。在一些实施例中，去核红细胞(例如，网织红细胞)包含本文所述的两种或更多种不同的外源性多肽。在一些实施例中，一种或多种(例如，全部)外源性多肽是人多肽或其片段或变体。

在一些实施例中，这两种或更多种多肽作用于相同的靶标，并且在其他实施例中，它们作用于两种或更多种不同的靶标。在一些实施例中，单个靶标或多个靶标选自内源性人蛋白或可溶性因子(例如，多肽、小分子或无细胞核酸)。

一种或多种外源性蛋白可以具有真核细胞(例如，哺乳动物细胞，例如人细胞)的翻译后修饰特征。在一些实施例中，一种或多种(例如，2、3、4、5种或更多种)外源性蛋白被糖基化、磷酸化或两者。使用改变的高碘酸-席夫(PAS)方法，在SDS-PAGE凝胶和蛋白质印迹上常规实现糖蛋白的体外检测。可以利用本领域已知的凝集素荧光缀合物来完成糖蛋白的细胞定位。可以使用磷酸特异性抗体通过蛋白质印迹来评估磷酸化。

翻译后修饰还包括与疏水基团缀合(例如，豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、异戊烯化或糖基磷脂酰肌醇化)，与辅因子缀合(例如，脂化黄素部分(例如，FMN或FAD)、血红素C附着、磷酸泛酰巯基乙胺基化(phosphopantetheinylation)、或亚视黄基席夫碱形成)，白喉酰胺形成，乙醇胺磷酸甘油附着，羟丁赖氨酸(hypusine)形成，酰化(例如，O-酰化、N-酰化或S-酰化)，甲酰化，乙酰化，烷基化(例如，甲基化或乙基化)，酰胺化，丁酰化，γ-羧基化，丙二酰化，羟基化，碘化，核苷酸添加如ADP-核糖基化，氧化，磷酸酯(O-连接)或氨基磷酸酯(N-连接)形成(例如，磷酸化或腺苷酰化)，丙酰化，焦谷氨酸酯形成，S-谷胱甘肽化，S-亚硝基化，琥珀酰化，硫酸化，ISG化，SUMO化，泛素化，类泛素化(Neddylation)或氨基酸的化学修饰(例如，瓜氨酸化、脱酰胺化、消去化(eliminylation)或氨甲酰化)，二硫键的形成，外消旋化(例如，脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸的外消旋化)。在实施例中，糖基化包括向精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、羟赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或色氨酸添加糖基基团，从而产生糖蛋白。在实施例中，糖基化包括例如O-连接的糖基化或N-连接的糖基化。

在一些实施例中，一种或多种外源性多肽是融合蛋白，例如是与内源性红细胞蛋白或其片段(例如，跨膜蛋白，例如GPA或其跨膜片段)的融合物。在一些实施例中，一种或多种外源性多肽与促进二聚化或多聚化的结构域融合，例如与任选地包含二聚化结构域的第二融合外源性多肽融合。在一些实施例中，二聚化结构域包含抗体分子的一部分，例如Fc结构域或CH3结构域。在一些实施例中，第一和第二二聚化结构域包含突出物入孔(knob-in-hole)突变(例如，T366Y突出物和Y407T孔)以促进异源二聚化。

示例性人多肽，例如选自表1-6中任一个的人多肽，包括：

a)天然存在形式的人多肽，例如与疾病状态无关的天然存在形式的人多肽；

b)具有在2017年1月11日出现在数据库(例如，GenBank数据库)中的序列的人多肽，例如与疾病状态无关的天然存在形式的、具有在2017年1月11日出现在数据库(例如，GenBank数据库)中的序列的人多肽；

c)具有与a)或b)的序列相差不超过1、2、3、4、5或10个氨基酸残基的序列的人多肽；

d)具有与a)或b)的序列相差不超过1％、2％、3％、4％、5％或10％的其氨基酸残基的序列的人多肽；

e)具有与a)或b)的序列基本没有差异的序列的人多肽；或

f)具有c)、d)或e)的序列的人多肽，其在生物学活性(例如，酶活性(例如，特异性或周转)或结合活性(例如，结合特异性或亲和力))上与具有a)或b)的序列的人多肽基本上没有差异。可以制备f)下的候选肽并且如本文所述筛选其类似活性，并且如果如本文所述在去核RBC中表达，则其在下文将是等同的。

在实施例中，外源性多肽包含人多肽或其片段，例如先前段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)中的人多肽的全部或片段。在一个实施例中，外源性多肽包含融合多肽，该融合多肽包含前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)中的人多肽的全部或片段以及另外的氨基酸序列。在一个实施例中，另外的氨基酸序列包含针对不同人多肽的前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)中的人多肽的全部或片段。

本发明考虑了可以制备其功能片段或变体(例如，表1、2或3中列出的受体的配体结合片段或其变体或表4中列出的抗原)，并如本文所述筛选其类似活性，并且如果如本文所述在去核RBC中表达，则其在下文将是等同的。

在实施例中，如本文所述，这两种或更多种外源性药剂(例如，多肽)具有相关的功能，这些功能是药剂累加的、药剂协同的、倍增的、独立功能的、基于定位的、邻近依赖的、基于支架的、基于多聚体的、或补偿的。在一些实施例中，多于一个的这些描述符适用于给定的RBC。

药剂累加配置

当两种或更多种药剂(例如，多肽)是药剂累加的时，这些药剂一起作用的效果大于任一药剂单独作用的效果。在一个实施例中，两种药剂在RBC中(例如，在RBC表面上)具有不同的(例如，互补的)功能并且一起起作用以具有更强的效果(与任一单独起作用的药剂相比)，例如对靶标具有更高的结合亲和力，或者靶标(例如，单个靶标)对信号转导的更大程度的调节。在一些实施例中，两种或更多种药剂各自结合相同的靶标，例如结合相同靶蛋白内的不同表位。

在一个实施例中，这些药剂彼此缔合，例如是异源二聚体复合物的成员。在一个实施例中，与单独作用时相比，这些药剂在共同作用时对靶标具有更高的亲合力。

在一些实施例中，这两种或更多种药剂比单独任一药剂能够更紧密地结合靶标。在一些实施例中，受体组分(例如，细胞因子受体组分，例如白细胞介素受体组分，例如IL-1受体组分)的异源二聚体以比任一单独受体组分更高的亲和力结合靶标(例如，IL-1)。许多信号转导分子在细胞表面形成异源二聚体或异源多聚体以结合其配体。细胞因子受体例如可以是异源二聚体或异源多聚体。例如，IL-2受体包含三种不同的分子：IL2Ra、IL2Rb和IL2Rg。IL-13受体是IL13Ra和IL4R的异源二聚体。Il-23受体是IL23R和IL12Rb1的异源二聚体。在实施例中，TNFa是TNFR1和TNFR2的异源二聚体。不希望受理论束缚，在疾病的某些情况下，例如在炎性疾病或败血症中，可能希望结合细胞因子并从循环中清除细胞因子。在实施例中，这通过给予同时表达靶分子的一种或多种(例如，2种或3种)受体的红细胞(例如，网织红细胞)来实现。例如，为了治疗银屑病，被工程化以表达IL23R和IL12Rb1的红细胞(例如，网织红细胞)结合并螯合IL-23(该疾病的炎症介质)。本文如表1提供了细胞因子及其受体的表格。在一些实施例中，这些药剂是结合细胞因子(例如，表1的一种或多种细胞因子)的抗体分子。在一些实施例中，去核RBC包含来自表1的一个或多个(例如，2、3、4、5个或更多个)细胞因子受体亚单位或其细胞因子结合变体或片段。在一些实施例中，去核RBC包含来自表1的单行的两个或三个(例如，全部)细胞因子受体亚单位或其细胞因子结合变体或功能片段。细胞因子受体可以存在于RBC的表面上。表达的受体典型地具有能够结合并螯合其靶配体的野生型人受体序列或其变体或片段。在实施例中，两个或更多个细胞因子受体亚单位彼此连接，例如作为融合蛋白。

在一些实施例中，第一多肽包含细胞因子或其片段或变体，例如表1的细胞因子或其片段或变体。在实施例中，第二多肽包含第二细胞因子或其片段或变体，例如表1的细胞因子或其片段或变体。在实施例中，一种或多种(例如，2种或全部)细胞因子与跨膜结构域(例如，GPA跨膜结构域或本文所述的其他跨膜结构域)融合，例如使得细胞因子位于类红细胞的表面上。在实施例中，类红细胞进一步包含靶向部分，例如本文图12或本文标题为“定位配置”的部分中描述的靶向部分。在一些实施例中，包含多种细胞因子的类红细胞用于治疗自身免疫性疾病，例如SLE。

表1.细胞因子和受体

在一些实施例中，这些药剂是不同的抗体结合分子，例如Fc结合分子，用于捕获循环中的抗体。在实施例中，这些药剂彼此是非竞争的以实现单独抗体或调理颗粒的更高亲和力结合。例如，在实施例中，一种或多种药剂选自蛋白A、Fc受体1(FcR1)、FcR2a、FcR2b、FcR3、FcR4、FcRn(新生儿Fc受体)或其抗体结合片段或变体。在实施例中，一种或多种药剂选自自身抗原或自身抗体结合片段或其变体、或结合自身抗体的抗独特型抗体分子。在实施例中，去核RBC用于治疗自身免疫性疾病。

去核类红细胞可以包含与靶标(例如，自身抗体)相互作用的第一外源性多肽(例如，自身抗原)和修饰靶标的第二外源性多肽(例如，蛋白酶，例如IdeS)。在实施例中，类红细胞被给予受试者，例如患有表4的自身免疫性障碍的受试者。

在实施例中，包含第一外源性多肽和第二外源性多肽的去核类红细胞的有效量小于在其他方面类似的缺乏第一外源性多肽或缺乏第二外源性多肽的去核类红细胞的有效量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)。在实施例中，预选量是去核类红细胞的有效剂量或体外有效量。在实施例中，预选量(例如，体外有效量)是在测定中例如有效于将至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的底物在预选时间量(例如，1、2、3、4、5或6小时)内转化为产品的量。在实施例中，预选量(例如，体外有效量)在5小时内有效切割至少50％的靶抗体。测定可以测量例如在溶液中可溶、未修饰的(例如，未切割的)靶标的水平的降低。

在实施例中，靶标的参考值是在给予时受试者的外周血中的靶标的数量。在实施例(例如，涉及体外有效量的细胞的实施例)中，靶标的参考值是用于测定的反应混合物中靶标的数量。

第一外源性多肽(例如，自身抗原)

第一外源性多肽可以结合靶标。在实施例中，第一外源性多肽包含识别抗体(例如，自身抗体)的结合结构域。在实施例中，第一结构域包含自身抗原，例如包含结合自身抗体的全长蛋白或其片段。在实施例中，第一外源性多肽包含来自表4中的蛋白质的自身抗原，例如包含结合自身抗体的全长蛋白或其片段。

在实施例中，第一外源性多肽包含结合结构域(例如，能够结合自身抗体的自身抗原)和膜锚定结构域(例如，跨膜结构域，例如I型或II型红细胞跨膜结构域)。在实施例中，膜锚定结构域位于修饰剂(例如，蛋白酶)结构域的C-末端或N-末端。在实施例中，跨膜结构域包含GPA或其跨膜部分(例如，如本文SEQ ID NO:9所示或其跨膜部分)，或与任一上述项具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的多肽。在实施例中，GPA多肽位于结合结构域的C-末端。

在实施例中，第一外源性多肽包含WO 2007030708中(例如，在其中的第34-45页中)描述的寻址(address)部分或靶向部分，将该申请通过引用以其全文并入本文。

可以适合用作第一外源性多肽的蛋白质的其他实例包括受体的配体结合结构域，如在靶标是受体配体的情况下。相反，第一外源性多肽可以包含受体配体，在靶标是受体的情况下。靶配体可以是多肽或小分子配体。

在一个另外的实施例中，第一外源性多肽可以包含衍生自具有免疫球蛋白样折叠的多肽的结构域，如人纤连蛋白的第10个III型结构域(“Fn3”)。参见美国专利号6,673,901、6,462,189。Fn3是很小的(约95个残基)，单体的，可溶的且稳定的。它不具有允许在还原环境中改进稳定性的二硫键。该结构可以被描述为类似于Ab VH结构域的β-夹层，除了Fn3具有七个β链而不是九个。Fn3的每一端有三个环；并且这三个环的位置对应于VH结构域的CDR1、2和3的位置。94个氨基酸的Fn3序列是：

VSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITGYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:18)

CDR样环的氨基酸位置将被定义为残基23-30(BC环)、52-56(DE环)和77-87(FG环)。因此，一个或多个CDR样环可以被修饰或随机化，以产生Fn3结合结构域的文库，然后可以筛选其与所需寻址结合位点的结合。还参见PCT公开WO 0232925。Fn3是免疫球蛋白超家族(IgSF)的大亚族的一个实例。Fn3家族包括细胞粘附分子、细胞表面激素和细胞因子受体、伴侣蛋白和碳水化合物结合结构域，所有这些也都可以适合用作结合剂。此外，转录因子NF-kB的DNA结合结构域的结构也与Fn3折叠密切相关，并且也可以适合用作结合剂。类似地，血清白蛋白(如人血清白蛋白)含有可适合用作靶向部分的免疫球蛋白样折叠。

在仍其他实施例中，第一外源性多肽可以包含基于其动力学和结合寻址位点的选择性而选择的(例如，合成地进化的)工程化多肽序列。在实施例中，使用筛选或选择方法，例如通过噬菌体展示或酵母双杂合筛选来设计第一外源性多肽的序列。

在一些实施例中，第一外源性多肽包含可溶性受体的肽配体(并且任选地靶标包含可溶性受体)、结合靶标的合成肽、补体调节结构域(并且任选地靶标包含补体因子)、或细胞表面受体的配体(并且任选地靶标包含细胞表面受体)。

第二外源性多肽(例如，蛋白酶)

在实施例中，第二外源性多肽(其修饰靶标)是表5中列出的因子。在一些实施例中，蛋白酶是表5中列出的蛋白酶。在实施例中，蛋白酶是细菌蛋白酶、人蛋白酶、或植物蛋白酶、或其片段或变体。

在实施例中，第二外源性多肽(其修饰靶标)是蛋白酶。示例性蛋白酶包括分类为以下的那些蛋白酶：氨肽酶；二肽酶；二肽基-肽酶和三肽基肽酶；肽基-二肽酶；丝氨酸型羧肽酶；金属羧肽酶；半胱氨酸型羧肽酶；ω肽酶；丝氨酸蛋白酶；半胱氨酸蛋白酶；天冬氨酸蛋白酶；金属蛋白酶；或未知机制的蛋白酶。

氨肽酶包括细胞溶质氨肽酶(亮氨酰氨肽酶)、膜丙氨酰氨肽酶、半胱氨酰氨肽酶、三肽氨肽酶、脯氨酰氨肽酶、精氨酰氨肽酶、谷氨酰氨肽酶、x-pro氨肽酶、细菌亮氨酰氨肽酶、嗜热氨肽酶、梭菌氨肽酶、细胞溶质丙氨酰氨肽酶、赖氨酰氨肽酶、x-trp氨肽酶、色氨酰氨肽酶、甲硫氨酰氨肽酶、d-立体特异性氨肽酶以及氨肽酶。二肽酶包括x-his二肽酶、x-arg二肽酶、x-甲基-his二肽酶、cys-gly二肽酶、glu-glu二肽酶、pro-x二肽酶、x-pro二肽酶、met-x二肽酶、非立体特异性二肽酶、细胞溶质非特异性二肽酶、膜二肽酶和β-ala-his二肽酶。二肽基-肽酶和三肽基肽酶包括二肽基-肽酶I、二肽基-肽酶II、二肽基-肽酶III、二肽基-肽酶IV、二肽基-二肽酶、三肽基-肽酶I和三肽基-肽酶II。肽基-二肽酶包括肽基-二肽酶A和肽基-二肽酶B。丝氨酸型羧肽酶包括溶酶体pro-x羧肽酶、丝氨酸型D-ala-D-ala羧肽酶、羧肽酶C和羧肽酶D。金属羧肽酶包括羧肽酶A、羧肽酶B、赖氨酸(精氨酸)羧肽酶、gly-X羧肽酶、丙氨酸羧肽酶、胞壁酰五肽羧肽酶、羧肽酶H、谷氨酸羧肽酶、羧肽酶M、胞壁酰四肽羧肽酶、锌D-ala-D-ala羧肽酶、羧肽酶A2、膜pro-x羧肽酶、微管蛋白基(tubulinyl)-tyr羧肽酶和羧肽酶T。ω肽酶包括酰基氨基酰基-肽酶、肽基-甘氨酰胺酶、焦谷氨酰-肽酶I、β-天冬氨酰-肽酶、焦谷氨酰-肽酶II、正甲酰甲硫氨酰-肽酶、蝶酰聚[γ]-谷氨酸羧肽酶、γ-glu-X羧肽酶和酰基胞壁酰-ala-肽酶。丝氨酸蛋白酶包括胰凝乳蛋白酶、胰凝乳蛋白酶C、metridin、胰蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa、纤溶酶、肠肽酶、顶体蛋白、α-裂解蛋白酶、谷氨酰基、内肽酶、组织蛋白酶G、凝血因子VIIa、凝血因子IXa、cucumisi、脯氨酰寡肽酶、凝血因子XIa、brachyurin、血浆激肽释放酶、组织激肽释放酶、胰弹性蛋白酶、白细胞弹性蛋白酶、凝血因子XIIa、糜酶、补体成分clr55、补体成分cls55、经典补体途径c3/c5转化酶、补体因子I、补体因子D、替代补体途径c3/c5转化酶、干酵母菌、皮蝇素C、赖氨酰内肽酶、内肽酶1a、γ-肾素、venombin AB、亮氨酰内肽酶、类胰蛋白酶、黄岑素(scutelarin)、kexin、枯草杆菌蛋白酶、水稻素(oryzin)、内肽酶K、thermomycolin、嗜热蛋白酶、内肽酶SO、T-纤溶酶原激活物、蛋白C、胰内肽酶E、胰弹性蛋白酶II、IGA特异性丝氨酸内肽酶、U-纤溶酶原、活化剂、venombin A、弗林蛋白酶、成髓细胞素、semenogelase、颗粒酶A或细胞毒性T淋巴细胞蛋白酶1、颗粒酶B或细胞毒性T淋巴细胞蛋白酶2、streptogrisin A、treptogrisin B、谷氨酰内肽酶II、寡肽酶B、鲎凝血因子C、鲎凝血因子、鲎凝血酶、omptin、阻遏物lexa、细菌前导肽酶I、以及togavirin、flavirin。半胱氨酸蛋白酶包括组织蛋白酶B、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、萝蘼蛋白酶、梭菌蛋白酶、streptopain、锕系元素、组织蛋白酶1、组织蛋白酶H、钙蛋白酶、组织蛋白酶T、甘氨酰基、内肽酶、癌症促凝血剂、组织蛋白酶S、picornain 3C、picornain 2A、番木瓜蛋白酶(caricain)、凤梨蛋白酶(ananain)、茎菠萝蛋白酶、果实菠萝蛋白酶、豆类蛋白酶(legumain)、histolysain和白细胞介素1-β转化酶。天冬氨酸蛋白酶包括胃蛋白酶A、胃蛋白酶B、胃亚蛋白酶、凝乳酶、组织蛋白酶D、neopenthesin、肾素、逆转录胃蛋白酶(retropepsin)、阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin)转化酶、曲霉胃蛋白酶(aspergillopepsin)I、曲霉胃蛋白酶II、青霉胃蛋白酶、根霉胃蛋白酶(rhizopuspepsin)、内座壳菌胃蛋白酶(endothiapepsin)、毛霉胃蛋白酶(mucoropepsin)、念珠菌胃蛋白酶(candidapepsin)、酵母胃蛋白酶(saccharopepsin)、红酵母胃蛋白酶(rhodotorulapepsin)、绒泡粘菌胃蛋白酶(physaropepsin)、顶柱霉胃蛋白酶(acrocylindropepsin)、多孔菌胃蛋白酶(polyporopepsin)、密孔菌胃蛋白酶(pycnoporopepsin)、柱顶孢霉胃蛋白酶(scytalidopepsin)A、柱顶孢霉胃蛋白酶B、黄单胞菌胃蛋白酶(xanthomonapepsin)、组织蛋白酶E、屏障胃蛋白酶(barrierpepsin)、细菌前导肽酶I、假单胞菌胃蛋白酶(pseudomonapepsin)和疟原虫胃蛋白酶(plasmepsin)。金属蛋白酶包括大响尾蛇金属内肽酶(atrolysin)A、微生物胶原酶、白细胞溶素、间质胶原酶、脑啡肽酶、envelysin、IgA特异性金属内肽酶、前胶原N-内肽酶、甲拌磷寡肽酶、溶神经素、溶基质素1、穿膜肽酶A、前胶原C-内肽酶、肽基-lys金属内肽酶、虾红素、溶基质素2、基质溶解素明胶酶、气单胞菌溶素(aeromonolysin)、假单胞菌溶素(pseudolysin)、嗜热菌蛋白酶、杆菌溶素(bacillolysin)、金黄色葡萄球菌溶素(aureolysin)、球菌溶素(coccolysin)、mycolysin、β-溶素金属内肽酶、肽基-asp金属内肽酶、嗜中性粒细胞胶原酶、明胶酶B、利什曼原虫溶素(leishmanolysin)、酵母溶素(saccharolysin)、自溶素、deuterolysin、serralysin、大响尾蛇金属内肽酶B、大响尾蛇金属内肽酶C、纤溶蛋白酶、大响尾蛇金属内肽酶E、大响尾蛇金属内肽酶F、去整合素(adamalysin)、horrilysin、ruberlysin、蝮蛇止血素(bothropasin)、蝮蛇溶素(bothrolysin)、ophiolysin、竹叶青蛇溶素(trimerelysin)I、竹叶青蛇溶素II、mucrolysin、溶加压素(pitrilysin)、胰岛素溶素(insulysin)、O-唾液酸糖蛋白(syaloglycoprotein)内肽酶、圆斑蝰蛇溶素(russellysin)、线粒体、中间体、肽酶、dactylysin、苯乙肼裂解酶(nardilysin)、木兰溶素(magnolysin)、穿膜肽酶B、线粒体加工肽酶、巨噬细胞弹性蛋白酶、绒毛溶素(choriolysin)和毒素溶素(toxilysin)。未知机制的蛋白酶包括thermopsin和多催化性内肽酶复合物。在实施例中，第二外源性多肽包含任何前述项的片段或变体。

在实施例中，第二外源性多肽包含IdeS多肽。在一些实施例中，IdeS多肽包含以下如SEQ ID NO:8列出的序列或SEQ ID NO:8的序列的蛋白水解活性片段(例如，至少100、150、200、250或300个氨基酸的片段)或与任何前述项具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的序列。在涉及核酸的一些实施例中，核酸编码IdeS多肽，该IdeS多肽具有以下如SEQ ID NO:8列出的序列或其蛋白水解活性片段或与任何前述项具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的序列。

IdeS多肽：

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPAKFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKEKIEAYLKKHPDKQKIMFGDQELLDVRKVINTKGDQTNSELFNYFRDKAFPGLSARRIGVMPDLVLDMFINGYYLNVYKTQTTDVNRTYQEKDRRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN(SEQ ID NO:8)

在实施例中，第二外源性多肽包含修饰剂结构域(例如，蛋白酶结构域，例如IdeS多肽)和膜锚定结构域(例如，跨膜结构域，例如I型或II型红细胞跨膜结构域)。在实施例中，膜锚定结构域位于修饰剂(例如，蛋白酶)结构域的C-末端或N-末端。在实施例中，跨膜结构域包含GPA或其跨膜部分。在实施例中，GPA多肽具有以下序列：

LSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ(SEQ ID NO:9)

或其跨膜部分，或与任何前述项具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的多肽。在实施例中，GPA多肽位于修饰剂(例如，蛋白酶)结构域的C-末端。

在一些实施例中，接头被布置在IdeS多肽与跨膜多肽之间，例如甘氨酸-丝氨酸接头，例如包含GGSGGSGG(SEQ ID NO:10)和/或GGGSGGGS(SEQ ID NO:11)的序列的接头。

在一些实施例中，外源性多肽(例如，第二外源性多肽，例如蛋白酶，例如IdeS多肽)包含前导序列，例如GPA前导序列，例如MYGKIIFVLLLSEIVSISA(SEQ ID NO:12)。

在一些实施例中，外源性多肽(例如，第二外源性多肽)进一步包含标签，例如HA标签或FLAG标签。

在一些实施例中，蛋白酶(例如，免疫球蛋白降解酶，例如免疫球蛋白-G降解酶，例如IdeS)在铰链区、CH2区或铰链区与CH2区之间切割免疫球蛋白。在实施例中，蛋白酶在下面的序列之一处切割免疫球蛋白，例如在下面的序列中的两个斜体化的甘氨酸或斜体化的丙氨酸和甘氨酸之间。

人IgG1铰链/CH2序列CPPCPAPELLGGPSVF(SEQ ID NO:13)

人IgG2铰链/CH2序列CPPCPAPPVAGPSVF(SEQ ID NO:14)

人IgG3铰链/CH2序列CPRCPAPELLGGPSVF(SEQ ID NO:15)

人IgG4铰链/CH2序列AHHAQAPEFLGGPSVF(SEQ ID NO:16)

在实施例中，蛋白酶(例如，细菌蛋白酶)切割IgG，例如IdeS或IgA蛋白酶。

在实施例中，蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶家族蛋白酶，例如木瓜蛋白酶)在Fc与Fab区之间切割免疫球蛋白，例如重链的位置224与225之间的组氨酸-苏氨酸键和/或重链的位置233与234之间的谷氨酸-亮氨酸键。

在实施例中，蛋白酶或其他修饰剂作用于表5或表6中列出的靶标。

在实施例中，例如，在患有败血症(例如，细菌败血症)的受试者中，蛋白酶或其他修饰剂作用于(例如，失活或抑制)TNF分子(如TNF-α)。例如，第一外源性多肽可以包含TNF-α结合部分(如抗TNF-α抗体)，并且第二外源性多肽可以包含切割TNF-α的蛋白酶，例如MT1-MMP、MMP12、类胰蛋白酶、MT2-MMP、弹性蛋白酶、MMP7、胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶、或其活性变体或片段。

在实施例中，第二外源性多肽包含WO 2007030708中(例如，在其中的第45-46页中)描述的催化部分，将该申请通过引用以其全文并入本文。

第二外源性多肽可以包含能够作用于靶标以诱导化学变化从而调节其活性的部分，例如能够催化靶标内的反应的部分。第二外源性多肽可以包含天然存在的酶、其活性(例如，催化活性)片段、或工程化酶，例如被工程化以具有酶活性的蛋白质，如被设计为含有丝氨酸蛋白酶活性基序的蛋白质。第二外源性多肽的催化结构域可以包含有效诱导靶标中所需化学变化的氨基酸排列。它们可以是天然酶的N-末端或C-末端截短形式、突变形式、酶原或完整的球形结构域。

第二外源性多肽可以包含单独具有混杂性、与其在许多不同生物分子上识别的切割位点结合，并且可能具有相对较差的反应动力学的酶活性位点。在实施例中，第一外源性多肽通过增加第二外源性多肽附近的靶标的局部浓度来提供或提高特异性。

在实施例中，第二外源性多肽可以修饰靶标以使其被另一种酶(例如，已经存在于受试者中的酶)识别并作用。在一个实施例中，第二外源性多肽包含改变靶标的结构以使其活性受到抑制或上调的部分。许多天然存在的酶激活其他酶，并且这些酶可以根据本文所述的组合物和方法进行开发。

第二外源性多肽可以包含蛋白酶、糖苷酶、脂肪酶或其他水解酶、酰胺酶(例如，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、PGRP-L酰胺酶)或其他酶活性，包括异构酶、转移酶(包括激酶)、裂解酶、氧化还原酶、氧化酶、醛缩酶、酮醇酶、糖苷酶、转移酶等。在实施例中，第二外源性多肽包含人溶菌酶、人溶菌酶的功能部分、人PGRP-L、人PGRP-L的功能部分、磷脂酶A2、磷脂酶A2的功能部分、或基质金属蛋白酶(MMP)胞外酶(如MMP-2(明胶酶A)或MMP-9(明胶酶B))。

在实施例中，第二外源性多肽是例如胰凝乳蛋白酶家族(其包括哺乳动物酶，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶或弹性蛋白酶或激肽释放酶)或枯草杆菌蛋白酶家族(其包括细菌酶，如枯草杆菌蛋白酶)的丝氨酸蛋白酶。一般的三维结构在这两个家族中是不同的，但它们具有相同的活性位点几何形状，并且催化通过相同的机制进行。丝氨酸蛋白酶表现出不同的底物特异性，这和与底物残基相互作用的不同酶亚位点中的氨基酸取代有关。形成催化三联体的三个残基在催化过程中很重要：His-57、Asp-102和Ser-195(胰凝乳蛋白酶原编号)。

在实施例中，第二外源性多肽是半胱氨酸蛋白酶，其包括植物蛋白酶如木瓜蛋白酶、猕猴桃素或菠萝蛋白酶，几种哺乳动物溶酶体组织蛋白酶、胞质钙蛋白酶(钙激活的)和几种寄生性蛋白酶(例如，锥虫属、血吸虫属)。木瓜蛋白酶是该家族中的原祖型并且是研究最为成熟的成员。像丝氨酸蛋白酶一样，催化通过共价中间体的形成进行并涉及半胱氨酸和组氨酸残基。必需的Cys-25和His-159(木瓜蛋白酶编号)分别与Ser-195和His-57起相同的作用。亲核体是硫醇根离子而不是羟基基团。硫醇根离子通过与邻近的His-159的咪唑鎓基团形成离子对而得到稳定。在两个步骤中攻击亲核体都是硫醇盐-咪唑鎓离子对，然后不需要水分子。

在实施例中，第二外源性多肽是天冬氨酸蛋白酶，其大部分属于胃蛋白酶家族。胃蛋白酶家族包括消化酶(如胃蛋白酶和凝乳酶)以及溶酶体组织蛋白酶D，加工酶(如肾素)和某些真菌蛋白酶(青霉胃蛋白酶、根霉胃蛋白酶、内座壳菌胃蛋白酶)。第二家族包含病毒蛋白酶，如来自AIDS vims(HIV)的蛋白酶，也称为逆转录胃蛋白酶。与丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶相反，天冬氨酸蛋白酶的催化不涉及共价中间体，尽管存在四面体中间体。通过两个同时的质子转移来实现亲核攻击：一个从水分子转移到两个羧基基团的二分体上，并且第二个从二分体转移到底物的羰基氧上，同时发生CO-NH键裂解。这种一般的酸碱催化(可称为“推拉(push-pull)”机理)导致非共价中性四面体中间体的形成。

在实施例中，第二外源性多肽是金属蛋白酶，其可以在细菌、真菌以及高等生物中找到。它们在其序列和其结构上差别很大，但绝大多数酶含有具催化活性的锌(Zn)原子。在一些情况下，锌可能被另一种金属如钴或镍替代而不会损失活性。细菌嗜热菌蛋白酶已被很好地表征，并且其晶体结构表明锌被两个组氨酸和一个谷氨酸结合。许多酶含有序列HEXXH，其为锌提供两个组氨酸配体，而第三个配体是谷氨酸(嗜热菌蛋白酶、脑啡肽酶、丙氨酰氨肽酶)或组氨酸(虾红素)。其他家族表现出不同的Zn原子结合模式。催化机制导致在锌结合的水分子对易裂开键的羰基基团发生攻击后非共价四面体中间体的形成。此中间体通过将谷氨酸质子转移至离去基团而进一步分解。

在实施例中，第二外源性多肽包含异构酶(例如，破坏并形成化学键或催化构象变化的异构酶)。在实施例中，异构酶是消旋酶(例如，氨基酸消旋酶)、差向异构酶、顺反异构酶、分子内氧化还原酶、分子内转移酶或分子内裂解酶。

在实施例中，第二外源性蛋白酶包含伴侣蛋白、或其活性变体或片段。例如，伴侣蛋白可以是一般伴侣蛋白(例如，GRP78/BiP、GRP94、GRP170)，凝集素伴侣蛋白(例如，钙联蛋白或钙网蛋白)，非经典分子伴侣(例如，HSP47或ERp29)，折叠伴侣蛋白(例如，PDI、PPI或ERp57)，细菌或古细菌伴侣蛋白(例如，Hsp60、GroEL/GroES复合物、Hsp70、DnaK、Hsp90、HtpG、Hsp100、Clp家族(例如，ClpA和ClpX)、Hsp104)。在实施例中，去核红细胞包含共伴侣蛋白、或其活性变体或片段，例如免疫亲和素、Sti1、p50(Cdc37)或Aha1。在实施例中，分子伴侣是伴侣蛋白。

第二外源性蛋白(其修饰靶标)的候选物可以根据它们的活性进行筛选。根据被测试的每种分子的比活性，可以使用适合于该分子的测定。例如，如果第二外源性蛋白是蛋白酶，则用于筛选蛋白酶的测定可以是用于检测由蛋白酶产生的切割产物的测定，例如基于色谱或凝胶电泳的测定。

在一个实例中，第二外源性多肽可以具有激酶活性。激酶活性的测定可以测量共价掺入到感兴趣的靶标中的磷酸的量。例如，掺入感兴趣的靶标中的磷酸可以是磷酸的放射性同位素，其可以通过使用闪烁计数器测量辐射的发射来进行定量。

靶标(例如，抗体或补体途径因子)和适应症

在实施例中，靶标是表5或表6中列出的靶标。

在实施例中，靶标是选自PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFβ的免疫检查点分子。在实施例中，靶标是表3中列出的抑制性配体，并且第一外源性多肽任选地包含来自表3中的相应靶受体的结合结构域。在一些实施例中，靶标是表3中的靶受体，并且第一外源性多肽任选地包含来自表3中的相应抑制性配体的结合结构域。在一些实施例中，第二外源性多肽包含切割免疫检查点分子的蛋白酶，例如胰蛋白酶。在例如用于治疗自身免疫性疾病的实施例中，例如通过使T细胞受体(例如，表3中的受体)与表3中的抑制性配体接触来抑制T细胞。

在实施例中，靶标是抗体，例如人抗体。抗体可以是例如自身抗体。抗体可以是例如IgA、IgD、IgE、IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、或IgM。在实施例中，靶标是结合表4中的自身抗原的自身抗体。在实施例中，靶标是抗AQP4自身抗体，其中第一外源性多肽结合抗AQP4自身抗体，并且第二多肽(例如，包含IdeS多肽)切割该自身抗体，例如用于治疗视神经脊髓炎。在实施例中，靶标是抗PLA2R自身抗体，其中第一外源性多肽结合抗PLA2R自身抗体，并且第二多肽(例如，包含IdeS多肽)切割该自身抗体，例如用于治疗膜性肾病。

在实施例中，靶标是补体因子，例如在经典补体途径或替代补体途径中起作用的因子。在实施例中，补体因子是前蛋白或活化的(例如，切割的)蛋白。在实施例中，补体因子包含C1、C2a、C4b、C3、C3a、C3b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8或C9。在实施例中，第二外源性多肽切割补体因子。在实施例中，第二外源性多肽激活补体因子，例如以促进免疫应答。例如，第二外源性多肽可以包含补体控制蛋白和/或补体活化家族蛋白(如因子H或因子I(其促进C3b切割))、或其片段或变体。在实施例中，第二外源性多肽失活补体因子，例如通过切割它来产生一个或多个无活性片段，例如以减少不需要的免疫应答，例如以治疗自身免疫性或炎性疾病。在实施例中，第一外源性多肽结合补体因子(例如，结合补体因子C3b)，并且第二外源性多肽切割该补体因子，例如切割成iC3b。例如，第一外源性多肽可以包含因子H或CR1或其片段或变体，并且第二外源性多肽可以包含因子I或其片段或变体。

本文所述的工程化类红细胞还可以用于治疗具有针对药物的抗体的受试者(例如，参见图7)。类红细胞可以降低受试者中抗药物抗体的水平，并且可以任选地进一步包含治疗该疾病的治疗性蛋白。例如，类红细胞包含结合靶标的第一外源性多肽，例如其中靶标是抗药物抗体。类红细胞可以进一步包含灭活(例如，切割)靶标的第二外源性多肽(例如，IdeS或其片段或变体)。类红细胞可以任选地进一步包含第三外源性多肽，例如治疗与受试者对其形成抗药物抗体的现有治疗剂相同的疾病的治疗性蛋白，例如与受试者对其形成抗药物抗体的先前治疗剂相同或不同的治疗性蛋白。在实施例中，受试者包含针对促红细胞生成素的抗药物抗体、抗TNF抗体分子(阿达木单抗或英夫利昔单抗)、抗EGFR抗体(例如，西妥昔单抗)、抗CD20抗体分子、胰岛素、抗α4整合素抗体分子(例如，那他珠单抗)或干扰素(例如IFNβ1a或IFNβ1b)。在实施例中，第一多肽包含抗MAdCAM-1抗体分子，并且第二多肽包含LysC或LysN(其可以在1个或多个位点(例如，2、3或4个位点)切割MAdCAM-1)或其具有蛋白酶活性的片段或变体，例如其中靶组织是发炎的肠或肝组织。在这样的治疗方法中，可以在给予本文所述的工程化类红细胞之前、期间和/或之后，测试患者是否存在抗药物抗体，例如是否存在中和抗药物抗体。

药剂协同配置

当两种或更多种药剂(例如，多肽)是药剂协同的时，这些药剂作用于单一途径中的两种或更多种不同的靶标。在一个实施例中，这两种或更多种药剂一起的作用大于任何单独药剂的作用。例如，第一和第二多肽是向同一下游靶标发出信号的细胞受体的配体。例如，第一外源性多肽包含第一靶细胞受体的配体，并且第二外源性多肽包含第二靶细胞受体的配体，例如第一和第二靶细胞受体向同一下游靶标发出信号。在实施例中，第一外源性多肽作用于第一靶标并且第二外源性多肽同时作用于第二靶标，例如，在第一外源性多肽与第一靶标的结合和第二外源性多肽与第二靶标的结合中存在一些暂时的重叠。在一些实施例中，同时作用产生比单独作用或孤立作用于靶标时预期的更大量级的协同应答。

在一个实施例中，第一和第二多肽是介导细胞凋亡的第一细胞受体和第二细胞受体的配体。在一个实施例中，这些药剂包含两种或更多种TRAIL受体配体(例如，野生型或突变型TRAIL多肽)或结合TRAIL受体的抗体分子，并诱导靶细胞(例如，自身反应性T细胞)中的细胞凋亡。在一些实施例中，包含TRAIL受体配体的RBC进一步包含靶向部分，例如本文所述的靶向部分。在一个实施例中，第一靶标和第二靶标与相同的底物(例如，底物蛋白)相互作用。在一个实施例中，第一靶标和第二靶标与不同的底物相互作用。

TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体)是诱导细胞凋亡的TNF家族的成员。TRAIL具有至少两种受体，TRAIL R1和TRAIL R2。TRAIL受体激动剂，例如结合一种或多种受体的TRAIL突变体或结合TRAIL R1或TRAIL R2中的一者或两者的抗体分子(参见例如，Gasparian等人,Apoptosis[细胞凋亡]2009年6月14(6)，Buchsbaum等人Future Oncol[未来肿瘤学]2007年8月3(4))，已经开发作为广泛癌症的临床疗法。除其他原因之外，TRAIL受体激动剂的临床试验因为以下事实而失败：许多原发癌对通过单一受体的信号转导不敏感而需要两种受体都参与以诱导细胞毒性(Marconi等人,Cell Death and Disease[细胞死亡与疾病](2013)4,e863)。在一个实施例中，在工程化血细胞上表达的药剂是单一受体特异性TRAIL激动剂，其组合使细胞能够同时参与并激动两种TRAIL受体，从而导致靶细胞凋亡的协同诱导。因此，在一些实施例中，去核红细胞(例如，网织红细胞)在其表面上包含结合TRAIL R1的第一多肽和结合TRAIL R2的第二多肽。在实施例中，每种多肽对TRAIL R1或TRAIL R2的Kd都比对另一受体的Kd强2、3、4、5、10、20、50、100、200或500倍。尽管不希望受理论束缚，但是在一些实施例中，包含TRAIL R1特异性配体和TRAIL R2特异性配体的去核红细胞比包含以大约相同的亲和力结合TRAIL R1和TRAIL R2的配体的去核红细胞更好地促进TRAIL R1和TRAILR2的异源二聚化。

在一些实施例中，一种、两种或更多种外源性多肽是TNF超家族的成员。在一些实施例中，外源性多肽结合死亡受体DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)中的一者或两者。在一些实施例中，外源性多肽结合TNFRSF10A/TRAILR1、TNFRSF10B/TRAILR2、TNFRSF10C/TRAILR3、TNFRSF10D/TRAILR4或TNFRSF11B/OPG中的一种或多种。在一些实施例中，外源性多肽激活MAPK8/JNK、半胱天冬酶8和半胱天冬酶3中的一种或多种。

在一些实施例中，TRAIL多肽是TRAIL激动剂，其具有本文SEQ ID NO:1-5中任一个的序列，或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列。例如通过BLAST(基本局部比对搜索工具)来测量序列同一性。SEQ ID No.1-5进一步被描述于Mohr等人BMC Cancer[生物医学中心癌症](2015)15:494中，将其通过引用以其全文并入本文。

SEQ ID NO:1

可溶性TRAIL变体DR4-1

MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRRRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

SEQ ID NO:2

可溶性TRAIL变体DR4-2

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SEQ ID NO:3

可溶性TRAIL变体DR4-3

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SEQ ID NO:4

可溶性TRAIL变体DR5-1

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SEQ ID NO:5

可溶性TRAIL变体DR5-2

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设想了TRAIL受体配体的所有组合。在一些实施例中，第一和第二药剂包含SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4；SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4；SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5；或SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5；或任何前述项的片段或变体。

在一些实施例中，TRAIL受体配体包含抗体分子。在实施例中，抗体分子识别TRAILR1和TRAIL R2中的一者或两者。抗体分子可以是例如马帕木单抗(人抗DR4 mAb)、替加珠单抗(Tigatuzumab)(人源化抗DR5 mAb)、来沙木单抗(人抗DR5 mAb)、可那木单抗(Conatumumab)(人抗DR5 mAb)或阿扑单抗(Apomab)(人抗DR5 mAb)或其片段或变体，例如与任何上述抗体具有相同的CDR的变体，例如通过Chothia或Kabat定义测得。在一些实施例中，去核红细胞(例如，网织红细胞)包含结合TRAIL受体的两种或更多种(例如，三种、四种、五种或更多种)不同的抗体分子。在一些实施例中，去核红细胞(例如，网织红细胞)包含至少一种结合TRAIL受体的抗体分子和至少一种TRAIL多肽。

在一些实施例中，这些药剂是多步骤途径的调节剂，其通过例如同时靶向途径的上游和下游步骤而起药剂协同作用。在一个实施例中，靶途径是补体级联，其具有几条平行的激活路径(经典途径、替代途径、凝集素途径)和多种自催化性酶以增强其对感染作出应答并导致膜攻击复合物形成的效力(参见例如，Bu等人Clin Dev Immunol.[临床与发育免疫学]2012；2012:370426)。补体级联抑制剂既作为作用于不同水平级联的合成抗体和肽存在，例如抗C5(依库珠单抗)和抗C3(补体抑制素)，又作为内源性蛋白和多肽存在，例如CFH、CFI、CD46/MCP、CD55/DAF、CD59和CR1。非酶补体抑制剂包括Efb(结合C3b的胞外纤维蛋白原结合蛋白，例如来自金黄色葡萄球菌)、Ehp(结合C3d并抑制C3转化)、SCIN(葡萄球菌补体抑制剂，其将C3转化酶稳定成非功能性状态)、CHIPS(拮抗C5a受体的金黄色葡萄球菌的趋化性抑制蛋白)和SSL-7(结合C5的葡萄球菌超抗原样蛋白-7)。酶补体抑制剂包括LysC、LysN、PaE、PaAP、来自粘质沙雷氏菌的56kDa蛋白酶、C5a肽酶、纤溶酶、SpeB、PrtH、葡萄球菌激酶和MMP(参见表1)。外源性多肽还可以包含本文所述的任何补体抑制剂的片段或变体。为了治疗补体过度活化的疾病，抑制补体级联可能是有益的，并且可以特别有利的是在级联的两个或更多个阶段进行干预以获得更有力的抑制。在一些实施例中，在工程化红细胞(例如，网织红细胞)上表达的药剂是作用于不同水平级联的补体级联抑制剂，例如CFI和MCP、CD55和CD59、或抗C3和抗C5。

在一些实施例中，去核RBC包含两种或更多种具有抗炎性的药剂。例如，这些药剂可以包含抗TNFα抗体分子(例如，humira)、抗IgE抗体分子(例如，Xolair)、或抑制T细胞的分子(例如，IL-10或PD-L1；还参见表1和表3)、或其任何组合。在实施例中，一种或多种药剂捕获诸如细胞因子等因子。在实施例中，一种或多种药剂调节免疫细胞。

倍增配置

当两种或更多种药剂(例如，多肽)是倍增的时，第一药剂作用于作为第一途径的一部分的第一分子，并且第二药剂作用于作为第二途径的一部分的第二分子，这两个路径一齐朝着所希望的应答起作用。

在一些实施例中，所希望的应答是不适当激活的免疫细胞(例如，T细胞)的失活(例如，无反应性)。在一些实施例中，这些药剂抑制多种T细胞激活途径。在实施例中，一种或多种(例如，2、3、4种或5种或更多种)T细胞抑制配体包含表2中的配体的抑制变体(例如，片段)。在实施例中，一种或多种(例如，2、3、4种或5种或更多种)T细胞抑制配体包含结合表2中的靶受体的抑制性抗体分子或其T细胞抑制变体(例如，片段)。在实施例中，这些蛋白质通过互补激活途径发信号。在一些实施例中，这些配体是抑制性细胞因子、干扰素或TNF家族成员。在一些实施例中，这些药剂是以上类别的分子的组合。这些药剂可以源自靶受体的内源性配体或抗体分子。

表2.T细胞激活

在一些实施例中，抗IL6或TNFα抗体分子包含本文中的SEQ ID NO:6或7的序列，或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列。

SEQ ID NO:6

抗IL6 scFv

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNFNDYFMNWVRQAPGKGLEWVAQMRNKNYQYGTYYAESLEGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARESYYGFTSYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIGISLSWYQQKPGKAPKLLIYNANNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSAPYTFGQGTKLEIKR

SEQ ID NO:7

抗TNFαscFv

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK

在一些实施例中，使用表3中的配体或受体或其片段或变体来抑制T细胞(例如，自身反应性T细胞)。例如，第一和第二外源性多肽可以包含T细胞抑制配体(例如，表3中的抑制性配体或其片段或变体)和抑制T细胞激活(例如，通过表2中的受体)的药剂。在一些实施例中，抑制T细胞的药剂是表3中的抑制性配体或其片段或变体。在一些实施例中，药剂是结合表3中的靶受体的抗体分子或其片段或变体。

表3.T细胞抑制

不希望受理论束缚，在一些实施例中，目的是通过抑制T细胞激活来抑制免疫应答。因此，在实施例中，工程化红细胞(例如，网织红细胞)靶向多种T细胞抑制途径的组合(例如，如表3所述)，例如使用在工程化红细胞上共表达的配体或抗体分子或两者。在一些实施例中，这些药剂包含捕获炎性细胞因子的受体或抗体分子，例如以防止额外激活靶T细胞。例如，这些药剂可以包含针对受体CTLA-4的激动剂抗体分子和针对TNFα的抗体分子。

在一些实施例中，目的是激活或抑制T细胞。为了确保优先于其他也可以表达如本文所述的激活或抑制性受体的免疫细胞靶向T细胞，红细胞(例如，网织红细胞)上的药剂之一可以包含靶向部分，例如结合T细胞受体(TCR)或另一种T细胞标记的抗体分子。在本文中标题为“定向配置”的部分中更详细地描述了靶向部分。在一些实施例中，可以增强(具有抗肿瘤特异性的T细胞)或抑制(具有自身免疫反应性的T细胞)特异性T细胞亚型或克隆。在一些实施例中，红细胞(例如，网织红细胞)上的一种或多种药剂是以抗原特异性方式选择性结合T细胞受体的肽-MHC分子。

在诱导致耐受性应答的背景下，在一些实施例中，第一和第二外源性多肽包含抗原和抑制性配体，使得通过APC进行的抗原呈递诱导耐受性而不是免疫性。在实施例中，抗原是自身免疫性抗原(例如，表4中的自身抗原)或过敏原(例如，来自植物如花粉的过敏原、来自食物的过敏原或来自动物的过敏原)。在实施例中，抑制性配体包含FasL、B7、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ、或其功能性变体(例如，片段)。在一些实施例中，抑制T细胞的药剂是表3中的抑制性配体或其抑制性片段或变体。在一些实施例中，抑制T细胞的药剂是结合表3中的靶受体的抗体分子或其抑制性片段或变体。在一些实施例中，红细胞(例如，网织红细胞)进一步包含结合树突细胞受体(例如CD205或CD206)的抗体分子。在实施例中，此药剂促进抗原呈递细胞的摄取。在一些实施例中，CD205在不存在另外的共刺激信号的情况下诱导致耐受性抗原呈递。

在一些实施例中，第一和第二外源性多肽包含，在一些实施例中，抗原和共刺激分子，例如其中类红细胞可以充当APC。

表4：自身免疫性疾病和抗原

在一些实施例中，将包含第一外源性多肽和第二外源性多肽的去核红细胞(例如，网织红细胞)给予具有第一靶标和第二靶标的受试者。在实施例中，第一外源性多肽作用于(例如，结合)第一靶标，并且第二外源性多肽作用于第二靶标。任选地，去核红细胞包含第三外源性多肽，并且患者包含第三靶标。在实施例中，第三外源性多肽作用于第三靶标。

在一些实施例中，类红细胞包含第一外源性多肽，其是第一途径中第一靶标的激动剂或拮抗剂，并且进一步包含第二外源性多肽，其是第二途径中第二靶标的激动剂或拮抗剂，其中第一和第二途径一齐朝着所希望的应答起作用。第一和第二外源性多肽都可以是激动剂；都可以是拮抗剂；或者一个可以是激动剂而另一个可以是拮抗剂。在一些实施例中(例如，参见图10)，第一外源性多肽包含表面暴露抗CD28抗体分子，并且第二外源性多肽包含表面暴露抗CTLA4抗体分子，例如用于治疗系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎。在一些实施例中，第一外源性多肽包含表面暴露抗ICOSL拮抗剂，并且第二外源性多肽包含表面暴露抗CD40拮抗剂，例如其中靶标是抗原呈递细胞，例如用于治疗系统性红斑狼疮。在一些实施例中，靶细胞或组织包含免疫细胞或患病组织。在一些实施例中，一种或多种外源性多肽是免疫检查点激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，类红细胞进一步包含靶向剂。

独立功能配置

当两种或更多种药剂(例如，多肽)具有独立功能关系时，这些药剂有两种不同的(例如，互补的)功能。例如，第一药剂结合第一靶标，并且第二药剂结合第二靶标。患者可能缺乏第一或第二靶标。任选地，第一和第二药剂处于不同的途径中。

在败血症、肿瘤溶解综合征和其他以细胞因子风暴为标志的病症中，损伤是由炎性细胞因子的不同混合而驱动的。针对一种细胞因子的现有单一疗法通常不足以治疗这些急性病症。此外，有时不可能及时测量细胞因子风暴的驱动物以防止临床损害。在一个实施例中，第一和第二肽是结合两种不同细胞因子的分子(例如，抗体分子)。在一些实施例中，这些药剂结合并中和不同的细胞因子，并且因此工程化红细胞产品提供了免于细胞因子风暴的多面保护。

在实施例中，这些细胞因子包含白细胞介素，例如IL-1、IL02、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35或IL-36。在一些实施例中，细胞因子是表1中的细胞因子或其片段或变体。在一些实施例中，第一细胞因子是TNFα，并且第二细胞因子是白细胞介素(例如，IL-6)或任何前述项的片段或变体。在一些实施例中，这些药剂包含抗TNFα、抗IL-6或抗IFNg抗体分子或其任何组合、或任何前述项的片段或变体。

在一些实施例中，这些药剂包含多种抗体分子，所述多种抗体分子结合多种常见的细菌、真菌或病毒病原体。在实施例中，这些抗体从人B细胞(例如，汇集的人B细胞的组合文库)产生。在实施例中，多抗体工程化红细胞用作静脉内免疫球蛋白(IVIG)的替代物、替换物或补充物。在实施例中，IVIG被给予免疫缺陷患者，例如缺乏产生内源性抗体的能力的患者。红细胞(例如，网织红细胞)将提供持久的保护并且免除与血浆捐献相关的风险。

在一些实施例中，将包含第一外源性多肽和第二外源性多肽的去核红细胞(例如，网织红细胞)给予具有第一靶标但不具有第二靶标的受试者，或者其中患者不知道具有第一靶标还是第二靶标。在实施例中，第一外源性多肽作用于(例如，结合)第一靶标，并且第二外源性多肽基本保持未结合。任选地，去核红细胞包含第三外源性多肽，并且患者缺乏第三靶标或不知道具有第三靶标。在一些实施例中，去核红细胞包含多种外源性多肽，并且患者不具有或不知道具有针对所述多种外源性多肽中的一种或子集的靶标。

独立功能配置的实例示于图4中。图4的类红细胞包含第一外源性多肽(白色)、第二外源性多肽(画影线)和任选的第三外源性多肽(封闭画影线)。第一外源性多肽可以结合第一靶标(例如，细胞因子A)，并且第二外源性多肽可以独立地结合第二靶标(例如，细胞因子B)。如果这两种细胞因子都存在于受试者中，则此工程化类红细胞诱捕并清除这两者。如果受试者中仅存在这些细胞因子中的一种，则工程化类红细胞可以清除该细胞因子。在实施例中，一种或多种(例如，两种或全部)外源性多肽包含抗体分子(例如，scFv)，并且任选地进一步包含跨膜结构域。在实施例中，靶标包含多种细胞因子、趋化因子或其组合。作为实例，第一外源性多肽可以结合TNF-α，并且第二外源性多肽可以结合IL6，例如以治疗类风湿性关节炎；第一外源性多肽可以结合IL4，并且第二外源性多肽可以结合IL13，例如以治疗哮喘和/或异位性皮炎；第一外源性多肽可以结合IL33，并且第二外源性多肽可以结合IL15，例如以治疗乳糜泻或炎性肠病；或第一外源性多肽可以结合IL35，并且第二外源性多肽可以结合IL25，例如以治疗过敏。在实施例中，第一靶标和第二靶标是不需要的抗体，例如内源性抗体，例如自身免疫性抗体或抗药物抗体(例如，如图5所示)。例如，第一外源性多肽可以结合MOG，并且第二外源性多肽可以结合MBP，例如以治疗多发性硬化症。

定位配置

当两种或更多种药剂(例如，多肽)具有定位关系时，与未定位于作用部位时其活性相比，第一药剂将RBC定位于增强第二或其他一种或多种药剂的活性的作用部位(例如，通过将第一药剂结合到其靶标上，使第二药剂在其靶标区域中的局部浓度增加)。在一些实施例中，一种药剂用于将红细胞(例如，网织红细胞)靶向作用部位，并且一种或多种药剂具有治疗效果。在一个实施例中，第一药剂的结合增加了由第二药剂结合的实体(例如，多肽)的活性。在一个实施例中，第一药剂结合由第二药剂结合的实体(例如，多肽)的底物或产物。定位RBC的药剂可以是例如靶细胞上的受体的配体，或结合靶细胞上的细胞表面分子的抗体。

作为另一个实例，RBC包含结合发炎脉管系统的靶向剂并且还包含抗炎分子。在一些实施例中，靶向剂结合炎性整合素，例如avB3整合素或地址素如MADCAM1。在一些实施例中，靶向剂包含淋巴细胞归巢受体(例如，CD34或GLYCAM-1)或其整合素结合部分或变体。在一些实施例中，抗炎分子包含抗炎细胞因子(例如，IL-1受体拮抗剂、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11和IL-13)、TNF抑制剂(例如，抗体分子，如Enbrel)、促炎细胞因子抑制剂、针对α4β7整合素的抑制剂(例如，抗体分子)、集落刺激因子、肽生长因子、单核细胞运动抑制因子(MLIF)、皮质抑素、或免疫细胞激活抑制剂(例如，PDL1或表3中描述的另一种分子或其抗体分子)、或其抗炎变体(例如，片段)。

在一些实施例中，类红细胞靶向例如发炎组织中的内皮细胞。如图9所示，细胞可以包含一种或多种靶向剂，例如结合发炎组织的表面标志物的外源性多肽。靶向剂可以是包含例如抗VCAM抗体分子或抗E-选择素抗体分子的外源性多肽。在实施例中，类红细胞包含两种靶向剂，与仅包含一种靶向剂的在其他方面类似的类红细胞相比，这两种靶向剂可以增加类红细胞结合其靶标的特异性和/或亲和力和/或亲合力。在实施例中，靶向部分包含：表面暴露抗VCAM抗体分子和表面暴露抗E-选择素抗体分子；表面暴露α4β1整合素或其片段或变体和表面暴露抗E-选择素抗体分子；或表面暴露αvβ2整合素或其片段或变体和表面暴露抗E-选择素抗体分子。类红细胞任选地进一步包含具有治疗活性(例如，抗炎活性)的外源性多肽。具有治疗活性的外源性多肽可以包含酶、捕获剂、激动剂或拮抗剂。

在实施例中，类红细胞还可以靶向免疫细胞或患病组织。在实施例中，靶向部分包含受体或其片段或变体。在实施例中，靶向部分包含抗体分子如scFv。

在一些实施例中，例如，为了杀死自体反应性细胞，第一外源性多肽包含靶向部分(例如，可将类红细胞靶向B细胞的表面暴露抗CD20抗体分子)或对自体反应性细胞具有特异性的靶向部分，并且第二外源性多肽包含可以杀死或使T细胞无反应性的部分，例如TRAIL配体。类红细胞可以进一步包含第二外源性多肽的抑制剂，例如，如图8所示。

第一外源性多肽可以包含靶向剂，并且第二外源性多肽可以包含酶(例如，图11)。例如，在一些实施例中，例如用于治疗自身免疫性疾病，类红细胞包含第一多肽和第二多肽，第一多肽包含结合免疫细胞的靶向剂，第二多肽抑制(例如，杀死、诱导无反应性、抑制生长)免疫细胞。例如，靶向剂可以包含结合T细胞(例如，自体反应性T细胞)表面上的CD4的抗CD4抗体。第二多肽可以包含可表面暴露或位于细胞内(例如，位于细胞内而不与膜缔合)的酶。该酶可以是IDO或其片段或变体(其耗尽色氨酸并且可以在自体反应性T细胞中诱导无反应性)、或ADA或其片段或变体。该酶可以是蛋白酶。在实施例中，第一多肽包含抗MAdCAM-1抗体分子，并且第二多肽包含LysC或LysN(其可以在1个或多个位点(例如，2、3或4个位点)切割MAdCAM-1)，例如其中靶组织是发炎的肠或肝组织。在一些实施例中，靶向剂包含抗IL13R抗体分子或IL13或其片段或变体，并且有效载荷包含IDO或ADA，例如用于治疗过敏或哮喘。在一些实施例中，靶向剂包含抗IL23R抗体分子或IL23或其片段或变体，并且有效载荷包含IDO或ADA，例如用于治疗银屑病。

在实施例中，靶细胞是免疫细胞(例如，T细胞，例如辅助性T细胞)和/或患病细胞。靶向剂可以包含抗体分子，例如scFv。

第一外源性多肽可以包含靶向剂，并且第二外源性多肽可以包含靶标的激动剂(参见例如，图12)。例如，在一些实施例中，第一外源性多肽包含例如可结合MAdCAM-1的抗MAdCAM-1抗体分子，例如在发炎组织上。第二外源性多肽可以包含抗炎分子，例如IL10或其片段或变体。在一些实施例中，靶细胞是致病性免疫细胞。在实施例中，靶向剂包含受体或其片段或变体、抗体分子、配体或片段或变体、细胞因子或其片段或变体。在实施例中，第二外源性多肽包含弱化剂、激活剂、细胞杀伤剂或细胞毒性分子(例如，小分子、蛋白质、RNA(例如，反义RNA)或TLR配体)。在实施例中，第二外源性多肽位于细胞内，例如不与膜缔合，并且在一些实施例中，第二外源性多肽是表面暴露的。在实施例中，靶向部分结合肝细胞，并且第二外源性多肽包含TGFβ或其片段或变体，例如用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

类红细胞可以包含靶向剂和捕获剂(例如，图13)。例如，第一外源性多肽可以包含结合浆细胞的靶向剂，例如抗BCMA抗体分子。第二外源性多肽可以捕获细胞因子，例如可包含可以捕获BLyS(也称为BAFF)和/或APRIL的TACI或其片段或变体。在实施例中，第二外源性多肽以防止靶标与内源性受体相互作用的方式结合其靶标，例如在与受体结合位点重叠的部分处结合靶标。在实施例中，靶向部分在疾病部位结合受体，例如结合整合素。在实施例中，靶细胞是致病性免疫细胞或患病组织。在实施例中，靶向剂包含配体或细胞因子或其片段或变体，或抗体分子(例如，scFv)。在实施例中，捕获剂包含受体或其片段或变体，或抗体分子(例如，scFv)。在实施例中，配体是不需要的细胞因子或趋化因子。

靶向剂可以将类红细胞引导至特定的细胞亚型，例如具有特定抗原特异性的免疫细胞，例如自体反应性免疫细胞。细胞可以进一步包含促进靶细胞中给定的活性或途径(例如，可以减弱、激活或诱导细胞死亡)的第二外源性多肽。例如，图14描绘了包含第一外源性多肽的类红细胞，该第一外源性多肽包含可以在自体反应性浆细胞上结合抗AQP4 B细胞受体(BCR)的AQP4表位；其他示例性第一外源性多肽包括ACHR或胰岛素或其片段或变体。类红细胞可以进一步包含抑制(例如，杀死、诱导无反应性、抑制生长)免疫细胞的第二外源性多肽。例如，第二外源性多肽可以包含细胞杀伤剂，例如促凋亡剂，例如诱导自体反应性免疫中的细胞凋亡的TRAIL多肽。作为另一个实例，类红细胞可以具有抗原呈递活性，例如可以包含MHCII上的MOG和/或MBP肽，并且进一步包含IL10和TGFβ中的一者或两者或其片段或变体，例如用于治疗多发性硬化症。类红细胞还可以包含抗原和表面暴露或细胞内的弱化剂或激活剂。例如，细胞可以包含抗原和PDL1或其片段或变体。作为另一个实例，细胞可以包含抗原和酶如IDO或ADA。类红细胞还可以包含抗原和细胞靶向剂，例如对B细胞类型具有特异性的抗原(例如，对自体反应性B细胞具有特异性的自身抗原)和靶向浆细胞的抗BCMA抗体分子。

基于邻近的配置

当两种或更多种药剂(例如，多肽)具有基于邻近的关系时，这两种药剂当它们彼此接近时比它们在物理上分离时更强烈地发挥作用，例如发挥更显著的作用。在实施例中，这两种药剂是邻近的，当它们彼此直接结合时，当它们是复合物的一部分(例如，通过第三药剂连接)时，当它们存在于同一细胞膜上时，或当它们存在于细胞膜的同一分段上(例如，在脂筏内、在脂筏外、或直接或间接结合至细胞内结构如细胞骨架组分)时。在一些实施例中，第一多肽结合第一靶分子并且第二多肽结合第二靶分子，并且此结合导致第一靶分子和第二靶分子彼此移动更接近，例如彼此结合。在一些实施例中，第一和第二靶分子是靶细胞上的细胞表面受体。

基于邻近的配置的实例示于图4中。图4的类红细胞包含任选的第一外源性多肽(白色)、第二外源性多肽(画影线)和第三外源性多肽(封闭画影线)。第二和第三外源性多肽结合靶标(例如，细胞因子B)的同一多肽链内的不同表位。安装在红细胞上的第二和第三外源性多肽以比假如第二和第三外源性多肽是游离多肽时更高的亲合力与靶标结合。作为实例，两种或更多种外源性多肽可以结合相同靶标上的不同位点，其中靶标是细胞因子、补体因子(例如，C5)、酶、抗体或免疫复合物。作为实例，第一外源性多肽包含结合特异性抗体(例如，自身抗体)的抗原(例如，自身抗原，例如表6中的自身抗原)，并且第二外源性多肽结合抗体Fc(例如，可以包含结合Fc的CD16A)以增加结合第一外源性多肽的抗体的亲合力。

支架配置

当两种或更多种药剂(例如，多肽)具有支架关系时，这些药剂将两种或更多种靶标放在一起，以增加靶标相互作用的可能性。在一个实施例中，第一和第二药剂在RBC表面处彼此缔合(形成支架)，例如两种复合多肽。在一个实施例中，红细胞(例如，网织红细胞)包含双特异性抗体分子，例如识别本文所述的一种或多种(例如，2种)蛋白质(例如，表1、表2、表3和表4中任一个中的)的抗体分子。

靶标可以包含例如蛋白质、细胞、小分子、或其任何组合。在一个实施例中，第一和第二靶标是蛋白质。在一个实施例中，第一和第二靶标是细胞。

在一些实施例中，RBC使一个免疫效应细胞与另一免疫细胞接近，例如以促进抗原呈递(例如，当一个细胞是抗原呈递细胞并且另一个细胞是T细胞时)或无反应性(例如，当一个细胞是Treg并且另一个细胞是免疫效应细胞，例如自体反应性免疫效应细胞时)。

在一些实施例中，RBC表达包含第一抗体分子结构域和第二抗体分子结构域的外源性融合多肽，其中该外源性多肽作为双特异性抗体起作用，例如其中第一抗体分子结构域结合第一细胞上的第一靶标并且第二抗体分子结构域结合第二细胞上的第二靶标，例如不同的细胞类型。

多聚体配置

当两种或更多种药剂(例如，多肽)具有多聚体配置时，这些药剂彼此联合(例如，彼此结合)以形成对靶标具有功能或活性的复合物。在一个实施例中，这些药剂是细胞表面复合物(例如，MHCI)的亚单位，并且功能是结合肽。在一个实施例中，这些药剂是MHCII的亚单位，并且功能是结合肽。在一个实施例中，这些药剂是细胞表面分子(例如，MHCI和肽，例如装载在MHCI分子上的肽)的亚单位，并且功能是呈递肽。在一个实施例中，这些药剂是MHCII和肽(例如，装载在MHCII分子上的肽)的亚单位，并且功能是呈递肽。在一个实施例中，复合物是功能性MHC I，这些药剂是MHC I(α链1-3)和β-2微球蛋白。在一个实施例中，复合物是MHC II，并且这些药剂是MHC IIα链和MHC IIβ链。在一些实施例中，MHC分子包含人MHC I类或II类，例如MHC IIα亚单位和MHC IIβ亚单位或包含这两个亚单位的融合分子或其抗原呈递片段。在一些实施例中，使用具有这两种多肽的RBC用于免疫诱导或抗原呈递。在一些实施例中，RBC包含单一蛋白质，其是MHC分子与抗原之间的融合物，例如单链肽-MHC构建体。在一些实施例中，在运输到表面之前，将复合物的非膜拴系组分(例如肽或β-2微球蛋白)与细胞内的另一种药剂进行组装，然后被细胞分泌，然后被该多聚体的膜拴系组分捕获在表面上，或以纯化形式加入到工程化红细胞中。

在一些实施例中，抗原是自身免疫性抗原，例如表4中的蛋白质或其片段或变体。在一些实施例中，抗原的长度为约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或35个氨基酸。

在一些实施例中，红细胞(例如，网织红细胞)作用于补体级联。一些补体调节蛋白作为彼此的辅因子一齐起作用，例如CFH和CD55是CFI的酶活性的辅因子。在一些实施例中，这些药剂包含加速并增强靶标补体分子上CFI的活性的酶蛋白或结构域(例如，CFI)和辅因子(例如，CFH或CD55)。

在一些实施例中，复合物包含衍生自不同多肽链的多个亚结构域，为了使复合物具有活性，所有这些亚结构域都必须被表达。

补偿配置

当两种或更多种药剂(例如，多肽)具有补偿关系时，第一药剂减少第二药剂的不良特征。例如，在一些实施例中，第二药剂具有给定水平的免疫原性，并且第一药剂例如通过负信号转导免疫细胞(参见表3)或通过屏蔽第二药剂的抗原表位来降低免疫原性。在一些实施例中，第二药剂具有给定的半衰期，并且第一药剂增加第二药剂的半衰期。例如，第一药剂可以包含伴侣蛋白或其片段或变体。

去核类红细胞可以共表达治疗性蛋白及其抑制剂(例如，图8)。抑制剂可以被释放(例如，停止结合治疗剂但保留在细胞表面上)在体内所需位置，以激活治疗性蛋白。

例如，在一些实施例中，类红细胞包含具有治疗活性的第一外源性多肽(例如，抗TNFα抗体分子)、抑制第一外源性多肽的第二外源性多肽(例如，TNFα或其片段或变体)。第二多肽(例如，TNFα)可以抑制第一外源性多肽(例如，抗TNFα)的活性，直至类红细胞处于所需位置，例如在发炎组织处，例如限制脱靶效应。第二外源性多肽(例如，TNFα)可以包含第一外源性多肽(例如，抗TNFα)结合的靶标(例如，内源性TNFα)的变体。例如，变体可以是在靶标存在下竞争淘汰的弱结合变体。在实施例中，第一外源性多肽对第二外源性多肽的Kd比第一外源性多肽对其靶标的Kd大至少2、3、5、10、20、50或100倍。类红细胞任选地包含含有靶向剂的第三外源性多肽。

在一些实施例中，去核类红细胞包含在受试者中的期望部位处成为药物(例如，胰岛素)的前药(例如，前胰岛素)。

包含三种或更多种药剂(例如，多肽)的去核红细胞

在实施例中，本文所述的红细胞(例如，网织红细胞)包含三种或更多种，例如至少4、5、10、20、50、100、200、500或1000种药剂。在实施例中，本文所述的红细胞群体包含三种或更多种，例如至少4、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种药剂，例如，其中该群体中的不同RBC包含不同的药剂或其中该群体中的不同RBC包含不同的多种药剂。在实施例中，RBC中或RBC群体中两种或更多种(例如，全部)药剂具有药剂累加、药剂协同、倍增、独立功能、基于定位、邻近依赖、基于支架、基于多聚体、或补偿活性。

在实施例中，通过使RBC祖细胞与编码这些药剂的多种mRNA进行接触来产生RBC。

真核展示筛选。在一个实施例中，产生组合的高度多样性细胞池，例如用于体外或体内结合测定。可以创建编码细胞表面蛋白的组合的高度多样性核酸文库。这样的文库可以例如由完全可变的序列组成，或者包含与高度可变的组合序列融合的固定序列。这些可以使用诸如电穿孔、转染或病毒转导等方法作为混合物或单独引入红细胞祖细胞中。在一个实施例中，随后使细胞在分化培养基中生长直至所希望的成熟水平。在一个实施例中，将细胞用于高度多路复用的体外测定。将细胞与微量滴定板中的生物样品一起孵育。使用细胞相容性缓冲液以所希望的严格水平来洗涤各孔。分离剩余的细胞并分析特定序列的富集。在一个实施例中，例如使用质谱法在蛋白质水平上进行分析以鉴定在结合群体中富集的氨基酸基序。在一个实施例中，在核酸水平(RNA或DNA)上进行分析以鉴定如下核酸序列，这些核酸序列识别在结合群体中富集的相应氨基酸基序。在一个实施例中，将高度多样性细胞群注射到动物模型(健康或患病)中。在一个实施例中，将细胞进行荧光标记以可视化其体内分布或定位。然后可以收集动物的各种组织并分析特定氨基酸基序或识别相应氨基酸基序的核酸序列的相对富集。

表达优化。大量的变体可以同时转染到单独细胞中以评估它们的相对转录或翻译能力。在实施例中，设计并合成具有多个5'非翻译区、3'非翻译区、密码子表示、氨基酸变化和其他序列差异的蛋白质编码序列文库。此文库将使用诸如电穿孔、转染或病毒转导等方法作为混合物或单独引入红细胞祖细胞中。在一个实施例中，随后使细胞在分化培养基中生长直至所希望的成熟水平。

去核红细胞的物理特性

在一些实施例中，本文所述的RBC(例如，网织红细胞)具有本文所述的一种或多种(例如，2、3、4种或更多种)物理特性，例如渗透脆性、细胞大小、血红蛋白浓度或磷脂酰丝氨酸含量。尽管不希望受理论束缚，但是在一些实施例中，表达外源性蛋白的去核RBC具有类似于野生型未处理的RBC的物理特性。相反，低渗负荷的RBC有时表现出异常的物理特性，如渗透脆性增加、细胞大小改变、血红蛋白浓度降低或细胞膜外叶中磷脂酰丝氨酸水平增加。

在一些实施例中，去核RBC包含由未被细胞保留的外源性核酸编码的、尚未纯化或还没有完全存在于RBC外部的外源性蛋白。在一些实施例中，RBC处于缺乏稳定剂的组合物中。

渗透脆性

在一些实施例中，去核红细胞表现出与不包含外源性多肽的分离的未培养的类红细胞基本相同的渗透膜脆性。在一些实施例中，去核红细胞群体在0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％NaCl下具有小于50％细胞裂解的渗透脆性。可以使用WO 2015/073587的实例59的方法测定渗透脆性。

细胞大小

在一些实施例中，去核RBC具有与野生型未处理的RBC近似的直径或体积。

在一些实施例中，RBC群体具有约4、5、6、7或8微米的平均直径，并且任选地，群体的标准差小于1、2或3微米。在一些实施例中，这一种或多种RBC具有约4-8、5-7或约6微米的直径。在一些实施例中，RBC的直径小于约1微米、大于约20微米，在约1微米和约20微米之间、在约2微米和约20微米之间、在约3微米和约20微米之间、在约4微米和约20微米之间、在约5微米和约20微米之间、在约6微米和约20微米之间、在约5微米和约15微米之间或在约10微米和约30微米之间。在一些实施例中，使用Advia 120血液学体系测量细胞直径。

在一些实施例中，RBC的平均红细胞体积的容积大于10fL、20fL、30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、或大于150fL。在一个实施例中，RBC的平均红细胞体积小于30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、160fL、170fL、180fL、190fL、200fL、或小于200fL。在一个实施例中，RBC的平均红细胞体积在80-100、100-200、200-300、300-400或400-500飞升(fL)之间。在一些实施例中，RBC群体具有此段落所列出的平均红细胞体积，并且群体的标准差小于50fL、40fL、30fL、20fL、10fL、5fL或2fL。在一些实施例中，使用血液学分析仪(例如，Coulter计数器)测量平均红细胞体积。

血红蛋白浓度

在一些实施例中，去核RBC具有与野生型未处理的RBC类似的血红蛋白含量。在一些实施例中，RBC包含大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或大于10％的胎儿血红蛋白。在一些实施例中，RBC包含至少约20pg、22pg、24pg、26pg、28pg或30pg，并且任选地高达约30pg的总血红蛋白。在一些实施例中，使用WO 2015/073587的实例33的德拉布坎(Drabkin's)试剂方法测定血红蛋白水平。

磷脂酰丝氨酸含量

在一些实施例中，去核RBC在其细胞膜的外叶上具有与野生型未处理的RBC大致相同的磷脂酰丝氨酸含量。磷脂酰丝氨酸主要位于野生型未处理的RBC细胞膜的内叶上，并且低渗负荷可以导致磷脂酰丝氨酸分布至它可以引发免疫应答的外叶中。在一些实施例中，RBC群体包含对膜联蛋白V染色呈阳性的少于约30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞。在一些实施例中，通过染色优先结合PS的膜联蛋白-V-FITC和通过流式细胞术测量FITC荧光，例如使用WO 2015/073587的实例54的方法，来评估磷脂酰丝氨酸暴露。

其他特征

在一些实施例中，RBC群体包含对GPA呈阳性的至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％(并且任选地高达90％或100％)的细胞。在一些实施例中，使用FACS检测GPA的存在。

在一些实施例中，RBC在受试者中具有至少30、45或90天的半衰期。

在一些实施例中，包含RBC的细胞群体包含少于约10％、5％、4％、3％、2％或1％的棘状红细胞。

在一些实施例中，RBC被去核，例如，大于50％、60％、70％、80％、90％的包含用作本文所述的治疗制剂的RBC的细胞群体被去核。在一些实施例中，细胞(例如，RBC)含有无功能的(例如，已经失活的)核。

制造去核红细胞的方法

制造包含(例如，表达)外源性药剂(例如，多肽)的去核红细胞(例如，网织红细胞)的方法描述于例如WO 2015/073587和WO 2015/153102中，将其各自通过引用以其全文并入。

在一些实施例中，使造血祖细胞(例如，CD34+造血祖细胞)与编码一种或多种外源性多肽的一种或多种核酸接触，并使细胞在培养中扩增并分化。

在一些实施例中，这两种或更多种多肽在单个核酸(例如，单个载体)中编码。在实施例中，单个载体对于每个基因都具有单独的启动子，具有两种蛋白质，这两种蛋白质最初转录成在中间具有蛋白酶切割位点的单个多肽，从而随后的蛋白水解加工产生两种蛋白质或任何其他合适的配置。在一些实施例中，这两种或更多种多肽在两种或更多种核酸中编码，例如每种载体编码多肽中的一种。

核酸可以例如是DNA或RNA。许多病毒可以用作基因转移媒介物，包括例如逆转录病毒、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒如人免疫缺陷病毒1(HIV 1)和泡沫病毒(spumaviruse)如泡沫病毒(foamy viruse)。

在一些实施例中，使用例如如WO 2014/183071或WO 2014/183066中所描述的sortagging来产生细胞，将其各自通过引用以其全文并入。

在一些实施例中，RBC被扩增至少1000、2000、5000、10,000、20,000、50,000或100,000倍(并且任选地高达100,000、200,000或500,000倍)。在一些实施例中，使用自动化细胞计数器测量细胞数量。

在一些实施例中，RBC群体包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％(并且任选地高达约80％、90％或100％)的去核RBC。在一些实施例中，RBC群体含有少于1％的活的去核细胞，例如，不含有可检测的活的去核细胞。在一些实施例中，使用核染色通过FACS测量去核。在一些实施例中，群体中至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％(并且任选地高达约70％、80％、90％或100％)的RBC包含一种或多种(例如，2、3、4种或更多种)外源性多肽。在一些实施例中，使用针对多肽的标记抗体通过FACS测量多肽的表达。在一些实施例中，群体中至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％(并且任选地高达约70％、80％、90％或100％)的RBC被去核并且包含一种或多种(例如，2、3、4种或更多种)外源性多肽。在一些实施例中，RBC群体包含约1x10⁹–2x10⁹、2x10⁹–5x10⁹、5x10⁹–1x10¹⁰、1x10¹⁰–2x10¹⁰、2x10¹⁰–5x10¹⁰、5x10¹⁰–1x10¹¹、1x10¹¹–2x10¹¹、2x10¹¹–5x10¹¹、5x10¹¹–1x10¹²、1x10¹²–2x10¹²、2x10¹²–5x10¹²、或5x10¹²–1x10¹³个细胞。

物理上邻近的协同剂

在一些方面，本披露提供了包含彼此物理接近的第一药剂和第二药剂的组合物。在一些实施例中，当药剂彼此物理接近时，这些药剂协同作用，但当它们分开时不协同作用。在一些实施例中，第一和第二药剂共价连接的，例如是融合蛋白的一部分或者化学缀合在一起。在一些实施例中，第一和第二药剂是非共价连接的，例如直接相互结合或结合到支架上。在一些实施例中，第一和第二药剂是(例如，连接到)纳米颗粒(例如，直径为1-100nm、100-2,500nm或2,500-10,000nm)、脂质体、囊泡、珠、聚合物、植入物或多肽复合物的一部分。

在一些实施例中，组合物包含彼此物理接近(例如，共价或非共价连接)的至少3、4、5、6、7、8、9或10种不同的药剂。

在一些实施例中，组合物包含本文所述的一种或多种(例如，2、3、4、5种或更多种)药剂，例如本文所述的外源性多肽，例如表1、表2、表3或表4中任一个中的多肽或其片段或变体或其抗体分子。在一些实施例中，一种或多种(例如，2、3种或更多种)外源性多肽包含细胞因子、白细胞介素、细胞因子受体、Fc结合分子、T细胞激活配体、T细胞受体、免疫抑制性分子、共刺激分子、MHC分子、APC结合分子、自身抗原、过敏原、毒素、靶向剂或TRAIL受体配体。

在一些实施例中，一种或多种(例如，2、3种或更多种)外源性多肽包含TRAIL受体配体，例如本文中SEQ ID NO:1-5中任一个的序列或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列，或结合TRAIL受体的抗体分子。在一些实施例中，第一药剂结合第一TRAIL受体(例如，TRAIL-RI)，并且第二药剂结合第二TRAIL受体(例如，TRAIL-RII)。在实施例中，与单独的任一种TRAIL受体配体相比，邻近的两种TRAIL受体配体在靶细胞中提供协同程度的细胞凋亡。当用包含两种非常接近的TRAIL受体配体的组合物(例如，在去核红细胞的表面上)处理靶细胞时，本文实例1证明了协同活性。

包含一种或多种药剂的工程化红细胞

在一些方面，本披露提供了包含外源性药剂的工程化红细胞(例如，网织红细胞)。更具体而言，在一些方面，本披露提供了包含外源性多肽的去核红细胞(例如，网织红细胞)。红细胞任选地进一步包含第二种不同的外源性多肽。

在一些实施例中，外源性多肽(例如，由任选地进一步包含第二外源性多肽的红细胞包含的外源性多肽)是本文所述的外源性多肽。在实施例中，多肽选自表1、表2、表3或表4中任一个或其片段或变体或其抗体分子。

在一些实施例中，外源性多肽(例如，由任选地进一步包含第二外源性多肽的红细胞包含的外源性多肽)包含刺激性配体，例如CD80、CD86、41BBL、或其任何组合。在一些实施例中，外源性多肽包含T细胞抑制剂如IL-10和PD-L1或其组合，例如用于治疗炎性疾病。

本文所述的多肽的媒介物

尽管在本文的许多实施例中，这一种或多种(例如，两种或更多种)外源性多肽位于红细胞上或红细胞中，但是应理解，本文所述的任何外源性多肽或外源性多肽的组合也可以位于另一媒介物上或另一媒介物中。媒介物可以包含例如细胞、类红细胞、小体、纳米颗粒、胶束、脂质体或外来体。例如，在一些方面，本披露提供了例如在其表面上包含本文所述的一种或多种药剂的媒介物(例如，细胞、类红细胞、小体、纳米颗粒、胶束、脂质体或外来体)。在一些实施例中，这一种或多种药剂包含结合PD-1的多肽(例如，结合PD-1的抗体分子或PD-1的激动剂如PD-L1)、结合PD-L1的多肽(例如，结合PD-L1的抗体分子)、结合CD20的多肽(例如，结合CD20的抗体分子)或结合TRAIL受体的多肽(例如，TRAIL受体的激动剂)。在一些实施例中，这一种或多种药剂包含选自表1、表2、表3或表4中任一个的多肽或其片段或变体、或其激动剂或拮抗剂、或其抗体分子的药剂。在一些实施例中，媒介物包含本文所述的两种或更多种药剂，例如本文所述的任何药剂对。

在一些实施例中，媒介物包含类红细胞。在实施例中，类红细胞是有核红细胞、红细胞前体或去核红细胞。在实施例中，类红细胞是脐带血干细胞、CD34+细胞、造血干细胞(HSC)、脾集落形成(CFU-S)细胞、普通髓系祖细胞(CMP)、胚细胞集落形成细胞、爆发集落形成单位红细胞(BFU-E)、巨核细胞红祖细胞(MEP)、红细胞集落形成单位(CFU-E)、网织红细胞、红细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、多染性正成红细胞、正染性正成红细胞(orthochromatic normoblast)、或其组合。在一些实施例中，类红细胞是永生的或永生化的细胞。

包封在膜中的细胞

在一些实施例中，本文所述的去核类红细胞或其他媒介物被包封在膜(例如，半透膜)中。在实施例中，膜包含多糖，例如阴离子多糖藻酸盐。在实施例中，半透膜不允许细胞穿过，但允许小分子或大分子(例如，代谢物、蛋白质或DNA)通过。在实施例中，膜是Lienert等人,“Synthetic biology in mammalian cells:next generation research tools andtherapeutics[哺乳动物细胞中的合成生物学：下一代研究工具和治疗剂]”NatureReviews Molecular Cell Biology[自然评论与分子细胞生物学]15,95–107(2014)中所描述的膜，将其通过引用以其全文并入本文。尽管不希望受理论束缚，但是在一些实施例中，膜使细胞屏蔽免疫系统和/或保持多个细胞接近，从而促进彼此或彼此的产物的相互作用。

用本文的组合物(例如，去核红细胞)治疗的方法

给予包含(例如，表达)外源性药剂(例如，多肽)的去核红细胞(例如，网织红细胞)的方法描述于例如WO 2015/073587和WO 2015/153102中，将其各自通过引用以其全文并入。

在实施例中，将本文所述的去核红细胞给予受试者，例如哺乳动物，例如人。可以治疗的示例性哺乳动物包括但不限于：人、家畜(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。本文所述的方法适用于人类疗法和兽医应用两者。

在一些实施例中，每1、2、3、4、5或6个月向患者给予RBC。

在一些实施例中，RBC的剂量包含约1x10⁹–2x10⁹、2x10⁹–5x10⁹、5x10⁹–1x10¹⁰、1x10¹⁰–2x10¹⁰、2x10¹⁰–5x10¹⁰、5x10¹⁰–1x10¹¹、1x10¹¹–2x10¹¹、2x10¹¹–5x10¹¹、5x10¹¹–1x10¹²、1x10¹²–2x10¹²、2x10¹²–5x10¹²、或5x10¹²–1x10¹³个细胞。

在一些实施例中，以足以在2周至一年(例如，一个月至一年或更长时间，例如至少2周、4周、6周、8周、3个月、6个月、一年、2年)的时间段内维持患者的血流中给予的RBC的功能的给药方案(给药剂量和周期)向患者给予RBC。

在一些方面，本披露提供了治疗本文所述的疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者给予本文所述的组合物，例如本文所述的去核红细胞(例如，网织红细胞)。在一些实施例中，疾病或病症是炎性疾病或自身免疫性疾病。在一些方面，本披露提供了本文所述的RBC用于治疗本文所述的疾病或病症(例如，免疫病症，例如炎性疾病或自身免疫性疾病，例如表4中的自身免疫性疾病)的用途。在一些方面，本披露提供了本文所述的RBC用于制造用以治疗本文所述的疾病或病症(例如，免疫病症，例如炎性疾病或自身免疫性疾病，例如表4中的自身免疫性疾病)的药物的用途。

炎性疾病包括败血症(例如，细菌性败血症)、类风湿性关节炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、系统性红斑狼疮(结缔组织炎性障碍)、肾小球性肾炎(肾脏毛细血管炎症)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、乳糜泻或其他特发性炎性肠病以及过敏性哮喘。

自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、1型糖尿病或表4中的疾病。

免疫缺陷包括原发性免疫缺陷(例如，腺苷脱氨酶缺乏症-重症联合免疫缺陷(ADA-SCID))和例如继发性免疫缺陷(例如，继发于免疫抑制疗法)。

附加表格

表5.示例性修饰剂，例如蛋白酶

表6.与靶标相互作用的示例性第一外源性多肽

实例

实例1.在表面上表达两种不同TRAIL受体配体的eRBC的药剂协同活性

合成了TRAIL受体激动剂DR4.2(SEQ ID 2)和DR5.2(SEQ ID 5)的基因。将基因克隆到人血型糖蛋白A的基因上游的慢病毒载体(SBI)中，并通过编码12个氨基酸的Gly-Ser(GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:19))柔性接头和HA表位标签(YPYDVPDY(SEQ ID NO:20))的序列来分开。

从澳赛尔斯公司(AllCells Inc.)购买冷冻源自正常人供体的移动的外周血细胞的人CD34+细胞。将细胞在含有1％FBS的PBS中解冻。然后将细胞以1E5个细胞/mL的密度用StemSpan CC100细胞因子混合物在StemSpan SFEM培养基中进行培养。将培养基在第5天更换为分化培养基。

如下进行病毒生产方案。简而言之，在转染前24小时接种HEK293T细胞。用包含构建体的慢病毒载体连同包装质粒一起转染细胞。转染后24小时进行培养基更换，并在转染后72小时收获病毒。在解冻后第6天，将细胞用等体积的各病毒以1:1细胞体积与病毒体积比进行转导，并与5-10μg/ml聚凝胺一起在845xg下离心1.5小时。

根据Hu等人,Blood[血液]2013年4月18日第121卷,16的方法，转导的细胞在确定的培养基中分化成类红细胞谱系细胞和成熟的去核网织红细胞。简而言之，细胞培养程序由3个阶段组成。基础培养基的组成为伊斯科夫改性杜氏培养基、2％人外周血浆、3％人AB血清、200mg/mL Holohuman转铁蛋白、3IU/mL肝素和10mg/mL胰岛素。在第一阶段(第0天至第6天)，将浓度为10^5/mL的CD341细胞在10ng/mL干细胞因子、1ng/mL Il-3和3IU/mL促红细胞生成素的存在下进行培养。在第二阶段(第7天至第11天)，从培养基中删除IL-3。在持续到第21天的第三阶段，将细胞浓度分别调整为第11天的10^6/mL和第15天的5x10^6/mL。此阶段的培养基是基础培养基加3IU/mL促红细胞生成素，并将转铁蛋白浓度调整为1mg/mL。

通过用已经与互补性荧光染料荧光素和DyLight 650化学缀合的可溶性TRAIL R1和TRAIL R2(购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Inc.))进行标记并通过流式细胞术染色来监测转基因的表达。通过流式细胞术验证配体DR4.2和DR5.2两者的表达水平。

根据Marconi等人,Cell Death and Disease[细胞死亡与疾病]2013的修改版本进行细胞凋亡测定。简而言之，将表达DR4.2和DR5.2的完全成熟的去核网织红细胞与CFSE标记的拉吉细胞以1:1的比率一起孵育24小时。然后用膜联蛋白V对细胞进行染色并通过流式细胞术进行分析。由也对膜联蛋白V染色呈阳性的CFSE阳性拉吉细胞确定细胞凋亡百分比。

如图1所示，当CFSE标记的拉吉细胞与未转导的、DR4.2转导的、DR5.2转导的、或DR4.2转导的和DR5.2转导的培养的网织红细胞的混合物一起孵育时，观察到与背景相比最小的细胞死亡。然而，当CFSE标记的拉吉细胞与已同时用DR4.2和DR5.2两者转导并因此同时表达两种蛋白质的培养的网织红细胞一起孵育时，观察到显著量的细胞死亡(相当于在用拉吉细胞进行的此测定中可实现的最大量的TRAIL诱导的细胞凋亡-参见例如Marconi等人,Cell Death and Disease[细胞死亡与疾病]2013)。此数据表明，相对于表达单一TRAIL受体激动剂的细胞以及甚至各自表达不同的TRAIL受体激动剂的细胞的混合物，TRAIL受体激动剂在单个工程化红细胞表面上的协同作用能够以协同方式诱导细胞杀伤。

包含TRAIL受体激动剂并任选地进一步包含靶向自体反应性免疫细胞的部分的细胞群可以在AS-3添加剂溶液中进行配制并且静脉内给予患者，例如患有自身免疫性疾病的患者。

实例2.产生包含5种细胞因子的、用于治疗败血症的捕获eRBC

由商业供应商合成抗TNFα(SEQ ID 7)、抗IL6(SEQ ID 6)、CD14(Uniprot#P08571)、IFNGR1(Uniprot#P15260)和IL12R1(Uniprot#P42701)的基因。将基因克隆到人血型糖蛋白A的基因上游的慢病毒载体(SBI)中，并通过编码12个氨基酸的Gly-Ser(GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:19))柔性接头和HA表位标签(YPYDVPDY(SEQ ID NO:20))的序列来分开。

如实例1中所述，可以培养人CD34+细胞，并且可以产生病毒。如本文所述使转导细胞进行分化。

为了评估转基因的表达，将细胞同时用与互补性荧光染料化学缀合的配体TNFα、IL-6、IFNg和IL-12(购自生命科技公司(Life Technologies))以及脂多糖(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))进行标记。通过流式细胞术分析细胞以验证(a)这些药剂均在细胞表面上表达，和(b)这些药剂能够结合其靶配体。

将细胞群在AS-3添加剂溶液中进行配制，并静脉内给予正在发展败血症的患者。预计如通过循环细胞因子水平的降低、血管渗漏综合征的减少或预防以及存活的改善所测量的，患者显示其症状得到改善。

实例3：靶蛋白的捕获和修饰

在此实例中，使用转基因去核类红细胞来捕获和修饰靶蛋白。对照细胞和实验细胞各自在其膜中包含内源性血型糖蛋白A(GPA)，其用于结合靶蛋白。实验细胞表达包含表面暴露IdeS的外源性蛋白，该表面暴露IdeS与作为膜锚着点的GPA融合。IdeS能够切割抗体以产生F(ab’)2片段和Fc片段。靶蛋白是用FITC进行荧光标记的抗GPA抗体。靶抗体的恒定区和可变区都是FITC标记的，所以如果抗体被切割，则可以检测到这两个片段。

首先，通过FACS来测试对照细胞和表达IdeS的细胞结合抗GPA抗体的能力。如通过FITC与细胞的缔合所测量的，对照细胞和表达IdeS的细胞都结合抗体(数据未显示)。另外，如通过或使用荧光标记的抗兔Fc抗体进行的第二检测方法所测量的，对照细胞和表达IdeS的细胞都结合抗体(数据未显示)。这些测量是在孵育细胞以允许IdeS介导的对靶抗体的切割之前的早期时间点进行的。

相比之下，只有表达IdeS的细胞能够切割靶抗体。通过将对照细胞或表达IdeS的细胞与靶抗体一起孵育以使抗体切割发生而显示了这一点。将荧光标记的抗兔Fc抗体添加至反应中以检测类红细胞表面上的完整抗体。表达IdeS的细胞显示与细胞的抗兔Fc缔合减少(图2)，这表明与对照细胞相比，表达IdeS的细胞表面上的Fc水平更低。与对照细胞或表达IdeS的细胞缔合的直接FITC标记的靶抗体的量没有减少，这表明至少靶抗体的FITC标记的可变区仍然结合表达IdeS的细胞和对照细胞。此结果通过蛋白质印迹得到证实，其中使用抗兔重链和抗兔轻链抗体来检测对照细胞或表达IdeS的细胞的上清液中的完整抗体和切割的抗体。实验显示，表达IdeS的类红细胞而非对照类红细胞切割抗GPA抗体，这导致重链片段的出现(图3)。

因此，对照细胞能够结合靶抗体，但只有表达IdeS的细胞能够结合并切割靶抗体。

实例4：共表达抗CD20和TRAIL配体的红细胞治疗剂

当类红细胞被工程化以同时表达抗CD20以及Trail配体(细胞凋亡诱导剂)时，拉莫斯(Ramos)细胞与RCT-抗CD20、RCT-Trail和RCT-抗CD20+Trail(共表达)的共培养在48小时后分别发挥32％、47％和76％的细胞凋亡，这表明共表达RCT的协同细胞杀伤作用。

包含TRAIL配体、抗CD20部分并任选地进一步包含特异性靶向自体反应性免疫细胞的部分的细胞群可以在AS-3添加剂溶液中进行配制并且静脉内给予患者，例如患有自身免疫性疾病的患者。

本发明提供了：

1.一种去核红细胞，例如网织红细胞，包含多种外源性多肽，其中所述多种多肽中的第一和第二外源性多肽具有药剂累加、药剂协同、倍增、独立功能、基于定位、邻近依赖、基于支架、基于多聚体、或补偿活性。

2.一种去核红细胞，例如网织红细胞，包含第一外源性多肽、第二外源性多肽和第三外源性多肽。

3.一种去核红细胞，例如网织红细胞，包含第一外源性多肽和第二外源性多肽，其中：

a)该第一和第二外源性多肽作用于相同的靶标，其中任选地该靶标是细胞表面受体和/或内源性人蛋白；

b)该第一外源性多肽结合第一内源性人蛋白并且该第二外源性多肽结合第二内源性人靶蛋白，例如以小于500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM、5nM、2nM、或1nM的Kd；

c)该第一外源性多肽作用于(例如，结合)第一靶标，并且该第二外源性多肽作用于(例如，结合)第二靶标，其中该第一和第二靶标是相同生物学途径的成员，其中任选地这些靶标是细胞表面受体、内源性人蛋白或两者；

d)该第一外源性多肽包含第一促凋亡多肽，并且该第二外源性多肽包含第二促凋亡多肽，例如TRAIL受体配体，例如TRAIL多肽；

e)该第一和第二外源性多肽彼此非常接近，例如相距小于10nm、7nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.5nm、0.2nm、或0.1nm持续至少1秒、2秒、5秒、10秒、30秒或60秒，1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、30分钟、或60分钟，或1小时、2小时、3小时、6小时、12小时或14小时的持续时间；

f)该第一和第二外源性多肽彼此具有小于500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM、5nM、2nM、或1nM的Kd；

g)该第一外源性多肽包含抗原呈递多肽，例如MHC分子，例如MHC II类分子，并且该第二外源性多肽包含抗原；

h)该第一和第二外源性多肽作用于不同的靶标，其中任选地这些靶标中的至少一种是细胞表面受体和/或内源性人蛋白，例如该第一外源性多肽结合第一细胞类型，例如免疫效应细胞，并且该第二外源性多肽结合第二细胞类型，例如免疫效应细胞，例如T细胞；

i)该第一外源性多肽和该第二外源性多肽具有按重量计或按拷贝数计约1:1、从约2:1至1:2、从约5:1至1:5、从约10:1至1:10、从约20:1至1:20、从约50:1至1:50、从约100:1至1:100的丰度比；

j)该第一外源性多肽和该第二外源性多肽分别对第一靶标和第二靶标具有如下Kd，其比率为约1:1、从约2:1至1:2、从约5:1至1:5、从约10:1至1:10、从约20:1至1:20、从约50:1至1:50、从约100:1至1:100；

k)该第一外源性多肽对第一靶标具有第一活性(例如，结合)，并且该第二外源性多肽对该第一靶标具有第二活性(例如，结合)，例如该第一和第二外源性多肽结合单个靶标；

l)该第一外源性多肽作用于(例如，结合)第一靶标，并且该第二外源性多肽作用于(例如，结合)第二靶标，并且该第一和第二靶标是相同途径的一部分，其中任选地该第一外源性多肽作用于该第一靶标，并且该第二外源性多肽同时作用于该第二靶标；

m)该第一外源性多肽作用于(例如，结合)第一靶标，并且该第二外源性多肽作用于(例如，结合)第二靶标，并且该第一和第二靶标是不同途径的一部分，其中任选地该第一和第二途径二者起作用以促进给定的细胞应答；

n)该第一外源性多肽将该去核红细胞定位于所需位点，例如人细胞，并且该第二外源性多肽具有治疗活性，例如免疫调节活性，如T细胞激活活性或抗原呈递活性；

o)该第一外源性多肽结合第一细胞，例如第一细胞类型，并且该第二外源性多肽结合第二细胞，例如第二细胞类型，例如免疫效应细胞，例如T细胞；

p)该第一外源性多肽和该第二外源性多肽是非人蛋白；

q)该第一外源性多肽和该第二外源性多肽都是酶，例如生物合成酶；

r)该第一外源性多肽促进中间体分子的形成，并且该第二外源性多肽作用于该中间体分子；或

s)该第一外源性多肽和该第二外源性多肽作用于途径的连续步骤。

4.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中该第一和第二外源性多肽具有药剂累加活性。

5.如项4所述的去核红细胞，其中该第一多肽包含细胞因子受体，例如表1中的细胞因子受体或其片段或变体，并且该第二外源性多肽包含不同的细胞因子受体，例如表1中的细胞因子受体或其片段或变体。

6.如项1-3中任一项所述的去核红细胞，其中该第一和第二外源性多肽具有药剂协同活性。

7.如项6所述的去核红细胞，其中该第一外源性多肽包含介导细胞凋亡的第一细胞受体的配体(例如，是TRAIL受体的配体，例如包含TRAIL多肽)，并且该第二外源性多肽包含介导细胞凋亡的第一细胞受体的配体(例如，是TRAIL受体的配体，例如包含TRAIL多肽)。

8.如项1-3中任一项所述的去核红细胞，其中该第一和第二外源性多肽具有倍增活性。

9.如项8所述的去核红细胞，其中该第一外源性多肽包含抗原，并且该第二外源性多肽包含抑制性配体，例如诱导耐受性的配体。

10.如项8所述的去核红细胞，其中该第一外源性多肽包含表4中的抗原。

11.如项1-3中任一项所述的去核红细胞，其中该第一和第二外源性多肽具有独立功能活性。

12.如项11所述的去核红细胞，其中该第一外源性多肽结合第一细胞因子，并且该第二外源性多肽结合第二细胞因子。

13.如项1-3中任一项所述的去核红细胞，其中该第一和第二外源性多肽具有基于定位的活性。

14.如项13所述的去核红细胞，其中该第一外源性多肽包含结合发炎脉管系统的靶向部分，并且该第二外源性多肽包含抗炎分子。

15.如项1-3中任一项所述的去核红细胞，其中该第一和第二外源性多肽具有邻近依赖活性。

16.如项15所述的去核红细胞，其中在与一个或多个靶标部分相互作用之前、期间或之后所述多种多肽之间的接近赋予在体内或体外不存在这种接近时不会看到的特性或结果。

17.如项15所述的去核红细胞，其中该第一外源性多肽与靶细胞(例如，免疫效应细胞，例如T细胞)上的第一靶标部分(例如，第一靶细胞多肽)相互作用，例如结合，并且该第二外源性多肽与该靶细胞上的第二靶标部分(例如，第二靶细胞多肽)相互作用，例如结合(例如，其中该第一和第二靶细胞多肽的结合改变该靶细胞的生物学特性)。

18.如项1-3中任一项所述的去核红细胞，其中该第一和第二外源性多肽具有基于支架的活性。

19.如项18所述的去核红细胞，其中该第一多肽结合抗原呈递细胞，并且该第二多肽结合T细胞。

20.如项1-3中任一项所述的去核红细胞，其中该第一和第二外源性多肽具有基于多聚体的活性。

21.如项20所述的去核红细胞，其中该第一外源性多肽包含MHCIIα链，并且该第二外源性多肽包含MHCIIβ链多肽。

22.如项1-3中任一项所述的去核红细胞，其中该第一和第二外源性多肽具有补偿活性。

23.如项22所述的去核红细胞，其中该第一外源性多肽是治疗性蛋白，并且该第二外源性多肽是该第一外源性多肽的抑制剂。

24.如项23所述的去核红细胞，其中该第一外源性多肽结合靶标比该第一外源性多肽结合该第二外源性多肽更强。

25.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中该第一外源性多肽促进该红细胞与靶细胞的融合，并且该第二外源性多肽是表1、表2或表3中任一个中的多肽。

26.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中该第一和第二外源性多肽彼此相互作用，例如该第一外源性多肽修饰该第二外源性多肽，例如通过切割或磷酸化。

27.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中该第一和第二外源性多肽形成二聚体或多聚体蛋白。

28.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其包含至少2种但不超过5、6、7、8、9或10种不同的外源性多肽，例如由一种或多种未被该去核红细胞保留的外源性核酸编码的外源性多肽。

29.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中这些外源性多肽由一种或多种未被该去核红细胞保留的外源性核酸编码。

30.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中该第一、第二和任选地第三外源性多肽中的一种或多种(例如，两种或三种)是跨膜多肽或表面锚定多肽。

31.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中该第一外源性多肽与靶细胞上的部分相互作用，例如结合，并且该第二外源性多肽改变该靶细胞的特性，例如杀死或激活该靶细胞。

32.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中该第一外源性多肽和该第二外源性多肽具有按重量计或按拷贝数计约1:1、从约2:1至1:2、从约5:1至1:5、从约10:1至1:10、从约20:1至1:20、从约50:1至1:50、或从约100:1至1:100的丰度比。

33.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中该第一和第二多肽两者都具有化学计量作用模式，或两者都具有催化作用模式，并且两者都以相似的丰度存在，例如约1:1或从约2:1至1:2。

34.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中该第一外源性多肽比该第二外源性多肽按重量计或按拷贝数计更丰富至少约10％、20％、30％、50％，或2、3、4、5、10、20、50或100倍(并且任选地高达10或100倍)。

35.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中该第一多肽具有化学计量作用模式，并且该第二多肽具有催化作用模式，并且该第一多肽比该第二多肽更丰富。

36.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其具有以下特征中的一个或多个：

e)渗透脆性为在0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％NaCl下小于50％的细胞裂解；

f)细胞容积为约10-200fL，或细胞直径在约1微米和约20微米之间、在约2微米和约20微米之间、在约3微米和约20微米之间、在约4微米和约20微米之间、在约5微米和约20微米之间、在约6微米和约20微米之间、在约5微米和约15微米之间、或在约10微米和约30微米之间；

g)大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的胎儿血红蛋白；或至少约20、25或30pg/细胞的血红蛋白；或

h)外叶的磷脂酰丝氨酸含量小于30％、25％、20％、15％、10％或5％，如通过膜联蛋白V染色所测量的。

37.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中所述多种外源性多肽中的至少一种(例如，全部)被糖基化。

38.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其是网织红细胞。

39.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中该一种或多种外源性多肽缺乏分选酶转移标记，如LPXTG(SEQ ID NO:17)。

40.如前述项中任一项所述的去核红细胞，其中外源性多肽，例如融合蛋白：

i)在该类红细胞表面上的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白具有相同的序列，

ii)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白具有相同的跨膜区，

iii)该融合蛋白不包括全长内源性膜蛋白，例如包含全长内源性膜蛋白的区段，该区段缺少该全长内源性膜蛋白的至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、200或500个氨基酸；

iv)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白彼此之间相差不超过1、2、3、4、5、10、20或50个氨基酸，

v)该外源性多肽缺乏分选酶转移标记，

vi)该外源性多肽包含存在于少于1、2、3、4或5种序列不同的融合多肽上的部分；

vii)该外源性多肽作为单一融合多肽而存在；

viii)该融合蛋白在内源性跨膜蛋白和该部分的连接处不含有Gly-Gly；

ix)该融合蛋白不含有Gly-Gly，或该融合蛋白不含有Gly-Gly或不含有胞外区中的Gly-Gly，不含有在跨膜区段的1、2、3、4、5、10、20、50或100个氨基酸内的胞外区中的Gly-Gly；或其组合。

41.一种去核类红细胞，包含：

与靶标相互作用的第一外源性多肽，和

修饰该靶标的第二外源性多肽；

其中以下中的一个或多个：

(a)该第二外源性多肽包含切割抗体的部分，例如在铰链区、CH2区或在铰链和CH2区之间切割的部分，例如IdeS多肽；

(b)该第二外源性多肽包含修饰该靶标(例如，对靶标上的位点有特异性，例如与靶标上的位点结合)、结合(例如，特异性地)并修饰(例如，共价修饰，例如切割)该靶标、或去除该靶标或将部分连接至该靶标的酶(例如，蛋白酶)，其中该靶标任选地是抗体或补体因子；

(c)该第二外源性多肽包含修饰该靶标的二级、三级或四级结构，并且在实施例中，改变(例如，降低或增加)该靶标与另一分子(例如，该第一外源性多肽或不同于该第一外源性多肽的分子)相互作用的能力的多肽，例如酶，例如蛋白酶，其中任选地该靶标包含抗体或补体因子；

(d)该第二外源性多肽包含在第一靶结构域和第二靶结构域(例如，结合第一底物的第一靶结构域和结合第二底物的第二靶结构域)之间切割该靶标(例如，多肽)的多肽，例如酶(例如，蛋白酶)；

(e)该靶标是多肽(例如，自身抗体或补体因子)；碳水化合物(例如，聚糖)，脂质(例如，磷脂)或核酸(例如，DNA或RNA)；

(f)该第一外源性多肽结合靶标(例如，抗体)但不切割键，例如共价键，例如该抗体中的共价键，并且该第二外源性多肽切割键，例如共价键，例如该抗体中的共价键；

(g)该靶标包含抗体并且该第一外源性多肽结合该抗体靶标的可变区；

(h)该靶标包含抗体并且该第一外源性多肽结合该抗体靶标的恒定区；

(i)该第一外源性多肽对该靶标的亲和力为约1-2pM、2-5pM、5-10pM、10-20pM、20-50pM、50-100pM、100-200pM、200-500pM、500-1000pM、1-2nM、2-5nM、5-10nM、10-20nM、20-50nM、50-100nM、100-200nM、200-500nM、500-1000nM、1-2μM、2-5μM、5-10μM、10-20μM、20-50μM或50-100μM；

(j)该第二外源性多肽对该靶标的K_M为约10^-1-10^-7M、10^-1-10^-2M、10^-2-10^-3M、10^-3-10^-4M、10^-4-10^-5M、10^-5-10^-6M或10^-6-10^-7M；

(k)该第一外源性多肽对该靶标的K_d(以M测量)除以该第二外源性多肽对该靶标的K_M(以M测量)的比率为约1x10^-9–2x10^-9、2x10^-9–5x10^-9、5x10^-9–1x10^-8、1x10^-8–2x10^-8、2x10^-8–5x10^-8、5x10^-8–1x10^-7、1x10^-7–2x10^-7、2x10^-7–5x10^-7、5x10^-7–1x10^-6、1x10^-6–2x10^-6、2x10^-6–5x10^-6、5x10^-6–1x10^-5、1x10^-5–2x10^-5、2x10^-5–5x10^-5、5x10^-5–1x10^-4、1x10^-4–2x10^-4、2x10^-4–5x10^-4、5x10^-4–1x10^-3、1x10^-3–2x10^-3、2x10^-3–5x10^-3、5x10^-3–1x10^-2、1x10^-2–2x10^-2、2x10^-2–5x10^-2、5x10^-2–1x10^-1、1x10^-1–2x10^-1、2x10^-1–5x10^-1或5x10^-1–1；

(l)观察到的修饰该靶标的该第二外源性多肽的反应速率大于在其他方面类似的反应条件下相似但缺乏该第一外源性多肽的去核细胞的反应速率；

(m)该类红细胞上该第一外源性多肽的平均数与该类红细胞上该第二外源性多肽的平均数的比率为约50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:20或1:50；

(n)该第一外源性多肽对该靶标的亲和力大于该第一外源性多肽对该修饰的(例如，切割的)靶标的亲和力；

(o)该去核类红细胞的治疗有效剂量小于给予时在受试者外周血中的靶标的量的化学计量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(p)有效剂量的去核类红细胞的数量小于给予时在该受试者外周血中的靶标(例如，靶分子)的数量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(q)由预选量(例如，有效剂量)的去核类红细胞或体外有效量的去核类红细胞包含的第二外源性多肽的数量小于靶标的参考值，例如小于给予时在该受试者外周血中的靶标的数量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(r)由预选量(例如，有效剂量)的去核类红细胞或体外有效量的去核类红细胞包含的第一外源性多肽的数量小于靶标的参考值，例如小于给予时在该受试者外周血中的靶标的数量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(s)由预选量的去核类红细胞(例如，有效剂量的去核类红细胞)包含的第一外源性多肽的数量和第二外源性多肽的数量各自小于靶标的参考值，例如小于给予时在该受试者外周血中的靶标的数量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)；

(t)该第二外源性多肽以至少10^-1M、10^-2M、10^-3M、10^-4M、10^-5M、10^-6M或10^-7M的K_M修饰(例如切割)该靶标；

(u)该第二外源性多肽包含伴侣蛋白；

(v)该第一外源性多肽包含表面暴露部分，并且该第二外源性多肽包含表面暴露部分；或

(w)这些去核类红细胞的有效量小于在其他方面类似的缺乏该第二外源性多肽的去核类红细胞的有效量(例如，小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％)。

42.如项41所述的去核类红细胞，其中(b)该第二外源性多肽包含修饰该靶标(例如，对靶标上的位点有特异性，例如与靶标上的位点结合)、结合(例如，特异性地)并修饰(例如，共价修饰，例如切割)该靶标、或去除该靶标或将部分连接至该靶标的酶(例如，蛋白酶)，其中该靶标任选地是抗体，例如自身抗体。

43.如项41或42所述的去核类红细胞，其中该修饰改变(例如，增加或降低)该靶标与另一分子(例如，该第一外源性多肽或不同于该第一外源性多肽的分子)相互作用的能力。

44.如项41-43中任一项所述的去核类红细胞，其中(d)该第二外源性多肽包含在第一靶结构域和第二靶结构域(例如，结合第一底物的第一靶结构域和结合第二底物的第二靶结构域)之间切割该靶标(例如，多肽)的多肽，例如酶(例如，蛋白酶)。

45.如项44所述的去核类红细胞，其中该第一靶结构域从该第二靶结构域中释放出来。

46.如项44或45所述的去核类红细胞，其中切割改变该第一靶结构域对第一底物的亲和力和该第二靶结构域对第二底物的亲和力中的一者或两者。

47.如项41-46中任一项所述的去核类红细胞，其中该靶标包含抗体(例如，自身抗体)，并且该第一靶结构域包含一个或多个CDR，并且该第二靶结构域包含恒定区的一部分，例如Fc区。

48.如项41-47中任一项所述的去核类红细胞，其中该靶标不是感染性组分，例如不是细菌组分、病毒组分、真菌组分或寄生组分。

49.如项41-48中任一项所述的去核类红细胞，其中该第一外源性多肽包含靶标结合结构域。

50.如项41-49中任一项所述的去核类红细胞，其中该第一外源性多肽的该表面暴露部分结合该靶标。

51.如项41-50中任一项所述的去核类红细胞，其中该第二外源性多肽的该表面暴露部分包含酶活性，例如蛋白酶活性。

52.如项41-51中任一项所述的去核类红细胞，其中该第二外源性多肽的该表面暴露部分酶促修饰(例如，切割)该靶标。

53.如项41-52中任一项所述的去核类红细胞，其中该靶标包含自身抗体，该第一外源性多肽包含该自身抗体所结合的多肽，并且该第二外源性多肽包含切割该自身抗体以产生Fab部分和Fc部分的蛋白酶。

54.如项41-53中任一项所述的去核类红细胞，其中该去核红细胞能够以比在其他方面类似的缺乏该第二外源性多肽的去核红细胞更快的速率从受试者的身体中清除该靶标。

55.如项41-54中任一项所述的去核类红细胞，其中该去核红细胞与该靶标或作用于该靶标的该第二外源性蛋白的反应产物进行复合，例如在切割期间。

56.一种去核类红细胞，包含：

第一外源性多肽，其包含跨膜结构域和能够结合自身抗体的表面暴露多肽，和

第二外源性多肽，其包含跨膜结构域和表面暴露IdeS多肽。

57.一种制剂，例如药物制剂，包含多个如项1-56中任一项所述的细胞，例如至少10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²个细胞。

58.如项1-56中任一项所述的细胞，用于治疗免疫病症，例如自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫缺陷。

59.如项58所述的细胞，其中该自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、1型糖尿病或表4中的疾病。

60.如项58所述的细胞，其中该炎性疾病选自细菌性败血症、类风湿性关节炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、系统性红斑狼疮(结缔组织炎性障碍)、肾小球性肾炎(肾脏毛细血管炎症)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、乳糜泻或其他特发性炎性肠病以及过敏性哮喘。

Claims (20)

1.包含去核类红细胞群体的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中的败血症，其中所述群体的所述去核类红细胞包含存在于所述去核类红细胞表面上的两种或更多种外源多肽，其中在所述两种或更多种外源多肽中的至少两种包含特异性结合炎性细胞因子的结合结构域。

2.权利要求1的用途，其中所述结合结构域是抗体或抗体片段。

3.权利要求2的用途，其中所述抗体片段是scFv。

4.权利要求1的用途，其中所述结合结构域是炎性细胞因子的受体。

5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述至少两种外源多肽的第一外源多肽包含结合第一炎性细胞因子的结合结构域，并且所述至少两种外源多肽的第二外源多肽包含结合第二炎性细胞因子的结合结构域，其中所述第一炎性细胞因子和所述第二炎性细胞因子是不同的。

6.权利要求5的用途，其中所述第一炎性细胞因子和所述第二炎性细胞因子独立地选自下组：肿瘤坏死因子-α、IL-6、干扰素-γ、IL-12、IL-1、G-CSF、IL-8、IL-11、IL-17、IL-18、干扰素-α、干扰素-β和肿瘤坏死因子β。

7.权利要求5或6的用途，其中所述群体的所述去核类红细胞包含存在于所述去核类红细胞表面上的第三外源多肽，其中所述第三外源多肽包含特异性结合第三炎症细胞因子的结合结构域。

8.权利要求7的用途，其中所述第一炎性细胞因子、所述第二炎性细胞因子和所述第三炎性细胞因子是不同的。

9.权利要求7或8的用途，其中所述第一炎性细胞因子、所述第二炎性细胞因子和所述第三炎性细胞因子独立地选自下组：肿瘤坏死因子-α、IL-6、干扰素-γ、IL-12、IL-1、G-CSF、IL-8、IL-11、IL-17、IL-18、干扰素-α、干扰素-β和肿瘤坏死因子β。

10.权利要求7-9中任一项的用途，其中所述群体的所述去核类红细胞包含存在于所述去核类红细胞表面上的第四外源多肽，其中所述第四外源多肽包含特异性结合第四炎性细胞因子的结合结构域。

11.权利要求10的用途，其中所述第一炎性细胞因子、所述第二炎性细胞因子、所述第三炎性细胞因子和所述第四炎性细胞因子是不同的。

12.权利要求10或11的用途，其中所述第一炎性细胞因子、所述第二炎性细胞因子、所述第三炎性细胞因子和所述第四炎性细胞因子独立地选自下组：肿瘤坏死因子-α、IL-6、干扰素-γ、IL-12、IL-1、G-CSF、IL-8、IL-11、IL-17、IL-18、干扰素-α、干扰素-β和肿瘤坏死因子β。

13.权利要求1-12中任一项的用途，其中所述去核类红细胞群体是网织红细胞。

14.权利要求1-12中任一项的用途，其中所述去核类红细胞群体是红细胞。

15.权利要求1-14中任一项的用途，其中所述去核类红细胞不是低渗负荷细胞。

16.权利要求1-15中任一项的用途，其中所述去核类红细胞表现出与不包含所述至少两种外源多肽的分离的、未修饰的、未培养的类红细胞基本上相同的渗透膜脆性。

17.权利要求1-16中任一项的用途，其中所述去核类红细胞是人去核类红细胞。

18.权利要求1-17中任一项的用途，其中所述去核类红细胞通过如下方法产生，所述方法包括：

提供包含编码所述两种或更多种外源多肽的外源核酸的有核类红细胞前体；和

在适合于去核所述有核类红细胞前体和适合于产生所述两种或更多种外源多肽的条件下培养所述有核类红细胞前体。

19.权利要求18的用途，其中所述方法进一步包括将所述外源核酸引入所述有核类红细胞前体中。

20.权利要求18或19的用途，其中所述有核类红细胞前体是CD34⁺造血干细胞。

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