CN116940668A - 经表面修饰的红细胞及其产生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及修饰红细胞(RBC)的细胞表面标志物的方法及其用途。特别地，所述方法包括在连接酶的存在下，在合适的条件下，使RBC与肽接触足够的时间以使所述肽与所述RBC连接以形成RBC‑肽缀合物。在一个实施方案中，所述连接酶是OaAEPI连接酶。所述RBC‑肽缀合物可进一步与效应物分子在合适的条件下接触足够的时间以使所述效应物分子与所述RBC‑肽缀合以形成RBC‑肽‑效应物分子缀合物。

Description

经表面修饰的红细胞及其产生方法
本申请要求2021年1月29日提交的SG10202101003S的优先权，其内容和要素出于所有目的通过引用并入本文。
发明领域
本发明总体上涉及分子生物学领域。具体地，本发明涉及修饰红细胞的细胞表面蛋白的方法及其用途。
背景技术
产生用于治疗用途的经表面修饰红细胞的方法遇到了许多挑战。大多数传统方法，如化学官能化或遗传工程改造的红细胞，必须在对红细胞长期存活有害的苛刻化学处理和祖细胞的非常昂贵的遗传工程改造和培养之间折衷。如果没有事先的遗传工程改造，现有的酶促方法效率低下。因此，对于提供产生用于治疗用途的经表面修饰红细胞的有效方法存在未满足的需求。
鉴于上述考虑而设计了本发明。
发明内容
最一般地，本披露涉及修饰去核后的红细胞的方法，并且涉及包含去核后表面缀合效应物分子的经修饰的红细胞。具体地，本披露涉及修饰未经遗传修饰的红细胞的方法。
在一个方面，本披露提供了一种方法，其包括：
(a)在连接酶存在下，在合适的条件下，将红细胞(RBC)与肽或多肽接触足够的时间以允许该肽或多肽与该RBC连接以形成RBC-肽或RBC-多肽缀合物；
其中该肽或多肽包含C末端连接酶识别序列。
该方法进一步可以包括洗涤RBC-肽缀合物的步骤，例如去除未缀合至RBC的肽。
连接酶可以是OaAEP1连接酶，例如突变型OaAEP1连接酶，例如OaAEP1-Cys247Ala。
C末端识别序列可具有选自NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG，优选NGL、NPL或NDL的序列。
在一些情况下，C末端识别序列不允许OaAEP1连接酶实现高连接效率。C末端识别序列可具有序列Xaa1GG，其中Xaa1是除G之外的任何氨基酸。C末端识别序列可具有序列NG或NCL。
在一些方面，肽或多肽是效应物分子。效应物分子可具有选自NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG，优选NGL、NPL或NDL的C末端识别序列。
当RBC与效应物分子缀合时，该方法可称为“1步法”。
在一些情况下，肽是接头肽。接头肽具有C末端连接酶识别序列。接头肽具有用于与另一种肽或多肽(例如效应物分子)缀合的N末端基序。N末端基序可以是连接酶识别序列、点击化学官能团或生物素部分。
连接酶识别序列可以是选自OaAEP1连接酶、分选酶、天冬酰胺酰肽酶、butelase 1或其任何突变形式或变体的连接酶的识别序列，优选OaAEP-Cys247Ala连接酶。
当接头肽具有N末端连接酶识别序列时，该序列可包含G、GG、GL、GGG、GLG和GGL。
当肽是接头肽时，肽与RBC的连接导致RBC-接头肽缀合物的形成。
RBC-接头肽缀合物可以与效应物分子接触。这种方法可以称为“2步法”，包括与接头肽缀合的第一步骤和与效应物分子缀合的第二步骤。
当接头肽具有N末端连接酶识别位点时，RBC-接头肽可以与具有C末端连接酶识别序列的效应物分子接触。这种接触可以在连接酶存在下在合适的条件下发生足够的时间，以允许效应物分子与接头肽连接，从而形成RBC-接头-效应物分子缀合物。在此类方法中，在RBC与接头肽接触期间存在的连接酶可称为第一连接酶，并且在RBC-接头缀合物和效应物分子接触期间存在的连接酶可被称为第二连接酶。第一和第二连接酶可以相同。第一和第二连接酶可以不同。在特别优选的方法中，第一和第二连接酶是OaAEP1连接酶，优选OaAEP1-Cys247Ala。
在此类情况下，接头肽的C末端连接酶识别序列可称为第一C末端连接酶识别序列，并且效应物分子的C末端连接酶识别序列可称为第二C末端连接酶识别序列。在此类方法中，通常有利的是第一C末端连接酶识别序列和第二C末端连接酶识别序列不同。当第一和第二连接酶均相同时，有利的是第一C末端连接酶识别序列和第二C末端连接酶识别序列不同。特别地，第一C末端连接酶识别序列对于连接酶识别的优化程度低于第二C末端连接酶识别序列可能是有利的。换句话说，通过第一连接酶将RBC与接头连接可能不如效应物分子与RBC-接头肽的连接有效。不希望受理论束缚，认为连接效率的变化减少了接头的自连接。在此类方法中，第一C末端连接酶识别序列具有序列Xaa1GG，其中Xaa1是除G之外的任何氨基酸或具有序列NG或NCL，并且第二C末端连接酶识别序列具有选自NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG，优选NGL、NPL或NDL的序列。
在一些情况下，接头肽包含在N末端或者以其他方式暴露在接头肽上的点击化学官能团。点击化学官能团可选自叠氮化物部分、四嗪部分、甲基四嗪部分、二芳基环辛炔(DBCO)部分或反式环辛炔(TCO)部分。
在一些情况下，接头肽包含在N末端或者以其他方式暴露在接头肽上的生物素部分。
当接头肽包含用于与不是连接酶识别基序的另一肽缀合的N末端基序时，例如当接头肽包含在N末端或以其他方式暴露在接头肽上的生物素部分的点击化学官能团时，C末端连接酶识别序列可以选自NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG，优选NGL、NPL或NDL。N末端基序的选择被确定为与效应物分子(GL-)上的第二个C末端基序互补。
当接头肽包含点击化学官能团时，RBC-接头缀合物可以与具有互补点击化学官能团(例如效应物分子C末端处或以其他方式暴露在效应物分子上的点击化学官能团)的效应物分子接触。互补点击化学官能团可选自叠氮化物部分、四嗪部分、甲基四嗪部分、二芳基环辛炔(DBCO)部分或反式环辛炔(TCO)部分。
当接头肽的点击化学官能团是叠氮化物部分时，效应物分子的互补点击化学官能团是DBCO部分。当接头肽的点击化学官能团是DBCO部分时，效应物分子的互补点击化学官能团是叠氮化物部分。当接头肽的点击化学官能团是TCO部分时，效应物分子的互补点击化学官能团是四嗪部分或甲基四嗪部分。当接头肽的点击化学官能团是四嗪部分或甲基四嗪部分时，效应物分子的互补点击化学官能团是TCO部分。
当接头肽包含点击化学官能团时，使RBC-接头肽缀合物与效应物分子在合适的条件下接触足够的时间以通过点击化学将RBC-接头缀合物缀合至效应物分子。
当接头肽包含生物素部分时，RBC-接头缀合物与链霉亲和素或亲和素在合适的条件下接触足够的时间，以使接头缀合物的生物素部分与链霉亲和素或亲和素缀合，从而形成RBC-接头-链霉亲和素或RBC-接头-亲和素缀合物。RBC-接头-链霉亲和素或RBC-接头-亲和素缀合物可以与生物素化的效应物部分接触。生物素化效应物部分是包含生物素部分的效应物部分，例如已缀合至生物素部分的效应物分子。RBC-接头-链霉亲和素或RBC-接头-亲和素缀合物可以与生物素化的效应物分子部分在合适的条件下接触足够的时间，以使效应物分子的生物素部分与RBC-接头-链霉亲和素或RBC-接头-亲和素缀合物的链霉亲和素或亲和素部分缀合，从而形成RBC-接头-链霉亲和素-效应物分子缀合物或RBC-接头-亲和素-效应物分子缀合物。
如上所述，本文披露的某些方法是“2步”方法，涉及与接头缀合的第一步骤和与效应物分子缀合的第二步骤。
在一个这样的方面，本披露提供了一种方法，其包括：
(a)在连接酶存在下，在合适的条件下，将RBC与接头肽接触足够的时间，以允许该接头肽与RBC连接以形成RBC-接头缀合物；
其中该接头肽包含第一C末端连接酶识别序列和N末端连接酶识别序列；以及
(b)在连接酶存在下，在合适的条件下，将来自(a)的该RBC-接头缀合物与效应物分子接触足够的时间以允许该效应物分子与该连接酶连接以形成RBC-接头-效应缀合物；以及
其中该效应物分子包含第二C末端连接酶识别序列。
该方法可以涉及洗涤RBC-接头缀合物的步骤。这种洗涤步骤优选在RBC-接头缀合物与效应物分子接触之前进行。
该方法可以涉及洗涤RBC-接头-效应物分子缀合物的步骤。
在可替代的方面，本披露提供了一种方法，其包括：
(a)在连接酶存在下，在合适的条件下，将RBC与接头肽接触足够的时间，以允许该接头肽与RBC连接以形成RBC-接头缀合物；
其中该接头肽包含C末端连接酶识别序列和N末端生物素部分；以及
(b)使来自(a)的RBC-接头缀合物与链霉亲和素接触，其中该RBC-接头缀合物和链霉亲和素在合适的条件下接触足够的时间以允许该链霉亲和素缀合以结合至该接头的生物素部分，从而形成RBC-接头-链霉亲和素缀合物；以及
(c)将该RBC-接头-链霉亲和素缀合物与生物素化的效应物分子在合适的条件下接触足够的时间以允许该生物素化的效应物分子与该RBC-接头-链霉亲和素缀合物缀合，从而形成RBC-接头-链霉亲和素-效应物分子缀合物。
该方法可以涉及洗涤RBC-接头缀合物的步骤。这种洗涤步骤优选在RBC-接头缀合物与链霉亲和素接触之前进行。
该方法可以涉及洗涤RBC-接头-链霉亲和素缀合物的步骤。这种洗涤步骤优选在RBC-接头-链霉亲和素缀合物与效应物分子接触之前进行。
该方法可以涉及洗涤RBC-接头-链霉亲和素-效应物分子缀合物的步骤。
在另一个可替代的方面，本披露提供了一种方法，其包括：
(a)在连接酶存在下，在合适的条件下，将RBC与接头肽接触足够的时间，以允许该接头肽与RBC连接以形成RBC-接头缀合物；
其中该接头肽包含C末端连接酶识别序列和点击化学官能团；以及
(b)使来自(a)的RBC-接头缀合物与包含互补点击化学官能团的效应物分子接触，其中该RBC-接头缀合物和该效应物分子在合适的条件下接触足够的时间以允许该效应物分子通过无铜点击化学与该接头缀合，从而形成RBC-接头-效应物分子缀合物。
该方法可以涉及洗涤RBC-接头缀合物的步骤。这种洗涤步骤优选在RBC-接头缀合物与效应物分子接触之前进行。
该方法可以涉及洗涤RBC-接头-效应物分子缀合物的步骤。
点击化学官能团可选自叠氮化物部分、四嗪部分、甲基四嗪部分、二芳基环辛炔(DBCO)部分或反式环辛炔(TCO)部分。
互补点击化学官能团可选自叠氮化物部分、四嗪部分、甲基四嗪部分、二芳基环辛炔(DBCO)部分或反式环辛炔(TCO)部分。
当接头肽的点击化学官能团是叠氮化物部分时，效应物分子的互补点击化学官能团是DBCO部分。当接头肽的点击化学官能团是DBCO部分时，效应物分子的互补点击化学官能团是叠氮化物部分。当接头肽的点击化学官能团是TCO部分时，效应物分子的互补点击化学官能团是四嗪部分或甲基四嗪部分。当接头肽的点击化学官能团是四嗪部分或甲基四嗪部分时，效应物分子的互补点击化学官能团是TCO部分。
本文描述的某些方法涉及接头肽。接头肽可包含用于连接至红细胞的C末端连接酶识别序列。接头肽可包含用于与另一肽(例如效应物分子)缀合的N末端基序。N末端基序可以是连接酶识别序列、点击化学官能团或生物素部分。
接头肽包含C末端连接酶识别序列，其具有选自NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG，优选NGL、NPL或NDL的序列或具有序列Xaa1GG，其中Xaa1是除G之外的任何氨基酸或具有序列NG或NCL。
接头肽具有N末端连接酶识别序列，该序列可包含G、GG、GL、GGG、GLG和GGL。
当接头肽具有N末端连接酶识别序列时，C末端连接酶识别序列具有序列Xaa1GG，其中Xaa1是除G之外的任何氨基酸或具有序列NG或NCL。
接头肽可以具有在N末端或以其他方式暴露在分子上的点击化学官能团或生物素部分。点击化学官能团可选自叠氮化物部分、四嗪部分、甲基四嗪部分、二芳基环辛炔(DBCO)部分或反式环辛炔(TCO)部分。
当接头肽具有点击化学官能团或生物素部分时，C末端连接酶识别序列可具有选自NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG，优选NGL、NPL或NDL的序列或具有序列Xaa1GG，其中Xaa1是除G之外的任何氨基酸或具有序列NG或NCL。优选地，序列选自NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG，最优选NGL、NPL或NDL。
接头肽优选具有C末端连接酶识别序列和N末端连接酶识别序列之间接头体序列、点击化学官能团或生物素部分。接头体序列可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。接头体序列可以包含α-螺旋肽序列。接头体序列可以包含序列EAAAK的重复。接头体序列可包含序列EAAAK的1-10个重复，例如序列EAAAK的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复，优选序列EAAAK的3个重复。接头体序列可包含序列EQKLISEEDL。
接头体可以包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
GLGEQKLISEEDLGLPETGG；
DBCO-EAAAKEAAAKEAAAKNGL(其中DBCO指二芳基环辛炔)；
叠氮化物-GSSGSGGEQKLISEEDLGGSGGSGSGNGL；
GLGEQKLISEEDLGLPETGG；
GGGEQKLISEEDLGLPETGG；
GLGEQKLISEEDLGNGL；
GGGEQKLISEEDLGNGL；以及
GLG(EAAAK)5LPETGG。
本文披露的某些方法涉及效应物分子。效应物分子可以选自由以下组成的组：蛋白质、酶、细胞表面标志物、单克隆抗体、单链抗体、纳米抗体、治疗剂、细胞因子、趋化因子、抗体片段及其组合。在一些优选的方面，效应物分子是单克隆抗体、单链抗体或纳米抗体。
在一些方面，效应物分子是细胞因子或趋化因子。例如，效应物分子可以是IL-8、IL-12、CD137L、IL-15、IL-7、IL-2或IL-10。在一些方面，效应物分子是免疫调节配体，例如4-1BB配体(4-1BBL)。
在一些方面，效应物分子是酶。例如，效应物分子可以是L-天冬酰胺酶、精氨酸脱氨酶、尿酸酶或已知可用于酶替代疗法的其他酶。
在一些方面，效应物分子是抗体，例如单链抗体、纳米抗体、单克隆抗体或抗原结合片段。例如，效应物可以针对目的靶标(例如癌细胞标志物，例如白血病细胞标志物)。标志物包括CXCR4/CD33、EGFR、HER2或其他癌细胞表面蛋白。效应物可针对诸如肉毒杆菌毒素的毒素，或针对诸如细菌或病毒的病原体。
效应物分子可包含C末端连接酶识别分子。C末端连接酶识别分子优选是选自NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG，优选NGL、NPL或NDL的序列。
效应物分子可以是生物素化的效应物部分。生物素化效应物部分是包含生物素部分的效应物部分，例如已缀合至生物素部分的效应物分子。生物素部分优选暴露在效应物部分上，使得其可与亲和素或链霉亲和素缀合。
效应物分子可包含互补点击化学官能团。互补点击化学官能团可选自叠氮化物部分、四嗪部分、甲基四嗪部分、二芳基环辛炔(DBCO)部分或反式环辛炔(TCO)部分。互补点击化学官能团与接头肽的点击化学官能团互补。当接头肽的点击化学官能团是叠氮化物部分时，互补点击化学官能团是DBCO部分。当接头肽的点击化学官能团是DBCO部分时，互补点击化学官能团是叠氮化物部分。当接头肽的点击化学官能团是TCO部分时，互补点击化学官能团是四嗪部分或甲基四嗪部分。当接头肽的点击化学官能团是四嗪部分或甲基四嗪部分时，互补点击化学官能团是TCO部分。
效应物分子可以具有至少10kDa的大小。例如，效应物分子可以是大小为至少10kDa的抗体或抗原结合片段。效应物分子可以具有至少10kDa、至少10.5kDa、至少11kDa、至少11.5kDa、至少12kDa、至少12.5kDa、至少13kDa、至少13.5kDa、至少14kDa、至少14.5kDa、至少15kDa、至少16kDa、至少17kDa、至少18kDa、至少19kDa、至少20kDa、至少21kDa、至少22kDa、至少23kDa、至少24kDa或至少25kDa的大小。
效应物分子可以具有至少7kDa的大小。例如，效应物分子可以是大小至少为7kDa的小蛋白质或多肽。效应物分子可以具有至少7kDa、至少7.5kDa、至少8kDa、至少8.5kDa、至少9kDa、至少9.5kDa、至少10kDa、至少10.5kDa、至少11kDa、至少11.5kDa或至少12kDa的大小。
本文披露的方法可以涉及选自由以下组成的组的连接酶：OaAEP1连接酶、分选酶A、天冬酰胺酰肽酶、butelase 1或其任何突变形式或变体的连接酶的识别序列，优选OaAEP-Cys247Ala连接酶。当该方法是两步法时，涉及接头肽与RBC的缀合和效应物分子与RBC-接头缀合物的缀合，用于接头肽与RBC缀合的连接酶(第一连接酶)和用于效应物分子与RBC-接头缀合物缀合的连接酶(第二连接酶)可以相同或不同。在优选的方面，第一和第二连接酶相同。在特别优选的方面，第一和第二连接酶是OaAEP1连接酶，优选OaAEP1-Cys247Ala连接酶。
在本文所述的一些方法中，RBC是去糖基化的RBC。换句话说，RBC之前已被处理以从RBC膜的糖蛋白中去除碳水化合物。RBC可以用选自由PNGaseF、EndoH、O-糖苷酶和外切糖苷酶(甘露糖苷酶、神经氨酸酶和β-N-乙酰己糖胺酶)组成的组的糖苷酶进行酶促去糖基化。例如，进行红细胞与PNGaseF、EndoH、O-糖苷酶或外切糖苷酶(甘露糖苷酶、神经氨酸酶和/或β-N-乙酰己糖胺酶)接触的步骤。在本文提供的一些方法中，使红细胞去糖基化的步骤发生在使红细胞与效应物分子或接头肽接触的任何步骤之前。本文披露的方法可以涉及使去糖基化的红细胞与肽接触，例如使去糖基化的红细胞与效应物分子或接头肽接触。
本披露还描述了通过本文披露的方法产生的经修饰的红细胞及其用途。
经修饰的红细胞可以在其外表面上包含肽，其中该肽与天然红细胞膜蛋白缀合。肽可以是效应物分子。在这种情况下，效应物分子可以直接缀合至膜蛋白。该肽可以是接头肽。在这种情况下，效应物分子可以缀合至接头肽。因此，在一些方面，本披露提供了一种经修饰的红细胞，其在其外表面上包含效应物分子，其中该效应物分子通过接头肽缀合至天然红细胞膜蛋白。接头肽可以是任何合适的接头肽，例如上述接头肽。效应物分子可以是任何合适的效应物分子，例如上述效应物分子。经修饰的红细胞可以是去糖基化的红细胞。
一方面，本披露提供了用于医学中使用的经修饰的红细胞，经修饰的红细胞在制备用于治疗疾病或障碍的药物中的用途，或包括向需要治疗的个体或患者施用经修饰的红细胞的治疗方法。治疗可以是针对酶缺乏、代谢疾病、免疫相关障碍、血液障碍或癌症的治疗。
另一方面，本披露涉及去核后对天然红细胞进行表面修饰的方法(该方法包括将从受试者获得的天然红细胞暴露于效应物分子，将效应物分子与红细胞缀合，从而修饰红细胞)和通过本文披露的方法获得的经修饰的红细胞、本文披露的用于在疗法中使用的红细胞、以及本文披露的经修饰的红细胞在制造治疗疾病或障碍的药物中的用途。
本发明包括所述的各个方面和优选特征的组合，除非这种组合是明显不允许的或明确避免的。
附图说明
当结合非限制性示例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：
图1OaAEP1 Cys247Ala可用于将肽共价连接到人红细胞表面。(A)使用链霉亲和素-HRP检测与生物素化肽(B肽/B-TL5)连接的人红细胞(hRBC)的蛋白质印迹分析。(B)人红细胞(hRBC)连接产物上的B肽(单生物素化)与系列稀释的二生物素化HRP标准品的比较，表明连接肽/人红细胞(hRBC)的定量。在A和B中，蛋白质标志物的分子量(kDa)显示在左侧。(C)使用链霉亲和素-AF647检测的B肽与hRBC连接的流式细胞术分析(平均值±SEM，n＝来自3个供体的3个红细胞)。(D)与肽一起孵育或连接的hRBC的免疫荧光图像(使用PE-抗生物素抗体染成绿色)，代表肽在细胞膜上的共定位(使用CellMaskTM深红色染成红色)。(E)连接的hRBC和对照hRBC中每单位细胞面积的PE-抗生物素的平均荧光。学生t检验***P<0.001。
图2使用两步连接法将纳米抗体与人红细胞缀合。(A)缀合方法的概述，其中接头肽用于促进蛋白质的连接。(B)对与人红细胞连接的EGFRVHH上的FLAG标签的流式细胞术分析(平均值±SEM，n＝3个独立重复)。(C)与EGFR VHH孵育或连接的人红细胞(hRBC)的免疫荧光图像(使用AF488-FLAG标签抗体染成绿色)，显示与细胞膜共定位的程度(使用CellMaskTM深红色染成红色)。(D)每单位hRBC面积的平均AF488荧光。学生t检验***P<0.001。
图3大蛋白通过链霉亲和素接头与人红细胞(hRBC)缀合。(A)用于在人红细胞(hRBC)表面缀合大蛋白的链霉亲和素介导的缀合方法的概述。(B)对与hRBC缀合的生物素化抗His标签单克隆抗体(B-His-mAb)的流式细胞术分析，以平均值±SEM(n＝3)表示。(C)与B-His-mAb孵育或缀合的人红细胞的免疫荧光图像(使用驴抗兔AF488二级抗体染成绿色)，显示与细胞膜共定位的程度(使用CellMaskTM深红色染成红色)。(D)从(C)中所示的人红细胞的细胞掩模信号得出的每单位细胞面积AF488信号的平均强度。(E)用于下拉带有FLAG和his标签的蛋白质的B-His-mAb缀合红细胞的FLAG标签染色的平均荧光强度。(F)与3,3'-二氨基联苯胺(DAB)色原一起孵育接着进行H&E染色后，生物素化的HRP(B-HRP)缀合的红细胞和未修饰的红细胞的图像。通过形成特征性棕色沉淀来观察辣根过氧化物酶活性。(G-H)hRBC上生物素化的人白细胞介素8(hIL-8)缀合的流式细胞术分析。使用初级小鼠抗hIL8抗体在hRBC表面检测hIL-8，随后使用驴抗小鼠AF647抗体检测初级小鼠抗hIL8抗体。(I)在以1个RBC:5个白血病细胞(相当于200,000个RBC/mL)的比例共培养4天后，使用CCK8测定评估L-天冬酰胺酶缀合的hRBC对Sup-B15白血病细胞活力的影响。浓度为5IU/mL的纯化的生物素化的L-天冬酰胺酶作为阳性对照。对来自不同供体的hRBC进行G和H(以平均值±SEM，n＝3表示)。学生t检验***P<0.001。
图4通过酶促连接和点击化学将大分子与人红细胞生物正交、共价结合。(A)使用无铜点击化学在红细胞表面缀合分子的概述。(B)CalFluor-647的流式细胞术分析，CalFluor-647是一种叠氮基分子，仅在用连接至人红细胞(hRBC)的DBCO肽点击时才会发出荧光。(C)生物素化叠氮基肽(B-TK3-N3)或叠氮基抗体(CMTM6-mAb-N3)的流式细胞术分析，其点击DBCO-肽连接的人红细胞，使用链霉亲和素-AF647和驴抗鼠-AF647抗体检测。(D)使用点击化学与叠氮基单克隆抗体缀合的hRBC的免疫荧光图像。人红细胞膜显示为绿色(CellMask Green)，而叠氮基抗体则使用驴抗小鼠AF647抗体(红色)进行检测。(E)使用无铜点击化学将单克隆抗体缀合在人红细胞上的效率，表示为AF647信号与CellMask的共定位的程度。(F)使用酶/点击化学组合方法将GFP缀合到hRBC上，并使用缀合hRBC和对照hRBC的流式细胞术分析进行评估。(G)F中数据的代表性流式细胞仪直方图。对来自不同供体的hRBC进行B、E和F(以平均值±SEM，n＝3表示)。学生t检验***P<0.001。
图5使用OaAEP1连接酶对小鼠红细胞(mRBC)进行表面修饰。(A)对使用OaAEP1连接酶与mRBC缀合的生物素化肽(B-肽/B-TL5)的流式细胞术分析，并使用链霉亲和素AF647进行检测。(B)与生物素化肽孵育或连接的mRBC的免疫荧光图像。连接的肽被染成绿色(PE-抗生物素抗体)，图像显示与细胞膜的共定位程度(使用CellMaskTM深红色染成红色)。(C)连接在mRBC膜上的生物素化肽的每单位细胞面积的平均PE荧光，如(B)所示。(D)使用流式细胞术评估肽连接基序对连接产量的影响的比较。mRBC与生物素-(EAAAK)3-X肽连接，其中X代表指定的C末端识别基序。显示的数据来自3个生物学重复，使用的血液来自三个独立的供体。(E)流式细胞分析评估肽长度对使用生物素-(EAAAK)n-NGL的连接产量的影响，其中n代表EAAK重复次数。该图代表来自3个生物学重复的数据。学生t检验***P<0.001。
图6红细胞(RBC)的缀合高效且用途广泛。(A)不同时间点RBC-B-肽连接(人和小鼠)的流式细胞术分析。在每个时间点淬灭反应并用链霉亲和素-Alexa Fluor 647染色以检测连接在红细胞表面上的生物素化肽的强度。(B)对点击化学介导的生物素化叠氮基肽(B-TK3-N3)缀合的流式细胞术分析，评估叠氮基肽浓度和反应时间对缀合的肽的产量的影响(使用链霉亲和素-Alexa Fluor 647检测)。(C)流式细胞术，以验证以相反的官能团方向进行点击化学的能力。将人红细胞(hRBC)与叠氮基肽(GL29)连接，并用经DBCO标记的包含FLAG标签的肽(GK25)点击(学生t检验***P<0.001)。随后在分析前用抗FLAG标签抗体对人红细胞(hRBC)进行染色。
图7缀合的红细胞在体内具有生物相容性和稳定性。(A)对未修饰的或生物素化的肽(B-TL5)连接的小鼠和人红细胞的膜联蛋白V染色的流式细胞术分析。(B)根据CFSE的流式细胞术分析，确定未修饰的或与B肽(B-TL5)连接的经CFSE染色的小鼠红细胞(mRBC)经24小时保留在NSG-S小鼠循环中的百分比。(C)NSG-S小鼠循环中mRBC表面上连接的生物素化的肽经24小时的稳定性，表示为工程改造的红细胞上链霉亲和素-AF647染色的平均荧光强度。(D)注射PBS、未修饰的或与B肽连接的经CFSE标记的小鼠红细胞(mRBC)的小鼠在施用后24小时采集的血涂片的代表性图像。(E)生物素化的肽连接的外部施用的小鼠红细胞(mRBC)和施用后24小时来自小鼠采集的血涂片的未修饰的小鼠红细胞(mRBC)的每单位细胞面积的平均链霉亲和素AF647荧光。
图8(A)为确定工程改造的mRBC的体内稳定性和半衰期而进行的实验的概要。(B)根据CFSE的流式细胞术分析，确定未修饰的或与B肽(B-TL5)连接的经CFSE染色的mRBC经24小时保留在NSG-SGM3或C57BL/6小鼠循环中的百分比。(C)NSG-SGM3或C57BL/6小鼠循环中mRBC表面上连接的生物素化的肽经24小时的稳定性，表示为工程改造的mRBC上链霉亲和素-AF647染色的平均荧光强度。
图9(A)使用流式细胞术评估肽连接基序的连接产量的影响的比较。hRBC与生物素-(EAAAK)3-X肽连接，其中X代表指定的C末端识别基序。显示的数据来自3个生物学重复，使用的血液来自三个独立的供体。(B)流式细胞分析生物素-(EAAAK)n-NGL评估肽长度对连接产量的影响，其中n代表EAAK重复次数。该图代表来自3个生物学重复的数据。学生t检验***P<0.001。
图10(A)代表性流式细胞术直方图，说明在有或没有GN20肽、B-GN20(GN20的生物素化形式，防止N末端连接)和TL20(相似长度的乱序肽)的情况下，hRBC上EGFR VHH连接的相对效率。每个接头肽的序列显示在右侧。(B)对于A中的每个条件，VHH连接的hRBC的百分比和hRBC FLAG标签信号的平均荧光强度(平均值±SEM，n＝3个独立重复)。(C)评估具有不同N末端和C末端基序组合的不同接头肽促进两步连接的能力。数据表示为流式细胞术分析后hRBC群体中FLAG标签信号的平均荧光强度。每个肽的肽序列显示在图的左侧。使用与APC缀合的经抗FLAG标记的单克隆抗体检测经FLAG标记的VHH的存在。学生t检验***P<0.001。
图11(A)用于在hRBC上有效缀合蛋白质的缀合方法的概述，其中使用接头肽来促进蛋白质的连接，或者在直接连接蛋白质之前进行去糖基化。(B)在未修饰的hRBC上直接与EGFR VHH连接后，或在用糖苷酶混合物)处理(去糖基化)后，对hRBC的FLAG标签信号的流式细胞术分析。针对每种情况指示了所使用的具体糖苷酶。PNGase F和Endo H切割N-聚糖，O-糖苷酶去除O-聚糖，而外切糖苷酶(甘露糖苷酶、神经氨酸酶和β-N-乙酰己糖胺酶f)去除单个单糖。(C)在以不同顺序进行选择的连续连接/去糖基化步骤之后，对hRBC上的EGFR VHH连接的hRBC的流式细胞术分析。(D)使用利用直接连接或接头肽与VHH EGFR缀合的hRBC下拉EGFR阳性4T1-tdTomato细胞。使用探测EGFR的蛋白质印迹检测4T1-tdTomato-hEGFR细胞的下拉效率，同时使用HBA作为RBC的内部对照。(E)通过VHH EGFR连接的RBC或对照RBC的4T1-tdTomato细胞的相对下拉效率，通过量化下拉裂解物中的tdTomato荧光来测量。对于G和H，使用与APC缀合的经抗FLAG标记的单克隆抗体检测经FLAG标记的VHH的存在。学生t检验***P<0.001。
图12对源自人RBC的生物素化肽连接的RBCEV联用生物素下拉实验和LFQ质谱，以鉴定与OaAEP1连接酶连接的RBCEV上的候选蛋白。环5、7、8、11、13和27是RBCEV中与生物素化肽相关联的25-50kDa的蛋白质。
图13来自RBCEV的候选蛋白与现有RBC膜蛋白质组研究的交叉比较，评估其相对丰度和估计拷贝数。
图14使用不同酶(OaAEP1 Cys247Ala或分选酶A七突变体(heptamutant))的连接效率比较。一系列生物素化肽(其具有相同的EK15序列(EAAAKEAAAKEAAAK)，仅在C末端基序不同(在本研究中进行了优化(OaAEP1的-NPL)或先前报道与每种酶相容(分选酶A的LPETGGG，OaAEP1的-NGL)连接到hRBC上，并使用流式细胞术评估连接效率。包括不同序列和长度的短肽被作为阳性对照。对照hRBC表示hRBC在没有任何肽的情况下简单地与酶孵育。
具体实施方式
同种异体细胞疗法，如工程改造的红细胞(RBC)和胞外囊泡(EV)，最近被发现是潜在的药物载剂，多年来因脂质体和DNA复合物等更人工和更适合的药物递送系统而被忽视(Chatin等人,2015；Durymanov&Reineke,2018)。虽然封装在红细胞中的疗法在临床试验中得到了快速发展，但它们的应用受到红细胞质膜选择性渗透性质的限制。
解决这个问题的方法是使用表面官能化的红细胞，其中治疗性分子被固定在红细胞的表面。然而，目前产生表面经工程改造的红细胞的方法在建立生物相容性、效率和可扩展性之间的平衡方面遇到了困难。目前使用的大多数表面修饰方法要么涉及严苛的化学处理，要么对造血祖细胞进行遗传修饰，然后在体外分化，这是一个非常昂贵且耗时的过程。首先，即使是更具生物相容性的化学修饰方法也已被证明会缩短体内半衰期，因为红细胞表面蛋白由于例如衰变加速因子而受到损害，导致最终被补体裂解。Shi等人(Shi等人，2014)也提出了一种酶促方法，其中使用分选酶A将肽连接到表达分选酶A识别基序的遗传工程改造的红细胞的表面上。这允许将肽生物相容地连接到遗传工程改造的红细胞的表面上，导致了红细胞工程改造平台的发展。然而，遗传工程方法需要繁琐且昂贵的干细胞培养和分化过程。最近，发现成熟的红细胞可以使用分选酶A直接与肽缀合(Pishesha等人，2017)。然而，成熟红细胞与蛋白质的共价缀合尚未得到证实。此外，基于亲和力的红细胞结合分子和脂质插入也对该领域做出了贡献。然而，这些方法都存在短暂性的问题(Villa等人,2016；Villa等人,2017)。
本披露描述了生物相容性酶促方法、位点特异性表面官能化的红细胞，其保持高拷贝数的稳定缀合的肽/蛋白质(例如但不限于单克隆抗体、单结构域抗体、酶、功能性蛋白质等等)/细胞，绕过任何先前的化学或遗传修饰。由此产生的工程改造的红细胞保持了结合蛋白的官能性，并且在缀合后没有显示出毒性迹象。通过与其他方法(例如但不限于生物正交点击化学和链霉亲和素介导的缀合)相结合，进一步扩展了这种酶促方法，以进一步增加工程改造的红细胞的通用性和官能性。这些工程改造的红细胞为遗传工程改造的红细胞和化学修饰的红细胞提供了一种更具规模化的方法。然后将这些经修饰的红细胞应用于一系列疾病的临床前开发，包括但不限于酶替代疗法、基于细胞的免疫疗法和其他预防性和治愈性治疗。
一方面，披露了一种对去核后的红细胞进行表面修饰的方法，该方法包括暴露天然红细胞，将效应物分子缀合至红细胞，从而修饰红细胞。在一个实例中，红细胞是天然红细胞。在另一个实例中，(天然)红细胞是从人获得的。在又一个实例中，红细胞尚未经过遗传工程改造或修饰。应当理解，遗传修饰的红细胞不同于天然红细胞，并且本领域技术人员将能够区分两者。
一方面，本文披露的方法用于用蛋白质产生/修饰天然红细胞，这些蛋白质含有至少100个氨基酸，包括但不限于单结构域抗体(sdAB)。在另一个实例中，如本文所述的天然红细胞在细胞表面上被酶促修饰。在另一个实例中，效应物分子是包含20个或更多个氨基酸的肽。在一个实例中，接头是肽。在另一个实例中，本文描述的接头具有适合于分选酶反应的一个末端和适合于蛋白质连接酶反应的另一个末端。
本文介绍的是使用一种在生物相容性、效率、稳定性、速度和可扩展性之间提供平衡的方法产生的经表面修饰的红细胞。这些经表面工程改造的红细胞主要使用但不限于蛋白质连接酶(例如但不限于butelase 1、OaAEP1、其变体和突变体)进行修饰，因此不会受到该过程的不利影响。连接允许蛋白质、肽、单克隆抗体或其他官能团以高拷贝数稳定掺入红细胞膜上。本文还公开了两步连接、双正交无铜点击化学和链霉亲和素介导的生物素化分子的缀合，以扩展该方法的通用性并将多种治疗性蛋白质缀合到红细胞表面上，同时在整个工作流程中建立的保持生物相容性谱。特别是，利用酶促连接与无铜点击化学相结合的组合方法导致任何经叠氮化物标记的目的分子以高拷贝数完全生物相容、共价、位点特异性地缀合到红细胞表面。在一个实例中，本文披露的红细胞通过接头连接至效应物分子。在另一个例子中，红细胞附着到接头上，接头又附着到效应物分子上。
本文用于生成这些表面官能化的红细胞的程序快速(可以在3至5小时内完成，具体取决于目的分子)、易于扩展(可以轻松地从血库/患者获得血液和可以轻松地在内部生产其他试剂)，并持续产生高拷贝数的目的分子。缀合的分子在体外和体内都很稳定，并且在红细胞表面保持完整和功能。因此，该平台提供了治疗一系列疾病的替代方案，例如但不限于酶缺乏(例如，通过将酶固定在红细胞表面，从而延长半衰期并减少频繁给药的需要)、免疫相关障碍(例如，通过基于人工红细胞的APC呈递抗原)、代谢障碍(例如家族性高胆固醇血症、戈谢病、亨特综合征、克拉伯病、枫糖浆尿病、异染性脑白质营养不良、线粒体脑病、乳酸性酸中毒、中风样发作(MELAS)、尼曼-匹克病、苯丙酮尿症(PKU)、卟啉症、泰萨克斯病和威尔逊病)、血液障碍(例如慢性病贫血、再生障碍性贫血、红细胞增多症、血色病、高凝性障碍、免疫性血小板减少性紫癜、缺铁性贫血、白细胞增多症、白细胞减少症、真性红细胞增多症、镰状细胞性贫血和血栓性血小板减少性紫癜)和癌症(例如，通过红细胞表面的天冬酰胺酶等酶导致肿瘤饥饿)。
一方面，天然红细胞与生物素化的肽缀合。在另一个实例中，红细胞与B-TL5缀合。在另一个实例中，红细胞与接头缀合，该接头与骆驼衍生的单结构域抗体(约15至30kDa)缀合。在另一个实例中，红细胞与接头缀合，该接头与抗EGFR单结构域抗体缀合。在又一个实例中，红细胞是生物素化的抗his标签单克隆抗体缀合的人红细胞。在另一个实例中，红细胞与经DBCO标记的肽(EK18)缀合。
红细胞可以与一系列抗体和/或蛋白质以高拷贝数稳定缀合，并在缀合后保持官能性。
导致高拷贝数大蛋白分子的稳定表面修饰的现有方法采用对红细胞/祖细胞的化学或遗传操作，这对红细胞半衰期和功能都是有害的，或者涉及对祖细胞的昂贵且耗时的操作。这是酶促方法首次能够满足通用性和高拷贝数的要求，而以前只有在广泛的遗传/化学操作后才能实现。使用点击化学和/或链霉亲和素的这种方法的扩展进一步用于增加经表面官能化的红细胞的官能性。特别是，无铜点击化学与酶促连接相结合，允许红细胞表面上高拷贝数的蛋白质进行位点特异性、生物正交、共价缀合，而没有可检测到的不利或免疫原性影响或者体内半衰期的减少。
经表面工程改造的红细胞的官能性不会受到影响，并且生成工程改造的红细胞的过程使用生物相容性方法，例如酶促蛋白质连接、双正交点击化学和强亲和力相互作用。
该方法利用高度生物相容性的方法进行表面官能化，避免了在处理阶段对红细胞造成任何损害或有害处理的风险。这比需要利用化学修饰的其他方法具有优势，无论是将官能团引入红细胞膜上以进行进一步处理还是整个蛋白质。先前的数据表明，化学修饰方法(例如红细胞的直接化学生物素化)可能会损害红细胞上的衰变加速因子(DAF)，导致补体裂解。
缀合的部分在体内长时间稳定地存在于红细胞表面，这类似于未修饰的红细胞。
这些工程改造的红细胞不仅表现出与未修饰的红细胞相似的体内半衰期，而且这些经修饰的红细胞还在体内保留了缀合的部分，在一定程度上保护它们免于降解。此外，缀合的共价和稳定性质意味着缀合的部分不会随着时间的推移从红细胞表面脱落。与肽/抗体介导的基于亲和力的缀合方法(其中缀合的分子会随着时间的推移而与红细胞分离)相比，这是一个优点。
该方法比任何现有的红细胞表面修饰方法更便宜、更快、更简单，同时保持了效率和生物相容性。此外，它很容易扩大规模。可以在治疗前几小时从供体处获取血液，清洗并在3至5小时内获得表面完全官能化的红细胞。这些红细胞可以通过类似于输血的方法安全地输回患者体内。缺乏潜在有毒化学物质和/或基因修饰使得这种方法更容易转化为临床。
红细胞需要从人获取。这可能来自预期的接受者或任何其他相容的血液供体(首选O型血液供体)
现有技术中公开的方法需要使用遗传工程改造的红细胞进行有效分选(意思是分选酶介导的表面修饰)，尤其是较大的蛋白质分子(例如纳米抗体)。本申请中披露的方法则不然。本领域披露的方法还仅包括肽与未修饰的细胞的酶促缀合，该方法之前已用分选酶证实。因此，在一个实例中，本文披露的方法在不使用分选酶的情况下产生经表面修饰的红细胞。在另一个实例中，分选酶不用于缀合目的。
然而，现有技术尚未采用酶促方法来缀合较大的功能分子，例如酶。现有技术中披露的一些方法披露了使用化学方法对红细胞进行直接生物素化，这已被证明对红细胞具有不利影响，特别是对于长期体内研究而言。
目前的酶替代疗法依赖于频繁施用纯化的酶来替代缺失的酶。这些酶的半衰期很短，很快就会从循环中消失。然而，本发明的缀合方法提供的半衰期与成熟红细胞的半衰期(30至90天之间)相当，这比现有方法明显长。
使用抗体/诱饵受体包被的红细胞的预防性/中和性疗法能够结合并中和抗原/病毒/毒素。然而，由于功效低、成本高，此类疗法从未进入临床试验阶段。本方法克服了所述限制。
本申请的范围还考虑使用基于细胞的疗法来激活免疫系统。其中一种策略涉及使用红细胞作为抗原呈递细胞(APC)。该平台可用于呈递抗原分子与共刺激分子，以激活免疫系统的特定分支。
基于本文披露的方法，红细胞可以与例如一系列的抗体和/或蛋白质以高拷贝数稳定缀合，并在缀合后保持官能性。使用点击化学和/或链霉亲和素的这种方法的扩展进一步用于增加经表面官能化的红细胞的官能性。无铜点击化学与酶促连接相结合，允许红细胞表面上高拷贝数的蛋白质进行位点特异性、生物正交、共价缀合，而很少至没有可检测到的不利或免疫原性影响或者体内半衰期的减少。
表面工程改造的红细胞利用生物相容性方法，如酶蛋白连接、生物正交点击化学和强亲和力相互作用进行表面官能化，避免在加工阶段对红细胞造成任何损害或有害处理的风险。
酶替代疗法：目前的酶替代疗法依赖于频繁施用纯化的酶来替代缺失的酶。这些酶的半衰期很短，很快就会从循环中消失。它们还经常与可延长半衰期的分子(例如PEG)缀合。然而，它们只能小幅延长药物的体内半衰期。然而，与红细胞的结合将提供与成熟红细胞相当的半衰期(30至90天)，这比现有方法明显更长。虽然酶替代疗法的临床试验中有许多基于红细胞的疗法，但所有这些都涉及将酶封装在红细胞内。这限制了其底物可以自然进入红细胞(通过红细胞膜上现有的内源性转运蛋白)的酶的应用。本披露中描述的工程改造的红细胞没有这样的限制，拓宽了基于红细胞的酶替代疗法的范围。已知可用于酶替代疗法的酶包括天冬酰胺酶、精氨酸脱氨酶和尿酸酶。
预防性/中和性疗法：抗体/诱饵受体包被的红细胞能够结合并中和抗原/病毒/毒素。虽然某些团体已经提出了该应用的概念证明，但尚未进行临床试验，主要受到功效低和成本高的限制。本披露中提出的简单且有效的方法可以克服这些限制中的一些。
免疫调节：许多团体正在研究使用基于细胞的疗法来激活免疫系统。其中一种策略涉及使用红细胞作为抗原呈递细胞(APC)。该平台可用于呈递抗原分子与共刺激分子，以激活免疫系统的特定分支。本文披露的方法涉及红细胞。该方法可以涉及提供一个或多个红细胞的步骤。该方法可以涉及提供全血样品并从全血制备红细胞样品。
优选地，RBC源自人或动物血液样品或是源自原代细胞或永生化红细胞系的红细胞。血细胞可以与待治疗的患者类型匹配，因此血细胞可以是A型、B型、AB型、O型或Oh型血。优选地，血液是O型血液。血液可以是恒河猴阳性或恒河猴阴性。在一些情况下，血液是O型和/或恒河猴阴性，例如O型。血液可能已被确定没有疾病或病症，例如没有HIV、镰状细胞性贫血、疟疾。然而，可以使用任何血型。在一些情况下，红细胞是自体的并且源自从待治疗的患者获得的血液样品。在一些情况下，红细胞是同种异体的并且不是源自从待治疗的患者获得的血液样品。
样品可以是全血样品。优选地，已从样品中除去红细胞以外的细胞，使得样品的细胞组分是红细胞。
样品中的红细胞可以被浓缩，或者与全血样品的其他组分(例如白细胞)分开。红细胞可以通过离心浓缩。可以对样品进行白细胞减少，例如通过白细胞减少过滤器。可以对样品进行处理以去除血浆和血小板，例如通过洗涤，例如PBS洗涤。
可以通过低速离心并使用白细胞减少过滤器从含有白细胞和血浆的全血样品中分离红细胞。在一些情况下，红细胞样品不包含其他细胞类型，例如白细胞。换句话说，红细胞样品基本上由红细胞组成。
获得的红细胞可以进行进一步的处理，例如洗涤、标记和任选的加载。
特别地，RBC可以被去糖基化。
本文披露的方法导致经修饰的红细胞的产生。这种红细胞的外表面经过修饰。这些可被称为经表面修饰的红细胞、经表面官能化的红细胞或经修饰的红细胞。这些术语在本文中可互换使用。
本文披露的方法涉及效应物分子与RBC的缀合。术语“缀合”是指效应物分子与红细胞的连接。缀合可以是直接的(即效应物分子在没有任何接头的情况下连接至RBC)或间接的(即效应物分子通过接头连接至RBC)。缀合可导致共价键形成。缀合可以是连接，例如由连接酶催化的酶促连接。缀合可以是生物素-链霉亲和素相互作用。缀合可以由点击化学产生。
如本文所用，术语“点击化学”是指化学合成中的概念，其中“点击”化学是指生物缀合中常用的一类生物相容性小分子反应，允许选择的底物与特定生物分子的连接。值得注意的是，点击化学并不被理解为单一的特定反应，而是描述了一种遵循自然界示例的生成产物的方法，该方法还通过连接小模块单元来生成物质。点击反应的使用示例包括但不限于连接生物分子和报道分子。点击化学不仅限于生物条件：“点击”反应的概念已用于药理学和各种生物模拟应用。然而，点击化学在生物分子的检测、定位和定量方面特别有用。本文披露的方法使用点击化学的生物相容形式，其通常被称为无铜点击化学。
点击反应通常在一锅中发生，不受水的干扰，产生最少且无害的副产物，其特点是具有高热力学驱动力，可快速且不可逆地驱动单一反应产物的高产率，具有高反应特异性(在一些情况下，具有区域特异性和立体特异性)。这些特性使得点击反应特别适合复杂生物环境中分离和靶向分子的问题。在这样的环境中，产物相应地需要是生理稳定的并且任何副产物需要是无毒的(例如，用于体内系统)。
可用于本文披露的方法中的点击化学方法是应变促进的炔烃-叠氮化物环加成(SPAAC)和逆电子需求Diels-Alder(IEDDA)。SPACC可涉及互补点击化学官能团二芳基环辛炔(DBCO)和叠氮化物。IEDDA可涉及互补点击化学官能团反式环辛炔(TCO)和四嗪或甲基四嗪。
通过开发特定且可控的生物正交反应(即在生命系统内部发生的任何化学反应，而不干扰天然生化过程)，点击化学已适用于活细胞，例如，使用小分子探针，其通过点击反应找到并附着在靶标上。简而言之，点击化学描述的反应产率高、范围广、仅产生无需色谱即可去除的副产物、具有立体特异性、易于执行，并且可以在易于去除或良性溶剂中进行。
本文描述的方法涉及在连接酶存在下使红细胞与接头或效应物分子接触。通过“接触”，我们的意思是使每个组分足够接近以允许组分缀合。术语“接触”和“孵育”可互换使用。接触可以在室温进行，例如20℃左右。接触优选在连接酶存在下进行。可以根据连接酶的任选官能性的温度来优化进行接触的温度。优选地，连接酶是OaAEP1连接酶，并且温度为约25℃。接触可以进行适合缀合发生的一段时间，例如适合连接酶催化缀合的时间。合适的时间段对于本领域技术人员来说是容易理解的，并且可以涉及接触1天、少于1天、12小时或少于12小时，例如约12小时、约11小时、约10小时、9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时。在很多情况下，合适的时间是3小时左右。
将接头或效应物分子缀合至红细胞的步骤导致RBC-接头或RBC-效应物缀合物的形成。在RBC-接头缀合物或RBC-效应物分子缀合物形成之后，例如在接触步骤之后，可以有洗涤步骤。换句话说，可以洗涤RBC-接头缀合物或RBC-效应物分子缀合物。洗涤可以去除混合物中尚未缀合的组分，例如未与RBC缀合的效应物分子或接头。洗涤可以去除连接酶或链霉亲和素。合适的洗涤方法对于技术人员来说是显而易见的，并且可以包括在缓冲液中洗涤，例如在PBS中洗涤。该方法可涉及1、2、3、4或更多次洗涤，或任何次数的洗涤，使得RBC-接头缀合物或RBC-效应物分子缀合物基本上不含未缀合的接头或效应物分子或连接酶。
当第一接触步骤涉及RBC与接头的缀合时，可以使用进一步的接触步骤。该步骤涉及RBC-接头缀合物与效应物分子的接触。接触可以在室温进行，例如20℃左右。接触可以在连接酶存在下进行。在这种情况下，可以根据连接酶的任选官能性的温度来优化进行接触的温度。进行接触的温度可以针对生物素-链霉亲和素相互作用进行优化。进行接触的温度可以针对点击化学进行优化。接触可以进行适合发生缀合的一段时间。合适的时间段对于本领域技术人员来说是容易理解的，并且可以涉及接触1天、少于1天、12小时或少于12小时，例如约12小时、约11小时、约10小时、9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时。在很多情况下，合适的时间是3小时左右。
将接头或效应物分子缀合至红细胞的步骤导致RBC-接头-效应物分子缀合物的形成。在RBC-接头-效应物分子缀合物形成之后，例如在接触步骤之后，可以有洗涤步骤。换句话说，可以洗涤RBC-接头-效应物分子缀合物。洗涤可以去除混合物中尚未缀合的组分，例如未与RBC缀合的效应物分子。洗涤可以去除连接酶。合适的洗涤方法对于技术人员来说是显而易见的，并且可以包括在缓冲液中洗涤，例如在PBS中洗涤。该方法可涉及1、2、3、4或更多次洗涤，或任何次数的洗涤，使得RBC-接头-效应物分子缀合物基本上不含未缀合的效应物分子和/或连接酶。
本文披露的一些方法涉及与去糖基化的红细胞缀合。红细胞可以在与接头和/或效应物分子缀合之前、或在与接头缀合之后、或在接头与效应物分子缀合之后被去糖基化。优选地，在缀合接头/效应物分子之前将红细胞去糖基化。换句话说，在任何缀合步骤之前，红细胞可能已经经历了去糖基化。在一些情况下，红细胞在缀合方法之前被去糖基化。也就是说，用于初始或唯一接触步骤的红细胞已被去糖基化。在一些方法中，该方法的第一步是使红细胞去糖基化。红细胞去糖基化的方法是本领域已知的并且包括酶促去糖基化，例如通过使红细胞与PNGaseF、EndoH、O-糖苷酶或外切糖苷酶(甘露糖苷酶、神经氨酸酶和/或β-N-乙酰己糖胺酶)接触。在一些方法中，用O-糖苷酶和外切糖苷酶的组合使红细胞去糖基化。
在本文披露的一些方法中，红细胞与包含N末端生物素部分的接头缀合。此类方法可用于将生物素化的效应物分子与红细胞缀合，以形成红细胞-接头-效应物分子缀合物。在此类实施方案中，接头和效应物分子均可包含生物素部分。在此类方法中，必须包括在使红细胞-接头缀合物与生物素缀合的效应物分子接触之前使红细胞-接头缀合物与生物素结合分子例如链霉亲和素接触的另一步骤。
如本文所用，术语“效应物分子”是指具有某种可预测效应的分子或活性物质，由此可以根据实施本文所公开的方法和经修饰的红细胞的人员的判断来选择该效应。例如，如果目的是治疗癌症，则与红细胞缀合的效应物分子可以是针对所述癌症的抗体，或者是与癌症特异性受体或癌细胞结合的蛋白质。效应物分子的实例包括但不限于蛋白质、酶、细胞表面标志物、抗体例如单克隆抗体、细胞因子、趋化因子、抗体片段、纳米抗体、治疗剂及其组合。在另一个实例中，本文披露的效应物分子可以通过连接功能性肽来进一步修饰，所述功能性肽例如但不限于荧光蛋白、标签蛋白和用于亲和结合的蛋白等。
“抗体”包括其片段或衍生物，或者合成的抗体或合成的抗体片段。鉴于当今与单克隆抗体技术相关的技术，可以制备针对大多数抗原的抗体。
针对所选抗原的合适的单克隆抗体可以通过已知技术来制备，例如“MonoclonalAntibodies:A manual of techniques",H Zola(CRC Press,1988)和in"MonoclonalHybridoma Antibodies:Techniques and Applications",J G R Hurrell(CRC Press,1982)中描述。Neuberger等人(1988,8th International Biotechnology Symposium Part2[第八届国际生物技术研讨会第二部分],792-799)讨论了嵌合抗体。
可以使用片段，例如Fab和Fab2片段，也可以使用遗传工程改造的抗体和抗体片段。抗体的可变重(VH)和可变轻(VL)结构域参与抗原识别，这是早期蛋白酶消化实验首次认识到的事实。通过啮齿动物抗体的“人源化”发现了进一步的证实。啮齿动物来源的可变结构域可以与人来源的恒定结构域融合，使得所得抗体保留啮齿动物亲本抗体的抗原特异性(Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sd.USA81,6851-6855)。可用于本文披露的经表面官能化的红细胞的抗体或抗原结合片段将识别和/或结合靶分子。
从涉及抗体片段(所有抗体片段均含有一个或多个可变结构域)的细菌表达的实验中得知，抗原特异性由可变结构域赋予并且独立于恒定结构域。这些分子包括Fab样分子(Better等人(1988)Science 240,1041)；Fv分子(Skerra等人(1988)Science 240,1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中VH和VL配偶体结构域通过柔性寡肽连接(Bird等人(1988)Science242,423；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sd.USA85,5879)和包含分离的V结构域的单结构域抗体(dAb)(Ward等人(1989)Nature 341,544)。对涉及保留其特异性结合位点的抗体片段的合成的技术的一般性综述可见于Winter&Milstein(1991)Nature 349,293-299。本文有用的抗体和片段可以是人的或人源化的、鼠类的、骆驼科动物的、嵌合的或来自任何其他合适的来源。
“ScFv分子”是指其中VH和VL配偶体结构域例如，直接地、通过肽或通过柔性寡肽共价连接的分子。Fab、Fv、ScFv和sdAb抗体片段都可以在大肠杆菌中表达和从其分泌，从而可以容易地产生大量所述片段。
完整抗体和F(ab')2片段是“二价的”。“二价”是指所述抗体和F(ab')2片段具有两个抗原结合位点。对比之下，Fab、Fv、ScFv和sdAb片段是单价的，仅具有一个抗原结合位点。单价抗体片段由于尺寸小，特别适合用作标签。
在一些情况下，结合分子是单链抗体或scAb。scAb由共价连接的VH和VL配偶体结构域(例如直接通过肽或通过柔性寡肽)和任选的轻链恒定结构域组成。
在一些优选的实施方案中，抗体被可检测地标记或至少能够检测。例如，抗体可以用放射性原子或有色分子或荧光分子或可以以任何其他方式容易地检测到的分子进行标记。合适的可检测分子包括荧光蛋白、萤光素酶、酶底物和放射性标记。抗体可以用可检测标记直接标记或者可以间接标记。例如，抗体可以是未标记的并且可以通过本身被标记的另一种抗体来检测。可替代地，第二抗体可以与其生物素结合，并且经标记的链霉亲和素与生物素的结合用于间接标记第一抗体。
在本文披露的某些方法中，效应物分子是纳米抗体。如本文所用，术语“纳米抗体”也称为单结构域抗体(sdAb)或VHH，是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。像整个抗体一样，它能够选择性地结合特定抗原。单结构域抗体的分子量通常在12至15kDa之间，比由两条重蛋白链和两条轻链组成的普通抗体(通常在150至160kDa之间)小得多，甚至比Fab片段(大约50kDa，一条轻链和半条重链)和单链可变片段(大约25kDa，两个可变结构域，一个来自轻链，一个来自重链)还要小。
抗体和抗原结合片段，例如单克隆抗体和纳米抗体，可以定向(即结合)任何合适的靶标。例如，抗体或抗原结合片段可以结合EGFR或IL8，或者是T细胞/免疫细胞活化抗体，或者针对毒素或病原体的抗体。
本文披露的一些方法使用OaAEP1连接酶。OaAEP1连接酶源自植物Oldenlandiaaffinis(O.affinis)。OaAEP1连接酶是天冬酰胺酰内肽酶(AEP)家族的原核酶。AEP酶通常充当蛋白酶，但一些AEP酶(例如OaAEP1)已进化出连接酶功能。根据本文披露的方法的优选OaAEP1连接酶是OaAEP-Cys247Ala连接酶，其在位置247处具有从Cys到Ala的点突变，通过识别和切割羧基末端分选信号来修饰表面蛋白。对于OaAEP1连接酶的大多数底物，识别信号由基序-N-X1L(Asn-X1-Leu，其中X1是任何氨基酸，优选选自A、C、D、E、F、H、K、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y的任何氨基酸，最优选G、D或P)组成。切割发生在天冬酰胺(N)和相邻残基之间。在一些情况下，连接酶识别序列在N末端包含序列GG(Gly-Gly)。在这种情况下，连接酶识别信号可包含基序LPXTG(Leu-Pro-任何-Thr-Gly)。OaAEP1连接酶和OaAEP1-Cys247Ala连接酶描述于WO2018/056899A1中，其全部内容通过引用并入本文。连接酶可以具有与下表中列出的序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或100％同一性，优选至少95％同一性、至少98％同一性或100％同一性的序列。
如本文所用，术语“分选酶”是指通过识别和切割羧基末端分选信号来修饰表面蛋白的一组原核酶。对于分选酶的大多数底物，识别信号由以下组成：基序LPXTG(Leu-Pro-任何-Thr-Gly)、然后是高度疏水性跨膜序列、随后是一簇碱性残基(例如精氨酸)。切割发生在苏氨酸(Thr)和甘氨酸(Gly)残基之间，其中通过苏氨酸(Thr)残基瞬时附着到活性位点半胱氨酸(Cys)残基，然后进行转肽作用，将蛋白质共价附着到细胞壁组分上。分选酶存在于几乎所有革兰氏阳性细菌和偶尔的革兰氏阴性细菌(例如腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens))或古细菌(例如热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum))中。分选酶可从多种来源购买，例如Creative Enzyme(EXWM-4247)和Active Motif(13100)。特别优选的分选酶是由pet30b-7M SrtA质粒编码的分选酶A七突变体，保藏于Addgene，保藏号为#51141。
本文披露的一些方法涉及生物素和链霉亲和素的相互作用。生物素是一种小而稳定的杂环化合物，可以很容易地工程改造到蛋白质和肽上，而不改变该蛋白质或肽的功能或活性。已知许多蛋白质可与生物素结合，包括链霉亲和素，形成强烈的非共价相互作用。用于将蛋白质或肽与生物素缀合的试剂盒和方法是本领域众所周知的并且是技术人员容易理解的，例如生物素缀合试剂盒(Biotin Conjugation Kit)(B型，AbcamTM，ab201796)。
可对本文所述方法中有用的效应物分子进行修饰。特别地，效应物分子可被工程改造以促进效应物分子与红细胞膜蛋白或接头的缀合。具体地，效应物分子可以包含或可以被工程改造以包含连接酶识别序列、生物素或链霉亲和素部分或叠氮化物、四嗪、甲基四嗪、二芳基环辛炔(DBCO)或反式环辛炔(TCO)部分。
在一些方面，效应物分子包含C末端连接酶识别序列，优选C末端连接酶识别序列。具体的连接酶识别序列将取决于用于实现缀合的连接酶。优选地，连接酶识别序列是OaAEP1连接酶识别序列。连接酶识别序列可以是选自以下的任何连接酶识别序列：NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG。在优选的方法中，效应物分子包含C末端NGL、NDP或NPL基序，最优选NGL。在一些方法中，效应物分子在C末端包含-NGL基序，例如被工程改造以在C末端包含该基序。在一些方法中，效应物分子在C末端包含-GG，例如被工程改造以在N末端包含基序，例如其中效应物分子被工程改造以包含序列LPXTGG。工程改造蛋白质和肽以包含另外的序列(例如另外的连接酶识别序列/基序)的方法是本领域技术人员众所周知的，例如Sambrook等人中描述的那些。此类效应物分子可用于“一步”方法，其中效应物分子直接缀合至红细胞。此类效应物分子还可以用于“两步”方法，其中RBC首先与接头缀合，随后效应物分子与接头缀合。
在其他方面，效应物分子包含C末端生物素基序，优选在C末端的生物素基序。效应物分子可能已被工程改造以在C末端包含生物素部分。工程改造蛋白质和肽以包含另外的序列(例如添加生物素部分)的方法是本领域技术人员众所周知的，例如Sambrook等人中描述的那些。
在又其他方面，效应物分子包含C末端叠氮化物部分。在效应物分子与叠氮化物缀合后，效应物分子可包含C末端叠氮化物分子。用于将蛋白质和肽缀合至叠氮化物部分的方法和试剂盒是本领域众所周知的，例如来自ThermoFisherTM的NHS-叠氮化物试剂盒(目录号88902)。效应物分子可包含C末端DBCO部分。
效应物分子可被进一步工程改造以促进官能性。例如，当效应物分子是纳米抗体或其他抗体片段时，可以适当地改造效应物分子以包括一个或多个接头序列以促进效应物分子的折叠。
效应物分子可被进一步工程改造以包括另外的序列，例如标签或标记，以便于效应物分子的工程改造、监测或追踪。蛋白质和肽的标签或标记是本领域众所周知的，用于工程改造蛋白质或肽以包括此类序列的方法也是如此。例如，效应物分子可包含His标签(6xHis)、FLAG标签、Myc标签或生物素中的一种或多种。
本文描述的某些方法涉及接头。接头包含氨基酸序列并且可用于将效应物分子连接至红细胞，而不是将效应物分子直接缀合至红细胞情。这样的接头可以允许与红细胞的连接，而不会例如通过接近红细胞的空间位阻或通过引起效应物分子折叠的扭曲妨碍效应物分子的功能。
接头体可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：
[A]-[Y]-[B]
其中[A]是连接酶识别序列、生物素、叠氮化物或DBCO部分。
其中[Y]是接头体序列；以及
其中[B]是连接酶识别序列。
其中[A]是连接酶识别序列，其具有氨基酸序列NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG，优选NGL、NPL或NDL。
其中[A]是连接酶识别序列，[B]具有Xaa1GG的氨基酸序列，其中Xaa1是除G之外的任何氨基酸，或[B]具有序列NG、GGG或NCL。在其中[A]是连接酶识别序列的一些方面，[B]具有氨基酸序列LPX3TGG，其中X3是任何氨基酸。优选地，X3是E，谷氨酸，因此连接酶识别序列具有氨基酸序列LPETGG。
在一些方面，[A]包含叠氮化物、四嗪、甲基四嗪或二芳基环辛炔(DBCO)或反式环辛炔(TCO)部分或生物素部分。
其中[A]包含叠氮化物、四嗪、甲基四嗪或二芳基环辛炔(DBCO)或反式环辛炔(TCO)部分或生物素部分，[B]具有氨基酸序列NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG，优选NGL、NPL或NDL。
接头体[Y]可包含任何合适的氨基酸序列。优选地，[Y]包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸组成的氨基酸序列。在一些情况下，[Y]包含α-螺旋肽。在一些情况下，[Y]包含序列EAAAK(Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)。在一些情况下，[Y]包含序列EAAAK的重复，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复。优选地，接头包含1-10或1-5个EAAAK重复。最优选地，接头包含1或5个EAAAK重复。在一些情况下，接头包含序列EQKLISEEDL或由序列EQKLISEEDL组成。
在一些情况下，接头包含29个氨基酸或由29个氨基酸组成，并且包含N末端GL基序和C末端LPETGG基序。在一些情况下，接头由GN20接头的序列，即GL-GEQKLISEEDLG-LPETGG组成。
在一些情况下，接头不包含链霉亲和素部分。
如本文所用，术语“天然红细胞”是指先前未经处理的红细胞。如本领域技术人员将理解的，天然红细胞是去核的、具有双凹形状的红细胞。也就是说，所述红细胞在根据本文披露的方法使用之前没有经过遗传(或其他)修饰。特别是，红细胞的膜可能没有经过遗传改造。因此，本文披露的方法中使用的红细胞的膜可能与本文披露的方法的红细胞所源自的相同物种的个体内的红细胞的膜无法区分。在特定方面，RBC可能不是从经遗传修饰的红细胞中去核的。本文描述的RBC是完整的红细胞。红细胞不是红细胞衍生的胞外囊泡。
值得注意的是，红细胞和红细胞胞外囊泡在它们包含或表现出的表面蛋白方面是不同的。红细胞胞外囊泡生物发生过程中，许多蛋白质和脂质经历翻转过程，使得胞质红细胞蛋白出现在表面。反之亦然，相同的翻转过程导致一些红细胞表面蛋白转向囊泡内部。
本文所述的经修饰的血细胞和包含经修饰的红细胞的组合物可用于治疗，例如用于疾病或障碍的治疗、预防和/或改善。
优选以“治疗有效量”施用，这个量足以显示对个体的益处。实际施用量以及施用速率和时程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如剂量等的决定属于全科医生和其他医生的责任，并且通常考虑待治疗的障碍、患者个体的状况、递送部位、施用方法和从业人员已知的其他因素。上述技术和方案的实例可以在Remington’sPharmaceutical Sciences,第20版,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins中找到。
待治疗的受试者可以是任何动物或人。受试者优选是哺乳动物，更优选是人。受试者可以是非人哺乳动物，但更优选地是人。受试者可以是男性或女性。受试者可以是患者。治疗用途可用于人或动物(兽医用途)。
本文所述的经修饰的红细胞可配制用于通过多种途径施用，包括但不限于肠胃外、静脉内、动脉内、肌内、肿瘤内、口服和鼻内。
本文所述的经修饰的红细胞可用于将效应物分子递送至靶细胞。在一些情况下，该方法是体外或离体方法。在其他情况下，该方法是体内方法。术语“体外”旨在涵盖在实验室条件或培养液中使用材料、生物物质、细胞和/或组织的实验；而术语“体内”旨在涵盖使用完整多细胞有机体的实验和程序。“离体”是指存在于有机体外或发生在有机体外，例如在人或动物体外的某物(事)，其可以在取自有机体的组织(例如整个器官)或细胞上。
通过本文描述的方法产生的经修饰的红细胞可能与以下特征中的一种或多种相关：
·与天然红细胞相比，红细胞表面的糖基残基水平降低；
·至少100,000个拷贝的与红细胞外表面缀合的外源肽，例如效应物分子或接头肽；
·至少100,000个分子的生物素和任选地链霉亲和素缀合至红细胞的外表面；
·结合靶细胞例如癌细胞的能力，其中靶细胞表达与红细胞缀合的效应物分子的配体。
一方面，本文提供了与效应物分子缀合的去糖基化红细胞。效应物分子可以是抗体、抗原结合片段或酶。
本文披露的方法提供了表面修饰红细胞的有效方式。该方法可以导致产生经平均每个红细胞至少80,000个肽、每个红细胞至少90,000个肽、每个红细胞至少100,000个肽、或每个红细胞至少10,500个肽、优选每个红细胞至少100,000个肽修饰的红细胞。术语“平均”是指平均数。
本文示例性描述的发明可以适当地在本文中未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制不存在的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被宽泛地解读且无限制。另外，这里使用的术语和表达是被用作描述术语而非限制的，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但应认识到，在所要求保护的本发明范围内，其可以进行各种修改。因此，应当理解的是，虽然本发明已经通过优选实施方案以及任选的特征进行特定的公开，但本领域技术人员可以使用本文所披露于其中的发明的修饰及变化，且认为这样的修饰及变化在本发明的范围内。
如本申请中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“该(这些)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。例如，术语“遗传标记”包括多个遗传标记，包括它们的混合物和组合。
如本文所用，在制剂组分浓度的语境中，术语“约”通常是指所叙述值的+/-5％，更通常是所叙述值的+/-4％，更通常是所叙述值的+/-3％，更通常是所叙述值的+/-2％，甚至更通常是所叙述值的+/-1％，并且甚至更通常是所叙述值的+/-0.5％。
在整个本披露中，某些实施方案可以以范围形式公开。形式应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应理解为对所披露范围的范围的硬性限制。因此，应该认为范围的描述已经具体披露了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对例如从1到6的范围的描述应视为已具体披露了例如从1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等的子范围，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
某些实施方案也可以在本文中广泛性地和一般性地描述。属于一般性披露的每个更窄的种类和亚一般组也构成本披露的一部分。这包括对实施方案的一般性描述，其条件或负面限制是将任何主题从该类中移除，而不管所切下的材料是否在本文中具体叙述。
本发明在此已被广泛地和一般性地描述。属于一般性披露的每个更窄的种类和亚一般组也构成本发明的一部分。这包括对本发明的一般性描述，其条件或负面限制是将任何主题从该类中移除，而不管所切下的材料是否在本文中具体叙述。
其他实施方案在所附权利要求和非限制性实施例内。另外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员子组进行描述。
以其特定形式或根据用于执行所披露的功能的方式、或者用于获得所披露的结果的方法或过程来表达的在前面的说明书或在以下权利要求书或在附图中披露的特征，视情况可以单独地，或者以此类特征的任何组合的方式用于以其各种形式来实现本发明。
尽管本发明已经结合下文所述的示例性实施方案进行了描述，很多等同修饰和变化在给出本披露时对于本领域技术人员是显而易见的。因此，认为以上阐述的本发明的示例性实施方案是说明性的而不是限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所述实施方案做出各种改变。
为避免任何疑问，本文提供的任何理论解释仅出于提高读者理解的目的而给出。发明人不希望受任何这些理论解释的束缚。
在此使用的任何小节标题仅是为了编排的目的并且不应该被解释为对所述主题进行限制。
除非上下文另有要求，否则贯穿本说明书，包括随后的权利要求书，词语“包含(comprise)”和“包括(include)”以及变体如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”和“包括(including)”应当被理解为隐含包括所陈述的整体或步骤或者多个整体或步骤的组，但不排除任何其他的整体或步骤或者多个整体或步骤的组。
必须指出，如在说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地规定。在本文中范围可以表达为从“约”一个具体值，和/或至“约”其他具体值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个具体值和/或到另一个具体值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，将理解该具体值形成另一个实施方案。与数值相关联的术语“约”是任选的，且表示例如+/-10％。
编号的段落
以下编号的段落提供了结合本发明所设想的特征和特征的组合的进一步陈述。
段落1.一种对去核后的天然红细胞进行表面修饰的方法，所述方法包括，
a.将从受试者获得的天然红细胞暴露于效应物分子，
b.将所述效应物分子与所述红细胞缀合，
c.从而修饰所述红细胞。
段落2.段落1所述的方法，其中所述效应物分子具有至少10kDa的大小。
段落3.前述段落中任一项所述的方法，其中所述效应物分子选自由以下组成的组：蛋白质、酶、细胞表面标志物、单克隆抗体、纳米抗体、治疗剂、抗体片段及其组合。
段落4.段落1至3中任一项所述的方法，其中使用选自由一种或多种酶促反应、生物素化和/或基于链霉亲和素的缀合组成的组的方法或使用无铜点击化学来进行缀合步骤。
段落5.段落4所述的方法，其中所述一种或多种酶促反应使用选自由butelase 1、OaAEP1连接酶、天冬酰胺酰肽酶或其任何突变形式或变体组成的组的一种或多种酶催化。
段落6.段落4至5所述的方法，其中所述酶促反应不由分选酶催化。
段落7.前述段落中任一项所述的方法，其中所述缀合步骤在所述效应物分子和所述天然红细胞之间产生共价键。
段落8.前述段落中任一项所述的方法，其中所述天然红细胞通过接头与所述效应物分子缀合。
段落9.前述段落中任一项所述的方法，其中所述天然红细胞被去核，具有双凹形状。
段落10.段落1至9中任一项所述的方法，其中使用OaAEP1连接酶催化酶促反应，并且其中所述效应物分子是纳米抗体。
段落11.一种通过前述段落中任一项所述的方法获得的经修饰的红细胞。
段落12.一种经修饰的红细胞，其包含去核后表面缀合的效应物分子。
段落13.段落12所述的红细胞，其中所述效应物分子具有至少10kDa的大小。
段落14.段落12至13中任一项所述的红细胞，其中使用选自由一种或多种酶促反应、生物素化和/或基于链霉亲和素的缀合组成的组的方法或使用无铜点击化学来缀合所述效应物分子。
段落15.段落14所述的红细胞，其中所述方法导致所述效应物分子和所述红细胞之间的共价键。
段落16.段落12所述的红细胞，其中所述酶促反应由选自由butelase1、OaAEP1连接酶、替代性天冬酰胺酰肽酶或其任何突变形式或变体组成的组的酶催化。
段落17.段落12至16中任一项所述的红细胞，其中所述效应物分子选自由以下组成的组：蛋白质、酶、细胞表面标志物、单克隆抗体、纳米抗体、抗体片段及其组合。
段落18.段落12至17中任一项所述的红细胞，其中接头缀合在所述红细胞和所述效应物分子之间。
段落19.段落12至18中任一项所述的红细胞，其中所述效应物分子是单克隆抗体。
段落20.段落1至11所述的方法，或段落12至19所述的红细胞，其中所述红细胞是人或动物来源的。
段落21.段落1至11和20所述的方法，或段落12至19所述的红细胞，其中所述缀合的效应物分子发挥治疗作用。
段落22.段落12至21中任一项所述的红细胞，用于在疗法中使用。
段落23.段落12至22中任一项所述的经修饰的红细胞在制造治疗疾病或障碍的药物中的用途。
段落24.段落23所述的用途，其中所述疾病或障碍选自由以下组成的组：酶缺乏、代谢疾病、免疫相关障碍、血液障碍和癌症。
现将参考附图来讨论本方面的各方面和实施方案。其他方面和实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文。
实施例
实施例1：材料与方法
红细胞(RBC)的纯化
将人全血收集在柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖腺嘌呤缓冲液中并储存在4℃直至进一步处理。将全血通过白细胞减少过滤器以去除大部分白细胞。使用过量的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)将所得血液洗涤三次以去除血浆和大部分血小板。将所得红细胞沉淀重新悬浮于红细胞储存缓冲液中，并储存在4℃以供将来的实验使用。通过心脏穿刺将小鼠血液采集到涂有EDTA的试管中。将血液通过40μm细胞过滤器过滤以去除凝固的血液，并通过WBC(白细胞)注射过滤器过滤以去除白细胞。将细胞在过量的PBS中洗涤3次以去除痕量血浆和血小板。随后使用血细胞计数器对细胞进行计数。
肽和纳米抗体设计
表1中列出的肽被设计为包含C末端基序(-NGL)，以便被OaAEP1蛋白连接酶识别以促进连接。单个伯胺基团的生物素化用于在需要时促进肽的检测。肽采用固相合成法生产，并使用HPLC纯化(GL Biochem Ltd.,Shanghai,China)。表皮生长因子(EGFR)纳米抗体序列获自Roovers等人。(Roovers等人,2011；DOI:10.1002/ijc.26145)并进行修饰以在N末端包含6xHis标签，在C末端包含FLAG标签和连接酶结合位点。每个表位标签之间包含柔性接头序列，以促进纳米抗体的官能性，如下所示：(HHHHHH-GSG-VHH-GSG-FLAG-NGL)。GuangzhouIGE Biotechnology Ltd(中国)合成了编码纳米抗体的DNA，并将其插入到pET32(a+)质粒中的T7启动子之后。编码OaAEP1-Cys247Ala质粒的质粒由Dr.Bin Wu,Nanyang TechnologyUniversity提供。eGFP、重组人IL-8和L-天冬酰胺酶是从商业来源预纯化的。
表1
蛋白质的表达和纯化
重组纳米抗体和蛋白质连接酶的表达和纯化是在本研究的早期部分进行的。简而言之，在BL21(DE3)大肠杆菌中表达后，裂解细菌并使用FPLC系统(包括Ni-NITA亲和色谱法随后尺寸排阻色谱法(SEC))纯化蛋白质。通过将纯化的无活性酶在pH 3.7的醋酸盐缓冲液中在室温孵育过夜来激活酶OaAEP1。
使用OaAEP1连接酶将红细胞与肽、纳米抗体或单克隆抗体缀合
对于连接，将1x107个红细胞与500μM肽或VHH和0.26mg/ml连接酶在PBS缓冲液pH7中(总体积为20μl)在室温在摇床上伴随颠倒搅拌(30rpm)孵育3小时。
对于纳米抗体连接，采用两步法。首先，连接接头肽(包含酶的N末端和C末端基序)，然后用PBS洗涤两次。然后将接头肽连接的红细胞与500μM VHH和0.26mg/ml连接酶在与肽连接相同的条件下孵育。连接后，在4℃以800x g离心5分钟洗涤红细胞。
为了缀合生物素化单克隆抗体，将红细胞与生物素化肽连接。彻底洗涤后，将酶促生物素化的红细胞与重组链霉亲和素蛋白(Abcam)一起在4℃孵育30分钟，链霉亲和素终浓度为0.04μg/μl。再次洗涤后，将这些红细胞与生物素化单克隆抗体一起孵育。这些抗体要么是商业获得的，要么是通过生物素缀合试剂盒(B型，Abcam)在内部进行生物素化的。使用最后的洗涤步骤洗掉游离(即未结合)的抗体。
为了使用菌株促进的炔叠氮化物环加成(SPAAC)或无铜点击化学来缀合DBCO缀合的肽/抗体，首先将DBCO缀合的接头肽连接到红细胞上。然后将这些红细胞与叠氮化物缀合的分子在室温孵育3至12小时，以通过点击化学实现稳定缀合。使用叠氮化物-NHS试剂盒将叠氮化物缀合到蛋白质上。对于单克隆抗体，可以通过商业途径获得具有与Fc结构域上的聚糖基团缀合的叠氮化物的位点特异性修饰抗体。
蛋白质印迹分析
连接的红细胞首先在蛋白酶抑制剂(Biotool)存在下用ACK(氯化铵、钾)裂解缓冲液处理，以获得红细胞膜影(降低胞内血红蛋白含量)。通过在21,000x g下离心2小时来沉淀膜。将红细胞膜沉淀与补充有蛋白酶抑制剂(Biotool)的RIPA缓冲液在冰上孵育15分钟。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒对蛋白质进行定量，并使用Nanodrop读数器对血红蛋白进行定量(420nm和586nm处的吸光度)。
将裂解物用Laemmli缓冲液处理并在95℃孵育5分钟以使蛋白质变性。在10％或12％聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质，然后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Immobilon-P)。PM5100 ExcelBand 3色蛋白梯(SmoBio，中国台湾)作为标志物来估计大小。使用含有0.1％Tween-20(TBST)的Tris缓冲盐水中的5％牛奶(Difco脱脂牛奶)封闭膜1小时，然后与一抗在4℃孵育过夜：兔抗FLAG(Sigma，Cat#F3165，稀释1:3000)。用TBST洗涤印迹3次，然后与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗兔二抗(Vector，稀释1:5000)在室温孵育1小时。为了检测生物素化肽，将印迹直接与Pierce高灵敏度链霉亲和素-HRP(Thermo Fisher，稀释1:5000)一起孵育。使用Bio-Rad Chemidoc凝胶记录系统对印迹进行成像。
流式细胞术(FACS)分析
用PBS洗涤细胞2次，重悬浮于100μl FACS缓冲液(含0.5％胎牛血清的PBS)中。对于表面蛋白分析，将细胞与2μl荧光缀合抗体在冰上、黑暗中孵育30分钟，并用1ml FACS缓冲液洗涤两次。使用CytoFLEX-S或CytoFLEX LX细胞仪(Beckman Coulter)或S1000Ex流式细胞仪(Stratedigm)进行RBC的FACS分析。使用Flowjo V10(Flowjo,USA)分析生成的FCS文件。首先通过FSC-A与SSC-A对细胞进行门控，以鉴定单个细胞群，排除碎片和死细胞。然后通过FSC宽度与FSC高度对单细胞进行门控，排除双联体和聚集体。随后通过目标荧光通道(例如AF488或CFSE的FITC、AF647的APC和mCherry的ECD)对荧光阳性珠群或细胞群进行门控。
L-天冬酰胺酶测定
天冬酰胺依赖性Sup-B15细胞在补充有20％iFBS和0.05mM 2-巯基乙醇的IMDM培养基中培养。如上所述，RBC与生物素化L-天冬酰胺酶缀合。未缀合的生物素化L-天冬酰胺酶或带有或不带有L-天冬酰胺酶缀合的RBC与Sup-B15细胞以1:5的比例(RBC比Sup-B15细胞)共培养。培养4天后，向每孔中加入10μL CCK8试剂，并将板在37℃孵育1小时。随后使用读板器在450nm处测量吸光度。
免疫荧光成像
将红细胞(105)在含有1％ BSA的冷PBS中洗涤两次。将体积补至100μl。准备载玻片和预湿过滤器，并将样品移入每个细胞离心涂片器漏斗的孔中。将载玻片以800x g旋转3分钟。将过滤器从载玻片上取下，而不接触载玻片上固定的红细胞。将细胞用各自的抗体在黑暗中染色30分钟并使用BSA-PBS洗涤三次。使用Leica Thunder显微镜覆盖载玻片并成像。成像以盲法进行，随机获取图像，然后使用Coloc 2(ImageJ)进行盲法共定位分析。
体内半衰期分析
经表面修饰(生物素肽连接)或未修饰的红细胞在37℃用CFSE标记20分钟，洗涤两次并通过尾静脉注射到小鼠体内。使用刺血针(通过面颊采血)定期通过下颌下静脉采集血液。将全血离心、计数并取出5000万个细胞，用浓度为0.2mg/ml的链霉亲和素-AF647进行染色。染色1小时后将细胞洗涤两次并通过流式细胞术进行分析。CFSE用于区分注射的红细胞和内源性红细胞，链霉亲和素-AF647用于监测连接的肽在体内随时间的稳定性。
数据分析
GraphPad Prism 8用于对数据进行统计分析并生成图表。P值<0.05被认为是显著的。实验轮廓图是使用BioRender.com和/或Adobe illustrator创建的。使用FIJI测定蛋白质印迹分析、共定位分析和每单位细胞面积的平均荧光。FACS图是使用FlowJo V10生成的。
实施例2：结果
OaAEP1 Cys247Ala可用于共价连接人红细胞(hRBC)表面上的肽
OaAEP1或Sortase等蛋白质连接酶可用于催化专门设计的肽与RBC的共价缀合。为了测试肽与人红细胞经OaAEP1蛋白连接酶介导的缀合的效率，设计了一种具有连接酶识别位点的生物素化肽(B-肽/B-TL5)，用于缀合在红细胞缀合上。连接后，通过蛋白质印迹分析所得红细胞中是否存在生物素化蛋白质。与生物素化肽(B-TL5)连接的红细胞的蛋白质印迹显示出约40kDa的清晰生物素化蛋白条带，而这在任何对照中均未观察到(图1A，泳道1至6)。数据表明，这种酶促方法可用于缀合肽和/或将官能团共价引入红细胞膜蛋白上(图1A)。为了进一步验证连接效率，我们试图确定每个人红细胞(hRBC)缀合的肽的拷贝数。通过链霉亲和素-HRP免疫印迹，用单生物素化肽(B-TL5)进行人红细胞标记的定量。二生物素化HRP用作定量参考。蛋白质标志物的分子量(kDa)显示在每个印迹的左侧。随后的分析表明，平均而言，单个人红细胞平均与超过100,000个肽缀合(图1B)。使用流式细胞术进一步验证了该结果。使用链霉亲和素-AF647对生物素化肽连接的红细胞或对照人红细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。只有在酶存在的情况下与B-TL5连接的人红细胞才会产生显著的群体变化，证实了人红细胞表面存在B-TL5肽(图1C)。还使用免疫荧光成像观察了连接和未连接的人红细胞，显示连接的肽(使用PE缀合的抗生物素抗体染色为绿色)共定位在人红细胞膜上(使用CellMask深红色质膜染色剂染色；图1D)。对于生物素化肽连接的人红细胞和未连接的人红细胞，对每种条件下约100个细胞的PE-生物素染色的平均荧光进行了每单位细胞面积的量化(使用CellMask染色作为掩模)，如图1E所示。此外，使用共定位分析可以更准确地量化CellMask和生物素的共定位程度，并且发现Pearson的R值为0.96，这证实了仅在成功酶促连接的情况下两个信号之间才存在强共定位。
我们还通过筛选具有不同序列X(C末端识别基序)的(EAAAK)3-X肽的连接效率，研究了肽序列如何影响连接产量。有意义的是，我们发现RBC连接对多种C末端序列都起作用(图9A)。当X为NDL或NPL时获得最佳连接产量，这导致连接产量显著更高。
还使用具有不同数量(EAAAK)重复单元的α螺旋肽评估肽长度的影响。长度从8个氨基酸到28个氨基酸(1-5个EAAAK重复)的总肽显示出有效的连接。所测试的最短肽(1个EAAAK重复，8个氨基酸长)显示出比具有较长序列的肽显著更高的产量。增加EAAAK重复次数导致连接从13个氨基酸至18个氨基酸(2至4个EAAAK重复)的产量小幅降低(图9B)。出人意料的是，与18个氨基酸的肽相比，具有28个氨基酸的肽(5个EAAAK重复)显示连接产量略有增加。
可以使用两步法将单结构域抗体共价连接到hRBC表面
可以使用两步法将单结构域抗体共价连接到人红细胞表面。该数据还表明，将明显较大的蛋白质(例如但不限于单结构域抗体(VHH))直接连接在人红细胞表面上是不可能的，很可能是由于更大且更复杂的结构。因此，设计了一种两步法来实现此类蛋白质的完全酶介导的缀合。第一步，使用OaAEP1连接酶将人红细胞与接头肽GN20缀合，第二步，使用相同的酶将接头肽与骆驼衍生的单结构域抗体(约15至30kDa)缀合(图2A)。结果，使用该方法将带有FLAG标签的抗EGFR单结构域抗体有效连接到人红细胞表面，如图2B中使用流式细胞术所示。该数据清楚地表明100％的人红细胞与单结构域抗体连接。
免疫荧光成像也支持这一点，证实两步法是有效的，尽管效率低于肽缀合(图2C，显示VHHEGFR的FLAG标签(使用抗FLAG-AF488抗体染成绿色)共定位于人红细胞膜(使用CellMaskTM深红色质膜染色剂染成红色)。CellMask和VHH的共定位也进行了量化，如图2D所示，表示为未连接的人红细胞和对照人红细胞每单位细胞面积的平均AF488信号。VHH连接的人红细胞的Pearson R值为0.51，验证了与肽连接相比，VHH与细胞膜的共定位程度较低。
可以使用两步法的接头肽设计将单结构域抗体共价连接到hRBC表面
我们还验证了2步连接法的效率，比较了许多不同接头肽的相对效率，每个接头肽在其N末端和C末端均具有酶识别基序。接头肽连接后，RBC与针对EGFR(EGFR VHH)的单结构域抗体缀合。随后使用抗FLAG标签抗体在RBC表面检测到经FLAG标记的单结构域抗体。最初的流式细胞术分析表明，纳米抗体在RBC上的直接连接没有导致任何明显的连接(图10A-B)。然而，在两个末端具有特定识别基序的专门设计的接头肽(GN20)存在的情况下，我们能够观察到100％hRBC的有效EGFR VHH缀合。值得注意的是，相似长度的乱序非接头肽(TL20)或在GN20 N末端添加生物素(B-GN20)消除了连接，表明2步接头肽法的缀合效率(图10A-B)。
比较N末端和C末端连接基序的不同变体的进一步分析表明，GN20肽中使用的组合具有最佳产量，而我们之前用于RBCEV缀合的肽GG20、EL17和GL17显示出明显较低的连接效率(图10C)。新设计的GN20肽具有最佳的连接产量，导致RBC 100％缀合，并且拷贝数比次佳肽GG20增加了约3倍(图10C)。通过GN20获得的更高拷贝数归因于GN20上的优化连接基序，这有助于在连接的第二步中更有效地在N末端连接至VHH(图10B)。我们的数据还揭示了2步连接的N末端和C末端基序的有限变化，其中将GN20的N末端基序从GLG-改变为GLA-或ALG-完全消除了连接反应(图10C)。此外，在C末端基序-LPETGG上添加一个另外的G(生成-LGETGGG)也完全抑制了2步连接。然而，我们能够证明，可以在不完全损害2步连接的情况下修改GN20肽的内部序列和长度，如使用GG39接头肽有效连接hRBC与VHH所证明的那样(图10C)。
实施例2：RBC去糖基化促进蛋白质与红细胞的连接
我们还比较了蛋白质连接前RBC去糖基化的影响(图11A)。值得注意的是，我们证明去糖基化本身对RBC的基础荧光没有影响(图11B)。然而，在随后连接蛋白质(EGFR VHH)后，我们能够检测到连接效率的增加，其中在去除O-聚糖后观察到最明显的增加(图11B)。值得注意的是，通过在EGFR VHH连接之前进行去糖基化和接头肽介导的连接，我们能够证明去糖基化策略与上述2步连接法具有协同作用(图11C)。有意义的是，用PNGase F去糖基化并与GL17接头肽连接导致EGFR VHH连接产量显著增加，这比单独使用任一条件获得的产量要高得多。值得注意的是，我们发现，当在接头肽连接之前进行去糖基化而不是其他方式时，连接产量会增加更多，这表明去糖基化过程能够促进接头肽更有效的缀合，并随后增加EGFR VHH缀合(图11C)。
实施例4：与EGFR结合单结构域抗体连接的RBC可以附着于EGFR阳性转移性乳腺癌细胞
我们还通过将对照RBC或GN20连接的EGFR VHH连接的红细胞与表达tdTomato和人EGFR(hEGFR)的4T1细胞短暂孵育10分钟，验证了EGFR VHH缀合的RBC的官能性。随后将RBC与4T1-tdTomato-hEGFR细胞分离、裂解，并通过EGFR的蛋白质印迹分析癌细胞下拉的效率。如图11D所示，只有GN20接头肽能够产生足够的EGFR VHH缀合，以提供癌细胞的明显下拉，证实了这些与单结构域抗体连接的工程改造的RBC与表达相应受体的癌细胞结合的能力。HBA用作RBC的内部对照，证明在每种条件下使用等量的RBC进行下拉。我们还通过使用读板器读取每个下拉样品的tdTomato荧光来验证该数据(图11E)。4T1细胞是转移性乳腺癌细胞，高频率通过循环从原发肿瘤向远处播散并形成转移灶。尽管4T1细胞天然表达EGFR，但在本研究中，EGFR的人同源物在4T1细胞上表达以模仿人癌细胞。EGFR是包括乳腺癌在内的人癌症的常见受体。因此，EGFR-VHH包被的RBC与4T1细胞的结合表明，可以将此类RBC输注到转移性癌症患者体内，以识别循环中的EGFR阳性肿瘤细胞。然后可以去除或消除RBC-肿瘤细胞成对体以降低转移率。
实施例5：通过链霉亲和素接头将更大、更复杂的蛋白质缀合到人红细胞(hRBC)表面。
虽然已经建立了将相对小至中等大小的蛋白质结合到人红细胞上的两步接头肽缀合方法，但是还在进一步寻找将较大的蛋白质如单克隆抗体(mAb)和酶固定在人红细胞表面上的方法。为此，基于将生物素化肽连接的人红细胞依次与链霉亲和素和选择的生物素化蛋白质简单孵育，建立了模块化链霉亲和素介导的缀合方法，如图3A所示。尽管是亲和相互作用，但链霉亲和素方法被证明非常稳定，并且每个链霉亲和素分子上的四个结合位点增加了每个红细胞的生物素化目的蛋白的拷贝数。使用流式细胞术分析生物素化抗His标签单克隆抗体缀合的人红细胞，确认人红细胞表面上存在单克隆抗体，如用第二荧光抗体染色后整个群体荧光的大位移所示(图3B)。免疫荧光成像显示生物素化的兔单克隆抗体(使用驴抗兔AF488抗体染成绿色)共定位在人红细胞膜上(使用CellMaskTM深红色质膜染色剂染成红色)，也用于证明单克隆抗体在人红细胞上的高效成功缀合(图3C)。共定位分析显示，单克隆抗体缀合的人红细胞的Pearson’s R值为0.86，显著高于之前用于VHH缀合的两步接头肽方法，表明该方法的效率更高。图3D还显示了每种条件下AF488通道中每单位细胞面积的平均荧光(参考细胞掩模)。单克隆抗体缀合的人红细胞显示出功能，能够从溶液中下拉靶抗原，如生物素化的抗his标签抗体缀合的人红细胞下拉his标签蛋白(也包含用于检测的FLAG标签)所证明的(图3E)。使用FLAG标签抗体检测人红细胞表面的靶抗原。为了进一步证明这种方法的通用性，还将生物素化的HRP缀合到红细胞表面。红细胞经过内源性过氧化物酶漂白，然后与生物素化的HRP结合，然后与DAB显色剂(3,3'-二氨基联苯胺)一起孵育，然后进行H&E染色。通过形成特征性棕色沉淀来测量辣根过氧化物酶(HRP)活性(图3F)。这也表明酶在缀合后在红细胞表面仍保持功能。
我们在图3G-H(使用抗IL-8抗体检测到的人IL-8缀合物)和图3I(l-天门冬酰胺酶缀合导致在与工程改造的RBC的共培养物中有效抑制天冬酰胺依赖性Sup-B15细胞的活力)中进一步证明了RBC缀合方法可转化成一系列不同大小和功能的不同蛋白质。值得注意的是，缀合蛋白保留了其功能，如GFP的内源荧光以及L-天冬酰胺酶缀合hRBC降低Sup-B15细胞活力和增殖的能力所证明的。
通过酶促连接和点击化学将大分子完全生物正交、共价、高效地缀合在人红细胞上。
虽然链霉亲和素方法证明了能够有效地将人红细胞与大分子缀合，但链霉亲和素分子本身具有免疫原性，因为其细菌来源不利于其在某些临床应用中的使用。因此，我们利用无铜点击化学和酶促连接的组合来证明任何经叠氮化物/DBCO标记的分子在人红细胞表面上的完全生物正交缀合，如图4A所示。第一酶促步骤的使用允许将第一反应基团(在该情况下为用DBCO标记的肽)生物相容地和共价地引入到人红细胞膜上，而不需要任何严苛的化学修饰。其次，使用无铜点击化学/SPAAC(应变促进的炔烃-叠氮化物环加成)允许随后将标记有互补反应性官能团(在该情况下为叠氮基抗体)的第二个较大功能分子缀合到人红细胞表面上。整个过程是完全生物相容的，不使用免疫原性分子，并导致目的分子完全共价缀合。为了证明点击化学成功，将hRBC与经DBCO标记的肽(EK18)缀合，然后与CalFluor 647叠氮化物(一种荧光叠氮化物探针，仅在通过点击化学激活后才发射荧光)一起孵育。图4B显示了与DBCO肽连接的hRBC和未连接的hRBC一起孵育的CalFluor 647的平均荧光，清楚地显示了EK18肽连接的hRBC进行无铜点击化学反应的能力。更重要的是，100％的hRBC对于CalFluor 647荧光呈阳性，表明所有hRBC均有效缀合。图4C显示了叠氮基肽(TK3)或叠氮基单克隆抗体与所有对照的hRBC成功缀合，表明EK18肽的酶促连接是成功点击化学的先决条件。数据还表明，单克隆抗体(mAb)缀合的效率略低于肽缀合，这可能是由于单克隆抗体大小较大且缀合步骤使用的浓度较低。然而，值得注意的是尽管拷贝数存在差异，但>95％RBC对于肽和单克隆抗体呈阳性，如FACS直方图中整个群体的变化所示(图4C)。免疫荧光成像也证明了通过点击化学进行的有效单克隆抗体缀合，其中仅在已成功进行点击化学的人红细胞上通过二抗在细胞表面检测到强烈的荧光(图4D)。图4E进一步将该数据总结为每种条件下每单位细胞面积的平均荧光。为了证明这种方法对其他分子的可转化性，我们还证明了其他不同大小的蛋白质(例如GFP)也可以使用这种方法成功地缀合到RBC上(图4F-G)。
实施例6：人红细胞(hRBC)连接方法可转化至小鼠红细胞(mRBC)。
到目前为止，所有实验都是在人红细胞(hRBC)上进行的。我们试图验证小鼠红细胞(mRBC)是否也可以以类似的方式进行修饰。对与B-TL5酶促连接的小鼠红细胞或对照小鼠红细胞进行流式细胞术(图5A)和免疫荧光成像(图5B)显示，在小鼠红细胞中缀合也成功。如FACS直方图所示，超过99％的小鼠红细胞与该肽成功缀合。更重要的是，这也表明上面展示的扩展方法，包括链霉亲和素介导的缀合和无铜点击化学也可以应用于小鼠红细胞，使得测试该方法功效的临床前试验变得更加简单。免疫荧光图像分析显示，肽连接的小鼠红细胞和未连接的小鼠红细胞之间的抗生物素-PE荧光存在显著差异(图5C)。共定位分析的Pearson R值显示，生物素化肽连接的小鼠红细胞的值为0.81，表明与人红细胞相比，缀合效率稍低，这可能是由于这两个物种之间的红细胞的膜蛋白质组组成略有不同。
不同肽C末端基序的比较还表明，mRBC可以有效地与展示不同范围的C末端序列的肽连接(图5D)。然而，这种趋势与hRBC不同，可能是由于人和小鼠RBC之间的RBC膜蛋白组成存在差异。然而，肽长度的比较揭示了类似的趋势，所有8至28个氨基酸(1-5个EAAAK重复)的肽均有效连接(图5E)。使用最短的肽(1个EAAAK重复序列，8个氨基酸)获得最佳产量，连接产量随着长度从13到18个氨基酸而降低。有意义的是，28个氨基酸的肽(5个EAAAK重复)的产量与8个氨基酸的单个EAAAK重复肽相当(图5E)。
红细胞的缀合高效且用途广泛。
为了确定酶促连接的效率，验证了人和小鼠红细胞与B-TL5肽完全缀合所需的时间(图6A)。人红细胞缀合在3小时内达到饱和，在90分钟内达到>90％的效率。小鼠红细胞的缀合速度要快得多(大约30分钟)，这可能是由于小鼠红细胞上肽的拷贝数较低。此外，还评估了通过点击化学扩展这种方法的效率和通用性。在一系列条件下，甚至叠氮基肽浓度为66μM或孵育时间短至3小时，观察到100％的人红细胞成功的经点击化学介导的缀合(图6B)。然而，在约250μM肽浓度和长达12小时的孵育时间下观察到最佳缀合。图6C还证明了在官能团取向转变情况下进行缀合的可能性(将叠氮基肽连接到人红细胞上，然后与带有经DBCO标记的肽一起孵育)，显示了利用酶促连接和无铜点击化学的组合方法的通用性。
连接方案具有生物相容性并且可在体内实现稳定且功能性的缀合。
为了测试该方法的生物相容性，使用膜联蛋白V分析生物素化肽连接的或未修饰的人红细胞和小鼠红细胞，以测试PS的存在，PS可能意味着诱导细胞凋亡。如图7A所示，与未修饰的红细胞相比，B肽连接的红细胞显示膜联蛋白V结合没有增加，证实了该方法的温和性和生物相容性。此外，我们还证明了工程改造的小鼠红细胞在体内的稳定性。为此，用CFSE标记B-TL5肽缀合的小鼠红细胞或对照小鼠红细胞，并通过尾静脉注射到小鼠体内。24小时内定期从颌下静脉采血。使用链霉亲和素Alexa Fluor 647对细胞进行染色，以检测小鼠红细胞表面的生物素。如图7B中的散点图所示，工程改造的小鼠红细胞以及未修饰的(对照)小鼠红细胞(使用CFSE荧光检测)保留在血液中。此外，缀合的肽的N末端的生物素标签在实验期间保持稳定(图7C)。图7D还显示了在24小时时从注射了PBS或B-TL5肽连接的或未连接的经CFSE染色的小鼠红细胞的小鼠采集的血涂片的代表性免疫荧光图像，证实了工程改造的红细胞在体内的稳定性。在免疫缺陷的NSG-SGM3或免疫功能正常的C57BL/6小鼠中也进行了为期39天的相同实验(图8A)。如图8B中的散点图所示，在两种小鼠模型中，工程改造的mRBC以及未修饰的(对照)mRBC(使用CFSE荧光检测)均保留在血液中。值得注意的是，我们可以检测到约50％的工程改造的红细胞在注射后21天仍保持在循环中。此外，在实验期间，缀合的肽的N末端上的生物素标签基本保持稳定(图8C)，尽管我们确实看到信号逐渐减弱，这可能是由于长时间暴露于血清蛋白酶后表面肽的降解。尽管如此，我们仍然能够在注射后3周检测到高达50％的原始连接产物。
实施例7：红细胞中膜蛋白与红细胞来源的胞外囊泡的比较
我们之前已经使用生物素下拉实验结合LFQ质谱法确定了RBCEV上的一系列候选蛋白，这些蛋白通过OaAEP1连接酶与生物素化肽连接(见图12)(从Pham等人,Journal ofExtracellular Vesicles,2021获得)。将这些候选蛋白与完整RBCEV蛋白的单独质谱进行比较，结果显示3个候选蛋白(ACKR1、ICAM4和F11R，相对丰度排名第33、第119和第57)与所有其他RBCEV蛋白相比(相对丰度根据LFQ(无标记定量)强度计算)在RBCEV中高度富集。
该数据与现有红细胞膜蛋白质组研究的交叉比较(见图13)表明，在RBC中，这些蛋白质的相对丰度非常低(均低于490)(相对丰度来自‘Quantitative analysis of humanred blood cell proteome；作者：Agata Bryk和Jacek R.(BiochemicalProteomics Group,Department of Proteomics and Signal Transduction,Max-Planck-Institute of Biochemistry,Am Klopferspitz 18,82152Martinsried,Germany))。此外，比较它们的拷贝数表明，如果连接与RBCEV相同的蛋白质，则会导致RBC上肽的拷贝数非常低，这表明连接方法可能无法有效地转化至RBC。
这与我们的连接数据形成鲜明对比，该数据显示拷贝远远超过100,000个。这表明RBC和RBCEV中连接有不同的蛋白质。这很可能是由于囊泡形成过程中膜蛋白组成的变化，或者是由于翻转酶和转位酶引起的膜翻转，或者是其他修饰，例如阻止连接的糖基化。
实施例7：分选酶和OaAEP1连接酶的连接效率比较
我们比较了分选酶和OaAEP1连接酶的连接效率。我们发现，分选酶无法催化单结构域抗体的连接，无论是在单步方法中(包括去糖基化的RBC)，还是在两个连接步骤中使用分选酶进行2步连接-都是将接头连接到RBC，并将抗体连接到接头上。这些方法的连接率基本上为0％，与我们使用上述OaAEP1连接酶实现的惊人效率形成鲜明对比。
为了进一步研究这一点，我们研究了分选酶将具有合适基序的肽与人RBC连接的能力。
将以下肽与hRBC在室温孵育过夜：
如图14所示，分选酶能够将合适的肽连接到hRBC，但与OaAEP1连接酶相比，产量要低得多。将-LPETGG或-LPETGGG(最佳分选酶AC末端基序)与-NGL或-NDL(最佳C末端OaAEP1基序)进行比较时，分选酶的连接产量分别低5倍和10倍。
参考文献
上面引用了许多出版物，以便更全面地描述和披露本发明以及本发明所属领域的现有技术状态。下面提供了这些参考文献的完整引用。这些参考文献中每一篇的全部内容均并入本文。
对于标准的分子生物学技术，参见Sambrook,J.,Russel,D.W.MolecularCloning,A Laboratory Manual.第3版2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press。

Claims (31)

1.一种方法，其包括：
(a)在连接酶存在下，在合适的条件下，使红细胞(RBC)与肽接触足够的时间，以允许所述肽与所述RBC连接以形成RBC-肽缀合物；
其中所述肽包含C末端连接酶识别序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述连接酶是OaAEP1连接酶，优选OaAEP1-Cys247Ala。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述肽是效应物分子。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述效应物分子具有选自NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG，优选NGL、NPL或NDL的C末端连接酶识别序列。
5.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述肽是接头肽。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述接头肽包含C末端连接酶识别序列和用于缀合至效应物分子的基序，其中用于缀合至另一分子的基序是N末端连接酶识别序列、点击化学官能团或生物素部分。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述RBC-肽缀合物是RBC-接头肽缀合物，并且其中所述方法还包括：
(b)使所述RBC-接头肽缀合物与效应物分子在合适的条件下接触足够的时间以使所述效应物分子与所述RBC-接头肽缀合以形成RBC-接头-效应物分子缀合物。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述接头肽包含N末端连接酶识别序列，并且其中所述C末端连接酶识别序列是Xaa1GG，其中Xaa1是除G之外的任何氨基酸或具有序列NG或NCL。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述N末端连接酶识别序列是G、GG、GL、GGG、GLG或GGL。
10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述效应物分子包含选自由以下组成的组的C末端连接酶识别序列：NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG，优选NGL、NPL或NDL。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中使所述RBC-接头肽缀合物与所述效应物分子在合适的条件下接触足够的时间以使所述效应物分子与所述RBC-接头肽连接以形成RBC-接头-效应物分子缀合物。
12.如权利要求11所述的方法，其中(a)中的连接酶与(b)中的连接酶相同，优选为OaAEP1连接酶，更优选为OaAEP1-Cys247Ala。
13.如权利要求6所述的方法，其中所述接头包含点击化学官能团和选自由以下组成的组的C末端连接酶识别序列：NGL、NDL、NPL、NAL、NCL、NEL、NFL、NHL、NKL、NIL、NLL、NQL、NRL、NSL、NTL、NVL、NWL、NYL、NSLD、NSLAN或NG，优选NGL、NPL或NDL。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述点击化学官能团包含叠氮化物部分、四嗪部分、甲基四嗪部分、二芳基环辛炔(DBCO)部分或反式环辛炔(TCO)部分。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述效应物分子包含互补点击化学官能团。
16.如权利要求13至权利要求15所述的方法，其中使所述RBC-接头缀合物与所述效应物分子在合适的条件下接触足够的时间以使所述效应物分子与所述RBC-接头缀合物通过无铜点击化学缀合。
17.如权利要求6所述的方法，其中所述RBC-肽缀合物是RBC-接头缀合物，其中所述接头包含生物素部分，并且其中所述方法还包括：
(b)使所述RBC-接头肽缀合物与链霉亲和素在合适的条件下接触足够的时间以使所述RBC-接头肽的生物素部分与链霉亲和素缀合以形成RBC-接头-链霉亲和素缀合物；以及
(c)使所述RBC-接头-链霉亲和素缀合物与生物素化的效应物分子在合适的条件下接触足够的时间以使所述效应物分子的生物素部分与所述RBC-接头-链霉亲和素缀合物的链霉亲和素缀合，从而形成RBC-接头-链霉亲和素-效应物分子缀合物。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括洗涤所述RBC-肽缀合物、所述RBC-接头-效应物分子缀合物或所述RBC-接头-链霉亲和素-效应物分子缀合物的步骤。
19.如权利要求5至18中任一项所述的方法，其中接头肽包含接头体序列，所述接头体序列：
(a)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸或由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸组成；
(b)包含α-螺旋肽序列；
(c)包含序列EAAAK的重复；或者
(d)包含序列EQKLISEEDL。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述接头由选自由以下序列组成的组的序列组成：
GLGEQKLISEEDLGLPETGG；
DBCO-EAAAKEAAAKEAAAKNGL；
叠氮化物-GSSGSGGEQKLISEEDLGGSGGSGSGNGL；
GLGEQKLISEEDLGLPETGG；
GGGEQKLISEEDLGLPETGG；
GLGEQKLISEEDLGNGL；
GGGEQKLISEEDLGNGL；以及
GLG(EAAAK)5LPETGG。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法中EBC是去糖基化的。
22.一种经修饰的红细胞(RBC)，其通过如权利要求1至21中任一项所述的方法产生。
23.一种经修饰的红细胞(RBC)，其在其外表面上包含肽，其中所述肽与天然红细胞蛋白缀合。
24.如权利要求23所述的经修饰的RBC，其中所述肽是效应物分子。
25.如权利要求23所述的经修饰的RBC，其中所述肽是接头蛋白。
26.如权利要求25所述的经修饰的RBC，其中所述接头蛋白进一步缀合至效应物分子。
27.如权利要求23至26中任一项所述的经修饰的RBC，其中所述RBC是去糖基化的。
28.一种治疗方法，其包括向有需要的个体施用如权利要求22-27中任一项所述的经修饰的RBC。
29.如权利要求22至27中任一项所述的经修饰的RBC，其用于治疗方法中。
30.如权利要求22至27中任一项所述的经修饰的RBC在制备用于治疗的药物中的用途。
31.如权利要求28所述的治疗方法、权利要求29所使用的经修饰的RBC、或权利要求30的经修饰的RBC的用途，其中所述治疗是针对酶缺乏、代谢疾病、免疫相关障碍、血液障碍或癌症的治疗。
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