JP2024505818A - 細胞表面を修飾された赤血球及びその調製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、赤血球（ＲＢＣ）の細胞表面マーカーを修飾する方法及びその使用に関する。特に、本方法は、ペプチドをＲＢＣに対してライゲーションさせてＲＢＣ－ペプチドコンジュゲートを形成するのに適した条件下で、十分な時間にわたって、リガーゼの存在下でＲＣＥをペプチドと接触させることを含む。一実施形態では、リガーゼはＯａＡＥＰＩリガーゼである。エフェクター分子をＲＢＣ－ペプチドに対してコンジュゲートさせてＲＢＣ－ペプチド－エフェクター分子コンジュゲートを形成させるのに適した条件下で、十分な時間にわたって、ＲＢＣ－ペプチドコンジュゲートをエフェクター分子と更に接触させてもよい。【選択図】図２

Description

本出願は、２０２１年１月２９日に出願されたシンガポール国特許出願第１０２０２１０１００３Ｓ号の優先権を主張し、その内容及び要素は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、概して分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、赤血球の細胞表面タンパク質を修飾する方法及びその使用に関する。

治療用途のための、細胞表面を修飾された赤血球を調製する方法には、多くの課題がある。赤血球の化学的機能付加又は遺伝子操作などの、従来のほとんどの方法では、赤血球の長期生存に有害である過酷な化学処理と、前駆細胞の非常に高価な遺伝子操作及び培養との間で折り合いをつけなければならない。既存の酵素による方法は、事前の遺伝子操作なしでは非効率的である。したがって、治療用途のための、細胞表面を修飾された赤血球を、効率的に調製する方法を提供するというニーズは、未だに満たされていない。

本発明は、上記の考察に鑑みてなされたものである。

最も一般的には、本開示は、脱核後の赤血球を修飾する方法、並びに脱核後の細胞表面にエフェクター分子がコンジュゲートしている修飾赤血球に関する。特に、本開示は、遺伝子改変をなされていない赤血球を修飾する方法に関する。

一態様では、本開示は、
（ａ）ペプチド又はポリペプチドを赤血球（ＲＢＣ）に対してライゲーションさせてＲＢＣ－ペプチド又はＲＢＣ－ポリペプチドコンジュゲートを形成させるのに適した条件下で十分な時間にわたって、リガーゼの存在下でＲＢＣをペプチド又はポリペプチドと接触させることを含み、
上記ペプチド又はポリペプチドがＣ末端リガーゼ認識配列を含む、方法を提供する。

本方法は、ＲＢＣ－ペプチドコンジュゲートを洗浄する工程、例えばＲＢＣに対してコンジュゲートしていないペプチドを除去する工程を更に含み得る。

リガーゼは、ＯａＡＥＰ１リガーゼ、例えば変異型ＯａＡＥＰ１リガーゼ、例えばＯａＡＥＰ１－Ｃｙｓ２４７Ａｌａであり得る。

Ｃ末端認識配列は、ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ又はＮＧ、好ましくはＮＧＬ、ＮＰＬ又はＮＤＬから選択される配列を有し得る。

場合によっては、Ｃ末端認識配列は、ＯａＡＥＰ１リガーゼによる高いライゲーション効率を可能にしない。Ｃ末端認識配列は、配列Ｘａａ_１ＧＧを有し得、Ｘａａ_１はＧ以外の任意のアミノ酸である。Ｃ末端認識配列は、配列ＮＧ又はＮＣＬを有し得る。

いくつかの態様では、ペプチド又はポリペプチドは、エフェクター分子である。エフェクター分子は、ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ又はＮＧ、好ましくはＮＧＬ、ＮＰＬ又はＮＤＬから選択されるＣ末端認識配列を有し得る。

ＲＢＣがエフェクター分子にコンジュゲートされる場合、この方法は、「一工程法」と呼ばれ得る。

場合によっては、ペプチドはリンカーペプチドである。リンカーペプチドは、Ｃ末端リガーゼ認識配列を有する。リンカーペプチドは、別のペプチド又はポリペプチド、例えばエフェクター分子に対するコンジュゲーションのためのＮ末端モチーフを有する。Ｎ末端モチーフは、リガーゼ認識配列、クリックケミストリー官能基、又はビオチン部分であり得る。

リガーゼ認識配列は、ＯａＡＥＰ１リガーゼ、ソルターゼ、アスパラギニルペプチダーゼ、ブテラーゼ－１、又はこれらの任意の変異体若しくは多様体から選択されるリガーゼ、好ましくはＯａＡＥＰ－Ｃｙｓ２４７Ａｌａリガーゼの認識配列であり得る。

リンカーペプチドがＮ末端リガーゼ認識配列を有する場合、この配列は、Ｇ、ＧＧ、ＧＬ、ＧＧＧ、ＧＬＧ及びＧＧＬを含み得る。

ペプチドがリンカーペプチドである場合、ペプチドのＲＢＣへのライゲーションは、ＲＢＣ－リンカーペプチドコンジュゲートの形成をもたらす。

ＲＢＣ－リンカーペプチドコンジュゲートをエフェクター分子と接触させてもよい。かかる方法は、リンカーペプチドに対してコンジュゲーションする第１の工程と、エフェクター分子に対してコンジュゲーションする第２の工程とを含む「二工程法」と呼ばれ得る。

リンカーペプチドがＮ末端リガーゼ認識部位を有する場合、ＲＢＣ－リンカーペプチドを、Ｃ末端リガーゼ認識配列を有するエフェクター分子と接触させてもよい。かかる接触は、リガーゼの存在下で、エフェクター分子をリンカーペプチドにライゲーションさせて、ＲＢＣ－リンカー－エフェクター分子コンジュゲートを形成するのに十分な時間及び適した条件下で起こり得る。かかる方法では、ＲＢＣをリンカーペプチドに接触させる間に存在するリガーゼは第１のリガーゼと呼ばれ得、ＲＢＣ－リンカーコンジュゲートとエフェクター分子とを接触させる間に存在するリガーゼは第２のリガーゼと呼ばれ得る。第１及び第２のリガーゼは同じであってもよい。第１及び第２のリガーゼは異なってもよい。特に好ましい方法では、第１及び第２のリガーゼは、ＯａＡＥＰ１リガーゼ、好ましくはＯａＡＥＰ１－Ｃｙｓ２４７Ａｌａである。

そのような場合、リンカーペプチドのＣ末端リガーゼ認識配列は、第１のＣ末端リガーゼ認識配列と呼ばれ得、エフェクター分子のＣ末端リガーゼ認識配列は、第２のＣ末端リガーゼ認識配列と呼ばれ得る。かかる方法では、第１のＣ末端リガーゼ認識配列及び第２のＣ末端リガーゼ認識配列は同じでないことが一般に有利である。第１及び第２のリガーゼが両方とも同じである場合、第１のＣ末端リガーゼ認識配列及び第２のＣ末端リガーゼ認識配列は同じでないことが有利であり得る。特に、第１のＣ末端リガーゼ認識配列が第２のＣ末端リガーゼ認識配列よりもリガーゼ認識に最適化されていないことが有利であり得る。換言すれば、第１のリガーゼによるリンカーへのＲＢＣのライゲーションは、エフェクター分子のＲＢＣ－リンカーペプチドに対するライゲーションよりも効率が低い可能性がある。理論に拘束されることを望むものではないが、ライゲーション効率の差異は、リンカーによるセルフライゲーションを減少させると考えられる。かかる方法では、第１のＣ末端リガーゼ認識配列は、配列Ｘａａ_１ＧＧを有し、ここで、Ｘａａ_１は、Ｇ以外の任意のアミノ酸残基であるか、又は配列ＮＧ若しくはＮＣＬを有し、第２のＣ末端リガーゼ認識配列は、ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ又はＮＧ、好ましくはＮＧＬ、ＮＰＬ又はＮＤＬから選択される配列を有する。

場合によっては、リンカーペプチドは、クリックケミストリー官能基をＮ末端に含むか、又はそうでなければクリックケミストリー官能基がリンカーペプチド上に露出している。クリックケミストリー官能基は、アジド部分、テトラジン部分、メチルテトラジン部分、ジアリールサイトオクチン（ｄｉａｒｙｌｃｙｔｏｏｃｔｙｎｅ）（ＤＢＣＯ）部分又はトランスシクロオクチン（ＴＣＯ）部分から選択され得る。

場合によっては、リンカーペプチドは、Ｎ末端にビオチン部分含むか、又はそうでなければビオチン部分がリンカーペプチド上に露出している。

リンカーペプチドが、リガーゼ認識モチーフではない別のペプチドに対するコンジュゲーションのためのＮ末端モチーフを含む場合、例えば、リンカーペプチドが、Ｎ末端にビオチン部分のクリックケミストリー官能基を含むか、又はそうでなければビオチン部分のクリックケミストリー官能基がリンカーペプチド上に露出している場合、Ｃ末端のリガーゼ認識配列は、ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ又はＮＧ、好ましくはＮＧＬ、ＮＰＬ又はＮＤＬから選択され得る。Ｎ末端モチーフの選択は、エフェクター分子（ＧＬ－）上の第２のＣ末端モチーフに相補的であるように決定される。

リンカーペプチドがクリックケミストリー官能基を含む場合、ＲＢＣ－リンカーコンジュゲートは、例えば、エフェクター分子のＣ末端にある、又はそうでなければエフェクター分子上に露出した、相補的なクリックケミストリー官能基を有するエフェクター分子と接触させてもよい。相補的なクリックケミストリー官能基は、アジド部分、テトラジン部分、メチルテトラジン部分、ジアリールサイトオクチン（ＤＢＣＯ）部分又はトランスシクロオクチン（ＴＣＯ）部分から選択され得る。

リンカーペプチドのクリックケミストリー官能基がアジド部分である場合、エフェクター分子の相補的なクリックケミストリー官能基はＤＢＣＯ部分である。リンカーペプチドのクリックケミストリー官能基がＤＢＣＯ部分である場合、エフェクター分子の相補的なクリックケミストリー官能基はアジド部分である。リンカーペプチドのクリックケミストリー官能基がＴＣＯ部分である場合、エフェクター分子の相補的なクリックケミストリー官能基は、テトラジン部分又はメチルテトラジン部分である。リンカーペプチドのクリックケミストリー官能基がテトラジン部分又はメチルテトラジン部分である場合、エフェクター分子の相補的なクリックケミストリー官能基はＴＣＯ部分である。

リンカーペプチドがクリックケミストリー官能基を含む場合、ＲＢＣ－リンカーペプチドコンジュゲートは、クリックケミストリーによるＲＢＣ－リンカーコンジュゲートのエフェクター分子に対するコンジュゲーションに十分な時間及び適した条件下でエフェクター分子による接触を受ける。

リンカーペプチドがビオチン部分を含む場合、リンカーコンジュゲートのビオチン部分をストレプトアビジン又はアビジンに対してコンジュゲートさせてＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジン又はＲＢＣ－リンカー－アビジンコンジュゲートを形成するのに十分な時間及び適した条件下で、ＲＢＣ－リンカーコンジュゲートをストレプトアビジン又はアビジンと接触させる。ＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジン又はＲＢＣ－リンカー－アビジンコンジュゲートは、ビオチン化エフェクター部分と接触させてもよい。ビオチン化エフェクター部分は、ビオチン部分を含むエフェクター部分、例えば、ビオチン部分にコンジュゲートされているエフェクター分子である。ＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジン又はＲＢＣ－リンカー－アビジンコンジュゲートは、エフェクター分子のビオチン部分をＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジン又はＲＢＣ－リンカー－アビジンコンジュゲートのストレプトアビジン又はアビジン部分にコンジュゲートさせてＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジン－エフェクター分子コンジュゲート又はＲＢＣ－リンカー－アビジン－エフェクター分子コンジュゲートを形成するのに適した条件下及び十分な時間で、ビオチン化エフェクター部分と接触させてもよい。

上記のように、本明細書に開示されるある特定の方法は、リンカーに対してコンジュゲーションさせる第１の工程及びエフェクター分子に対してコンジュゲーションさせる第２の工程を含む「二工程」法である。

そのような一態様では、本開示は、
（ａ）ペプチドをＲＢＣに対してライゲーションさせてＲＢＣ－リンカーコンジュゲートを形成させるのに適した条件下で十分な時間にわたって、リガーゼの存在下でＲＢＣをリンカーペプチドと接触させる工程であって、
リンカーペプチドが第１のＣ末端リガーゼ認識配列及びＮ末端リガーゼ認識配列を含む工程と、
（ｂ）（ａ）からのＲＢＣ－リンカーコンジュゲートを、エフェクター分子をリガーゼにライゲーションさせてＲＢＣ－リンカー－エフェクターコンジュゲートを形成するのに適した条件下で十分な時間にわたって、リガーゼの存在下でエフェクター分子と接触させる工程であって、
エフェクター分子が第２のＣ末端リガーゼ認識配列を含む工程と、
を含む方法を提供する。

本方法は、ＲＢＣ－リンカーコンジュゲートを洗浄する工程を含み得る。かかる洗浄工程は、好ましくは、ＲＢＣ－リンカーコンジュゲートをエフェクター分子と接触させる前に行われる。

本方法は、ＲＢＣ－リンカー－エフェクター分子コンジュゲートを洗浄する工程を含み得る。

代替的な態様では、本開示は、
（ａ）リンカーペプチドをＲＢＣに対してライゲーションさせてＲＢＣ－リンカーコンジュゲートを形成させるのに適した条件下で十分な時間にわたって、リガーゼの存在下でＲＢＣをリンカーペプチドと接触させる工程であって、
リンカーペプチドがＣ末端リガーゼ認識配列及びＮ末端ビオチン部分を含む工程と、
（ｂ）リンカーのビオチン部分に対してストレプトアビジンを結合させてＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジンコンジュゲートを形成するコンジュゲーションに適した条件下で十分な時間にわたって、（ａ）からのＲＢＣ－リンカーコンジュゲートをストレプトアビジンと接触させる工程と、
（ｃ）ビオチン化エフェクター分子をＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジンコンジュゲートに対してコンジュゲーションさせてＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジン－エフェクター分子コンジュゲートを形成するのに適した条件下で十分な時間にわたって、ＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジンコンジュゲートをビオチン化エフェクター分子と接触させる工程と、
を含む、方法を提供する。

本方法は、ＲＢＣ－リンカーコンジュゲートを洗浄する工程を含み得る。かかる洗浄工程は、好ましくは、ＲＢＣ－リンカーコンジュゲートをストレプトアビジンと接触させる前に行われる。

本方法は、ＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジンコンジュゲートを洗浄する工程を含み得る。かかる洗浄工程は、好ましくは、ＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジンコンジュゲートをエフェクター分子と接触させる前に行われる。

本方法は、ＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジン－エフェクター分子コンジュゲートを洗浄する工程を含み得る。

別の代替的な態様では、本開示は、
（ａ）リンカーペプチドをＲＢＣに対してライゲーションさせてＲＢＣ－リンカーコンジュゲートを形成させるのに適した条件下で十分な時間にわたって、リガーゼの存在下で、ＲＢＣをリンカーペプチドと接触させる工程であって、
リンカーペプチドがＣ末端リガーゼ認識配列及びクリックケミストリー官能基を含む工程と、
（ｂ）（ａ）からのＲＢＣ－リンカーコンジュゲートを、相補的なクリックケミストリー官能基を含むエフェクター分子と接触させる工程であって、銅フリーのクリックケミストリーによりエフェクター分子をリンカーにコンジュゲーションさせてＲＢＣ－リンカー－エフェクター分子コンジュゲートを形成するのに適した条件下で十分な時間にわたって、ＲＢＣ－リンカーコンジュゲートと、エフェクター分子とを接触させる工程と、
を含む方法を提供する。

本方法は、ＲＢＣ－リンカーコンジュゲートを洗浄する工程を含み得る。かかる洗浄工程は、好ましくは、ＲＢＣ－リンカーコンジュゲートをエフェクター分子と接触させる前に行われる。

本方法は、ＲＢＣ－リンカー－エフェクター分子コンジュゲートを洗浄する工程を含み得る。

クリックケミストリー官能基は、アジド部分、テトラジン部分、メチルテトラジン部分、ジアリールサイトオクチン（ＤＢＣＯ）部分又はトランスシクロオクチン（ＴＣＯ）部分から選択され得る。

相補的なクリックケミストリー官能基は、アジド部分、テトラジン部分、メチルテトラジン部分、ジアリールサイトオクチン（ＤＢＣＯ）部分又はトランスシクロオクチン（ＴＣＯ）部分から選択され得る。

リンカーペプチドのクリックケミストリー官能基がアジド部分である場合、エフェクター分子の相補的なクリックケミストリー官能基はＤＢＣＯ部分である。リンカーペプチドのクリックケミストリー官能基がＤＢＣＯ部分である場合、エフェクター分子の相補的なクリックケミストリー官能基はアジド部分である。リンカーペプチドのクリックケミストリー官能基がＴＣＯ部分である場合、エフェクター分子の相補的なクリックケミストリー官能基は、テトラジン部分又はメチルテトラジン部分である。リンカーペプチドのクリックケミストリー官能基がテトラジン部分又はメチルテトラジン部分である場合、エフェクター分子の相補的なクリックケミストリー官能基はＴＣＯ部分である。

本明細書に記載される特定の方法は、リンカーペプチドを含む。リンカーペプチドは、赤血球に対するライゲーションのためのＣ末端リガーゼ認識配列を含み得る。リンカーペプチドは、エフェクター分子などの別のペプチドに対するコンジュゲーションのためのＮ末端モチーフを含み得る。Ｎ末端モチーフは、リガーゼ認識配列、クリックケミストリー官能基、又はビオチン部分であり得る。

リンカーペプチドは、ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ若しくはＮＧ、好ましくはＮＧＬ、ＮＰＬ若しくはＮＤＬから選択される配列を有するか、又は配列Ｘａａ_１ＧＧを有するＣ末端リガーゼ認識配列を含み、Ｘａａ_１は、Ｇ以外の任意のアミノ酸残基であるか、又は配列ＮＧ若しくはＮＣＬを有する。

リンカーペプチドは、Ｎ末端リガーゼ認識配列を有し、この配列は、Ｇ、ＧＧ、ＧＬ、ＧＧＧ、ＧＬＧ及びＧＧＬを含み得る。

リンカーペプチドがＮ末端リガーゼ認識配列を有する場合、Ｃ末端リガーゼ認識配列は、配列Ｘａａ_１ＧＧを有し、Ｘａａ_１は、Ｇ以外の任意のアミノ酸であるか、又は配列ＮＧ若しくはＮＣＬを有する。

リンカーペプチドは、クリックケミストリー官能基又はビオチン部分をＮ末端に有していてもよいか、又はそうでなければクリックケミストリー官能基又はビオチン部分を分子上に露出していてもよい。クリックケミストリー官能基は、アジド部分、テトラジン部分、メチルテトラジン部分、ジアリールサイトオクチン（ＤＢＣＯ）部分又はトランスシクロオクチン（ＴＣＯ）部分から選択され得る。

リンカーペプチドがクリックケミストリー官能基、又はビオチン部分を有する場合、Ｃ末端リガーゼ認識配列は、ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ若しくはＮＧ、好ましくはＮＧＬ、ＮＰＬ若しくはＮＤＬから選択される配列を有し得るか、又は配列Ｘａａ_１ＧＧを有し、Ｘａａ_１は、Ｇ以外の任意のアミノ酸であるか、又は配列ＮＧ若しくはＮＣＬを有する。好ましくは、配列は、ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ又はＮＧから選択され、最も好ましくはＮＧＬ、ＮＰＬ又はＮＤＬである。

リンカーペプチドは、好ましくは、Ｃ末端リガーゼ認識配列と、Ｎ末端リガーゼ認識配列、クリックケミストリー官能基又はビオチン部分との間にリンカー本体配列を有する。リンカー本体配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、又は３０個のアミノ酸を含み得る。リンカー本体配列は、α－ヘリックスペプチド配列を含み得る。リンカー本体配列は、配列ＥＡＡＡＫの反復を含み得る。リンカー本体配列は、配列ＥＡＡＡＫの１～１０個の反復、例えば配列ＥＡＡＡＫの１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の反復、好ましくは配列ＥＡＡＡＫの３個の反復を含み得る。リンカー本体配列は、配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを含み得る。

リンカーは、下記から選択される配列を含み得るか、又はそれからなり得る。
ＧＬＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＬＰＥＴＧＧ；
ＤＢＣＯ－ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＮＧＬ（ここで、ＤＢＣＯは、ジアリールサイトオクチンを指す）；
アジド－ＧＳＳＧＳＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＧＳＧＧＳＧＳＧＮＧＬ；
ＧＬＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＬＰＥＴＧＧ；
ＧＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＬＰＥＴＧＧ；
ＧＬＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＮＧＬ；
ＧＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＮＧＬ；及び
ＧＬＧ（ＥＡＡＡＫ）_５ＬＰＥＴＧＧ。

本明細書に開示される特定の方法は、エフェクター分子を含む。エフェクター分子は、タンパク質、酵素、細胞表面マーカー、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ナノボディ、治療剤、サイトカイン、ケモカイン、抗体断片及びこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。いくつかの好ましい態様では、エフェクター分子は、モノクローナル抗体、一本鎖抗体又はナノボディである。

いくつかの態様では、エフェクター分子は、サイトカイン又はケモカインである。例えば、エフェクター分子は、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－２、又はＩＬ－１０であり得る。いくつかの態様では、エフェクター分子は、免疫調節リガンド、例えば４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）である。

いくつかの態様では、エフェクター分子は酵素である。例えば、エフェクター分子は、Ｌ－アスパラギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、ウリカーゼ、又は酵素補充療法において有用であることが知られている他の酵素であり得る。

いくつかの態様では、エフェクター分子は、抗体、例えば一本鎖抗体、ナノボディ、モノクローナル抗体又は抗原結合断片である。例えば、エフェクターは、白血病細胞マーカーなどのがん細胞マーカーなどの、目的とする標的に対して作製（ｒａｉｓｅｄ）され得る。マーカーとしては、ＣＸＣＲ４／ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又は別のがん細胞表面タンパク質が挙げられる。エフェクターは、ボツリヌス毒素などの毒素に対して、又は細菌若しくはウイルスなどの病原体に対して作製（ｒａｉｓｅｄ）され得る。

エフェクター分子は、Ｃ末端リガーゼ認識分子を含み得る。Ｃ末端リガーゼ認識分子は、好ましくは、ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ又はＮＧ、好ましくはＮＧＬ、ＮＰＬ又はＮＤＬから選択される配列である。

エフェクター分子は、ビオチン化エフェクター部分であり得る。ビオチン化エフェクター部分は、ビオチン部分を含むエフェクター部分、例えば、ビオチン部分にコンジュゲートされているエフェクター分子である。ビオチン部分は、好ましくは、アビジン又はストレプトアビジンに対するコンジュゲーションに利用可能であるように、エフェクター部分上に露出される。

エフェクター分子は、相補的なクリックケミストリー官能基を含み得る。相補的なクリックケミストリー官能基は、アジド部分、テトラジン部分、メチルテトラジン部分、ジアリールサイトオクチン（ＤＢＣＯ）部分又はトランスシクロオクチン（ＴＣＯ）部分から選択され得る。相補的なクリックケミストリー官能基は、リンカーペプチドのクリックケミストリー官能基に対して相補的である。リンカーペプチドのクリックケミストリー官能基がアジド部分である場合、相補的なクリックケミストリー官能基はＤＢＣＯ部分である。リンカーペプチドのクリックケミストリー官能基がＤＢＣＯ部分である場合、相補的なクリックケミストリー官能基はアジド部分である。リンカーペプチドのクリックケミストリー官能基がＴＣＯ部分である場合、相補的なクリックケミストリー官能基は、テトラジン部分又はメチルテトラジン部分である。リンカーペプチドのクリックケミストリー官能基がテトラジン部分又はメチルテトラジン部分である場合、相補的なクリックケミストリー官能基はＴＣＯ部分である。

エフェクター分子は、少なくとも１０ｋＤａのサイズを有し得る。例えば、エフェクター分子は、少なくとも１０ｋＤａのサイズを有する抗体又は抗原結合断片であり得る。エフェクター分子は、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも１０．５ｋＤａ、少なくとも１１ｋＤａ、少なくとも１１．５ｋＤａ、少なくとも１２ｋＤａ、少なくとも１２．５ｋＤａ、少なくとも１３ｋＤａ、少なくとも１３．５ｋＤａ、少なくとも１４ｋＤａ、少なくとも１４．５ｋＤａ、少なくとも１５ｋＤａ、少なくとも１６ｋＤａ、少なくとも１７ｋＤａ、少なくとも１８ｋＤａ、少なくとも１９ｋＤａ、少なくとも２０ｋＤａ、少なくとも２１ｋＤａ、少なくとも２２ｋＤａ、少なくとも２３ｋＤａ、少なくとも２４ｋＤａ又は少なくとも２５ｋＤａのサイズを有し得る。

エフェクター分子は、少なくとも７ｋＤａのサイズを有し得る。例えば、エフェクター分子は、少なくとも７ｋＤａのサイズを有する小タンパク質又はポリペプチドであり得る。エフェクター分子は、少なくとも７ｋＤａ、少なくとも７．５ｋＤａ、少なくとも８ｋＤａ、少なくとも８．５ｋＤａ、少なくとも９ｋＤａ、少なくとも９．５ｋＤａ、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも１０．５ｋＤａ、少なくとも１１ｋＤａ、少なくとも１１．５ｋＤａ又は少なくとも１２ｋＤａのサイズを有し得る。

本明細書に開示される方法は、ＯａＡＥＰ１リガーゼ、ソルターゼＡ、アスパラギニルペプチダーゼ、ブテラーゼ－１、又はこれらの任意の変異体若しくは多様体からなる群から選択されるリガーゼ、好ましくはＯａＡＥＰ－Ｃｙｓ２４７Ａｌａリガーゼを含み得る。本方法が、リンカーペプチドのＲＢＣに対するコンジュゲーション及びエフェクター分子のＲＢＣ－リンカーコンジュゲートに対するコンジュゲーションを含む二工程法である場合、リンカーペプチドをＲＢＣに対してコンジュゲーションするためのリガーゼ（第１のリガーゼ）及びエフェクター分子をＲＢＣ－リンカーコンジュゲートに対してコンジュゲーションするためのリガーゼ（第２のリガーゼ）は、同じであっても異なっていてもよい。好ましい態様では、第１及び第２のリガーゼは同じである。特に好ましい態様では、第１及び第２のリガーゼは、ＯａＡＥＰ１リガーゼ、好ましくはＯａＡＥＰ１－Ｃｙｓ２４７Ａｌａリガーゼである。

本明細書に記載されるいくつかの方法では、ＲＢＣは脱グリコシル化ＲＢＣである。換言すれば、ＲＢＣは予め処理されて、ＲＢＣ膜中の糖タンパク質から糖鎖（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）が除去されている。ＲＢＣは、ＰＮＧａｓｅＦ、ＥｎｄｏＨ、Ｏ－グリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼ（マンノシダーゼ、ノイラミニダーゼ及びβ－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼ）からなる群から選択されるグリコシダーゼ酵素により脱グリコシル化されていてもよい。例えば、赤血球を、ＰＮＧａｓｅＦ、ＥｎｄｏＨ、Ｏ－グリコシダーゼ又はエキソグリコシダーゼ（マンノシダーゼ、ノイラミニダーゼ及び／又はβ－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼ）と接触させる工程。本明細書で提供されるいくつかの方法では、赤血球を脱グリコシル化する工程は、赤血球とエフェクター分子又はリンカーペプチドを接触させる任意の工程の前に行われる。本明細書に開示される方法は、脱グリコシル化赤血球とペプチドを接触させること、例えば、脱グリコシル化赤血球とエフェクター分子又はリンカーペプチドを接触させることを含み得る。

本開示はまた、本明細書に開示される方法によって産生される修飾赤血球、及びそのための使用を記載する。

修飾赤血球は、外表面上に、天然の赤血球膜タンパク質に対してコンジュゲートされているペプチドを含み得る。ペプチドはエフェクター分子であり得る。その場合、エフェクター分子は膜タンパク質に対して直接コンジュゲートされ得る。ペプチドはリンカーペプチドであり得る。その場合、エフェクター分子はリンカーペプチドに対してコンジュゲートされ得る。したがって、いくつかの態様では、本開示は、外表面上にエフェクター分子を含む修飾赤血球を提供し、エフェクター分子は、リンカーペプチドを介して天然の赤血球膜タンパク質に対してコンジュゲートされている。リンカーペプチドは、任意の適切なリンカーペプチド、例えば、上記のリンカーペプチドであり得る。エフェクター分子は、任意の適切なエフェクター分子、例えば、上記のエフェクター分子であり得る。修飾赤血球は、脱グリコシル化赤血球であり得る。

一態様では、本開示は、医薬における使用のための修飾赤血球、疾患若しくは障害を治療するための医薬品の製造における修飾赤血球の使用、又は治療を必要とする個体若しくは患者に修飾赤血球を投与することを含む治療方法を提供する。治療は、酵素欠損症、代謝疾患、免疫関連障害、血液疾患、又はがんの治療であり得る。

別の態様では、本開示は、天然の赤血球を脱核後に表面修飾する方法であって、対象から得られた天然の赤血球をエフェクター分子に曝露することと、エフェクター分子を赤血球に対してコンジュゲートさせて赤血球を修飾することと、を含む方法、並びに本明細書に開示される方法によって得られる修飾赤血球、治療に使用するための本明細書に開示される赤血球、及び疾患又は障害を治療する医薬品の製造における本明細書に開示される修飾赤血球の使用に関する。

本発明は、記載された態様及び好ましい特徴の組み合わせを、そのような組み合わせが明らかに許容されないか又は明示的に回避される場合を除いて含む。

本発明は、非限定的な実施例及び添付の図面と併せて考慮しながら詳細な説明を参照することにより、十分に理解されるであろう。

図１は、ＯａＡＥＰ１ Ｃｙｓ２４７Ａｌａを使用して、ヒト赤血球表面に対してペプチドを共有結合させることができることを示す図である。（Ａ）ストレプトアビジン－ＨＲＰを使用して検出した、ビオチン化ペプチド（Ｂ－ペプチド／Ｂ－ＴＬ５）をライゲートしたヒトＲＢＣ（ｈＲＢＣ）のウェスタンブロット解析。（Ｂ）ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）ライゲーション産物上のＢ－ペプチド（モノビオチン化）と、ジビオチン化ＨＲＰ標準の段階希釈物との比較。ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）当たりのライゲートされたペプチドを定量する。Ａ及びＢではタンパク質マーカーの分子量（ｋＤａ）を左側に示す。（Ｃ）ストレプトアビジン－ＡＦ６４７を使用して検出した、ｈＲＢＣに対するＢ－ペプチドライゲーションのフローサイトメトリー解析（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３人のドナーからの３つの赤血球）。（Ｄ）ペプチド（ＰＥ－抗ビオチン抗体を使用して緑色に染色）とインキュベート又はライゲートしたｈＲＢＣの免疫蛍光画像。細胞膜（ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）ｄｅｅｐ ｒｅｄを使用して赤色に染色）上のペプチドの共局在を表す。（Ｅ）ライゲートしたｈＲＢＣ及び対照ｈＲＢＣにおける単位細胞面積当たりのＰＥ－抗ビオチンの平均蛍光。スチューデントのｔ検定^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図２は、二工程ライゲーション法を用いた、ヒト赤血球に対するナノボディのコンジュゲーションを示す図である。（Ａ）コンジュゲーションアプローチの概要。リンカーペプチドを使用してタンパク質のライゲーションを促進する。（Ｂ）ヒト赤血球に対してライゲートしたＥＧＦＲＶＨＨ上のＦＬＡＧタグのフローサイトメトリー解析（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３の独立した複製）。（Ｃ）ＥＧＦＲ ＶＨＨ（ＡＦ４８８－ＦＬＡＧタグ抗体を使用して緑色に染色）とインキュベート又はライゲートしたヒト赤血球（ｈＲＢＣ）の免疫蛍光画像。細胞膜（ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）ｄｅｅｐ ｒｅｄを使用して赤色に染色）との共局在の程度を示す。（Ｄ）単位ｈＲＢＣ面積当たりの平均ＡＦ４８８蛍光。スチューデントのｔ検定^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図３は、ストレプトアビジンリンカーを介した、大きなタンパク質のヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対するコンジュゲーションを示す図である。（Ａ）ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）表面上に大きなタンパク質をコンジュゲートするために用いる、ストレプトアビジンによるコンジュゲーションアプローチの概要。（Ｂ）ｈＲＢＣに対してコンジュゲートされたビオチン化抗ｈｉｓタグモノクローナル抗体（Ｂ－Ｈｉｓ－ｍＡｂ）のフローサイトメトリー解析。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。（Ｃ）Ｂ－Ｈｉｓ－ｍＡｂ（二次ロバ抗ウサギＡＦ４８８抗体を使用して緑色に染色）とインキュベート又はコンジュゲートしたヒト赤血球の免疫蛍光画像。細胞膜（ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）ｄｅｅｐ ｒｅｄを使用して赤色に染色）との共局在の程度を示す。（Ｄ）（Ｃ）に示されるヒト赤血球のｃｅｌｌ ｍａｓｋシグナルに由来する単位細胞面積当たりのＡＦ４８８シグナルの平均強度。（Ｅ）ＦＬＡＧタグ及びｈｉｓタグの両方を有するタンパク質をプルダウンするために使用したＢ－Ｈｉｓ－ｍＡｂコンジュゲート赤血球のＦＬＡＧタグ染色の平均蛍光強度。（Ｆ）３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）色素原とインキュベートし、続いてＨ＆Ｅ染色した後のビオチン化ＨＲＰ（Ｂ－ＨＲＰ）コンジュゲート赤血球及び未修飾赤血球の画像。特徴的な褐色沈殿物の形成によって西洋ワサビペルオキシダーゼの活性を可視化した。 （Ｇ～Ｈ）ｈＲＢＣに対するビオチン化ヒトインターロイキン８（ｈＩＬ－８）コンジュゲーションのフローサイトメトリー解析。一次マウス抗ｈＩＬ８抗体を使用してｈＲＢＣの表面のｈＩＬ－８を検出し、次にロバ抗マウスＡＦ６４７抗体を使用して一次抗体を検出した。（Ｉ）Ｌ－アスパラギナーゼコンジュゲートｈＲＢＣがＳｕｐ－Ｂ１５白血病細胞の生存率に及ぼす効果。１個のＲＢＣ：５個の白血病細胞（２０万個のＲＢＣ／ｍＬに相当する）の比で４日間共培養した後にＣＣＫ８アッセイを使用して評価した。５ＩＵ／ｍＬの濃度の精製ビオチン付加Ｌ－アスパラギナーゼを陽性対照として含める。Ｇ及びＨは、別々のドナー（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３として提示）からのｈＲＢＣで行った。スチューデントのｔ検定^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図４は、酵素によるライゲーションとクリックケミストリーとを介した、大分子のヒト赤血球に対する生体直交型の共有結合によるコンジュゲーションを示す図である。（Ａ）銅フリーのクリックケミストリーを用いた、赤血球表面における分子のコンジュゲーションの概要。（Ｂ）ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）にライゲートされたＤＢＣＯペプチドとのクリック反応によってのみ蛍光を発するアジド分子であるＣａｌＦｌｕｏｒ－６４７のフローサイトメトリー解析。（Ｃ）ＤＢＣＯ－ペプチドライゲートヒト赤血球上でクリック反応したビオチン化アジド－ペプチド（Ｂ－ＴＫ３－Ｎ３）又はアジド抗体（ＣＭＴＭ６－ｍＡｂ－Ｎ３）のフローサイトメトリー解析。ストレプトアビジン－ＡＦ６４７及びロバ抗マウス－ＡＦ６４７抗体を使用して検出した。（Ｄ）クリックケミストリーを用いアジド－モノクローナル抗体とコンジュゲートさせたｈＲＢＣの免疫蛍光画像。ヒト赤血球細胞膜は緑色（ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｇｒｅｅｎ）で示される。アジド抗体はロバ抗マウスＡＦ６４７抗体（赤色）を使用して検出した。（Ｅ）銅フリーのクリックケミストリーを用いた、モノクローナル抗体のヒト赤血球に対するコンジュゲーションの効率。ＡＦ６４７シグナルとＣｅｌｌＭａｓｋとの共局在の程度として表す。（Ｆ）コンビナトリアル酵素／クリックケミストリーアプローチを用いたｈＲＢＣに対するＧＦＰコンジュゲーションの、コンジュゲートさせたｈＲＢＣ及び対照ｈＲＢＣのフローサイトメトリー解析による評価。（Ｇ）Ｆのデータの代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。Ｂ、Ｅ及びＦは、別々のドナーからのｈＲＢＣで行った（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３として提示）。スチューデントのｔ検定^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図５は、ＯａＡＥＰ１リガーゼを使用したマウス赤血球（ｍＲＢＣ）の表面修飾を示す図。（Ａ）ストレプトアビジンＡＦ６４７を使用して検出された、ＯａＡＥＰ１リガーゼを使用してｍＲＢＣに対してコンジュゲートさせたビオチン化ペプチド（Ｂ－ペプチド／Ｂ－ＴＬ ５）のフローサイトメトリー解析。（Ｂ）ビオチン化ペプチドとインキュベート又はライゲートしたｍＲＢＣの免疫蛍光画像。ライゲートしたペプチドは緑色に染色された（ＰＥ－抗ビオチン抗体）。画像は細胞膜（ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）ｄｅｅｐ ｒｅｄを使用して赤色に染色）との共局在の程度を示す。（Ｃ）（Ｂ）に示すｍＲＢＣ膜に対してライゲートされたビオチン化ペプチドの単位細胞面積当たりの平均ＰＥ蛍光。（Ｄ）フローサイトメトリーを使用して評価されたライゲーション収率に対してペプチドライゲーションモチーフが及ぼす効果の比較。ｍＲＢＣをビオチン－（ＥＡＡＡＫ）_３－Ｘペプチドとライゲートした。Ｘは記載のＣ末端認識モチーフを表す。データは、３名の別々のドナーから得られた血液を使用した３つ生物学的反復から示される。（Ｅ）ビオチン－（ＥＡＡＡＫ）_ｎ－ＮＧＬのフローサイトメトリー解析を用いて評価した、ペプチド長がライゲーション収率に及ぼす効果。ｎはＥＡＡＫ反復の数を表す。グラフは、３つの生物学的反復からのデータを表す。スチューデントのｔ検定^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図６は、赤血球（ＲＢＣ）のコンジュゲーションが効率的で汎用性があることを示す図である。（Ａ）異なる時点でのＲＢＣ－Ｂ－ペプチドライゲーション（ヒト及びマウス）のフローサイトメトリー解析。反応を各時点でクエンチし、ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で染色して、赤血球表面上にライゲートしたビオチン化ペプチドの強度を検出した。（Ｂ）ビオチン化アジド－ペプチド（Ｂ－ＴＫ３－Ｎ３）のクリックケミストリーによるコンジュゲーションのフローサイトメトリー解析。アジド－ペプチド濃度及び反応時間がコンジュゲートペプチド（ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７を使用して検出）の収率に及ぼす効果を評価する。（Ｃ）官能基の配置を入れ替えて（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）クリックケミストリーを行う能力を検証するためのフローサイトメトリー。ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）をアジド－ペプチド（ＧＬ２９）とライゲートし、ＤＢＣＯ標識ＦＬＡＧタグ含有ペプチド（ＧＫ２５）とクリック反応させた（スチューデントｔ検定^＊＊＊Ｐ＜０．００１）。続いて、ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）を解析前に抗ＦＬＡＧタグ抗体で染色した。 図７は、コンジュゲートされた赤血球は生体適合性であり、インビボで安定であることを示す図である。（Ａ）未修飾マウスＲＢＣ又はビオチン化ペプチド（Ｂ－ＴＬ５）ライゲートマウスＲＢＣ及びヒトＲＢＣのアネキシンＶ染色のフローサイトメトリー解析。（Ｂ）２４時間にわたってＮＳＧ－Ｓマウスの循環血液中に残存し、ＣＦＳＥで染色された、未修飾のマウス赤血球（ｍＲＢＣ）又はＢ－ペプチド（Ｂ－ＴＬ５）とライゲートさせたマウス赤血球（ｍＲＢＣ）のパーセンテージ。ＣＦＳＥのフローサイトメトリー解析に基づいて決定した。（Ｃ）ＮＳＧ－Ｓマウスの循環血液における、ｍＲＢＣ表面上にライゲートされたビオチン化ペプチドの、２４時間の安定性。改変赤血球をストレプトアビジン－ＡＦ６４７染色した平均蛍光強度として表す。（Ｄ）ＰＢＳ、未修飾マウス赤血球（ｍＲＢＣ）又はＢ－ペプチドライゲートＣＦＳＥ標識マウス赤血球ｍＲＢＣを注射したマウスから投与の２４時間後に採取した血液塗抹標本の代表的な画像。（Ｅ）ビオチン化ペプチドライゲートマウス赤血球（ｍＲＢＣ）及び未修飾マウス赤血球（ｍＲＢＣ）を体外から投与したマウス赤血球（ｍＲＢＣ）の、投与の２４時間後にマウスから採取した血液塗抹標本による単位細胞面積当たりの平均ストレプトアビジンＡＦ６４７蛍光。 図８は次の内容を示す図である。（Ａ）改変ｍＲＢＣのインビボ安定性及び半減期を決定するために行った実験の概要。（Ｂ）ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス又はＣ５７ＢＬ／６マウスの循環血液中に２４時間にわたって残存する、未修飾のｍＲＢＣ又はＢ－ペプチド（Ｂ－ＴＬ５）とライゲートされたｍＲＢＣの、ＣＦＳＥ染色のパーセンテージ。ＣＦＳＥのフローサイトメトリー解析に基づいて決定した。（Ｃ）ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス又はＣ５７ＢＬ／６マウスの循環血液における、ｍＲＢＣ表面上にライゲートされたビオチン化ペプチドの２４時間にわたる安定性。改変ｍＲＢＣをストレプトアビジン－ＡＦ６４７染色した平均蛍光強度として表す。 図９は次の内容を示す図である。（Ａ）ペプチドライゲートモチーフがライゲート収率に及ぼす影響のフローサイトメトリーによる評価及び比較。ｈＲＢＣをビオチン－（ＥＡＡＡＫ）３－Ｘペプチドとライゲートした。Ｘは記載のＣ末端認識モチーフを表す。データは、３人の別々のドナーから得られた血液を使用した３つの生物学的反復から示される。（Ｂ）ペプチド長がライゲート収率に及ぼす影響のビオチン－（ＥＡＡＡＫ）ｎ－ＮＧＬのフローサイトメトリー解析による評価。ｎはＥＡＡＫ反復の数を表す。グラフは、３つの生物学的反復からのデータを表す。スチューデントのｔ検定^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図１０は次の内容を示す図である。（Ａ）ＧＮ２０ペプチド、Ｂ－ＧＮ２０（Ｎ末端でのライゲーションを防止するビオチン化されたＧＮ２０）、及びＴＬ２０（同様の長さのスクランブルペプチド）を有するｈＲＢＣ又は有さないｈＲＢＣに対するＥＧＦＲ ＶＨＨライゲーションの相対効率を示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。各リンカーペプチドの配列を右側に示す。（Ｂ）Ａの各条件についての、ＶＨＨライゲートｈＲＢＣのパーセンテージ及びｈＲＢＣのＦＬＡＧタグシグナルの平均蛍光強度（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３の独立した反復）。（Ｃ）さまざまな組み合わせのＮ末端モチーフ及びＣ末端モチーフを有する異なるリンカーペプチドが二工程ライゲーションを促進する能力の評価。データは、フローサイトメトリー解析後のｈＲＢＣ集団におけるＦＬＡＧタグシグナルの平均蛍光強度として表す。各ペプチドのペプチド配列をグラフの左側に示す。ＡＰＣとコンジュゲートした抗ＦＬＡＧタグ化モノクローナル抗体を使用して、ＦＬＡＧタグ付加ＶＨＨの存在を検出した。スチューデントのｔ検定^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図１１は次の内容を示す図である。（Ａ）ｈＲＢＣに対するタンパク質の効率的なコンジュゲーションのために利用するコンジュゲーションアプローチの概要。リンカーペプチドを使用してタンパク質のライゲーションを促進する、又は脱グリコシル化をタンパク質の直接ライゲーションの前に行う。（Ｂ）未修飾ｈＲＢＣに対してＥＧＦＲ ＶＨＨを直接ライゲートした後、又はグリコシダーゼのカクテルによる処理（脱グリコシル化）後のＦＬＡＧタグシグナルについての、ｈＲＢＣのフローサイトメトリー解析。各条件に使用した具体的なグリコシダーゼを示す。ＰＮＧａｓｅ Ｆ及びＥｎｄｏ ＨはＮ－グリカンを切断し、Ｏ－グリコシダーゼはＯ－グリカンを除去し、一方、エキソグリコシダーゼは、個々の単糖（マンノシダーゼ、ノイラミニダーゼ及びβ－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼ_ｆ）を除去する。（Ｃ）異なる順序での選択された一連のライゲーション工程／脱グリコシル化工程後のｈＲＢＣの、ｈＲＢＣに対するＥＧＦＲ ＶＨＨライゲーションのフローサイトメトリー解析。（Ｄ）直接ライゲーション又はリンカーペプチドのいずれかを使用してＶＨＨ ＥＧＦＲとコンジュゲートさせたｈＲＢＣを使用したＥＧＦＲ陽性４Ｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞のプルダウン。ＥＧＦＲを探索するウェスタンブロットを用い４Ｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ－ｈＥＧＦＲ細胞のプルダウン効率を検出し、かつＨＢＡをＲＢＣの内部対照として使用した。（Ｅ）プルダウンライセート中のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を定量することによって測定した、ＶＨＨ ＥＧＦＲライゲートＲＢＣ又は対照ＲＢＣを介した４Ｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞の相対的プルダウン効率。Ｇ及びＨでは、ＡＰＣとコンジュゲートさせた抗ＦＬＡＧタグ化モノクローナル抗体を使用して、ＦＬＡＧタグ付加ＶＨＨの存在を検出した。スチューデントのｔ検定^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図１２は、ヒトＲＢＣ由来のビオチン化ペプチドライゲートＲＢＣＥＶに対して実施した、ＯａＡＥＰ１リガーゼによりライゲートしたＲＢＣＥＶ上の候補タンパク質の同定のための、ＬＦＱ－質量分析と併用したビオチンプルダウン実験を示す図である。丸５、丸７、丸８、丸１１、丸１３及び丸２７は、ＲＢＣＥＶにおいてビオチン化ペプチドと関連付けられた２５～５０ｋＤａのタンパク質である。 図１３は、相対存在度及び推定コピー数を評価する既存のＲＢＣ膜プロテオーム研究による、ＲＢＣＥＶからの候補タンパク質の相互比較を示す図である。 図１４は、異なる酵素（ＯａＡＥＰ１ Ｃｙｓ２４７Ａｌａ又はソルターゼＡ ｈｅｐｔａｍｕｔａｎｔ）を使用したライゲーション効率の比較を示す図である。同一のＥＫ１５配列（ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ）を有し、Ｃ末端モチーフのみが異なる（いずれも本研究において最適化されている（ＯａＡＥＰ１では－ＮＰＬ））か、又は各酵素と適合性であることが既報である（ソルターゼＡではＬＰＥＴＧＧＧ、ＯａＡＥＰ１では－ＮＧＬ）、さまざまなビオチン化ペプチドをｈＲＢＣに対してライゲートし、フローサイトメトリーを用いライゲーション効率を評価した。配列及び長さの異なる短いペプチドを陽性対照として含める。Ｃｔｒｌ ｈＲＢＣは、任意のペプチドの非存在下で酵素と単純にインキュベートしたｈＲＢＣを示す。

より人工的でかつ許容され得るリポソーム及びＤＮＡポリプレックスなどの薬物送達系と比べて長年冷遇されてきたが、近年になって、改変赤血球（ＲＢＣ）及び細胞外小胞（ＥＶ）などの同種細胞療法が、有望な薬物担体として脚光を浴びている（Chatin et al., 2015; Durymanov & Reineke, 2018）。赤血球中への治療薬の封入は臨床試験において急速な進展が見られているが、赤血球の原形質膜には選択透過性があることから、適用は限定されている。

解決策には、治療用分子を赤血球表面上に固定した表面機能化赤血球の使用があるが、表面改変赤血球を作成する既存の方法では、生体適合性、効率及びスケーラビリティの間のバランスを成立させることが困難である。現在使用されているほとんどの表面修飾方法は、造血前駆細胞に対する過酷な化学処理又は遺伝子修飾のいずれかの処理と、その後のインビトロでの分化とを含み、非常に費用及び時間のかかるプロセスである。第１の例では、より生体適合性の高い化学的修飾方法であっても、赤血球表面タンパク質が例えば崩壊促進因子によって損なわれて、最終的には補体による溶解に至ることにより、インビボ半減期が減少することが示されている。酵素によるアプローチも、Shi et al.（Shi et al, 2014）によって開示されている。このアプローチでは、ソルターゼＡの認識モチーフを発現するよう遺伝子操作した赤血球表面上に、ソルターゼＡによりペプチドをライゲートする。この手法により、遺伝子操作した赤血球表面上への生体適合性のペプチドライゲーションが可能となり、赤血球を改変するプラットフォームの開発につながった。しかしながら、遺伝子操作法は、幹細胞の培養及び分化という手間と費用のかかる手順を必要とする。更に最近では、成熟赤血球は、ソルターゼＡを使用してペプチドと直接コンジュゲートされ得ることが見出された（Pishesha et al, 2017）。しかしながら、成熟赤血球とタンパク質との共有結合によるコンジュゲーションは、まだ実証されていない。他には、親和性ベースでの赤血球結合分子及び脂質挿入という形態で当該分野への貢献があった。しかしながら、これらは全て、これらの方法に特徴的な、一過性であるという性質を有している（Villa et al, 2016; Villa et al, 2017）。

本開示は、生体適合性酵素法、部位特異的表面機能化赤血球について記載しており、該赤血球は、任意の事前の化学修飾又は遺伝子改変を経由せずに、安定的にコンジュゲートされたペプチド／タンパク質（例えば、限定されないが、モノクローナル抗体、シングルドメイン抗体、酵素、機能性タンパク質など）の細胞当たりの高コピー数を維持する。得られる改変赤血球は、コンジュゲートされたタンパク質の機能を維持し、コンジュゲーション後に毒性の徴候を示さない。この酵素アプローチは、他の方法、例えば、限定されないが、生体直交型クリックケミストリー及びストレプトアビジンによるコンジュゲーションと組み合わせることによって更に拡張され、改変赤血球の汎用性及び機能性を更に高める。これらの改変赤血球は、遺伝子操作した赤血球及び化学修飾した赤血球に対して、よりスケーラブルな方法を提供する。次いで、これらの修飾赤血球は、酵素補充療法、細胞ベースの免疫療法並びに予防的及び治癒的な他の治療を含むがこれらに限定されない、さまざまな疾患のための前臨床開発に応用される。

一態様では、脱核後の赤血球を表面修飾する方法であって、天然の赤血球を曝露することと、エフェクター分子を赤血球にコンジュゲートして赤血球を修飾することと、を含む方法が開示される。一例では、赤血球は天然の赤血球である。別の例では、（天然の）赤血球はヒトから得られる。更に別の例では、赤血球は、遺伝子操作又は遺伝子改変をなされていない。遺伝子改変された赤血球は天然の赤血球とは異なり、当業者であればこれら２つを区別し得ることが理解される。

一態様では、本明細書に開示される方法は、シングルドメイン抗体（ｓｄＡＢ）を含むがこれに限定されない、少なくとも１００個のアミノ酸を含有するタンパク質を用い天然の赤血球を生成／修飾するために使用される。別の例では、天然の赤血球は、本明細書に記載されるように、細胞表面上で酵素により修飾される。別の例では、エフェクター分子は、２０個以上のアミノ酸を含むペプチドである。一例では、リンカーはペプチドである。別の例では、本明細書に記載されるリンカーは、ソルターゼ反応に適した一端と、タンパク質リガーゼ反応に適した他端とを有する。

本明細書には、生体適合性、効率、安定性、速度及びスケーラビリティの間のバランスを成立させるアプローチを使用して生成される、表面修飾された赤血球が提示される。これらの表面改変赤血球は、限定するものではないが主にタンパク質リガーゼ（例えば、限定されないが、ブテラーゼ－１、ＯａＡＥＰ１、それらの多様体及び変異体）を使用して修飾され、そのため、プロセスからの悪影響を受けない。ライゲーションが、タンパク質、ペプチド、モノクローナル抗体又は他の官能基を高いコピー数でＲＢＣ膜上に安定に組み込むことを可能にする。また、本明細書では、このワークフロー全体を通して確立された生体適合性プロファイルを維持しながら、このアプローチの汎用性を拡張し、さまざまな治療用タンパク質を赤血球表面上にコンジュゲートするための、二工程ライゲーション、生体直交型の銅フリーのクリックケミストリー、及びストレプトアビジンを介したビオチン化分子のコンジュゲーションが開示される。特に、銅フリーのクリックケミストリーと併せて酵素によるライゲーションを利用するコンビナトリアルアプローチは、目的とする任意のアジドタグ付加分子の、赤血球表面上への完全に生体適合性で共有結合による部位特異的コンジュゲーションを、高いコピー数でもたらす。一例では、本明細書に開示される赤血球には、リンカーによってエフェクター分子が付着する。別の例では、赤血球にリンカーが付着した後、リンカーにエフェクター分子が結合する。

これらの表面機能化赤血球を生成するために本明細書で使用される手順は、迅速であり（目的とする分子に応じて３～５時間以内に完了することができる）、容易に拡張可能であり（血液は血液バンク／患者から容易に得ることができ、他の試薬は社内で容易に製造することができる）、目的とする分子を一貫して高いコピー数でもたらす。コンジュゲートされた分子は安定であり、インビトロ及びインビボのいずれでも赤血球表面上でそのままの状態及び機能を保持する。したがって、このプラットフォームは、限定するものではないが、酵素欠損症（例えば、赤血球表面への酵素の固定を介して半減期を延長させ、頻繁な投薬の必要性を減少させる）、免疫関連障害（例えば、人工赤血球ベースのＡＰＣを介した抗原の提示）、代謝疾患（例えば、家族性高コレステロール血症、ゴーシェ病、Ｈｕｎｔｅｒ症候群、クラッベ病、メープルシロップ尿症、異染性白質ジストロフィー、ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス、脳卒中様エピソード（ＭＥＬＡＳ）、ニーマン・ピック病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポルフィリン症、テイ・サックス病、及びウィルソン病）、血液疾患（例えば、慢性疾患の貧血、再生不良性貧血、赤血球増多症、ヘモクロマトーシス、凝固亢進障害、免疫性血小板減少性紫斑病、鉄欠乏性貧血、白血球増加症、白血球減少症、真性赤血球増加症、鎌状赤血球貧血、及び血栓性血小板減少性紫斑病）、並びにがん（例えば、赤血球表面でのアスパラギナーゼなどの酵素を介した腫瘍飢餓（ｔｕｍｏｕｒ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）などの、さまざまな疾患の治療のための代替手段を提供する。

一態様では、天然の赤血球がビオチン化ペプチドに対してコンジュゲートされる。別の例では、赤血球はＢ－ＴＬ５に対してコンジュゲートされる。別の例では、赤血球はリンカーに対してコンジュゲートされ、リンカーはラクダ科動物由来のシングルドメイン抗体（約１５～３０ｋＤａ）に対してコンジュゲートされる。別の例では、赤血球はリンカーにコンジュゲートされ、リンカーは抗ＥＧＦＲ単一ドメイン抗体に対してコンジュゲートされる。更に別の例では、赤血球は、ビオチン化抗ｈｉｓタグモノクローナル抗体コンジュゲートヒト赤血球である。別の例では、赤血球は、ＤＢＣＯタグ付加ペプチド（ＥＫ１８）とコンジュゲートされる。

赤血球は、さまざまな抗体及び／又はタンパク質を高いコピー数で安定的にコンジュゲートされ、コンジュゲーション後に機能を維持することができる。

大きなタンパク質分子を高いコピー数でもたらす安定な表面修飾の既存の方法は、赤血球／前駆細胞の化学的操作又は遺伝子操作のいずれかを採用するものであり、赤血球の半減期及び機能のいずれにも有害であるか、又は費用及び時間がかかる前駆細胞の操作を伴う。本願は、以前は大がかりな遺伝子操作／化学的操作後にのみ利用可能であった汎用性及び高いコピー数を、酵素による方法で得ることができるようにした最初の例である。クリックケミストリー及び／又はストレプトアビジンを使用するこのアプローチの拡張は、表面機能化赤血球の機能性を高めるのに更に役立つ。特に、酵素によるライゲーションと組み合わせた銅フリーのクリックケミストリーは、検出され得る有害作用若しくは免疫原性作用、又はインビボ半減期の減少、を全く伴わずに、赤血球表面に対する高いコピー数でのタンパク質の部位特異的、生体直交型で、共有結合によるコンジュゲーションを可能にする。

表面改変赤血球は赤血球としての機能が損なわれず、かつ改変赤血球を生成するプロセスは、酵素によるタンパク質ライゲーション、生体直交型のクリックケミストリー及び強い親和性相互作用などの、生体適合性の方法を用いる。

本願の方法は表面機能化のための高度に生体適合性の方法を利用し、処理段階中の赤血球に対する損傷又は有害な処理による一切のリスクを回避する。本願は、更なる処理のために赤血球膜上に官能基を導入する又は完全なタンパク質上に官能基を導入するのに化学修飾を利用する必要がある他の方法を上回る利点を提供する。既存のデータは、赤血球の直接的な化学的ビオチン化などの化学修飾方法が、赤血球上の崩壊促進因子（ＤＡＦ）を損なう可能性があり、補体による溶解につながり得ることを示している。

コンジュゲート部分は、未修飾の赤血球の場合と同様に、長期間にわたってインビボで赤血球の表面上で安定である。

これらの改変赤血球は、未修飾の赤血球と同様のインビボ半減期を示すだけでなく、これらの改変赤血球はまた、コンジュゲート部分をインビボで維持して分解からある程度保護する。更に、コンジュゲーションの共有結合による性質及び安定な性質は、時間が経ってもコンジュゲート部分が赤血球表面から脱落しないことを意味する。脱落しないことは、時間が経つとコンジュゲート分子がＲＢＣから分離する傾向がある、ペプチド／抗体介在性の親和性ベースのコンジュゲーション方法と比較して有利である。

この方法は、効率及び生体適合性を維持する赤血球表面修飾のための任意の既存の方法よりも安価、迅速かつ単純である。更に、スケールアップが容易である。血液は治療の数時間前にドナーから得ることができ、３～５時間以内に洗浄して、表面が十分に機能化された赤血球を得ることができる。これらの赤血球は、輸血と同様の方法で患者に安全に投与して戻すことができる。毒性であり得る化学物質及び／又は遺伝的修飾が存在しないことで、本願方法はより容易に臨床に転用可能となる。

赤血球はヒトから得る必要がある。赤血球は、意図されたレシピエントに由来していてもよいし、適合性のある供血者（Ｏ型供血者が好ましい）である任意の他の個体由来であってもよい。

先行技術において開示される方法では、特にナノボディなどのより大きなタンパク質分子の効率的なソルタギング（ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ）（ソルターゼによる表面修飾を意味する）のために、遺伝子操作された赤血球を使用する必要がある。本願に開示された方法ではそのような赤血球を使用する必要はない。当該技術分野に開示されている方法はまた、未修飾細胞に対するペプチドの酵素コンジュゲーションのみを含み、この方法は以前にはソルターゼを用いて実証されていた。したがって、一例では、本明細書に開示される方法は、ソルターゼを使用せずに表面修飾赤血球を生成する。別の例では、ソルターゼは、コンジュゲーション目的では使用されない。

しかしながら、先行技術は、酵素による方法を、例えば、酵素などのより大きな機能性分子のコンジュゲーションに採用していない。先行技術に開示されているいくつかの方法は、化学的方法を使用した赤血球の直接ビオチン化を開示しており、それらの方法は、特に長期インビボ研究において、赤血球に悪効果を及ぼすことが示されている。

現在の酵素補充療法は、不足している酵素を補充するために頻繁に精製酵素を投与することによる。これらの酵素は非常に短い半減期を有しており、速やかに循環血から失われる。しかしながら、本コンジュゲーション方法は、成熟赤血球の半減期（３０日～９０日）と同等の半減期を提供し、この半減期は既存の方法よりも著しく長い。

抗体／デコイ受容体でコーティングされた赤血球を使用する予防／中和療法は、抗原／ウイルス／毒素に結合し、中和することができる。しかしながら、かかる療法は有効性が低く、コストが高いため、臨床試験段階には至っていない。本方法は、この制限を克服する。

免疫系を活性化するための細胞ベース療法の使用もまた、本出願の範囲において企図される。かかる戦略の１つは、赤血球を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用することを含む。このプラットフォームを使用して、抗原分子を共刺激分子と併せて提示して、免疫系の抗原認識部位（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｒｍｓ）を活性化することができる。

本明細書に開示される方法に基づき、赤血球は、例えば、さまざまな抗体及び／又はタンパク質と高いコピー数で安定的にコンジュゲートし、かつコンジュゲーション後に機能を維持することができる。クリックケミストリー及び／又はストレプトアビジンを使用するこのアプローチの拡張は、表面機能化赤血球の機能性を高めるのに更に役立つ。酵素によるライゲーションと組み合わせた銅フリーのクリックケミストリーは、検出され得る有害作用若しくは免疫原性作用、又はインビボ半減期の減少、をほとんど～全く伴わずに、赤血球表面に対する高いコピー数でのタンパク質の部位特異的、生体直交型で、共有結合によるコンジュゲーションを可能にする。

表面改変赤血球は、生体適合性の方法、例えば、酵素タンパク質ライゲーション、生体直交型のクリックケミストリー、及び表面機能化のための強い親和性相互作用を利用し、処理段階中の赤血球に対する、損傷又は有害な処理による一切のリスクを回避する。

酵素補充療法：現在の酵素補充療法は、不足している酵素を補充するために頻繁に精製酵素を投与することによる。精製酵素は非常に短い半減期を有しており、速やかに循環血から失われる。それらはまた、しばしば半減期を延長させる分子（例えば、ＰＥＧ）とコンジュゲートされる。しかしながら、そのようなコンジュゲートは薬物のインビボ半減期を僅かに延長するだけである。代わりに赤血球へのコンジュゲーションは、成熟赤血球の半減期（３０日～９０日）と同等の半減期を提供し、この半減期は既存の方法よりも著しく長い。酵素補充療法の臨床試験では多くの赤血球ベースの療法が存在するが、それらの全ては、赤血球の内部に酵素を封入することを含む。この手法の適用は、酵素基質が（赤血球膜の既存の内因性輸送体を介して）赤血球に自然に入ることができる酵素に限られる。本開示に記載される改変赤血球は、そのような制限を有さず、赤血球ベースの酵素補充療法の範囲を広げる。酵素補充療法において有用であることが知られている酵素としては、アスパラギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ及びウリカーゼが挙げられる。

予防／中和療法：抗体／ウイルス／毒素に結合し、中和することができる、抗体／デコイ受容体でコーティングされた赤血球。複数のグループが本願の概念について証拠を提出しているが、いずれも臨床試験には到達しておらず、そのほとんどは有効性の低さ及び高コストによる制限がある。本開示で提示される単純かつ効率的なアプローチは、これらの制限のいくつかを克服することができる。

免疫調節：多くのグループが、免疫系を活性化するための細胞ベース療法の使用を調査している。かかる戦略の１つは、赤血球を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用することを含む。このプラットフォームを使用して、抗原分子を共刺激分子と併せて提示して、免疫系の抗原認識部位を活性化することができる。本明細書に開示される方法は、赤血球を含む。本方法は、単個の赤血球又は複数の赤血球を用意する工程を含み得る。本方法は、全血のサンプルを用意することと、全血から赤血球のサンプルを調製することと、を含み得る。

好ましくは、ＲＢＣは、ヒト若しくは動物の血液サンプルに由来するか、又は初代細胞若しくは不死化赤血球細胞株に由来する赤血球である。血液細胞は、治療を受ける患者と型が一致していてもよく、したがって、血液細胞は、Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型、Ｏ型、又はＯｈ型であってもよい。好ましくは、血液はＯ型である。血液は、Ｒｈ陽性又はＲｈ陰性であり得る。場合によっては、血液は、Ｏ型及び／又はＲｈ陰性、例えばＯ－型である。血液は、疾患又は障害がないこと、例えば、ＨＩＶ、鎌状赤血球貧血、マラリアがないことが確認されていてよい。しかしながら、任意の血液型を使用してもよい。場合によっては、ＲＢＣは自己由来であり、治療を受ける患者から得られた血液サンプルに由来する。場合によっては、ＲＢＣは同種異系であり、治療を受ける患者から得られた血液サンプルに由来しない。

サンプルは全血サンプルであってもよい。好ましくは、サンプルの細胞成分が赤血球であるように、赤血球以外の細胞がサンプルから除去されている。

サンプル中の赤血球は濃縮されていてもよく、又は全血サンプルの他の成分、例えば白血球）から分けられていてもよい。赤血球は遠心分離によって濃縮され得る。サンプルは、白血球除去フィルターなどによる白血球の低減に供され得る。サンプルは、ＰＢＳ洗浄などの洗浄などによって、血漿及び血小板を除去するように処理されてもよい。

赤血球は、低速遠心分離によって、かつ白血球除去フィルターを使用して、白血球及び血漿を含有する全血サンプルから分離することができる。場合によっては、赤血球サンプルは、他の細胞型、例えば白血球を含有しない。換言すれば、赤血球サンプルは実質的に赤血球から構成される。

得られたＲＢＣは、更なる処理、例えば、洗浄、タグ付加、及び任意選択的にローディングなどに供され得る。

特に、ＲＢＣは脱グリコシル化されてもよい。

本明細書に開示される方法は、修飾赤血球の産生をもたらす。かかる赤血球は、外表面上に修飾を受けている。このような赤血球は、表面修飾赤血球、表面機能化赤血球又は修飾赤血球と呼ばれ得る。これらの用語は、本明細書において互換的に使用される。

本明細書に開示される方法は、エフェクター分子のＲＢＣに対するコンジュゲーションに関する。「コンジュゲーション」という用語は、エフェクター分子のＲＢＣに対する結合を指す。コンジュゲーションは、直接的（すなわち、リンカーなしでエフェクター分子がＲＢＣに結合する）又は間接的（すなわち、リンカーによってエフェクター分子がＲＢＣに結合する）であり得る。コンジュゲーションは、共有結合の形成をもたらし得る。コンジュゲーションは、リガーゼによって触媒される、酵素によるライゲーションなどのライゲーションであってもよい。コンジュゲーションは、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用であってもよい。コンジュゲーションは、クリックケミストリーから生じてもよい。

本明細書で使用される場合、「クリックケミストリー」という用語は、化学合成における概念を指す。「クリック」ケミストリーは、バイオコンジュゲーションにおいて一般的に使用され、選択された基質と特定の生体分子とを結合させる、生体適合性の小分子反応の一種を指す。クリックケミストリーは単一の特異的反応ではなく、自然界に見られるように産物を生成し、かつ小さなモジュール単位を結合させることによって物質を生成する方法であると理解されている。クリック反応の使用例としては、生体分子とレポーター分子との結合が挙げられるが、これに限定されない。クリックケミストリーは、生物学的条件に限定されず、「クリック」反応の概念は、薬理学的用途及びさまざまなバイオミメティクス用途において使用されている。しかしながら、クリックケミストリーは、特に生体分子の検出、局在化及び定量化において役立っている。本明細書に開示される方法は、一般に銅フリーのクリックケミストリーと呼ばれる生体適合性のクリックケミストリーを使用する。

クリック反応は、典型的にはワンポットで生じ、水によって妨害されず、最小限かつ無害な副産物を生成し、熱力学的駆動力が高く、高い反応特異性（場合によっては、位置特異性及び立体特異性の両方を有する）で反応を迅速かつ不可逆的に、高収率で単一反応産物へと駆動する。これらの性質は、クリック反応を、複雑な生体環境下で分子を分離及び標的化する際の課題に特に適したものにする。したがって、そのような環境下では、反応産物は生理学的に安定である必要があり、任意の副産物は非毒性である必要がある（例えば、インビボ系での使用のために）。

本明細書に開示される方法に有用なクリックケミストリーの方法は、ＳＰＡＡＣ（ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ ａｌｋｙｎｅ－ａｚｉｄｅ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）及び逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ（ＩＥＤＤＡ）である。ＳＰＡＣＣは、相補的なクリックケミストリー官能基ジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）及びアジドを含み得る。ＩＥＤＤＡは、相補的なクリックケミストリー官能基トランスシクロオクチン（ＴＣＯ）及びテトラジン又はメチルテトラジンを含み得る。

特異的かつ制御可能な生体直交型反応（すなわち、天然の生化学プロセスに干渉せずに生体系の内部で生じ得る任意の化学反応）を開発することによって、例えば、標的を認識し、その標識にクリック反応により結合する小分子プローブを使用することで、クリックケミストリーは生細胞での使用に適合したものとなった。要するに、クリックケミストリーは、高収率であり、対象が広く、クロマトグラフィーを行わずとも除去することができる副産物のみを生成し、立体特異的であり、実施するのが簡単であり、容易に除去可能な溶媒又は低負荷溶媒（ｂｅｎｉｇｎ ｓｏｌｖｅｎｔｓ）中で行うことができる反応について記載する。

本明細書に記載される方法は、リガーゼの存在下で、赤血球をリンカー分子又はエフェクター分子と接触させることを含む。「接触させる」とは、成分にコンジュゲーションさせるのに十分近くに各成分を近接させることを意味する。「接触させる」及び「インキュベートする」という用語は、互換的に使用される。接触は、室温、例えば約２０℃で行うことができる。接触は、好ましくはリガーゼの存在下で行われる。接触を行う温度は、リガーゼの任意の機能のための温度に従って最適化することもできる。好ましくは、リガーゼはＯａＡＥＰ１リガーゼであり、温度は約２５℃である。接触は、リガーゼにコンジュゲーションを触媒させるための期間などの、コンジュゲーションを生じさせるのに適した期間にわたって行われ得る。適切な期間は当業者であれば容易に認識可能であり、１日、１日未満、１２時間、又は１２時間未満、例えば、約１２時間、約１１時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間の接触を含み得る。多くの場合、適切な時間は約３時間である。

リンカー又はエフェクター分子を赤血球にコンジュゲートする工程は、ＲＢＣ－リンカー又はＲＢＣ－エフェクターコンジュゲートの形成をもたらす。ＲＢＣ－リンカーコンジュゲート又はＲＢＣ－エフェクター分子コンジュゲートの形成後、例えば接触工程の後、洗浄工程が存在してもよい。換言すれば、ＲＢＣ－リンカーコンジュゲート又はＲＢＣ－エフェクター分子コンジュゲートを洗浄することができる。洗浄は、ＲＢＣに対してコンジュゲートされていないエフェクター分子又はリンカーなどの、コンジュゲートされていない混合物成分を除去することができる。洗浄は、リガーゼ又はストレプトアビジンを除去することができる。適切な洗浄方法は当業者であれば認識可能であり、緩衝液中での洗浄、例えばＰＢＳ中での洗浄を含み得る。本方法は、ＲＢＣ－リンカーコンジュゲート又はＲＢＣ－エフェクター分子コンジュゲートが、コンジュゲートされていないリンカー又はエフェクター分子又はリガーゼを実質的に含まないように、１回、２回、３回、４回以上の洗浄、又は任意の回数の洗浄を含み得る。

第１の接触工程がＲＢＣのリンカーに対するコンジュゲーションを含む場合、更なる接触工程を使用してもよい。そのような工程は、ＲＢＣ－リンカーコンジュゲートをエフェクター分子と接触させることを含む。接触は、室温、例えば約２０℃で行うことができる。接触は、リガーゼの存在下で行われ得る。そのような場合、接触を行う温度は、リガーゼの任意の機能のための温度に従って最適化することもできる。接触を行う温度は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用のために最適化することもできる。接触を行う温度は、クリックケミストリーのために最適化することもできる。接触は、コンジュゲーションが起こるのに適した期間にわたって行われ得る。適切な期間は当業者であれば容易に認識可能であり、１日、１日未満、１２時間、又は１２時間未満、例えば、約１２時間、約１１時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間の接触を含み得る。多くの場合、適切な時間は約３時間である。

リンカー又はエフェクター分子を赤血球に対してコンジュゲートする工程は、ＲＢＣ－リンカー－エフェクター分子コンジュゲートの形成をもたらす。ＲＢＣ－リンカー－エフェクター分子コンジュゲートの形成後、例えば接触工程後に、洗浄工程が存在してもよい。換言すれば、ＲＢＣ－リンカー－エフェクター分子コンジュゲートを洗浄してもよい。洗浄は、ＲＢＣに対してコンジュゲートされていないエフェクター分子などの、コンジュゲートされていない混合物成分を除去することができる。洗浄は、リガーゼを除去することもできる。適切な洗浄方法は当業者であれば認識可能であり、緩衝液中での洗浄、例えばＰＢＳ中での洗浄を含み得る。本方法は、ＲＢＣ－リンカー－エフェクター分子コンジュゲートが、コンジュゲートされていないエフェクター分子及び／又はリガーゼを実質的に含まないように、１回、２回、３回、４回以上の洗浄、又は任意の回数の洗浄を含み得る。

本明細書に開示されるいくつかの方法は、脱グリコシル化赤血球に対するコンジュゲーションを含む。赤血球は、リンカー及び／若しくはエフェクター分子に対するコンジュゲーションの前に、又はリンカーに対するコンジュゲーションの後に、又はリンカーのエフェクター分子に対するコンジュゲーションの後に脱グリコシル化され得る。好ましくは、赤血球は、リンカー／エフェクター分子のコンジュゲーションの前に脱グリコシル化される。換言すれば、任意のコンジュゲーション工程の前に、赤血球は脱グリコシル化を受けていてもよい。場合によっては、赤血球は、コンジュゲーション方法の前に脱グリコシル化される。すなわち、最初の又は唯一の接触工程に供された赤血球は脱グリコシル化されている。いくつかの方法では、本方法の第１の工程は、赤血球を脱グリコシル化することである。赤血球を脱グリコシル化する方法は当該技術分野において公知であり、赤血球をＰＮＧａｓｅＦ、ＥｎｄｏＨ、Ｏ－グリコシダーゼ又はエキソグリコシダーゼ（マンノシダーゼ、ノイラミニダーゼ及び／又はβ－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼ）と接触させることなどによる酵素による脱グリコシル化が含まれる。いくつかの方法では、赤血球は、Ｏ－グリコシダーゼとエキソグリコシダーゼとの組み合わせで脱グリコシル化される。

本明細書に開示されるいくつかの方法では、赤血球は、Ｎ末端ビオチン部分を含むリンカーに対してコンジュゲートされる。そのような方法は、ビオチン化エフェクター分子を赤血球に対してコンジュゲートさせて赤血球－リンカー－エフェクター分子コンジュゲートを形成するのに有用であり得る。そのような実施形態では、リンカー及びエフェクター分子の両方がビオチン部分を含み得る。そのような方法では、赤血球－リンカーコンジュゲートをビオチンコンジュゲートエフェクター分子と接触させる前に、赤血球－リンカーコンジュゲートをストレプトアビジンなどのビオチン結合分子と接触させる更なる工程を含む必要がある。

本明細書で使用される場合、「エフェクター分子」という用語は、特定の予測可能な効果を有することによって、その効果が、本明細書に開示される方法及び修飾赤血球を扱う者の裁量で選択され得る、分子又は活性物質を指す。例えば、がんを治療することが意図される場合、赤血球に対してコンジュゲートさせるエフェクター分子は、前出のがんに対する抗体、又はがん特異的受容体若しくはがん細胞に結合するタンパク質であり得る。エフェクター分子の例としては、タンパク質、酵素、細胞表面マーカー、モノクローナル抗体などの抗体、サイトカイン、ケモカイン、抗体断片、ナノボディ、治療剤、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。別の例では、本明細書に開示されるエフェクター分子は、機能性ペプチド、例えば、限定されないが、蛍光タンパク質、タグ付加タンパク質及び親和性結合のためのタンパク質などを付加することによって更に修飾することができる。

「抗体」には、その断片若しくは誘導体、又は合成抗体若しくは合成抗体断片が含まれる。モノクローナル抗体技術に関する今日の技術を考慮すると、抗体はほとんどの抗原に対して作製することができる。

選択された抗原に対する適切なモノクローナル抗体を、公知の技術、例えば、Monoclonal Antibodies: A manual of techniques, H Zola (CRC Press, 1988)及びMonoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, J G R Hurrell (CRC Press, 1982)に開示される技術によって作製することもできる。キメラ抗体は、Neuberger et al (1988), 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799)によって考察されている。

Ｆａｂ断片及びＦａｂ２断片などの断片は、遺伝子操作された抗体及び抗体断片と同様に使用することができる。抗体の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインが抗原認識に関与していることは、初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識された。更なる確認は、げっ歯類抗体の「ヒト化」によってなされた。げっ歯類の可変ドメインは、得られる抗体がげっ歯類親抗体の抗原特異性を保持するように、ヒトの定常ドメインに融合させることもできる（Morrison et al (1984)Proc. Natl. Acad. Sd. USA 81, 6851-6855）。本明細書に開示される表面機能化赤血球において有用な抗体又は抗原結合断片は、標的分子を認識及び／又は結合する。

抗原特異性が可変ドメインによって付与され、定常ドメインとは無関係であることは、全てが１つ以上の可変ドメインを含有する抗体断片の細菌発現を伴う実験から知られている。これらの分子としては、Ｆａｂ様分子（Better et al. (1988) Science 240, 1041）、Ｆｖ分子（Skerra et al. (1988) Science 240, 1038）、ＶＨ及びＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して結合されている一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Bird et al. (1988) Science 242, 423、Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 85, 5879）並びに単離されたＶドメインを含むシングルドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ward et al. (1989) Nature 341, 544）が挙げられる。それらの特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に関与する技術の一般的な概説は、Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299に見られる。本明細書で有用な抗体及び断片は、ヒト若しくはヒト化、マウス、ラクダ科動物、キメラ、又は任意の他の適切な供給源からのものであり得る。

「ＳｃＦｖ分子」とは、ＶＨ及びＶＬパートナードメインが、例えば、ペプチドによって、又はフレキシブルなオリゴペプチドによって直接共有結合している分子を意味する。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ及びｓｄＡｂ抗体断片は全て大腸菌（E. coli）による発現及び分泌が可能であり、したがって当該断片の大量産生は容易である。

全抗体及びＦ（ａｂ’）２断片は「二価」である。「二価」とは、当該抗体及びＦ（ａｂ’）２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ及びｓｄＡｂ断片は一価であり、抗原結合部位を１つのみ有する。一価の抗体断片はサイズが小さいため、タグとして特に有用である。

場合によっては、結合分子は、単鎖抗体又はｓｃＡｂである。ｓｃＡｂは、共有結合したＶＨ及びＶＬパートナードメイン（例えば、直接的に、ペプチドによって、又はフレキシブルなオリゴペプチドによって）と、任意選択的に軽鎖定常ドメインと、からなる。

いくつかの好ましい実施形態では、抗体は検出可能に標識されているか、又は少なくとも検出可能である。例えば、抗体は、放射性原子又は着色分子又は蛍光分子又は任意の他の方法で容易に検出され得る分子で標識され得る。適切な検出分子としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、酵素基質、及び放射性標識が挙げられる。抗体は、検出可能な標識で直接標識されてもよく、又は間接的に標識されてもよい。例えば、抗体は標識されていなくてもよく、標識済みの別の抗体によって検出することができる。あるいは、二次抗体にビオチンを結合させ、標識ストレプトアビジンを該ビオチンに結合させることにより一次抗体を間接的に標識してもよい。

本明細書に開示される特定の方法では、エフェクター分子はナノボディである。本明細書で使用される場合、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又はＶＨＨとしても知られる「ナノボディ」という用語は、単一の可変抗体ドメイン単量体からなる抗体断片を指す。ナノボディは、全抗体と同様に選択的に特異的抗原に結合することができる。通常１２～１５ｋＤａの分子量を有し、単一ドメイン抗体は、２つのタンパク質重鎖と２つの軽鎖とで構成される一般的な抗体（通常１５０～１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、Ｆａｂ断片（およそ５０ｋＤａ、１つの軽鎖及び半分の重鎖）並びに単鎖可変断片（およそ２５ｋＤａ、２つの可変ドメイン、１つは軽鎖由来、１つは重鎖由来）よりも更に小さい。

モノクローナル抗体及びナノボディなどの抗体及び抗原結合断片は、任意の適切な標的を対象とし得る（すなわち、結合し得る）。例えば、抗体又は抗原結合断片は、ＥＧＦＲ若しくはＩＬ８に結合してもよく、又はＴ細胞／免疫細胞活性化抗体、又は抗毒素抗体若しくは抗病原体抗体であってもよい。

本明細書に開示されるいくつかの方法は、ＯａＡＥＰ１リガーゼを使用する。ＯａＡＥＰ１リガーゼは、植物種Oldenlandia affinis（O. affinis）に由来する。ＯａＡＥＰ１リガーゼは、アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）ファミリーの原核生物酵素である。ＡＥＰ酵素は典型的にはプロテアーゼとして作用するが、ＯａＡＥＰ１などのいくつかのＡＥＰ酵素は、進化したリガーゼ機能を有する。本明細書に開示される方法による好ましいＯａＡＥＰ１リガーゼは、ＯａＡＥＰ－Ｃｙｓ２４７Ａｌａリガーゼである。ＯａＡＥＰ－Ｃｙｓ２４７Ａｌａリガーゼは２４７位にＣｙｓからＡｌａへの点変異を有しており、カルボキシル末端選別シグナルを認識及び切断することによって表面タンパク質を修飾する。ＯａＡＥＰ１リガーゼのほとんどの基質について、認識シグナルは、モチーフ－Ｎ－Ｘ１Ｌ（Ａｓｎ－Ｘ１－Ｌｅｕ、ここで、Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、最も好ましくはＧ、Ｄ又はＰから選択される任意のアミノ酸）からなる。切断は、アスパラギン（Ｎ）と隣接残基との間で起こる。場合によっては、リガーゼ認識配列は、Ｎ末端に配列ＧＧ（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）を含む。この場合、リガーゼ認識シグナルは、モチーフＬＰＸＴＧ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－ａｎｙ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ）を含み得る。ＯａＡＥＰ１リガーゼ、及びＯａＡＥＰ！－Ｃｙｓ２４７Ａｌａリガーゼは、国際公開第２０１８／０５６８９９号（Ａ１）に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。リガーゼは、下表に示す配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は１００％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は１００％の同一性を有する配列を有し得る。

本明細書で使用される場合、「ソルターゼ」という用語は、カルボキシル末端選別シグナルを認識及び切断することによって表面タンパク質を修飾する原核生物酵素の群を指す。ソルターゼ酵素のほとんどの基質では、認識シグナルは、モチーフＬＰＸＴＧ（Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－ａｎｙ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ）と、次いで高度に疎水性の膜貫通配列と、続いて塩基性残基（例えば、アルギニンなど）のクラスターとからなる。切断は、スレオニン（Ｔｈｒ）残基とグリシン（Ｇｌｙ）残基との間で生じ、スレオニン（Ｔｈｒ）残基を介して活性部位システイン（Ｃｙｓ）残基に一時的に付加し、続いてタンパク質を細胞壁成分に共有結合させるペプチド転移が生じる。ソルターゼは、ほとんど全てのグラム陽性細菌及び時折グラム陰性細菌（例えば、Shewanella putrefaciens）又は古細菌（例えば、Methanobacterium thermoautotrophicum）に存在する。ソルターゼは、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ（ＥＸＷＭ－４２４７）及びＡｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ（１３１００）などの多くの供給元から市販されている。特に好ましいソルターゼは、Ａｄｄｇｅｎｅに＃５１１４１として寄託されたｐｅｔ３０ｂ－７Ｍ ＳｒｔＡプラスミドによってコードされるソルターゼＡヘプタミュータント（ｈｅｐｔａｍｕｔａｎｔ）である。

本明細書に開示されるいくつかの方法は、ビオチンとストレプトアビジンとの相互作用を含む。ビオチンは、タンパク質又はペプチドの機能又は活性を変化させずに当該タンパク質及びペプチドに容易に付加することができる、小さく安定な複素環式化合物である。多くのタンパク質が、ストレプトアビジンを含むビオチンに結合し、強い非共有結合相互作用を形成することが知られている。タンパク質又はペプチドをビオチンにコンジュゲートするためのキット及び方法は、当該技術分野において周知であり、当業者であれば容易に認識され、例えば、ビオチンコンジュゲーションキット（タイプＢ、Ａｂｃａｍ（商標）、ａｂ２０１７９６）が挙げられる。

本明細書に記載の方法に有用なエフェクター分子は、修飾されてもよい。特に、エフェクター分子は、赤血球膜タンパク質又はリンカーへのエフェクター分子のコンジュゲーションを容易にするように操作されてもよい。特に、エフェクター分子は、リガーゼ認識配列、ビオチン若しくはストレプトアビジン部分、又はアジド、テトラジン、メチルテトラジン、ジアリールサイトオクチン（ＤＢＣＯ）若しくはトランスシクロオクチン（ＴＣＯ）部分を含み得るか、又は含むように操作され得る。

いくつかの態様では、エフェクター分子は、Ｃ末端リガーゼ認識配列、好ましくはＣ末端リガーゼ認識配列を含む。特異的リガーゼ認識配列は、コンジュゲーションを行うために使用されるリガーゼによって異なる。好ましくは、リガーゼ認識配列はＯａＡＥＰ１リガーゼ認識配列である。リガーゼ認識配列は、以下：ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ又はＮＧから選択される、任意のリガーゼ認識配列であり得る。好ましい方法では、エフェクター分子は、Ｃ末端ＮＧＬ、ＮＤＰ又はＮＰＬモチーフ、最も好ましくはＮＧＬを含む。いくつかの方法では、エフェクター分子は、Ｃ末端に－ＮＧＬモチーフを含み、例えば、Ｃ末端にモチーフを含むように設計されている。いくつかの方法では、エフェクター分子はＣ末端に－ＧＧを含み、例えば、Ｎ末端にモチーフを含むように設計されており、例えば、エフェクター分子は、配列ＬＰＸＴＧＧを含むように設計されている。追加のリガーゼ認識配列／モチーフなどの追加の配列を含むようにタンパク質及びペプチドを設計する方法は、当業者に周知であり、例えば、Sambrook et al.に報告されている方法が挙げられる。かかるエフェクター分子を、エフェクター分子がＲＢＣに直接コンジュゲートされる「一工程」法において使用することもできる。かかるエフェクター分子はまた、最初にＲＢＣにリンカーをコンジュゲートし、続いてリンカーにエフェクター分子をコンジュゲートする「二工程」法において使用することもできる。

他の態様では、エフェクター分子は、Ｃ末端ビオチンモチーフを含み、好ましくはＣ末端にビオチンモチーフを含む。エフェクター分子は、Ｃ末端にビオチン部分を含むように設計されていてもよい。追加の配列を含むようにタンパク質及びペプチドを設計する方法、例えばビオチン部分を付加する方法は当業者に周知であり、例えば、Sambrook et al.に報告されている方法が挙げられる。

更に他の態様では、エフェクター分子はＣ末端アジド部分を含む。エフェクター分子は、エフェクター分子とアジドとのコンジュゲーション後にＣ末端アジド分子を含んでもよい。アジド部分に対するタンパク質及びペプチドのコンジュゲーションのための方法及びキットは、当該技術分野において周知であり、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（商標）製のＮＨＳ－アジドキット（カタログ番号８８９０２）が挙げられる。エフェクター分子は、Ｃ末端ＤＢＣＯ部分を含み得る。

エフェクター分子は、機能性を高めるために更に操作することもできる。例えば、エフェクター分子がナノボディ又は他の抗体断片である場合、エフェクター分子の折り畳みを促進するために、１つ以上のリンカー配列を含むようにエフェクター分子を設計することが適切であり得る。

エフェクター分子には、例えば、エフェクター分子の作製、モニタリング又は追跡を容易にするために、タグ又は標識などの追加の配列を含むよう、更なる改変を行うこともできる。タンパク質及びペプチドのタグ又は標識は、このような配列を含むようにタンパク質又はペプチドを作製する方法と同様に、当該技術分野において周知である。例えば、エフェクター分子は、Ｈｉｓタグ（６×Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ又はビオチンのうちの１つ以上を含み得る。

本明細書に記載される特定の方法は、リンカーを含む。リンカーはアミノ酸配列を含み、エフェクター分子を赤血球に直接コンジュゲートさせずにエフェクター分子を赤血球に接続させるのに有用である。このようなリンカーは、赤血球に近接することによる立体障害や、エフェクター分子の折り畳みの歪みを引き起こすことによる立体障害などのエフェクター分子の機能阻害を生じさせることなく、赤血球に接続させる。

リンカーは、下記アミノ酸配列を含むか、又はそれからなっていてもよい。
［Ａ］－［Ｙ］－［Ｂ］
式中、
［Ａ］は、リガーゼ認識配列、ビオチン、アジド又はＤＢＣＯ部分であり、
［Ｙ］は、リンカー本体配列であり、
［Ｂ］は、リガーゼ認識配列である。

［Ａ］がリガーゼ認識配列である場合、アミノ酸配列ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ又はＮＧ、好ましくはＮＧＬ、ＮＰＬ又はＮＤＬを有する。

［Ａ］がリガーゼ認識配列である場合、［Ｂ］はＸａａ_１ＧＧのアミノ酸配列を有し、Ｘａａ_１は、Ｇ以外の任意のアミノ酸であるか、又は［Ｂ］は配列ＮＧ、ＧＧＧ若しくはＮＣＬを有する。［Ａ］がリガーゼ認識配列であるいくつかの態様では、［Ｂ］はアミノ酸配列ＬＰＸ_３ＴＧＧを有し、Ｘ_３は任意のアミノ酸である。好ましくは、Ｘ_３は、Ｅ、グルタミン酸であり、したがってリガーゼ認識配列はアミノ酸配列ＬＰＥＴＧＧを有する。

いくつかの態様では、［Ａ］は、アジド部分、テトラジン部分、メチルテトラジン部分又はジアリールサイトオクチン（ＤＢＣＯ）部分若しくはトランスシクロオクチン（ＴＣＯ）部分又はビオチン部分を含む。

［Ａ］が、アジド部分、テトラジン部分、メチルテトラジン部分又はジアリールサイトオクチン（ＤＢＣＯ）部分若しくはトランスシクロオクチン（ＴＣＯ）部分又はビオチン部分を含む場合、［Ｂ］は、アミノ酸配列ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ又はＮＧ、好ましくはＮＧＬ、ＮＰＬ又はＮＤＬを有する。

リンカー本体［Ｙ］は、任意の適切なアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、［Ｙ］は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個又は３０個のアミノ酸のからなるアミノ酸の配列を含む。場合によっては、［Ｙ］は、αヘリックスペプチドを含む。場合によっては、［Ｙ］は、配列ＥＡＡＡＫ（Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ）を含む。場合によっては、［Ｙ］は、配列ＥＡＡＡＫの反復、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の反復を含む。好ましくは、リンカーは、ＥＡＡＡＫの１個～１０個又は１個～５個の反復を含む。最も好ましくは、リンカーは、ＥＡＡＡＫの１個又は５個の反復を含む。場合によっては、リンカーは、配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを含むか、又はそれからなる。

場合によっては、リンカーは、２９個のアミノ酸を含むか、又はそれからなり、Ｎ末端ＧＬモチーフ及びＣ末端ＬＰＥＴＧＧモチーフを含む。場合によっては、リンカーは、ＧＮ２０リンカーの配列、すなわちＧＬ－ＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧ－ＬＰＥＴＧＧからなる。

場合によっては、リンカーはストレプトアビジン部分を含まない。

本明細書で使用される場合、「天然の赤血球」という用語は、予め処理されていない赤血球を指す。当業者であれば理解するように、天然の赤血球は、脱核されており、両凹形状を有する。すなわち、赤血球は、本明細書に開示される方法に従って使用する前に遺伝子操作（又は他の方法）による改変を受けていない。特に、赤血球は、赤血球膜に関して遺伝子改変されていなくてもよい。したがって、本明細書に開示される方法において使用される赤血球の膜は、本明細書に開示される方法の赤血球が由来する同種個体における赤血球の膜と区別できないものであり得る。特定の態様では、ＲＢＣは、遺伝子改変された赤血球から脱核されていなくてもよい。本明細書に記載されるＲＢＣは、未改変／未修飾の赤血球である。ＲＢＣは、赤血球由来細胞外小胞ではない。

赤血球及び赤血球細胞外小胞は、含む又は提示する表面タンパク質に関して異なることに留意されたい。赤血球細胞外小胞の生合成の間、多くのタンパク質及び脂質が反転プロセスを経ることで、細胞質の赤血球タンパク質が赤血球表面に現れる。逆に、同反転プロセスにより、いくつかの赤血球表面タンパク質は小胞の内側に移動する。

本明細書に記載の修飾血液細胞、及び修飾赤血球を含む組成物は、治療において、例えば、疾患又は障害の処置、予防及び／又は改善において使用することもできる。

投与は、好ましくは「治療有効量」であり、これは個体に利益を示すのに十分な量である。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療する疾患の性質及び重篤度によって異なる。処置の処方、例えば投与量の決定などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、処置する障害、個別の患者の症状、送達部位、投与方法及び開業医に知られている他の因子を考慮する。上述の技術及びプロトコルの例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkinsに見出され得る。

処置される対象は、任意の動物又はヒトであり得る。対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。対象は非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒトである。対象は男性又は女性であり得る。対象は患者であり得る。治療目的使用は、ヒト又は動物（獣医学的使用）におけるものであり得る。

本明細書に記載される修飾赤血球は、非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、腫瘍内、経口及び経鼻を含むがこれらに限定されないいくつかの経路による投与のために製剤化され得る。

本明細書に記載の修飾赤血球は、エフェクター分子を標的細胞に送達するために使用され得る。場合によっては、方法は、インビトロ又はエクスビボの方法である。他の場合には、方法はインビボ方法である。「インビトロ」という用語は、実験室条件又は培養における材料、生物学的物質、細胞及び／又は組織を用いた実験を包含することを意図し、一方、「インビボ」という用語は、改変されてない多細胞生物を用いた実験及び手順を包含することを意図する。「エクスビボ」は、生物の外部、例えばヒト又は動物の体外に存在するか又は生じるものを指し、これは生物から採取された組織（例えば全臓器）又は細胞上に存在する場合もある。

本明細書に記載される方法によって産生される修飾赤血球は、以下の特徴のうちの１つ以上と関連し得る：
・天然の赤血球と比較して、赤血球表面の減少したグリコシル化残基レベル；
・赤血球の外表面にコンジュゲートされた少なくとも１００，０００コピーの外因性ペプチド、例えば、エフェクター分子又はリンカーペプチド；
・赤血球の外表面に対してコンジュゲートされた少なくとも１００，０００分子のビオチン及び任意選択的にストレプトアビジン；
・標的細胞（例えば、がん細胞など）に結合する能力であって、該標的細胞は赤血球に対してコンジュゲートしたエフェクター分子のリガンドを発現する能力。

一態様では、エフェクター分子に対してコンジュゲートした脱グリコシル化赤血球が本明細書で提供される。エフェクター分子は、抗体、抗原結合断片又は酵素であり得る。

本明細書に開示される方法は、赤血球を表面修飾する効率的な方法を提供する。本方法は、平均して、赤血球当たり少なくとも８０，０００個のペプチド、赤血球当たり少なくとも９０，０００個のペプチド、赤血球当たり少なくとも１００，０００個のペプチド、又は赤血球当たり少なくとも１０，５００個のペプチド、好ましくは赤血球当たり少なくとも１００，０００個のペプチドで修飾された赤血球の生成をもたらし得る。「平均」という用語は、平均値（ｍｅａｎ ａｖｅｒａｇｅ）を指す。

本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素、限定、又は制限が存在しない場合であっても適切に実施され得る。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、拡大的に解釈され、限定的なものではない。更に、本明細書で用いられる用語及び表現は、説明的な用語として使用され、限定的なものではなく、かかる用語及び表現又はその一部の使用は、表示及び記載された特徴のいかなる均等物をも除外する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが理解される。したがって、本発明は、好ましい実施形態によって具体的に開示されるものであり、本明細書に具体化された形で開示される本発明の任意選択的な特徴、修飾、及び変形は、当業者により再現され得、またかかる修飾及び変形は本発明の範囲内にあると考えられることを理解されたい。

本願で使用する場合、単数形を表す「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含まれる。例えば、「遺伝子マーカー」という用語は、混合物及び組み合わせを含む、複数種の遺伝子マーカーを含む。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、製剤の成分の濃度の文脈において、典型的には、記載された値の±５％、より典型的には、記載された値の±４％、より典型的には、記載された値の±３％、より典型的には、記載された値の±２％、更により典型的には、記載された値の±１％、更により典型的には、記載された値の±０．５％を意味する。

本開示を通して、特定の実施形態は、範囲形式で開示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性及び簡潔さのためであり、開示される範囲の柔軟性を欠く限定的なものと解釈すべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲、及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５及び６も具体的に開示するとみなされるべきである。これは、範囲の大きさに関わらず適用される。

特定の実施形態はまた、本明細書において広くかつ全般的に記載され得る。全般的な開示に含まれるより狭い種及び準全般的なグループ化の各々もまた、本開示の一部を形成する。これは、個々の群から任意の主題を除外する但し書き又は否定的な限定を伴う実施形態の全般的な説明を含むものであり、除外される材料が本明細書に具体的に列挙されているか否かに関係ない。

本発明は、本明細書において広範囲かつ全般的に記載されている。全般的な開示内に含まれるより狭い種及び準全般的なグループ化の各々もまた、本発明の一部を形成する。これは、個々の群から任意の主題を除外する但し書き又はネガティブ限定を伴う本発明の全般的な説明を含むものであり、除外される材料が本明細書に具体的に列挙されているか否かに関係ない。

他の実施形態が、以下の特許請求の範囲及び非限定的な実施例内に存在する。加えて、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群として記載される場合、当業者は、それによって本発明がマーカッシュグループのメンバーの任意の個々のメンバー又はサブグループに関して記載されていることを認識するであろう。

前述の説明、又は以下の特許請求の範囲、又は添付の図面に開示された特徴は、それらの具体的な形態で、又は開示された機能を実行するための手段、又は開示された結果を得るための方法若しくはプロセスの観点から適宜表現され、別個に、又はそのような特徴の任意の組み合わせで、その多様な形態で本発明を実現するために利用することができる。

上記の例示的な実施形態と併せて本発明を説明してきたが、多くの等価な修正形態及び変形形態が、本開示を与えられたときに当業者には明らかになるであろう。したがって、上述した本発明の例示的な実施形態は例示的なものであり、限定的なものではないと考えられる。記載された実施形態に対する様々な変更が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得る。

誤解を避けるために、本明細書で提供される任意の理論的説明は、読者による理解を向上させる目的で提供される。本発明者らは、これらの理論的説明のいずれにも拘束されることを望まない。

本明細書で使用される任意のセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。

特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外しないことを意味すると理解されるであろう。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうではないことを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。範囲は、本明細書において、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約」の使用によって近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。数値に関する「約」という用語は任意選択的であり、例えば±１０％を意味する。

番号付けされた項目
以下の番号付けされた項目は、本発明に関連して企図される特徴及び特徴の組み合わせの更なる記述を提供する。

項目１ 天然の赤血球を脱核後に表面修飾する方法であって、
ａ．対象から得られた天然の赤血球をエフェクター分子に曝露することと、
ｂ．エフェクター分子を赤血球に対してコンジュゲートすることと、
ｃ．それによって赤血球を修飾することと、
を含む方法。

項目２ エフェクター分子が少なくとも１０ｋＤａのサイズを有する、項目１に記載の方法。

項目３ エフェクター分子が、タンパク質、酵素、細胞表面マーカー、モノクローナル抗体、ナノボディ、治療剤、抗体断片及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１又は２に記載の方法。

項目４ コンジュゲーション工程が、１つ以上の酵素反応、ビオチン化及び／若しくはストレプトアビジンベースのコンジュゲーションからなる群から選択される方法を使用して、又は銅フリーのクリックケミストリーを使用して行われる、項目１～３のいずれか一つに記載の方法。

項目５ １つ以上の酵素反応が、ブテラーゼ１、ＯａＡＥＰ１リガーゼ、アスパラギニルペプチダーゼ、又はこれらの任意の変異体若しくは多様体からなる群から選択される１つ以上の酵素を使用して触媒される、項目４に記載の方法。

項目６ 酵素反応がソルターゼによって触媒されない、項目４又は５に記載の方法。

項目７ コンジュゲーション工程が、エフェクター分子と天然の赤血球との間に共有結合を生成する、項目１～６のいずれか一つに記載の方法。

項目８ 天然の赤血球が、リンカーを介してエフェクター分子に対してコンジュゲートされている、項目１～７のいずれか一つに記載の方法。

項目９ 天然の赤血球が脱核され、両凹形状を有している、項目１～８のいずれか一つに記載の方法。

項目１０ 酵素反応がＯａＡＥＰ１リガーゼを使用して触媒され、エフェクター分子がナノボディである、項目１～９のいずれか一つに記載の方法。

項目１１ 項目１～１０のいずれか一つに記載の方法によって得られる修飾赤血球。

項目１２ 脱核後の表面にコンジュゲートされたエフェクター分子を含む、修飾赤血球。

項目１３ エフェクター分子が少なくとも１０ｋＤａのサイズを有する、項目１２に記載の赤血球。

項目１４ エフェクター分子が、１つ以上の酵素反応、ビオチン化及び／又はストレプトアビジンベースのコンジュゲーションからなる群から選択される方法を使用して、あるいは銅フリーのクリックケミストリーを使用して、コンジュゲートされている、項目１２又は１３に記載の赤血球。

項目１５ 方法が、エフェクター分子と赤血球との間に共有結合をもたらす、項目１４に記載の赤血球。

項目１６ 酵素反応が、ブテラーゼ１、ＯａＡＥＰ１リガーゼ、代替アスパラギニルペプチダーゼ、又はこれらの任意の変異体若しくは多様体からなる群から選択される酵素によって触媒される、項目１２に記載の赤血球。

項目１７ エフェクター分子が、タンパク質、酵素、細胞表面マーカー、モノクローナル抗体、ナノボディ、抗体断片、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１２～１６のいずれか一つに記載の赤血球。

項目１８ リンカーが赤血球とエフェクター分子との間にコンジュゲートされている、項目１２～１７のいずれか一つに記載の赤血球。

項目１９ エフェクター分子がモノクローナル抗体である、項目１２～１８のいずれか一つに記載の赤血球。

項目２０ 赤血球がヒト又は動物に由来する、項目１～１１のいずれか一つに記載の方法又は項目１２～１９のいずれか一つに記載の赤血球。

項目２１ コンジュゲートされたエフェクター分子が治療効果を発揮する、項目１～１１及び２０のいずれか一つに記載の方法、又は項目１２～１９のいずれか一つに記載の赤血球。

項目２２ 治療に使用するための項目１２～２１のいずれか一つに記載の赤血球。

項目２３ 疾患又は障害を治療する医薬品の製造における、項目１２～２２のいずれか一つに記載の修飾赤血球の使用。

項目２４ 疾患又は障害が、酵素欠損症、代謝疾患、免疫関連障害、血液疾患、及びがんからなる群から選択される、項目２３に記載の使用。

次に、添付の図面を参照して本発明の態様及び実施形態を説明する。更なる態様及び実施形態は、当業者には明らかであろう。本明細書で言及される全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

実施例１ 材料及び方法
赤血球（ＲＢＣ）の精製
ヒト全血をクエン酸－リン酸－デキストロースアデニン緩衝液中に採取し、更なる処理まで４℃で保存した。全血を白血球除去フィルターに通して大部分の白血球を除去した。得られた血液を、過剰量の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して３回洗浄して、血漿及び大部分の血小板を除去した。得られた赤血球ペレットを赤血球保存緩衝液に再懸濁し、将来の実験のために４℃で保存した。ＥＤＴＡをコートした管にマウスの血液を心臓穿刺により得た。血液は、凝固した血液を除去するために４０μｍのセルストレーナーで濾し、白血球を除去するためにＡｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）ＷＢＣ（白血球）シリンジフィルターで濾した。細胞を過剰量のＰＢＳで３回洗浄して、微量の血漿及び血小板を除去した。続いて、血球計を使用して細胞を計数した。

ペプチド及びナノボディの設計
表１に掲載するペプチドは、ライゲーションを促進するために、ＯａＡＥＰ１タンパク質リガーゼが認識するＣ末端モチーフ（－ＮＧＬ）を含むように設計した。必要に応じて単一の第一級アミン基をビオチン化して、ペプチドの検出を容易にした。ペプチドを固相合成し、ＨＰＬＣ（中国、上海、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｌｔｄ）を使用して精製した。上皮成長因子（ＥＧＦＲ）ナノボディ配列をRoovers et al.（Roovers et al., 2011; DOI: 10.1002/ijc.26145）から入手し、Ｎ末端には６×Ｈｉｓタグを含み、Ｃ末端にはＦＬＡＧタグ及びリガーゼ結合部位を含むように修飾した。ナノボディの機能性を高めるために、各エピトープタグ間には以下：（ＨＨＨＨＨＨ－ＧＳＧ－ＶＨＨ－ＧＳＧ－ＦＬＡＧ－ＮＧＬ）に示すとおりのフレキシブルリンカー配列が含まれていた。ナノボディをコードするＤＮＡの合成、及びＴ７プロモーターに続けてのｐＥＴ３２（ａ＋）プラスミドへの挿入はＧｕａｎｇｚｈｏｕ ＩＧＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ（中国）が行った。ＯａＡＥＰ１－Ｃｙｓ２４７Ａｌａをコードするプラスミドは、南洋理工大学（Ｎａｎｙａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＢｉｎ Ｗｕ博士により提供を受けた。ｅＧＦＰ、組換えヒトＩＬ－８及びＬ－アスパラギナーゼの予備精製品は、商業的供給源から得た。

タンパク質の発現及び精製
本研究の前半では、組換えナノボディ及びタンパク質リガーゼの発現及び精製を行った。簡単に説明すると、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（E. coli）で発現させた後、該大腸菌を溶解させ、Ｎｉ－ＮＩＴＡアフィニティークロマトグラフィーに続けてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含むＦＰＬＣシステムによりタンパク質を精製した。酵素ＯａＡＥＰ１は、精製した不活性酵素をｐＨ３．７の酢酸緩衝液中で室温にて一晩インキュベートすることによって活性化させた。

ＯａＡＥＰ１リガーゼを使用した、赤血球に対するペプチド、ナノボディ又はモノクローナル抗体のコンジュゲーション
ライゲーションのため、１×１０^７個の赤血球を、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中、５００μＭのペプチド又はＶＨＨ及び０．２６ｍｇ／ｍＬのリガーゼと共に、総体積２０μＬで、エンド・オーバー・エンド式撹拌機で穏やかに撹拌しながら（３０ｒｐｍ）室温で３時間インキュベートした。

ナノボディライゲーションには二工程法を利用した。最初に、リンカーペプチド（酵素のＮ末端モチーフ及びＣ末端モチーフを両方含有する）をライゲーションし、続いてＰＢＳで２回洗浄した。次いで、該リンカーペプチドをライゲーションした赤血球を、ペプチドのライゲーションと同じ条件で５００μＭのＶＨＨ及び０．２６ｍｇ／ｍＬのリガーゼとインキュベートした。ライゲーション後、８００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、赤血球を洗浄した。

ビオチン化モノクローナル抗体のコンジュゲーションのために、赤血球にビオチン化ペプチドをライゲートした。十分に洗浄した後、酵素によりビオチン化された赤血球を、ストレプトアビジンの最終濃度０．０４μｇ／μＬで組換えストレプトアビジンタンパク質（Ａｂｃａｍ社）と共に４℃で３０分間インキュベートした。更に洗浄した後、これらの赤血球をビオチン化モノクローナル抗体と共にインキュベートした。これらの抗体は、市販のものを入手したか、又はＢｉｏｔｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タイプＢ、Ａｂｃａｍ社）を使用して社内でビオチン化した。遊離（すなわち未結合）抗体を、最終洗浄工程により洗い流した。

ＳＰＡＡＣ（ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ ａｌｋｙｎｅ－ａｚｉｄｅ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）又は銅フリーのクリックケミストリーを用いるＤＢＣＯコンジュゲートペプチド／抗体のコンジュゲーションのために、ＤＢＣＯコンジュゲートリンカーペプチドを最初に赤血球にライゲートした。次いで、これらの赤血球とアジドコンジュゲート分子とを室温で３～１２時間インキュベートして、クリックケミストリーにより安定的にコンジュゲートさせた。アジド－ＮＨＳキットを使用して、アジドをタンパク質にコンジュゲートした。モノクローナル抗体には、Ｆｃドメインのグリカン基にアジドがコンジュゲートしている部位特異的に修飾された市販の抗体を入手した。

ウェスタンブロット解析
ライゲートした赤血球を、最初に、プロテアーゼ阻害剤（Ｂｉｏｔｏｏｌ社）の存在下でＡＣＫ（塩化アンモニウム、カリウム）溶解緩衝液で処理して、赤血球の細胞膜ゴーストを得た（細胞内ヘモグロビン含量を減少させる）。細胞膜を２１，０００×ｇで２時間の遠心分離によってペレットにした。この赤血球細胞膜のペレットを、プロテアーゼ阻害剤（Ｂｉｏｔｏｏｌ社）を添加したＲＩＰＡ緩衝液を使用して氷上で１５分間インキュベートした。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用してタンパク質を定量し、Ｎａｎｏｄｒｏｐリーダー（４２０ｎｍ及び５８６ｎｍでの吸光度）を使用してヘモグロビンを定量した。

溶解液をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液で処理し、９５℃で５分間インキュベートしてタンパク質を変性させた。タンパク質を１０％又は１２％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ）に転写した。ＰＭ５１００ ＥｘｃｅｌＢａｎｄ ３－ｃｏｌｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｄｄｅｒ（台湾、ＳｍｏＢｉｏ社）をマーカーとしてロードして分子サイズを評価した。０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を添加したトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中５％ミルク（Ｄｉｆｃｏ Ｓｋｉｍ Ｍｉｌｋ）を使用してメンブレンを１時間ブロッキングし、続いて一次抗体：ウサギ抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｆ３１６５、希釈１：３０００）と共に４℃で一晩インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ウサギ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ社、希釈１：５０００）と共に室温で１時間インキュベートした。ビオチン化ペプチドの検出のために、ブロットをＰｉｅｒｃｅ高感度ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、希釈１：５０００）と共に直接インキュベートした。ブロットの画像をＢｉｏ－Ｒａｄ Ｃｈｅｍｉｄｏｃゲル撮影装置で取得した。

フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）に再懸濁した。細胞表面タンパク質を解析するために、細胞を２μＬの蛍光標識抗体と共に氷上、暗所で３０分間インキュベートし、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＲＢＣのＦＡＣＳ解析は、ＣｙｔｏＦＬＥＸ－Ｓ又はＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）又はＳ１０００Ｅｘ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｓｔｒａｔｅｄｉｇｍ社）で行った。得られたＦＣＳファイルを、Ｆｌｏｗｊｏ Ｖ１０（米国、Ｆｌｏｗｊｏ社）を使用して解析した。まずは細胞をＦＳＣ－Ａ値対ＳＳＣ－Ａ値でゲーティングして、デブリ及び死細胞を除くそれぞれの細胞集団を同定した。次いで、ダブレット及び凝集塊を除いた単個細胞を、ＦＳＣ幅対ＦＳＣ高さによってゲーティングした。続いて、ビーズ又は細胞の蛍光陽性集団を、ＡＦ４８８又はＣＦＳＥの場合はＦＩＴＣ、ＡＦ６４７の場合はＡＰＣ、及びｍＣｈｅｒｒｙの場合はＥＣＤのように設定した蛍光チャネルによってゲーティングした。

Ｌ－アスパラギナーゼアッセイ
アスパラギン依存性Ｓｕｐ－Ｂ１５細胞を、２０％ｉＦＢＳ及び０．０５ｍＭの２－メルカプトエタノールを添加したＩＭＤＭ培地で培養した。ＲＢＣに上記のようにビオチン化Ｌ－アスパラギナーゼをコンジュゲートした。コンジュゲートされていないビオチン化Ｌ－アスパラギナーゼ、又はＬ－アスパラギナーゼによりコンジュゲーションされた若しくはコンジュゲーションされていないＲＢＣを、Ｓｕｐ－Ｂ１５細胞と１：５の比（ＲＢＣ対Ｓｕｐ－Ｂ１５細胞）で共培養した。４日後、１０μＬのＣＣＫ８試薬を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。続いて、プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。

免疫蛍光イメージング
１％のＢＳＡを添加した冷ＰＢＳで赤血球細胞（１０^５個）を２回洗浄した。体積を１００μＬにした。スライド及びプレウェットフィルターを用意し、サンプルをそれぞれのサイトスピンフューネルのウェルにピペットで入れた。スライドを８００×ｇで３分間回転させた。スライド上に固定した赤血球には触れずに、フィルターをスライドから除去した。細胞を暗所で３０分間それぞれの抗体で染色し、ＢＳＡ－ＰＢＳを使用して３回洗浄した。スライドを覆い、Ｌｅｉｃａ Ｔｈｕｎｄｅｒ顕微鏡で画像を取得した。画像の取得は盲検様式で行い、画像を無作為に取得した後、Ｃｏｌｏｃ ２（ＩｍａｇｅＪ）を使用して盲検で共局在解析を行った。

インビボ半減期分析
表面修飾（ビオチンペプチドライゲート）又は未修飾赤血球をＣＦＳＥで３７℃にて２０分間標識し、２回洗浄し、尾静脈を介してマウスに注射した。ランセットを使用して顎下静脈から（頬出血を介して）一定の間隔で採血した。全血をスピンダウンし、計数し、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度のストレプトアビジン－ＡＦ６４７で染色するために５，０００万個の細胞を採取した。細胞を１時間染色した後、２回洗浄し、フローサイトメトリーによって解析した。注入した赤血球と内在性赤血球とをＣＦＳＥにより区別し、ライゲートしたペプチドのインビボでの安定性はストレプトアビジン－ＡＦ６４７により経時的にモニターした。

データ解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用してデータの統計解析を行い、グラフを作成した。Ｐ値＜０．０５を有意であるとみなした。ＢｉｏＲｅｎｄｅｒ．ｃｏｍ及び／又はＡｄｏｂｅ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒを使用して実験概要の図を作成した。ウェスタンブロット解析、共局在解析及び単位細胞面積当たりの平均蛍光を、ＦＩＪＩを使用して評価した。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０を使用してＦＡＣＳプロットを生成した。

実施例２：結果
ＯａＡＥＰ１ Ｃｙｓ２４７Ａｌａを使用して、ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）表面にペプチドを共有結合させることができる。

ＯａＡＥＰ１又はソルターゼなどのタンパク質リガーゼを使用すると、特別に設計したペプチドのＲＢＣに対する共有結合を触媒することができる。ＯａＡＥＰ１タンパク質リガーゼによるペプチドのヒト赤血球に対するコンジュゲートの効率を試験するために、赤血球に対してコンジュゲートさせるためのリガーゼ認識部位を備えているビオチン化ペプチド（Ｂ－ペプチド／Ｂ－ＴＬ５）を設計した。ライゲーション後、得られた赤血球を、ビオチン化タンパク質の存在についてウェスタンブロットによって解析した。ビオチン化ペプチド（Ｂ－ＴＬ５）をライゲートした赤血球をウェスタンブロットしたところ、対照のいずれにおいても観察されなかった約４０ｋＤａのビオチン化タンパク質の明瞭なバンドが示された（図１Ａ、レーン１～６）。データは、この酵素アプローチを用いると、赤血球膜タンパク質に対して、ペプチドをコンジュゲートすること、及び／又は共有結合により官能基を導入できることを実証した（図１Ａ）。ライゲーションの効率を更に検証するために、本発明者らは、コンジュゲートされたペプチドのヒト赤血球（ｈＲＢＣ）当たりのコピー数を測定することにした。モノビオチン化ペプチド（Ｂ－ＴＬ５）によるヒト赤血球の標識を、ストレプトアビジン－ＨＲＰを用いた免疫ブロッティングにより定量した。ジビオチン化ＨＲＰを定量のための参照として使用した。タンパク質の分子量マーカー（ｋＤａ）を各ブロットの左側に示す。その後の解析により、単個のヒト赤血球に平均して１００，０００個を超えるペプチドがコンジュゲートしていたことが明らかになった（図１Ｂ）。この結果を、フローサイトメトリーを使用して更に検証した。ビオチン化ペプチドをライゲートさせたヒト赤血球又は対照ヒト赤血球をストレプトアビジン－ＡＦ６４７で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。酵素の存在下でＢ－ＴＬ５とライゲートさせたヒト赤血球でのみ細胞集団の有意なシフトが生じ、ヒト赤血球表面のＢ－ＴＬ５ペプチドの存在が確認された（図１Ｃ）。ライゲート処理及び未処理ヒト赤血球を免疫蛍光イメージングにより観察したところ、ライゲートさせたペプチド（ＰＥコンジュゲート抗ビオチン抗体を用い緑色に染色）はヒト赤血球細胞膜（ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ Ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔａｉｎを使用して染色；図１Ｄ）上に共局在していた。ビオチン化ペプチドをライゲートしたヒト赤血球及び未ライゲートのヒト赤血球の、１条件当たりおよそ約１００個の細胞についての、単位細胞面積当たり（ＣｅｌｌＭａｓｋ染色をマスクとして使用して）のＰＥ－ビオチン染色による平均蛍光を定量した。図１Ｅに示す。更に、共局在解析を使用してＣｅｌｌＭａｓｋ及びビオチンの共局在化の程度をより正確に定量したところ、ピアソンのＲ値は０．９６であることが判明し、酵素によるライゲーションの成功が存在する場合でのみ２つのシグナルが強く共局在していることが確認された。

本発明者らはまた、Ｃ末端認識モチーフであるＸの配列をさまざまに変えた（ＥＡＡＡＫ）３－Ｘペプチドのライゲーション効率をスクリーニングすることによって、ペプチド配列がライゲーション収率にどのように影響するかを調査した。興味深いことに、本発明者らは、さまざまなＣ末端配列でＲＢＣライゲーションが機能的であることを発見した（図９Ａ）。ＸがＮＤＬ又はＮＰＬである場合に得られた最適なライゲーション収率は、有意により高いライゲーション収率をもたらした。

（ＥＡＡＡＫ）反復単位の数をさまざまに変えたαヘリックスペプチドを使用して、ペプチド長の影響も評価した。８アミノ酸から２８アミノ酸までの長さのペプチド（１～５個のＥＡＡＡＫ反復）は、総じて効率的なライゲーションを示した。試験したなかで最も短いペプチド（ＥＡＡＡＫ反復１つ、８個のアミノ酸長）は、より長い配列を有するペプチドよりも有意に高い収率を示した。ＥＡＡＡＫ反復の数を増加させると、ライゲーション収率は１３アミノ酸から１８アミノ酸（ＥＡＡＡＫ反復２個から４個）に僅かに減少した（図９Ｂ）。驚くべきことに、２８アミノ酸（５個のＥＡＡＡＫ反復）を有するペプチドは、１８アミノ酸のペプチドと比較してライゲーション収率の僅かな増加を示した。

二工程法を用い、ｈＲＢＣ表面に対してシングルドメイン抗体を共有結合させることができる。

二工程法を用い、ヒト赤血球表面に対してシングルドメイン抗体を共有結合させることができる。このデータにより、著しく大きなタンパク質、例えば限定するものではないがヒト赤血球表面上のシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）などは、おそらくより大きくより複雑な構造のため、直接的にライゲーションさせることはできないことも明らかになった。したがって、かかるタンパク質の、完全に酵素により介在されるコンジュゲーションのために、二工程法が考案された。第１の工程では、ＯａＡＥＰ１リガーゼを使用してリンカーペプチドＧＮ２０をヒト赤血球にコンジュゲートさせ、第２の工程では、同じ酵素を使用してリンカーペプチドをラクダ科動物由来のシングルドメイン抗体（約１５～３０ｋＤａ）とコンジュゲートさせた（図２Ａ）。結果として、図２Ｂでフローサイトメトリーにより示されるように、この方法は、ＦＬＡＧタグを有する抗ＥＧＦＲ単一ドメイン抗体をヒト赤血球表面に効率的にライゲートした。このデータは、ヒト赤血球の１００％がシングルドメイン抗体とライゲートされることを明確に示す。

免疫蛍光イメージングもこれを裏付けており、二工程法はペプチドコンジュゲーション法と比較して効率性に劣るが、機能的ではあることが確認された（図２Ｃ、ＶＨＨＥＧＦＲのＦＬＡＧタグ（抗ＦＬＡＧ－ＡＦ４８８を使用して緑色に染色）がヒト赤血球細胞膜（ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ Ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔａｉｎを使用して赤色に染色）に共局在したことを示す）。ＣｅｌｌＭａｓｋ及びＶＨＨの共局在化も定量した。図２Ｄに、未ライゲートのヒト赤血球及び対照ヒト赤血球についての単位細胞面積当たりの平均ＡＦ４８８シグナルとして示す。ＶＨＨをライゲートしたヒト赤血球のピアソンのＲ値は０．５１であることが判明し、ペプチドライゲーションと比較して、ＶＨＨの細胞膜への共局在化の程度は低いことが確認された。

二工程法のためのリンカーペプチドは、シングルドメイン抗体をｈＲＢＣ表面に対して共有結合させるよう設計することができる。

本発明者らは更に、二工程ライゲーション法の効率を検証し、それぞれＮ末端及びＣ末端の両方に酵素認識モチーフを有するいくつかの異なるリンカーペプチドの相対効率を比較した。リンカーペプチドのライゲーション後、ＲＢＣに抗ＥＧＦＲ単一ドメイン抗体（ＥＧＦＲ ＶＨＨ）をコンジュゲートさせた。続いて、抗ＦＬＡＧタグ抗体を使用して、ＲＢＣ表面上のＦＬＡＧタグ付加単一ドメイン抗体を検出した。最初のフローサイトメトリー解析により、ナノボディをＲＢＣに対して直接的にライゲーションしても顕著なライゲーションは全く得られないことが明らかになった（図１０Ａ～図１０Ｂ）。しかしながら、本発明者らは、特異的な認識モチーフを両末端に有する特別に設計したリンカーペプチド（ＧＮ２０）の存在下では、ｈＲＢＣの１００％が効率的にＥＧＦＲ ＶＨＨコンジュゲーションしていることを観察することができた。注目すべきことに、同様の長さの非リンカースクランブルペプチド（ＴＬ２０）又はＮ末端にビオチンを付加したＧＮ２０（Ｂ－ＧＮ２０）ではライゲーションは無効になり、二工程リンカーペプチド法のコンジュゲーション効率を示した（図１０Ａ～図１０Ｂ）。

さまざまなバリエーションのＮ末端及びＣ末端ライゲーションモチーフを比較する更なる解析により、ＧＮ２０ペプチドにおいて使用した組み合わせにより最適な収率が得られた一方で、本発明者らが以前にＲＢＣＥＶコンジュゲーションに使用したペプチド、ＧＧ２０、ＥＬ１７及びＧＬ１７は、著しく低いライゲーション効率を示したことが明らかになった（図１０Ｃ）。新たに設計したＧＮ２０ペプチドでは最良のライゲーション収率が得られ、１００％のＲＢＣのコンジュゲーションと、次に最良なペプチドであるＧＧ２０と比較して約３倍のコピー数増加とがもたらされた（図１０Ｃ）。ＧＮ２０を介することで得られる高コピー数は、ＧＮ２０の最適化されたライゲーションモチーフが、ライゲーションの第２の工程において、ＶＨＨに対するＮ末端でのより効率的なライゲーションを促進することに起因する（図１０Ｂ）。本発明者らのデータはまた、二工程ライゲーションの際のＮ末端及びＣ末端モチーフの僅かな違いも明らかにした。ＧＮ２０のＮ末端モチーフをＧＬＧ－からＧＬＡ－又はＡＬＧ－に変えると、ライゲーション反応が完全に無効になった（図１０Ｃ）。更に、Ｃ末端モチーフ－ＬＰＥＴＧＧへの追加のＧの付加（結果としてＬＧＥＴＧＧＧが生じる）もまた、二工程ライゲーションを完全に阻害した。しかしながら本発明者らは、ＧＧ３９リンカーペプチドを使用した、ｈＲＢＣへのＶＨＨの効率的なライゲーションによって実証されるように、二工程ライゲーションを完全に損なうことなくＧＮ２０ペプチドの内部配列及び長さを改変できることを実証できた（図１０Ｃ）。

実施例２：ＲＢＣの脱グリコシル化は、ＲＢＣ上へのタンパク質のライゲーションを促進する。
本発明者らはまた、タンパク質のライゲーション前にＲＢＣを脱グリコシル化することによる効果を比較した（図１１Ａ）。注目すべきことに、本発明者らは、脱グリコシル化そのものはＲＢＣの基底蛍光に影響を及ぼさないことを実証する（図１１Ｂ）。しかしながら、本発明者らは、その後のタンパク質（ＥＧＦＲ ＶＨＨ）のライゲーション時にライゲーション効率の増加を検出することができた。最も顕著な増加はＯ－グリカンの除去後に見られた（図１１Ｂ）。重要なことに、本発明者らは、ＥＧＦＲ ＶＨＨライゲーションの前に脱グリコシル化とリンカーペプチドによるライゲーションとの両方を行うことによって、脱グリコシル化戦略が、上記で概説した二工程ライゲーション法と相乗的であることを実証することができた（図１１Ｃ）。興味深いことに、ＰＮＧａｓｅ Ｆで脱グリコシル化し、かつＧＬ１７リンカーペプチドでライゲーションすると、ＥＧＦＲ ＶＨＨライゲーション収率のかなりの増加が得られ、その収率は、いずれかの条件のみで得られる収率よりもはるかに高かった。注目すべきことに、本発明者らは、脱グリコシル化をリンカーペプチドライゲーションの前に行った場合にライゲーション収率のより大きな増加を観察したが、その逆は観察されなかった。脱グリコシル化プロセスがリンカーペプチドのより効率的なコンジュゲーションを促進し、続いてＥＧＦＲ ＶＨＨコンジュゲーションを増加させることができたことが示唆される（図１１Ｃ）。

実施例４：ＥＧＦＲ結合単一ドメイン抗体をライゲートしたＲＢＣは、ＥＧＦＲ陽性転移性乳がん細胞に付着することができる。
本発明者らはまた、対照ＲＢＣ又はＧＮ２０連結ＥＧＦＲ ＶＨＨライゲートＲＢＣのいずれかを、ｔｄＴｏｍａｔｏ及びヒトＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲ）を発現する４Ｔ１細胞と共に手短に１０分間インキュベートして、ＥＧＦＲ ＶＨＨコンジュゲートＲＢＣの機能を検証した。続いて、ＲＢＣを４Ｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ－ｈＥＧＦＲ細胞から分離し、溶解させ、ＥＧＦＲをウェスタンブロットすることによって、がん細胞プルダウンの効率を解析した。図１１Ｄに示されるように、ＧＮ２０リンカーペプチドのみが、がん細胞のかなりのプルダウンをもたらすのに十分なＥＧＦＲ ＶＨＨコンジュゲーションをもたらすことができ、シングルドメイン抗体とライゲートされたこれらの改変ＲＢＣ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＲＢＣ）の、対応する受容体を発現するがん細胞に対する結合能が確認された。ＨＢＡはＲＢＣの内部対照として使用しており、各条件において等量のＲＢＣがプルダウンに使用されたことを示す。本発明者らはまた、プレートリーダーを使用してそれぞれのプルダウンサンプルのｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を読み取ることによって、このデータを検証した（図１１Ｅ）。４Ｔ１細胞は転移性乳がん細胞であり、通常、原発腫瘍から循環血液を介して離れた部位に播種し、高頻度で転移を形成する。４Ｔ１細胞はＥＧＦＲを天然に発現するが、この試験では、ヒトのがん細胞を模倣するために、ＥＧＦＲのヒト相同体を４Ｔ１細胞で発現させる。ＥＧＦＲは、乳がんを含むヒトがんにおける一般的な受容体である。したがって、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ被覆ＲＢＣの４Ｔ１細胞に対する結合は、かかるＲＢＣが、転移性がんを有する患者に注入されることで、循環血中のＥＧＦＲ陽性腫瘍細胞を認識し得ることを示唆している。次いで、ＲＢＣ－腫瘍細胞のデュプレックスが除去又は排除されることで、転移速度が低下し得る。

実施例５：ストレプトアビジンリンカーを介した、より大きくより複雑なタンパク質のヒト赤血球（ｈＲＢＣ）表面に対するコンジュゲーション。
ヒト赤血球に対する比較的小さいサイズ～中程度のサイズのタンパク質の二工程式リンカーペプチドコンジュゲーション方法は確立されていたが、ヒト赤血球表面にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び酵素などのより大きいタンパク質を固定する方法を見出すことが更に求められていた。この目的のために、図３Ａに概説されているように、ビオチン化ペプチドライゲートヒト赤血球をストレプトアビジン及び選択したビオチン化タンパク質と順次単純にインキュベートすることをベースとして、モジュール式のストレプトアビジンによるコンジュゲーションアプローチを確立した。親和性相互作用であるにもかかわらず、ストレプトアビジン法は非常に安定であることが実証され、各ストレプトアビジン分子の４つの結合部位は、対象とするビオチン化タンパク質の赤血球当たりのコピー数を増強した。フローサイトメトリーを使用してビオチン化抗ｈｉｓタグモノクローナル抗体コンジュゲートヒト赤血球を解析した。二次蛍光抗体での染色後に集団全体の蛍光が大きくシフトすることによる可視化により、ヒト赤血球表面上のモノクローナル抗体の存在を確認した（図３Ｂ）。ビオチン化ウサギモノクローナル抗体（ロバ抗ウサギＡＦ４８８抗体を使用して緑色に染色）がヒト赤血球細胞膜（ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）ｄｅｅｐ ｒｅｄ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔａｉｎを使用して赤色に染色）に共局在していることを示す、免疫蛍光イメージングも、モノクローナル抗体のヒト赤血球に対する高効率でのコンジュゲーションの成功を実証するのに用いた（図３Ｃ）。共局在解析により、モノクローナル抗体コンジュゲートヒト赤血球のピアソンのＲ値は０．８６であることが明らかになった。この値は、ＶＨＨコンジュゲーションに以前に使用されていた二工程リンカーペプチド法よりも有意に高く、本アプローチの効率がより高いことを示している。図３Ｄはまた、条件毎に、ＡＦ４８８チャネルにおける単位細胞面積当たりの平均蛍光（ｃｅｌｌ ｍａｓｋを参照とする）を示す。モノクローナル抗体コンジュゲートヒト赤血球は機能的であり、ビオチン化抗ｈｉｓタグ抗体コンジュゲートヒト赤血球による、ｈｉｓタグ付加タンパク質（検出のためのＦＬＡＧタグも含有する）のプルダウンによって実証されるように、溶液から標的抗原をプルダウンすることができることが示された（図３Ｅ）。ＦＬＡＧタグ抗体を使用して、ヒト赤血球表面上の標的抗原を検出した。このアプローチの汎用性を更に実証するために、ビオチン化ＨＲＰも赤血球の表面にコンジュゲートした。赤血球を内在性ペルオキシダーゼで漂白し、次いでビオチン化ＨＲＰとコンジュゲートした後、ＤＡＢ色素原（３，３’－ジアミノベンジジン）とインキュベートし、続いてＨ＆Ｅ染色した。特徴的な褐色沈殿物の形成により、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）活性を測定した（図３Ｆ）。これはまた、酵素がコンジュゲーション後にもＲＢＣ表面で機能を保有していることを実証する。

本発明者らは更に、ＲＢＣコンジュゲーションアプローチは、さまざまなサイズ及び機能を有するさまざまな異なるタンパク質に転用可能であることを、図３Ｇ～図３Ｈ（抗ＩＬ－８抗体を使用して検出されたヒトＩＬ－８コンジュゲーション）及び図３Ｉ（改変ＲＢＣとの共培養においてアスパラギン依存性Ｓｕｐ－Ｂ１５細胞の効率的な生存率抑制をもたらすＬ－アスパラギナーゼコンジュゲーション）において実証する。注目すべきことに、ＧＦＰの内因性蛍光と、Ｌ－アスパラギナーゼコンジュゲートｈＲＢＣがＳｕｐ－Ｂ１５細胞の生存率及び増殖を減少させる能力とによって実証されるように、コンジュゲートタンパク質は機能を保持することが示される。

酵素によるライゲーションとクリックケミストリーとを介した、大分子のヒト赤血球に対する完全に生体直交型である共有結合による効率的なコンジュゲーション。

ストレプトアビジン法が、大きな分子をヒト赤血球に効率的にコンジュゲートする能力は実証されたが、ストレプトアビジン分子が細菌起源であることを考慮すると、ストレプトアビジン分子そのものが免疫原性を有しており、特定の臨床用途では使用が忌避される。したがって、本発明者らは、銅フリーのクリックケミストリーと酵素によるライゲーションとの組み合わせを利用して、図４Ａに示すように、任意のアジド／ＤＢＣＯタグ付加分子の、ヒト赤血球表面上への完全に生体直交型のコンジュゲーションを実証した。第１の酵素工程の使用により、第１の反応性基（この場合、ＤＢＣＯタグを付加されたペプチド）のヒト赤血球膜に対する生体適合性及び共有結合による導入を、いかなる過酷な化学修飾も必要とせずに可能にする。第２に、銅フリーのクリックケミストリー／ＳＰＡＡＣ（ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ ａｌｋｙｎｅ－ａｚｉｄｅ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）の使用により、相補的反応性官能基（この場合、アジド－抗体）タグを付加された第２のより大きな機能性分子の、ヒト赤血球表面に対するその後のコンジュゲーションを可能にする。プロセス全体は完全に生体適合性であり、免疫原性分子を利用せず、対象とする分子の完全に共有結合によるコンジュゲーションをもたらす。クリックケミストリーの成功を実証するために、ｈＲＢＣにＤＢＣＯタグ付加ペプチド（ＥＫ１８）をコンジュゲートし、続いて、クリックケミストリーによる活性化の際にのみ蛍光を発する蛍光標識アジドプローブであるＣａｌＦｌｕｏｒ ６４７アジドと共にインキュベートした。図４Ｂは、ＤＢＣＯ－ペプチドでライゲート処理した及び未処理のＲＢＣと共にインキュベートしたＣａｌＦｌｕｏｒ ６４７の平均蛍光を示し、ＥＫ１８ペプチドライゲートｈＲＢＣが銅フリーのクリックケミストリー反応を受ける能力を明確に示している。より重要なことに、１００％のｈＲＢＣがＣａｌＦｌｕｏｒ ６４７蛍光に対して陽性であり、全てのｈＲＢＣの効率的なコンジュゲーションを示した。図４Ｃは、全ての対照でｈＲＢＣに対するアジド－ペプチド（ＴＫ３）又はアジド－モノクローナル抗体のいずれかのコンジュゲーションが成功したことを示しており、酵素によるＥＫ１８ペプチドのライゲーションがクリックケミストリーの成功のための前提条件であることを実証する。データはまた、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）コンジュゲーションはペプチドコンジュゲーションよりも僅かに効率が低いことを実証している。この差は、コンジュゲーション工程に使用したモノクローナル抗体はサイズがより大きく、濃度がより低かったことに起因する可能性がある。しかしながら、ＦＡＣＳヒストグラムにおける集団全体のシフトによって示されるように、コピー数の変動にもかかわらず、ＲＢＣの＞９５％がペプチド及びモノクローナル抗体の両方について陽性であったことは注目に値する（図４Ｃ）。クリックケミストリーを介した効率的なモノクローナル抗体コンジュゲーションは、免疫蛍光イメージングによっても実証され、クリックケミストリーが成功したヒト赤血球でのみ、二次抗体により細胞表面で強い蛍光が検出される（図４Ｄ）。図４Ｅは、このデータを、条件毎に単位細胞面積当たりの平均蛍光として更に要約する。このアプローチを他の分子に転用できることを実証するために、本発明者らはまた、ＧＦＰなどの異なるサイズの他のタンパク質もまた、同方法を使用してＲＢＣに対して首尾よくコンジュゲートできることを実証した（図４Ｆ～図４Ｇ）。

実施例６：ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）ライゲーションアプローチは、マウス赤血球（ｍＲＢＣ）に転用可能である。

これまで、全ての実験はヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対して行った。マウス赤血球（ｍＲＢＣ）も同様に修飾され得るかどうかを検証することが求められた。酵素によりＢ－ＴＬ５をライゲートしたマウス赤血球又は対照マウス赤血球のフローサイトメトリー（図５Ａ）及び免疫蛍光イメージング（図５Ｂ）により、コンジュゲーションがマウス赤血球でも成功したことが明らかになった。ＦＡＣＳヒストグラムによって示されるように、９９％を超えるマウス赤血球が首尾よくペプチドをコンジュゲートされた。より重要なことに、このことはまた、ストレプトアビジンによるコンジュゲーションと銅フリーのクリックケミストリーとを含む、上記で実証された拡張アプローチが、マウス赤血球にも適用でき、アプローチの有効性を試験するための前臨床試験をはるかに単純にできることを示す。免疫蛍光画像の解析により、ペプチドライゲートマウス赤血球と未ライゲートマウス赤血球との間で抗ビオチン－ＰＥ蛍光における有意差が示された（図５Ｃ）。共局在解析では、ビオチン化ペプチドライゲートマウス赤血球のピアソンのＲ値は０．８１であり、ヒト赤血球と比較してコンジュゲーションが僅かに低効率であることが明らかになった。これはおそらく、これらの２つの種間で赤血球の膜プロテオームの組成が僅かに異なることに起因する。

異なるペプチドＣ末端モチーフの比較により、ｍＲＢＣが、多様な範囲のＣ末端配列を示すペプチドにより効率的にライゲートされ得ることが明らかになった（図５Ｄ）。しかしながら、この傾向は、おそらくヒトＲＢＣとマウスＲＢＣとでＲＢＣ膜タンパク質の組成に違いがあることに起因して、ｈＲＢＣで見られるものとは異なっている。しかしながら、ペプチド長の比較により、８アミノ酸～２８アミノ酸（ＥＡＡＡＫ反復１～５個）のペプチドでは全てが効率的にライゲーションするという同様の傾向が明らかになった（図５Ｅ）。最も短いペプチド（ＥＡＡＡＫ反復１個、８アミノ酸）で最良の収率が見られ、ライゲーション収率は長さに伴い１３アミノ酸から１８アミノ酸で減少した。興味深いことに、２８アミノ酸ペプチド（ＥＡＡＡＫ反復５個）は、８アミノ酸のＥＡＡＡＫ反復ペプチド１つと同等の収率を有した（図５Ｅ）。

赤血球のコンジュゲーションは効率的であり、汎用性がある。

酵素によるライゲーション効率を確認するために、ヒト赤血球及びマウス赤血球とＢ－ＴＬ５ペプチドとの完全なコンジュゲーションにかかる時間を検証した（図６Ａ）。ヒト赤血球コンジュゲーションは３時間以内に飽和し、＞９０％の効率が９０分以内に達成された。マウス赤血球は、おそらくマウス赤血球上のペプチドのコピー数がより少ないことに起因して、はるかに速くコンジュゲートした（約３０分）。更に、クリックケミストリーを介したこのアプローチの拡張も、効率及び汎用性について評価した。６６μＭのアジド－ペプチド濃度又は３時間という短いインキュベーション時間であっても、条件範囲全体で、クリックケミストリーの成功による１００％のヒト赤血球のコンジュゲーションが観察された（図６Ｂ）。しかしながら、最適なコンジュゲーションは、約２５０μＭのペプチド濃度で、１２時間までのインキュベーション時間で観察された。図６Ｃはまた、官能基の配置を切り替えた（ヒト赤血球にアジド－ペプチドをライゲート、続いてＤＢＣＯタグ付加ペプチドとインキュベーション）コンジュゲーションの可能性を実証する。銅フリーのクリックケミストリーを用い、酵素によるライゲーションを利用するコンビナトリアルアプローチの汎用性を示す。

ライゲーションプロトコルは生体適合性であり、インビボで安定かつ機能的なコンジュゲーションをもたらす。

この方法の生体適合性を試験するために、アポトーシスの誘導を表し得るＰＳの存在を検査するアネキシンＶを使用して、ビオチン化ペプチドライゲート後又は未修飾のヒト赤血球及びマウス赤血球を解析した。図７Ａに示すように、Ｂ－ペプチドライゲート赤血球は、未修飾赤血球と比較してアネキシンＶの結合の増加を示さず、この方法が穏やかで生体適合性であることが確認された。更に、本発明者らは、インビボで改変マウス赤血球の安定性を実証した。この目的のために、Ｂ－ＴＬ５ペプチドコンジュゲートマウス赤血球又は対照マウス赤血球をＣＦＳＥで標識し、マウスに尾静脈注射した。２４時間にわたって一定間隔で顎下静脈から採血した。細胞をストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で染色して、マウス赤血球表面のビオチンを検出した。図７Ｂの散布図によって示されるように、改変マウス赤血球は、未修飾（対照）マウス赤血球（ＣＦＳＥ蛍光を使用して検出される）と同様に血液中に保持された。更に、コンジュゲートペプチドのＮ末端ビオチンタグは、実験期間中安定なままであった（図７Ｃ）。図７Ｄはまた、ＰＢＳ又はＢ－ＴＬ５ペプチドライゲート又は未ライゲートのＣＦＳＥ染色後マウス赤血球を注射したマウスから２４時間の時点で採取した血液塗抹標本の、代表的な免疫蛍光画像を示す。改変赤血球の性質がインビボで安定なものであることが確認される。免疫不全のＮＳＧ－ＳＧＭ３又は免疫能力のあるＣ５７ＢＬ／６マウスでも、３９日間にわたって同じ実験を行った（図８Ａ）。図８Ｂの散布図によって示されるように、改変ｍＲＢＣは、両方のマウスモデルにおいて、未修飾（対照）ｍＲＢＣ（ＣＦＳＥ蛍光を使用して検出される）と同様に血液中に保持された。注目すべきことに、本発明者らは、改変ＲＢＣの約５０％が注射の２１日後まで循環血中に残存していることを検出することができた。更に、コンジュゲートペプチドのＮ末端ビオチンタグは、実験期間中ほとんど安定のまま維持されたが（図８Ｃ）、本発明者らは、血清プロテアーゼへの長期曝露後に表面ペプチドの分解に起因し得るシグナルの漸減を観察している。これにもかかわらず、本発明者らは、注射の３週間後にも元のライゲート産物の最大５０％を尚も検出することができる。

実施例７：赤血球膜タンパク質と赤血球由来細胞外小胞との比較
本発明者らは、以前に、ＬＦＱ－質量分析とビオチンプルダウン実験とを併用して、ＯａＡＥＰ１リガーゼによってビオチン化ペプチドがライゲートされたＲＢＣＥＶの候補タンパク質のリストを同定した（図１２を参照）（Pham et al, Journal of Extracellular Vesicles, 2021から入手）。これらの候補タンパク質を全ＲＢＣＥＶタンパク質の別個の質量分析と比較することにより、候補タンパク質のうちの３つ（相対存在度で３３位、１１９位及び５７位にランク付けされるＡＣＫＲ１、ＩＣＡＭ４及びＦ１１Ｒ）が、他の全てのＲＢＣＥＶタンパク質と比較してＲＢＣＥＶにおいて高度に豊富に含まれていることが明らかになった（ＬＦＱ（ラベルフリー定量）強度に基づいて計算された相対存在度）。

このデータと既存のＲＢＣ膜プロテオーム研究との相互比較により（図１３を参照）、ＲＢＣでは、これらのタンパク質の相対存在度が非常に低い（全て４９０未満）ことが実証される（Relative abundance obtained from ‘Quantitative analysis of human red blood cell proteome; Authors: Agata Bryk and Jacek R. Wisniewski (Biochemical Proteomics Group, Department of Proteomics and Signal Transduction, Max-Planck-Institute of Biochemistry, Am Klopferspitz 18, 82152 Martinsried, Germany））。更に、コピー数の比較により、ＲＢＣＥＶと同じタンパク質がライゲートされた場合、ＲＢＣのペプチドのコピー数が非常に少なくなることが実証され、ライゲーションアプローチがＲＢＣには効率的に応用できない可能性があることが示唆される。

これは、１００，０００をはるかに超えるコピーを示す本発明者らのライゲーションデータとは対照的である。このことは、ＲＢＣとＲＢＣＥＶとで異なるタンパク質がライゲートされることを示している。この差異は、フリッパーゼ及びトランスロカーゼに起因する膜のフリッピング、又はライゲーションを遮断するグリコシル化などの他の修飾のいずれかによる、小胞化中の膜タンパク質組成の変化に起因する可能性が最も高い。

実施例７：ソルターゼ及びＯａＡＥＰ１リガーゼのライゲーション効率の比較
本発明者らは、ソルターゼ及びＯａＡＥＰ１リガーゼのライゲーション効率を比較した。本発明者らは、ソルターゼが、シングル工程法（脱グリコシル化ＲＢＣによるものを含む）において、又は両方のライゲーション工程（リンカーをＲＢＣにライゲーションすることと、抗体をリンカーにライゲートすることとの両方）においてソルターゼを使用する二工程ライゲーションの使用において、シングルドメイン抗体のライゲーションを触媒できないことを見出した。本発明者らが上記のＯａＡＥＰ１リガーゼを使用して達成した顕著な効率とは対照的に、これらの方法ではライゲーションは本質的に０％であった。

更に調査するために、本発明者らは、適切なモチーフを有するペプチドをヒトＲＢＣに対してライゲートするソルターゼの能力を調査した。

以下のペプチドをｈＲＢＣと共に室温で一晩インキュベートした。

図１４に示すように、ソルターゼは適切なペプチドをｈＲＢＣに対してライゲーションすることができるが、そのライゲーション収率はＯａＡＥＰ１リガーゼと比較してはるかに低い。－ＬＰＥＴＧＧ又は－ＬＰＥＴＧＧＧ（ソルターゼＡの最適なＣ末端モチーフ）を－ＮＧＬ又は－ＮＤＬ（ＯａＡＥＰ１の最適なＣ末端モチーフ）と比較した場合、ソルターゼのライゲーション収率は、それぞれ５倍及び１０倍低い。

参考文献
本発明及び本発明が関係する現在の技術をより十分に説明及び開示するために、いくつかの刊行物を上記に引用している。これらの参考文献についての完全な引用を以下に提供する。これらの参考文献の各々の全体は、本明細書に組み込まれる。

標準的な分子生物学技術については、Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。

配列番号１： ＡＧ２０
配列番号２： ペプチド
配列番号３： ペプチド
配列番号４： ペプチドリンカー
配列番号５： ペプチドリンカー
配列番号６： ペプチドリンカー
配列番号７： Ｂ－ＥＫ１５－ＬＰＥＴＧＧ
配列番号８： Ｂ－ＥＫ１５－ＬＰＥＴＧＧＧ
配列番号９： Ｂ－ＥＫ１５－ＮＤＬ
配列番号１０： ＥＫ１８
配列番号１１： ペプチドリンカー
配列番号１２： ペプチドリンカー
配列番号１３： ＧＧ２０
配列番号１４： ＥＬ１７
配列番号１５： ＧＡ２０
配列番号１６： ＧＧ３９
配列番号１７： ＧＮ２０
配列番号１８： ＧＬ１７
配列番号１９： ＧＫ２５
配列番号２０： Ｂ－ＧＧ８
配列番号２１： ＴＬ２０
配列番号２２： ＧＬ２９
配列番号２３： ペプチドリンカー
配列番号２４： ペプチドリンカー
配列番号２５： ペプチドリンカー
配列番号２６： ペプチドリンカー
配列番号２７： ペプチドリンカー、３位のＸａａは任意の天然アミノ酸であり得る
配列番号２８： ペプチドリンカー、３位のＸａａは任意の天然アミノ酸であり得る
配列番号２９： ペプチドリンカー
配列番号３０： ペプチドリンカー
配列番号３１： ＴＬ５

Claims (31)

1. （ａ）ペプチドを赤血球（ＲＢＣ）に対してライゲーションさせてＲＢＣ－ペプチドコンジュゲートを形成させるのに適した条件下で十分な時間にわたって、リガーゼの存在下で前記ＲＢＣを前記ペプチドと接触させることを含み、
   前記ペプチドがＣ末端リガーゼ認識配列を含む、方法。
2. 前記リガーゼがＯａＡＥＰ１リガーゼ、好ましくはＯａＡＥＰ１－Ｃｙｓ２４７Ａｌａである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ペプチドがエフェクター分子である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記エフェクター分子が、ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ又はＮＧ、好ましくはＮＧＬ、ＮＰＬ又はＮＤＬから選択されるＣ末端リガーゼ認識配列を有する、請求項３に記載の方法。
5. 前記ペプチドがリンカーペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
6. 前記リンカーペプチドが、Ｃ末端リガーゼ認識配列と、エフェクター分子に対してコンジュゲートさせるためのモチーフとを含み、別の分子に対してコンジュゲートさせるための前記モチーフが、Ｎ末端リガーゼ認識配列、クリックケミストリー官能基、又はビオチン部分である、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＲＢＣ－ペプチドコンジュゲートが、ＲＢＣ－リンカーペプチドコンジュゲートであり、前記方法が、
   （ｂ）エフェクター分子を前記ＲＢＣ－リンカーペプチドに対してコンジュゲートさせて、ＲＢＣ－リンカー－エフェクター分子コンジュゲートを形成させるのに適した条件下で十分な時間にわたって、前記ＲＢＣ－リンカーペプチドコンジュゲートを前記エフェクター分子と接触させることを更に含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記リンカーペプチドがＮ末端リガーゼ認識配列を含み、前記Ｃ末端リガーゼ認識配列がＸａａ_１ＧＧであり、Ｘａａ_１が、Ｇ以外の任意のアミノ酸であるか、又は配列ＮＧ若しくはＮＣＬを有する、請求項７に記載の方法。
9. 前記Ｎ末端リガーゼ認識配列が、Ｇ、ＧＧ、ＧＬ、ＧＧＧ、ＧＬＧ又はＧＧＬである、請求項８に記載の方法。
10. 前記エフェクター分子が、ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ又はＮＧ、好ましくはＮＧＬ、ＮＰＬ又はＮＤＬからなる群から選択されるＣ末端リガーゼ認識配列を含む、請求項８又は請求項９に記載の方法。
11. 前記エフェクター分子を前記ＲＢＣ－リンカーペプチドに対してライゲーションさせて、ＲＢＣ－リンカー－エフェクター分子コンジュゲートを形成させるのに適した条件下で十分な時間にわたって、前記ＲＢＣ－リンカーペプチドコンジュゲートを前記エフェクター分子と接触させる、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 工程（ａ）の前記リガーゼが、工程（ｂ）の前記リガーゼと同じであり、好ましくはＯａＡＥＰ１リガーゼ、より好ましくはＯａＡＥＰ１－Ｃｙｓ２４７Ａｌａである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記リンカーが、クリックケミストリー官能基と、ＮＧＬ、ＮＤＬ、ＮＰＬ、ＮＡＬ、ＮＣＬ、ＮＥＬ、ＮＦＬ、ＮＨＬ、ＮＫＬ、ＮＩＬ、ＮＬＬ、ＮＱＬ、ＮＲＬ、ＮＳＬ、ＮＴＬ、ＮＶＬ、ＮＷＬ、ＮＹＬ、ＮＳＬＤ、ＮＳＬＡＮ又はＮＧ、好ましくはＮＧＬ、ＮＰＬ又はＮＤＬからなる群から選択されるＣ末端リガーゼ認識配列とを含む、請求項６に記載の方法。
14. 前記クリックケミストリー官能基が、アジド部分、テトラジン部分、メチルテトラジン部分、ジアリールサイトオクチン（ｄｉａｒｙｌｃｙｔｏｏｃｔｙｎｅ）（ＤＢＣＯ）部分又はトランスシクロオクチン（ＴＣＯ）部分を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記エフェクター分子が相補的なクリックケミストリー官能基を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 銅フリーのクリックケミストリーによって前記エフェクター分子を前記ＲＢＣ－リンカーコンジュゲートに対してコンジュゲートさせるのに適した条件下で、十分な時間にわたって、前記ＲＢＣ－リンカーコンジュゲートを前記エフェクター分子と接触させる、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記ＲＢＣ－ペプチドコンジュゲートがＲＢＣ－リンカーコンジュゲートであり、前記リンカーがビオチン部分を含み、前記方法が、
    （ｂ）前記ＲＢＣ－リンカーペプチドの前記ビオチン部分をストレプトアビジンに対してコンジュゲートさせてＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジンコンジュゲートを形成させるのに適した条件下で十分な時間にわたって、前記ＲＢＣ－リンカーペプチドコンジュゲートをストレプトアビジンと接触させることと、
    （ｃ）エフェクター分子のビオチン部分を前記ＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジンコンジュゲートの前記ストレプトアビジンに対してコンジュゲートさせてＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジン－エフェクター分子コンジュゲートを形成させるのに適した条件下で十分な時間にわたって、前記ＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジンコンジュゲートを前記ビオチン化エフェクター分子と接触させることと
    を更に含む、請求項６に記載の方法。
18. 前記ＲＢＣ－ペプチドコンジュゲート、前記ＲＢＣ－リンカー－エフェクター分子コンジュゲート又は前記ＲＢＣ－リンカー－ストレプトアビジン－エフェクター分子コンジュゲートを洗浄することを更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記リンカーペプチドがリンカー本体配列を含み、前記リンカー本体配列が、
    （ａ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のアミノ酸を含むか若しくはそれからなる、
    （ｂ）αヘリックスペプチド配列を含む、
    （ｃ）配列ＥＡＡＡＫの反復を含む、又は
    （ｄ）配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを含む、
    請求項５～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記リンカーが、下記からなる群から選択される配列からなる、請求項１９に記載の方法。
    ＧＬＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＬＰＥＴＧＧ；
    ＤＢＣＯ－ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＮＧＬ；
    アジド－ＧＳＳＧＳＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＧＳＧＧＳＧＳＧＮＧＬ；
    ＧＬＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＬＰＥＴＧＧ；
    ＧＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＬＰＥＴＧＧ；
    ＧＬＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＮＧＬ；
    ＧＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＮＧＬ；及び
    ＧＬＧ（ＥＡＡＡＫ）５ＬＰＥＴＧＧ。
21. 前記ＲＢＣが脱グリコシル化される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法によって産生される、修飾赤血球（ＲＢＣ）。
23. 修飾されたＲＢＣであって、前記ＲＢＣの外表面上にペプチドを含み、前記ペプチドが天然の赤血球タンパク質に対してコンジュゲートされている、修飾ＲＢＣ。
24. 前記ペプチドがエフェクター分子である、請求項２３に記載の修飾ＲＢＣ。
25. 前記ペプチドがリンカータンパク質である、請求項２３に記載の修飾ＲＢＣ。
26. 前記リンカータンパク質がエフェクター分子に対して更にコンジュゲートされている、請求項２５に記載の修飾ＲＢＣ。
27. 前記ＲＢＣが脱グリコシル化されている、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の修飾ＲＢＣ。
28. 請求項２２～２７のいずれか一項に記載の修飾ＲＢＣを、それを必要とする個体に投与することを含む、治療方法。
29. 治療方法における使用のための、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の修飾ＲＢＣ。
30. 治療に使用する医薬品の製造における、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の修飾ＲＢＣの使用。
31. 前記治療が、酵素欠損症、代謝疾患、免疫関連障害、血液疾患、又はがんの治療である、請求項２８、２９又は３０に記載の治療方法、使用するための修飾ＲＢＣ、又は修飾ＲＢＣの使用。