KR20230009409A - 피브리노겐 단편 및 라미닌 단편을 포함하는 융합단백질 및 그 이용 - Google Patents

피브리노겐 단편 및 라미닌 단편을 포함하는 융합단백질 및 그 이용 Download PDF

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기요토시 세키구치
마모루 다키자와
유키마사 다니구치
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오사카 유니버시티
매트릭솜, 인크.
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Abstract

본 발명은 트롬빈 처리에 의해 피브리노겐에 결합할 수 있는 피브리노겐 단편과 인테그린 결합활성을 갖는 라미닌 단편을 포함하고, 또한 성장인자 결합활성을 갖는 단백질을 포함할 수 있는 융합단백질의 트롬빈 처리 분자와 피브린으로 형성된 겔을 제공한다. 본 발명의 겔은, 기저막 활성을 구비하고 의료에 응용 가능한 겔 기재로서 적합하게 사용될 수 있다.

Description

피브리노겐 단편 및 라미닌 단편을 포함하는 융합단백질 및 그 이용
본 발명은 피브리노겐 단편 및 라미닌 단편을 포함하는 융합단백질(chimeric protein, fusion protein) 및 그 이용에 관한 것이다.
여러 장기(臟器)로부터 꺼낸 세포를 배양할 때, 배양기에 부착하여 지지체(scaffold)를 확보할 수 없는 세포는 증식할 수 없고, 세포예정사(programmed cell death)가 작동되어 스스로 사멸한다. 이 현상은 장기의 세포에도 적용되는 보편적인 속성이며 「세포의 부착의존성(anchorage dependency)」이라 불린다. 생체내에서 세포가 지지체로 하는 것은 세포 주위에 구축되는 「세포외 기질(extracellular matrix)」이라 불리는 구조물이다. 세포외 기질를 구성하는 단백질은 300개 이상이 알려져 있으며, 세포별로 지지체로서 사용하는 세포외 기질의 분자조성은 다르다. 생체로부터 꺼낸 세포, 특히 줄기세포를 배양하기 위해서는, 그 세포가 생체 내에서 어떠한 분자 조성의 세포외 기질를 지지체로 하고 있는지를 고려하여 배양기재를 선택할 필요가 있다.
세포외 기질는 그 형태와 생체내 존재부위에 따라 기저막(basement membrane)과 간질(interstitium)로 분류된다. 기저막은 상피와 결합조직의 경계에 형성되고 두께 100nm 정도의 시트상 세포외 기질로, 다양한 장기의 실질세포(parenchymal cell)와 그 줄기세포가 항상성과 증식능력을 유지하는데 필요한 지지체 역할을 담당한다. 그 때문에, 장기로부터 꺼낸 세포, 특히 줄기세포를 배양할 때에는, 그 줄기세포가 생체 내에서 지지체로 하고 있는 기저막을 모방한 배양기재를 지지체으로서 사용하는 것이 바람직하다.
지금까지, 기저막에 국소적으로 존재하는 40개 이상의 단백질이 알려져 있다(비특허문헌 1). 그 중에서도 IV형 콜라겐, 라미닌 및 퍼레칸(perlecan) 등의 헤파란 황산 프로테오글리칸은, 세포나 장기의 종류에 관계없이, 어떠한 기저막에도 포함되는 구성적(constitutive) 성분이며, 기저막의 구축과 기능 발현에 필수불가결한 역할을 담당하고 있다. 이들 구성적 기저막 분자는, 조사된 바로는, 모든 후생동물에서 존재가 확인되고 진화적으로 잘 보존된 단백질이다.
Ⅳ형 콜라겐은 기저막에 국소적으로 존재하는 대표적인 콜라겐으로, 자가결합(self-association)하여 망상구조를 형성한다. 라미닌은 기저막의 지지체 활성을 담당하는 접착단백질이며, 세포 표면의 인테그린과 결합하여 기저막에 세포의 접착을 매개하는 역할을 한다. 퍼레칸은 기저막에 포함되는 대표적인 헤파란 황산 프로테오글리칸이며, D1 도메인에 부가된 헤파란 황산 사슬을 통해 다양한 성장인자를 결합하고 성장인자의 작용을 제어하는 역할을 담당한다. 헤파란 황산은 헤파린과 구조적으로나 기능적으로 유사한 산성 당사슬 분자이며, 기본섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), activin A, 골형성단백질(bone morphogenetic protein, BMP), Wnt 등 다양한 성장인자와 결합하는 것으로 알려져 있다. 기저막을 모방한 배양기재를 제조하기 위해서는, 기저막의 접착 활성을 담당하는 라미닌뿐만 아니라, 기저막의 구조적 또는 기능적 특성을 담당하는 다른 기저막 구성 분자를 조합하는 것이 중요하다. 본 발명자들은, 라미닌의 인테그린 결합 부위와 퍼레칸의 D1 도메인을 연결한 융합단백질을 제작하고(특허문헌 1), 이것이 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)의 분화 유도용 기재로서 유용함을 발견하였다.
종래, 기저막을 모방한 배양기재로는, 마우스 Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) 육종(sarcoma)의 조추출물(粗抽出物, rough extract)이 널리 사용되어 왔다. EHS육종은 기저막 구성분자를 과잉 생산하는 특수한 종양이며, 마우스 초기 배아의 벽측 내배엽(parietal endoderm)에서 유래하는 것으로 알려져 있다. EHS 육종의 추출물은 매트리겔(Matrigel, 상표)의 명칭으로 제품화되어 있으며, 기저막의 생리 활성을 모방한 배양기재로서 지금까지 다양한 세포의 배양에 이용되고있다. 매트리겔의 약 60%는 라미닌-111(1β1γ1)이고, 나머지는 IV형 콜라겐, 퍼레칸, 엔탁틴(니도겐)이다. 매트리겔에는 종양성장인자(transforming growth factor, TGF-β), 인슐린유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF)-1, 혈소판유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF) 등의 성장인자도 미량 포함되어 있다.
매트리겔은 22℃∼35℃로 열을 가하면 겔화하기 때문에, 세포를 포매(embedding, 包埋)하여 배양함으로써, 3차원 배양기재로서 적합하게 사용할 수 있다. 세포의 3차원 배양에는, 콜라겐겔이나 피브린겔도 이용되고 있지만, 생체로부터 꺼낸 장기 줄기세포나 다분화능 줄기세포로부터 분화유도한 장기 줄기세포의 배양에 있어서는, 매트리겔을 3차원 배양기재로서 사용한 예가 다수 보고되고 있다. 특히, 복수의 세포를 조합하여 오가노이드라고 불리는 3차원 장기 모델을 제작하는 경우에는, 대부분이 매트리겔을 3차원 배양기재로서 사용하고 있다.
매트리겔은 생체로부터 꺼낸 줄기세포의 3차원 배양기재로서 매우 유용하지만, 배양한 세포나 세포집합체(cell aggregation)를 의료에 응용하는 경우에는, 이하와 같은 문제점이 남아 있다. 첫째, 매트리겔은 마우스 종양의 조추출물이고, 이 것을 사용하여 배양된 세포는 마우스 유래 단백질의 혼입을 피할 수 없다. 둘째, 매트리겔의 화학 조성은 로트마다 편차가 있는 것으로 알려져 있고, 화학조성을 표준화하는 것이 곤란하다. 셋째, 매트리겔에 포함된 라미닌 아이소폼이 라미닌-111로 제한된다는 것이다. 라미닌에는 12종류 이상의 아이소폼이 존재하고, 지지체로서 유효한 라미닌은 세포마다 달라진다. 라미닌-111은 인간 iPS 세포를 간줄기세포로 분화유도할 때는 유효한 지지체이지만(특허문헌 2), 혈관내피세포로의 분화유도에는 라미닌-411이 유효하고(특허문헌 3), 각막상피세포로의 분화유도에는 라미닌-332가 유효한 것으로 보고되어 있다(비특허문헌 2). 그러나, 매트리겔에 함유된 라미닌 아이소폼을 임의로 변형시키는 것은 기술적으로 어렵다.
이러한 기술적 배경에 기초하여, 매트리겔을 대체하는 3차원 겔기재의 개발이 장기 줄기세포를 이용한 의료나 신약개발 분야에서 많이 요구되고 있다.
[특허문헌]
[특허문헌 1] WO2012/137970
[특허문헌 2] WO2014/168157
[특허문헌 3] 일본특허공개 2019-141086
[비특허문헌]
[비특허문헌 1] Manabe R, et al. Transcriptome-based systematic identification of extracellular matrix proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 12849-12854, 2008.
[비특허문헌 2] Shibata S, et al. Cell-type-specific adhesiveness and proliferation propensity on laminin isoforms enable purification of iPSC-derived corneal epithelium. Stem Cell Reports, 14: 663-676, 2020.
본 발명은, 기저막의 활성을 구비하고, 의료에 응용 가능한 겔기재의 제공을 과제로 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해 이하의 각 발명을 포함한다.
[1] 트롬빈 처리에 의해, 피브리노겐에 결합할 수 있는 피브리노겐 단편과, 인테그린 결합활성을 갖는 라미닌 단편을 포함하는, 융합단백질.
[2] 상기 [1]에 있어서, 추가로 성장인자 결합활성을 갖는 단백질을 포함하는 융합단백질.
[3] 상기 [2]에 있어서, 성장인자 결합활성을 갖는 단백질이 헤파란 황산 프로테오글리칸인 융합단백질.
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 융합단백질의 트롬빈 처리 분자와 피브린으로 형성된 겔.
[5] 상기 [4]에 기재된 겔의 제조방법에 있어서, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 융합단백질, 피브리노겐 및 트롬빈의 혼화물을 제조하는 공정을 포함하는 제조방법.
[6] 상기 [5]에 있어서, 상기 혼화물 중의 융합단백질과 피브리노겐의 몰비가 1:5 내지 1:20,000인 제조방법.
[7] 상기 [1] 내지 [3]에 기재된 융합단백질과 피브리노겐을 포함하는 겔 제조용 조성물.
[8] 상기 [4]에 기재된 겔을 제조하기 위한 키트에 있어서, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 융합단백질, 피브리노겐 및 트롬빈을 포함하는 키트.
[9] 상기 [4]에 기재된 겔을 이용한 세포 또는 조직절편의 3차원 배양 방법.
[10] 상기 [9]에 기재된 3차원 배양 방법을 이용하여, 이식 의료용 세포 또는 오가노이드를 제조하는 방법.
본 발명에 의하면, 기저막의 활성을 구비하고 의료에 응용 가능한 겔 기재를 제공할 수 있다. 본 발명의 겔 기재는 세포나 조직절편의 3차원 배양에 사용할 수 있고, 매트리겔을 대체할 수 있다.
[도 1] (A)는 인간 라미닌 5β1γ1E8(LM511E8)의 분자구조, (B)는 인간 피브리노겐(Fibrinogen)의 분자구조, (C)는 인간 피브리노겐과 인간 라미닌 5β1γ1의 인테그린 결합영역의 융합단백질(Chimera-511)의 분자구조를 나타내는 도면이다.
[도 2] 도 2는 정제한 LM511E8 및 Chimera-511을 SDS-PAGE에 넣어 분석한 결과를 나타내는 그림으로, 왼쪽이 비환원 조건에서의 결과, 오른쪽이 환원 조건에서의 결과이다.
[도 3] LM511E8 및 Chimera-511의 인테그린 결합분석(binding assay)의 결과를 나타낸다.
[도 4] 트롬빈 처리된 LM511E8 및 Chimera-511의 피브리노겐 결합분석의 결과를 나타낸다.
[도 5] Chimera-511을 조합한 피브린겔을 이용한 인간 iPS 세포의 포매배양에 있어서, 배지에 트라넥삼산을 첨가한 경우(상단)와, 첨가하지 않는 경우(하단)를 비교한 결과를 나타내는 그림이고, 배양 7일째의 대표적인 웰의 관찰 이미지를 나타내는 도면이다.
[도 6] Chimera-511을 조합한 피브린겔을 이용한 인간 iPS 세포의 포매배양에 있어서, Chimera-511의 첨가 농도 의존성을 검토한 결과를 나타내는 그림으로, 각 농도에서 배양 7일째의 대표적인 웰의 관찰 이미지를 나타내는 도면이다.
[도 7] Chimera-511을 조합한 피브린겔을 이용한 인간 iPS 세포의 포매배양에 있어서, Chimera-511의 첨가 농도 의존성을 검토한 결과를 나타내는 그림으로, 배양 8일째에 각 웰로부터 회수된 총세포수, 살아있는 세포수, 죽은 세포수 및 생존율을 나타내는 도면이다.
[도 8] Chimera-511을 조합한 피브린겔을 이용한 인간 iPS 세포의 포매배양에 있어서, Chimera-511의 최종 농도를 50nM로 하고, 배양 8일째까지의 경시 변화를 관찰한 결과를 나타내는 그림으로, 각 관찰 일자의 대표적인 웰의 관찰 이미지를 나타내는 그림이다(상단). 하단은 Chimera-511을 첨가하지 않은 피브린겔을 사용하여 인간 iPS 세포를 배양한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 9] 피브린겔을 이용한 인간 iPS 세포의 포매배양에 있어서, 최종 농도 50nM의 Chimera-511을 첨가한 피브린겔을 이용한 경우(A)와, 최종 농도 100nM의 LM511E8을 첨가한 피브린겔을 이용한 경우(B)를 비교한 결과를 나타내는 그림으로, 두 군에서 배양 8일째의 대표적인 웰의 관찰 이미지를 나타내는 도면이다.
[도 10] Chimera-511을 조합한 피브린겔을 이용한 세포배양후의 인간 iPS 세포의 미분화성을 검토한 결과를 나타내는 그림으로, 배양 7일째의 세포를 회수하여 미분화 마커를 항체로 염색하고, 유동세포계측법(flow cytometric analysis) 분석한 결과이다. (A)는 SSEA4의 결과, (B)는 OCT3/4의 결과, (C)는 rBC2LCN의 결과, 각 상단은 대조로서 사용하여 2차원 유지배양한 인간 iPS 세포의 결과, 각 하단은 피브린겔을 사용하여 3차원 포매배양한 인간 iPS 세포의 결과이다.
[도 11] Chimera-511P의 인테그린 결합분석의 결과를 나타낸다.
[도 12] 트롬빈 처리된 Chimera-511P의 피브리노겐 결합분석의 결과를 나타낸다.
[도 13] 피브린겔을 이용한 인간 iPS 세포의 포매배양에 있어서, (A)무첨가의 피브린겔(Fibrin only)을 사용하여 세포를 배양한 경우와, (B)최종농도 50 nM의 Chimera-511P를 첨가한 피브린겔을 이용하여 세포를 배양한 경우를 비교한 결과를 나타내는 도면이다. 배양 8일째에 대표적인 웰의 관찰 이미지를 나타내는 도면이다. 왼쪽은 웰의 이미지이고 오른쪽은 왼쪽 프레임의 확대 이미지이다.
[도 14] 배양 상청 중의 융합단백질의 발현을, 비환원조건의 SDS-PAGE 및 His태그 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 15] 정제된 (A) Chimera-111, (B) Chimera-221, (C) Chimera-332, (D) Chimera-411, (E) Chimera-421을 각각 SDS-PAGE에 넣어 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 왼쪽은 비환원조건에서의 결과, 우측은 환원조건에서의 결과이다.
[도 16] 트롬빈 처리된 (A) Chimera-111, (B) Chimera-221, (C) Chimera-332, (D) Chimera-421의 피브리노겐 결합분석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 17] 트롬빈 처리된 (A) Chimera-111, (B) Chimera-221, (C) Chimera-332, (D) Chimera-421을 피브리노겐에 결합시키고, 결합된 각 융합단백질에 대해 인테그린 결합분석을 실시한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 18] 배양 상청 중의 퍼레칸 첨가형의 융합단백질의 발현을, 비환원 조건의 SDS-PAGE와 His태그 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 19] 정제된 (A) Chimera-111P, (B) Chimera-221P, (C) Chimera-332P, (D) Chimera-421P, (E) Chimera-511P를 각각 SDS-PAGE에 넣어 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 왼쪽은 비환원 조건에서의 결과, 우측은 환원 조건에서의 결과이다.
[도 20] 트롬빈 처리된 (A) Chimera-111P, (B) Chimera-221P, (C) Chimera-332P, (D) Chimera-421P를 피브리노겐에 결합시키고 결합된 각 융합단백질에 대해 인테그린 결합분석을 실시한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 21] 정제된 (A) Chimera-111P, (B) Chimera-221P, (C) Chimera-332P, (D) Chimera-421P, (E) Chimera-511P의 프로액티빈 A의 결합분석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 22] 배양 상청 중의 융합단백질(Combination-1, Combination-2, Combination-3)의 발현을, 비환원 조건의 SDS-PAGE와 His태그 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[융합단백질]
본 발명은 피브리노겐 단편 및 라미닌 단편을 포함하는 융합단백질을 제공한다(이하, 「본 발명의 융합단백질」이라 한다). 피브리노겐 단편은 트롬빈 처리에 의해 피브리노겐에 결합할 수 있는 피브리노겐 단편이면 되고, 라미닌 단편은 인테그린 결합활성을 갖는 라미닌 단편이면 된다. 즉, 본 발명의 융합단백질은 트롬빈 처리에 의해 피브리노겐에 결합할 수 있는 능력과 인테그린 결합활성을 겸비하는 융합단백질이다. 본 발명의 융합단백질은, 추가로 기타 단백질 또는 기타 단백질의 기능 도메인(functional domain)을 포함하는 융합단백질일 수 있다. 기타 단백질은 성장인자 결합활성을 갖는 단백질을 포함하는 융합단백질이면 된다.
피브리노겐은 혈액 응고반응의 최종 단계에서 트롬빈의 작용에 의해 피브린으로 변화하고, 혈액 응고, 지혈, 혈전 형성, 상처 치유, 염증, 혈관신생(angiogenesis), 세포와 세포외 기질 간의 상호작용 등에 관여하는 당단백질이다. 피브리노겐은 Aα사슬, Bβ사슬 및 γ사슬의 3개의 서브유닛사슬이 코일드 코일(coiled-coil) 구조로 결합한 헤테로 삼량체 분자로, 이 헤테로 삼량체 2분자가 N-말단측에서 결합한 육량체(Aα- Bβ-γ)2를 기본 구조로 하고 있다. Aα사슬, Bβ사슬, γ사슬의 질량수는 각각 67kDa, 56kDa, 47.5kDa이고, 육량체(Aα-Bβ-γ)2의 질량수는 340kDa이다. 피브리노겐은 트롬빈에 의해 Aα사슬의 Arg16과 Gly17 사이 및 Bβ사슬의 Arg14와 Gly15 사이가 절단되어 각각 A knob 및 B knob을 생성되어, 피브린 단량체로 전환한다. A knob 및 B knob은 각각 피브리노겐(피브린)의 γ사슬 C-말단영역의 a-hole 및 β사슬 C-말단영역의 b-hole에 결합한다. 따라서, 트롬빈 처리에 의해 피브리노겐에 결합할 수 있는 피브리노겐 단편은, 피브리노겐의 N-말단의 A knob 및 B knob을 포함하고, Aα-Bβ-γ의 헤테로 삼량체를 형성하는 단편이다.
라미닌은 기저막의 주요한 세포접착 분자이며, α사슬, β사슬 및 γ사슬의 3개의 서브유닛사슬로 이루어지는 헤테로 삼량체로, 분자량이 약 80만인 거대한 당단백질이다. 3개의 서브유닛 사슬은 C-말단측에서 결합되어 코일드 코일 구조를 형성하고, 디설파이드 결합에 의해 안정화된 헤테로 삼량체 분자를 형성한다. α사슬는 α1∼α5의 5종류, β사슬는 β1∼β3의 3종류, γ사슬는 γ1∼γ3의 3종류가 알려져 있고, 이들의 조합으로 적어도 12종류 이상의 아이소폼이 존재한다(표 1 참조). 본 발명의 융합단백질을 구성하는 라미닌 단편은 임의의 아이소폼일 수 있다. 즉, 본 발명의 융합단백질을 구성하는 라미닌은, α1∼α5로부터 선택되는 1종의 α사슬, β1∼β3으로부터 선택되는 1종의 β사슬, γ1∼γ3으로부터 선택되는 1종의 γ 사슬로 이루어진 것이면 된다. 구체적으로는, 표 1에 기재된 12종류, 및 이들 이외의 모든 아이소폼을 적합하게 사용할 수 있다.
α사슬 삼량체 조성
α1 α1β1γ1 (laminin-111)
α1β2γ1 (laminin-121)
α2 α2β1γ1 (laminin-211)
α2β2γ1 (laminin-221)
α2β1γ3 (laminin-213)
α3 α3β3γ2 (laminin-332)
α3β1γ1 (laminin-311)
α3β2γ1 (laminin-321)
α4 α4β1γ1 (laminin-411)
α4β2γ1 (laminin-421)
α5 α5β1γ1 (laminin-511)
α5β2γ1 (laminin-521)
라미닌의 인테그린 결합활성의 발현에는, 적어도 α사슬 C-말단측의 3개의 구형 도메인(LG1-3)과 γ사슬 C-말단영역이 관여한다는 것이, 본 발명자들에 의해 해명되어 있다. 따라서, 인테그린 결합활성을 갖는 라미닌 단편은 라미닌의 α사슬 C-말단측의 LG1-3과 γ사슬 C-말단영역을 포함하는 단편이며, 이들이 β사슬의 C-말단영역과 함께 헤테로 삼량체를 형성하는 라미닌 단편인 것이 바람직하다.
본 발명의 융합단백질은 성장인자 결합활성을 갖는 단백질을 포함하는 것이면 된다. 성장인자 결합활성을 갖는 단백질은, 세포증식에 관여하는 성장인자와 결합할 수 있는 단백질이면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 성장인자 결합활성을 갖는 단백질로는, 예를 들면 헤파란 황산 프로테오글리칸이 있다. 헤파란 황산 프로테오글리칸으로는, 예를 들면 퍼레칸, 아그린, XVIII형 콜라겐, 신데칸 1∼4, 글리피칸 1∼6 등이 있다. 또한, 헤파란 황산 프로테오글리칸 이외의 성장인자 결합분자로는, 예를 들면, latent TGF-β binding protein 1~4 등이 있다. 이들 분자는 전체이어도 되고, 성장인자 결합활성을 갖는 단편이어도 된다. 헤파란 황산 프로테오글리칸의 성장인자 결합활성을 갖는 단편으로서는, 예를 들면 퍼레칸의 도메인 1, 아그린의 폴리스타틴 도메인의 1번째부터 8번째까지를 포함하는 영역 등이 있다.
본 발명의 융합단백질을 구성하는 각 단백질(피브리노겐 단편, 라미닌 단편 및 성장인자 결합활성을 갖는 단백질, 이하 「융합 구성 단백질」이라 기재할 수 있음)은 어떠한 유기체의 단백질이어도 되고, 특별히 한정되지 않는다. 융합 구성 단백질은 포유동물의 단백질일 수 있다. 포유동물의 예로, 인간, 마우스, 래트, 소, 돼지 등이 있지만, 이에 한정되지 않는다. 융합 구성 단백질은 상이한 유기체의 단백질을 조합한 융합단백질이어도 되지만, 동일한 생물의 단백질을 조합한 융합단백질인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 융합단백질을 인간의 의료에 적용하는 경우, 융합 구성 단백질은 인간의 단백질인 것이 바람직하다. 또한, 융합 구성 단백질은 야생형이어도 되고, 필요한 생물학적 활성을 유지한 채로 1개 이상의 아미노산 잔기가 변형된 조합형이어도 된다.
본 발명의 융합단백질은 각 융합 구성 단백질이 직접 연결되어 있는 형태일 수도 있고, 스페이서 펩티드(spacer peptide)나 링커를 통해 연결되어 있는 형태일 수도 있다. 본 발명의 융합단백질은, 각 구성 단백질 이외에, 예를 들면 His 태그, HA 태그, FLAG 태그 등의 친화성 태그(Affinity tag)를 포함하고 있을 수 있다. 또한, 본 발명의 융합단백질은 공지된 단백질 표지 물질로 표지될 수도 있다.
본 발명의 융합단백질은, 공지의 유전자 재조합 기술을 적절히 이용하여, 재조합 융합단백질로 제조할 수 있다. 주요 포유동물의 피브리노겐을 코딩하는 유전자의 염기 서열정보와 아미노산 서열정보, 주요 포유동물의 라미닌을 코딩하는 유전자의 염기 서열정보와 아미노산 서열정보, 및 주요 포유동물의 성장인자 결합활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열정보 및 아미노산 서열정보는 NCBI 등의 공지된 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 표 2는 인간 라미닌을 구성하는 각 사슬을 코딩하는 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열의 수탁 번호를 나타내고, 표 3은 인간 피브리노겐을 구성하는 각 사슬을 코딩하는 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열의 기탁번호를 나타내며, 표 4는 인간 성장인자 결합활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열의 기탁번호를 나타낸다.
아미노산 서열 염기 서열
인간 라미닌 α1 사슬 NP-005550 NM-005559
인간 라미닌 α2 사슬 NP-000417 NM-000426
인간 라미닌 α3 사슬 NP-000218 NM-000227
인간 라미닌 α4 사슬 NP-002281 NM-002290
인간 라미닌 α5 사슬 NP-005551 NM-005560
인간 라미닌 β1 사슬 NP-002282 NM-002291
인간 라미닌 β2 사슬 NP-002283 NM-002292
인간 라미닌 β3 사슬 NP-000219 NM-000228
인간 라미닌 γ1 사슬 NP-002284 NM-002293
인간 라미닌 γ2 사슬 NP-005553 NM-005562
인간 라미닌 γ3 사슬 NP-006050 NM-006059
아미노산 서열 염기 서열
인간 피브리노겐 α 사슬 NP-068657 NM-021871
인간 피브리노겐 β 사슬 NP-005132 NM-005141
인간 피브리노겐 γ 사슬 NP-000500 NM-000509
아미노산 서열 염기 서열
인간 퍼레칸 NP_005520 NM_005529
인간 아그린 NP_940978 NM_198576
인간 XVIII형 콜라겐 α1 사슬 NM_085059 NM_030583
인간 신데칸 1 NM_001006947 NM_001006946
인간 신데칸 2 NM_002989 NM_002998
인간 신데칸 3 NM_055469 NM_014654
인간 신데칸 4 NM_002990 NM_002999
인간 글리피칸 1 NM_002072 NM_002081
인간 글리피칸 2 NM_689955 NM_152742
인간 글리피칸 3 NM_001158089 NM_001164617
인간 글리피칸 4 NM_001439 NM_001448
인간 글리피칸 5 NM_004457 NM_004466
인간 글리피칸 6 NM_005699 NM_005708
인간 latent TGF-β binding protein 1 NM_996826 NM_206943
인간 latent TGF-β binding protein 2 NM_000419 NM_000428
인간 latent TGF-β binding protein 3 NM_001123616 NM_001130144
인간 latent TGF-β binding protein 4 NM_001036009 NM_001042544
피브리노겐 단편과 라미닌 단편의 융합단백질은, 피브리노겐의 N-말단을 포함하며 헤테로 삼량체를 형성하는 단편과, 라미닌의 C-말단을 포함하며 헤테로 삼량체를 형성하는 라미닌 단편을 연결시킨 형태로 제조할 수 있다. 융합단백질이 트롬빈 처리에 의해 피브리노겐에 결합할 수 있는 능력과 인테그린 결합활성을 겸비하는 한, 피브리노겐의 N-말단을 포함하며 헤테로 삼량체를 형성하는 단편과, 라미닌의 C-말단을 포함하며 헤테로 삼량체를 형성하는 라미닌 단편은, 어떻게 연결된 상태라도 무방하다. 구체적으로, 피브리노겐의 Aα사슬, Bβ사슬 및 γ사슬과 라미닌의 α사슬, β사슬 및 γ사슬는 어떠한 조합으로 연결되어도 된다. 바람직하게는 피브리노겐의 Aα사슬과 라미닌의 β사슬, 피브리노겐의 Bβ사슬과 라미닌의 α사슬, 피브리노겐의 γ사슬과 라미닌의 γ사슬을 연결하는 형태, 피브리노겐의 Aα사슬과 라미닌의 γ사슬, 피브리노겐의 Bβ사슬과 라미닌의 β사슬, 피브리노겐의 γ사슬과 라미닌의 α사슬을 연결하는 형태, 피브리노겐의 Aα사슬과 라미닌의 α사슬, 피브리노겐의 Bβ사슬과 라미닌의 γ사슬, 피브리노겐의 γ사슬과 라미닌의 β사슬을 연결하는 형태이다. 융합단백질의 각 사슬의 전체 길이, 각 사슬에 있어서 피브리노겐 사슬과 라미닌 사슬의 길이의 비율 등에 대해서도 특별히 한정되지 않고, 상기의 2개의 기능을 발현할 수 있는 범위 내에서 임의로 설정할 수 있다.
피브리노겐 단편과 라미닌 단편의 재조합 융합단백질은, 예를 들면 이하와 같이 실시하여 제조할 수 있다. 즉, 피브리노겐의 1개의 사슬을 코딩하는 DNA의 일부와, 그것과 연결하는 라미닌의 1개의 사슬을 코딩하는 DNA의 일부를 연결하여 3종의 키메라 DNA를 제작한다. 다음으로, 적절한 발현벡터에 이들 3종의 키메라 DNA를 각각 삽입하여 3종의 발현벡터를 제작한다. 이들 3종의 발현벡터를 적당한 숙주세포에 동시주입(cotransfection)하여 발현시키고, 삼량체를 형성하고 있는 단백질을 공지의 방법으로 정제함으로써 제조할 수 있다.
또한, 성장인자 결합활성을 갖는 단백질을 포함하는 융합단백질은, 성장인자 결합활성을 갖는 단백질을 라미닌 단편의 적어도 하나의 α사슬의 C-말단에 연결시킨 형태로 제조할 수 있다. 예를 들어, 라미닌 단편의 α사슬의 C-말단에 성장인자 결합활성을 갖는 단백질을 연결하는 경우는, 상기 3종의 키메라 DNA 중 라미닌 사슬을 코딩하는 DNA를 포함하는 키메라 DNA에, 추가로 성장인자 결합활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA를 연결함으로써, 피브리노겐의 한 사슬과 라미닌의 한 사슬과 성장인자 결합활성을 갖는 단백질의 키메라 DNA를 제조한다. 이 키메라 DNA를 적당한 발현벡터에 삽입하고, 나머지 2종의 발현벡터와 함께 적당한 숙주세포에 동시주입하여 발현시키고, 삼량체를 형성하고 있는 단백질을 공지의 방법으로 정제함으로써 제조할 수 있다.
[겔, 겔의 제조방법, 겔 제조용 조성물, 겔 제조용 키트]
본 발명은 상기 본 발명의 융합단백질의 트롬빈 처리 분자와 피브린으로 형성된 겔 (이하, "본 발명의 겔"이라고 함)을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 겔의 제조방법을 제공한다(이하, 「본 발명의 제조방법」이라고 함). 본 발명의 제조방법은, 본 발명의 융합단백질, 피브리노겐 및 트롬빈의 혼화물을 제조하는 공정을 포함하는 것이면 된다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 융합단백질 및 피브리노겐에 트롬빈이 작용하면 피브리노겐의 Aα사슬 및 Bβ사슬의 N-말단이 절단되어 각각 A knob 및 B knob을 생성하고, 피브리노겐의 γ사슬 C-말단 영역의 a-hole 및 β사슬 C-말단영역의 b-hole에 결합함으로써, 본 발명의 융합단백질이 조합된 피브린겔이 형성된다.
피브리노겐은 어떠한 생물로부터 얻어지는 것이어도 되지만, 본 발명의 융합단백질을 구성하는 각 단백질과 동일한 생물로부터 얻은 것이 바람직하다. 트롬빈은 임의의 생물로부터 얻어질 수 있지만, 본 발명의 융합단백질을 구성하는 각 단백질 및 피브리노겐과 동일한 생물로부터 얻어진 것이 바람직하다. 융합단백질, 피브리노겐 및 트롬빈은 모두 인간으로부터 얻은 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 융합단백질은 성장인자 결합활성을 갖는 단백질을 포함하는 융합단백질인 것이 바람직하다.
구체적으로는, 본 발명의 제조방법은, 본 발명의 융합단백질 용액, 피브리노겐 용액 및 트롬빈 용액의 혼화물을 제조함으로써 실시할 수 있다. 각각을 별도의 용액(3용액)으로 하여 혼화물을 제조해도 되지만, 융합단백질과 피브리노겐의 혼합용액과 인간 트롬빈 용액의 2용액으로부터 혼화물을 제조해도 되고, 융합단백질과 트롬빈의 혼합 용액과 피브리노겐 용액의 2용액으로부터 혼화물을 제조해도 된다. 용매로는 생리적 용액을 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들어 생리식염수, 생리적 완충액, 세포 배양용 배지 등을 적합하게 사용할 수 있다. 융합단백질, 피브리노겐 및 트롬빈의 혼화물에는, 제XIII인자, 아프로티닌, 혈청 알부민, 글리신, L-아르기닌 염산염, L-이소류신, L-글루탐산나트륨, D-만니톨, 시트르산 나트륨 수화물, 염화나트륨 등이 포함되어 있어도 된다.
본 발명의 겔에는, 피브린 안정제로서 트라넥삼산, ε-아미노카프로산 등의 라이신 유사체를 함유하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 제조방법은 본 발명의 융합단백질, 피브리노겐, 트롬빈 및 라이신 유사체(트라넥삼산 또는 ε-아미노카프로산)의 혼합물을 제조하는 공정를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 겔중에서 세포 또는 조직절편을 배양하는 경우에는, 세포 현탁액 또는 조직절편 현탁액을 추가로 첨가하여 혼화물을 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 혼화물 중의 융합단백질과 피브리노겐의 몰비는, 1:5∼1:20,000인 것이 바람직하다. 혼화물 중의 융합단백질의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 0.5 nM 내지 1,000 nM일 수 있다. 혼화물 중의 융합단백질의 농도는 1nM 이상, 1.5nM 이상, 2nM 이상, 3nM 이상, 5nM 이상, 10nM 이상, 20nM 이상, 30nM 이상, 50nM 이상, 70nM 이상, 100 nM 이상일 수 있고, 900 nM 이하, 800 nM 이하, 700 nM 이하, 600 nM 이하, 500 nM 이하, 400 nM 이하일 수 있다.
혼화물 중의 피브리노겐 농도는 특별히 한정되지 않지만, 0.1 mg/mL 내지 50 mg/mL일 수 있다. 혼화물 중의 피브리노겐 농도는 0.5 mg/mL 이상, 1.0 mg/mL 이상, 1.5 mg/mL 이상, 2 mg/mL 이상, 2.5 mg/mL 이상, 3 mg/mL 이상, 5 mg/mL 이상, 7 mg/mL 이상, 10 mg/mL 이상, 15 mg/mL 이상, 20 mg/mL 이상, 25 mg/mL 이상일 수 있고, 45 mg/mL 이하, 40 mg/mL 이하, 35 mg/ mL 이하, 30 mg/mL 이하일 수 있다. 혼화물 중의 피브리노겐 농도를 조절함으로써 겔의 유연성을 조절할 수 있다. 즉, 혼화물 중의 피브리노겐 농도를 높게 하면 딱딱한 겔을 제조할 수 있고, 혼화물 중의 피브리노겐 농도를 낮게 하면 부드러운 겔을 제조할 수 있다. 따라서, 사용 목적에 따라 겔의 유연성을 조정하는 것이 바람직하다.
혼화물 중의 트롬빈 농도는 특별히 한정되지 않고, 피브리노겐 농도에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 혼화물 중의 트롬빈 농도는 0.01 NIH unit/mL 내지 250 NIH unit/mL 일 수있다. 혼화물 중의 트롬빈 농도는 0.05 NIH unit/mL 이상, 0.1 NIH unit/mL 이상, 0.5 NIH unit/mL 이상, 1 NIH unit/mL 이상, 2 NIH unit/mL 이상, 3 NIH unit/mL 이상, 5 NIH unit/mL 이상, 7 NIH unit/mL 이상, 10 NIH unit/mL 이상일 수 있으며, 200 NIH unit/mL 이하, 150 NIH unit/mL 이하, 125 NIH unit/mL 이하, 100 NIH unit /mL 이하, 70 NIH unit/mL 이하, 50 NIH unit/mL 이하일 수 있다.
본 발명의 겔은, 겔 형성 후에 동결건조하여, 동결건조 겔로서 실시할 수도 있다. 동결건조된 겔은 사용시 생리적 용액이나 세포 배양액으로 팽윤시켜 사용할 수 있다. 또한, 사용시에 세포 또는 조직절편을 현탁한 배양액 중에서 팽윤시켜도 된다. 또한, 본 발명의 겔은 기타 배양용 겔 기재와 혼합 겔로서 실시할 수도 있다.
본 발명은 본 발명의 융합단백질 및 피브리노겐을 포함하는 겔 제조용 조성물을 제공한다(이하, 「본 발명의 조성물」이라고 함). 본 발명의 조성물은 용액 또는 용액을 동결건조하여 얻은 동결건조물의 형태로 실시할 수 있다. 본 발명의 조성물에는 제 XIII인자, 아프로티닌, 트라넥삼산, ε-아미노카프로산, 혈청 알부민, 글리신, L-아르기닌 염산염, L-이소류신, L-글루탐산나트륨, D-만니톨, 시트르산나트륨 수화물, 염화나트륨 등이 포함되어 있어도 된다. 본 발명의 조성물에 있어서 융합단백질과 피브리노겐의 바람직한 몰비, 바람직한 농도에 대해서는, 본 발명의 제조방법의 설명으로서 기재한 바와 같다.
본 발명의 조성물 용액에 트롬빈 용액을 첨가하여 혼합함으로써, 본 발명의 겔을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 겔 제조용 제품으로 실시될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 겔을 제조하기 위한 키트를 제공한다(이하, "본 발명의 키트"라고 함). 본 발명의 키트는 본 발명의 융합단백질, 피브리노겐 및 트롬빈을 포함하는 것이면 된다. 구체적으로는, 융합단백질, 피브리노겐 및 트롬빈의 각 용액, 또는 각 용액의 동결건조물을 포함하는 키트로서 실시할 수 있다. 융합단백질, 피브리노겐 및 트롬빈의 각각의 용액은 3용액으로 실시해도 되고, 2용액으로 실시할 수도 있다. 본 발명의 키트의 구성품으로서 상기 본 발명의 조성물을 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명의 키트가 융합단백질, 피브리노겐 및 트롬빈의 각 용액을 동결건조물로서 함유하는 경우, 각 동결건조물의 용해액을 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 키트는 겔 제조용 튜브, 사용 설명서 등을 포함할 수 있다.
[본 발명의 겔의 용도]
본 발명의 겔은 세포 또는 조직절편의 3차원 배양에 사용할 수 있다. 즉, 본 발명은 상기 본 발명의 겔을 이용한 세포 또는 조직절편의 3차원 배양 방법을 제공한다(이하, 「본 발명의 3차원 배양 방법」이라고 함). 본 발명의 3차원 배양 방법은, 본 발명의 겔을 이용하여 세포 또는 조직절편을 3차원 배양할 수 있는 형태이면, 어떠한 배양 용기나 배양 조건을 이용하여 실시할 수 있다. 본 발명의 3차원 배양 방법은, 예를 들면 세포 배양 플레이트의 웰 내에 세포 또는 조직절편을 포함하는 겔을 첨가하고, 추가로 세포 배양액을 첨가하여 일반적인 배양 조건에서 배양함으로써 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 3차원 배양 방법은, 예를 들면, 세포 배양 플레이트의 웰 내의 겔 상에, 배양액에 현탁된 세포 또는 조직절편을 첨가하여 일반적인 배양 조건으로 배양할 수 있다.
3차원 배양에 사용하는 세포 또는 조직절편은 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 겔을 사용하여 3차원 배양할 수 있는 것이면, 어떠한 생물의 세포 또는 조직절편이어도 된다. 바람직하게는 포유동물의 세포 또는 조직절편이다. 포유동물로는 인간, 마우스, 래트, 소, 돼지 등을 들 수 있다. 그 중에서도 인간이 바람직하다.
세포는 초대 배양세포일 수도 있고, 주화세포(established cell line)일 수도 있다. 또한, 세포는 체세포일 수도 있고, 줄기세포일 수도 있다. 줄기세포에는 신체줄기세포(somatic stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell) 등이 포함된다. 신체줄기세포로는, 신경 줄기세포, 간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 심장 줄기세포, 간 줄기세포, 소장 줄기세포 등을 들 수 있다. 다분화능 줄기세포로는 배아 줄기세포(ES세포), 인공 유도만능 줄기세포(iPS세포), 핵이식에 의해 얻어지는 클론 배아 유래의 배아줄기세포(ntES세포), 정자 줄기세포(GS세포), 배아 생식세포(EG세포), 배양 섬유아세포나 골수 줄기세포 유래의 다분화능 세포(Muse 세포) 등을 들 수 있다.
조직절편은 정상 조직에서 유래한 것이어도 되고, 종양조직에서 유래한 것이어도 된다. 특히 인간 종양 조직절편으로부터 분리한 종양 세포를 본 발명의 겔을 이용하여 배양한 암 오가노이드는 인간 생체내의 암세포의 성질을 고도로 반영하고 있는 것으로 생각되며, 화학요법, 면역요법, 방사선요법 등의 암치료법에 대한 암세포의 감수성 예측, 항암제의 스크리닝, 그 외의 암 연구를 실시하는데 유용하다.
본 발명의 3차원 배양 방법에 있어서, 본 발명의 융합단백질을 구성하는 라미닌의 아이소폼은 배양하는 세포 또는 조직절편에 따라 최적의 아이소폼을 선택하는 것이 바람직하다. 세포의 종류와 라미닌 아이소폼의 적합성에 대해서는 선행기술문헌에서 쉽게 찾아볼 수 있다(Masashi Yamada and Kiyotoshi Sekiguchi, Molecular Basis of Laminin-integrin Interactions, Current Topics in Membranes, 76:197-229, 2015; Lynn Yap, et al. Laminins in Cellular Differentiation, Trends in Cell Biology, 29:987-1000, 2019). 또한, 겔의 유연성에 대해서도, 세포 또는 조직절편에 따라 최적의 유연성을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 3차원 배양 방법을 이용하여 얻어지는 세포 또는 오가노이드는, 이식 의료용으로 사용할 수 있다. 즉, 본 발명은 상기 본 발명의 3차원 배양 방법을 이용하여 이식 의료용 세포 또는 오가노이드를 제조하는 방법을 제공한다. 특히, 인간 단백질로 구성된 본 발명의 융합단백질, 인간 피브리노겐, 인간 트롬빈을 사용하여 제조된 본 발명의 겔을 사용하는 본 발명의 3차원 배양 방법은, 배양시스템로부터 이종 유래의 성분을 배제한 무이종(Xeno-Free) 조건을 만족하므로, 이러한 조건에서 인간 세포를 배양하여 얻어지는 세포 또는 오가노이드는, 인간의 이식 의료용으로 적합하게 사용할 수 있다.
이식의료에 이용하는 3차원 배양세포로는 심근세포, 혈관내피세포, 지방세포, 섬유아세포, 근아세포, 간세포, 췌장세포, 장상피세포, 폐포상피세포, 기도상피세포, 신장세포, 조혈세포, 면역세포, 신경세포, 눈조직세포, 표피세포 등을 들 수 있다. 이들 이식 의료용 세포는, 본 발명의 겔을 이용하여 줄기세포로부터 유도하여 얻어진 세포일 수도 있다.
이식의료에 이용하는 오가노이드로는, 예를 들면 신장, 간, 소화관(위, 장, 식도 등), 폐·기관, 대뇌, 혈관 등의 장기가 있다. 예를 들면, 신장은 Takasato 외(Nat Protoc11: 1681-1692, 2016)에 기재된 제조방법에 있어서, 3차원 겔기재를 본 발명의 겔로 변경함으로써 실시할 수 있다. 예를 들어, 간과 장은 Takebe 외(Cell Rep21: 2661-2670, 2017)과 Sato 외(Nature459: 262-265, 2009)에 각각 기재된 제조방법에 있어서, 3차원 겔기재를 본 발명의 기제로 변경함으로써 실시할 수 있다. 예를 들면, 폐와 기도는 Yamamoto 외(Nature Methods 14: 1097-1109, 2017)와 Rock 외(Proc Natl Acad Sci USA106: 12771-12775, 2009)에 각각 기재된 제조방법에 있어서, 3차원 겔기재를 본 발명의 겔로 변경함으로써 실시할 수 있다.
본 발명의 겔은 세포, 조직, 오가노이드 등을 생체이식할 때, 이식 부위를 보호하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 이식하는 세포, 조직, 오가노이드 등을 본 발명의 겔로 포매하여 이식 부위에 매립해도 되고, 세포, 조직, 오가노이드 등을 이식한 후에 이식 부위의 주변에 본 발명의 겔을 겹쳐놓을 수도 있다.
[실시예]
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하나, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1: 인간 피브리노겐-인간 라미닌 511 융합분자의 제작, 정제 및 활성 평가]
(1) 인간 라미닌 511E8 단편의 발현벡터의 구축
우선, pcDNA3.4-TOPO(Thermo Fisher Scientific)를 주형으로 하여, 타키자와 등의 방법(Takizawa et al., Sci. Adv., 2017;3:e1701497)에 따라 pSecTag2B 유래의 멀티 클로닝 부위를 삽입한 발현벡터(이하 「pcDNA3.4+MCS」라 한다)를 구축하였다. 인간 라미닌 α5E8(Ala2534-Ala3327, N-말단측으로부터 순서대로 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드 및 6×His 태그를 포함한다), 인간 라미닌 β1E8(Leu1561-Leu1786, N-말단 측으로부터 순서대로 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드 및 6×His 태그를 포함한다), 인간 라미닌 γ1E8(Asn1362-Pro1609, N-말단측으로부터 순서대로 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C 신호펩티드 및 FLAG 태그를 포함한다)을 각각 코딩하는 DNA 단편을 제한효소 NheI 및 NotI로 절단하고, pcDNA3.4 + MCS의 해당 제한효소 부위에 삽입하여 인간 라미닌 α5사슬단편 LMα5(Ala2534-Ala3327), 인간 라미닌 β1사슬단편 LMβ1(Leu1561-Leu1786) 및 인간 라미닌 γ1 사슬단편 LMγ1(Ala1362-Pro1609)의 각 발현벡터를 구축하였다.
(2) 인간 피브리노겐에 인간 라미닌 511의 인테그린 결합 영역을 연결한 융합단백질 발현벡터의 구축
인간 피브리노겐에 인간 라미닌 511의 인테그린 결합 영역을 연결한 융합단백질(이하, 「Chimera-511」이라 한다)으로서, 인간 피브리노겐 α사슬(이하, 「FBGα(Met1-Pro644」이라 한다), 인간 피브리노겐 β사슬(이하, 「FBGβ(Met1-Gln491)」이라 한다) 및 인간 피브리노겐 γ사슬(이하, 「FBGγ(Met1-Val437)」이라 한다)를 코딩하는 DNA 단편을 삽입한 발현벡터를 구축한 후, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGβ(Gln31-Asn194)/LMα5(Ile2716-Ala3310)(이하, 「Chimera-α5」라 한다), 마우스 Ig-κ사슬V-J2-C신호펩티드/FBGα(Ala20-His151)/LMβ1(Leu1761-Leu1786)(이하, 「Chimera-β1」이라 한다) 및 마우스 Ig-κ사슬V-J2-C신호펩티드/FBGγ(Tyr27-Ser132)/LMγ1(Ile1579-Pro1609)(이하, 「Chimera-γ1」이라 한다)를 구축했다.
(2-1) 인간 피브리노겐 발현벡터의 구축
먼저, 인간 간 유래 cDNA 라이브러리는 Human Liver Total RNA(Clontech, 636531)를 주형으로 하고, First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace-α-(도요보, FSK-101)를 사용하여, 제공된 프로토콜에 따라 다음과 같이 제작하였다. 19μL의 마스터믹스(RNase-free H2O10μL, 5×RT Buffer 4μL, 10mM dNTP Mixture 2μL, 10U/μL RNase Inhibitor 1μL,10 pmol/μL Oligo(dt) 201μL, ReverTraAce 1μL)와 1μg/μL Human Liver Total RNA 1μL를 혼합하고, 역전사반응(42℃에서 20분간 인큐베이션 후, 99℃에서 5분간 인큐베이션)을 실시하였다.
다음으로, 인간 간 유래 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, 이하의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하고, FBGα(Met1-Pro644),FBGβ(Met1-Gln491)및 FBGγ(Met1-Val437)를 각각 코딩하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 증폭된 각 DNA 단편을 제한효소 NheI와 NotI로 절단(digestion)하고, 각각 pcDNA3.4+MCS의 해당 제한효소 부위에 삽입하여 FBGα(Met1-Pro644),FBGβ(Met1-Gln491)및 FBGγ(Met1-Val437)의 각 발현벡터를 구축하였다.
(i) FBGα(Met1-Pro644)증폭용 프라이머 세트
5'-GGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGTTTTCCATGAGGATCGTCTGCC-3'(forward, 서열번호 1)
5'-TCCTCGAGCGGCCGCCGATCTAGGGGGACAGGGAAGG-3'(reverse, 서열번호 2)
(ii) FBGβ(Met1-Gln491)증폭용 프라이머 세트
5'-TAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGAAAAGGATGGTTTCTTGGAGCTTCC-3'(forward, 서열번호 3)
5'-CCTCCTCGAGCGGCCGCGATCTATTGCTGTGGGAAGAAGG-3'(reverse, 서열번호 4)
(iii) FBGγ(Met1-Val437)증폭용 프라이머 세트
5'-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGAGTTGGTCCTTGCACCCCCG-3'(forward, 서열번호 5)
5'-CCCTCCTCGAGCGGCCGCGATTTAAACGTCTCCAGCCTGTTTGG-3'(reverse, 서열번호 6)
(2-2) C-말단에 10×His태그를 첨가한 LMα5(Ala2534-Ala3310)발현벡터의 구축
LMα5(Ala2534-Ala3327)발현벡터를 주형으로 하여, 이하의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하고, 5'측 단편과 3'측 단편을 증폭하였다. 또한, (iv)의 리버스 프라이머의 5'측과 (v)의 포워드 프라이머의 5'측에는 익스텐션 PCR에 사용하기 위한 서열이 첨가되어 있다.
(iv) 5'측 단편 증폭용 프라이머 세트
5'-AGCCTGCGATGGCTCTTCCCCACCGGAGGCTCAG-3'(forward, 서열번호 7)
5'-GTGATGGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGGGCCTGCAGTC-3'(reverse, 서열번호 8)
(v) 3'측 단편 증폭용 프라이머 세트
5'-AGGCCCATCACCATCACCATCACCATCACCATCACTAGATCCAGCAC-3'(forward, 서열번호 9)
5'-GATCGAACCCTTGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGCTG-3'(reverse, 서열번호 10)
얻어진 2종류의 DNA 단편을, 이하의 프라이머 세트를 사용한 익스텐션 PCR에 의해 연결하여 증폭시켰다. 증폭된 DNA 단편을 제한효소 AscI와 NotI로 절단하고, LMα5(Ala2534-Ala3327)발현벡터의 해당 제한효소 부위에 삽입하여, C-말단부에 10×His태그를 첨가한 LMα5(Ala2534-Ala3310)(이하, 「LMα5(Ala2534-Ala3310)/10×His」라 한다)의 발현벡터를 구축하였다.
(vi) LMα5(Ala2534-Ala3310)/10×His연결·증폭용 프라이머 세트
5'-AGCCTGCGATGGCTCTTCCCCACCGGAGGCTCAG-3'(forward, 서열번호 7)
5'-GATCGAACCCTTGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGCTG-3'(reverse, 서열번호 10)
(2-3) Chimera-α5, Chimera-β1 및 Chimera-γ1 발현벡터의 구축
인간 피브리노겐 각 사슬의 발현벡터를 주형으로 하고, 이하의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하여, FBGα(Met1-His151), FBGβ(Met1-Asn194) 또는 FBGγ(Met1-Ser132)를 코딩하는 DNA 단편을 증폭하였다. 또한, 각 프라이머 세트의 리버스 프라이머의 5'측에는 익스텐션 PCR에 사용하기 위한 서열이 첨가되어 있다.
(vii) FBGα(Met1-His151)증폭용 프라이머 세트
5'-AGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGC-3'(forward, 서열번호 11)
5'-GAACGGACTTCTCCTTCCAGTCTTGCTAAATGCTGTACTTTTTCTATGACTTTGCGC-3'(reverse, 서열번호 12)
(viii) FBGβ(Met1-Asn194)증폭용 프라이머 세트
5'-AGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGC-3'(forward, 서열번호 11)
5'-GCTCTCGCACGCGGCCAATGTTAGTTGGGATATTGCTATTC-3'(reverse, 서열번호 13)
(ix) FBGγ(Met1-Ser132)증폭용 프라이머 세트
5'-AGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGC-3'(forward, 서열번호 11)
5'-GCGAATGTCCTTCATGATCTCCTCGATACTTGAGTCATGTGTTAAAATCGATG-3'(reverse, 서열번호 14)
다음으로, LMα5(Ala2534-Ala3310)/10×His, LMβ1(Leu1561-Leu1786)및 LMγ1(Asn1362-Pro1609)의 발현벡터를 주형으로 하고, 이하의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하여, LMα5(Ile2710-Ala3310)/10×His, LMβ1(Leu1761-Leu1786)또는 LMγ1(Ile1579-Pro1609)을 코딩하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 각 프라이머 세트의 포워드 프라이머의 5'측에는 익스텐션 PCR에 사용하기 위한 서열이 부가되어있다.
(x) LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His 증폭용 프라이머 세트
5'-GAATAGCAATATCCCAACTAACATTGGCCGCGTGCGAGAGC-3'(forward, 서열번호 15)
5'-CCTTGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3' (reverse, 서열번호 16)
(xi) LMβ1(Leu1761-Leu1786) 증폭용 프라이머 세트
5'-GCGCAAAGTCATAGAAAAAGTACAGCATTTAGCAAGACTGGAAGGAGAAGTCCGTTC-3'(forward, 서열번호 17)
5'-CCTTGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3'(reverse, 서열번호 16)
(xii) LMγ1(Ile1579-Pro1609) 증폭용 프라이머 세트
5'-CATCGATTTTAACACATGACTCAAGTATCGAGGAGATCATGAAGGACATTCGC-3'(forward, 서열번호 18)
5'-CCTTGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3'(reverse, 서열번호 16)
얻어진 6종류의 단편을, 이하의 프라이머 세트를 사용하여 익스텐션 PCR을 실시하고, FBGα(Met1-His151)/LMβ1(Leu1761-Leu1786), FBGβ(Met1-Asn194)/LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His, 또는 FBGγ(Met1-Ser132)/LMγ1(Ile1579-Pro1609)을 코딩하는 DNA 단편에 연결하여 증폭시켰다. 증폭된 DNA 단편을 제한효소 NheI 및 NotI로 절단하고 pcDNA3.4 + MCS의 해당 제한효소 부위에 삽입하였다.
(xiii) 각 사슬 연결, 증폭용 프라이머 세트
5'-AGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGC-3'(forward, 서열번호 11)
5'-CCTTGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3'(reverse, 서열번호 16)
이어서, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C 신호펩티드를 도입하기 위해, LMα5(Ala2534-Ala3327)의 발현벡터를 주형으로 하고, 이하의 프라이머를 이용한 PCR을 실시하여, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 각 프라이머 세트의 리버스 프라이머의 5'측에는 익스텐션 PCR에 사용하기위한 서열이 부가되어 있다.
(xiv) 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C 신호펩티드 증폭용 프라이머 세트(Chimera-α5용)
5'-CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGC-3'(forward, 서열번호 19)
5'-CATTGTCGTTGACACCTTGGTCACCAGTGGAACCTGG-3'(reverse, 서열번호 20)
(xv) 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드 증폭용 프라이머 세트(Chimera-β1용)
5'-CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGC-3'(forward, 서열번호 19)
5'-CACCTTCACCACTATCTGCGTCACCAGTGGAACCTGGA-3'(reverse, 서열번호 21)
(xvi) 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드 증폭용 프라이머 세트(Chimera-γ1용)
5'-CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGC-3'(forward, 서열번호 19)
5'-CAGTTGTCTCTGGTAGCAACATAGTCACCAGTGGAACCTGGAACCC-3'(reverse, 서열번호 22)
다음으로, FBGα(Met1-His151)/LMβ1(Leu1761-Leu1786), FBGβ(Met1-Asn194)/LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His 및 FBGγ(Met1-Ser132)/LMγ1(Ile1579-Pro1609)의 발현벡터를 주형으로 하여, 이하의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 실시하고, FBGβ(Gln31-Asn194)/LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His, FBGα(Ala20-His151)/LMβ1(Leu1761-Leu1786) 및 FBGγ(Tyr27-Ser132)/LMγ1(Ile1579-Pro1609)을 코딩하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 각 프라이머 세트의 포워드 프라이머의 5'측에는 익스텐션 PCR에 사용하기위한 서열이 첨가되어 있다.
(xvii) FBGβ(Gln31-Asn194)/LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His 증폭용 프라이머 세트
5'-CCAGGTTCCACTGGTGACCAAGGTGTCAACGACAATG-3'(forward, 서열번호 23)
5'-CCGGTAGGGATCGAACCCTTGATGGCTGGCAACTAGAAG-3'(reverse, 서열번호 24)
(xviii) FBGα(Ala20-His151)/LMβ1(Leu1761-Leu1786) 증폭용 프라이머 세트
5'-TCCAGGTTCCACTGGTGACGCAGATAGTGGTGAAGGTG-3'(forward, 서열번호 25)
5'-CCGGTAGGGATCGAACCCTTGATGGCTGGCAACTAGAAG-3'(reverse, 서열번호 24)
(xix) FBGγ(Tyr27-Ser132)/LMγ1(Ile1579-Pro1609) 증폭용 프라이머 세트
5'-GGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTATGTTGCTACCAGAGACAACTG-3'(forward, 서열번호 26)
5'-CCGGTAGGGATCGAACCCTTGATGGCTGGCAACTAGAAG-3'(reverse, 서열번호 24)
상기 (xiv) ~ (xix)의 프라이머 세트로 증폭시킨 6종류의 DNA 단편을, 이하의 프라이머 세트가 사용된 익스텐션 PCR을 실시하고, 각각 연결하여 증폭시켰다. 증폭된 DNA 단편을 제한효소 NheI 및 NotI로 절단하고, pcDNA3.4 + MCS의 해당 제한효소 부위에 삽입하여, Chimera-α5, Chimera-β1 및 Chimera-γ1의 각 발현벡터를 구축하였다.
(xx) 각 사슬 연결·증폭용 프라이머 세트
5'-CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGC-3'(forward, 서열번호 19)
5'-CCGGTAGGGATCGAACCCTTGATGGCTGGCAACTAGAAG-3'(reverse, 서열번호 24)
(3) 인간 라미닌 511E8 단편 및 Chimera-511의 발현과 정제
인간 라미닌 511E8(이하 「LM511E8」로 기재) 및 Chimera-511은, 구축된 각 사슬의 발현벡터를 FreeStyle 293-F 세포(Thermo Fisher Scientific, 이하 「293-F 세포」로 기재)에 도입하여 발현시켰다. 즉, LM511E8의 경우에는 LMα5(Ala2534-Ala3327), LMβ1(Leu1561-Leu1786)및 LMγ1(Asn1362-Pro1609)의 각 발현벡터를 293-F 세포에 도입하고, Chimera-511의 경우 Chimera-α5, Chimera-β1 및 Chimera-γ1의 각 발현벡터를 293-F 세포에 도입하였다. 1.0x109 개의 293-F 세포(1.0x106 cells/mL)에 대해, 형질감염 시약 293 fectin(Thermo Fisher Scientific) 및 Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 각 사슬 발현벡터를 400μg씩 동시에 형질감염하고, 72시간 배양을 실시한 후, 배양액을 회수하였다.
회수한 배양액을 1,000×g에서 10분간 원심분리하고, 그 상청을 다시 15,000×g에서 30분간 원심분리하여, 세포 및 불용물을 제거하였다. 배양 상청에 10mL의 complete His-Tag Purification Resin(Roche)을 첨가하고, 하룻밤 배양하여 목적 단백질을 흡착시켰다. complete His-Tag Purification Resin을 회수하고, pH 8.0으로 조정한 HEPES-buffered Saline(20mM HEPES 및 137mM NaCl을 포함하는 완충 생리식염수, 이하 「HBS」라고 함)로 세정한 후, 250mM 이미다졸을 포함하는 HBS(pH 8.0)로 용출하였다. 용출 분획은 A280의 흡광도 측정에 의해 확인하였다.
목적 단백질을 함유하는 용출 분획을 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(Merck Millipore)를 사용하여 농축한 후, Superose 6 Increase 10/300GL(GE Healthcare)에 의한 겔여과 크로마토그래피에 투입하고, HBS(pH 7.4)를 이용하여 유속 0.5mL/min으로 용출하였다. 용출 분획 중의 목적 단백질량은 A280의 흡광도 및 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 겔여과 크로마토그래피 후의 정제물을 0.22μm 디스크 주사기 필터(Merck Millipore, SLGV033RS)로 멸균한 후, -80℃에 보존하였다.
(4) LM511E8 및 Chimera-511의 SDS-PAGE 분석
정제한 LM511E8(도 1(A) 참조) 및 Chimera-511(도 1(C) 참조)을 각각 SDS-PAGE에 투입하고, 전기영동 패턴을 비교하였다. 5%-20% 농도구배를 갖는 폴리아크릴아미드 겔(ATTO, #2331830)에 LM511E8 및 Chimera-511을 각각 1.2μg/well 적용하고, 20mA에서 75분 동안 전기영동하였다. 전기영동은 Laemmli 방법에 따라 25mM 트리스, 192mM 글리신, 0.1% 도데실황산 소듐으로 구성된 완충액을 사용하여 환원 및 비환원 조건에서 수행하였다. 단백질의 염색에는 Quick-CBB(후지필름 와코순약, #299-50101)를 이용하였다.
결과를 도 2에 나타냈다. 비환원 조건에서는, LM511E8로부터는, LMα5E8과 LMβ1E8-LMγ1E8 이량체의 2개의 밴드가 출현하고, Chimera-511로부터는, Chimera-511 육량체의 밴드 1개만이 출현했다. 환원 조건에서는, LM511E8로부터는 LMα5E8과 LMγ1E8과 LMβ1E8의 3개의 밴드가 출현하고, Chimera-511에서는, Chimera-α5의 밴드와, Chimera-β1 및 Chimera-γ1의 밴드가 같은 위치에서 중첩되어 1개의 밴드로 출현하였다. 이 결과로부터, 목적하는 LM511E8과 Chimera-511이 얻어지는 것을 확인할 수 있었다.
(5) 인테그린 결합 분석(binding assay)
(5-1) 플레이트에 코팅
HBS(pH 7.4)에서 최종 농도가 10nM이 되도록 LM511E8 및 Chimera-511을 희석한 후, 96-well 플레이트(Thermo Fisher Scientific, #442404)에 50 μL/well씩 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 천천히 진탕하면서 코팅을 실시하였다.
(5-2) 인테그린 결합 분석
인테그린 결합 분석은 이도(井戶) 등의 방법(Hiroyuki Ido et al., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007)에 따라 실시하였다. 즉, 상기와 같이 LM511E8 및 Chimera-511을 각각 코팅한 96-well 플레이트에, 0.02% Tween-20(후지필름 와코순약, #167-11515) 및 137mM NaCl을 포함하는 20mM 트리스 완충액, pH 7.4(이하 「TBST」라고 함)에 0.1% 우혈청 알부민(BSA; Sigma-Aldrich A7906)을 첨가한 용액(이하, 「0.1% BSA/TBST」라고 함)을 200μL/well씩 첨가하고, 플레이트를 세정하였다. 이어서, 1% BSA를 첨가한 TBST를 200μL/well씩 첨가하고, 셰이커(B.Braun Biotech International CERTOMAT MT) 상에서 진탕하면서 실온에서 1시간 블로킹을 실시하였다. 200 μL/well의 0.1% BSA/TBST로 1회 세정하였다. 1mM MnCl2 또는 10mM EDTA를 포함하는 0.1% BSA/TBST로 α6β1 인테그린을 희석하고, 최종 농도가 0.001 nM, 0.003 nM, 0.01 nM, 0.03 nM, 0.1 nM, 0.3 nM, 1 nM nM, 30 nM, 100 nM이 되도록 α6β1 인테그린 용액을 제조하였다. α6β1 인테그린 용액을 플레이트에 50 μL/well씩 첨가하고, 실온에서 쉐이커상에 진탕하며 3시간 반응시켰다.
200μL/well의 1mM MnCl2/0.1%BSA/TBST, 또는 10mM EDTA/0.1% BSA/TBST로 3회 세정한 후, 1mM MnCl2/0.1% BSA/TBST로 희석한 1.5μg/mL의 비오틴 표지 Velcro 항체(Takagi, J., Erickson, H. P. and Springer, T. A. (2001) Nat. Struct. Biol. 8, 412-416의 설명에 따라 제조)를 50μL/well 씩 첨가하고, 실온에서 쉐이커상에 진탕하면서 30분 반응시켰다. 200μL/well의 1mM MnCl2/0.1%BSA/TBST로 3회 세정한 후, 1mM MnCl2/0.1%BSA/TBST로 희석한 0.53μg/mL의 streptavidin-horseradish peroxidase(Thermo Fisher Scientific, #21126)을 50μL/well 씩 가하고, 실온에서 쉐이커상에서 진탕하며 15분간 반응시켰다. 200μL/well의 1mM MnCl2/0.1%BSA/TBST로 3회 세정한 후, 0.04% H2O2를 함유하는 25mM 시트르산/50mM Na2HPO4 완충액으로 최종 농도가 0.4mg/mL가 되도록 용해시킨 o-phenylenediamine(OPD; 후지필름 와코순약 #615-28-1)을 50μL/well씩 첨가하여 2분 30초 반응시켰다. 2.5M H2SO4로 반응을 정지시킨 후, 마이크로 플레이트 리더(Molecular Devices EMax)를 사용하여 490nm에서 발색기질의 흡광도를 측정하였다.
결과를 도 3에 나타냈다. Chimera-511의 α6β1 인테그린에 대한 결합활성은 LM511E8의 α6β1 인테그린에 대한 결합활성과 동등한 것으로 나타났다. 도 3의 결과로부터, 니시우치 등의 방법(Ryoko Nishiuchi et al. Matrix Biology, 25, 189-197, 2006)에 의해 구한 LM511E8에 대한 α6β1 인테그린의 해리상수는 0.59nM이고, Chimera-511에 대한 α6β1 인테그린의 해리상수는 0.58nM이었다.
(6) 피브리노겐 결합 검정
(6-1) 플레이트에 코팅
HBS(pH 7.4)로 최종농도 100nM이 되도록 인간 피브리노겐을 희석한 후, 96-well 플레이트에 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 하룻밤 천천히 진탕하면서 코팅을 실시하였다.
(6-2) 트롬빈 첨가에 의한 Chimera-511의 피브리노겐으로의 결합
인간 피브리노겐을 코팅한 96-well 플레이트에 1% Skim milk(나카라이테스크, #31149-75), 0.1% Tween-20, 137mM NaCl을 포함하는 20mM 트리스 완충액, pH 7.4(이하, 「1% Skim/TBST」라고 함)를 200μL/well씩 가하여 플레이트를 세정하였다. 이어서 1% Skim/TBST를 200μL/well씩 첨가하고, 쉐이커 상에서 진탕하며 실온에서 1시간 블로킹을 실시하였다. TBST로 1회 세정한 플레이트에 0.5 NIH units/mL 트롬빈 용액을 25 μL/well씩 첨가한 후, HBS(7.4)로 최종농도가 0.3125 nM, 0.625 nM, 1.25 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM가 되도록 LM511E8과 Chimera-511을 희석한 용액을 25 μL/well씩 첨가하고, 실온에서 쉐이커상에 진탕하며 1시간 반응시켰다. 대조로서, 트롬빈 용액 대신에 PBS(-)를 25μL/well씩 첨가한 후, LM511E8과 Chimera-511을 단계 희석한 용액을 25 μL/well씩 첨가하고, 동일하게 실온에서 진탕하며 1시간 반응시켰다.
(6-3) 결합된 Chimera-511 양의 측정
피브리노겐에 결합된 Chimera-511은 항-라미닌 α5사슬 항체 4C7(Merck Millipore, MAB1924)을 사용하여 정량하였다. 4C7은 LM511E8의 α5E8 사슬과 결합하는 것으로 보고되어 있다(Hiroyuki Ido et al., Matrix Biology, 25, 112-117, 2006). TBST로 3,000배 희석한 항라미닌 α5 사슬 항체 4C7을 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 셰이커 상에 1시간 반응시켰다. 200 μL/well의 TBST로 3회 세정한 후, TBST로 희석한 10nM Donkey anti-Mouse IgG/HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories, #715-035-150)를 50 μL/well씩 첨가하고, 실온에서 쉐이커상에 1시간 반응시켰다. 200μL/well의 TBST로 3회 세정한 후, 0.04% H2O2를 포함하는 25mM 시트르산/50mM Na2HPO4 완충액으로 최종농도 0.4mg/mL가 되도록 용해시킨 o-phenylenediamine을 50 μL/well씩 첨가하여 2분 반응시켰다. 2.5M H2SO4로 반응을 정지시킨 후, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 490nm에서 발색기질의 흡광도를 측정하였다.
결과를 도 4에 나타냈다. Chimera-511은 트롬빈 존재하에서 용량의존적으로 피브리노겐에 결합하였으나, 트롬빈이 없으면 결합하지 않았다. LM511E8은 트롬빈의 유무에 관계없이 피브리노겐에는 결합하지 않았다. 이 결과는, Chimera-511이 트롬빈에 의해 Chimera-α5 사슬과 Chimera-β1 사슬의 N-말단영역에서 절단되고, 이로 인해 노출된 A knob 및 B knob(도 1 참조)가 플레이트에 코팅된 피브리노겐의 a-hole과 b-hole에 결합함을 나타낸다.
[실시예 2: Chimera-511을 조합한 피브린겔을 이용한 세포 배양에 있어서, 트라넥삼산 첨가 효과의 검토]
(1) 인간 iPS 세포의 유지배양
인간 iPS 세포 (이하, 「hiPS 세포라고 함)로서 201B7 균주를 RIKEN BioResource Research Center로부터 구입하여 사용했다. hiPS 세포는 나카가와 등의 방법(Nakagawa et al., Sci. Rep. 4:3594, doi:10.1038/srep03594, 2014)을 일부 변경한 이하의 프로토콜에 따라 6-well 플레이트(코닝, #353046)를 사용하여 유지배양을 실시하였다. hiPS 세포에 세포 박리액[TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific)을 0.5mM EDTA/PBS(-)로 1:1 희석한 액]을 첨가하여 37℃에서 5분간 인큐베이션하여 hiPS를 박리하고, hiPS 세포 현탁액을 제조하였다. 상세하게는, 인큐베이션 후에 세포 박리액을 흡인 제거하고, PBS(-)로 세정한 후, 10 μM의 ROCK 저해제(Y-27632, 와코순약)를 함유하는 StemFit AK02N(아지노모토)를 1mL/well 첨가하고 셀 스크레이퍼(스미토모 베이클라이트)를 사용하여 hiPS 세포를 회수하였다. 반복 피펫팅으로 단일 세포까지 분산시킨 후, 세포현탁액 10μL와 0.4% 트리판블루(Thermo Fisher Scientific, T10282) 10μL를 혼합하고, Countess 자동 셀카운터(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 세포 수를 측정하였다.
배양 개시 전날에, 배양용 6-well 플레이트에 22nM LM511E8 코팅액을 1.5mL/well 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 코팅을 실시하였다. 배양 개시 당일, 코팅된 LN511E8의 건조에 의한 활력소실을 방지하기 위해, PBS(-)로 제조한 재조합 인간 혈청 알부민(Novozymes) 용액(1mg/mL)을 1.5mL/well 첨가하였다. 웰에 남은 용액을 흡인 제거하고, 단일 세포에 분산된 201B7주 hiPS 세포를 1.0×104 cells/well로 파종하고, 37℃/0.5% CO2 조건하에 배양을 개시하였다. 배양 개시의 다음날, 배양 4일째, 배양 5일째, 배양 6일째에 StemFit AK02N을 사용하여 배지교환을 실시하였다. 배양 7일째의 hiPS 세포를 피브린겔을 이용한 세포 배양에 제공하였다.
(2) 피브린겔을 이용한 hiPS 세포의 포매배양
(2-1) 하층 겔의 제조
인간 피브리노겐 (Enzyme Research Laboratories, FIB 3)을 StemFit AK02N으로 5mg/mL가 되도록 희석하여 2×피브리노겐 용액을 제조하였다. Thrombin(Sigma-Aldrich, T4393)을 StemFit AK02N으로 1 NIH units/mL가 되도록 희석하여 2x트롬빈 용액을 제조하였다. 250μL의 2×피브리노겐 용액을 첨가한 1.7mL 튜브에 250μL의 2×트롬빈 용액을 첨가하였다. 피펫팅 및 전도교반한 후, 배양용 24-well 플레이트(BD Biosciences)에 혼합액을 250μL 첨가하고, 37℃에서 10분간 정치하여 겔화시켰다. 트라넥삼산 비첨가 배지군용 웰의 피브린겔 위에 10μM Y-27632/StemFit AK02N을, 트라넥삼산 첨가 배지군용 웰의 피브린겔 위에 10M Y-27632/1mM 트라넥삼산/StemFit AKO2N을 각각 1 mL/well을 첨가하고 37℃/0.5% CO2 조건하에서 하루밤 정치시켰다.
(2-2) 상층 겔의 제작 및 hiPS 세포의 배양
유지배양 7일째의 hiPS 세포를, 상기와 동일한 순서로, 박리, 단일세포에 분산 및 세포수 측정을 실시하였다. 4×104 cells/mL 세포, 1 NIH units/mL 트롬빈과, 100nM Chimera-511을 함유하는 2×세포현탁액을 제조하였다. 250μL의 2×피브리노겐 용액을 첨가한 1.7mL 튜브에 250μL의 2×세포현탁액을 첨가하였다. 피펫팅 및 전도교반한 후, 하층 겔이 형성된 웰에 혼합액을 250μL 첨가하고, 37℃에서 10분간 정치하여 겔화시켰다. 트라넥삼산 비첨가 배지군용 웰의 피브린겔 위에 10μM Y-27632/StemFit AK02N을, 트라넥삼산 첨가 배지군용 웰의 피브린겔 위에 10μM Y-27632/1mM 트라넥삼산/StemFit AK02N을 각각 1mL/well 첨가하고 37℃/0.5% CO2조건하에서 포매배양을 개시하였다. 배양개시의 다음날, 배양 4일째, 배양 5일째, 배양 6일째에 1mM 트라넥삼산/StemFit AK02N을 사용하여 배지교환을 실시하였다.
배양 7일째의 결과를 도 5에 나타냈다. 상단이 트라넥삼산 첨가 배지군의 대표적인 웰의 관찰 이미지, 하단이 트라넥삼산 비첨가 배지군의 대표적인 웰의 관찰 이미지이다. 좌측이 명시야 이미지, 우측이 위상차 이미지이다. 트라넥삼산 비첨가 배지군에서는, 포매배양 개시 4일째부터 겔의 용해가 현저해지고, 배지 교환시에 일부의 세포가 겔마다 벗겨져 떨어지는 현상이 여기저기 보였다. 한편, 트라넥삼산 첨가 배지군에서는, 관찰 종료시까지 겔의 용해는 확인되지 않고, 세포는 완전구형에 가까운 형상의 덩어리를 형성하여 증식하였다. 트라넥삼산 첨가 배지군에서 겔이 용해되지 않은 것은 트라넥삼산의 항플라스민 작용에 의한 것으로 생각되었다.
[실시예 3: Chimera-511을 조합한 피브린겔을 이용한 세포배양에 있어서, Chimera-511의 농도 의존성의 검토]
실시예 2에 있어서, Chimera-511의 최종농도가 0.15nM, 0.5nM, 1.5nM, 5nM, 15nM, 50nM 또는 150nM가 되도록, 2×세포현탁액에 Chimera-511을 첨가한 것 이외에는, 실시예 2와 동일한 순서로 hiPS 세포를 포매배양하였다. 음성 대조군으로서, Chimera-511을 첨가하지 않은 피브린겔을 사용하여 hiPS 세포를 포매배양하였다. 올인원 형광현미경(키엔스, BZ-X710)을 이용하여 포매 다음날, 배양 4일째, 배양 5일째, 배양 6일째, 배양 7일째의 세포집합체(cell aggregation)를 촬영하고, 세포집합체 형성에 있어서 Chimera-511의 첨가 농도 의존성을 관찰하였다.
배양 8일째에, 이하의 순서로 세포를 회수하여, 세포수를 측정하였다. 세포배양액을 흡인 제거하고 PBS(-)로 세정하였다. 피브린겔 용해액[2.5mg/mL 트립신(Thermo Fisher Scientific, #15090046), 5mM EDTA, 10μM Y-27632를 포함하는 PBS(-)]를 1mL/well씩 첨가하고, 37℃에서 셰이커상에 30분 동안 피브린겔을 소화시켰다. 반복 피펫팅으로 단일세포까지 분산시킨 후, 5분 동안 원심분리(300×g)하여 상청을 제거하고, 피브린겔 용해액에 재현탁시켰다. 세포현탁액 10μL와 0.4% 트리판 블루(Thermo Fisher Scientific, T10282) 10μL를 혼합하고, Countess 자동 셀카운터(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 세포수를 측정하였다. 총 세포수 및 트리판 블루 염색된 세포수를 측정하여 생존율을 산출하였다.
배양 7일째의 관찰 결과를 도 6에 나타냈다. Chimera-511의 농도의존적 세포집합체 수의 증가가 관찰되었다.
배양 8일째의 세포수 및 생존율의 결과를 도 7에 나타냈다. 도 7의 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균값 및 표준편차로 나타냈다. 세포수 및 생존율은 Chimera-511의 농도 의존적으로 증가하였다.
[실시예 4: Chimera-511을 조합한 피브린겔을 이용한 세포배양에 있어서, 경시적 변화의 검토]
실시예 2와 동일한 순서로, Chimera-511의 최종농도를 50nM로 하여 hiPS 세포를 포매배양하였다. 음성 대조군으로서, Chimera-511을 첨가하지 않은 피브린겔을 사용하여 hiPS 세포를 포매배양하였다. 올인원 형광현미경(키엔스, BZ-X710)을 이용하여 포매 다음날(배양 1일째), 배양 4일째, 배양 6일째, 배양 8일째의 세포집합체를 촬영하고, 경시 변화를 관찰하였다.
결과를 도 8에 나타냈다. 상단은 Chimera-511을 첨가한 피브린겔을 사용하여 hiPS 세포를 배양한 결과를 나타내고, 하단은 Chimera-511을 첨가하지 않은 피브린겔을 사용하여 hiPS 세포를 배양한 결과를 나타낸다. Chimera-511을 첨가한 피브린겔에서는 세포집합체는 시간이 지남에 따라 증식하여 커지는 것이 관찰되었다. 한편, Chimera-511을 첨가하지 않은 피브린겔에서는, 배양 8일째에서도 세포집합체의 증식은 확인되지 않았다.
[실시예 5: 피브린겔을 이용한 세포 배양에 있어서, Chimera-511과 LM511E8의 첨가 효과의 비교]
실시예 2와 동일한 순서로, 최종농도 50nM의 Chimera-511을 첨가한 피브린겔을 사용하여 hiPS 세포를 포매배양하였다. 동일하게, Chimera-511 대신에 최종농도 100nM의 LM511E8을 첨가한 피브린겔을 사용하여 hiPS 세포를 포매배양하였다. 올인원 형광현미경(키엔스, BZ-X710)을 이용하여 배양 8일째에 세포집합체를 촬영하고, 세포집합체의 증식을 비교하였다.
결과를 도 9에 나타냈다. (A)는 Chimera-511을 첨가한 피브린겔의 결과, (B)는 LM511E8을 첨가한 피브린겔의 결과이다. Chimera-511을 첨가한 피브린겔을 이용한 경우는 증식한 hiPS 세포의 세포집합체가 다수 관찰되었으나, LM511E8을 첨가한 피브린겔을 사용한 경우에는 증식한 hiPS 세포의 세포집합체가 거의 관찰되지 않았다. 이 결과는, 인테그린 결합활성을 갖는 LM511E8이 피브린겔 내에 존재하는 것만으로는 불충분하고, 인테그린 결합활성을 갖는 LM511의 단편이 피브린겔에 결합한 상태로 존재하는 것이 세포의 증식에 필요하다는 것을 보여준다.
[실시예 6: Chimera-511을 조합한 피브린겔을 이용한 세포배양 후의 hiPS 세포의 미분화성의 검토]
실시예 2와 동일한 순서로, Chimera-511의 최종농도를 50nM로 하여 hiPS 세포를 포매배양하였다. 배양 7일째에, 세포배양액을 흡인 제거하고, PBS(-)로 세정하였다. 피브린겔 용해액[2.5mg/mL 트립신, 5mM EDTA, 10μM Y-27632를 포함하는 PBS(-)]를 1mL/well씩 첨가하고, 37℃에서 셰이커 상에 30분간 피브린겔을 소화하였다. 반복 피펫팅으로 단일세포까지 분산시킨 후, 5분 동안 원심분리(300×g)하여 상청을 제거하였다. 10μM Y-27632/PBS(-)에 재현탁한 후, 40m 셀스트레이너(corning, #352340)에 통과시켰다. 10μM Y-27632/PBS(-)로 1회 세정한 후, 10μM Y-27632/PBS(-)에 재현탁하고, Countess 자동 셀카운터를 이용하여 세포수를 측정하였다.
PBS(-)로 희석한 3.7% 파라포름알데히드에 현탁하고, 실온에서 10분간 고정하였다. PBS(-)로 2회 세정 후, 1.5% 소태아혈청(FBS) 함유 PBS(-)에 현탁하고, 4℃에서 하룻밤 정치하였다. 이 세포 현탁액에 아래의 항체, isotype control 또는 재조합 단백질을 첨가하고, 얼음 상에 1시간 동안 정치하였다.
·FITC Mouse anti-SSEA4(BD, #560126)
·FITC Mouse IgG3 control(BD, #555588)
·Alexa Fluor 488 Mouse anti-Oct3/4(BD, #555588)
·Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Isotype control(BD, #557782)
·rBC2LCN-FITC(후지필름 와코순약, #180-01192)
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Oct3/4를 첨가한 세포현탁액 및 Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Isotype control을 첨가한 세포현탁액에는 0.2% NP-40을 첨가하여 항체 반응과 병행하여 투과처리를 실시하였다. rBC2LCN-FITC의 음성 대조군으로서 미첨가의 세포 현탁액을 준비하였다. 항체 반응액을 제거한 후, 1.5% FBS 함유 PBS(-)로 1회 세정하고, D-PBS에 재현탁하였다. 이 세포 현탁액을 얼음위에 보존하고, BD FACSCelesta 세포측정기로 미분화 마커를 검출하였다.
대조군으로서, 6-well 플레이트(코닝, #353046)를 사용하여 2차원 유지배양된 hiPS 세포를 사용하였다. 유지배양 7일째의 hiPS 세포에 세포 박리액을 첨가하여 37℃에서 5분간 인큐베이션하고, 세포 박리액을 흡인 제거하고, PBS(-)로 세정한 후, 10μM Y-27632를 함유하는 StemFit AK02N 1mL/well을 첨가하고 셀 스크레이퍼를 사용하여 hiPS 세포를 회수하였다. 반복 피펫팅으로 단일세포까지 분산시킨 후, 세포현탁액 10μL와 0.4% 트리판 블루 10μL를 혼합하고, Countess 자동 셀카운터를 이용하여 세포 수를 측정하였다. 10μM Y-27632/PBS(-)로 2회 세정한 후, PBS(-)로 희석한 3.7% 파라포름알데히드에 현탁하고, 실온에서 10분간 고정하였다. 이후, 상기 피브린겔을 이용한 3차원 포매배양한 hiPS 세포에서의 순서와 동일한 순서로, 항체 처리 및 미분화 마커 검출을 실시하였다.
결과를 도 10에 나타냈다. (A)는 SSEA4의 검출 결과, (B)는 OCT3/4의 검출 결과, (C)는 rBC2LCN의 검출 결과이다. 각 상단은 2차원 유지배양한 hiPS 세포의 결과, 하단은 피브린겔을 사용하여 3차원 포매배양한 hiPS 세포의 결과이다. 피브린겔을 이용하여 3차원 포매배양한 hiPS 세포는, 2차원 유지배양한 hiPS 세포와 마찬가지로 미분화성을 유지하고 있는 것으로 나타났다.
[실시예 7: 퍼레칸 첨가형 Chimera-511의 제작, 정제 및 활성 평가]
(1) 인간 퍼레칸 도메인 1을 연결한 Chimera-α5의 발현벡터의 구축
퍼레칸은 기저막의 주요한 헤파란 황산 프로테오글리칸이다. 성장인자 결합활성을 갖는 헤파란 황산 사슬은 도메인 1에 결합하고 있다. 성장인자 결합활성을 갖는 Chimera-511을 제작하기 위해, 인간 퍼레칸의 도메인 1을 Chimera-α5의 C-말단에 융합시킨 융합단백질(이하, 「Chimera-α5(+P)」라고 함)을 이하와 같이 하여 제작했다. 우선, WO2014/199754A1에 기재된 순서에 따라 구축한 인간 퍼레칸의 도메인 1과 LM5E8 단편의 융합단백질(이하 「LMα5E8(+P)」라고 함)의 발현벡터를 주형으로 하여, 퍼레칸 D1 도메인을 포함하는 LMα5E8(+P)의 C-말단영역을 코딩하는 DNA 단편을 제한효소 ClaI 및 NotI로 잘라냈다. 이것을 Chimera-α5의 발현벡터의 해당 제한효소 부위에 삽입하여, Chimera-α5(+P)의 발현벡터를 구축하였다.
(2) 퍼레칸 첨가형 Chimera-511(이하 「Chimera-511P」라고 함)의 발현 및 정제
Chimera-511P의 발현은 구축한 각 사슬의 발현벡터를 293-F 세포에 도입하여 실시하였다. 즉, Chimera-α5(+P), Chimera-β1 및 Chimera-γ1의 발현벡터를 293-F 세포에 도입하였다. 1.0×109개의 293-F 세포(1.0×106 cells/mL)에 트랜스펙션 시약 293 fectin 및 Opti-MEM을 사용하여 각 사슬 발현벡터를 400μg씩 동시에 형질감염하고, 72시간 배양한 후, 배양액을 회수하였다. 회수된 배양액을 1,000×g에서 10분간 원심분리하고, 상청을 다시 15,000×g에서 30분간 원심분리하여, 세포 및 불용물을 제거하였다. 배양 상청에 10mL의 complete His-Tag Purification Resin(Roche)을 첨가하고, 하루밤 배양하여 목적 단백질을 흡착시켰다. complete His-Tag Purification Resin을 회수하고 HBS(pH 8.0)로 세정한 후, 250mM 이미다졸을 용해한 HBS(pH 8.0)로 용출시켰다. 용출 분획은 A280의 흡광도 측정에 의해 확인하였다.
목적 단백질을 함유하는 용출 분획을 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(Merck Millipore)를 사용하여 농축한 후, Superose 6 Increase 10/300GL(GE Healthcare)에 의한 겔여과 크로마토그래피에 투입하고, HBS(pH 7.4)를 사용하여 유속 0.5mL/min으로 용출하였다. 용출 분획 중의 목적 단백질량은 A280의 흡광도 및 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 겔여과 크로마토그래피 후의 정제물을 0.22μm 디스크 주사기필터(Merck Millipore, SLGV033RS)로 멸균한 후 -80℃에서 보존하였다.
(3) 인테그린 결합 분석
실시예 1(5)에 기재된 방법을 사용하여, Chimera-511P의 α6β1 인테그린에 대한 결합활성을 측정하였다.
인테그린 결합 분석의 결과를 도 11에 나타냈다. α6β1 인테그린은 용량 의존적으로 Chimera-511P와 결합하였고, 겉보기 해리상수는 0.90nM이었다. 이 결과로부터, Chimera-511P는 Chimera-511이나 LM511E8과 거의 동등하게 α6β1 인테그린에 대한 결합활성을 유지하고 있다고 생각되었다.
(4) 피브리노겐 결합 분석
(4-1) 플레이트에 코팅
HBS(pH 7.4)로 최종농도 100nM이 되도록 인간 피브리노겐을 희석한 후, 96-well 플레이트에 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 하루밤 천천히 진탕하면서 코팅을 실시하였다.
(4-2) 트롬빈 첨가에 의한 Chimera-511P의 피브리노겐으로의 결합
인간 피브리노겐으로 코팅된 96-well 플레이트에 1% Skim/TBST를 200μL/well씩 첨가하고, 플레이트를 세정하였다. 이어서 1% Skim/TBST를 200μL/well씩 첨가하고, 쉐이커 상에 진탕하면서 실온에서 1시간 블로킹을 실시하였다. TBST로 1회 세정한 플레이트에 0.5 NIH units/mL 트롬빈 용액을 25μL/well씩 첨가한 후, HBS(7.4)로 최종농도가 0.3125 nM, 0.625 nM, 1.25 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM이 되도록 Chimera-511P를 희석한 용액을 25 μL/well씩 첨가하고, 실온에서 쉐이커 상에 진탕하면서 1시간 반응시켰다. 대조군으로서, 트롬빈 용액 대신에 PBS(-)를 25μL/well씩 첨가한 후, Chimera-511P를 단계 희석한 용액을 25μL/well씩 첨가하고, 동일하게 실온에서 진탕하며 1시간 반응시켰다.
(4-3) 결합된 Chimera-511P 량의 측정
피브리노겐에 결합된 Chimera-511P는 항라미닌 α5 사슬 항체 4C7(Merck Millipore, MAB1924)을 사용하여 정량하였다. TBST로 3,000배 희석한 항라미닌 α5사슬 항체 4C7을 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 셰이커 상에 1시간 반응시켰다. 200μL/well의 TBST로 3회 세정한 후 TBST로 희석한 10nM Donkey anti-Mouse IgG/HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories, #715-035-150)를 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 쉐이커상에 1시간 반응시켰다. 200 μL/well의 TBST로 3회 세정한 후, 0.04% H2O2를 포함하는 25 mM 시트르산/50mM Na2HPO4완충액으로 최종농도 0.4mg/mL가 되도록 용해시킨 o-phenylenediamine을 50μL/well씩 첨가하여 2분 반응시켰다. 2.5M H2SO4로 반응을 정지시킨 후, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 490nm에서의 발색기질의 흡광도를 측정하였다.
결과를 도 12에 나타냈다. Chimera-511P는 트롬빈 존재 하에서 용량 의존적으로 피브리노겐에 결합하였으나, 트롬빈이 없으면 결합하지 않았다. 이 결과는 Chimera-511과 마찬가지로 Chimera-511P가 트롬빈에 의해 Chimera-α5(+P)사슬과 Chimera-β1사슬의 N-말단영역에서 절단되고, 이에 의해 노출된 A knob와 B knob가 플레이트에 코팅된 피브리노겐의 a-hole과 b-hole에 결합했음을 시사한다.
[실시예 8: Chimera-511P를 조합한 피브린겔을 이용한 세포 배양]
실시예 2와 동일한 순서로, Chimera-511P의 최종농도를 50nM로 하여 hiPS 세포를 포매배양하였다. 음성 대조군으로서, Chimera-511P를 첨가하지 않은 피브린겔을 사용하여 hiPS 세포를 포매배양하였다.
배양 7일째의 hiPS 세포를 올인원 형광현미경으로 관찰한 결과를 도 13에 나타냈다. (A)는 음성 대조(Fibrin만), (B)는 50nM Chimera-511P를 첨가한 피브린겔에서 배양한 결과이다. 왼쪽은 웰 전체의 이미지이고 오른쪽은 왼쪽 프레임의 확대 이미지이다. (A) 음성 대조군에서는 배양 7일째에 세포집합체가 관찰되지 않았다. 한편, (B) 50nM Chimera-511P를 포함하는 피브린겔 내에서 배양한 경우에는, 증식한 hiPS 세포의 세포집합체가 다수 관찰되었다.
[실시예 9: 라미닌 511 이외의 라미닌 아이소폼과 피브리노겐의 융합 분자의 제작, 정제 및 활성 평가]
(1) 인간 피브리노겐에 라미닌 111, 라미닌 121, 라미닌 211, 라미닌 221, 라미닌 311, 라미닌 321, 라미닌 332, 라미닌 411, 라미닌 421, 라미닌 521의 인테그린 결합 영역을 연결한 융합단백질 발현벡터의 구축
C-말단에 10×His 태그를 부가한 인간 라미닌 α1 사슬의 융합단백질 Chimera-α1(마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGβ(Gln31-Asn194)/LMα1(Leu2099-Pro2683)/10×His)의 발현벡터는, 실시예 1(2)에 기재된 방법에 따라 인간 라미닌 α1E8 단편의 발현벡터(Hiroyuki Ido et al. J Biol Chem 283:28149-28157, 2008)를 주형으로 하여 제작하였다. 동일하게, 인간 라미닌 α2 사슬의 융합단백질 Chimera-α2(마우스 Ig-κ 사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGβ (Gln31-Asn194)/LMα2(Ile2127-Asp2720)/10×His), 인간 라미닌 α3 사슬의 융합단백질 Chimera-α3(마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGβ(Gln31-Asn194)/LMα3(Met2370-Leu2937)/10×His),인간 라미닌 α4 사슬의 융합단백질 Chimera-α4(마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGβ(Gln31-Asn194)/LMα4(Ile815-Leu1412)/10×His)의 발현벡터를 인간 라미닌 α2E8 단편(Hiroyuki Ido et al. J Biol Chem 283:28149-28157, 2008), 인간라미닌 α3E8 단편(Takamichi Miyamzaki et al. Nature Commun 3:1236, 2012), 인간 라미닌 α4E8 단편(Ryo Ohta et al. Sci Rep 6:35680, 2016)의 발현벡터를 각각 주형으로 하여 제작하였다. 또한, Chimera-α1 및 Chimera-α2에 대해서는, 인간 피브리노겐 β사슬(「FBGβ(Met1-Gln491」)과 인간 라미닌 α1 사슬 또는 α2 사슬의 연결부에 N형 당사슬 부가서열(Asn-Xaa-Ser) )이 발생하므로, 인간 피브리노겐 β사슬 Asn194를 글루타민(Gln)으로 치환한 융합단백질의 발현벡터를 각각 제작하였다.
인간 라미닌 β2 사슬의 융합단백질 Chimera-β2(마우스 Ig-κ 사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGα(Ala20-His151)/LMβ2(Leu1773-Gln1798)는 실시예 1에 기재된 방법에 따라 인간 라미닌 β2E8 단편의 발현벡터(Yukimasa Taniguchi et al. J Biol Chem 284:7820-7831, 2009)를 주형으로 하여 제작하였다. 동일하게, 인간 라미닌 β3 사슬의 융합단백질 Chimera-β3(마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGα(Ala20-His151)/LMβ3(Leu1147-Lys1172)의 발현벡터와 인간 라미닌 γ2 사슬의 융합단백질 Chimera-γ2(마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGα(Ala20-His151)/LMγ2(Ile1163-Gln1193)의 발현벡터를 인간 라미닌 β3E8 단편의 발현벡터(Takamichi Miyamzaki et al. Nature Commun 3:1236, 2012)와 인간 라미닌 γ2E8 단편의 발현벡터(Takamichi Miyamzaki et al., Nature Commun 3:1236, 2012)를 주형으로 하여 제작하였다.
(2) 인간 피브리노겐에 라미닌 111, 라미닌 121, 라미닌 211, 라미닌 221, 라미닌 311, 라미닌 321, 라미닌 332, 라미닌 411, 라미닌 421, 라미닌 521의 인테그린 결합 영역을 연결한 융합단백질(Chimera-111, Chimera-121, Chimera-211, Chimera-221, Chimera-311, Chimera-321, Chimera-332, Chimera-411, Chimera-421, Chimera-521)의 발현 및 정제
Chimera-111은 실시예 1(3)에 기재된 방법에 따라 Chimera-α1, Chimera-β1, Chimera-γ1의 발현벡터를 293-F 세포에도입하여 발현시켰다. 동일하게, Chimera-121, Chimera-211, Chimera-221, Chimera-311, Chimera-321, Chimera-332, Chimera-411, Chimera-421, Chimera-511, Chimera-521은 Chimera-α1, Chimera-α2, Chimera-α3, Chimera-α4, Chimera-α5, Chimera-β1, Chimera-β2, Chimera-β3, Chimera-γ1, Chimera-γ2의 각 발현벡터를 각 라미닌 서브유닛 사슬의 조성에 따라 조합하여 293-F 세포에도입하여 발현시켰다.
배양 개시로부터 72시간 후, 배양액을 회수하고, 원심 조작에 의해 배양 상청을 회수하였다. 실시예 1(3)에 기재된 방법에 따라, Chimera-α사슬의 C-말단에 부가한 10×His 태그를 이용한 친화성 크로마토그래피와 Superose 6 Increase 10/300GL (GE Healthcare)를 이용한 겔여과 크로마토그래피를 조합하여, 배양 상청으로부터 융합단백질을 정제하였다. 정제된 융합단백질을 0.22μm 디스크 주사기 필터(Merck Millipore, SLGV033RS)로 멸균한 후 -80℃에 보존하였다.
(3) Chimera-111, Chimera-121, Chimera-211, Chimera-221, Chimera-311, Chimera-321, Chimera-332, Chimera-411, Chimera-421, Chimera-521의 SDS-PAGE 분석
(3-1) 융합단백질의 발현 확인
각 융합단백질의 발현벡터를 도입한 293-F 세포의 배양액을 배양 개시로부터 72시간 후에 회수하고, 배양 상청 중에 목적하는 융합단백질이 발현하고 있는 것을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 배양 상청 5μL에 5xSDS sample treatment buffer 1.3μL를 첨가하고, 95℃에서 5분 처리한 후, 5%-20%의 농도 구배를 가지는 폴리아크릴아미드겔(ATTO, #2331830)에 투입하여, 15mA로 115분간 전기영동하였다. 전기영동은 Laemmli 방법에 따라 25mM 트리스, 192mM 글리신, 0.1 % 도데실 황산 소듐으로 이루어진 완충액을 사용하여 비환원 조건에서 실시하였다. 전기영동 후, 분리된 단백질을 polyvinylidene difluoride 막에 전사하였다. 막 상에 전사된 융합단백질은 Chimera-α1, Chimera-α2, Chimera-α3, Chimera-α4, Chimera-α5의 C-말단에 첨가된 10×His 태그에 대한 항체(Penta-His HRP conjugate; QIAGEN # 34460)를 이용하여 검출하였다.
결과를 도 14에 나타냈다. 모든 융합단백질의 배양 상청으로부터 250kDa의 분자량 마커보다 고분자량 측에 육량체 밴드가 검출되었다. 또한, 100kDa의 분자량 마커의 위치에 소량의 Chimera-α1/Chimera-α2/Chimera-α3/Chimera-α4/Chimera-α5의 밴드가 검출되었다. 이들 결과로부터, Chimera-511과 마찬가지로, 각 융합단백질이 육량체로서 발현하고 있음이 확인되었다.
(3-2) 정제된 융합단백질의 순도 검정
5%-20%의 농도 구배를 가지는 폴리아크릴아미드겔(ATTO, #2331830)에 정제한 Chimera-111, Chimera-221, Chimera-332, Chimera-411, Chimera-421을 각각 1.2μg/well 적용하고, 20mA에서 75분 동안 전기영동하였다. 영동 후, Quick-CBB(후지필름 와코순약, #299-50101)를 이용하여 겔을 염색하고, 분리된 단백질을 가시화하였다.
결과를 도 15에 나타냈다. 비환원 조건에서, 모든 융합단백질에서 250kDa의 분자량 마커보다 고분자량 측에서 육량체 밴드 1개가 검출되었다. 환원조건에서는, Chimera-α1/Chimera-α2/Chimera-α3/Chimera-α4의 밴드가 100kDa의 분자량 마커 위치에서 검출되고, Chimera-β1/Chimera-β2/Chimera-β3/Chimera-γ1/Chimera-γ2의 밴드가 15 kDa 분자량 마커의 약간 고분자량측 위치에서 검출되었다. 이들 결과로부터, 각 융합단백질이 고순도로 정제되어 있음이 확인되었다.
(4) Chimera-111, Chimera-221, Chimera-332, Chimera-421의 피브리노겐 결합활성 및 인테그린 결합활성의 측정
(4-1) 피브리노겐 결합활성
정제된 Chimera-111, Chimera-221, Chimera-332, Chimera-421의 피브리노겐 결합활성을 실시예 1(6)에 기재된 방법에 준하여 측정하였다. 96-well 플레이트에 HBS(pH 7.4)로 최종농도가 100nM이 되도록 희석한 인간 피브리노겐을 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 하룻밤 천천히 진탕하면서 코팅을 실시하였다. 코팅후, 1% Skim/TBST를 200μL/well씩 첨가하여 플레이트를 세정하였다. 이어서 1% Skim/TBST를 200μL/well씩 첨가하고, 쉐이커 상에 진탕하면서 실온에서 1시간 블로킹을 실시하였다. TBST로 1회 세정한 플레이트에 0.5 NIH units/mL 트롬빈 용액을 25μL/well씩 첨가한 후, HBS(pH 7.4)로 최종농도가 0.3125 nM, 0.625 nM, 1.25 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM 되도록 각 융합단백질을 희석한 용액을 25μL/well씩 첨가하고, 실온에서 셰이커 상에 진탕하며 1시간 반응시켰다. 대조군에는 트롬빈 용액 대신에 HBS(pH 7.4)를 25μL/well씩 첨가하였다.
결합된 융합단백질은 Chimera-α 사슬의 C-말단에 부가한 10×His 태그에 결합하는 항체(Penta-His HRP conjugate; QIAGEN #34460; 이하 「His 태그 항체」라고 함)를 사용하여 정량하였다. 200μL/well의 TBST로 플레이트를 3회 세정한 후, 1% Skim/TBST로 3,000배 희석한 His 태그 항체를 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 셰이커 상에 1시간 반응시켰다. 200μL/well의 TBST로 3회 세정한 후, 0.04% H2O2를 포함하는 25mM 시트르산/50mM Na2HPO4완충액으로 최종농도 0.4mg/mL가 되도록 용해시킨 ο-phenylenediamine을 50μL/well씩 첨가하여 2분 반응시켰다. 2.5M H2SO4로 반응을 정지시킨 후, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 490nm에서의 발색기질의 흡광도를 측정하였다.
결과를 도 16에 나타냈다. 각각의 융합단백질은 트롬빈 존재 하에서 용량 의존적으로 피브리노겐에 결합하였다. 트롬빈이 없으면 결합하지 않았다. 이 결과는 Chimera-511과 마찬가지로 각 융합단백질이 트롬빈 의존적으로 피브리노겐에 결합하는 활성을 보유하고 있음을 보여주고 있다.
(4-2) 인테그린 결합활성
각 융합단백질은 라미닌의 인테그린 결합 영역을 포함하기 때문에, 96-well 플레이트에 코팅한 피브리노겐에 트롬빈 의존적으로 결합한 융합단백질에 대해, 인테그린 결합활성을 이용하여 정량하는 것이 가능하다. 즉, 결합된 융합단백질을 His-태그 항체 대신에 라미닌 결합성 인테그린을 사용하여 정량할 수 있다. 라미닌 결합성 인테그린 중에서도 라미닌-111과 라미닌-221은 α7X2β1 인테그린에 강하게 결합하고, 라미닌-332, 라미닌-421은 α6β1 인테그린에 강하게 결합한다(Yukimasa Taniguchi et al., J Biol Chem 284:7820-7831, 2009; Ryoko Nishiuchi et al., Matrix Biol 25:189-197, 2006; Taichi Ishikawa et al., Matrix Biol 38:69-83, 2014). 이 때문에, 피브리노겐에 결합한 Chimera-111과 Chimera-221은 α7X2β1 인테그린을 이용하여 정량하고, 피브리노겐에 결합한 Chimera-332, Chimera 421은 α6β1 인테그린을 이용하여 정량하였다.
α7X2β1 인테그린과 α6β1 인테그린은 Ido 등의 방법(Hiroyuki Ido et al., J Biol Chem 282(15):11144-11154, 2007)에 의해 제작하였다. 상기 (4-1)에 기재된 방법에 따라, 96-well 플레이트에 코팅된 피브리노겐으로 정제된 Chimera-111, Chimera-221, Chimera-332, Chimera-421을 각각 결합시켰다. 결합된 인테그린을 실시예 1(5-2)에 기재된 방법에 준하여 정량하였다. 구체적으로는, 1mM MnCl2, 또는 10mM EDTA를 포함하는 0.1% BSA/TBST로 최종농도가 30nM이 되도록 희석한 인테그린 용액을 제조하고, 이것을 플레이트에 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 쉐이커상에 진탕하면서 1시간 반응시켰다. 200μL/well의 1mM MnCl2/0.1%BSA/TBST,또는 10mM EDTA/0.1% BSA/TBST로 3회 세정한 후, 1mM MnCl2/0.1%BSA/TBST로 희석한 의 비오틴표지 Velcro항체(Takagi, J., Erickson, H. P. and Springer, T. A. (2001) Nat. Struct. Biol. 8, 412-416의 기재에 따라 제작)를 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 셰이커상에 진탕하면서 30분간 반응시켰다. 200μL/well의 1mM MnCl2/0.1%BSA/TBST로 3회 세정한후, 1mM MnCl2/0.1%BSA/TBST로 희석한 0.53μg/mL의 streptavidin-horseradish peroxidase(Thermo Fisher Scientific, #21126)을 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 쉐이커상에 진탕하면서 분간 반응시켰다. 200μL/well의 1mM MnCl2/0.1%BSA/TBST로 3회 세정한 후, 0.04% H2O2를 포함하는 25mM 시트르산/50 mM Na2HPO4완충액으로 최종농도가 0.4mg/mL가 되도록 용해시킨 ο-phenylenediamine(OPD; 후지필름 와코순약 #615-28-1)을 50μL/well씩 첨가하여 2분~5분 반응시켰다. 2.5M H2SO4로 반응을 정지시킨 후, 마이크로 플레이트 리더(Molecular Devices EMax)를 사용하여 490nm에서의 발색기질의 흡광도를 측정하였다.
결과를 도 17에 나타냈다. 모든 융합단백질이 1mM MnCl2 존재하에서 인테그린에 강하게 결합하고, 10mM EDTA 존재하에서는 결합하지 않았다. 한편, 96-well 플레이트에 코팅한 피브리노겐에, 트롬빈이 없는 상태에서 융합단백질을 결합시키면, 검출에 His 태그 항체를 사용한 경우와 마찬가지로, 인테그린의 결합은 검출되지 않았다. 이 결과는, 융합단백질이 피브리노겐과 융합하는 라미닌 아이소폼 타입의 차이에 관계없이, 트롬빈 의존적으로 피브리노겐에 결합할 수 있음을 확인함과 동시에, 피브리노겐에 결합된 상황에서도 인테그린 결합활성을 유지하고 있음을 보여준다.
[실시예 10: 라미닌 511 이외의 라미닌 아이소폼과 피브리노겐의 퍼레칸 첨가형 융합분자의 제작, 정제 및 활성 평가]
(1) 인간 퍼레칸 도메인 1을 연결한 Chimera-α1, Chimera-2, Chimera-α3, Chimera-α4의 발현벡터의 구축
인간 퍼레칸의 도메인 1을 Chimera-α1의 C-말단에 융합시킨 융합단백질(이하, 「Chimera-α1(+P)」이라 함)의 발현벡터는, WO2014/199754A1에 기재된 절차에 따라 구축된 인간 퍼레칸의 도메인 1을 라미닌 α1E8 단편의 C-말단에 첨가한 융합단백질의 발현벡터를 제작하고(W02018/088501A1), 이것을 주형으로 하여, 실시예 7(1)에 기재된 방법에 따라 구축하였다. 동일하게, 인간 퍼레칸의 도메인 1을 Chimera-α2, Chimera-3, Chimera-α4의 C-말단에 융합시킨 융합단백질(이하, 각각 「Chimera-α2(+P)」, 「Chimera-α3(+P)」, 「Chimera-α4(+P)」라고 함)의 발현벡터를 인간 퍼레칸의 도메인 1이 C-말단에 첨가된 라미닌 α2E8 단편, 라미닌 α3E8 단편, 라미닌 α4E8 단편의 발현벡터(WO2018/088501A1)를 주형으로 하여 제작하였다.
(2) 퍼레칸 첨가형의 Chimera-111, Chimera-121, Chimera-211, Chimera-221, Chimera-311, Chimera-321, Chimera-332, Chimera-411, Chimera-421, Chimera-521의 발현 및 정제
퍼레칸 첨가형 Chimera-111(이하, 「Chimera-111P」라고 함)은 실시예 7(2)에 기재된 방법에 따라 Chimera-α1(+P), Chimera-1, Chimera-γ1의 발현벡터를 293-F 세포에 도입하여 발현시켰다. 동일하게, 퍼레칸 첨가형의 Chimera-121, Chimera-211, Chimera-221, Chimera-311, Chimera-321, Chimera-332, Chimera-411, Chimera-421, Chimera-521(이하, 각각 「Chimera- 121P」, 「Chimera-211P」, 「Chimera-221P」, 「Chimera-311P」, 「Chimera-321P」, 「Chimera-332P」, 「Chimera-411P」, 「Chimera-421P」, 「Chimera-521P」라고 함)는, Chimera-α1(+P), Chimera-α2(+P), Chimera-α3(+P), Chimera-α4(+P), Chimera-α5(+P), Chimera-β1, Chimera-β2, Chimera-β3, Chimera-γ1, Chimera-γ2의 각 발현벡터를 각각의 라미닌 서브유닛 사슬의 조성에 따라 조합하고, 실시예 7(2)에 기재된 방법을 사용하여 293-F 세포에 도입하고, 각 융합단백질을 발현시켰다. 배양 개시로부터 72시간 후, 배양액을 회수하고, 원심 조작에 의해 배양 상청을 회수하였다.
퍼레칸 D1 도메인에 결합하는 헤파란 황산사슬는 4차 암모늄기를 갖는 음이온 교환체에 강하게 결합한다. 이 성질을 이용하여, 10×His 태그를 이용한 친화성 크로마토그래피와 겔여과 크로마토그래피를 사용하지 않고, 음이온 교환 크로마토그래피만으로 정제하는 것이 가능하다. 구체적으로, 회수된 배양액 300mL를 500×g에서 10분간 원심분리하고, 그 상청을 추가로 10,000×g에서 30분간 원심분리하여, 세포 및 불용물을 제거하였다. HiTrap Q Fast Flow(5mL)(Cytiva, 17515601) 2개를 AKTA avant 25에 연결하고, 상청을 2.5mL/min으로 컬럼에 흘렸다. 2mM NaCl 함유 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 100mL를 5mL/min으로 흘려 컬럼을 세정한 후, 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 1M NaCl 함유 20mM Tris-HCl(pH 8.0)에 의해 흡착된 단백질을 용출시켰다. 목적 단백질을 함유하는 용출 분획을 SDS-PAGE 분석으로 결정한 후, 해당 분획을 하나로 모으고, 20mM Tris-HCl(pH 8.0)로 NaCl 농도를 약 500 mM으로 조정하였다. 이어서, HiTrap®Q HP(5mL)(Cytiva, 17115401) 1개를 AKTA avant 25에 연결하고, 상기 분획 풀을 2.5mL/min으로 컬럼에 흘려넣었다. 450-500mM NaCl 함유 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 50mL를 2.5mL/min로 흘려 컬럼을 세정한 후, 2M NaCl 함유 20mM Tris-HCl(pH 8.0)에 의해 흡착된 단백질을 용출하였다. 목적 단백질을 포함하는 용출 분획을 SDS-PAGE 분석으로 결정한 후, 해당 분획을 하나로 모으고, HBS(-)(pH 7.4)로 투석하였다. 투석 후 정제물을 0.22μm 디스크 주사기 필터(Merck Millipore, SLGVJ13SL)로 멸균한 후, Pierce BCA Protein Assay Kit(ThermoFisher Scientific, 23227)로 단백질 농도를 결정하고, -80℃에 보존하였다.
(3) Chimera-111P, Chimera-121P, Chimera-211P, Chimera-221P, Chimera-311P, Chimera-321P, Chimera-332P, Chimera-411P, Chimera-421P, Chimera-521P의 SDS-PAGE 분석
(3-1) 퍼레칸 첨가형 융합단백질의 발현 확인
각 융합단백질의 발현벡터를 도입한 293-F 세포의 배양액을 배양 개시로부터 72시간 후에 회수하고, 배양 상청 중에 목적 융합단백질이 발현하고 있는 것을, 비환원 조건하에서의 SDS-PAGE에 의해 확인했다. 배양 상청 16μL에 5xSDS sample treatment buffer 4μL를 첨가하여, 95℃에서 5min 처리한 후, 5%-20%의 농도구배를 갖는 폴리아크릴아미드겔(ATTO, #2331830)에 투입하여, 20mA로 75분 동안 전기영동하였다. 전기영동 후, 분리된 단백질을 polyvinylidene difluoride 막으로 전사하였다. 막 상에 전사된 융합단백질은 Chimera-α1P, Chimera-2P, Chimera-α3P, Chimera-α4P, Chimera-α5P의 C-말단에 첨가된 10×His 태그에 대한 항체(Penta-His HRP conjugate; QIAGEN # 34460)을 이용하여 검출하였다.
결과를 도 18에 나타냈다. 모든 퍼레칸 첨가형 융합단백질의 배양 상청으로부터, 비환원 조건하에 있어서, 250kDa의 분자량 마커보다 고분자량측에 조금 넓은 밴드 1개가 검출되고, 각 융합단백질이 설계대로인 6단량체로서 발현되는 것이 확인되었다. 퍼레칸 첨가형 융합단백질의 발현량은 라미닌 아이소폼의 종류에 따라 다르며, 라미닌 1사슬, 라미닌 α2사슬, 라미닌 4사슬을 포함하는 융합단백질(Chimera-111P, Chimera-121P, Chimera-211P, Chimera-221P, Chimera-411P, Chimera-421P)는 라미닌 α3 사슬와 라미닌 α5 사슬을 포함하는 융합단백질(Chimera-311P, Chimera-321P, Chimera-332P, Chimera-511P, Chimera-521P)에 비해, 발현량이 많은 경향이 확인되었다.
(3-2) 정제된 융합단백질의 순도 검정
정제된 Chimera-111P, Chimera-221P, Chimera-332P, Chimera-421P, Chimera-511P를 각각 1.2μg/well로 5%-20%의 농도구배를 갖는 폴리아크릴아미드겔(ATTO, #2331830)에 투입하고, 20mA에서 75분 동안 전기영동하였다. 영동 후, Quick-CBB(후지필름 와코순약, #299-50101)를 이용하여 겔을 염색하고, 분리한 단백질을 가시화하였다.
결과를 도 19에 나타냈다. 비환원 조건에서는, 모든 융합단백질에 있어서 250kDa의 분자량 마커보다 고분자량측에 육량체의 밴드가 검출되고, 환원조건에서는, 분자량 150kDa 내지 250kDa보다 고분자량측의 영역에 걸쳐 확산성 Chimera-α1 (+P)/Chimera-α2(+P)/Chimera-α3(+P)/Chimera-α4(+P)/Chimera-α5(+P)의 밴드가 검출되었다. 헤파란 황산 사슬을 포함하는 단백질(헤파란 황산 사슬 프로테오글리칸)은 헤파란 황산 사슬의 사슬 길이 및 황산화도의 불균일성으로 인해, SDS-PAGE 분석에서는 확산된 광범위한 밴드를 제공하는 것으로 알려져있다(Shaoliang Li et al. J Biol Chem 285:36645-36655, 2010). 환원조건하의 SDS-PAGE에서, 분자량 150kDa 내지 250kDa 초과의 영역에 확산성 밴드가 출현하는 것은 Chimera-α1(+P)/Chimera-2(+P)/Chimera-3(+P)/Chimera-4(+P)/Chimera-5(+P)의 퍼레칸 D1 도메인에 충분한 양의 헤파란 황산 사슬이 첨가되었음을 나타낸다. 환원조건하에서는, 분자량 15kDa로부터 조금 고분자량측의 위치에 Chimera-β1/Chimera-β2/Chimera-β3/Chimera-γ1/Chimera-γ2도 검출되었다. 또한, 환원조건하에서 분자량 100kDa의 영역에 검출된 샤프한 밴드는, 퍼레칸 D1 도메인이 절단된 Chimera-α(+P)사슬의 밴드인 것이, 퍼레칸 D1 도메인을 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다.
(4) Chimera-111P, Chimera-221P, Chimera-332P, Chimera-421의 피브리노겐 결합활성 및 인테그린 결합활성의 측정
정제된 Chimera-111P, Chimera-221P, Chimera-332P, Chimera-421P의 피브리노겐 결합활성 및 인테그린 결합활성을 실시예 1(6)에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 96-well 플레이트에 HBS(pH 7.4)로 최종농도가 100nM이 되도록 희석한 인간 피브리노겐을 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 하룻밤 천천히 진탕하면서 코팅을 실시하였다. 코팅 후, 1% Skim/TBST를 200μL/well씩 첨가하고, 플레이트를 세정하였다. 이어서 1% Skim/TBST를 200μL/well씩 첨가하고, 쉐이커 상에서 진탕하며 실온에서 1시간 블로킹을 실시하였다. TBST로 1회 세정한 플레이트에 0.5 NIH units/mL 트롬빈 용액을 25 μL/well씩 첨가한 후, HBS(7.4)로 최종농도가 0.3125 nM, 0.625 nM, 1.25 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM이 되도록 각 융합단백질을 희석한 용액을 25μL/well씩 첨가하고, 실온에서 셰이커 상에 진탕하며 1시간 반응시켰다. 대조군에는 트롬빈 용액 대신에 HBS를 25μL/well씩 첨가하였다.
퍼레칸 첨가형 융합단백질은 라미닌의 인테그린 결합 영역을 포함하기 때문에, 결합된 융합단백질은 인테그린 결합활성을 지표로 하여 측정하였다. 구체적으로는, 실시예 9(4-2)에 기재된 방법에 의해, 피브리노겐에 결합한 Chimera-111P 및 Chimera-221P는 α7X2β1 인테그린을 사용하여 정량하고, 피브리노겐에 결합한 Chimera-332P 및 Chimera-421P는 α6β1 인테그린을 사용하여 정량하였다.
결과를 도 20에 나타냈다. 모든 퍼레칸 첨가형 융합단백질이 1mM MnCl2존재하에서 인테그린에 강하게 결합하였고, 10mM EDTA 존재하에서는 결합하지 않았다. 한편, 트롬빈이 없을 때 퍼레칸 첨가형 융합단백질을 결합시킨 경우에는, 인테그린의 결합은 검출되지 않았다. 이들 결과는 퍼레칸 첨가형 융합단백질이 피브리노겐과 융합하는 라미닌 아이소폼의 타입의 차이와 관계없이, 트롬빈 의존적으로 피브리노겐에 결합하는 활성을 보유하고 있음을 보여주고, 피브리노겐에 결합된 상황에서도 인테그린 결합활성을 유지하고 있음을 보여주고 있다.
(5) Chimera-111P, Chimera-221P, Chimera-332P, Chimera-421의 성장인자 결합활성의 측정
퍼레칸은 헤파란 황산 사슬을 통해 다양한 성장인자를 포획하는 것으로 알려져 있다(Shaoliang Li et al. J Biol Chem 285:36645-36655, 2010). 퍼레칸 첨가형 융합단백질이 성장인자 결합활성을 유지하고 있음을 확인하기 위해, 헤파란 황산사슬에 결합하는 것으로 보고된 프로액티빈 A와 정제한 퍼레칸 첨가형 융합단백질의 결합활성을 측정하였다.
(5-1) 프로액티빈 A의 발현 및 정제
프로액티빈 A는, N-말단측에 6×His 태그를 첨가한 전장 인간 프로액티빈 발현벡터를 293-F 세포에 도입하여 발현시켰다. 3×108개의 293-F 세포(1.0×106cells/mL)에 형질감염 시약 293 fectin 및 Opti-MEM을 사용하여 발현벡터 360μg을 형질감염시키고, 72시간 배양을 실시한 후, 배양액을 회수하였다.
회수된 배양액을 500×g에서 10분간 원심분리하고, 그 상청을 추가로 12,000×g에서 30분간 원심분리하여 세포 및 불용물을 제거하였다. 배양 상청에 최종농도 5mM 이미다졸, 1mM Pefabloc SC PLUS(Roche, # 11873628001), 0.02%(중량/부피) 아지드화 나트륨을 첨가하고 교반에 의해 혼합하였다. cOmplete His-Tag Purification Column Prepacked(1mL)(Roche, #6781535001) 1개를 AKTA avant 25에 연결하고, 상청을 유속 1 mL/분으로 컬럼에 흘렸다. 200mM NaCl 함유 50mM Tris-HCl(pH 8.0) 10mL를 유속 1mL/min으로 흘려 컬럼을 세정한 후, 250mM 이미다졸 및 200mM NaCl을 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 8.0)에 의해 흡착된 단백질을 용출시켰다. 목적 단백질을 함유하는 용출 분획을 SDS-PAGE 분석에 의해 결정한 후, 해당 분획을 하나로 모아, 25mM Tris-HCl(pH 8.0)로 10배 희석하였다. 다음으로, RESOURCE Q(1mL)(Cytiva, 17117701) 1개를 AKTA avant 25에 연결하고, 상기 분획 풀을 유속 2mL/min 으로 컬럼에 흘렸다. 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 10mL를 유속 4mL/min으로 흘려 컬럼을 세정한 후, 1M NaCl 함유 25mM Tris-HCl(pH 8.0)에 의해 흡착된 단백질을 용출한 후, 목적 단백질을 포함하는 용출 분획을 SDS-PAGE 분석에 의해 결정하였다.
해당 분획을 Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units - 10,000 NMWL(Millipore, UFC801008)로 농축시켰다. 이어서, 농축액을 Superose 6 Increase 10/300GL(GE Healthcare)에 의한 겔여과 크로마토그래피에 투입하고, D-PBS(-)(Nacalai Tesque, 14249-95)를 사용하여 유속 0.5mL/min으로 용출한 후, 목적 단백질을 포함하는 용출 분획을 SDS-PAGE 분석에 의해 결정하였다. 정제물을 0.22μm 디스크 주사기 필터(Merck Millipore, SLGVJ13SL)로 멸균한 후, Pierce BCA Protein Assay Kit(ThermoFisher Scientific, 23227)로 단백질 농도를 측정하고, -80℃에 보존하였다.
(5-2) 프로액티빈 A의 결합 분석
HBS(pH 7.4)로 Chimera-111P, Chimera-221P, Chimera-332P, Chimera-421P, Chimera-511P를 희석하고 최종 농도가 0.31 nM, 0.63 nM, 1.25 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM 이 되도록 제조하였다. 각 희석액을 96-well 플레이트(Thermo Fisher Scientific, #442404)에 50μL/well씩 첨가하고, 4℃에서 하루밤 천천히 진탕하면서 코팅을 실시하였다.
퍼레칸 첨가형 융합단백질을 코팅한 96-well 플레이트에 1% BSA/TBST를 200μL/well씩 첨가하고, 플레이트를 세정하였다. 이어서 1% BSA/TBST를 200μL/well씩 첨가하고, 쉐이커 상에서 진탕하며 실온에서 1시간 블로킹을 실시하였다. 1% BSA/TBST로 1회 세정한 플레이트에, 30nM 프로액티빈 A를 포함하는 1% BSA/TBST를 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 셰이커 상에 1시간 반응시켰다. 200μL/well의 TBST로 3회 세정한 후, 1% BSA/TBST로 희석한 0.5μg/mLmouse anti-Activin A βA Subunit(R&D SYSTEMS、MAB3381)을 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 셰이커상에 1시간 반응시켰다. 200μL/well의 TBST로 3회 세정 후, 1% BSA/TBST로 희석한 0.4μg/mL donkey anti-mouse IgG pAb/HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories, 715-035-150)를 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 셰이커 상에 1시간 동안 반응시켰다. 200μL/well의 TBST로 3회 세정한 후, 0.04% H2O2를 포함하는 25mM 시트르산/50mM Na2HPO4완충액으로 최종농도 0.4mg/mL가 되도록 용해시킨 ο-phenylenediamine을 50μL/well씩 첨가하여 10분 반응시켰다. 2.5M H2SO4로 반응을 정지시킨 후, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 490nm에서의 발색기질의 흡광도를 측정하였다.
결과를 도 21에 나타냈다. 퍼레칸 첨가형 융합단백질은 코팅 농도 의존적으로 프로액티빈 A에 결합하는 반면, 종래의 융합단백질에서는 유의한 프로액티빈 A의 결합이 관찰되지 않았다. 이들 결과는 프로액티빈 A가 퍼레칸 도메인에 담지된 헤파란 설페이트 사슬을 통해 퍼레칸 첨가형 융합단백질에 결합됨을 보여주고 있다.
[실시예 11: 인간 피브리노겐 Aα사슬, Bβ사슬, γ사슬과 인간 라미닌 α5사슬, β1사슬, γ1사슬의 조합이 다른 융합분자의 제작]
(1) 인간 피브리노겐 Aα사슬, Bβ사슬, γ사슬과 인간 라미닌 α5사슬, β1사슬, γ1사슬의 조합이 다른 융합단백질의 발현벡터의 구축
라미닌(α사슬, β사슬, γ사슬의 헤테로 삼량체)과 피브리노겐(Aα사슬, Bβ사슬, γ사슬의 헤테로 삼량체)의 융합단백질을 제작하는 경우, 양쪽 서브유닛 사슬의 조합이 다른 아래의 세 가지 융합단백질을 만들 수 있다.
Combination-1(FBGα-LMα/FBGγ-LMβ/FBGβ-LMγ)
Combination-2(FBGγ-LMα/FBGβ-LMβ/FBGα-LMγ)
Combination-3(FBGβ-LMα/FBGα-LMβ/FBGγ-LMγ)
이 세 가지 융합단백질의 발현을 확인하기 위해, 각 융합단백질의 발현벡터를 구축하였다. Combination-3의 발현벡터는 실시예 9에 기재된 바와 같다.
<Combination-1의 발현벡터의 구축>
마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGα(Ala20-His151)/LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His로 구성된 chimera-α5, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드 /FBGγ(Tyr27-Ser132)/LMβ1(Leu1761-Leu1786)로 구성된 chimera-β1, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGβ(Gln31-Asn194)/LMγ1(Ile1579-Pro1609로 구성된 chimera-γ1의 발현벡터는 다음과 같이 구축하였다. 즉, 실시예 1에 기재된 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/LMβ1(Leu1761-Leu1786), 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/LMγ1(Ile1579-Pro1609), 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGβ(Gln31-Asn194)/LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGα(Ala20-His151)/LMβ1(Leu1761-Leu1786),마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGγ(Tyr27-Ser132)/LMγ1(Ile1579-Pro1609)의 발현벡터를 주형으로 하고, 이하의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGα(Ala20-His151), LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His,마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGγ(Tyr27-Ser132), LMβ1(Leu1761-Leu1786),마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGβ(Gln31-Asn194), LMγ1(Ile1579-Pro1609)의 DNA 단편을 증폭시켰다. 각 프라이머 세트의 리버스 프라이머의 5'측에는 익스텐션 PCR에 사용하기 위한 서열이 첨가되어있다.
(xxi) 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGα(Ala20-His151)증폭용 프라이머 세트
5'-CGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGAC-3'(forward, 서열번호 27)
5'-CAATGAGCTCTCGCACGCGGCCAATATGCTGTACTTTTTCTATGACTTTG-3'(reverse, 서열번호 28)
(xxii) LMα5(Ile2716-Ala3310)증폭용 프라이머 세트
5'-CAAAGTCATAGAAAAAGTACAGCATATTGGCCGCGTGCGAGAGCTCATTG-3'(forward, 서열번호 29)
5'-CCCTTGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3'(reverse, 서열번호 30)
(xxiii) 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGγ(Tyr27-Ser132)증폭용 프라이머 세트
5'-CGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGAC-3'(forward, 서열번호 27)
5'-GAGTGAACGGACTTCTCCTTCCAGTCTTGCTAAACTTGAGTCATGTGTTAAAATCGATGC-3' (reverse, 서열번호 31)
(xxiv) LMβ1(Leu1761-Leu1786)증폭용 프라이머 세트
5'-GCATCGATTTTAACACATGACTCAAGTTTAGCAAGACTGGAAGGAGAAGTCCGTTCACTC-3'(forward, 서열번호 32)
5'-CCCTTGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3' (reverse, 서열번호 30)
(xxv) 마우스 Ig-사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGβ(Gln31-Asn194)증폭용 프라이머 세트
5'-CGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGAC-3'(forward, 서열번호 27)
5'-GCGAATGTCCTTCATGATCTCCTCGATGTTAGTTGGGATATTGCTATTCACAGTCTCATC-3' (reverse, 서열번호 33)
(xxvi) LMγ1(Ile1579-Pro1609)증폭용 프라이머 세트
5'-GATGAGACTGTGAATAGCAATATCCCAACTAACATCGAGGAGATCATGAAGGACATTCGC-3' (forward, 서열번호 34)
5'-CCCTTGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3' (reverse, 서열번호 30)
얻은 6종류의 단편을, 이하의 프라이머 세트를 사용한 익스텐션 PCR을 실시하고, 각각 연결하여 증폭시켰다. 증폭된 DNA 단편을 제한효소 NheI와 NotI로 절단하고, pcDNA3.4+MCS의 해당 제한효소 부위에 삽입하여, combination1에 해당하는 Chimera-α5, Chimera-1 및 Chimera-γ1의 각 발현벡터를 구축하였다.
(xxvii) 각 사슬 연결 증폭용 프라이머 세트
5'-CGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGAC-3'(forward, 서열번호 27)
5'-CCCTTGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3'(reverse, 서열번호 30)
<Combination-2의 발현벡터의 구축>
마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGγ(Tyr27-Ser132)/LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His로 구성된 chimera-α5, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGβ(Gln31-Asn194)/LMβ1(Leu1761-Leu1786)으로 구성된 chimera-β1, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGα(Ala20-His151)/LMγ1(Ile1579-Pro1609)로 구성되는 chimera-γ1의 발현벡터는 다음과 같이 구축되었다. 즉, [실시예 1]에 기재된 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/LMβ1(Leu1761-Leu1786), 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/LMβ1(Ile1579-Pro1609), 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGβ(Gln31-Asn194)/LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGα(Ala20-His151)/LMβ1(Leu1761-Leu1786), 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGγ(Tyr27-Ser132)/LMγ1(Ile1579-Pro1609)의 발현벡터를 주형으로 하고, 이하의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGγ(Tyr27-Ser132), LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His, 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGβ(Gln31-Asn194), LMβ1(Leu1761-Leu1786), 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGα(Ala20-His151), LMγ1(Ile1579-Pro1609)의 DNA 단편을 증폭시켰다. 또한, 각 프라이머 세트의 리버스 프라이머의 5'측에는 익스텐션 PCR에 사용하기위한 서열이 부가되어 있다.
(xxviii) 마우스 Ig- κ 사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGγ(Tyr27-Ser132)증폭용 프라이머 세트
5'-CGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGAC-3' (forward, 서열번호 27)
5'-GAGCTCTCGCACGCGGCCAATACTTGAGTCATGTGTTAAAATCG-3' (reverse, 서열번호 35)
(xxix) LMα5(Ile2716-Ala3310)/10×His증폭용 프라이머 세트
5'-CGATTTTAACACATGACTCAAGTATTGGCCGCGTGCGAGAGCTC-3' (forward, 서열번호 36)
5'-CCCTTGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3' (reverse, 서열번호 30)
(xxx) 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGβ(Gln31-Asn194)증폭용 프라이머 세트
5'-CGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGAC-3'(forward, 서열번호 27)
5'-GGAGTGAACGGACTTCTCCTTCCAGTCTTGCTAAGTTAGTTGGGATATTGCTATTCACAGTCTCATC-3' (reverse, 서열번호 37)
(xxxi) LMβ1(Leu1761-Leu1786)증폭용 프라이머 세트
5'-GATGAGACTGTGAATAGCAATATCCCAACTAACTTAGCAAGACTGGAAGGAGAAGTCCGTTCACTCC-3' (forward, 서열번호 38)
5'-CCCTTGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3' (reverse, 서열번호 30)
(xxxii) 마우스 Ig-κ사슬 V-J2-C신호펩티드/FBGα(Ala20-His151)증폭용 프라이머 세트
5'-CGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGAC-3'(forward, 서열번호 27)
5'-GCGAATGTCCTTCATGATCTCCTCGATATGCTGTACTTTTTCTATGACTTTGCGCTTC-3' (reverse, 서열번호 39)
(xxxiii) LMγ1(Ile1579-Pro1609)증폭용 프라이머 세트
5'-GAAGCGCAAAGTCATAGAAAAAGTACAGCATATCGAGGAGATCATGAAGGACATTCGC-3' (forward, 서열번호 40)
5'-CCCTTGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3' (reverse, 서열번호 30)
(2) 인간 피브리노겐 Aα사슬, Bβ사슬, γ사슬과 인간 라미닌 α5사슬, β1사슬, γ1사슬의 조합이 다른 융합단백질 발현의 확인
Combination-1, Combination-2 및 Combination-3의 조합에 따라 발현벡터를 293-F 세포에 도입하였다. 배양 개시로부터 72시간 후에 배양액을 회수하고, 배양 상청 중에 각 융합단백질이 발현하고 있음을, 비환원 조건하에서의 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 배양 상청 5L에 5xSDS sample treatment buffer 1.3 μL를 첨가하고 95℃에서 5분 처리한 후, 5%-20%의 농도구배를 갖는 폴리아크릴아미드겔(ATTO, #2331830)에 투입하여, 15mA에서 115분간 전기영동하였다. 전기영동 후, 분리된 단백질을 polyvinylidene difluoride 막으로 전사하였다. 막상에 전사된 융합단백질은 각 combination의 Chimera-α5의 C-말단에 첨가된 10xHis 태그에 대한 항체(Penta-His HRP conjugate; QIAGEN #34460)를 사용하여 검출하였다.
결과를 도 22에 나타낸다. 피브리노겐과 라미닌의 구성 서브유닛 사슬의 조합이 Combination-3인 경우에 융합단백질의 발현량이 가장 많고, 예상되는 육량체의 분자량에 위치에 주된 밴드가 검출되었다. Combination-1과 Combination-2의 구성 서브 유닛 사슬의 조합에서도 발현량은 Combination-3보다는 낮지만, 예상되는 육량체의 분자량 위치에서 주요 밴드가 검출되었다. 이들 결과는, 피브리노겐과 라미닌의 각각의 삼량체 구조가 유지되는 한, 융합단백질의 구성사슬의 조합(피브리노겐의 Aα사슬, Bβ사슬, γ사슬과 γ라미닌의 사슬, β사슬, 1사슬의 조합)은 특정 조합으로 제한되지 않음을 보이고 있다.
또한, 본 발명은 상술한 각 실시형태 및 실시예에 한정되는 것은 아니며, 청구항에 나타낸 범위에서 여러 가지 변경이 가능하고, 다른 실시형태에 각각 개시된 기술적 수단을 적절히 조합하여 얻어진 실시형태도 본발명의 기술적 범위에 포함된다. 또한, 본 명세서에 기재된 모든 학술 문헌 및 특허 문헌은 본 명세서에 참고로 포함된다.

Claims (10)

  1. 트롬빈 처리에 의해 피브리노겐에 결합할 수 있는 피브리노겐 단편과, 인테그린 결합활성을 갖는 라미닌 단편을 포함하는, 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    추가로 성장인자 결합활성을 갖는 단백질을 포함하는 융합단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    성장인자 결합활성을 갖는 단백질이 헤파란 황산 프로테오글리칸인 융합단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 융합단백질의 트롬빈 처리 분자와 피브린으로 형성된 겔.
  5. 제4항에 기재된 겔의 제조방법에 있어서,
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 융합단백질, 피브리노겐 및 트롬빈의 혼화물을 제조하는 공정을 포함하는 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 혼화물 중의 융합단백질과 피브리노겐의 몰비가 1:5 내지 1:20,000인 제조방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 융합단백질과 피브리노겐을 포함하는 겔 제조용 조성물.
  8. 제4항에 기재된 겔을 제조하기 위한 키트에 있어서,
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 융합단백질, 피브리노겐 및 트롬빈을 포함하는 키트.
  9. 제4항에 기재된 겔을 이용하는 세포 또는 조직절편의 3차원 배양 방법.
  10. 제9항에 기재된 3차원 배양 방법을 이용하여 이식의료용 세포 또는 오가노이드를 제조하는 방법.
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