JPH04506972A

JPH04506972A - 細胞結合を強める合成ペプチド

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Publication number: JPH04506972A
Application number: JP2512245A
Authority: JP
Inventors: バトナガー　ラジェンドラ　サハイ
Original assignee: ザリージェンツオブザユニバーシティオブカリフォルニア
Priority date: 1989-08-14
Filing date: 1990-08-13
Publication date: 1992-12-03
Anticipated expiration: 2018-09-02
Also published as: DE69028783T2; DE69028783D1; EP0487617A1; WO1991002537A1; IN171598B; JP3442383B2; EP0487617B1; EP0487617A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】細胞結合を強める合成ペプチド発明の音量！■二五里圀互この発明は細胞結合を強める合成ペプチド及び非ペプチドからなる新規な組成物に関する。これらの合成化合物は生物学的に活性なタンパク質の小さなセグメントであるコラーゲンによく似た作用をする。加えて本発明は、これらの化合物を基質に付けてを椎動物の細胞の付着を助長するために使用する方法を提供する。

この発明はデパートメント　オブ　ヘルス　アンド　ヒユーマン　サービシスによって与えられた許可証、Ｎｏ、ＡＲ−３７２８７のもとで政府の支持によって行われた。

政府はこの発明に一定の権利を有している。

′の　なコラーゲンはを椎動物において最も量の多いタンパク質である。概算で、全ての動物のタンパク質のうち２５％はコラーゲンである。コラーゲンは、アミノ酸のグリシンが全体のアミノ酸含有量の３分の１を占め、かつほぼ３番目毎のアミノ酸残基の位置に存在する点でタンパク質の中でも珍しいものである。また、コラーゲンにはアミノ酸のプロリンが多（存在している。コラーゲンは他のほとんどのタンパク質中には存在しない２種のアミノ酸、すなわちヒドロキシプロリン及びヒドロキシリジンを含んでいる。そのグリシン−プロリン−ヒドロキシプロリンの配列は頻繁に繰り返されている。

グリシンは非常に小さなアミノ酸であるので、コラーゲンの鎖は互いに隙間な（巻き付（ことができ、三重らせんを形成している。プロリン側鎖は三本のらせんを一緒に絡み合わせる相互結合（ｃｒｏｓｓ−１１ｎｋｓ）を形成する。更に成熟したコラーゲンは、そのヒドロキシリジン残基に共育結合した炭水化物ユニットを頻繁に含有している。グルコースやガラクトースの二糖類が通常、コラーゲンの鎖に結合していることがわかる。更にコラーゲンの他の形態は平面的なシート状をしており、その部分では炭水化物が多く見られる。コラーゲンの構造の概略の記載としては、次の文献を参照することができる。５ｔｒｙｅｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ■（３ｄ　ｅｄ、）、　Ｌ）１．　Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　（＋９８８）；　Ｒａｗａｃｈａｎｄｒａｎ、　ｅｔ　ａｌ、　（■р刀A）、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　ｏｆ　Ｃｏ旦ｇｇ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（＋９７８）；Ｍａｙｎｅ、　ｅｔ　ａｌ、@（ｅｄｓ）、　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏ旦」凹ユｕ悶、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋi１９８７）。

コラーゲンは組織の構造タンパク質として機能している。それは皮膚や軟骨、骨、脚、歯、血管における主要な繊維要素である。コラーゲンはほとんど全ての器官にある程度存在し、かつ別々のユニットの中で細胞を相互に保持する役割をしている。コラーゲンは高い引っ張り強度を有する不溶性の繊維を形成している。

更にコラーゲンの基本的構造は特定の組繊細胞の特殊な必要性に合致するように修飾されており、これらは既に同定されているコラーゲンのさまざまなタイプに反影されている。

コラーゲンの数種のタイプは、基本的に類似の二次及び三次のタンパク質構造を示す遺伝学的に関連するタンパク質の一つのファミリーである。参照としてＨａｙｎｅ、　ｅｔ　ａｉ、　（ｅｄｓ、）、　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏ１１ａ　ｅｎ　Ｔ　ｅｓ、　Ａｃ≠рモ魔奄メ@Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８７）、を挙げる。ここでは別に指定しない限り、”コラーゲン”とは知られたタイプのコラーゲンのいずれをも指すものとする。

Ｉ型コラーゲンは最も多いタイプで、皮膚や腹、骨、角膜に見いだされる種であり、α１（Ｉ）と命名されている一種類と、α２（Ｉ）と命名されている他の種類の二本鎖からなる。コラーゲンの他の型は三本の同一の鎖を有する。三本の鎖はそれぞれ約１　、０００個のアミノ酸残基からなっており、それぞれはらせん状の配座をとっている。三本の鎖はそれぞれ絡み合って超らせんケーブルを形成しており、互いに水素結合をしている。上記に記載したように、この構造はグリシンユニットが存在し、かつこれが規則正しく配されていることにより可能となる。

研究によると、イミノ残基であるプロリンやヒドロキシプロリンの存在や割合が、コラーゲンの三重らせん構造を生じさせ、安定化するのに必要であることが判っている。参照としてＮ　ａｈａｔｎａｇｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、＋　ｐｐ、４７９−５３　ｉｎ　Ｒａ１ａＣｈａｎｄｒａｎ、　ｅｔａｌ、（ｅｄｓ）、　Ｂｉｏｃｈ＋ｖｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｃｏ１１ａ　ｅｎ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７U）；　Ｂｈａｔｎａｇｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、ｐｐ、４２９−３８　ｉｎ　Ａｇｒｉｓ　（ｅｄ、）、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎп@Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７８）、を挙げる。

手短かにいうと、コラーゲンの一本鎖のらせん構造の安定性はプロリン及びヒドロキシプロリン残基の固定（ｌｏｃｋｉｎｇ）効果によるものである。更に三重らせん構造は、異なる埴土の残基間の横方向の水素結合及びファン　デル　ワールス相互力によって安定化される。この超らせん構造は、アミノ酸配列においてグリシンが三番目ごとに存在していることから立体的に許されるのである。

１ラーゲンは組織の構成や引っ張り強度を大きく決定付けることに加えて、非常に多（の生理学的に重要な相互作用に関係している。これらは、次のことに限られるものではないが、例えばフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）　、細胞の増殖の調節、細胞の遊走や分化の仲介、また特異的な遺伝子の発現の調節のような他の巨大分子との複合体の形成を含む。

このような相互作用を生じさせるためにコラーゲン繊維の表面の分子には、認識部位に対して特異的である分子的全体像が示されていなければならない。これは局所的な配座の変化を要求するものである。血小板のようなある細胞の接合には、コラーゲンのαＩｌｌの配座的に自由度のある部位で、Ｃ−末端から鎖のほぼ４分の１の長さのところに局在している部位が含まれていることが示唆された。

参照として、Ｄｅｓｓａｕ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｊ、　＋６９：５５−５９　（１９７８）；　Ｋｌｅｉｒｖａｎ、　ｅｔ　ａ戟A。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５３：５８４２−４６　（１９７８）、を挙げる。この部位はまた、を椎動物の酵素であるコラゲナーゼによるタンパク質分解に対し感受性があるとして知られている唯一の部位を含んでいる。参照として、Ｇｒｏｓｓ、　ｐｐ、　２７５−３１７　ｉｎ　Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ、ｅｔ　ａｌ、、（ｅｄｓ）＋　Ｂｉｏｃｈｅ　１ｓｔｒ　ｏｆ　Ｃｏ１１ａ　ｅｎ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　i＋９７６）：　Ｍｉｌｌｅｒ、　ｅｔ、ａｌｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　１５ニア８７−９２　（１９７６）、を挙げる。加えて、この部位はコラーゲンへのフィブロネクチンの結合において関連があることが知られている。参照として、Ｄｅｓｓａｕ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｔｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１６９：５５−５９　（＋９７８）；Ｋｌｅｉｎｍａｎ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｔｏｃｈｅｍ、＆　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｗｓ、　７２：４２６−３２　（１９７６）：　Ｋｌｅｉｎｍａ氏A　ｅｔ　ａｌユ、ハｍ工紅匹ｈｅｗ、　９４：３０８−１２　（１９７９）、を挙げる。そしてまたこの部位は、繊維の形成に至る分子間の相互作用の部位でもある。参照として、５ｉｌｖｅｒ、　Ｊ、　Ｂ凹１、Ｃｈｅｍ、　２５６：４９７３−７７　（１９８１）、を挙げる。

以前の研究では、三個のアミノ酸配列ＲＧＤ、これはコラーゲンを含むさまざまなタンパク質の中に見られるが、細胞の結合で大きな役割を果たすことができることが判っている。参照としてＤｅｄｈａｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｒｉａｌ、　１０４：５８５−９３　（１９８７）；Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２８：１Ｉ５−２８　（１９８５）、を挙■驕B この配列はα１（Ｉ）鎖の中に二度出現し、その内の一度は上記の配座的に自由度のある部位の中に存在している。参照としてＫｌｅｉｎｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５３：５６４２−４６　（＋９７８）、を挙げる。

発明の要約本発明は、Ｐ−１５とここで呼ばれるコラーゲンのαＩ（１）鎖の１５個のアミノ酸残基であるＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶのすべであるいは一部を含むコラーゲンの小さい一部分に構造的あるいは生物学的にアナロガスである合成組成物からなる。この組成物はペプチド及び非ペプチドの両方を含んでおり、ペプチドはｐ−ｉｓにある少なくとも４個の連なったアミノ酸からなる一つの一次配列を通常有している。しかしながら、他の一次配列を持っている非ペプチドとペプチドもまた、それらがＰ−１５の全てにあるいは少な（とも一つの部位に比較できるほどの生物学的な活性を育している限り、利用することができる。本発明の組成物は、この組成物で基質を被覆することによって基質へのを椎動物の細胞付着を助長する点で特に作用である。

発明の詳細な説明及び好適な実施例新規な合成組成物について本発明において記述する。この組成物はコラーゲンの小さな一部位に構造的あるいは生物学的にアナロガスである化合物を含んでいる。Ｐ−１５とここで呼ぶこの部位は、コラーゲンのａｌ（＋）鎮の１５のアミノ酸残基であるＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶのすべて、あるいは一部分を含んでおり、この鎖のほぼ７６６−７８０の残基にわたる。（ここでは−記号のアミノ酸省略形が用いられている。参照として、５ｔｒｙｅｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（３ｄ　ｅｄ、）、　Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍｅｎ　＆　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａ獅モ■ ｓｃｏ　（１９８８）、を挙げる。）　Ｐ−１５はコラーゲンの天然のフラグメントとして生じることはないし、また天然の酵素開裂の生成物でもない。

上記に記載したように、コラーゲンは非常にしっかりと巻いた超らせん構造の形で存在しており、イミノ残基の高い含有量によってその引っ張り強度が安定化されている。このため他の細胞や化合物との相互作用を行うには、コラーゲンの構造は自由度を持っていな（ではならない。熱をかけると二重鎖らせんを安定化する結合力が破壊でき、分裂した構造が得られる。この発明の最大の長所は、合成組成物の大きさや構造が明らかになっていて、配座的な自由度を必要としていないことであり、更にこの化合物がコラーゲンの生物学的活性とよ（似た作用をすることができるだけでなく、少な（ともいくつかの場合では、高い細胞結合機能を示せることである。

この発明の合成化合物はペプチドと非ペプチドを含んでいる。ここで記載したペプチドは、少なくともＰ−１５からなる配列、Ｐ−１５の中の少なくとも４個の連続したアミノ酸からなる配列、及びＰ−１５の一部分ではないが実質的に等価である生物学的及び結合的な活性は有しており、かつすべであるいはいくつかの天然物ではないアミノ酸を含んでいる配列を含む。ここで記載した非ペプチドは通常は小さな分子であり、Ｐ−１５のすべであるいはい（つかの部位の生物学的活性に機能的に匹敵するほどの生物学的活性を育する化合物である。また、Ｐ− １５やその部位に対する抗体が含まれている。これらのペプチド及び非ペプチド組成物については、それらの調製方法とともに以下に記載されている。

本発明の合成ペプチド化合物は通常、Ｐ−１５と命名されていてＧＴＰＧＰＱＧ　ＩＡＧＱＲＧＶＶからなる１５個のアミノ酸残基のすべであるいは一部分を含んでいる。

これらの合成ペプチドのアミノ酸配列はＰ−１５配列に＃１麿に一致する必要はなく、むしろその＝一部位のみを含ませておくことができる。少なくとも４個のアミノ酸配列、即ちＱＧＩ＾、ＧＩＡＧあるいはＩＡＧＱが存在していなけわばならず、そしζ好ましくは少な（とも完全なｏｃｔＡＧＱ配列を含むとよい。そのペプチドは一般的には１００個あるいはそれ以下のアミノ酸配列を含み、更に一般的には５０個あるいはそれ以下のアミノ酸配列を含み、そして典型的には２５個またはそれ以下のアミノ酸配列を含むものである。好ましいペプチドは１５個までのアミノ酸を育し、最も好ましい配列としてはｐ−１５である。更に、それ以上のアミノ酸をＮ−末端あるいはＣ−末端のいずれかに連結することも可能である。

この発明のペプチドは特定のアミノ酸の置換体を組み入れることもできるが、３個あるいは４個だけのアミノ酸を含むペプチドでは１換できないことが多い。通常、５個から約１０個のアミノ酸の配列では１個の置換より多くはできず、約１０個から２０個の長さのアミノ酸を持っている配列では２個の置換より多くの置換はできない。もちろん置換によってペプチドの活性を不利なように実質的に変えてはいけない。

この発明の更に他の実施例では、一部あるいはすべてに非天然物のアミノ酸から成り立っている合成ペプチドも含んでいる。そのような非天然物のアミノ酸は一般に少なくとも一つのＮ−末端及び−っのＣ−末端を有しており、天然のアミノ酸の相対物に同一であるか、あるいは天然のアミノ酸の相対物から化学的に修飾されたり、置換されたりした側鎖を有している。非天然アミノ酸の一例として、天然にあるし一アミノ酸の光学異性体が挙げられる。化学的修飾あるいは置換の例としては、天然のアミノ酸におけるＣ−Ｈ結合のヒドロキシル化あるいはフッ素化が含まれる。このような技法は生物学的な化合物の薬物アナログを工業的に生産する場合に用いられ、当業者には公知である。

上記記載した合成ペプチドは好ましくは実質的に次に記載する事象からは免除されている。即ち、天然の包含や配糖、他のペプチド鎖との結合、交差結合、そしてヒドロキシル化である。これらの性質は天然にあるコラーゲンに存在する傾向がある。、′実質的に免除されている。（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ　ｆｒｅｅ）”によって、それは天然に存在するコラーゲンに見いだされる平均的な含有量よりは少ないということになる。

天然の配列の生物学的な活性と同じかもしくは類似の生物学的活性を有している合成ペプチドは、二通りの一般的な方法のいずれかによって生産することができる。

第１番目の方法として、約１００個のアミノ酸より数の少ないアミノ酸を育しているポリペプチド、一般的には約５０個のアミノ酸よりも少なく、更に一般的には２５個よりも少ない数のアミノ酸を育しているポリペプチドは、よく知られたメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｔｅｌｄ）の固相化学合成法で合成することができる。そこではアミノ酸が生長過程の鎖に順次加えられる。参照としてＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、　ｋＩｌ、　ＣｈｅＩｌ。

Ｓａｃ、　８５：２１．４９−５６　（１９６３）、を示す。この発明のペプチドの大きさには理論的には上限はないが、１００個のアミノ酸よりも長い長さを持つペプチドを提供すべき理由はまれであり、ペプチドが５０個のアミノ酸よりも短いこともよくある。直線的なペプチドは人が手で行う手法によって化学的に合成されたり、あるいは商業的に入手できる合成装置内で自動的に化学的に合成されたりする。ポリエチレン　ベツグ（ｐｅｇｓ）上において人が行うペプチド合成の系は、マサチューセッツ州ケンブリッジにあるケンブリッジ　リサーチ　バイオケミカルス（Ｃａｉ＋ｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から人手できる。自動的なペプチド合成装置は、カリフォルニア州フォスターシティにあるアプライド　バイオンステムズ　Ｉｎｃ、（＾ｐｐｌｉ６ｄ　Ｂｉ。

５ｙｓｔｅ■ｓ、Ｉｎｃ、）や、ニューシャーシー州ワルドウィブクにあるベツグマン　インストウルメンツ　Ｉｎｃ、（Ｂｅｃｌｖａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、）や、カリフォルニア州サンラフアニルにあるバイオサーチ　Ｉｎｃ、（Ｂｉｏｓｅａｃｈ、　Ｉｎｃ、）製の装置が用いられる。

メーカーの指図書きによりこのような自動的な合成装置を用いると、ペプチドを本発明で利用するためにダラム量単位で生産することができる。

比較的短く、直線的なペプチドフラグメントを利用することが本発明で記載した利用方法を遂行する上で有効である。そのペプチドは大量に生産することができ、組換え技術によって生産されるペプチド内でよく見いだされる汚染物質から免れることができるであろう。

第２番目の方法として、本発明の合成ペプチドは組換え技術、即ちコラーゲンのＣ１（１）鎖の望ましい部位に対する遺伝子をエンコードする組換えＯＮ＾分子の培養細胞における形質発現を含む組換え技術によって合成することができる。

コラーゲン自体のＣ１（１）ｊｌの望ましい部位をエンコードする遺伝子は天然物であっても、あるいは合成物であってもよい。便宜上、ポリヌクレオチドはよく知られた技術を用いて合成できる。例えば短い一本鎖のＤＮＡフラグメントは、Ｂｅａｕｃａｇｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２：１８５９−６２（＋９８１）、に記載されているフォスフォアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法によって調製できる。そして二本鎖のフラグメントは、相補的な鎖を合成して適当な条件の下でその鎖を一緒にアニーリングして得るか、あるいは適当なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて相補的な鎖を加えることによって得ることができる。コラーゲンのＣ１（１）ｔｌｉの望ましい部位がコードされている天然あるいは合成のＤＮＡフラグメントは、インビトロの細胞培地に導入されてそこで形質発現をすることができるＤＮＡ構成体に組み入れられる。

一般的にＤＮＡ構成体は、イーストやバクテリアのような単細胞の宿主内で複製されるのが好ましいが、培養された哺乳類や他の真核細胞ラインのゲノム内に導入し、組み込まれることも企てられる。バクテリアやイーストに導入するために準備されたＤＮＡ構成体は、宿主によって認識される複製系と、望ましいＣ１（Ｉ）ポリペプチドをエンコードするＤＮＡフラグメントと、αＩ（１）コラーゲンのＤＮＡ配列の５゛−末端に結合している転写と翻訳の開始調節配列と、Ｃ１（１）コラーゲンの配列の３゛−末端に結合している転写と翻訳の終止調節配列とを含んでいる。転写調節配列は宿主によって認識される異種構造（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）のプロモーターを含んでいる。

便宜上、Ｃ１（（）コラーゲンのＤＭＡ配列のための挿入部位とともに、複製系と転写及び翻訳の調節配列を含んでいる入手可能な形質発現ベクターを用いることができる。

細胞結合のための利用としては、これらのペプチドは実質的には純粋な形、即ち典型的には５０％Ｗ／Ｖあるいはそれ以上の純度で、実質的には邪魔なタンパク質や汚染物のない形で得られる。そのペプチドは好ましくは少なくとも約８０％Ｗ／Ｗの純度で、更に好ましくは少な（とも約９５％ｗ／ｗの純度で単離あるいは合成される。慣用の精製技術を用いると、少なくとも９９％ＷＯＷの均質なペプチドを得ることができる。例えば、そのペプチドは逆相高速液相クロマトグラフィーを用いることによって精製することができる。しかし通常は、細胞結合にこれらのペプチドを利用するにあたり、高純度の、即ち９９％もの純度のペプチドを得る必要はない。

この発明のもう一つの実施例では、Ｐ−１５のすべであるいはいくつかの部位の生物学的活性に機能的に匹敵する生物学的活性を育する合成非ペプチド組成物を含んでいる。″機能的に匹敵する”ことによって、その化合物の形、大きさ、及び自由度がその化合物の生物学的活性がコラーゲンのＰ−１５の範囲、あるいはその一部分に似ているようなものであることを意味している。そのペプチドが有している生物学的活性はコラーゲン合成の抑制作用、コラーゲン結合の抑制作用、及び細胞移動の抑制作用である。本発明で特に興味の持てる点は強められた細胞結合の性質である。このような化合物はＰ−１５やその一部分と比較して、類似の場所的及び電気的特性を育することを基礎として選択されるべきである。典型的にこれらの化合物は、約１００−５．０００ダルトンの分子の重さの範囲を有する小さな分子であり、典型的には＋５０−２．５００ダルトンの範囲、更に典型的には２５０−１，０００ダルトンの範囲にある分子である。

このような化合物の同定は、ドラッグデザインの分野における当業者に知られている技術を用いて行われることが可能である。この方法には、次の方法に限られないが、セルフ−コンシステント　フィールド（ＳＣＦ：５ｅｌｆ−ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｆｉｅｌｄ）、配置の相互作用（Ｃ１：ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ　１ｎｔｅｒｒａｃｔｉｏｎ）及び通常モードのダイナミックコンピュータ　プログラムが含まれ、それらの全ては簡単に入手できる。参照としてＲｅ１ｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｏｗ　ｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｌ１ｏｄｅｌｉｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｅ　ｔｏｒ−Ｌｉ　ａｎｄ　Ｉ獅狽■窒■ ｃｔｉｏｎｓ　Ａｌａｎ　Ｌｉ５ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）−を示す。同定される化合物の調製は、化合物の望ましい特徴に依存しており、かつ標準的な化学的合成手段を含むものである◇参照としてＣａｒｅｙ＋　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　ａｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｐａｒｔ　Ｂ、　Ｐｌｅｎ浮■ Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１，９８３）、を示す。

もう一つの実施例では、モノクローナル抗体がＰ−１５あるいはその一部分によって、あるいはこの発明のいずれかの化合物によって決定づけられるエピトープの部位に抗して産生され、その中でエピトープ部位は結合性で生物学的な活性に対して応答する。それから初めにできた抗体に抗して抗体が産生されることによって、抗イテ゛イオタイア゛の抗体の結合部位がＰ−１５の機能的アナログや、上記に記載した機能的に類似の化合物を提供する。

このような抗体は精製したペプチドあるいは非ペプチド化合物を常法に従って広範囲のさまざまな哺乳類に注射することによって得ることができる。適している哺乳類はマウス、ラット、ヒツジ、ヤギであり、とりわけマウスがよい。しばしばその動物は、力価及び特異性を上昇させるために血液で周期的に流血させられる。その化合物は筋肉、腹腔内、皮下等に注射されつる。しばしば完全あるいは不完全なフロイントのアジュバントのような媒体が用いられる。希望ならばモノクローナル抗体が調製されるであろう。代わりに、その化合物は天然物から奥− 特異性抗体を単離するために用いられることができる。

モノクローナル抗体を得るために、免疫化された哺乳類から得た肺臓細胞は不滅化される。不滅化の手法は重大なことではない。最近最も常用されている方法は、骨髄腫の融合パートナ−と融合させることである。他の技術手段はＥＢＶ形質転換、ありのままの（ｂａｒｅ）　ＤＮＡである例えば腫瘍遺伝子やレトロウィルス等とともに行う形質転換や、あるいは細胞ラインの安定維持とモノクローナル抗体の生産とを目的として行う他の方法を含んでいる。ヒトのモノクローナル抗体は適切なヒトの融合パートナ−と膵臓細胞を融合させることによって得ることができる。

マウスとマウスをかけあわせてモノクローナル抗体を産生ずる詳細な技術については、Ｏｆ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｐｐ、　３５１−７２　ｉｎ　Ｍｉｓｈｅｌｌ、　ｅｔ　ａｌ、　（ｅｄｓ）、　５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅ狽■盾р■ ｔ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　、　Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｅｏ　（＋９８０）、■■■ で説明されている。本発明の抗体はイムノグロビンの部類からは離れている。

この発明では哺乳類の細胞付着を促進する方法についても述べており、これは基質に上記記載した組成物のいずれかを付けること、及びその基質に細胞を加えることからなっている。基質としては、ガラスやプラスチック、セラミック、有機ポリマー、ゲル、シリカが含まれるが、これらに限られてはいない。付着される細胞の好ましいタイプとしては、繊維芽細胞が含まれるが、全ての細胞ではないが大部分の細胞のタイプを用いることができる。

付着の形式としては共有結合、非共有結合性の相互作用、非特異性の吸着を経て行われる。共有結合はエステル、アミド、エーテルを含む結合を含んでいるが、それらに限られるわけではない。参照として、Ｃａｒｅｙ、　ｅｔ　ａム、屁胆旺吋」Ｊ堕ｊｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　Ｐａｒｔ　Ｂ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｔａｒｋ　（１９８３）、を挙げる。共有結合の典型的な体系としては、この発明のペプチドのＮ−末端あるいはＣ−末端のいずれかに非天然物のアミノ酸を付加して、固相や他のタンパク質へのこのペプチドの結合あるいは接合に備えることを含む。例えば、システィンの配列をいずれか末端に付加すると、キャリアへの結合を容易化できる。疎水性残基あるいは脂質を含有する部分、例えば疎水性の側鎖を含むアミノ酸が、リポソームや膜の結合を増強するために加えられる。選んだ基質は、基質への組成物の結合を助長する目的でＣｎＢｒや他の活性化試薬で処理されることができる。非共有結合性の相互作用及び非特異性の吸着は、典型的には基質に本発明の組成物を含有する溶液を直接施用することを含んでいる。これらの使用方法としては多くの応用例、例えばそれらの生理機能を研究したり、特異性のある化合物を作ったりするために細胞を培養する応用例がある。このような利点は、当業者には極めて明白である。

叉−！−団以下に記載した実験例は本発明のほんの一例を示したものであって、その記載に限られるものではない。実験例１では、コラーゲンと比較してＰ−１５によって細胞付着の助長が高められることを示している。実験例２では、Ｐ−１５及び他のペプチドの存在により、コラーゲンへの細胞結合が比較的抑制されることを示している。

及」（」Ｌユこの発明のペプチドＰ−１５であるＧＴＰＧＰＱＧＩ＾ＧＱＲＧＶＶは、ｌ−ヒドロキシベンジルトリアゾールと結合したＱ残基以外の５ａｃ−アミノ酸の結合を目的として、対称性の無水物を用いて固相法により合成された。円偏光二色性分光分析と１）（及び”ＣＮＭＲの測定によると、Ｐ−１りは水性溶液中ではランダムな配座を取っており、−・リコジェニック（ｈｅｌ　ｉｃｏｇｅｎｉｃ）溶媒の存在する溶液中ではコラーゲンやポリプロリン様の配座を生じることはほとんどない。しかし、極性の低下している溶媒中ではβ−鎖構造を形成する傾向を示す。

組織培養のための全ての媒体及び用具はユニバーシティ　オブ　カリフｔルニア　サン　フランシスコ　ティッシュ　カルチャー　ファシリティ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ）から得られた。シクロヘキソイミド（ｅｙｃｌｏｈｅｘｉ＊１ｄｅ）はミズーリー州のセント、ルイスにあるシグマバイオケミカルズ（Ｓｉｇ＋ｗａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した。

ラットの尾の朧のコラーゲンは発明者らの研究室において公表された方法を用いて均質に精製され、かつ特性をめた。組織の培養皿は（直径３５龍、ファルコンプラスチックＩＩ）、０．０１　Ｎの酢酸中に、ＩＯμｇ／冒１の濃度になるように溶解したコラーゲンで被覆された。その培養皿は滅菌性を維持するように紫外線照射をして乾燥空気中、−晩さらされた。

１９週口のヒトの胎児の皮膚から採取し発達の第一段階にある繊維芽細胞の培養組織が得られた。その培養組織は１０％のウシ胎児の血清を追加したアールス塩（Ｅａｒｌｅ’ｓ　５ａｔｔｓ）を含むイーグル（Ｅａｇｌｅ）の最小必須培地中で維持された。用いた全ての細胞は第二段階となり、集密的培養組織から得られた。ト１ノブシンで放出し、かつ分散するよりも前にその細胞は燐酸緩衝塩で３回すす力くれた。細胞を含む層は２分間、燐酸緩衝塩中にて０．０５％のトリプシン及び０．０２％のＮａＥＤＴＡにさらされ、続いて無血清培地ですすがれた。

カバーガラス（１２−１５枚）が−晩クリーニング溶液で洗浄された後、充分量の蒸留水ですすがれた。そのカバーガラスはそれから高温の炉の中で濾紙のシートの間で乾燥することによって滅菌が行われた。続いてその力１＜−ガラス番よ滅菌状態にある小さな培養皿内に入れられた。酢酸中のコラーゲンの溶液（Ｊｉｇ／璽１）力５準備された。５０マイクロリツトルの溶液が４枚のそれぞれのカッく−ガラス上１こ載せられ、それからそれらを空気中−晩乾燥した。酢酸中のＰ−１，５の溶液（１ｍｇ／ｍｌ）　ｂ＜準備された。４枚のカバーガラスが５０μｍの溶液で処理された後、上記記載したように乾燥された。

はぼ１００，０００個の繊維芽細胞が４枚の対照のカッ〈−ガラスと培養皿上、４枚のコラーゲンを被着したカバーガラスと培養皿上、及び４枚のＰ−１５を被着したカッく一ガラスと培養皿上に滴下された。１５分後、浮遊細胞を含む過剰の媒体がそれぞれの培養皿から取り除かれた。新しい媒体が加えられて、その培養皿ｉｔそれぞれのカッく一ガラスへの細胞の結合の程度を測定するために顕微鏡で検査された。結合した細胞の数が異なっているように見えた場合には、それぞれのカッ（−ガラス（こ付着した細胞のＤＮＡの検定を行った。その細胞は血球計を用ＩＩ）で数えられた。

１５′の細　の　結合旦臘Ω虜Ｉ対照（コラーゲンもＰ−１５もなし）　７．０１これろの結果から、Ｐ−１５の細胞結合の方が標準（コラーゲンもＰ−１５もなし）の培養皿よりも６０％多く、かつＰ−１５の細胞結合の方がコラーゲンを被着した培養皿よりも４０％多いことが判る。

実−】Ｌ」１−２コラーゲンが関連するペプチド（ＰＰＧ）　Ｉｌｌ及び（Ｐ−Ｈｙｐ−Ｇ）　１ｅ　（ここでＨｙｐはヒドロキシプロリンである。）は、カリフォルニア州ベルモントのベニンスラ　ラボラトリ−（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から得られた。ポリプロリンはミズーリー州セント　ルイスのシグマ　バイオケミカルズから購入された。ダイノルフィン１−１３　（ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ；　ＹＧＧＦＬＲＲＩＲＰＫＬＫ）及びヒトのプレアンジオテンシノーゲン１− １４　（ｐｒｅａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ；　ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬＶＩＨＮ）はカリフォルニア州トーランスのノ＜ツヘム（Ｂａｃｈｅｍ）から購入された。フィブロネクチンが関連するペプチド配列（ＲＧ［ｌ。

ＧＲＤＳＰ、　ＧＲＧＤＴＰ）もバラヘムから購入され、もう一度分析することな（用１１１られた。

Ｐ−１５は実験例１に記載したように合成され、実験例１と同様の方法及び条件がここで用いられた。

結合性についての種々の添加物の効果を検定するためのこの実験では、添加物は、結合検定のための培養皿に移し変える前に細胞を含む媒体内に加えられた。

コラーゲンへの細胞の結合は実験の初めはすばやく進行するが、はぼ３０分後にはゆっくりとなって、ペプチドがないときは細胞結合のほぼ７０−８０％がこの時間の間に起こることが観察された。細胞とコラーゲンとの結合反応の初期の速度に及ぼす抑制剤の効果が検定された。３０分後のコラーゲンへの細胞結合に及ぼす種々の条件の効果は、通常複合されたものであった。

Ｐ−１５による細胞結合の抑制は、このペプチドに対して特異的であった。なぜなら、下記の結果に示したように多くの他のペプチドには同様の効果がなかったからである。ペプチドによる結合の抑制が非特異的な作用であるかどうかを確かめるために、コラーゲンへの細胞の結合に及ぼす、同濃度（３５Ｘ　１０−６Ｍ）の数種のペプチドの効果を比較した。用いた全てのペプチドは細胞結合においてわずかな抑制効果を有しているが、どれもＰ−１５で観察された抑制効果のレベルまでは達しなかった。この結果から判るように、ポリプロリン、（ＰＰＧ）　Ｉ＠、及び（Ｐ−Ｈｙｐ−Ｇ）ＩＱのようなコラーゲンに関連している配座を有するペプチドは、細胞の結合性に対して有意的には作用しなかった。これらの実験の条件では、ポリプロリン及び（ＰＰＧ）　Ｉｌｌはポリプロリンの配座内で一本鎖として存在しており、一方、（Ｐ−Ｈｙｐ−Ｇ）　、ｌ＋は三重らせん構造をしている。Ｐ−１５と類似の大きさのペプチドであるダイノルフィンｌ− １３及びブレアンジオテンシノーゲン１−１４の細胞結合に及ぼす挙動についても実験を行った。これらは、Ｐ−１５によって示された程度にはコラーゲンへの細胞の結合性に影響を与えなかった。これらの結果は、Ｐ−１５がコラーゲンへの細胞の結合性の有効な抑制剤であることを示している。

コラーゲン　への細　の・着　に　ぼ　Ｐ−１５と使のペプチドの　果最大の細胞付着　細胞付着の抑制り１塗ニーＱΩ−Ω剋念−工１゜対照（何も添加していない）　＋００　−Ｐ−１５，７，２Ｘ　１０−６！Ｉｆ　１５　８５ｐ−１５，３６Ｘ　１０−’Ｍ　１２　８８（ＰＰＧ）＋１１’、　３５ＸＩＯ−’Ｎ　７９　２１（Ｐ−Ｈｙｐ−Ｇ）ｉｌｌｂ、　３５Ｘ　１０ −６Ｍ　８７　１３ホ′す７’［＋リン”、　１．７ＸＩＯづ！１　９０　１．０ダイノルフイン　Ｉ−１，３，３５Ｘ　１０−６Ｍ　８１　１９）゛し７ンシ゛オテンシノーケ゛ン　ｌ−１４，３５ＸＩＯ−’Ｍ　８８　１２ａこの実験の条件下、（ＰＰＧ）＋ａは三重らせん構造を取っていない。（Ｈ２ＯにおけるＴ目が２４．５℃）ゝこの実験の条件下、（Ｐ−Ｈｙｐ−Ｇ）＋９は三重らせん構造になっている。

Ｃ分子ｉｃｘｗ）は、はぼ２，７００キロダルトンである。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．コラーゲンやその天然のフラグメント以外の成分の組成物であって、ＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶからなるアミノ酸配列あるいはその一部分に匹敵する生物学的活性を有することを特徴とする成分の組成物。
２．天然の包合、配糖、交差結合、及びヒドロキシル化が実質的にないことを特徴とする請求項１記載の成分の組成物。
３．他のペプチド鎖と実質的に会合していない請求項１記載の成分の組成物。
４．コラーゲンやその天然のフラグメント以外の成分の組成物であって、ＱＧＩＡ、ＧＩＡＧ、及びＩＡＧＱからなるグループから選択された一個のアミノ酸配列からなることを特徴とする成分の組成物。
５．コラーゲンやその天然のフラグメント以外の成分の組成物であって、ＱＧＩＡＧＱのアミノ酸配列からなることを特徴とする成分の組成物。
６．前記アミノ酸配列がＧＴＰＯＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶ（ｐ−１５）であることを特徴とする請求項４記載の成分の組成物。
７．ＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶやその一部のアミノ酸配列によって決定づけられる少なくとも一つのエビトープと反応することを特徴とする抗体。
８．基質に請求項１記載の組成物を付着し、その基質に細胞を添加することからなる脊椎動物の細胞付着を助長する方法。
９．基質に請求項７記載の組成物を待合し、その基質に細胞を添加することからなる脊椎動物の細胞付落を助長する方法。
１０．前記細胞が繊維芽細胞であることを特徴とする請求項９記載の方法。