JP5236313B2 - 細胞の形態及び機能の調節活性を有するアリールスルファターゼタンパク質 - Google Patents
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Description
Yogalingam, G., Litjens, T., Bielicki, J., Crawley, A.C., Muller, V., Anson, D.S, Hopwood, J.J., 1996. Feline mucopolysaccharidosis type VI. Characterization of recombinant N-acetylgalactosamine 4-sulfatase and identification of a mutation causing the disease. J. Biol. Chem. 271, 27259-27265 Mehl, E., Jatzkewitz, H., 1968. Cerebroside 3-sulfate as a physiological substrate of arylsulfatase A. Biochim. Biophys. Acta. 151, 619-627 Evers, M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8214-8219 (1996) Harmatz, P. et al. J. Pediatr. 144, 574-580 (2004) Consiglio, A. et al. Nat. Med. 7, 310-316 (2001) Bond, C. S. et al. Structure 5, 277-289 (1997)
(1) アリールスルファターゼタンパク質を含む、細胞接着用基質。
この細胞接着用基質は、さらに少なくとも1の細胞外基質を含んでもよい。
また、前記細胞接着用基質に含まれるアリールスルファターゼタンパク質は、ヒト、マウス又はラット由来でもよい。
さらに、前記細胞接着用基質が接着する細胞は、内皮細胞でもよい。
(2) アリールスルファターゼタンパク質を含む、細胞形態調節用基質。
(3) (1)記載の細胞接着用基質を含む、細胞培養用基質。
(4) (1)記載の細胞接着用基質を用いて、細胞を接着させる方法。
(5) (2)記載の細胞形態調節用基質を用いて、細胞の形態を調節する方法。
(6) (3)記載の細胞培養用基質を用いて、細胞を培養する方法。
1.本発明の細胞接着用基質
本発明は、アリールスルファターゼタンパク質を含む、細胞接着用基質に関する。アリールスルファターゼタンパク質(以下、「本発明のタンパク質」という場合もある)は、人工基質のアリール硫酸を加水分解し、アリール基から硫酸基を遊離させる活性を有する酵素である。本酵素は以前はリソゾームに局在すると考えられてきた。
本発明の細胞接着用基質には、コラーゲン、ラミニン等の細胞外マトリックスおよびFGF、EGF、PDGF等の成長因子等も加えることができるがこれらに限定されない。
2.本発明の細胞形態調節用基質
本発明はまた、アリールスルファターゼタンパク質を含む、細胞形態調節用基質に関する。
3.本発明の細胞培養液
本発明はまた、上記のように、細胞培養液に関する。
本細胞の細胞培養液としては、市販の培地にアリールスルファターゼタンパク質を添加したものが使用でき、その中でも、Medium200S培地(クラボウ)、K110培地等が好ましい。
(1)組換えアリールスルファターゼの作製
マウスアリールスルファターゼ遺伝子をコードするcDNAをPCRで増幅した。プライマーとしては以下の:
Forward primer:5’-CGGGATCCACCATGGCCCTGGGGACC-3’(配列番号8)
Reverse primer:5’-GCTCTAGAGGACTGGGAGCCTGG-3’(配列番号9)
の配列を用いた。マウスアリールスルファターゼ(マウス ARS A)遺伝子をコードした塩基配列(配列番号1)(GeneBank Accession No. BC098075)をpcDNA3.1/myc-HisA expression vector(Invitrogen)に導入した。
(1)で精製した組換えマウスアリールスルファターゼ(3μg)を200μlの生理塩化ナトリウム濃度トリス緩衝液(pH7.4)に溶解させた。この溶液を100μlのヘパリン結合セファロース樹脂(Amersham Biosciences)と混合した。混合液を遠心分離し、沈殿した上清を非結合画分とした。ヘパリンセファロース樹脂は500μlの生理塩化ナトリウム濃度トリス緩衝液で2回洗浄する。その後ヘパリンセファロース樹脂を200μlの2M塩化ナトリウム濃度トリス緩衝液で洗浄して、結合したタンパク質を溶出させた。その後、ヘパリンセファロース樹脂を2%SDS、1%メルカプトプトエタノールを含むトリス緩衝液で洗浄して2M塩化ナトリウムでも溶出しなかったタンパク質を回収した。次に、非結合画分と2M塩化ナトリウム、SDS溶出画分を10%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。電気泳動後のゲル中の成分をPVDF膜に電気的に転写し、転写した膜上の組換えマウスアリールスルファターゼをパーオキシダーゼ標識抗His抗体によって検出した。検出には化学発光試薬Super Signal West Dura Extended Duration Substrate(PIERCE)を用いて、X線フィルムに感光させて検出した。
(1)蛍光観察用標本の作製
免疫蛍光顕微鏡観察用の標本は以下の方法で作製した。ラットもしくはマウスの肝臓組織を塩化カルシウム、塩化マグネシウムを含む4%パラフォルムアルデヒド−リン酸緩衝液中で固定した。リン酸緩衝液で洗浄した後、組織をマイクロスライサーDTK-1500(DSK Co)で40μmの厚さの切片とした。切片はリン酸緩衝液で洗浄し、0.05%TritonX−100添加のリン酸緩衝液に30分浸漬した後、5%ロバ血清でブロックキングを行った。切片は抗ラットアリールスルファターゼ抗体及び抗ヘパラン硫酸プロテオグリカン抗体と反応させた。その後Cy3標識ロバ抗ウサギ又はラット抗体と反応させた。さらにTO−PRO−3(Molecular Probe, Eugen, OR)で核を染色した。染色した標本は0.5mMp−フェニレンジアミン添加90%グリセロール−トリス緩衝液でマウントし、共焦点レーザー顕微鏡(MRC-1024, BioRad, Hercules, CA, USA)で観察した。
電子顕微鏡観察は以下のように行った。すなわち、組織の固定、切片作製は(1)の蛍光観察用標本と同じ方法で作製した。切片はウサギ抗アリールスルファターゼ抗体と反応させた後、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識ロバ抗ウサギ抗体と反応させた。その後標本は0.05%過酸化水素水を含む0.05%3,3’−ジアミノベンジジン(diaminobenzidine)(DAB)と反応させて反応部位を可視化した。その後、標本は1%オスミウム酸で固定後エタノールを用いて脱水した。標本はEpon812に包埋した後、超薄切片を作製して、酢酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡JEM−1010(JEOL, Tokyo, Japan)で観察した。
上記(1)及び(2)で用いた抗体の作製方法を以下に記載する。すなわち、抗原には抗マウスアリールスルファターゼA用に以下の配列:
QYDAAMTFGPSQIAKGEDPA (配列番号10)
の合成ペプチドを用いた。この配列はマウスアリールスルファターゼAの464−483のアミノ酸配列に相当する。また抗ラットアリールスルファターゼB用には以下の配列:VASPLLKQKGVKSRELMHIT (配列番号11)
の合成ペプチドを用いた。この配列はラットアリールスルファターゼBの327−346のアミノ酸配列に相当する。これらの抗原をウサギに免疫して、抗アリールスルファターゼ抗体を得た。
実験に用いた細胞は、ヒト微小血管内皮細胞(クラボウより購入)、ヒト大動脈血管内皮細胞(クラボウより購入)及びヒト皮膚表皮細胞由来株化細胞E1L8の3種類である。内皮細胞はMedium200S培地(クラボウ)、皮膚表皮細胞はK110培地(極東製薬)を用いて各々培養した。培養用基質はスライドガラス上にコラーゲン又はリコンビナントマウスアリールスルファターゼを10μg/mLの濃度で載せて、室温で2時間放置した後、1%牛血清アルブミン溶液でブロックした。その後、各コート基質上に細胞を2x104/cm2の密度で培養した。1時間後、細胞を2%ホルムアルデヒドリン酸緩衝液で固定した後、クマシーブリリアントブルーで染色した。染色標本は光学顕微鏡で観察して、写真撮影した。撮影後1mm x 0.7mmのガラス面上に接着した細胞数を計数して、接着した細胞数を比較した(表1)。
表1に記載の細胞及び培養条件を用いて、細胞をアリールスルファターゼコート及び牛血清アルブミンンコート上で培養し、1時間後に固定して、クマシーブリリアントブルーで染色した後、顕微鏡で観察した(対物レンズx10)写真が図4である。図4においてA及びBは微小血管内皮細胞、C及びDは大動脈内皮細胞、E及びFは皮膚表皮細胞である。A、C及びEはアリールスルファターゼ上の、B、D及びFは血清アルブミン上での培養である。なお、図中のスケールは100μmである。
Claims (9)
- アリールスルファターゼタンパク質を含む、細胞接着用基質。
- さらに少なくとも1の細胞外基質を含む、請求項1記載の細胞接着用基質。
- アリールスルファターゼタンパク質がヒトアリールスルファターゼタンパク質、マウスアリールスルファターゼタンパク質又はラットアリールスルファターゼタンパク質である、請求項1又は2記載の細胞接着用基質。
- 接着する細胞が内皮細胞である、請求項1〜3のいずれか1項記載の細胞接着用基質。
- アリールスルファターゼタンパク質を含む、細胞形態調節用基質。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の細胞接着用基質を含む、細胞培養用基質。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の細胞接着用基質を用いて、細胞を接着させる方法。
- 請求項5記載の細胞形態調節用基質を用いて、細胞の形態を調節する方法。
- 請求項6記載の細胞培養用基質を用いて、細胞を培養する方法。
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