CN114269921A - TREM组合物用以调节tRNA池的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明总体上涉及基于tRNA的效应分子(TREM)的用途及其制备方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年5月31日提交的美国临时申请号62/855,561的优先权，该案的全部内容特此通过援引并入。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且特此通过援引以其全文并入。所述ASCII拷贝创建于2020年5月19日，名为F2099-7001WO_SL.txt，并且大小为105,520字节。
背景技术
基于tRNA的效应分子(TREM)是具有多种功能，包括蛋白质的起始和延伸的复杂分子。包含TREM的组合物可以用于调节所述功能以治疗或预防疾病。
发明内容
在一个方面，本发明的特征在于一种调节包含内源开放阅读框(ORF)的细胞中的tRNA池的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
任选地，获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如获得该细胞中(i)和(ii)的相对量的信息，其中(i)是tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子，并且(ii)是同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与该细胞中不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子；
使该细胞与包含TREM的组合物接触，其中该TREM具有与以下配对的反密码子：(a)该具有第一序列的密码子；或(b)不是该具有第一序列的密码子的密码子，其量和时间足以调节该细胞中该第一tRNA部分和该第二tRNA部分的相对量，
从而调节该细胞中的该tRNA池。
在一个实施例中，包含TREM的该组合物是药学上可接受的组合物。
在一个实施例中，该TREM不包含与终止密码子配对的反密码子。
在一个实施例中，该方法包括获得(i)的信息。在一个实施例中，该方法包括获得(ii)的信息。在一个实施例中，该方法包括获得(i)和(ii)的信息。
在一个方面，本发明的特征在于一种调节具有内源ORF的受试者中的tRNA池的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
任选地，获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如获得该受试者中(i)和(ii)的相对量的信息，其中(i)是tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子，并且(ii)是同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与该受试者中不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子；
使该受试者与包含TREM的组合物接触，其中该TREM具有与以下配对的反密码子：(a)该具有第一序列的密码子；或(b)不是该具有第一序列的密码子的密码子，其量和时间足以调节该受试者中该第一tRNA部分和该第二tRNA部分的相对量，
从而调节该受试者中的该tRNA池。
在一个实施例中，包含TREM的该组合物是药学上可接受的组合物。
在一个实施例中，该TREM不包含与终止密码子配对的反密码子。
在一个实施例中，该方法包括获得(i)的信息。在一个实施例中，该方法包括获得(ii)的信息。在一个实施例中，该方法包括获得(i)和(ii)的信息。
在另一方面，本披露提供一种评价具有内源ORF的细胞中的tRNA池的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括获得，例如直接或间接获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如获得该细胞中(i)和(ii)的相对量的信息，其中(i)是tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子，并且(ii)是同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与该细胞中不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子，从而评价该细胞中的该tRNA池。
在一个实施例中，该方法包括获得(i)的信息。在一个实施例中，该方法包括获得(ii)的信息。在一个实施例中，该方法包括获得(i)和(ii)的信息。
在一个实施例中，获得(i)的信息包括获得(i)的丰度值，例如相对量。
在一个实施例中，获得(ii)的信息包括获得(ii)的丰度值，例如相对量。
在一个实施例中，响应于所述值，该方法包括施用包含TREM的组合物，其中该TREM具有与以下配对的反密码子：(a)该具有第一序列的密码子；或(b)不是该具有第一序列的密码子的密码子，其量和时间足以调节该第一tRNA部分和该第二tRNA部分的相对量。
在另一方面，本披露提供一种评价具有内源ORF的受试者中的tRNA池的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括获得，例如直接或间接获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如获得该受试者中(i)和(ii)的相对量的信息，其中(i)是tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子，并且(ii)是同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与该细胞中不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子，从而评价该受试者中的该tRNA池。
在一个实施例中，该方法包括获得(i)的信息。在一个实施例中，该方法包括获得(ii)的信息。在一个实施例中，该方法包括获得(i)和(ii)的信息。
在一个实施例中，获得(i)的信息包括获得(i)的丰度值，例如相对量。
在一个实施例中，获得(ii)的信息包括获得(ii)的丰度值，例如相对量。
在一个实施例中，响应于所述值，该方法包括施用包含TREM的组合物，其中该TREM具有与以下配对的反密码子：(a)该具有第一序列的密码子；或(b)不是该具有第一序列的密码子的密码子，其量和时间足以调节该第一tRNA部分和该第二tRNA部分的相对量。
在另一方面，本发明的特征在于一种调节包含内源ORF的受试者或细胞中的tRNA池的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
提供包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有与该SMC配对的反密码子序列的同工受体tRNA部分(该TREM)；
使该受试者与包含TREM的组合物接触，或在细胞的情况下，使该细胞与来自包含TREM的组合物的该TREM接触，其量和时间足以调节该受试者中或该细胞中的tRNA池，
从而调节该受试者或该细胞中的该tRNA池。
在一个实施例中，在与包含TREM的该组合物接触之前，该受试者或该细胞包含具有与该SMC配对的反密码子的第一tRNA部分(该第一tRNA部分)和具有与不是该SMC的密码子配对的反密码子的第二tRNA部分(该第二tRNA部分)。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗具有内源ORF的受试者的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
提供包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有以下的同工受体tRNA部分：(a)与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子；或(b)与不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子，
使该受试者与包含TREM的该组合物接触，其量和时间足以治疗该受试者，
从而治疗该受试者。
在另一方面，本披露提供一种治疗具有内源ORF的受试者的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
提供包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有与该SMC配对的反密码子的同工受体tRNA部分(该TREM)；
使该受试者与包含TREM的该组合物接触，其量和时间足以治疗该受试者，
从而治疗该受试者。
在另一方面，本发明提供一种治疗具有内源ORF的受试者的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
(i)获得，例如直接或间接获得该受试者中该具有第一序列的密码子的状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中该具有第一序列的密码子的存在或不存在的量度；并且将该受试者鉴定为包含该具有第一序列的密码子；以及
(ii)响应于所述值，向该受试者施用包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有与该具有第一序列的密码子配对的反密码子的同工受体tRNA部分，
从而治疗该受试者。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗具有内源ORF的受试者的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
(i)获得，例如直接或间接获得该受试者的SMC状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中SMC的存在或不存在的量度，并且将该受试者鉴定为具有SMC；以及
(ii)响应于所述值，向该受试者施用包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有与该SMC配对的反密码子的同工受体tRNA部分，
从而治疗该受试者。
在一方面，本发明的特征在于一种选择用于具有内源ORF的受试者的疗法的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
获得，例如直接或间接获得该受试者中该具有第一序列的密码子的状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中该具有第一序列的密码子的存在或不存在的量度；以及
其中该具有第一序列的密码子的存在指示所述受试者可能是该疗法的反应者，或所述受试者将对该治疗有反应或将可能有反应，
从而选择该疗法。
在一方面，本发明的特征在于一种选择用于具有内源ORF的受试者的疗法的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
获得，例如直接或间接获得该受试者的SMC状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中SMC的存在或不存在的量度，并且
其中SMC的存在指示所述受试者可能是该疗法的反应者，或所述受试者将对该治疗有反应或将可能有反应，
从而选择该疗法。
在一方面，本发明提供一种评价具有内源ORF的受试者的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
获得，例如直接或间接获得该受试者中该具有第一序列的密码子的状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中该具有第一序列的密码子的存在或不存在的量度；以及
将该受试者鉴定为包含该具有第一序列的密码子，
从而评价该受试者。
在一方面，本发明的特征在于一种评价具有内源ORF的受试者的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
获得，例如直接或间接获得该受试者的SMC状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中SMC的存在或不存在的量度；以及
将该受试者鉴定为具有SMC，
从而评价该受试者。
如本文所披露，基于tRNA的效应分子(TREM)是可以介导多种细胞过程的复杂分子。可以将包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物例如在体外或体内施用于细胞、组织或受试者以调节受试者、组织或细胞中的tRNA池。本文还披露了通过施用包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物来治疗或预防障碍或障碍的症状的方法。本文进一步披露了包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物、制剂及其制备方法。
任何前述组合物(例如，包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物)的其他特征；使用所述组合物的方法和/或其制备方法包括以下列举的实施例中的一个或多个。
本领域技术人员将认知到、或不使用过度常规实验就能够确定本案所述发明的特定实施例的许多等效实例。此类等效实施例意在由以下列举的实施例涵盖。
列举的实施例
1.一种评价具有内源ORF的细胞中的tRNA池的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括获得，例如直接或间接获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如获得该细胞中(i)和(ii)的相对量的信息，其中(i)是tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子，并且(ii)是同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与该细胞中不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子，从而评价该细胞中的该tRNA池。
2.一种评价具有内源ORF的受试者中的tRNA池的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括获得，例如直接或间接获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如获得该受试者中(i)和(ii)的相对量的信息，其中(i)是tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子，并且(ii)是同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与该细胞中不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子，从而评价该受试者中的该tRNA池。
3.如实施例1或2所述的方法，该方法包括获得(i)的信息。
4.如实施例1或2所述的方法，该方法包括获得(ii)的信息。
5.如实施例1或2所述的方法，该方法包括获得(i)和(ii)的信息。
6.如实施例1-3或5中任一个所述的方法，其中获得(i)的信息包括获得(i)的丰度值，例如相对量。
7.如实施例1-2或4-5中任一个所述的方法，其中获得(ii)的信息包括获得(ii)的丰度值，例如相对量。
8.如实施例6或7所述的方法，其中响应于所述值，该方法包括施用包含TREM的组合物，其中该TREM具有与以下配对的反密码子：(a)该具有第一序列的密码子；或(b)不是该具有第一序列的密码子的密码子，其量和时间足以调节该第一tRNA部分和该第二tRNA部分的相对量。
9.一种调节包含内源开放阅读框(ORF)的细胞中的tRNA池的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
任选地，获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如获得该细胞中(i)和(ii)的相对量的信息，其中(i)是tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子，并且(ii)是同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与该细胞中不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子；
使该细胞与包含TREM的组合物接触，其中该TREM具有与以下配对的反密码子：(a)该具有第一序列的密码子；或(b)不是该具有第一序列的密码子的密码子，其量和/或时间足以调节该细胞中该第一tRNA部分和该第二tRNA部分的相对量，
从而调节该细胞中的该tRNA池。
10.如实施例9所述的方法，其中该TREM包含与(a)配对的反密码子。
11.如实施例9所述的方法，其中该TREM包含与(b)配对的反密码子。
12.一种调节具有内源开放阅读框(ORF)的受试者中的tRNA池的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
任选地，获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如获得该受试者中(i)和(ii)的相对量的信息，其中(i)是tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子，并且(ii)是同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与该受试者中不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子；
使该受试者与包含TREM的组合物接触，其中该TREM具有与以下配对的反密码子：(a)该具有第一序列的密码子；或(b)不是该具有第一序列的密码子的密码子，其量和/或时间足以调节该受试者中该第一tRNA部分和该第二tRNA部分的相对量，
从而调节该受试者中的该tRNA池。
13.如实施例12所述的方法，其中该TREM包含与(a)配对的反密码子。
14.如实施例12所述的方法，其中该TREM包含与(b)配对的反密码子。
15.如实施例9-14中任一个所述的方法，该方法包括获得(i)的信息。
16.如实施例9-14中任一个所述的方法，该方法包括获得(ii)的信息。
17.如实施例9-14中任一个所述的方法，该方法包括获得(i)和(ii)的信息。
18.如实施例9-14中任一个所述的方法，其中获得(i)的信息包括获得(i)的丰度值，例如相对量。
19.如实施例9-14中任一个所述的方法，其中获得(ii)的信息包括获得(ii)的丰度值，例如相对量。
20.如实施例18或19所述的方法，其中响应于所述值，使该细胞或受试者与包含该TREM的组合物接触，该TREM具有与(a)或(b)配对的反密码子。
21.一种调节具有内源开放阅读框(ORF)的受试者中的tRNA池的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
提供包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有与该SMC配对的反密码子序列的同工受体tRNA部分(该TREM)；
使该受试者与包含TREM的该组合物接触，其量和/或时间足以调节该受试者中的tRNA池，
从而调节该受试者中的该tRNA池。
22.一种调节包含内源开放阅读框(ORF)的细胞中的tRNA池的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
提供包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有与该SMC配对的反密码子序列的同工受体tRNA部分(该TREM)；
使该细胞与包含TREM的该组合物接触，其量和/或时间足以调节该细胞中的tRNA池，
从而调节该细胞中的该tRNA池。
23.如实施例21或22所述的方法，该方法包括获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如获得(i)和(ii)的相对量的信息，其中(i)是tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与该SMC配对的反密码子，并且(ii)是同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与该受试者或细胞中不是该SMC的密码子配对的反密码子。
24.如实施例23所述的方法，该方法包括获得(i)的信息。
25.如实施例23所述的方法，该方法包括获得(ii)的信息。
26.如实施例23所述的方法，该方法包括获得(i)和(ii)的信息。
27.如实施例23所述的方法，其中获得(i)的信息包括获得(i)的丰度值，例如相对量。
28.如实施例23所述的方法，其中获得(ii)的信息包括获得(ii)的丰度值，例如相对量。
29.如实施例27或28所述的方法，其中响应于所述值，使该细胞或受试者与该TREM接触。
30.一种治疗具有内源开放阅读框(ORF)的受试者的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
提供包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有以下的同工受体tRNA部分：与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子；或与不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子，
使该受试者与包含TREM的该组合物接触，其量和/或时间足以治疗该受试者，
从而治疗该受试者。
31.一种治疗具有内源开放阅读框(ORF)的受试者的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
提供包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有与该SMC配对的反密码子的同工受体tRNA部分(该TREM)；
使该受试者与包含TREM的该组合物接触，其量和/或时间足以治疗该受试者，
从而治疗该受试者。
32.如实施例30或31所述的方法，该方法包含获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如，获得以下的相对量的信息：
(i)tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与具有第一序列的该密码子或该SMC配对的反密码子；和/或
(ii)同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与不是该具有第一序列的密码子的密码子配对或与不是该SMC的密码子配对的反密码子。
33.如实施例32所述的方法，该方法包括获得(i)的信息。
34.如实施例32所述的方法，该方法包括获得(ii)的信息。
35.如实施例32所述的方法，该方法包括获得(i)和(ii)的信息。
36.如实施例32所述的方法，其中获得(i)的信息包括获得(i)的丰度值，例如相对量。
37.如实施例32所述的方法，其中获得(ii)的信息包括获得(ii)的丰度值，例如相对量。
38.如实施例27或28所述的方法，其中响应于所述值，使该受试者与该TREM接触。
39.一种治疗具有内源开放阅读框(ORF)的受试者的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
(i)获得，例如直接或间接获得该受试者中该具有第一序列的密码子的状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中该具有第一序列的密码子的存在或不存在的量度；并且将该受试者鉴定为包含该具有第一序列的密码子；以及
(ii)响应于所述值，向该受试者施用包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有与该具有第一序列的密码子配对的反密码子的同工受体tRNA部分，
从而治疗该受试者。
40.一种治疗具有内源开放阅读框(ORF)的受试者的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
(i)获得，例如直接或间接获得该受试者的SMC状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中SMC的存在或不存在的量度，并且将该受试者鉴定为具有SMC；以及
(ii)响应于所述值，向该受试者施用包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有与该SMC配对的反密码子的同工受体tRNA部分，
从而治疗该受试者。
41.一种选择用于具有内源开放阅读框(ORF)的受试者的疗法的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
获得，例如直接或间接获得该受试者中该具有第一序列的密码子的状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中该具有第一序列的密码子的存在或不存在的量度；并且
其中该具有第一序列的密码子的存在指示所述受试者可能是该疗法的反应者，或所述受试者将对该治疗有反应或将可能有反应，
从而选择该疗法。
42.一种选择用于具有内源开放阅读框(ORF)的受试者的疗法的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
获得，例如直接或间接获得该受试者的SMC状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中SMC的存在或不存在的量度，并且
其中SMC的存在指示所述受试者可能是该疗法的反应者，或所述受试者将对该治疗有反应或将可能有反应，
从而选择该疗法。
43.一种评价具有内源开放阅读框(ORF)的受试者的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
获得，例如直接或间接获得该受试者中该具有第一序列的密码子的状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中该具有第一序列的密码子的存在或不存在的量度；以及
将该受试者鉴定为包含该具有第一序列的密码子，
从而评价该受试者。
44.一种评价具有内源开放阅读框(ORF)的受试者的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
获得，例如直接或间接获得该受试者的SMC状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中SMC的存在或不存在的量度；以及
将该受试者鉴定为具有SMC，
从而评价该受试者。
45.如实施例8-44中任一个所述的方法，其中该TREM不包含与终止密码子配对的反密码子。
46.如实施例1-45中任一个所述的方法，其中：(a)该具有第一序列的ORF密码子；或(b)该SMC；不是终止密码子，例如，TAA、TGA或TAG。
47.如实施例8-46中任一个所述的方法，其中该TREM包含经典反密码子/装载位点组合。
48.如实施例1-47中任一个所述的方法，其中：(a)该具有第一序列的ORF密码子；或(b)该SMC；在所述密码子的第一位置中具有突变，例如SNP。
49.如实施例1-48中任一个所述的方法，其中：(a)该具有第一序列的ORF密码子；或(b)该SMC；在所述密码子的第二位置中具有突变，例如SNP。
50.如实施例1-49中任一个所述的方法，其中：(a)该具有第一序列的ORF密码子；或(b)该SMC；在所述密码子的第三位置中具有突变，例如SNP。
51.如实施例1-20、23-29、32-38或45-50中任一个所述的方法，其中该第一tRNA部分包含内源tRNA，并且该第二tRNA部分包含内源tRNA，例如，其中该细胞或受试者尚未与包含TREM的组合物接触。
52.如实施例1-20、23-29、32-38或45-51中任一个所述的方法，其中该第一tRNA部分和该第二tRNA部分中的一者包含内源tRNA和TREM。
53.如前述实施例中任一个所述的方法，其中：(a)该具有第一序列的ORF密码子；或(b)该SMC；在不存在与包含TREM的该组合物的接触的情况下与如下表型相关，例如不需要的表型，例如障碍或症状，例如选自表1的障碍或症状。
54.如实施例53所述的方法，其中该障碍或症状选自表1中提供的疾病组，例如心血管、皮肤、内分泌、免疫学、神经学、肿瘤学、眼科或呼吸疾病。
55.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是心脏肥大。
56.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是冠状动脉疾病。
57.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是高血压。
58.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍或症状是肥胖相关的特征。
59.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是1型糖尿病。
60.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是2型糖尿病。
61.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是牛皮癣。
62.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是子宫内膜异位。
63.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是慢性炎症性疾病，例如强直性脊柱炎、克罗恩氏病(Crohn's diseases)、牛皮癣、原发性硬化性胆管炎、溃疡性结肠炎或基因多效性。
64.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是克罗恩氏病。
65.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是格雷夫氏病(Grave'sdisease)。
66.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sdisease)，例如按年龄发作的阿尔茨海默氏病或家族性阿尔茨海默氏病。
67.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是重度抑郁障碍。
68.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是偏头痛。
69.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是帕金森氏病(Parkinson'sdisease)。
70.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是精神分裂症。
71.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍或症状是对化疗的不良反应，例如中性粒细胞减少或白细胞减少。
72.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是乳腺癌，例如早发性乳腺癌。
73.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是卵巢癌。
74.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是结直肠癌。
75.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是上皮性卵巢癌中的卡铂分布。
76.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是多发性骨髓瘤中的艰难梭菌(clostridium difficile)感染。
77.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是子宫内膜癌，例如具有子宫内膜样组织学。
78.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是食管鳞状细胞癌。
79.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是胶质母细胞瘤。
80.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是肺癌。
81.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍或症状是巨噬细胞迁移抑制因子水平。
82.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是口腔癌和咽癌。
83.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是胰腺癌。
84.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是近视。
85.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是COPD。
86.如实施例53或54所述的方法，其中该障碍是哮喘。
87.如实施例1-86中任一个所述的方法，其中该具有第一序列的ORF密码子；或该SMC位于基因，例如表1中提供的转录本中。
88.如实施例1-87中任一个所述的方法，其中该具有第一序列的ORF密码子或该SMC包含表1中提供的密码子，例如表1的“密码子从/到”栏中列出的密码子，例如表1中所述栏中列出的第二密码子。
89.如实施例1-88中任一个所述的方法，其中与包含TREM的该组合物接触与如下第二表型相关，例如改善不需要的表型，例如改善障碍或症状，例如改善选自表1的障碍或症状。
90.如实施例89所述的方法，其中该障碍或症状选自表1中提供的疾病组，例如心血管、皮肤、内分泌、免疫学、神经学、肿瘤学、眼科或呼吸疾病。
91.如前述实施例中任一个所述的方法，其中该受试者具有选自表1的障碍或症状，或者来自该受试者的细胞与表1中列出的障碍或症状相关，例如选自以下的疾病组：心血管、皮肤、内分泌、免疫学、神经学、肿瘤学、眼科或呼吸疾病。
92.如实施例91所述的方法，其中该障碍是心脏肥大。
93.如实施例91所述的方法，其中该障碍是冠状动脉疾病。
94.如实施例91所述的方法，其中该障碍是高血压。
95.如实施例91所述的方法，其中该障碍或症状是肥胖相关的特征。
96.如实施例91所述的方法，其中该障碍是1型糖尿病。
97.如实施例91所述的方法，其中该障碍是2型糖尿病。
98.如实施例91所述的方法，其中该障碍是牛皮癣。
99.如实施例91所述的方法，其中该障碍是子宫内膜异位。
100.如实施例91所述的方法，其中该障碍是慢性炎症性疾病，例如强直性脊柱炎、克罗恩氏病、牛皮癣、原发性硬化性胆管炎、溃疡性结肠炎或基因多效性。
101.如实施例91所述的方法，其中该障碍是克罗恩氏病。
102.如实施例91所述的方法，其中该障碍是格雷夫氏病。
103.如实施例91所述的方法，其中该障碍是阿尔茨海默氏病，例如按年龄发作的阿尔茨海默氏病或家族性阿尔茨海默氏病。
104.如实施例91所述的方法，其中该障碍是重度抑郁障碍。
105.如实施例91所述的方法，其中该障碍是偏头痛。
106.如实施例91所述的方法，其中该障碍是帕金森氏病。
107.如实施例91所述的方法，其中该障碍是精神分裂症。
108.如实施例91所述的方法，其中该障碍或症状是对化疗的不良反应，例如中性粒细胞减少或白细胞减少。
109.如实施例91所述的方法，其中该障碍是乳腺癌，例如早发性乳腺癌。
110.如实施例91所述的方法，其中该障碍是卵巢癌。
111.如实施例91所述的方法，其中该障碍是结直肠癌。
112.如实施例91所述的方法，其中该障碍是上皮性卵巢癌中的卡铂分布。
113.如实施例91所述的方法，其中该障碍是多发性骨髓瘤中的艰难梭菌感染。
114.如实施例91所述的方法，其中该障碍是子宫内膜癌，例如具有子宫内膜样组织学。
115.如实施例91所述的方法，其中该障碍是食管鳞状细胞癌。
116.如实施例91所述的方法，其中该障碍是胶质母细胞瘤。
117.如实施例91所述的方法，其中该障碍是肺癌。
118.如实施例91所述的方法，其中该障碍或症状是巨噬细胞迁移抑制因子水平。
119.如实施例91所述的方法，其中该障碍是口腔癌和咽癌。
120.如实施例91所述的方法，其中该障碍是胰腺癌。
121.如实施例91所述的方法，其中该障碍是近视。
122.如实施例91所述的方法，其中该障碍是COPD。
123.如实施例91所述的方法，其中该障碍是哮喘。
124.如前述实施例中任一个所述的方法，其中获得信息包括获得该第一tRNA部分和该第二tRNA部分的相对量的值。
125.如实施例124所述的方法，其中响应于所述值，该方法包括使受试者或细胞与包含TREM的组合物接触。
126.如前述实施例中任一个所述的方法，其中该第一tRNA部分包含内源tRNA，并且该第二tRNA部分包含内源tRNA，例如，其中该细胞或受试者尚未与包含TREM的组合物接触。
127.如前述实施例中任一个所述的方法，其中该第一tRNA部分和该第二tRNA部分中的一者包含内源tRNA和TREM。
128.如实施例8-127中任一个所述的方法，其中在与该受试者或细胞接触之前，该第一tRNA部分比该第二tRNA部分丰度高。
129.如前述实施例中任一个所述的方法，其中第一tRNA部分比该第二tRNA部分丰度高：
至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％；15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％；或
0.5％-99％之间、1％-99％之间、2％-99％之间、3％-99％之间、4％-99％之间、5％-99％之间、6％-99％之间、7％-99％之间、8％-99％之间、9％-99％之间、10％-99％之间、15％-99％之间、20％-99％之间、25％-99％之间、30％-99％之间、40％-99％之间、50％-99％之间、60％-99％之间、70％-99％之间、80％-99％之间、95％-99％之间、0.5％-95％之间、0.5％-90％之间、0.5％-85％之间、0.5％-80％之间、0.5％-70％之间、0.5％-60％之间、0.5％-50％之间、0.5％-40％之间、0.5％-30％之间、0.5％-25％之间、0.5％-20％之间、0.5％-15％之间、0.5％-10％之间、0.5％-9％之间、0.5％-8％之间、0.5％-7％之间、0.5％-6％之间、0.5％-5％之间、0.5％-4％之间、0.5％-3％之间、0.5％-2％之间或0.5％-1％之间；
例如，其中丰度通过实例29-32中任一个中所述的测定确定。
130.如实施例8-129中任一个所述的方法，其中在与该受试者或细胞接触之前，该第二tRNA部分比该第一tRNA部分丰度高。
131.如前述实施例中任一个所述的方法，其中第二tRNA部分比该第一tRNA部分丰度高：
至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％；15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％；或
0.5％-99％之间、1％-99％之间、2％-99％之间、3％-99％之间、4％-99％之间、5％-99％之间、6％-99％之间、7％-99％之间、8％-99％之间、9％-99％之间、10％-99％之间、15％-99％之间、20％-99％之间、25％-99％之间、30％-99％之间、40％-99％之间、50％-99％之间、60％-99％之间、70％-99％之间、80％-99％之间、95％-99％之间、0.5％-95％之间、0.5％-90％之间、0.5％-85％之间、0.5％-80％之间、0.5％-70％之间、0.5％-60％之间、0.5％-50％之间、0.5％-40％之间、0.5％-30％之间、0.5％-25％之间、0.5％-20％之间、0.5％-15％之间、0.5％-10％之间、0.5％-9％之间、0.5％-8％之间、0.5％-7％之间、0.5％-6％之间、0.5％-5％之间、0.5％-4％之间、0.5％-3％之间、0.5％-2％之间或0.5％-1％之间；
例如，其中丰度通过实例29-32中任一个中所述的测定确定。
132.如实施例8-131中任一个所述的方法，其中与包含TREM的组合物接触或用该组合物处理细胞或受试者包括调节该细胞或受试者中的tRNA池。
133.如实施例9-29或45-132中任一个所述的方法，其中调节包括与该第二tRNA部分相比增加该第一tRNA部分的量。
134.如实施例133所述的方法，其中该增加是受试者或经处理细胞中该第一tRNA部分的量，例如绝对量。
135.如实施例133或134所述的方法，其中该增加相对于参考，例如该经处理细胞的组分，例如该第一tRNA部分或该第二tRNA部分的基线水平。
136.如实施例133-135中任一个所述的方法，其中该第一tRNA部分的量相对于该参考增加至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、25、50或100倍或者1-100倍之间、1-50倍之间、1-25倍之间、1-20倍之间、1-15倍之间、1-10倍之间、1-5倍之间、1-4倍之间、1-3倍之间、1-2倍之间、2-100倍之间、3-100倍之间、4-100倍之间、5-100倍之间、10-100倍之间、15-100倍之间、20-100倍之间、25-100倍之间或50-100倍之间。
137.如实施例9-29或45-136中任一个所述的方法，其中调节包括与该第一tRNA部分相比增加该第二tRNA部分的相对量。
138.如实施例137所述的方法，其中该增加是受试者或经处理细胞中该第二tRNA部分的量，例如绝对量。
139.如实施例137或138所述的方法，其中该增加相对于参考，例如该经处理细胞的组分，例如该第二tRNA部分或该第一tRNA部分的基线水平。
140.如实施例137-139中任一个所述的方法，其中该第一tRNA部分的量相对于该参考增加至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、25、50或100倍。
141.如实施例9-29或45-140中任一个所述的方法，其中调节包括调节该第一tRNA部分与该第二tRNA部分的比率。
142.如实施例141所述的方法，其中该第一tRNA部分与该第二tRNA部分的比率为1:10,000、1:5000、1:1000、1:900、1:800、1:700、1:600、1:500、1:400、1:300、1:200、1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1。
143.如实施例141所述的方法，其中该第二tRNA部分与该第一tRNA部分的比率为1:10,000、1:5000、1:1000、1:900、1:800、1:700、1:600、1:500、1:400、1:300、1:200、1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1。
144.如实施例141-143中任一个所述的方法，其中该第一tRNA部分与该第二tRNA部分的比率增加。
145.如实施例141-143中任一个所述的方法，其中该第一tRNA部分与该第二tRNA部分的比率减少。
146.如实施例141-145中任一个所述的方法，其中将该第一tRNA部分与该第二tRNA部分的比率与参考，例如未与包含TREM的组合物接触的其他方面类似的细胞中的比率比较。
147.如前述实施例中任一个所述的方法，其中该细胞是人类细胞或该受试者是人类。
148.如实施例8-147中任一个所述的方法，其中未向该细胞或该受试者引入该ORF的突变拷贝。
149.如实施例8-147中任一个所述的方法，其中与包含TREM的该组合物接触或用该组合物处理增加了该ORF的翻译产物的产生和/或功能，例如，如通过实例33-38中任一个所述的测定所评价。
150.如前述实施例中任一个所述的方法，其中该ORF或该含有SMC的ORF编码多肽。
151.如前述实施例中任一个所述的方法，其中该ORF或该含有SMC的ORF是染色体ORF。
152.如实施例1-150中任一个所述的方法，其中该ORF或该含有SMC的ORF是线粒体ORF。
153.如实施例8-152中任一个所述的方法，其中与包含TREM的组合物接触改善了症状或障碍，例如与该具有第一序列的密码子或该SMC相关的症状或障碍。
154.如实施例153所述的方法，其中该症状或障碍选自表1。
155.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是心脏肥大。
156.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是冠状动脉疾病。
157.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是高血压。
158.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍或症状是肥胖相关的特征。
159.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是1型糖尿病。
160.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是2型糖尿病。
161.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是牛皮癣。
162.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是子宫内膜异位。
163.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是慢性炎症性疾病，例如强直性脊柱炎、克罗恩氏病(Crohn's diseases)、牛皮癣、原发性硬化性胆管炎、溃疡性结肠炎或基因多效性。
164.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是克罗恩氏病。
165.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是格雷夫氏病(Grave'sdisease)。
166.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sdisease)，例如按年龄发作的阿尔茨海默氏病或家族性阿尔茨海默氏病。
167.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是重度抑郁障碍。
168.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是偏头痛。
169.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是帕金森氏病(Parkinson'sdisease)。
170.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是精神分裂症。
171.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍或症状是对化疗的不良反应，例如中性粒细胞减少或白细胞减少。
172.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是乳腺癌，例如早发性乳腺癌。
173.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是卵巢癌。
174.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是结直肠癌。
175.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是上皮性卵巢癌中的卡铂分布。
176.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是多发性骨髓瘤中的艰难梭菌感染。
177.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是子宫内膜癌，例如具有子宫内膜样组织学。
178.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是食管鳞状细胞癌。
179.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是胶质母细胞瘤。
180.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是肺癌。
181.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍或症状是巨噬细胞迁移抑制因子水平。
182.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是口腔癌和咽癌。
183.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是胰腺癌。
184.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是近视。
185.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是COPD。
186.如实施例153或154所述的方法，其中该障碍是哮喘。
187.如前述实施例中任一个所述的方法，其中该具有第一序列的ORF密码子或该SMC存在于一个等位基因中，例如，该受试者或该细胞对于该具有第一序列的密码子或该SMC是杂合的。
188.如前述实施例中任一个所述的方法，其中该具有第一序列的ORF密码子或该SMC存在于两个等位基因中，例如该受试者或该细胞对于该具有第一序列的密码子或该SMC是纯合的。
189.如实施例8-188中任一个所述的方法，该方法包括调节受试者或细胞中的蛋白质产生。
190.如实施例8-189中任一个所述的方法，该方法包括调节翻译产物谱，例如，受试者中或细胞中多肽的量、氨基酸掺入的速率、产生速率、构象、活性、细胞定位、修饰速率或与结合配偶体的共翻译相互作用。
191.如实施例8-190中任一个所述的方法，该方法包括调节从包含该具有第一序列的ORF密码子或该SMC的mRNA翻译的多肽的起始或延伸。
192.如实施例8-191中任一个所述的方法，其中包含TREM的该组合物通过本文所述的方法制备，例如使用合成方法(例如，使用固态合成或液相合成来合成)；使用体外转录(IVT)，或通过在细胞中表达编码TREM的载体。
193.如实施例192所述的方法，其中该方法包括：
(a)在足以表达TREM的条件下提供宿主细胞，该宿主细胞包含编码该TREM的外源核酸，例如DNA或RNA；以及
(b)从该宿主细胞培养物纯化表达的TREM以产生包含TREM的组合物，从而制备包含TREM的组合物。
194.如实施例8-193所述的方法，其中包含TREM的该组合物是包含TREM的药物组合物。
195.如实施例8-194中任一个所述的方法，其中包含TREM的该组合物包含药物赋形剂。
196.如实施例193-195中任一个所述的方法，该方法包括将外源DNA或RNA引入该哺乳动物宿主细胞中。
197.如实施例193-196中任一个所述的方法，其中该核酸包含如下DNA，其转录后表达TREM。
198.如实施例193-197中任一个所述的方法，其中该核酸包含如下RNA，其在逆转录后产生可转录得到TREM的DNA。
199.如实施例8-198中任一个所述的方法，其中包含TREM的该组合物包含例如本文所述的TREM片段。
200.如实施例193-199中任一个所述的方法，其中该宿主细胞是哺乳动物细胞。
201.如实施例193-200中任一个所述的方法，其中该宿主细胞包含选自以下的细胞：HEK293T细胞(例如，Freestyle 293-F细胞)、HT-1080细胞、PER.C6细胞、HKB-11细胞、CAP细胞、HuH-7细胞、BHK 21细胞、MRC-S细胞、MDCK细胞、VERO细胞、WI-38细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或MCF7细胞。
202.如实施例193-201中任一个所述的方法，其中该宿主细胞是非哺乳动物细胞，例如细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞。
203.如实施例8-202中任一个所述的方法，其中TREM是包含重组TREM的GMP级组合物(例如，按照cGMP和/或根据类似要求制备的包含TREM的组合物)，该GMP级组合物包含与表2所列DNA序列编码的RNA序列至少80％相同的RNA序列或者其片段或功能片段。
204.如实施例8-203中任一个所述的方法，其中该TREM包含表3中所列的一种或多种转录后修饰。
205.如实施例203或204所述的方法，其中包含重组TREM的该组合物为至少0.5g、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、15g、20g、30g、40g、50g、100g、200g、300g、400g或500g。
206.如实施例203或204所述的方法，其中包含重组TREM的该组合物为0.5g至500g之间、0.5g至400g之间、0.5g至300g之间、0.5g至200g之间、0.5g至100g之间、0.5g至50g之间、0.5g至40g之间、0.5g至30g之间、0.5g至20g之间、0.5g至10g之间、0.5g至9g之间、0.5g至8g之间、0.5g至7g之间、0.5g至6g之间、0.5g至5g之间、0.5g至4g之间、0.5g至3g之间、0.5g至2g之间、0.5g至1g之间、1g至500g之间、2g至500g之间、5g至500g之间、10g至500g之间、20g至500g之间、30g至500g之间、40g至500g之间、50g至500g之间、100g至500g之间、200g至500g之间、300g至500g或400g至500g。
207.如实施例8-206中任一个所述的方法，其中包含TREM的该组合物包含一种或多种，例如多种TREM。
208.如实施例8-207中任一个所述的组合物或药物组合物，其中包含TREM的该组合物(或制备包含TREM的组合物中的中间体)包含以下特征中的一种或多种：
(i)纯度至少为30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；
(ii)宿主细胞蛋白(HCP)污染少于0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml，40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml或100ng/ml；
(iii)宿主细胞蛋白(HCP)污染少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng或100ng/毫克(mg)包含TREM的该组合物；
(iv)DNA，例如，宿主细胞DNA，少于1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml或100ng/ml；
(v)片段少于0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％；
(vi)内毒素水平低或不存在，例如，如通过鲎变形细胞裂解物(LAL)测试所测量；
(vii)体外翻译活性，例如，如通过实例14中描述的测定所测量；
(viii)TREM浓度为至少0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、0.1ug/mL、0.5ug/mL、1ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL、40ug/mL、50ug/mL、60ug/mL、70ug/mL、80ug/mL、100ug/mL、200ug/mL、300ug/mL、500ug/mL、1000ug/mL、5000ug/mL、10,000ug/mL或100,000ug/mL；
(ix)无菌，例如，根据无菌药物产品的cGMP指南，例如，在无菌条件下测试时，该组合物或制剂支持少于100个活微生物的生长，该组合物或制剂符合USP<71>的标准，和/或该组合物或制剂符合USP<85>的标准；或
(x)病毒污染，例如，所述组合物或制剂不存在病毒污染或检测不到病毒污染水平。
209.如实施例8-208中任一个所述的方法，其中该接触是体外方法，例如，使细胞或组织与包含TREM的该组合物在体外接触。
210.如实施例8-209中任一个所述的方法，其中该接触是离体方法，例如，使细胞或组织与包含TREM的该组合物离体接触，并且任选地，将该接触的细胞或组织引入，例如施用于受试者，例如该细胞或组织所来自的受试者，或不同受试者中。
211.如实施例8-209中任一个所述的方法，其中该方法是体内方法，例如，使受试者或受试者的组织或细胞与包含TREM的该组合物在体内接触。
212.如实施例8-211中任一个所述的方法，其中包含TREM的该组合物用递送剂，例如脂质体、聚合物(例如，聚合物缀合物)、颗粒、微球体、微颗粒或纳米颗粒施用。
213.如实施例8-211中任一个所述的方法，其中包含TREM的该组合物在没有载剂的情况下施用，例如通过该TREM的裸递送。
214.如实施例8-213中任一个所述的方法，其中该TREM提高了：
(a)产物，例如蛋白质的稳定性，和/或
(b)产物的核糖体占用。
215.如实施例8-214中任一个所述的方法，其中该TREM：
调节核糖体占用；
调节蛋白质翻译或稳定性；
调节mRNA稳定性；
调节蛋白质折叠或结构；
调节蛋白质转导或区室化；
调节密码子使用；
调节细胞命运；或
调节信号传导路径，例如细胞信号传导路径。
216.如实施例8-215中任一个所述的方法，其中该TREM包含表3中的转录后修饰。
217.如实施例8-216中任一个所述的方法，其中该TREM包含同源衔接子功能，并且其中该TREM介导在肽链的起始或延伸中与该TREM的反密码子天然相关的氨基酸的接受和掺入。
218.如实施例8-217中任一个所述的方法，其中该TREM包含与天然存在的tRNA的RNA序列至少80％相同的RNA序列。
219.如实施例8-218中任一个所述的方法，其中该TREM包含与表2中所列DNA序列编码的RNA至少80％相同的RNA序列，或者其片段或功能片段。
220.如实施例8-219中任一个所述的方法，其中该TREM包含表2中所列DNA序列编码的RNA序列，或其片段。
221.如实施例8-220中任一个所述的方法，其中该TREM包含与表2中所列DNA序列编码的RNA序列至少XX％相同的RNA序列，或其片段，其中XX选自80、85、90、95、96、97、98或99。
222.如实施例221所述的方法，其中XX是80。
223.如实施例221所述的方法，其中XX是85。
224.如实施例221所述的方法，其中XX是90。
225.如实施例221所述的方法，其中XX是95。
226.如实施例221所述的方法，其中XX是97。
227.如实施例221所述的方法，其中XX是98。
228.如实施例221所述的方法，其中XX是99。
229.如实施例219-228中任一个所述的方法，其中该DNA序列是SEQ ID NO:1或其片段、或SEQ ID NO:2或其片段、或SEQ ID NO:3或其片段、或SEQ ID NO:4或其片段、或SEQID NO:5或其片段、或SEQ ID NO:6或其片段、或SEQ ID NO:7或其片段、或SEQ ID NO:8或其片段、或SEQ ID NO:9或其片段、或SEQ ID NO:10或其片段、或SEQ ID NO:11或其片段、或SEQ ID NO:12或其片段、或SEQ ID NO:13或其片段、或SEQ ID NO:14或其片段、或SEQ IDNO:15或其片段、或SEQ ID NO:16或其片段、或SEQ ID NO:17或其片段、或SEQ ID NO:18或其片段、或SEQ ID NO:19或其片段、或SEQ ID NO:20或其片段、或SEQ ID NO:21或其片段、或SEQ ID NO:22或其片段、或SEQ ID NO:23或其片段、或SEQ ID NO:24或其片段、或SEQ IDNO:25或其片段、或SEQ ID NO:26或其片段、或SEQ ID NO:27或其片段、或SEQ ID NO:28或其片段、或SEQ ID NO:29或其片段、或SEQ ID NO:30或其片段、或SEQ ID NO:31或其片段、或SEQ ID NO:32或其片段、或SEQ ID NO:33或其片段、或SEQ ID NO:34或其片段、或SEQ IDNO:35或其片段、或SEQ ID NO:36或其片段、或SEQ ID NO:37或其片段、或SEQ ID NO:38或其片段、或SEQ ID NO:39或其片段、或SEQ ID NO:40或其片段、或SEQ ID NO:41或其片段、或SEQ ID NO:42或其片段、或SEQ ID NO:43或其片段、或SEQ ID NO:44或其片段、或SEQ IDNO:45或其片段、或SEQ ID NO:46或其片段、或SEQ ID NO:47或其片段、或SEQ ID NO:48或其片段、或SEQ ID NO:49或其片段、或SEQ ID NO:50或其片段、或SEQ ID NO:51或其片段、或SEQ ID NO:52或其片段、或SEQ ID NO:53或其片段、或SEQ ID NO:54或其片段、或SEQ 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230.一种制备tRNA效应分子(TREM)的方法，该方法包括合成方法(例如，使用固态合成或液相合成来合成)；或体外转录(IVT)方法。
231.一种制备tRNA效应分子(TREM)的方法，该方法包括：
(a)在足以表达TREM的条件下提供宿主细胞，该宿主细胞包含编码该TREM的外源核酸，例如，DNA或RNA，并且
(b)从该宿主细胞培养物纯化表达的TREM以产生包含TREM的组合物，从而制备包含TREM的组合物。
232.如实施例230或231所述的方法，其中包含TREM的该组合物包含例如本文所述的TREM片段。
233.如实施例232所述的方法，其中该TREM片段在该宿主细胞中在体内产生。
234.如实施例232或233所述的方法，其中通过在该细胞产生TREM后将表达的该TREM片段化来产生该TREM片段，例如，该宿主细胞产生的TREM在从该宿主细胞释放或纯化后被片段化，例如，将该TREM离体片段化。
235.如实施例230-234中任一个所述的方法，其中该方法使该宿主细胞中总内源tRNA和TREM的产生增加，例如至少增加2.2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10或20倍(例如，如通过实例1-3或7-11中任一个所述的测定所测量)，例如与参考细胞相比，该参考细胞例如类似细胞但未经工程化或修饰以表达TREM。
236.如实施例235所述的方法，其中该方法使TREM产生和/或tRNA产生增加2.2至20倍之间、2.2至15倍之间、2.2至10倍之间、2.2至9倍之间、2.2至8倍之间、2.2至7倍之间、2.2至6倍之间、2.2至5倍之间、2.2至4倍之间、2.2至3倍之间、2.2至2.5倍之间、2.5至20倍之间、3至20倍之间、4至20倍之间、5至20倍之间、6至20倍之间、7至20倍之间、8至20倍之间、9至20倍之间、10至20倍之间或15至20倍之间。
237.如实施例230-236中任一个所述的方法，其中该方法得到该宿主细胞中可检测水平的TREM，例如，如通过实例1-3或7-11中任一个所述的测定所测量。
238.如实施例230-237中任一个所述的方法，其中该宿主细胞能够对该TREM进行转录后修饰。
239.如实施例230-238中任一个所述的方法，其中该宿主细胞能够对该TREM进行转录后修饰，例如，选自表3的转录后修饰。
240.如实施例230-239中任一个所述的方法，其中该宿主细胞已经修饰以调节例如，增加其提供TREM转录后修饰的能力，例如，选自表3的转录后修饰，例如，该宿主细胞已经修饰以提供、增加或减少基因的表达，例如，编码来自表3的酶的基因，或编码具有核酸酶活性(例如，内切核酸酶活性或核糖核酸酶活性)的酶的基因，例如或切丁酶、血管生成素、RNA酶A、RNA酶P、RNA酶Z、Rny1或PrrC中的一种或多种。
241.如实施例230-240中任一个所述的方法，其中该宿主细胞是哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞能够对该TREM进行转录后修饰，例如，选自表3的转录后修饰。
242.如实施例230-241中任一个所述的方法，其中该宿主细胞包含HeLa细胞、HEK293细胞、HT-1080细胞、PER.C6细胞、HKB-11细胞、CAP细胞或HuH-7细胞。
243.如实施例230-242中任一个所述的方法，其中该宿主细胞的癌基因，例如Ras、c-myc或c-jun的表达增加。
244.如实施例230-243中任一个所述的方法，其中该宿主细胞的肿瘤抑制因子，例如p53或Rb的表达减少。
245.如实施例230-244中任一个所述的方法，其中该宿主细胞的RNA聚合酶III(RNA Pol III)的表达增加。
246.如实施例230-245中任一个所述的方法，其中该细胞是非哺乳动物宿主细胞。
247.如实施例230-246中任一个所述的方法，其中该宿主细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞，或酵母细胞。
248.如实施例230-247中任一个所述的方法，该方法进一步包括测量包含TREM的该组合物(或制备包含TREM的组合物中的中间体)的以下特征中的一种或多种：
(i)纯度至少为30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；
(ii)宿主细胞蛋白(HCP)污染少于0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml，40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml或100ng/ml；
(iii)宿主细胞蛋白(HCP)污染少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng或100ng/毫克(mg)包含TREM的该组合物；
(iv)DNA，例如，宿主细胞DNA，少于1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml或100ng/ml；
(v)片段少于0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％；
(vi)内毒素水平低或不存在，例如，如通过鲎变形细胞裂解物(LAL)测试所测量；
(vii)体外翻译活性，例如，如通过实例14中描述的测定所测量；
(viii)TREM浓度为至少0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、0.1ug/mL、0.5ug/mL、1ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL、40ug/mL、50ug/mL、60ug/mL、70ug/mL、80ug/mL、100ug/mL、200ug/mL、300ug/mL、500ug/mL、1000ug/mL、5000ug/mL、10,000ug/mL或100,000ug/mL；
(ix)无菌，例如，根据无菌药物产品的cGMP指南，例如，在无菌条件下测试时，该组合物或制剂支持少于100个活微生物的生长，该组合物或制剂符合USP<71>的标准，和/或该组合物或制剂符合USP<85>的标准；或
(x)病毒污染，例如，所述组合物或制剂不存在病毒污染或检测不到病毒污染水平。
249.如实施例248所述的方法，该方法进一步包括将该测量值与参考值或标准进行比较。
250.如实施例249所述的方法，该方法进一步包括响应于该比较调节包含TREM的该组合物以：
(i)增加该组合物的纯度；
(ii)减少该组合物中HCP的量；
(iii)减少该组合物中DNA的量；
(iv)减少该组合物中片段的量；
(v)减少该组合物中内毒素的量；
(vi)增加该组合物的体外翻译活性；
(vii)增加该组合物的TREM浓度；或
(viii)增加该组合物的无菌性。
251.如实施例230-250中任一个所述的TREM，其中该TREM从生物反应器中培养的宿主细胞中纯化。
252.如实施例251所述的生物反应器，该生物反应器
(i)其包含至少1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013或1x1014个宿主细胞；
(ii)包含100mL与100L之间的培养基，例如至少100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升或100升培养基；
(iii)其中该生物反应器选自连续流动生物反应器、分批工艺生物反应器、灌注生物反应器和补料分批生物反应器；或
(iv)其中将该生物反应器保持在足以表达该TREM的条件下。
253.如实施例230-252中任一个所述的方法，其中该TREM由包含以下的核酸序列编码或由该核酸序列表达：
(i)控制区序列；
(ii)编码经修饰TREM的序列；
(iii)编码多于一个TREM的序列；或
(iv)不是tRNAMET序列的序列。
254.如实施例253所述的方法，其中该核酸序列包含启动子序列。
255.如实施例253或254所述的方法，其中该核酸序列包含启动子序列，该启动子序列包含RNA聚合酶III(Pol III)识别位点，例如Pol III结合位点，例如U6启动子序列或其片段。
本发明的其他特征、目的和优点将从说明书和权利要求中是显而易见。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。所有的公开案、专利申请、专利和本文提及的其他参考文献以全文援引的方式并入。另外，材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在限制。
附图说明
图1小图A描绘了非SNP受试者的mRNA和蛋白质序列以及内源tRNA池。第二密码子的序列是GTG(由空心三角形描绘)，其编码氨基酸缬氨酸。显示了两种缬氨酸同工受体tRNA种类。两种tRNA种类中的每一种均识别不同的缬氨酸密码子。该两种种类具有不同的丰度。识别野生型密码子GTG的种类没有标阴影并且丰度较高。具有较低丰度的标阴影种类不与野生型密码子配对。因此，对应于所用密码子(GTG)的缬氨酸同工受体tRNA种类的丰度较高。
图1小图B描绘了如下受试者的mRNA和蛋白质序列以及内源tRNA池，该受试者在所描绘的mRNA序列中第二密码子的第三位置(用实心三角形显示)处具有单核苷酸多态性(SNP)。该内源tRNA池的组成与对于图1小图A所述相同。然而，现在在第二密码子处掺入缬氨酸依赖于使用丰度较低的tRNA种类(标阴影种类)。因此，如图1小图B所示，翻译受损。使用丰度较低的tRNA种类的其他结果也可能是，例如，肽链的延伸中断、蛋白质产生降低、蛋白质错误折叠、蛋白质错误定位、蛋白质功能改变或mRNA转录本稳定性改变。
图1小图C描绘了与图1小图B相同的mRNA序列，其在第二密码子的第三位置包括SNP。池中的内源tRNA与小图A和小图B中相同，但该池补充了外源TREM，这些外源TREM增加了与SNP密码子配对的种类的丰度。这可以改进mRNA的翻译。
图2小图A描绘了非SNP受试者的mRNA和蛋白质序列以及内源tRNA池。第二密码子的序列是GTG(由空心三角形描绘)，其编码氨基酸缬氨酸。显示了两种缬氨酸同工受体tRNA种类。两种tRNA种类中的每一种均识别不同的缬氨酸密码子。该两种种类具有不同的丰度。识别野生型密码子GTG的种类没有标阴影并且丰度较高。具有较低丰度的标阴影种类不与野生型密码子配对。因此，对应于所用密码子(GTG)的缬氨酸同工受体tRNA种类的丰度较高。这使得mRNA序列翻译为所描绘的相应蛋白质。
图2小图B描绘了如下受试者的mRNA和蛋白质序列以及内源tRNA池，该受试者在所描绘的mRNA序列中第二密码子的第三位置(用实心三角形显示)处具有单核苷酸多态性(SNP)。该内源tRNA池的组成与对于图2小图A所述相同。然而，现在在第二密码子处掺入缬氨酸依赖于使用丰度较低的tRNA种类(标阴影种类)。因此，如图2小图B所示，mRNA序列翻译为相应蛋白质受损。
图2小图C描绘了与图2小图B相同的mRNA序列，其在第二密码子的第三位置包括SNP(用实心三角形显示)。池中的内源tRNA与小图A和小图B中相同，但该池补充了外源TREM，这些外源TREM增加了与SNP密码子配对的种类的丰度。因此，mRNA序列翻译为相应蛋白质未受损，并且与非SNP受试者类似。
图3顶行描绘了非SNP受试者的内源tRNA池，向右是mRNA和蛋白质序列。第二密码子的序列是GTG(由空心三角形描绘)，其编码氨基酸缬氨酸。显示了两种缬氨酸同工受体tRNA种类。两种tRNA种类中的每一种均识别不同的缬氨酸密码子。该两种种类具有不同的丰度。识别野生型密码子GTG的种类没有标阴影并且丰度较高。具有较低丰度的标阴影种类不与野生型密码子配对。因此，对应于所用密码子(GTG)的缬氨酸同工受体tRNA种类的丰度较高。这使得mRNA序列翻译为所描绘的相应蛋白质。使用丰度较高的tRNA种类还可以对转录稳定性、蛋白质表达、蛋白质功能、蛋白质折叠或蛋白质定位具有影响。
图3中间行描绘了如下受试者的内源tRNA池和mRNA以及蛋白质序列，该受试者在所描绘的mRNA序列中第二密码子的第三位置(用实心三角形显示)处具有单核苷酸多态性(SNP)。内源tRNA池的组成与对于图3顶行所述相同。然而，现在在第二密码子处掺入缬氨酸依赖于使用丰度较低的tRNA种类(标阴影种类)。因此，如图3中间行所示，mRNA序列翻译为相应蛋白质受损。使用丰度较低的tRNA种类还可以降低转录稳定性、减少蛋白质表达、改变蛋白质功能、改变蛋白质折叠或改变蛋白质定位。
图3底行描绘了与图3中间行相同的mRNA序列，其在第二密码子的第三位置包括SNP(用实心三角形显示)。池中的内源tRNA与顶行和中间行中相同，但该池补充了外源TREM，这些外源TREM增加了可以与SNP密码子配对的种类的丰度。因此，mRNA序列翻译为所描绘的相应蛋白质。
图4A-4C是显示在用对应于起始甲硫氨酸(iMet)的TREM转染后三种细胞系中细胞生长增加的图。图4A是显示用经Cy3标记的iMet-CAT-TREM转染或用经Cy3标记的非靶向对照转染的U20S细胞的增加的细胞汇合％(细胞生长的量度)的图。图4B是显示用经Cy3标记的iMet-CAT-TREM转染或用经Cy3标记的非靶向对照转染的H1299细胞的增加的细胞汇合％(细胞生长的量度)的图。图4C是显示用经Cy3标记的iMet-CAT-TREM转染或用经Cy3标记的非靶向对照转染的Hela细胞的增加的细胞汇合％(细胞生长的量度)的图。
图5是描绘在将iMET-TREM加入到具有无细胞裂解物的翻译反应中后NanoLuc报告子表达增加的图。作为对照，用缓冲液进行翻译反应。
具体实施方式
本披露的特征尤其在于使用基于tRNA的效应分子(TREM)来调节细胞或受试者中的tRNA池的方法。本文还披露了通过施用包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物来治疗障碍或改善障碍的症状的方法。如本文所披露，基于tRNA的效应分子(TREM)是可以介导多种细胞过程的复杂分子。可以向细胞、组织或受试者施用包含TREM的药物组合物以调节这些功能。
定义
如本文使用的术语“获得”是指通过“直接获得”或“间接获得”物理实体或值来拥有值，例如数值。“直接获得”是指执行过程(例如，执行分析方法)来获得值。“间接获得”是指从另一方或来源(例如，直接获得或值的第三方实验室)接收值。
如本文所用的术语“同源衔接子功能TREM”是指TREM，其介导与TREM的反密码子天然相关的AA(同源AA)的起始或延伸。
如本文所用的术语“减少的表达”是指与参考相比减少，例如在改变的控制区或药剂的添加导致受试者产物表达减少的情况下，相对于没有所述改变或添加的在其他方面类似的细胞，其表达减少。
如本文所用的术语“外源核酸”是指不存在于参考细胞中或与参考细胞中的最接近序列差异至少一个核苷酸的核酸序列，所述参考细胞是例如外源核酸被引入的细胞。在一个实施例中，外源核酸包含编码TREM的核酸。
如本文所用的术语“外源TREM”是指如下TREM，该TREM：
(a)与参考细胞中最接近的序列tRNA差异至少有一个核苷酸或一个转录后修饰，所述参考细胞是例如外源核酸被引入的细胞；
(b)已被引入不是转录其的细胞的细胞；
(c)存在于不是其自然发生的细胞的细胞中；或
(d)具有非野生型的表达谱，例如水平或分布，例如，它的表达水平高于野生型。在一个实施例中，表达谱可以通过将变化引入调节表达的核酸或通过添加调节RNA分子表达的药剂来介导。在一个实施例中，外源TREM包括特性(a)-(d)中的1、2、3或4个。
如本文所用的“GMP级组合物”是指按照当前良好制造实践(cGMP)指南或其他类似要求的组合物。在一个实施例中，GMP级组合物可用作药物产品。
如本文所用，术语“增加”和“减少”是指相对于参考，调节分别产生特定指标的功能、表达或活性更大或更小的量。例如，在向细胞、组织或受试者施用本文所述的TREM之后，如本文所述的指标(例如蛋白质翻译、mRNA稳定性、蛋白质折叠)的标志物的量可以相对于施用前标志物的量或相对于阴性对照剂的作用增加或减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％、2X、3X、5X、10X或更多。在施用已达到所述作用的时间，例如在开始治疗后至少12小时、24小时、一周、一个月、3个月、或6个月时，测量施用后的指标。
如本文所用的术语“增加的表达”是指与参考相比增加，例如在改变的控制区或药剂的添加导致受试者产物表达增加的情况下，相对于没有所述改变或添加的在其他方面类似的细胞，其表达增加。
如本文所用的术语“同工受体”是指多个tRNA分子或TREM，其中该多个分子中的每个分子包含不同的天然存在反密码子序列，并且该多个分子中的每个分子介导相同氨基酸的掺入，并且该氨基酸是天然对应于该多个分子的反密码子的氨基酸。
如本文所用的术语“非同源衔接子功能TREM”是指TREM，其介导不是与TREM的反密码子天然相关的AA的AA(非同源AA)的起始或延伸。在一个实施例中，非同源衔接子功能TREM也被称为无负载的TREM(mTREM)。
如本文所用的术语“癌基因”是指调节一种或多种细胞过程的基因，该一种或多种细胞过程包括：细胞命运决定、细胞存活和基因组维持。在一个实施例中，癌基因为其存在的细胞提供选择性生长优势，例如，失调，例如，在遗传上失调(例如，突变或扩增)或表观遗传失调。示例性癌基因包括Myc(例如，c-Myc、N-Myc或L-Myc)、c-Jun、Wnt或RAS。
如本文所用的术语“药物组合物”是指适用于药物用途的组合物。典型地，药物组合物包含药物赋形剂。在一个实施例中，药物组合物可以包含TREM(包含TREM的药物组合物)。在一个实施例中，TREM是包含TREM的药物组合物中的唯一活性成分。在实施例中，药物组合物，例如包含TREM的药物组合物不含、基本上不含或具有少于药学上可接受量的宿主细胞蛋白、DNA例如宿主细胞DNA、内毒素和细菌。在一个实施例中，药物组合物，例如包含TREM的药物组合物是按照当前良好制造实践(cGMP)指南或其他类似要求的GMP级组合物。在一个实施例中，药物组合物，例如包含TREM的药物组合物无菌，例如，根据无菌药物产品的cGMP指南，例如，在无菌条件下测试时，该组合物或制剂支持少于100个活微生物的生长，该组合物或制剂符合USP<71>的标准，和/或该组合物或制剂符合USP<85>的标准。
关于主题分子，例如，TREM、RNA或tRNA，如本文所用的术语“转录后加工”是指主题分子的共价修饰。在一个实施例中，共价修饰发生在转录后。在一个实施例中，共价修饰共转录地发生。在一个实施例中，修饰在体内进行，例如，在用于产生TREM的细胞中。在一个实施例中，修饰是离体，例如，其是在从产生TREM的细胞中分离或获得的TREM上进行的。在一个实施例中，转录后修饰选自表3中列出的转录后修饰。
如本文所用的术语“重组TREM”是指在通过人为干预修饰具有介导TREM产生的修饰的细胞中表达的TREM，例如，细胞包含编码TREM的外源序列，或介导表达的修饰，例如，TREM的转录表达或转录后修饰。重组TREM可以与参考tRNA，例如天然tRNA具有相同或不同的序列、转录后修饰组或三级结构。
如本文所用的术语“合成的TREM”是指在不是具有编码TREM的内源核酸的细胞的细胞中合成(例如通过无细胞固相合成)的TREM。合成的TREM可以与天然tRNA具有相同或不同的序列、转录后修饰组或三级结构。
如本文所用的术语“在异源细胞中表达的TREM”是指在非天然条件下制备的TREM。例如，TREM，i)在与天然存在的细胞不同的细胞中制备，例如，遗传上，代谢上(例如，具有不同的基因表达谱或具有不同水平的细胞组分，例如，吸收的营养物)，或表观遗传上不同；ii)在细胞中制造，所述细胞在与天然条件不同(天然条件是细胞在自然界中产生tRNA的条件)的条件下培养，例如，营养、pH、温度、细胞密度或压力条件；或iii)在细胞中以与参考不同的水平、速率或浓度制造，或定位在与参考不同的隔室或位置中，例如以与天然条件下发生的不同的水平、速率或浓度制造，或定位在与天然条件下发生的不同的隔室或位置中。在异源细胞中表达的TREM可以与天然tRNA具有相同或不同的序列、转录后修饰组或三级结构。
如本文所用的术语“tRNA”是指以其天然状态的天然存在的转移核糖核酸。
如本文所用的术语“基于tRNA的效应分子”或“TREM”是指包含来自以下(a)-(v)的结构或特性的RNA分子，并且其是重组TREM、合成的TREM，或从异源细胞表达的TREM。TREM可以具有(a)-(v)中的多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9个)结构和功能。
在一个实施例中，TREM包含反密码子，并且可以接受氨基酸并介导该氨基酸掺入多肽链，例如天然存在的tRNA或本文所述的tRNA中。
在一个实施例中，TREM是非天然的，如通过其结构或制备方式所评价的。
在一个实施例中，TREM包括以下结构或特性中的一个或多个：
(a)结合氨基酸的氨基酸附接结构域，例如，接纳茎结构域(AStD)，其中AStD包含足够的RNA序列来介导，例如当存在于在其他方面为野生型的tRNA中时，接受氨基酸，例如其同源氨基酸或非同源氨基酸，以及在多肽链的起始或延伸中氨基酸(AA)的转移。典型地，AStD包含3'-末端腺苷(CCA)，用于接纳茎负载，这是合成酶识别的一部分。在一个实施例中，AStD与天然存在的AStD(例如，由表2中的核酸编码的AStD)具有至少75％、80％、85％、85％、90％、95％或100％同一性。在一个实施例中，TREM可以包含AStD(例如，由表2中的核酸编码的AStD)的片段或类似物，该片段在实施例中具有AStD活性而在其他实施例中不具有AStD活性。(普通技术人员可以从表2中的核酸编码的序列确定本文提及的任何结构域、茎、环或其他序列特征的相关对应序列。例如，普通技术人员可以从表2中的核酸编码的tRNA序列中确定对应于AStD的序列)；
(b)二氢尿苷发夹结构域(DHD)，其中DHD包含足够的RNA序列来介导，例如，当存在于在其他方面为野生型的tRNA中时，识别氨酰基-tRNA合成酶，例如充当氨酰基-tRNA合成酶的识别位点，用于TREM的氨基酸负载。在实施例中，DHD介导TREM三级结构的稳定化。在一个实施例中，DHD与天然存在的DHD(例如，由表2中的核酸编码的DHD)具有至少75％、80％、85％、85％、90％、95％或100％的同一性。在一个实施例中，TREM可以包含DHD(例如，由表2中的核酸编码的DHD)的片段或类似物，该片段在实施例中具有DHD活性而在其他实施例中不具有DHD活性；
(c)结合mRNA中相应密码子的反密码子，例如，反密码子发夹结构域(ACHD)，其中ACHD包含足够的序列，例如反密码子三联体，以介导例如当存在于在其他方面为野生型的tRNA中时，与密码子配对(有或没有摆动)；在一个实施例中，ACHD与天然存在的ACHD(例如，由表2中的核酸编码的ACHD)具有至少75％、80％、85％、85％、90％、95％或100％同一性。在一个实施例中，TREM可以包含ACHD(例如，由表2中的核酸编码的ACHD)的片段或类似物，该片段在实施例中具有ACHD活性而在其他实施例中不具有ACHD活性；
(d)可变环结构域(VLD)，其中VLD包含足够的RNA序列来介导，例如，当存在于在其他方面为野生型的tRNA中时，识别氨酰基-tRNA合成酶，例如充当氨酰基-tRNA合成酶的识别位点，用于TREM的氨基酸负载。在实施例中，VLD介导TREM三级结构的稳定化。在一个实施例中，VLD调节，例如增加TREM例如对于它的同源氨基酸的特异性，例如，VLD调节TREM的同源衔接子功能。在一个实施例中，VLD与天然存在的VLD(例如，由表2中的核酸编码的VLD)具有至少75％、80％、85％、85％、90％、95％或100％的同一性。在一个实施例中，TREM可以包含VLD(例如，由表2中的核酸编码的VLD)的片段或类似物，该片段在实施例中具有VLD活性而在其他实施例中不具有VLD活性；
(e)胸腺嘧啶发夹结构域(THD)，其中THD包含足够的RNA序列，以介导例如，当存在于在其他方面为野生型的tRNA中时，识别核糖体，例如充当核糖体的识别位点，在翻译过程中形成TREM-核糖体复合物。在一个实施例中，THD与天然存在的THD(例如，由表2中的核酸编码的THD)具有至少75％、80％、85％、85％、90％、95％或100％的同一性。在一个实施例中，TREM可以包含THD(例如，由表2中的核酸编码的THD)的片段或类似物，该片段在实施例中具有THD活性而在其他实施例中不具有THD活性；
(f)在生理条件下，它包含茎结构和一个或多个环结构，例如1、2或3个环。环可包含本文所述的结构域，例如，选自(a)-(e)的结构域。一个环可以包含一个或多个结构域。在一个实施例中，茎或环结构与天然存在的茎或环结构(例如，由表2中的核酸编码的茎或环结构)具有至少75％、80％、85％、85％、90％、95％或100％同一性。在一个实施例中，TREM可以包含茎或环结构(例如，由表2中的核酸编码的茎或环结构)的片段或类似物，该片段在实施例中具有茎或环结构的活性而在其他实施例中不具有茎或环结构的活性；
(g)三级结构，例如，L形三级结构；
(h)衔接子功能，即TREM介导氨基酸(例如，其同源氨基酸)的接受和AA在多肽链的起始或延伸中的转移；
(i)同源衔接子功能，其中TREM介导与TREM的反密码子天然相关的氨基酸(例如，同源氨基酸)的接受和掺入以启动或延长多肽链；
(j)非同源衔接子功能，其中在多肽链的起始或延长过程中，该TREM介导接受和掺入不是与该TREM的反密码子天然相关的氨基酸的氨基酸(例如非同源氨基酸)；
(k)调节性功能，例如，表观遗传功能(例如，基因沉默功能或信号传导路径调节功能)，细胞命运调节功能，mRNA稳定性调节功能，蛋白质稳定性调节功能，蛋白质转导调节功能，或蛋白质区室化功能；
(l)允许核糖体结合的结构；
(m)转录后修饰，例如，它包含来自表3的一个或多个修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个在表3中列出的修饰；
(n)抑制tRNA功能特性的能力，例如，tRNA具有的特性(h)-(k)中的任一个；
(o)调节细胞命运的能力；
(p)调节核糖体占用的能力；
(q)调节蛋白质翻译的能力；
(r)调节mRNA稳定性的能力；
(s)调节蛋白质折叠和结构的能力；
(t)调节蛋白质转导或区室化的能力；
(u)调节蛋白质稳定性的能力；
(v)调节信号传导路径的能力，例如，细胞信号传导路径；
(w)该反密码子不与终止密码子配对，例如，是与不是UAG、UAA或UGA的其他密码子配对的反密码子；或
(x)包含反密码子，并且可以接受氨基酸并介导该氨基酸掺入多肽链，例如天然存在的tRNA或本文所述的tRNA中。
在一个实施例中，TREM包含全长tRNA分子或其片段。
在一个实施例中，TREM包含以下特性：(a)-(e)。
在一个实施例中，TREM包含以下特性：(a)和(c)。
在一个实施例中，TREM包含以下特性：(a)、(c)和(h)。
在一个实施例中，TREM包含以下特性：(a)、(c)、(h)和(b)。
在一个实施例中，TREM包含以下特性：(a)、(c)、(h)和(e)。
在一个实施例中，TREM包含以下特性：(a)、(c)、(h)、(b)和(e)。
在一个实施例中，TREM包含以下特性：(a)、(c)、(h)、(b)、(e)和(g)。
在一个实施例中，TREM包含以下特性：(a)、(c)、(h)和(m)。
在一个实施例中，TREM包含以下特性：(a)、(c)、(h)、(m)和(g)。
在一个实施例中，TREM包含以下特性：(a)、(c)、(h)、(m)和(b)。
在一个实施例中，TREM包含以下特性：(a)、(c)、(h)、(m)和(e)。
在一个实施例中，TREM包含以下特性：(a)、(c)、(h)、(m)、(g)、(b)和(e)。
在一个实施例中，TREM包含以下特性：(a)、(c)、(h)、(m)、(g)、(b)、(e)和(q)。
在一个实施例中，TREM包含：
(i)结合氨基酸的氨基酸附接结构域(例如，如本文(a)中所述的AStD)；以及
(ii)结合mRNA中相应密码子的反密码子(例如，如本文(c)中所述的ACHD)。
在一个实施例中，TREM包含提供(i)至(ii)的共价连接的柔性RNA接头。
在一个实施例中，TREM介导蛋白质翻译。
在一个实施例中，TREM包含接头，例如，RNA接头，例如，柔性RNA接头，其提供第一和第二结构或结构域之间的共价连接。在一个实施例中，RNA接头包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核糖核苷酸。TREM可以包含一个或多个接头，例如，在实施例中，包含(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的TREM可以具有在第一和第二结构域之间的第一接头，以及在第三结构域和另一个结构域之间的第二接头。
在一个实施例中，TREM包含与由表2中所列的DNA序列编码的RNA序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或差异不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个核糖核苷酸的RNA序列，或者其片段或功能片段。在一个实施例中，TREM包含由表2中所列的DNA序列编码的RNA序列，或者其片段或功能片段。在一个实施例中，TREM包含由与表2中所列的DNA序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码的RNA序列，或者其片段或功能片段。在一个实施例中，TREM包含TREM结构域，例如本文所述的结构域，其与由表2中所列的DNA序列编码的RNA至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或差异不超过1、2、3、4、5、10或15个核糖核苷酸，或者其片段或功能片段。在一个实施例中，TREM包括TREM结构域，例如本文所述的结构域，其包含由表2中所列的DNA序列编码的RNA序列，或者其片段或功能片段。在一个实施例中，TREM包括TREM结构域，例如本文所述的结构域，其包含由与表2中所列的DNA序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码的RNA序列，或者其片段或功能片段。
在一个实施例中，TREM的长度为76-90个核苷酸。在实施例中，TREM或者其片段或功能片段是10-90个之间的核苷酸、10-80个之间的核苷酸、10-70个之间的核苷酸、10-60个之间的核苷酸、10-50个之间的核苷酸、10-40个之间的核苷酸、10-30个之间的核苷酸、10-20个之间的核苷酸、20-90个之间的核苷酸、20-80个之间的核苷酸、20-70个之间的核苷酸、20-60个之间的核苷酸、20-50个之间的核苷酸、20-40个之间的核苷酸、30-90个之间的核苷酸、30-80个之间的核苷酸、30-70个之间的核苷酸、30-60个之间的核苷酸或30-50个之间的核苷酸。
在一个实施例中，TREM被氨酰化，例如通过氨酰基tRNA合成酶负载氨基酸。
在一个实施例中，TREM不负载氨基酸，例如，无负载的TREM(uTREM)。
在一个实施例中，TREM包含小于全长的tRNA。在实施例中，TREM可以对应于tRNA的天然存在的片段，或对应于非天然存在的片段。示例性片段包括：TREM一半(例如，来自ACHD中的切割，例如，在反密码子序列中，例如，5'半或3'半)；5'片段(例如，包含5'末端的片段，例如来自DHD或ACHD中的切割)；3'片段(例如，包含3'末端的片段，例如来自THD中的切割)；或内部片段(例如，来自ACHD、DHD或THD中的一个或多个的切割)。
如本文所用的术语“包含TREM的组合物”是指包含本文所述的TREM的组合物。包含TREM的组合物可以包含一个种类或多个种类的TREM。在一个实施例中，组合物仅包含单一种类的TREM。在一个实施例中，组合物包含第一TREM种类和第二TREM种类。例如，在一个实施例中，第一种类和第二种类是同工受体但具有彼此不同的序列。在一个实施例中，组合物可以包含介导第一氨基酸例如丙氨酸的掺入的第一种类和介导第二氨基酸例如赖氨酸的掺入的第二种类。在一个实施例中，组合物包含X个TREM种类，其中X＝2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，TREM与表2中的核酸编码的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％，或具有100％同一性。在一个实施例中，TREM从细胞培养物中纯化。在一个实施例中，从中纯化TREM的细胞培养物包含至少1x107个宿主细胞、1x108个宿主细胞、1x109个宿主细胞，1x1010个宿主细胞，1x1011个宿主细胞，1x1012个宿主细胞，1x1013个宿主细胞，或1x1014个宿主细胞。在一个实施例中，包含TREM的组合物是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％干重TREM(对于液体组合物，干重是指去除基本上所有液体，例如冻干后)。在一个实施例中，组合物是液体。在一个实施例中，组合物是干燥的，例如冻干的物质。在一个实施例中，组合物是冷冻的组合物。在一个实施例中，组合物无菌，例如，例如，在无菌条件下测试时，该组合物支持少于100个活微生物的生长，该组合物符合USP<71>的标准，和/或该组合物符合USP<85>的标准。在一个实施例中，组合物包含至少0.5g、1.0g、50g、10g、15g、25g、50g、100g、200g、400g或500g(例如，由干重确定)TREM。
如本文所用的术语“tRNA池”指所有种类的池，例如内源tRNA和可以用作tRNA的TREMS。未施用TREM的细胞或受试者的内源tRNA池仅包括内源tRNA。可以添加TREM以调节仅包含内源tRNA的tRNA池，但也可以将其施用于具有tRNA池的细胞或受试者，该tRNA池包括先前施用的TREM。在一个实施例中，施用于细胞或受试者的TREM通过掺入与特定反密码子天然相关的氨基酸(同源氨基酸)介导起始或延伸。在一个实施例中，施用的TREM具有不是终止密码子的反密码子。
如本文所用，“肿瘤抑制因子”是指调节一种或多种细胞过程的基因，所述过程包括：细胞命运决定、细胞存活和基因组维持。在一个实施例中，肿瘤抑制因子向其失调(例如遗传上失调(例如，突变或缺失)或表观遗传失调)的细胞提供选择性生长优势。示例性的肿瘤抑制因子包括p53或Rb。
如本文所用的术语“配对”是指密码子与反密码子的对应关系，并且包括完全互补的密码子:反密码子对以及“摆动”配对，其中第三位置不必是互补的。完全互补配对是指根据Watson-Crick碱基配对，密码子的所有三个位置均与相应反密码子配对。摆动配对是指根据Watson-Crick碱基配对，密码子的第一和第二位置与相应反密码子互补配对，并且密码子的第三位置与相应的反密码子灵活配对。
除非在本披露中明确提供，否则术语修饰、置换、衍生和类似术语在用于或应用于产物时，仅指最终产物或最终产物的结构，并且不受任何制造或制备产物的方法限制。
包括标题、小标题、副标题、编号或其他字母/数字层次结构仅为了便于阅读，并且未明确相反地指示性能顺序、重要性顺序、大小或其他值。
同义SNP和调节tRNA池的方法
单核苷酸多态性(SNP)是一种在基因组中发现的突变。SNP可以出现在基因组的任何地方，例如，在编码序列(例如，外显子)中，或在调节区(例如，在内含子、启动子元件、增强子中)，或在非编码序列中。
出现在编码序列例如外显子中的SNP可以通过改变密码子以指定不同的氨基酸，例如与非突变密码子指定的氨基酸相比不同的氨基酸来影响相应多肽。
出现在改变密码子但不改变所述突变密码子指定的氨基酸的编码序列中的SNP不会改变在该位置处并入相应多肽中的氨基酸。这可能是由于遗传密码子的简并性(即超过一种密码子指定一种氨基酸)。tRNA反密码子第一个碱基处的“摆动”碱基配对支持密码子简并性。例如，如果指定氨基酸亮氨酸的野生型CTT密码子突变为指定相同氨基酸亮氨酸的CTC密码子，则预期相应蛋白质在该特定位置处的组成不会变化。密码子CTT和CTC均由指定氨基酸亮氨酸的tRNA识别。这些不同种类的tRNA被称为同工受体tRNA。
改变密码子但不改变由突变密码子指定的相应氨基酸的突变称为同义SNP。同义SNP也称为沉默SNP。
在人群中发现的同义SNP与某些疾病有关。由于预期同义SNP不会改变多肽链的组成，因此在不希望受理论束缚的情况下，相信同义SNP的作用与密码子使用的偏倚有关。例如，同义SNP可能导致蛋白质翻译减少、蛋白质折叠改变、蛋白质定位改变或蛋白质功能改变。目前正在研究密码子使用和tRNA丰度之间的关系。
在一个实施例中，细胞中tRNA的量与密码子使用相关。在一个实施例中，与高度使用的密码子配对的tRNA比与不高度使用的密码子配对的tRNA丰度高。在一个实施例中，与不高度使用的密码子配对的tRNA的丰度低于与高度使用的密码子配对的tRNA。
如本文所定义，细胞中的tRNA池是所有种类的tRNA池，例如内源tRNA和可以用作tRNA的TREMS。未施用TREM的细胞或受试者的内源tRNA池仅包括内源tRNA。施用TREM的细胞或受试者的tRNA池包括内源tRNA和TREM。
在不希望受理论束缚的情况下，相信细胞或受试者中的tRNA池可以通过向细胞或受试者施用包含TREM的组合物而改变。在一个实施例中，施用包含TREM的组合物的细胞或受试者中的tRNA池包含内源tRNA和施用的TREM。
在一个实施例中，具有同义SNP的受试者或细胞具有与SNP密码子配对的tRNA的丰度较低的tRNA池。在一个实施例中，向受试者或细胞施用与SNP密码子配对的TREM增加了受试者或细胞中同工接受tRNA池的量，例如增加可与SNP密码子配对的氨基酸指定分子的量。
表1提供了示例性同义SNP。标题为“密码子从/到”的栏描述了特定转录本的野生型密码子和突变密码子。在一个实施例中，本文披露的治疗方法、调节tRNA池的方法或评价方法中描述的细胞或受试者具有表1中提供的SNP。在一个实施例中，本文披露的治疗方法、调节tRNA池的方法或评价方法中描述的细胞或受试者患有表1所列的疾病。在一个实施例中，本文披露的治疗方法、调节tRNA池的方法或评价方法中描述的细胞或受试者具有表1所列的SNP和相应疾病。
宿主细胞
宿主细胞是可用于表达和/或纯化TREM的细胞(例如，培养的细胞)。在一个实施例中，宿主细胞包含哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。在一个实施例中，宿主细胞包含哺乳动物细胞，例如人细胞，或啮齿动物细胞。在一个实施例中，宿主细胞包含HeLa细胞、HEK293T细胞(例如，Freestyle 293-F细胞)、HT-1080细胞、PER.C6细胞、HKB-11细胞、CAP细胞、HuH-7细胞、BHK 21细胞、MRC-S细胞、MDCK细胞、VERO细胞、WI-38细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施例中，宿主细胞包含癌细胞，例如，实体瘤细胞(例如乳腺癌细胞(例如MCF7细胞)、胰腺细胞系(例如MIA PaCa-2细胞)、肺癌细胞、或前列腺癌细胞或血液癌细胞)。在一个实施例中，宿主细胞是原代细胞，例如尚未永生化的细胞或具有有限增殖能力的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是来源于受试者，例如患者的细胞。
在一个实施例中，宿主细胞包含非哺乳动物细胞，例如细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞。在一个实施例中，宿主细胞包含细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。在一个实施例中，宿主细胞包含酵母细胞，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞。在一个实施例中，宿主细胞包含昆虫细胞，例如Sf-9细胞或Hi5细胞。
在一个实施例中，宿主细胞包含表达一种或多种组织特异性tRNA的细胞。例如，宿主细胞可以包含源自与tRNA(例如组织特异性tRNA)表达相关的组织的细胞。在一个实施例中，表达组织特异性tRNA的宿主细胞经修饰以表达TREM或其片段。
在一个实施例中，宿主细胞是可以在允许表达TREM的条件下维持的细胞。
在一个实施例中，宿主细胞能够转录后修饰TREM，例如，添加从表3中选择的转录后修饰。在一个实施例中，宿主细胞表达(例如，天然或异源地)表3中列出的酶。在一个实施例中，宿主细胞表达(例如，天然或异源地)酶，例如，具有核酸酶活性的酶(例如，内切核酸酶活性或核糖核酸酶活性)，例如或切丁酶、血管生成素、RNA酶A、RNA酶P、RNA酶Z、Rny1或PrrC中的一种或多种。
培养宿主细胞的方法
宿主细胞可以在促进生长(例如宿主细胞的增殖或过度增殖)的培养基中培养。宿主细胞可以在合适的培养基中培养，例如，以下培养基中的任一种：DMEM、MEM、MEMα、RPMI、F-10培养基、F-12培养基、DMEM/F-12培养基、IMDM、培养基199、Leibovitz L-15、McCoys's5A、MDCB培养基或CMRL培养基。在一个实施例中，培养基补充有谷氨酰胺。在一个实施例中，培养基不补充谷氨酰胺。在一个实施例中，宿主细胞在具有过量营养物例如不是营养限制的培养基中培养。
宿主细胞可以在包含或补充以下的培养基中培养：生长因子、细胞因子或激素的一种或组合，例如，血清(例如胎牛血清(FBS))、HEPES、纤维母细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子β(TGFb)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)或肿瘤坏死因子(TNF)中的一种或组合。
宿主细胞，例如非哺乳动物宿主细胞，可以在以下任何培养基中培养：LuriaBroth、YPD培养基或Grace培养基。
宿主细胞也可以在诱导应激的条件下培养，例如，细胞应激、渗透应激、转化应激或致癌应激。在一个实施例中，表达TREM的宿主细胞在诱导应激(例如，如本文所述)的条件下培养产生TREM的片段，例如，如本文所述。
宿主细胞可以在营养限制条件下培养，例如，宿主细胞在具有有限量的一种或多种营养物的培养基中培养。可以限制的营养物的实例是氨基酸、脂质、碳水化合物、激素、生长因子或维生素。在一个实施例中，表达TREM的宿主细胞在具有限制量的一种或多种营养物的培养基中培养，例如培养基营养物不足，导致TREM的片段，例如，如本文所述。在一个实施例中，表达TREM的宿主细胞在具有限制量的一种或多种营养物的培养基中培养，例如培养基营养物不足，导致无负载的TREM(例如uTREM)。
宿主细胞可以包括永生化细胞，例如，表达一种或多种参与永生化的酶(例如TERT)的细胞。在一个实施例中，宿主细胞可以无限繁殖。
宿主细胞可以悬浮培养或作为单层培养。宿主细胞培养可以在细胞培养容器或生物反应器中进行。细胞培养容器包括细胞培养皿、板或烧瓶。示例性细胞培养容器包括35mm、60mm、100mm或150mm培养皿、多孔板(例如6孔、12孔、24孔、48孔或96孔板)，或T-25、T-75或T-160烧瓶。
在一个实施例中，宿主细胞可以在生物反应器中培养。生物反应器可以是，例如连续流式分批生物反应器、灌注生物反应器、分批工艺生物反应器或补料分批生物反应器。生物反应器可以维持在足以表达TREM的条件下。可以调节培养条件以优化TREM的产率、纯度或结构。在一个实施例中，生物反应器包含至少1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013或1x1014个宿主细胞。在一个实施例中，生物反应器包含1x107至1x1014个之间的宿主细胞；1x107至0.5x1014个之间的宿主细胞；1x107至1x1013个之间的宿主细胞；1x107至0.5x1013个之间的宿主细胞；1x107至1x1012个之间的宿主细胞；1x107至0.5x1012个之间的宿主细胞；1x107至1x1011个之间的宿主细胞；1x107至0.5x1011个之间的宿主细胞；1x107至1x1010个之间的宿主细胞；1x107至0.5x1010个之间的宿主细胞；1x107至1x109个之间的宿主细胞；1x107至0.5x109个之间的宿主细胞；1x107至1x108个之间的宿主细胞；1x107至0.5x108个之间的宿主细胞；0.5x108至1x1014个之间的宿主细胞；1x108至1x1014个之间的宿主细胞；0.5x109至1x1014个之间的宿主细胞；1x109至1x1014个之间的宿主细胞；0.5x1010至1x1014个之间的宿主细胞；1x1010至1x1014个之间的宿主细胞；0.5x1011至1x1014个之间的宿主细胞；1x1011至1x1014个之间的宿主细胞；0.5x1012至1x1014个之间的宿主细胞；1x1012至1x1014个之间的宿主细胞；0.5x1013至1x1014个之间的宿主细胞；1x1013至1x1014个之间的宿主细胞；或0.5x1013至1x1014个宿主细胞。
在一个实施例中，生物反应器包含至少1x105个宿主细胞/mL、2x105个宿主细胞/mL、3x105个宿主细胞/mL、4x105个宿主细胞/mL、5x105个宿主细胞/mL、6x105个宿主细胞/mL、7x105个宿主细胞/mL、8x105个宿主细胞/mL、9x105个宿主细胞/mL、1x106个宿主细胞/mL、2x106个宿主细胞/mL、3x106个宿主细胞/mL、4x106个宿主细胞/mL、5x106个宿主细胞/mL、6x106个宿主细胞/mL、7x106个宿主细胞/mL、8x106个宿主细胞/mL、9x106个宿主细胞/mL、1x107个宿主细胞/mL、2x107个宿主细胞/mL、3x107个宿主细胞/mL、4x107个宿主细胞/mL、5x107个宿主细胞/mL、6x107个宿主细胞/mL、7x107个宿主细胞/mL、8x107个宿主细胞/mL、9x107个宿主细胞/mL、1x108个宿主细胞/mL、2x108个宿主细胞/mL、3x108个宿主细胞/mL、4x108个宿主细胞/mL、5x108个宿主细胞/mL、6x108个宿主细胞/mL、7x108个宿主细胞/mL、8x108个宿主细胞/mL、9x108个宿主细胞/mL、或1x109个宿主细胞/mL。在一个实施例中，生物反应器包含1x105个宿主细胞/mL至1x109个宿主细胞/mL、5x105个宿主细胞/mL至1x109个宿主细胞/mL、1x106个宿主细胞/mL至1x109个宿主细胞/mL；5x106个宿主细胞/mL至1x109个宿主细胞/mL、1x107个宿主细胞/mL至1x109个宿主细胞/mL、5x107个宿主细胞/mL至1x109个宿主细胞/mL、1x108个宿主细胞/mL至1x109个宿主细胞/mL、5x108个宿主细胞/mL至1x109个宿主细胞/mL、1x105个宿主细胞/mL至5x108个宿主细胞/mL、1x105个宿主细胞/mL至1x108个宿主细胞/mL、1x105个宿主细胞/mL至5x107个宿主细胞/mL、1x105个宿主细胞/mL至1x107个宿主细胞/mL、1x105个宿主细胞/mL至5x106个宿主细胞/mL、1x105个宿主细胞/mL至1x106个宿主细胞/mL、或1x105个宿主细胞/mL至5x105个宿主细胞/mL。
在一个实施例中，分批工艺生物反应器包含1x106至1x107个宿主细胞/ml。
在一个实施例中，具有100mL体积的分批工艺生物反应器包含1x108至1x109个宿主细胞。
在一个实施例中，具有100L体积的分批工艺生物反应器包含1x1011至1x1012个宿主细胞。
在一个实施例中，分批补料生物反应器包含1x107至3x107个宿主细胞/ml。
在一个实施例中，具有100mL体积的分批补料生物反应器包含1x109至3x109个宿主细胞。
在一个实施例中，具有100L体积的分批补料生物反应器包含1x1012至3x1012个宿主细胞。
在一个实施例中，灌注生物反应器包含1x108个宿主细胞/ml。
在一个实施例中，具有100mL体积的灌注生物反应器包含1x1010个宿主细胞。
在一个实施例中，具有100L体积的灌注生物反应器包含1x1013个宿主细胞。
在一个实施例中，生物反应器维持在促进宿主细胞生长的条件下，例如，在允许宿主细胞生长的温度(例如37℃)和气体浓度(例如5％CO2)下。
例如，在一些方面，生物反应器单元可执行以下一项或多项或全部：营养物和/或碳源的供给，合适的气体(例如，氧气)的注入，发酵或细胞培养基的入口和出口流动，气相和液相的分离，温度的维持，氧气和CO2水平的维持、pH水平的维持、搅拌(例如搅动)和/或清洁/消毒。示例性的生物反应器单元，可以在单元内包含多个反应器，例如所述单元可以在每个单元中具有1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个或更多个生物反应器和/或设施可包含在设施内具有单个或多个反应器的多个单元。可以使用任何合适的生物反应器直径。
在一个实施例中，生物反应器的体积可以是约100mL至约100L。非限制性实例包括100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升的体积。此外，合适的反应器可以是多次使用的、单次使用的、一次性的或非一次性的，并且可以由任何合适的材料形成，包括金属合金，诸如不锈钢(例如316L或任何其他合适的不锈钢)和铬镍铁合金、塑料和/或玻璃。在一些实施例中，合适的反应器可以是圆形的，例如，圆柱形。在一些实施例中，合适的反应器可以是方形的，例如，矩形。在一些情况下，方形反应器可提供优于圆形反应器的益处，诸如易于使用(例如，由技术人员装载和设置)、反应器内容物的更好混合和均匀性以及更低的占地面积。
修饰宿主细胞的方法
可以修饰宿主细胞以优化TREM的生产，例如，以具有优化的TREM产率、纯度、结构(例如折叠)或稳定性。在一个实施例中，宿主细胞可以经修饰(例如，使用本文所述的方法)，以增加或减少所期望分子(例如，优化TREM生产(例如，优化TREM的产率、纯度、结构或稳定性)的基因)的表达。在一个实施例中，宿主细胞可以经表观遗传修饰，例如，使用本文所述的方法，以增加或减少所期望基因(其优化生产)的表达。
在一个实施例中，宿主细胞可以经修饰以增加或减少癌基因(例如，如本文所述)、肿瘤抑制因子(例如，如本文所述)或参与tRNA或TREM调节的分子(例如，参与tRNA或TREM转录、加工、修饰、稳定性或折叠的基因)的表达。示例性癌基因包括Myc(例如c-Myc、N-Myc或L-Myc)、c-Jun、Wnt或RAS。示例性的肿瘤抑制因子包括p53或Rb。参与tRNA或TREM调节的示例性分子包括：RNA聚合酶III(Pol III)和Pol III辅助分子(例如TFIIIB)；Maf1、Trm1、Mck1或Kns1；参与tRNA或TREM修饰的酶，例如表3所列基因；或具有核酸酶活性的分子，例如或切丁酶、血管生成素、RNA酶A、RNA酶P、RNA酶Z、Rny1或PrrC中的一种或多种。
在一个实施例中，宿主细胞可以通过以下修饰：转染(例如，瞬时转染或稳定转染)；转导(例如，病毒转导，例如，慢病毒，腺病毒或逆转录病毒转导)；电穿孔；基于脂质的药剂递送(例如，脂质体)，基于纳米颗粒的药剂递送；或本领域已知的其他方法。
在一个实施例中，可以修饰宿主细胞以增加以下的表达，例如过表达：所期望的分子，例如，基因(例如，癌基因，或参与tRNA或TREM调节的基因(例如，编码表3中列出的酶的基因，或编码具有核酸酶活性(例如内切核酸酶活性或核糖核酸酶活性)的酶的基因，例如，或切丁酶、血管生成素、RNA酶A、RNA酶P、RNA酶Z、Rny1或PrrC中的一种或多种。增加基因表达的示例性方法包括：(a)使宿主细胞与编码基因的核酸(例如DNA或RNA)接触；(b)使宿主细胞与表达靶蛋白的肽接触；(c)将宿主细胞与调节，例如增加靶基因的表达的分子(例如小RNA(例如微小RNA或小干扰RNA)或低分子量化合物)接触；或(d)将宿主细胞与基因编辑部分(例如锌指核酸酶(ZFN)或Cas9/CRISPR分子)接触，所述基因编辑部分抑制(例如突变或敲除)靶基因负调节因子的表达。在一个实施例中，可以通过转染或电穿孔将编码基因的核酸或含有编码基因的核酸的质粒引入宿主细胞。在一个实施例中，可以通过将宿主细胞与表达基因的病毒(例如慢病毒、腺病毒或逆转录病毒)接触，将编码基因的核酸引入宿主细胞。
在一个实施例中，可以修饰宿主细胞以减少所期望的分子的表达，例如最小化所期望的分子的表达，所述所期望的分子是例如基因(例如，肿瘤抑制基因，或参与tRNA或TREM调节的基因)。减少基因表达的示例性方法包括：(a)使宿主细胞与编码基因抑制剂(例如，基因或由该基因编码的蛋白质的显性阴性变体或负调控因子)的核酸(例如DNA或RNA)接触；(b)使宿主细胞与抑制靶蛋白的肽接触；(c)将宿主细胞与调节，例如抑制靶基因的表达的分子(例如小RNA(例如微小RNA或小干扰RNA)或低分子量化合物)接触；或(d)将宿主细胞与基因编辑部分(例如锌指核酸酶(ZFN)或Cas9/CRISPR分子)接触，所述基因编辑部分抑制(例如突变或敲除)靶基因的表达。在一个实施例中，可以通过转染或电穿孔将编码基因抑制剂的核酸或含有编码基因抑制剂的核酸的质粒引入宿主细胞。在一个实施例中，可以通过将宿主细胞与表达基因抑制剂的病毒(例如慢病毒、腺病毒或逆转录病毒)接触，将编码基因抑制剂的核酸引入宿主细胞。
在一个实施例中，宿主细胞(例如，本文所述的宿主细胞)经修饰(例如，通过用核酸转染)，以表达，例如过表达癌基因，例如本文所述的癌基因，例如c-Myc。
在一个实施例中，宿主细胞(例如，本文所述的宿主细胞)经修饰(例如，通过用核酸转染)，以抑制，例如下调，肿瘤抑制因子的表达，例如本文所述的肿瘤抑制因子，例如p53或Rb。
在一个实施例中，宿主细胞(例如HEK293T细胞)经修饰(例如，使用CRISPR/Cas9分子)以抑制，例如敲除调节tRNA或TREM的基因(例如，Maf1)的表达。在一个实施例中，宿主细胞(例如HEK293T细胞)经修饰以过表达调节tRNA或TREM的基因，例如，Trm1。
在一个实施例中，宿主细胞(例如HEK293T细胞)经修饰以过表达调节tRNA或TREM的基因(例如，Trm1)以及以过表达癌基因(例如，本文所述的癌基因，例如，c-Myc)。
TREM
“基于tRNA的效应分子”或“TREM”是指包含一种或多种本文所述特性的RNA分子。TREM可以负载氨基酸，例如，同源氨基酸；负载非同源氨基酸(例如，错误负载的TREM(mTREM)；或不负载氨基酸，例如，未负载的TREM(uTREM)。
在一个实施例中，TREM包含由表2中披露的脱氧核糖核酸(DNA)序列(例如，表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)编码的核糖核酸(RNA)序列。在一个实施例中，TREM包含与由表2中披露的DNA序列(例如，表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)编码的RNA序列至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列。在一个实施例中，TREM包含由与表2中提供的DNA序列(例如，表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码的RNA序列。
在一个实施例中，TREM包含由表2中披露的DNA序列编码的RNA序列的至少30个连续核苷酸，例如，由表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个编码的RNA序列的至少30个连续核苷酸。在一个实施例中，TREM包含与由表2中披露的DNA序列(例如，表2中披露的SEQ IDNO:1-451中的任一个)编码的RNA序列至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列的至少30个连续核苷酸。在一个实施例中，TREM包含由与表2中提供的DNA序列(例如，表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码的RNA序列的至少30个连续核苷酸。
在一个实施例中，TREM，例如外源TREM，包含以下特性中的1、2、3或4种：
(a)与参考细胞中最接近的序列tRNA差异至少有一个核苷酸或一个转录后修饰，所述参考细胞是例如外源核酸被引入的细胞；
(b)已被引入不是转录其的细胞的细胞；
(c)存在于不是其自然发生的细胞的细胞中；或
(d)具有非野生型的表达谱，例如水平或分布，例如，它的表达水平高于野生型。
在一个实施例中，表达谱可以通过将变化引入调节表达的核酸或通过添加调节RNA分子表达的药剂来介导。
在一个实施例中，TREM，例如，外源TREM包含(a)、(b)、(c)和(d)。
在一个实施例中，TREM，例如，外源TREM包含(a)、(b)和(c)。
在一个实施例中，TREM，例如，外源TREM包含(a)、(b)和(d)。
在一个实施例中，TREM，例如，外源TREM包含(a)、(c)和(d)。
在一个实施例中，TREM，例如，外源TREM包含(b)、(c)和(d)。
在一个实施例中，TREM，例如，外源TREM包含(a)和(d)。
在一个实施例中，TREM，例如，外源TREM包含(c)和(d)。
TREM片段
在一个实施例中，TREM包含片段(本文有时称为TREM片段)，例如，由表2中披露的脱氧核糖核酸序列编码的RNA的片段。例如，TREM包括少于来自与接受治疗的受试者相同的物种的tRNA的完整序列，例如，少于具有相同反密码子的tRNA的完整序列，或两者。在一个实施例中，例如来自全长TREM或更长的片段的TREM片段的产生可以被酶催化，例如，具有核酸酶活性的酶(例如，内切核酸酶活性或核糖核酸酶活性)，例如切丁酶、血管生成素、RNA酶P、RNA酶Z、Rny1或PrrC。
在一个实施例中，TREM片段可以在体内、离体或体外产生。在一个实施例中，TREM片段在宿主细胞中在体内产生。在一个实施例中，TREM片段离体产生。在一个实施例中，TREM片段在体外产生，例如，如实例12中所述。在一个实施例中，通过在该细胞产生TREM后将表达的该TREM片段化来产生该TREM片段，例如，该宿主细胞产生的TREM在从该宿主细胞释放或纯化后被片段化，例如，将该TREM离体或在体外片段化。
示例性的TREM片段包括TREM一半(例如，来自ACHD中的切割，例如，5'TREM一半或3'TREM一半)，5'片段(例如，包含5'末端的片段，例如，来自DHD或ACHD中的切割)，3'片段(例如，包含TREM的3'末端的片段，例如，来自THD中的切割)，或内部片段(例如，来自ACHD、DHD或THD中的一个或多个的切割)。
在一个实施例中，TREM片段包含由表2中提供的DNA序列(例如，表2中披露的SEQID NO:1-451中的任一个)编码的RNA序列的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施例中，TREM片段包含与由表2中提供的DNA序列(例如，表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)编码的RNA序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的RNA序列的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施例中，TREM片段包含由与表2中提供的DNA序列(例如，表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的DNA序列编码的RNA序列的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一个实施例中，TREM片段包含由表2中披露的DNA序列(例如，表2中披露的SEQID NO:1-451中的任一个)编码的RNA序列的至少5个核糖核苷酸(nt)、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt或60nt(但小于全长)。在一个实施例中，TREM片段包含与由表2中提供的DNA序列(例如，表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)编码的RNA序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的RNA序列的至少5个核糖核苷酸(nt)、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt或60nt(但小于全长)。在一个实施例中，TREM片段包含由与表2中提供的DNA序列(例如，表2中披露的SEQID NO:1-451中的任一个)具有至少80％、82％、85％、87％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的DNA序列编码的RNA序列的至少5个核糖核苷酸(nt)、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt或60nt(但小于全长)。
在一个实施例中，TREM片段包含长度10-90个核糖核苷酸(rnt)、10-80rnt、10-70rnt、10-60rnt、10-50rnt、10-40rnt、10-30rnt、10-20rnt、20-90rnt、20-80rnt,20-70rnt、20-60rnt、20-50rnt、20-40rnt、30-90rnt、30-80rnt、30-70rnt、30-60rnt或30-50rnt的序列。
在一个实施例中，TREM片段包含TREM结构、结构域或活性，例如，如上文所述。在一个实施例中，TREM片段包含衔接子功能，例如，如本文所述。在一个实施例中，TREM片段包含同源衔接子功能，例如，如本文所述。在一个实施例中，TREM片段包含非同源衔接子功能，例如，如本文所述。在一个实施例中，TREM片段包含调节性功能，例如，如本文所述。
在一个实施例中，TREM片段包含翻译抑制功能，例如，起始因子例如eIF4G的位移。
在一个实施例中，TREM片段包含表观遗传功能，例如，障碍，例如代谢障碍的表观遗传。在一些实施例中，表观遗传功能可具有世代影响，例如，与体细胞表观遗传调节相比。
在一个实施例中，TREM片段包含逆转录病毒调节功能，例如，逆转录病毒逆转录的调节，例如HERV调节。
在一个实施例中，TREM片段包含基因沉默功能，例如，通过结合到AGO和/或PIWI。
在一个实施例中，TREM片段包含神经保护功能，例如通过螯合翻译起始因子，例如在应激颗粒中，以促进例如细胞应激下的运动神经元存活。
在一个实施例中，TREM片段包含抗癌功能，例如，通过结合和/或螯合例如转移性转录物稳定蛋白来防止癌症进展。
在一个实施例中，TREM片段包含细胞存活功能，例如，通过与例如细胞色素c和/或cyt c核糖核蛋白复合物结合来增加细胞存活。
在一个实施例中，TREM片段包含核糖体生物发生功能，例如，TREM片段可以通过例如调节编码核糖体蛋白的mRNA或结合至编码核糖体蛋白的mRNA来调节核糖体生物发生。
TREM修饰
本文所述的TREM可包含部分，通常在本文中称为修饰，例如，表3中描述的部分。虽然本文使用的术语修饰通常不应被解释为任何特定过程的产物，但在实施例中，修饰的形成可由表3中的酶介导。在实施例中，修饰是转录后形成。在实施例中，修饰是共转录形成。在一个实施例中，修饰发生在体内，例如，在宿主细胞中。
在一个实施例中，修饰是在表3的第1-62行中的任一个中列出的修饰。在一个实施例中，修饰是表3第1-62行中的任一个中列出的修饰，并且修饰的形成由表3中的酶介导。在一个实施例中，修饰选自表3中的行并且修饰的形成由来自表3中相同行的酶介导。
表3：tRNA修饰和相关酶的列表。
TREM融合
在一个实施例中，本文披露的TREM包含另一部分，例如，融合部分。在一个实施例中，融合部分可用于纯化以改变TREM的折叠或用作靶向部分。在一个实施例中，融合部分可以包含标签、接头，可以是可切割的或可以包括酶的结合位点。在一个实施例中，融合部分可以位于TREM的N末端或TREM的C末端。在一个实施例中，融合部分可由编码TREM的相同或不同核酸分子编码。
制备TREM的方法
可以根据本领域已知的任何方法制备TREM。例如，可以使用合成方法制备TREM，例如，使用固态合成或液相合成来合成。作为另一个实例，可以使用体外转录(IVT)方法制备TREM。作为另一个实例，可以通过在细胞中表达编码TREM的载体来制备TREM。
用于合成寡核苷酸的体外方法是本领域已知的，并且可以用于制备本文披露的TREM。例如，实例27中披露了一种制备TREM的化学合成方法。实例28中披露了用于制备TREM的体外转录方法的一个实例。
用于通过5'-甲硅烷基-2'-原酸酯(2'-ACE)化学法制备合成寡核苷酸的其他方法披露于Hartsel SA等人,(2005)Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成],033-050中，该文献的全部内容在此通过引用并入，并且可以用于制备本文披露的TREM。
用于设计和构建表达载体和修饰用来产生目标(例如本文披露的TREM或酶)的宿主细胞的方法使用本领域已知的技术。例如，使用培养的哺乳动物细胞(例如，培养的人细胞)、昆虫细胞、酵母、细菌或其他细胞在适当启动子控制下对细胞进行遗传修饰以表达外源TREM。通常，可以使用重组方法。通常参见Pharmaceutical Biotechnology:Fundamentals and Applications[药物生物技术：基础与应用],Springer[斯普林格出版社](2013)；Green和Sambrook(编),Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第四版),Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](2012)。例如，哺乳动物表达载体可包含非转录元件，诸如复制起点、合适的启动子和增强子，以及其他5'或3'侧翼非转录序列。源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传元件。
在一个实施例中，制备本文披露的TREM或包含TREM的组合物的方法包括使用表达TREM的宿主细胞，例如，经修饰的宿主细胞。
在允许表达TREM的条件下培养经修饰的宿主细胞。在一个实施例中，可以调节培养条件以增加TREM的表达。制备TREM的方法进一步包括从宿主细胞培养物纯化表达的TREM以产生包含TREM的组合物。在一个实施例中，TREM是TREM片段，例如，由表2中披露的脱氧核糖核酸序列编码的tRNA片段。例如，TREM包括少于来自与接受治疗的受试者相同的物种的tRNA的完整序列，例如，少于具有相同反密码子的tRNA的完整序列，或两者。在一个实施例中，例如来自全长TREM或更长的片段的TREM片段的产生可以被酶催化，例如，具有核酸酶活性的酶(例如，内切核酸酶活性或核糖核酸酶活性)，例如RNA酶A、切丁酶、血管生成素、RNA酶P、RNA酶Z、Rny1或PrrC。
在一个实施例中，制备本文所述的TREM的方法包括使宿主细胞(例如，如本文所述，例如，经修饰的宿主细胞)与本文所述的编码TREM的外源核酸(例如，DNA或RNA)在足以表达TREM的条件下接触(例如，转导或转染)。在一个实施例中，外源核酸包含含有由表2中披露的DNA序列编码的RNA的核糖核酸(RNA)序列的RNA(或编码RNA的DNA)。在一个实施例中，外源核酸包含与表2中提供的DNA序列编码的RNA序列至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的RNA序列(或编码RNA序列的DNA)。在一个实施例中，外源核酸包含含有由表2中披露的脱氧核糖核酸(DNA)序列编码的核糖核酸(RNA)序列的至少30个连续核苷酸的RNA序列(或编码RNA序列的DNA)。在一个实施例中，外源核酸包含含有与表2中提供的DNA序列编码的RNA序列至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的RNA序列的至少30个连续核苷酸的RNA序列(或编码RNA序列的DNA)。
在一个实施例中，宿主细胞用表达TREM的病毒(例如慢病毒、腺病毒或逆转录病毒)转导，如实例8中所述。
可以从宿主细胞或宿主细胞培养物纯化表达的TREM以产生包含TREM的组合物，例如，如本文所述。TREM的纯化可以通过亲和纯化进行，例如，如特定tRNA分子的MACS分离方案中所述，或本领域已知的其他方法。在一个实施例中，TREM通过实例7中描述的方法纯化。
在一个实施例中，制备TREM，例如包含TREM的组合物的方法包括使TREM与试剂，例如包含与TREM互补的核酸序列的捕获试剂接触。单一捕获试剂或多种捕获试剂可以用于制备TREM，例如包含TREM的组合物。当使用单一捕获试剂时，捕获试剂可与TREM具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的互补序列。当使用多个捕获试剂时，可以制备具有多个不同TREM的TREM组合物。在一个实施例中，捕获试剂可以与药剂，例如生物素缀合。
在一个实施例中，方法包括使TREM变性，例如，在与捕获试剂杂交之前。在一个实施例中，方法包括在杂交和/或从捕获试剂释放之后复性TREM。
在一个实施例中，制备TREM，例如包含TREM的组合物的方法包括使TREM与试剂，例如分离试剂，例如色谱试剂接触。在一个实施例中，色谱试剂包括柱色谱试剂、平面色谱试剂、置换色谱试剂、气相色谱试剂、液相色谱试剂、亲和色谱试剂、离子交换色谱试剂或尺寸排阻剂色谱试剂。
在一个实施例中，通过本文所述的任何方法制备的TREM可以：(i)负载氨基酸，例如，同源氨基酸；(ii)负载非同源氨基酸(例如，错误负载的TREM(mTREM)；或(iii)未负载氨基酸，例如，未负载的TREM(uTREM)。
在一个实施例中，通过本文所述的任何方法制备的TREM是未负载的TREM(uTREM)。在一个实施例中，制备uTREM的方法包括在具有限制量的一种或多种营养物(例如培养基营养物不足)的培养基中培养宿主细胞。
在一个实施例中，负载的TREM，例如负载同源AA或非同源AA的TREM，可以是未负载的，例如通过解离AA，例如通过在高温下孵育TREM。
编码TREM或TREM片段的外源核酸
在一个实施例中，外源核酸，例如编码TREM的DNA或RNA包含核酸序列，所述核酸序列包含由表2中披露的DNA序列(例如表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)编码的一个或多个RNA序列的核酸序列。在一个实施例中，外源核酸，例如编码TREM的DNA或RNA包含与由表2中披露的DNA序列(例如表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)编码的RNA序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％，或99％相同的核酸序列。
在一个实施例中，外源核酸，例如编码TREM的DNA或RNA包含由表2中披露的DNA序列(例如表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)编码的RNA序列的核酸序列。在一个实施例中，外源核酸，例如编码TREM的DNA或RNA包含与由表2中披露的DNA序列(例如表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)编码的多个RNA序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。在一个实施例中，编码TREM的外源核酸包含由与表2中披露的DNA序列(例如表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码的RNA序列。
在一个实施例中，外源核酸，例如编码TREM的DNA或RNA包含一个或多个TREM片段的RNA序列，例如由表2中披露的DNA序列编码的RNA的片段，例如如本文所述，例如如表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个的片段。在一个实施例中，TREM片段包含由表2中提供的DNA序列(例如表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)编码的RNA的核酸序列的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施例中，TREM片段包含与由表2中提供的DNA序列编码的RNA至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施例中，TREM片段包含由与表2中提供的DNA序列(例如，表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码的核酸序列的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一个实施例中，TREM片段包含由表2中披露的DNA序列(例如，表2中披露的SEQID NO:1-451中的任一个)编码的RNA序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸。在一个实施例中，TREM片段包含与由表2中披露的DNA序列(例如，表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)编码的RNA序列至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸。在一个实施例中，TREM片段包含由与表2中提供的DNA序列(例如，表2中披露的SEQ ID NO:1-451中的任一个)至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的DNA序列编码的RNA序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25由DNA序列编码的RNA序列的26、27、28、29或30个连续核苷酸。
在一个实施例中，外源核酸包含DNA，其在转录后表达TREM。
在一个实施例中，外源核酸包含RNA，其在逆转录后产生可转录以提供TREM的DNA。
在一个实施例中，编码TREM的外源核酸包含：(i)控制区序列；(ii)编码经修饰TREM的序列；(iii)编码多于一个TREM的序列；或(iv)不是tRNAMET序列的序列。
在一个实施例中，编码TREM的外源核酸包含启动子序列。在一个实施例中，外源核酸包含RNA聚合酶III(Pol III)识别序列，例如，Pol III结合序列。在一个实施例中，启动子序列包含U6启动子序列或其片段。在一个实施例中，核酸序列包含含有突变的启动子序列，例如，启动子上调突变，例如增加转录起始的突变，例如增加TFIIIB结合的突变。在一个实施例中，核酸序列包含增加Pol III结合并导致增加的tRNA生产(例如TREM生产)的启动子序列。
本文还披露了包含编码TREM的外源核酸的质粒。在一个实施例中，质粒包含启动子序列，例如如本文所述。
包含TREM的组合物
在一个实施例中，包含TREM的组合物，例如包含TREM的药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。示例性赋形剂包括在FDA非活性成分数据库(https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.Cfm)中提供的那些。
在一个实施例中，包含TREM的组合物，例如包含TREM的药物组合物包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或150克TREM。在一个实施例中，包含TREM的组合物，例如包含TREM的药物组合物包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或100毫克TREM。
在一个实施例中，包含TREM的组合物，例如包含TREM的药物组合物是至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或99％干重TREM。
在一个实施例中，可以使用如实例12中披露的或本领域已知的体外负载反应，将通过本文披露的任何制备方法产生的包含TREM的组合物负载氨基酸。
在一个实施例中，包含TREM的组合物包含至少1x106个TREM分子、至少1x107个TREM分子、至少1x108个TREM分子或至少1x109个TREM分子。
TREM纯化
包含TREM的组合物，例如包含TREM的药物组合物可以通过核苷酸纯化技术从宿主细胞纯化。在一个实施例中，包含TREM的组合物通过亲和纯化(例如如特定tRNA分子的MACS分离方案中所述)或通过实例7中所述的方法进行纯化。在一个实施例中，包含TREM的组合物通过液相色谱纯化，例如，反相离子对色谱(IP-RP)、离子交换色谱(IE)、亲和色谱(AC)、尺寸排阻色谱(SEC)及其组合。参见，例如，Baronti等人Analytical and BioanalyticalChemistry[分析和生物分析化学](2018)410:3239-3252。
TREM质量控制和生产评定
可以评定TREM或包含TREM的组合物(例如通过本文披露的任何方法产生的药物组合物)的与TREM或TREM制剂相关的特征，诸如纯度、宿主细胞蛋白或DNA含量、内毒素水平、无菌性、TREM浓度、TREM结构或TREM的功能活性。任何上述特征均可以通过为特征提供值来评价，例如，通过评价或测试TREM、包含TREM的组合物或制备包含TREM的组合物中的中间体。值还可以与标准值或参考值进行比较。响应于评价，可以对包含TREM的组合物进行分类，例如准备发布，符合人体试验的生产标准，符合ISO标准，符合cGMP标准，或符合其他药物标准。响应于评价，包含TREM的组合物可以进行进一步处理，例如它可以分成等份，例如分成单剂量或多剂量，置于容器(例如最终用途小瓶)中，被包装、运输或投入商业。在实施例中，响应于评价，可以调节、处理或再处理一种或多种特征以优化包含TREM的组合物。例如，可以调节、加工或再加工包含TREM的组合物以(i)增加包含TREM的组合物的纯度；(ii)减少该组合物中HCP的量；(iii)减少该组合物中DNA的量；(iv)减少该组合物中片段的量；(v)减少该组合物中内毒素的量；(vi)增加该组合物的体外翻译活性；(vii)增加该组合物的TREM浓度；或(viii)灭活或去除组合物中存在的任何病毒污染物，例如通过降低组合物的pH值或通过过滤。
在一个实施例中，TREM(例如包含TREM的组合物或制备包含TREM的组合物中的中间体)具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度，即按质量计。
在一个实施例中，TREM(例如包含TREM的组合物或制备包含TREM的组合物中的中间体)具有少于0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml或500ng/ml的宿主细胞蛋白(HCP)污染。
在一个实施例中，TREM(例如包含TREM的组合物或制备包含TREM的组合物中的中间体)具有少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng或500ng/毫克(mg)组合物的宿主细胞蛋白(HCP)污染。
在一个实施例中，TREM(例如包含TREM的组合物或制备包含TREM的组合物中的中间体)具有少于1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml或500ng/ml的DNA含量，例如宿主细胞DNA含量。
在一个实施例中，TREM(例如包含TREM的组合物或制备包含TREM的组合物中的中间体)具有少于0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％的TREM片段。
在一个实施例中，TREM(例如包含TREM的组合物或制备包含TREM的组合物中的中间体)具有低水平内毒素或不存在内毒素，例如如通过鲎变形细胞裂解物(LAL)测试所测量；
在一个实施例中，TREM(例如包含TREM的组合物或制备包含TREM的组合物中的中间体)具有体外翻译活性，例如如通过实例15中描述的测定所测量。
在一个实施例中，TREM(例如包含TREM的组合物或制备包含TREM的组合物中的中间体)具有至少0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、0.1ug/mL、0.5ug/mL、1ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL、40ug/mL、50ug/mL、60ug/mL、70ug/mL、80ug/mL、100ug/mL、200ug/mL、300ug/mL、500ug/mL、1000ug/mL、5000ug/mL、10,000ug/mL或100,000ug/mL的TREM浓度。
在一个实施例中，TREM(例如包含TREM的组合物或制备包含TREM的组合物中的中间体)是无菌的，例如，在无菌条件下测试时，该组合物或制剂支持少于100个活微生物的生长，该组合物或制剂符合USP<71>的标准，和/或该组合物或制剂符合USP<85>的标准。
在一个实施例中，TREM(例如包含TREM的组合物或制备包含TREM的组合物中的中间体)不具有或具有不可检测水平的病毒污染物，例如，无病毒污染物。在一个实施例中，存在于组合物中的病毒污染物，例如任何残余病毒，被灭活或去除。在一个实施例中，病毒污染物，例如任何残余病毒例如通过降低组合物的pH值被灭活。在一个实施例中，病毒污染物，例如任何残余病毒例如通过过滤或本领域已知的其他方法被去除。
TREM施用
本文所述的包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物可以施用于细胞、组织或受试者，例如通过在体外、离体或体内直接施用于细胞、组织和/或器官。体内施用可以经由，例如通过局部、全身和/或胃肠外途径，例如静脉内、皮下、腹膜内、鞘内、肌内、眼、鼻、泌尿生殖器、皮内、真皮、肠内、玻璃体内、脑内、鞘内或硬膜外途径。
在一个实施例中，将本文所述的包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物施用于具有本文披露的症状或障碍的受试者。在一个实施例中，施用本文所述的包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物以预防或治疗症状或障碍。在一个实施例中，施用本文所述的包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物可治疗或预防症状或障碍。在一个实施例中，施用本文所述的包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物调节受试者的tRNA池，例如，可治疗症状或障碍。在一个实施例中，障碍选自表1。
在一个实施例中，将本文所述的包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物施用于来自具有本文披露的症状或障碍的受试者的细胞。在一个实施例中，施用本文所述的包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物调节来自受试者的细胞中的tRNA池。在一个实施例中，可以将本文所述的包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物体内、体外或离体施用于细胞。在一个实施例中，受试者患有选自表1的障碍。
在一个实施例中，将本文所述的包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物施用于具有本文披露的症状或障碍的受试者的组织。在一个实施例中，施用本文所述的包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物调节受试者的组织中的tRNA池。在一个实施例中，受试者患有选自表1的障碍。
载体和载剂
在一些实施例中，使用载体将本文所述的TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物递送至细胞，例如哺乳动物细胞或人细胞。载体可以是例如质粒或病毒。在一些实施例中，递送是体内、体外、离体或原位的。在一些实施例中，病毒是腺相关病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒。在一些实施例中，系统或系统的组分与病毒样颗粒或病毒体一起被递送至细胞。在一些实施例中，递送使用一种以上的病毒、病毒样颗粒或病毒体。
载剂
本文所述的TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物可以包含载剂，可以与载剂一起配制，或者可以在载剂中递送。
病毒载体
载剂可以是病毒载剂(例如，包含编码TREM的序列的病毒载剂)。可以将病毒载体施用于细胞或受试者(例如人受试者或动物模型)以递送TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物。病毒载体可以全身或局部施用(例如，注射)。
病毒基因组提供了丰富的载体来源，可用于将外源基因有效递送到哺乳动物细胞中。本领域已知病毒基因组可用作递送的有用载体，因为包含在此类基因组中的多核苷酸典型地通过通用或特化转导掺入到哺乳动物细胞的核基因组中。这些过程是自然病毒复制周期的一部分，不需要添加蛋白质或试剂来诱导基因整合。病毒载体的实例包括逆转录病毒(例如，逆转录病毒科病毒载体)、腺病毒(例如Ad5、Ad26、Ad34、Ad35和Ad48)、细小病毒(例如，腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒(诸如正粘病毒(例如流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒))、正链RNA病毒(诸如微核糖核酸病毒和甲病毒)、以及双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒1型和2型、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒、复制缺陷疱疹病毒)和痘病毒(例如牛痘、改良安卡拉牛痘(MVA)、鸡痘和金丝雀痘))。其他病毒包括例如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、肝炎病毒、人乳头瘤病毒、人泡沫病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病肉瘤、禽C型病毒、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、癌逆转录病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、α-逆转录病毒、γ-逆转录病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:Theviruses and their replication[逆转录病毒科：病毒及其复制],Virology[病毒学](第三版)Lippincott-Raven[利平科特-雷文出版社],Philadelphia[费城],1996)。其他实例包括鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒、禽白血病病毒、人T细胞白血病病毒、狒狒内源病毒、长臂猿白血病病毒、梅森辉瑞(Mason Pfizer)猴病毒、猴免疫缺陷病毒、猴肉瘤病毒、劳斯肉瘤病毒和慢病毒。载体的其他实例描述于例如美国专利号5,801,030中，其教导以引用的方式并入本文。在一些实施例中，系统或系统的组分与病毒样颗粒或病毒体一起被递送至细胞。
基于细胞和囊泡的载剂
可以将本文所述的TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物在囊泡或其他基于膜的载剂中施用于细胞。
在实施例中，本文所述的TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物在细胞、囊泡或其他基于膜的载剂中施用或经由其施用。在一个实施例中，TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物可以配制在脂质体或其他类似的囊泡中。脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子的、中性的或阳离子的。脂质体具有生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，保护其负载物免受血浆酶的降解，并且将其装载转运穿过生物膜和血脑屏障(BBB)(关于综述，参见例如，Spuch和Navarro,Journalof Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。
囊泡可以由若干种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于生成脂质体作为药物载剂。制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,693,086，其关于多层囊泡脂质制备的教导通过援引并入本文)。尽管当脂质膜与水性溶液混合时，囊泡形成可以是自发的，但也可以通过经由使用均质器、超声波仪或挤压设备以振荡的形式施加力来加快囊泡形成(关于综述，参见例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可以通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如Templeton等人,NatureBiotech[自然-生物技术],15:647-652,1997中所述，将该文献关于挤出脂质制备的传授内容通过援引并入本文中。
脂质纳米颗粒是为本文所述的TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物提供生物相容性和生物可降解递送系统的载剂的另一个实例。纳米结构化的脂质载剂(NLC)是经修饰的固体脂质纳米颗粒(SLN)，这些经修饰的固体脂质纳米颗粒保留了SLN的特征、改进了药物稳定性和装载能力、并且防止了药物泄漏。聚合物纳米颗粒(PNP)是药物递送的重要组成部分。这些纳米颗粒可以有效地将药物递送指导至特定靶标并且改善药物稳定性和受控的药物释放。也可以使用脂质聚合物纳米颗粒(PLN)，即一种组合了脂质体和聚合物的新型载剂。这些纳米颗粒具有PNP和脂质体的互补优势。PLN由核-壳结构构成；聚合物核提供了稳定的结构，并且磷脂壳提供了良好的生物相容性。这样，这两种组分增加了药物包封效率、促进了表面修饰、并且防止了水溶性药物的泄漏。对于综述，参见例如，Li等人2017,Nanomaterials[纳米材料]7,122；doi:10.3390/nano7060122。
外泌体也可用作本文所述的TREM或包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物的药物递送媒剂。对于综述，参见Ha等人,July 2016年7月.Acta Pharmaceutica Sinica B[药学学报].第6卷,第4期,第287-296页；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
离体分化的红细胞也可用作本文所述的TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物的载剂。参见例如，WO 2015073587；WO 2017123646；WO 2017123644；WO2018102740；wO2016183482；WO 2015153102；WO 2018151829；WO 2018009838；Shi等人2014.Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136；美国专利9,644,180；Huang等人2017.Nature Communications[自然-通讯]8:423；Shi等人2014.Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136。
融合体组合物，例如如WO 2018208728中所述，也可用作载剂以递送本文所述的TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物。
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可以用作将本文所述的TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物递送至所靶向细胞的载剂。
植物纳米囊泡，例如，如WO 2011097480 A1、WO 2013070324 A1或WO 2017004526A1中所述，也可以用作递送本文所述的TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物的载剂。
无载剂的情况下递送
本文所述的TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物可以在没有载剂的情况下施用于细胞，例如通过裸递送TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物。
在一些实施例中，如本文所用的裸递送是指无载剂的情况下递送。在一些实施例中，无载剂的情况下递送，例如裸递送，包括用部分例如靶向肽递送。
在一些实施例中，将本文所述的TREM、包含TREM的组合物或包含TREM的药物组合物在没有载剂的情况下递送至细胞，例如通过裸递送。在一些实施例中，无载剂的情况下递送，例如裸递送，包括用部分例如靶向肽递送。
TREM的用途
包含TREM的组合物(例如，如本文所述的包含TREM的药物组合物)可用于调节细胞或受试者中的tRNA池，例如，如本文所述。在实施例中，使如本文所述的包含TREM的组合物(例如，包含TREM的药物组合物)与细胞或组织接触，或向有需要的受试者施用该组合物，其量和时间足以调节(增加或减少)tRNA池。在实施例中，tRNA池包含第一tRNA部分和另一个tRNA部分，例如第二tRNA部分。在一个实施例中，tRNA部分包含内源tRNA和/或TREM。
在一个实施例中，包含TREM的组合物(例如，如本文所述的包含TREM的药物组合物)可以用于治疗具有内源ORF的受试者，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)。在一个实施例中，受试者患有表1披露的障碍。
包含TREM的组合物(例如，如本文所述的包含TREM的药物组合物)也可以用于调节细胞、组织或受试者中的功能。在实施例中，使如本文所述的包含TREM的组合物(例如，包含TREM的药物组合物)与细胞或组织接触，或向有需要的受试者施用该组合物，其量和时间足以调节(增加或减少)以下参数中一种或多种：衔接子功能(例如，同源或非同源衔接子功能)，例如，多肽链起始或延伸的速率、效率、稳健性和/或特异性；核糖体结合和/或占用；调节性功能(例如，基因沉默或信号传导)；细胞命运；mRNA稳定性；蛋白质定位；蛋白质折叠；蛋白质稳定性；蛋白质转导；或蛋白质区室化。
与参考组织、细胞或受试者(例如，健康、野生型或对照细胞、组织或受试者)相比，参数可以被调节例如至少5％(例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多)。
本文引用的所有参考文献和出版物均通过援引并入本文。
提供以下实例以进一步说明本发明的一些实施例，但并非旨在限制本发明的范围；通过其示例性性质将理解，可以替代性地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。
实例
实例内容列表：
实例1：通过瞬时转染在哺乳动物生产宿主细胞中制造TREM
本实例描述了在瞬时表达TREM的哺乳动物宿主细胞中生产的TREM。
质粒产生
为了产生包含编码TREM(在本实例中是iMet-CAT TREM)的序列的质粒，按照制造商的说明和标准分子克隆技术，合成含有序列AGCAGAGTGGCGCAGCGGAAGCGTGCTGGGCCCATAACCCAGAGGTCGATGGATCGAAACCATCCTCTGCTA(SEQ ID NO:262)的一个拷贝的DNA片段，并克隆到具有U6启动子的pLKO.1-puro-mCherry骨架质粒中。
转染
根据制造商的说明，使用9uL lipofectamine RNAiMax试剂，将上述三(3)μg质粒用于转染以80％汇合铺板的HEK293T细胞的T175烧瓶。在转染后48小时收获细胞用于纯化。
使用小RNA分离试剂盒进行纯化
裂解过表达iMet的细胞。为了产生小RNA(sRNA)部分，按照制造商的说明，使用小RNA分离试剂盒(诸如Qiagen miRNeasy试剂盒)从裂解物中总RNA池的其余部分中分离出小于200个核苷酸的RNA。为了进一步排除较大的RNA，进行LiCl沉淀以去除sRNA级分中剩余的大RNA。最后，将sRNA级分添加到G50柱中，以从sRNA级分中去除小于10个核苷酸的RNA并进行缓冲液交换。
为了从sRNA级分中分离TREM，使用了探针结合方法。使用对应于与所纯化的靶标TREM的独特区域互补的DNA探针或2'-OMe核酸的生物素化捕获探针来结合并纯化iMet-CAT-TREM，在本实例中，该生物素化捕获探针是在5'末端与生物素缀合的探针(序列为TAGCAGAGGATGGTTTCGATCCATCA(SEQ ID NO:455))。将sRNA级分与退火缓冲液和生物素化捕获探针在90℃下孵育4-5分钟，并以0.1℃/s的速率冷却至25℃。
然后将混合物与结合缓冲液和链霉亲和素缀合的无RNA酶磁珠孵育15分钟，以使DNA-TREM复合物能够与珠结合。然后将混合物加入磁场分离器架并用洗涤缓冲液洗涤2-3次。通过添加含有或不含DNA酶的洗脱缓冲液来洗脱保留在珠上的TREM，以确保完全去除DNA捕获探针，然后与药学上可接受的赋形剂混合以制备测试TREM产物。
实例2：在来自稳定细胞系的哺乳动物生产宿主细胞中制造TREM
本实例描述了在稳定表达TREM的哺乳动物宿主细胞中生产的TREM的制造。
表达TREM的慢病毒的制备
为了在10mm培养皿中制备表达TREM的慢病毒，将包装细胞，诸如HEK293T细胞(293T细胞(
CRL-3216TM)根据制造商的说明使用TransIT-LT1转染试剂用以下进行正向转染：9μg包含编码如实例1中所述的TREM的序列的质粒和9μg ViraPower慢病毒包装混合物。
18小时后，将培养基更换为新鲜的不含抗生素的高FBS(30％FBS)培养基，24小时后，收集含有病毒的培养基并储存在4℃。将另外15mL高FBS培养基添加到板中，并在24小时后收获。将两种含有病毒的培养基收获物合并并通过0.45微米过滤器过滤。根据制造商的方案，使用Lenti-X qRT-PCR滴定试剂盒评定病毒拷贝数。
用表达TREM的慢病毒转导宿主细胞
为了用表达TREM的慢病毒转导细胞，在存在10μg/mL聚凝胺的情况下，将含有慢病毒的培养基以1:4的比例用完全细胞培养基稀释，并添加到细胞中。在本实例中，使用了293T细胞。将板以1000x g旋转2小时以旋转感染细胞。18小时后，更换培养基以使细胞恢复。转导后四十八小时，与未转导的对照细胞群一起进行5-7天的嘌呤霉素(2μg/mL)抗生素选择。
如实例1中所述分离、纯化和配制TREM以产生TREM制剂。
使用苯酚氯仿提取进行纯化
如J.Sambrook和D.Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],New York,NY,USA[美国纽约州纽约市],第3版2所述，通过硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取从细胞回收细胞的总RNA池，并且通过乙醇沉淀浓缩。然后通过在如Cathala,G.等人,DNA,1983；2(4):329-35所述的高锂盐条件下沉淀将沉淀物中的总tRNA池与较大的核酸(包括rRNA和DNA)分离。通过探针结合进一步纯化含有TREM的洗脱级分。
将TREM级分与退火缓冲液和对应于DNA探针或2'-OMe核酸的生物素化捕获探针(其与待纯化的目标TREM的独特区域互补)一起孵育。在本实例中，使用在5'末端与生物素缀合的探针(序列为TAGCAGAGGATGGTTTCGATCCATCA(SEQ ID NO:455))纯化包含iMet-CAT的TREM。将混合物在90℃下孵育4-5分钟，然后以0.1℃/s的速率冷却至25℃。
然后将混合物与结合缓冲液和链霉亲和素缀合的无RNA酶磁珠孵育15分钟，以使DNA-TREM复合物能够与珠结合。然后将混合物加入磁场分离器架并洗涤2-3次。通过添加含有或不含DNA酶的洗脱缓冲液来洗脱保留在珠上的TREM，以确保完全去除DNA捕获探针，然后与药学上可接受的赋形剂混合以制备测试TREM产物。
实例3：在来自稳定细胞系的哺乳动物生产宿主细胞中制造TREM-2
本实例描述了从哺乳动物宿主细胞产生的粗细胞裂解物中制造TREM。
产生表达TREM的稳定细胞
在本实例中，如实例1或2中所述产生包含编码TREM的序列的质粒。如实例2中所述进行表达TREM的慢病毒的制备和用表达TREM的慢病毒转导宿主细胞。
从粗细胞裂解物中纯化
过表达TREM的细胞，在本实例中是过表达iMet-CAT-TREM的细胞，被裂解，将裂解的材料与退火缓冲液和对应于DNA探针或2'-OMe核酸的生物素化捕获探针(其与待纯化的目标TREM的独特区域互补)一起孵育。在本实例中，使用在5'末端与生物素缀合的探针(序列为TAGCAGAGGATGGTTTCGATCCATCA(SEQ ID NO:455))纯化包含iMet-CAT的TREM。将混合物在90℃下孵育4-5分钟，然后以0.1℃/s的速率冷却至25℃。
然后将混合物与结合缓冲液和链霉亲和素缀合的无RNA酶磁珠孵育15分钟，以使DNA-TREM复合物能够与珠结合。然后将混合物加入磁场分离器架并洗涤2-3次。通过添加含有或不含DNA酶的洗脱缓冲液来洗脱保留在珠上的TREM，以确保完全去除DNA捕获探针，然后与药学上可接受的赋形剂混合以制备测试TREM产物。
实例4：将TREM递送至哺乳动物细胞
本实例描述了将TREM递送至哺乳动物细胞。
为确保正确折叠，TREM在85℃下加热2分钟，然后在4℃下快速冷却5分钟。为了将TREM递送至哺乳动物细胞，根据制造商的说明使用RNAiMax试剂，在U2OS(U-2OS(
HTB-96TM)、H1299(NCI-H1299(
CRL-5803TM))和HeLa(HeLa(
CCL-2TM))细胞中转染了100nM在不同位置用Cy3标记的两种TREM制剂(Cy3-iMET-1和Cy3-iMET-2))。18小时后，去除转染培养基并更换为新鲜的完全培养基(U2OS：McCoy's 5A，10％FBS，1％PenStrep；H1299：RPMI1640，10％FBS，1％PenStrep；HeLa：EMEM，10％FBS，1％PenStrep)。
为了观察TREM向细胞的递送，在活细胞分析系统中监测细胞。在本实例中，IncuCyte(来自伊森生物科学公司(Essen BioScience))用于监测细胞。监测细胞4天(20x，红色550ms)。
Cy3荧光信号很容易从已经递送经Cy3标记的TREM的细胞中检测到。从已经递送TREM的细胞中观察了超过48小时的Cy3荧光信号。检测到来自细胞的Cy-3荧光证实了经Cy3标记的TREM向细胞的递送。
实例5：使用TREM情况下哺乳动物细胞中的细胞生长增加
本实例描述了TREM递送后哺乳动物细胞的细胞生长增加。
为确保正确折叠，iMet TREM在85℃下加热2分钟，然后在4℃下快速冷却5分钟。为了将iMet TREM递送至哺乳动物细胞，根据制造商的说明使用RNAiMax试剂，在U2OS(U-2OS(
HTB-96TM)、H1299(NCI-H1299(
CRL-5803TM))和HeLa(HeLa(
CCL-2TM))细胞中转染了100nM经Cy3标记的iMet TREM。作为对照，将经Cy3标记的非靶向对照siRNA递送至细胞。18小时后，去除转染培养基并更换为新鲜的完全培养基(U2OS：McCoy's5A，10％FBS，1％PenStrep；H1299：RPMI1640，10％FBS，1％PenStrep；HeLa：EMEM，10％FBS，1％PenStrep)。为了观察细胞生长的变化，在活细胞分析系统(在本实例中是在IncuCyte(来自伊森生物科学公司))中监测细胞4天(20x，相差)。
将iMet TREM递送至U2OS细胞(图4A)、H1299(图4B)或Hela细胞(图4C)导致所有测试的细胞系中的细胞生长的显著增加。将细胞生长的增加与通过递送经Cy3标记的非靶向对照(Cy3-NTC)观察到的细胞生长进行比较。数据表明将TREM递送至细胞导致增加的增殖和生长。
实例6：人细胞提取物无细胞蛋白合成(hCFPS)裂解物中的TREM翻译活性测定
本实例描述了无细胞裂解物系统中TREM介导的翻译活性增加。
制备人细胞提取物
HEK293T细胞在40X 150mm培养皿中生长至约80％汇合。收获细胞，在PBS中洗涤，以1:1的比例重悬于冰冷的低渗裂解缓冲液(20mM HEPES pH 7.6、10mM KAc、1.5mM MgAc、5mM DTT和5X完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物)中并孵育在冰上放置30分钟。使用Dounce匀浆器或通过将裂解物通过27G针头裂解细胞，直到>95％的细胞被破坏。裂解物在4℃下以14,000g离心10分钟，收集上清液并用低渗裂解缓冲液稀释以获得约15mg/ml的蛋白质溶液。
转录mRNA
mRNA转录模板设计为具有T7聚合酶启动子、β-珠蛋白3'UTR、nanoLuc ORF和短人工3'UTR。模板经过PCR扩增，并使用带尾的HiScribe T7 ARCA mRNA试剂盒(新英格兰生物实验室)按照制造商的推荐方案转录加帽和多腺苷酸化的mRNA。
在hCFPS裂解物中进行TREM翻译活性测定
在翻译缓冲液(16mM HEPES pH 7.6、2.2mM MgAc、60mM KCl、0.02mM完整氨基酸混合物、1mM ATP、0.5mM GTP、20mM磷酸肌酸、0.1μg/μL肌酸激酶、0.1mM亚精胺，2U/μlRiboLock RNA酶抑制剂)中建立翻译反应，所述翻译缓冲液含35％HEK293T裂解物，0.02μM加帽和多腺苷酸化的nanoLuc mRNA和2μM细胞纯化的TREM(根据实例2纯化)。将反应以10μl一式三份在37℃下进行30分钟。对于对照反应，在不向反应中添加TREM的情况下进行一个对照反应，在不向反应中添加mRNA的情况下进行一个对照反应。然后，通过将每个反应与40μl室温Nano-Glo萤光素酶测定系统(普洛麦格公司(Promega))混合并在读板器中读取发光来检测NanoLuc活性。
如图5所示，与对照反应(缓冲液)相比，iMET TREM反应导致NanoLuc表达增加约1.5倍。数据显示，TREM的递送导致nanoLuc mRNA翻译的增加，如发光增加所反映的。
实例7：在哺乳动物生产宿主细胞中制造TREM及使用其调节细胞功能本实例描述了在哺乳动物宿主细胞中生产的TREM的制造。
质粒产生
为了产生包含具有tRNA基因的TREM(在本实例中是tRNAiMet)的质粒，使用以下引物对从人基因组DNA PCR扩增含有该tRNA基因(chr6.tRNA-iMet(CAT)，其具有基因组位置6p22.2和序列AGCAGAGTGGCGCAGCGGAAGCGTGCTGGGCCCATAACCCAGAGGTCGATGGATCGAAACCATCCTCTGCTA(SEQ ID NO:262))的DNA片段：5'-TGAGTTGGCAACCTGTGGTA(SEQ ID NO:452)和5'-TTGGGTGTCCATGAAAATCA(SEQ ID NO:453)。按照制造商的说明，将该片段克隆到具有U6启动子(或任何其他RNA聚合酶III募集启动子)的pLKO.1puro骨架质粒中。
转染
将1mg上述质粒用于以1X 105个细胞/mL转染悬浮适应HEK293T细胞(Freestyle293-F细胞)的1L培养物。在转染后24、48、72或96小时收获细胞，以确定TREM表达的优化时间点，如通过RNA印迹分析或定量PCR(q-PCR)所确定。
纯化
在优化的收获细胞密度点，TREM按照先前Cayama等人,Nucleic Acids Research.[核酸研究]28(12),e64(2000)中所述进行纯化。简而言之，通过苯酚提取从细胞中回收短RNA(例如tRNA)，并通过乙醇沉淀进行浓缩。然后在高盐条件下通过逐步异丙醇沉淀将沉淀物中的总tRNA与较大的核酸(包括rRNA和DNA)分离。通过探针结合进一步纯化含有TREM的洗脱级分。将TREM级分与退火缓冲液一起孵育，并且使用对应于与所纯化的靶标TREM的独特区域互补的DNA探针或2'-OMe核酸的生物素化捕获探针来纯化包含tRNA-Lys-UUU的TREM，在本实例中，该生物素化捕获探针是在3'末端与生物素缀合的探针(序列为UAGCAGAGGAUGGUUUCGAUCCAUCA(SEQ ID NO:454))。将混合物在90℃下孵育2-3分钟，然后快速冷却至45℃并在45℃下孵育过夜。然后将混合物与预先加热至45℃的结合缓冲液和链霉亲和素缀合的无RNA酶磁珠孵育3小时，使DNA-tRNA复合物与珠结合。然后将混合物添加到磁场分离器架中的预平衡柱中并洗涤4次。通过添加预热至80℃的洗脱缓冲液，然后与药学上可接受的赋形剂混合以制备测试TREM产物，将保留在珠上的TREM洗脱三次。
用途
将一微克测试TREM制剂和对照剂通过转染、电穿孔或脂质体递送与培养的细胞系(诸如HEP-3B或HEK293T)、组织或受试者接触，接触的时间足以让TREM制剂相对于对照剂调节细胞的翻译水平或活性。
实例8：在哺乳动物生产宿主细胞中制造TREM及使用其调节细胞功能本实例描述了在哺乳动物宿主细胞中生产的TREM的制造。
质粒产生
为了产生包含具有tRNA基因的TREM(在本实例中是tRNA-iMet-CAT)的质粒，按照制造商的说明和标准分子克隆技术，合成含有该tRNA基因(序列为AGCAGAGTGGCGCAGCGGAAGCGTGCTGGGCCCATAACCCAGAGGTCGATGGATCGAAACCATCCTCTGCTA(SEQ ID NO:262))的至少一个拷贝的DNA片段，并且克隆到具有U6启动子(或任何其他RNA聚合酶III募集启动子)的pLKO.1puro骨架质粒中。
转染
将1mg上述质粒用于以1X 105个细胞/mL转染悬浮适应HEK293T细胞(Freestyle293-F细胞)的1L培养物。在转染后24、48、72或96小时收获细胞，以确定TREM表达的优化时间点，如通过RNA印迹分析或定量PCR(q-PCR)或纳米孔测序所确定。
纯化
在优化的收获时间点，细胞被裂解，并根据制造商的说明使用小RNA分离试剂盒从小于200个核苷酸的RNA的裂解物分离，以产生小RNA(sRNA)级分。
为制备亲和纯化试剂，将链霉亲和素缀合的无RNA酶磁珠与200mM生物素化寡核苷酸(其对应于与正在纯化的目标TREM互补的DNA探针或2'-OMe核酸)在室温下孵育30分钟。在本实例中，使用序列为5'生物素-TAGCAGAGGATGGTTTCGATCCATCA(SEQ ID NO:455)的探针来纯化包含tRNA-iMet(CAT)的TREM。将珠洗涤并在75℃下加热10分钟。
将sRNA级分在75℃下加热10分钟，然后与上述亲和纯化试剂混合。将混合物在室温下孵育3小时，使TREM以序列特异性方式与珠结合的DNA探针结合。然后洗涤珠直到洗涤溶液在260nm处的吸光度接近于零。可替代地，将珠洗涤三次，并通过UV光谱检查最终洗涤液以测量最终洗涤液中存在的核酸量。使用可预热至80℃的无RNA酶水将保留在珠上的TREM洗脱三次，然后与药学上可接受的赋形剂混合以制备测试TREM产物。
用途
将一微克测试TREM制剂和对照剂通过转染、电穿孔或脂质体递送与培养的细胞系(诸如HeLa、HEP-3B或HEK293T)、组织或受试者接触，接触的时间足以让TREM制剂相对于对照剂调节细胞的翻译水平或活性。
实例9：在表达癌基因的经修饰哺乳动物生产宿主细胞中制造TREM
本实例描述了在哺乳动物宿主细胞中制造TREM以过表达Myc。
质粒产生和宿主细胞修饰
为了制造本实例的生产宿主细胞，使用常规分子生物学技术将HeLa细胞(
CCL-2TM)或HEP-3B细胞(
HB-8064TM)用含有编码c-myc癌基因蛋白的基因序列的质粒(例如，pcDNA3-cmyc(Addgene质粒#16011))转染。所得细胞系在本文中称为HeLamyc+宿主细胞或HEP-3Bmyc+宿主细胞。
表达TREM的慢病毒的制备
为了制备表达TREM的慢病毒，根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000将HEK293T细胞用以下进行共转染：3μg的每种包装载体(pRSV-Rev、pCMV-VSVG-G和pCgpV)和9μg包含实例7所述的TREM的序列的质粒。24小时后，将培养基更换为新鲜的不含抗生素的培养基，48小时后，收集含病毒的上清液并以2000rpm离心10分钟，然后通过0.45μm过滤器过滤。
用表达TREM的慢病毒转导宿主细胞
在8μg/mL聚凝胺存在下，使用如上所述制备的2mL病毒转导100,000个HeLamyc+宿主细胞或HEP-3Bmyc+宿主细胞。转导后四十八小时，与未转导的对照细胞群一起进行2-7天的嘌呤霉素(2μg/mL)抗生素选择。
如实例7或8中所述分离、纯化和配制TREM以产生包含TREM的组合物或包含TREM的制剂。
实例10：制备经修饰以对tRNA合成的阻遏物进行抑制的TREM生产宿主细胞
本实例描述了用于生产TREM的Hek293Maf-/TRM1细胞的制备。
Maf1是tRNA合成的阻遏物。Maf1敲除HEK293T细胞系是使用标准CRISPR/Cas敲除技术产生的，例如，CRISPR/Cas系统可以被设计为在Maf1的编码外显子中引入移码突变，以降低Maf1的表达或敲除Maf1表达，以产生Maf1表达水平和/或活性降低的Hek293Maf-细胞系。然后将该细胞系用表达质粒转染用于修饰酶Trm1(tRNA(鸟嘌呤26-N2)-二甲基转移酶)，诸如pCMV6-XL4-Trm1，并用选择标志物，例如新霉素进行选择以产生过表达Trm1的稳定细胞系(Hek293Maf-/TRM1细胞)。
Hek293Maf-/TRM1细胞可用作生产宿主细胞以制备如实例7-9中任一项所述的TREM。
实例11：在过表达癌基因和tRNA修饰酶的经修饰的哺乳动物生产宿主细胞中制造TREM
本实例描述了在哺乳动物宿主细胞中制造TREM以过表达Myc和Trm1。
质粒产生
在本实例中，如实施例7或8中所述产生包含TREM的质粒。
宿主细胞修饰、转导和纯化
通过将表达myc癌基因的逆转录病毒从pBABEpuro-c-mycT58A质粒转导到HEK293T细胞中，可以产生稳定过表达Myc癌基因的人细胞系，诸如HEK293T。为了产生表达myc的逆转录病毒，使用磷酸钙方法用人c-myc逆转录病毒载体pBABEpuro-c-mycT58A和包装载体ψ2载体转染HEK293T细胞。6小时后，去除转染培养基并更换为新鲜培养基。孵育24小时后，收集培养基并通过0.45um过滤器过滤。对于逆转录病毒感染，将HEK293T细胞用逆转录病毒和聚凝胺(8ug/ml)感染，在18℃下以2500rpm旋转感染1小时。24小时后，用新鲜培养基更换细胞培养基，并且在24小时后，用2μg/mL嘌呤霉素选择细胞。一旦建立稳定过表达癌基因myc的细胞，将它们用Trm1质粒(诸如pCMV6-XL4-Trm1质粒)转染，并使用选择标志物(在这种情况下使用新霉素)进行选择，以产生除了Myc还过表达Trm1的稳定细胞系。同时，如实例9中所述，用HEK293T细胞和PLKO.1-tRNA载体产生过表达TREM的慢病毒。
在存在8μg/mL聚凝胺的情况下，用TREM病毒转导了1x105个过表达Myc和Trm1的细胞。24小时后更换培养基。转导后四十八小时，使用2μg/mL嘌呤霉素与未转导的对照细胞群一起进行2-7天的抗生素选择。使用实例7或8中描述的方法分离、纯化和配制TREM以产生TREM制剂。
实例12：错误负载的TREM的产生
本实例描述了负载有与其天然反密码子不同的氨基酸的TREM的产生。
TREM如实例7-11中任一个所述生产。使用本领域已知的体外负载反应将TREM产物负载异源氨基酸(参见，例如，Walker&Fredrick(2008)Methods[方法](圣地亚哥,加利福尼亚州)44(2):81-6)。简言之，将纯化的TREM，例如包含tRNA-Val(GTG)的TREM，置于具有异源目的氨基酸(例如谷氨酸)和相应氨酰基-tRNA合成酶(例如Valyl-tRNA合成酶，其被突变以增强tRNA错误负载)的缓冲液中，以诱导TREM负载。为了分离氨酰基-TREM，将体外负载反应通过离心柱，并确定基于A260吸光度的浓度以及使用酸性凝胶电泳的氨酰化程度。氨酰化的TREM也可以通过以下来分离：与经His6标记(SEQ ID NO:456)的EF-Tu结合，然后在Ni-NTA琼脂糖上进行亲和色谱、苯酚-氯仿提取和随后的核酸沉淀，如Rezgui等人,2013,PNAS[美国国家科学院院刊]110:12289-12294中所述。
实例13：TREM片段的产生(体外)
本实例描述了从哺乳动物宿主细胞中制造的TREM体外产生TREM片段。
如以上任何实例中所述制备TREM。使用已知可产生tRNA片段(诸如RNA酶A或血管生成素)的酶进行的酶促切割测定以产生片段，用于施用给细胞、组织或受试者。
简而言之，将如上所述制造的TREM在以下之一中孵育：
0.1M Hepes/NaOH，pH 7.4，10nM RNA酶A终浓度，30℃ 10分钟，或
0.1M MES、0.1M NaCl、pH 6.0、有效量的血管生成素、和BSA，37℃6小时。
为了在酶处理后分离目标TREM片段，执行序列亲和纯化程序，如上所述。
实例14：在细胞表达系统中产生TREM片段
本实例描述了在细胞表达系统中产生TREM片段。
如实例7-9或11中任一项所述，产生稳定过表达TREM的细胞系。过表达TREM的Hek293T细胞用0.5μg/ml重组血管生成素处理90分钟，然后用Trizol提取总RNA。根据制造商的说明，使用小RNA分离试剂盒对小于200个核苷酸的RNA进行大小选择。将链霉亲和素缀合的无RNA酶磁珠与200mM生物素化寡核苷酸(其对应于与待纯化的一半tRNA的独特区域互补的探针或DNA探针)在室温下孵育30分钟。将珠洗涤并在75℃下加热10分钟。经大小选择的RNA洗脱液也在75℃下加热10分钟，然后与珠混合。TREM-珠混合物在室温下孵育3小时，以使TREM与珠结合的DNA探针结合。然后洗涤珠直到260nm处的洗涤溶液接近零(0)。可替代地，将珠洗涤三次，并通过UV光谱检查最终洗涤液以测量最终洗涤液中存在的核酸量。使用预热至80℃的无RNA酶水或预热至80℃的洗脱缓冲液将保留在珠上的TREM洗脱3次。
实例15：TREM翻译活性测定
本实例描述了评价TREM掺入新生多肽链的能力的测定。
FLAG-AA-His肽序列的翻译
用编码肽FLAG-XXX-His6x(“His6x”，披露为SEQ ID NO:456)的mRNA在体外翻译反应中对测试TREM进行测定，其中XXX是对应于测试TREM反密码子的3个连续密码子。
将tRNA耗尽的兔网织红细胞裂解物(Jackson等人2001.RNA7:765-773)在30℃与10-25ug/mL的测试TREM以及10-25ug/mL的对于FLAG和His标签翻译所需的tRNA一起孵育1小时。在本实例中，使用的TREM是tRNA-Ile-GAT，因此使用的肽是FLAG-LLL-His6x(“His6x”，披露为SEQ ID NO:456)，并且添加的tRNA是tRNA-Ile-GAT，以及以下(其被添加以翻译肽FLAG和HIS标签)：tRNA-Asp-GAC、tRNA-Tyr-TAC、tRNA-Lys-AAA、tRNA-Lys-AAAG、tRNA-Asp-GAT、tRNA-His-CAT。为了确定测试TREM在功能上是否能够并入新生肽中，进行了ELISA捕获测定。简而言之，固定化的抗His6X抗体(“His6X”，披露为SEQ ID NO:456)用于捕获来自反应混合物的FLAG-LLL-His6x肽(“His6x”，披露为SEQ ID NO:456)。然后洗去反应混合物，用酶缀合的抗FLAG抗体(其在ELISA检测步骤中与底物反应)检测肽。如果产生的TREM是有功能的，则产生FLAG-LLL-His6肽(“His6”，披露为SEQ ID NO:456)并通过ELISA捕获测定检测到。本实例中描述的方法可以用于评价TREM的功能。
翻译抑制测定
该测定描述了一种通过拯救抑制突变并允许翻译完整蛋白质而具有翻译衔接分子功能的测试TREM。产生测试TREM，在本实例中是tRNA-Ile-GAT，以使得其含有tRNA-Ile-GAT体的序列，但具有对应于CUA而不是GAT的反密码子序列。如Geslain等人2010.J MolBiol.[分子生物学杂志]396:821-831中所述，将HeLa细胞用以下共转染：50ng TREM和200ng编码突变GFP(在S29位置处包含UAG终止密码子)的DNA质粒。仅用GFP质粒转染的HeLa细胞作为阴性对照。24小时后，收集细胞并通过流式细胞术分析荧光恢复。以509nm处的发射峰(395nm处的激发)读出荧光。本实例中描述的方法可以用于评价TREM的功能，或者TREM是否可以拯救GFP分子中的终止突变并可以产生全长荧光蛋白。
体外翻译测定
该测定描述了通过在体外翻译反应中成功掺入新生多肽链中而具有翻译衔接子分子功能的测试TREM。首先，产生了使用反义或互补寡核苷酸耗尽内源tRNA的兔网织红细胞裂解物，该反义或互补寡核苷酸(i)靶向反密码子和可变环之间的序列；或(ii)结合反密码子和可变环之间的区域(参见，例如，Cui等人,2018.Nucleic Acids Res[核酸研究].46(12):6387-6400)。除了2ug/uL的GFP编码mRNA之外，还向耗尽的裂解物中添加10-25ug/mL的测试TREM。将含有GFP mRNA并且添加或未添加测试TREM的非耗尽的裂解物用作阳性对照。将含有GFP mRNA但未添加测试TREM的耗尽的裂解物用作阴性对照。通过在37℃下3-5小时内使用λex485/λem528的酶标仪上的荧光增加监测GFP mRNA翻译的进程。本实例中描述的方法可以用于评价测试TREM是否可以补充耗尽的裂解物并因此可能具有功能。
实例16：测定细胞状态的调节
本实例描述了用于检测TREM在调节细胞状态(例如，细胞死亡)方面的活性的测定。
TREM片段如实例13中所述产生。将1uM TREM片段用Lipofectamine 3000转染到HEK293T细胞中，并以一小时的间隔孵育1-6小时，然后进行细胞裂解。通过Western印迹分析来分析细胞裂解物，并用针对总和裂解的半胱天冬酶3和9的抗体探测印迹，作为细胞凋亡的读数。为了测量细胞活力，在室温下用PBS中的4％多聚甲醛洗涤和固定细胞15分钟。然后在室温下用0.1％Triton X-100处理固定和洗涤过的细胞10分钟，并用PBS洗涤三次。最后，将细胞用TUNEL测定反应混合物在37℃下在黑暗中处理1小时。通过流式细胞术分析样品。
实例17：测定未负载的TREM调节自噬的活性
本实例描述了一种测定以测试未负载的TREM调节，例如诱导自噬的能力，例如激活GCN2依赖性应激反应(饥饿)路径信号传导、抑制mTOR或激活自噬的能力。
通过转染或脂质体递送将测试的未负载的TREM(uTREM)制剂递送至HEK293T或HeLa细胞中。递送uTREM后，将执行30分钟到6小时范围的时程，其中包含一个小时的间隔时间点。然后将细胞用胰蛋白酶消化、洗涤和裂解。使用负载对照TREM和随机RNA寡核苷酸作为对照执行相同的程序。通过蛋白质印迹分析来分析细胞裂解物，并使用针对GCN2路径激活、mTOR路径抑制或自噬诱导的已知读数(包括但不限于磷酸-eIF2a、ATF4、磷酸-ULK1、磷酸-4EBP1、磷酸-eIF2a、磷酸-Akt和磷酸-p70S6K)的抗体探测印迹。总蛋白质装载对照(诸如GAPDH、肌动蛋白或微管蛋白，以及未经修饰(即非磷酸化)的信号传导蛋白(即，使用eIF2a作为磷酸-eIF2a的对照))作为装载对照进行探测。本实例中描述的方法可以用于评价TREM递送后GCN2饥饿信号传导路径、自噬路径的活化和/或mTOR路径的抑制。
实例18：测定未负载的TREM(mTREM)的活性
本实例描述了一种测定，以使用质粒转染然后体外错误负载来测试在细胞系统中产生的mTREM的功能。
在本实例中，尽管mRNA含有突变密码子，但mTREM可以通过在蛋白质中掺入WT氨基酸将突变mRNA翻译为野生型(WT)蛋白质。本实例使用了具有T203I或E222G突变的GFP mRNA分子，它们分别阻止了470nm和390nm波长处的GFP激发。阻止GFP荧光的GFP突变体也可以用作该测定中的报告蛋白。简而言之，使用体外翻译测定，使用含有GFP E222G突变mRNA(GAG→GGG突变)的兔网织红细胞裂解物和过量的mTREM(在这种情况下为tRNA-Glu-CCC)。作为阴性对照，无错误负载的TREM被添加到反应中。本实例中描述的方法可以用于评价mTREM的功能。
实例19：鉴定可以通过TREM调节改善的疾病相关SMC
本实例描述了基于TREM的疗法的含有SMC的蛋白质靶标选择。SMC可以理解为信息沉默的突变，其将密码子序列改为同义密码子，但可能对翻译或翻译后特性有影响。选择方法分为三个渐进选择步骤(1)SMC鉴定，(2)检查tRNA频率和(3)疾病相关性注释。下面更详细地描述这些步骤。
SMC鉴定
所有已知SNP的精选列表被用作SMC选择的起点。在本实例中，将dbSNP NCBI突变数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/和FTP站点ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/ organisms/)过滤以选择SMC，也称为同义SNP(即不会引起氨基酸变化的编码序列中的单核苷酸变化)。简而言之，将突变序列与人基因组(此处为GRCh38p7)进行比对，并将SNPS归类为变体和突变类型，诸如：非编码变体或编码变体；和同义或非同义突变。那些被归类为具有同义突变的编码变体被指定为SMC并进入下一个选择。
tRNA频率的检查
对于每个SMC，鉴定了每个野生型和突变密码子(SMC)的相应tRNA。每个野生型和突变密码子(SMC)的tRNA丰度由tRNA测序数据确定。在本实例中，使用了先前从HEK293T细胞(Zheng等人,Nature Methods[自然-方法]12,835-837(2015))确定的tRNA-seq。在tRNA丰度方面具有差异，例如大差异，诸如>10X变化的SNP将优先进入下一选择。
确定疾病相关性
将SNP ID映射到一组已知的疾病相关SNP以确定哪些SNP具有疾病相关性。在本实例中，我们使用GWAS(全基因组关联研究)(https://www.ebi.ac.uk/gwas/)或类似资源来确定哪些SNP具有已知的疾病相关性。那些具有治疗相关的疾病相关性(例如，致癌的或与神经障碍相关的)的SNP进入下一步骤。
最终选择
经过滤的SMC列表在编码区中含有SMC，这些SMC：(1)不改变氨基酸的编码序列；(2)tRNA总数存在差异，例如大的差异；并且(3)具有疾病相关性。在本实例中，最终选择基于目的疾病，例如胰腺癌进行。例如，已知BCAR1基因与胰腺癌相关，并且具有使密码子CUC变为CUU的SNP(rs7190458)。此编码序列变化引起掺入的TREM发生相应变化。在一些实施例中，突变的掺入TREM具有例如约100倍的丰度降低，使其成为上调和/或改善疾病表型的潜在靶标。
实例20：PNPL3A SMC
使用实例19的方法来鉴定PNPL3A基因中的SMC。PNPL3A基因具有rs738408多态性，该多态性被鉴定为人非酒精性脂肪肝病、纤维化和血清丙氨酸转氨酶升高的诱发因素。rs738408多态性是SMC，因为其位于ORF中并将密码子从CCC变为CCU。CCC和CCU密码子均编码脯氨酸氨基酸，使得在链的该位置处与野生型PNPL3A ORF具有相同的多肽序列。此多肽链是脂联素蛋白。
实例21：TERT SMC
使用实例19的方法来鉴定TERT基因中的SMC。TERT基因具有rs2736098多态性，该多态性被鉴定为人胰腺癌和非小细胞肺癌的易感因素。rs2736098多态性是SMC，因为其位于ORF中并将密码子从GCG变为GCA。GCG和GCA密码子均编码丙氨酸氨基酸，使得在链的该位置处与野生型TERT ORF具有相同的多肽序列。此多肽链是端粒酶逆转录酶蛋白。
实例22：ACHE SMC
使用实例19的方法来鉴定ACHE基因中的SMC。ACHE基因具有rs7636多态性，该多态性被鉴定为亚洲人群的2型糖尿病的易感因素。rs7636多态性是SMC，因为其位于ORF中并将密码子从CCC变为CCT。CCC和CCT密码子均编码脯氨酸氨基酸，使得在链的该位置处与野生型ACHE ORF具有相同的多肽序列。此多肽链是乙酰胆碱酯酶(AChE)蛋白，其为负责将神经递质乙酰胆碱(ACh)水解代谢为胆碱和乙酸酯的主要酶。
实例23：CFTR SMC
使用实例19的方法来鉴定CFTR基因中的SMC。CFTR基因具有rs1042077多态性，该多态性存在于患有CFTR相关障碍的患者中。rs1042077多态性是SMC，因为其位于ORF中并将密码子从ACT变为ACG。ACT和ACG密码子均编码苏氨酸氨基酸，使得在链的该位置处与野生型CFTR ORF具有相同的多肽序列。此多肽链是囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
实例24：MAP3K1 SMC
使用实例19的方法来鉴定MAP3K1基因中的SMC。MAP3K1基因具有rs2229882多态性，该多态性被鉴定为早发性乳腺癌的易感因素。rs2229882多态性是SMC，因为其位于ORF中并将密码子从ACC变为ACT。ACC和ACT密码子均编码苏氨酸氨基酸，使得在链的该位置处与野生MAP3K1ORF具有相同的多肽序列。此多肽链是丝裂原活化蛋白激酶1(MAP3K1)，其是调节ERK和JNK MAPK路径以及转录因子NF-κ-B路径的丝氨酸/苏氨酸激酶。
实例25：通过哺乳动物细胞纯化产生与SMC互补的候选TREM
本实例描述了哺乳动物宿主细胞中TREM的产生。
质粒产生
为了产生包含具有tRNA基因的TREM(在本实例中是tRNA-Ser-AGA)的质粒，按照制造商的说明和标准分子克隆技术，合成含有该tRNA基因(序列为GTAGTCGTGGCCGAGTGGTTAAGGCGATGGACTAGAAATCCATTGGGGTTTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCCGACTACG(SEQ ID NO:192))的至少一个拷贝的DNA片段，并且克隆到具有U6启动子(或任何其他RNA聚合酶III募集启动子)的pLKO.1puro骨架质粒中。
转染
将一(1)mg上述质粒用于以1X 105个细胞/mL转染悬浮适应HEK293T细胞(Freestyle 293-F细胞)的1L培养物。在转染后24、48、72或96小时收获细胞，以确定TREM表达的优化时间点，如通过定量方法诸如Northern印迹分析、定量PCR(q-PCR)或纳米孔测序确定。
纯化
在优化的收获时间点，裂解细胞，并使用诸如苯酚氯仿的方法纯化总RNA。根据制造商的说明，使用小RNA分离试剂盒从裂解物分离小于200个核苷酸的RNA，以产生小RNA(sRNA)级分。
将sRNA级分与退火缓冲液一起孵育，并且使用对应于与所纯化的靶标TREM的独特区域互补的DNA探针的生物素化捕获探针来纯化包含tRNA-Ser-AGA的TREM，在本实例中，该生物素化捕获探针是序列为3'生物素-CCAATGGATTTCTATCCATCGCCTTAACCACTCGGCCACGACTACAAAA(SEQ ID NO:457)的探针。将混合物在90℃下孵育2-3分钟，然后快速冷却至45℃并在45℃下孵育过夜。然后将混合物与预先加热至45℃的结合缓冲液和链霉亲和素缀合的无RNA酶磁珠孵育3小时，使DNA-tRNA复合物与珠结合。然后将混合物添加到磁场分离器架中的预平衡柱中并洗涤4次。通过添加预热至80℃的洗脱缓冲液，然后与药学上可接受的赋形剂混合以制备测试TREM产物，将保留在珠上的TREM洗脱三次。
实例26：通过细菌细胞纯化产生与SMC互补的候选TREM
本实例描述了细菌宿主细胞中TREM的产生。
质粒产生
为了产生在细菌中产生TREM的质粒，如先前在Ponchon等人,Nat Protoc[自然实验手册]4,947-959(2009)中所述合成tRNA基因，在本实例中是含有tRNA-Lys-UUU(序列为GCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCATCAGACTTTTAATCTGAGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCG(SEQID NO:166))的至少一个拷贝的DNA片段，并克隆到细菌tRNA表达载体中。
转化
在不同的细胞密度点，在本实例中OD(600)＝0.5、OD(600)＝0.7、OD(600)＝0.9收获从TREM表达质粒转化的感受态细菌生长的1X109个细菌，以确定TREM表达的最佳点，如通过定量方法诸如Northern印迹分析、定量PCR(q-PCR)或纳米孔测序所确定。
纯化
在优化的收获细胞密度点，TREM按照先前Cayama等人,Nucleic Acids Research.[核酸研究]28(12),e64(2000)中所述进行纯化。简而言之，通过苯酚提取从细胞中回收短RNA(例如tRNA)，并通过乙醇沉淀进行浓缩。然后在高盐条件下通过逐步异丙醇沉淀将沉淀物中的总tRNA与较大的核酸(包括rRNA和DNA)分离。通过探针结合进一步纯化含有TREM的洗脱级分。将TREM级分与退火缓冲液一起孵育，并且使用对应于与所纯化的靶标TREM的独特区域互补的DNA探针的生物素化捕获探针来纯化包含tRNA-Lys-UUU的TREM，在本实例中，该生物素化捕获探针为在3'末端与生物素缀合的序列为CAGAUUAAAAGUCUG(SEQ ID NO:458)的探针。将混合物在90℃下孵育2-3分钟，然后快速冷却至45℃并在45℃下孵育过夜。然后将混合物与预先加热至45℃的结合缓冲液和链霉亲和素缀合的无RNA酶磁珠孵育3小时，使DNA-tRNA复合物与珠结合。然后将混合物添加到磁场分离器架中的预平衡柱中并洗涤4次。通过添加预热至80℃的洗脱缓冲液，然后与药学上可接受的赋形剂混合以制备测试TREM产物，将保留在珠上的TREM洗脱三次。
实例27：通过化学合成产生与SMC互补的候选TREM
本实例描述了使用化学合成进行的TREM的产生。
化学合成TREM，在本实例中是tRNA-Thr-CGT，其序列为GGCUCUAUGGCUUAGUUGGUUAAAGCGCCUGUCUCGUAAACAGGAGAUCCUGGGUUCGACUCCCAGUGGGGCCUCAA(SEQ ID NO:459)。如先前例如在Zlatev等人,(2012)Current Protocols[实验室指南],50(1),1.28.1-1.28.16中所述，通过使用亚磷酰胺化学法进行固相化学合成产生此TREM。简而言之，将经保护的RNA亚磷酰胺按所需顺序依次添加到固定在固体支持物(例如，可控孔径玻璃)上的生长链中。各添加循环具有多个步骤，包括：(i)使保护生长链的5'-羟基的DMT基团去阻断，(ii)使生长链与进入的亚磷酰胺结构单元偶联，(iii)向仍具有5'-羟基的任何链分子，即未能与所需进入的结构单元偶联的任何链分子加帽，以及(iv)氧化新形成的三配位亚磷酸三酯键。在最终的结构单元偶联和氧化后，将该链从固体支持物切割下来，去除除保护5'-羟基的DMT基团之外的所有保护基。然后通过RP-HPLC(例如，DMT-on纯化)纯化该链，并将含有该链的级分在酸性条件下进行DMT基团去保护，得到最终的TREM。TREM将具有5'-磷酸酯和3'-OH。然后将TREM与药学上可接受的赋形剂混合以制备测试TREM产物。
如果TREM需要负载，则使用氨酰基tRNA合成酶在体外氨酰化通过化学合成反应产生的TREM，如先前在Stanley,Methods Enzymol[酶学方法]29:530-547(1974)中所述。简而言之，将TREM在37℃下与其合成酶和其同源氨基(在本实例中，分别是苏氨酰基-tRNA合成酶和苏氨酸)一起孵育30min，然后进行苯酚提取，使用Nuc-trap柱过滤并进行乙醇沉淀。然后将TREM与药学上可接受的赋形剂混合以制备测试TREM产物。
实例28：通过体外转录产生与SMC互补的候选TREM
本实例描述了使用体外转录(IVT)进行的TREM的产生。
如先前在Pestova等人,RNA 7(10):1496-505(2001)中所述，使用体外转录产生TREM，在本实例中是tRNA-Leu-CAA，其序列为GUCAGGAUGGCCGAGUGGUCUAAGGCGCCAGACUCAAGUUCUGGUCUCCGUAUGGAGGCGUGGGUUCGAAUCCCACUUCUGACA(SEQ ID NO:460)。简而言之，将依序含有噬菌体T7启动子和tRNA-Leu-CAA基因序列的DNA质粒线性化，并在37℃下在体外用T7RNA聚合酶转录45min，然后苯酚提取，使用Nuc-trap柱过滤并进行乙醇沉淀。然后将TREM与药学上可接受的赋形剂混合以制备测试TREM产物。
如果TREM需要负载，则使用氨酰基tRNA合成酶在体外氨酰化通过IVT反应产生的TREM，如先前在Stanley,Methods Enzymol[酶学方法]29:530-547(1974)中所述。简而言之，将TREM在37℃下与其合成酶和其同源氨基(在本实例中，分别是亮氨酰基-tRNA合成酶和亮氨酸)一起孵育30min，然后进行苯酚提取，使用Nuc-trap柱过滤并进行乙醇沉淀。然后将TREM与药学上可接受的赋形剂混合以制备测试TREM产物。
实例29：通过向细胞施用TREM来调节tRNA池
本实例描述了将TREM施用于细胞以调节细胞中的tRNA池。
如先前在Nature Methods[自然-方法]3,67-68(2006)中所述，将如实例25-28中产生的TREM通过电穿孔递送至细胞中。简而言之，将106-107个细胞(在本实例中是人上皮MCF10A细胞)转移到电穿孔比色皿中，并在添加1-30ug TREM后轻轻混合，该TREM在本实例中是tRNA-Thr-CGT，序列为GGCUCUAUGGCUUAGUUGGUUAAAGCGCCUGUCUCGUAAACAGGAGAUCCUGGGUUCGACUCCCAGUGGGGCCUCAA(SEQ ID NO:459)。将比色皿转移到电穿孔仪并将装置放电(使用200-350V的电压)。将比色皿置于冰上，将电穿孔的细胞转移到具有完全培养基的培养皿中，并转移到孵育箱中维持24-48hr。
递送后，可以通过诸如纳米孔测序、tRNA测序、Northern印迹分析或定量RT-PCR的方法来定量tRNA池的变化。在本实例中，如先前在Sadaoka等人,Nature Communications[自然-通讯](2019)10,754中所述使用Oxford纳米孔引导的RNA测序监测tRNA池变化。
简而言之，裂解TREM转染的细胞，并使用诸如苯酚氯仿的方法纯化总RNA。根据制造商的说明，使用小RNA分离试剂盒从裂解物分离小于200个核苷酸的RNA，以产生小RNA(sRNA)级分。
在37℃下使用100mM Tris-HCl(pH 9.0)将sRNA级分去酰化30分钟。通过添加等体积的100mM乙酸钠/乙酸(pH 4.8)和100mM NaCl中和溶液，然后进行乙醇沉淀。将去酰化的sRNA溶解在水中，并通过琼脂糖凝胶电泳验证其完整性。然后按照制造商的说明使用酵母poly(A)加尾试剂盒对去酰化的sRNA进行聚腺苷酸化，产生sRNA聚腺苷酸化池。聚腺苷酸化后，使用SuperScript III逆转录酶(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))或对RNA结构和修饰不太敏感的热稳定组II内含子RT(TGIRT，InGex有限公司(InGex LLC))进行逆转录反应，产生cDNA。按照Oxford纳米孔的标准方案，通过将cDNA混合物与RNA接头、T4连接酶和连接缓冲液一起孵育，将测序接头连接到cDNA混合物上。然后对文库进行纳米孔测序，并将序列映射到基因组数据库，在本实例中映射到基因组tRNA数据库GtRNAdb。本实例中描述的方法可以用于评价与未施用TREM的细胞相比，施用TREM的细胞中的tRNA池。
实例30：通过使用脂质体向细胞施用TREM来调节tRNA池
本实例描述了使用脂质体囊泡将TREM施用于细胞以调节细胞中的tRNA池。
将如实例25-28中产生的TREM在囊泡或其他基于脂质的载剂诸如脂质体或脂质纳米颗粒中递送至细胞。在本实例中，按照制造商的说明，使用脂质体试剂盒(来自西格玛公司(Sigma)或其他供应商)制备含有TREM的脂质体，该TREM在本实例中是tRNA-Thr-CGT，其序列为GGCUCUAUGGCUUAGUUGGUUAAAGCGCCUGUCUCGUAAACAGGAGAUCCUGGGUUCGACUCCCAGUGGGGCCUCAA(SEQ ID NO:459)。在本实例中使用人细胞系HEK293T。在转染当天接种细胞以获得70％-80％汇合。在转染前30分钟将培养基替换为无血清培养基，之后将脂质体添加至细胞培养基中。
递送后，可以通过诸如纳米孔测序、tRNA测序(Zheng等人,Nature Methods[自然-方法]12,835-837(2015))、Northern印迹分析或定量RT-PCR的方法来定量tRNA池的变化。在本实例中，使用tRNA测序监测tRNA池变化。简而言之，裂解TREM转染的细胞，并使用诸如苯酚氯仿的方法纯化总RNA。根据制造商的说明，使用小RNA分离试剂盒从裂解物分离小于200个核苷酸的RNA，以产生小RNA(sRNA)级分。
用去甲基酶混合物处理sRNA级分以去除位于Watson-Crick面处的m1A、m1G和m3C修饰。tRNA池去甲基化后，使用对tRNA结构不太敏感的热稳定组II内含子RT(TGIRT)从tRNA产生cDNA文库。此逆转录酶在无需连接RNA的情况下通过模板转换将RNA测序接头添加到tRNA。然后对从tRNA产生的文库进行Illumina测序，并将序列读段映射到基因组数据库，在本实例中映射到基因组tRNA数据库GtRNAdb。本实例中描述的方法可以用于评价与未施用TREM的细胞相比，施用TREM的细胞中的tRNA池。
实例31：通过向细胞递送TREM编码质粒来调节tRNA池
本实例描述了将TREM编码质粒递送至细胞以调节细胞中的tRNA池。
通过使用基于囊泡的载剂递送TREM编码质粒在细胞中表达TREM。为了在人细胞中表达TREM，产生含有tRNA基因的质粒，该tRNA基因在本实例中是tRNA-Gly-GCC，其序列为GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCTGCCACGCGGGAGGCCCGGGTTCGATTCCCGGCCAATGCA(SEQ IDNO:108)。使用DNA片段的无缝组装(在本实例中使用NEBuilder HiFi组装主混合物(NEBuilder HiFi Assembly Master Mix))产生质粒，其中线性化的目的哺乳动物表达载体，在本实例中是通过PpuMI酶限制线性化的pLKO.1-puro-turboGFP，与含有tRNA基因的DNA片段融合。本实例中的DNA片段按5'至3'的顺序包括以下元件：来自载体线性化位点3'末端的长度为25个核苷酸的序列、U6启动子、tRNA序列、RNA聚合酶III终止信号、来自载体线性化位点5'末端的长度为25个核苷酸的序列。
制备质粒后，按照制造商的说明，使用Lipofactamine 3000用TREM编码质粒转染人细胞系，在本实例中是HEK293T。递送后，可以通过诸如纳米孔测序、tRNA测序(Zheng等人,Nature Methods[自然-方法]12,835-837(2015))、Northern印迹分析或定量RT-PCR的方法来定量tRNA池的变化。在本实例中，使用tRNA测序监测tRNA池变化。简而言之，裂解TREM转染的细胞，并使用诸如苯酚氯仿的方法纯化总RNA。根据制造商的说明，使用小RNA分离试剂盒从裂解物分离小于200个核苷酸的RNA，以产生小RNA(sRNA)级分。
用去甲基酶混合物处理sRNA级分以去除位于Watson-Crick面处的m1A、m1G和m3C修饰。tRNA池去甲基化后，使用对tRNA结构不太敏感的热稳定组II内含子RT(TGIRT)从tRNA产生cDNA文库。此逆转录酶在无需连接RNA的情况下通过模板转换将RNA测序接头添加到tRNA。然后对从tRNA产生的文库进行Illumina测序，并将序列读段映射到基因组数据库，在本实例中映射到基因组tRNA数据库GtRNAdb。本实例中描述的方法可以用于评价与未施用TREM的细胞相比，施用TREM的细胞中的tRNA池。
实例32：通过向细胞递送编码TREM的病毒载体来调节tRNA池
本实例描述了将TREM编码病毒载体递送至细胞以调节细胞中的tRNA池。
通过递送TREM编码病毒载体在细胞中表达TREM。在本实例中，使用编码TREM的慢病毒包装和递送系统。简而言之，通过首先产生包含TREM的质粒构建TREM编码病毒载体，在本实例中该TREM是tRNA-Gly-GCC，其序列为GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCTGCCACGCGGGAGGCCCGGGTTCGATTCCCGGCCAATGCA(SEQ ID NO:108)。使用DNA片段的无缝组装产生质粒，其中将pLKO.1-puro-turboGFP线性化载体与含有该tRNA序列的DNA片段连接，如实例31所述。为了制备表达TREM的慢病毒，根据制造商的说明使用Lipofectamine 3000将HEK293T细胞用以下进行共转染：3μg的每种包装载体(pRSV-Rev、pCMV-VSVG-G和pCgpV)和9μg包含TREM的序列的质粒。24小时后，将培养基更换为新鲜的不含抗生素的培养基，48小时后，收集含病毒的上清液并以2000rpm离心10分钟，然后通过0.45μm过滤器过滤。
然后用该病毒感染目的细胞。在本实例中，在8μg/mL聚凝胺存在下，使用制备的2mL病毒转导100,000个HeLa细胞。转导后四十八小时，与未转导的对照细胞群一起进行2-7天的嘌呤霉素(puromycin)(2μg/mL)抗生素选择以选择在基因组中整合TREM以进行表达的细胞。
可以通过诸如纳米孔测序、tRNA测序(Zheng等人,Nature Methods[自然-方法]12,835-837(2015))、Northern印迹分析或定量RT-PCR的方法来定量tRNA池的变化。在本实例中，使用定量RT-PCR(Korniy等人,Nucleic Acids Research[核酸研究](2019),gkz202)监测tRNA池变化。简而言之，裂解TREM转染的细胞，并使用诸如苯酚氯仿的方法纯化总RNA。根据制造商的说明，使用小RNA分离试剂盒从裂解物分离小于200个核苷酸的RNA，以产生小RNA(sRNA)级分。
用去甲基酶混合物处理sRNA级分以去除位于Watson-Crick面处的m1A、m1G和m3C修饰。去甲基化后，使用与目的tRNA的3'-末端互补的茎环接头将池逆转录为cDNA。在此步骤中，使用Superscript III第一链合成系统(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))进行逆转录(RT)。然后根据制造商的方案，用与目的tRNA编码的cDNA区域互补的正向引物和与RT期间附加的茎环接头互补的通用引物，使用QuantiTect SYBR Green试剂盒(凯杰公司(Qiagen))进行定量PCR。本实例中描述的方法可以用于评价与未施用TREM的细胞相比，施用TREM的细胞中可与CGT密码子配对的甘氨酸指定分子的水平。
实例33：测试TREM施用对含有SMC的ORF的影响的系统
本实例描述了一种系统，在本实例中是细胞系，其表达含有SMC的ORF来研究TREM施用的影响。
为了研究TREM施用对含有SMC的ORF的影响，在本实例中对MAP3K1基因的rs2229882多态性的影响，由CRISPR-Cas基因组编辑已建立的细胞系，在本实例中，人乳房上皮细胞，诸如MCF10A或184A1细胞，以敲除目的内源基因，在本实例中MAP3K1基因的表达。如先前所述(例如Bauer等人,J.Vis.Exp.[视觉实验杂志],(95),doi:10.3791/52118(2015))，使用CRISPR-Cas9系统在MAP3K1的编码外显子中插入1bp以引起移码突变来产生MAP3K1敲除细胞。简而言之，使用预测用于基因组编辑的最有效引导RNA的在线设计工具，例如https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design来选择含有20个碱基对(bp)靶标序列的高分引导RNA(gRNA)，该引导RNA最小化基因组匹配以降低脱靶位点裂解的风险。在本实例中，靶向序列是CAGTGTGTGAAGACGGCTGC(SEQ ID NO:461)。将该靶向序列克隆到pSpCas9(BB)质粒(pX330)(Addgene质粒ID 42230)中。将HEK293T细胞用靶向MAP3K1的CRISPR/Cas9构建体和用于克隆选择的嘌呤霉素表达构建体瞬时转染。第二天，用嘌呤霉素筛选细胞2天，然后亚克隆以形成单菌落。通过PCR筛选鉴定MAP3K1 KO克隆。通过使用针对MAP3K1的抗体进行qPCR和免疫印迹分析来验证获得的克隆。
产生后，使用此细胞系通过瞬时质粒转染或通过稳定的慢病毒转导方法来过表达WT或含有SMC的mRNA。然后将目的TREM施用于每个细胞系，并使用诸如实例19-24中所述的测定评定与WT ORF相比其对含有SMC的ORF的影响。
实例34：确定施用TREM影响了含有SMC的ORF的蛋白质表达水平本实例描述了施用TREM以改变含有SMC的ORF的表达水平。
为了产生用于研究TREM施用对含有SMC的蛋白质(在本实例中，来自编码脂联素的PNPL3A基因)的蛋白质表达水平的影响的系统，将含有PNPL3A rs738408ORF序列的质粒转染到正常人肝细胞的细胞系THLE-3中，该细胞系由CRISPR/Cas编辑以在PNPLA3的编码外显子中含有移码突变以敲除内源PNPLA3(THLE-3_PNPLA3KO细胞)。作为对照，用含有野生型PNPL3A ORF序列的质粒转染THLE-3_PNPLA3KO细胞的等分试样。
将TREM递送至含有rs738408ORF序列的THLE-3_PNPLA3KO细胞中以及含有野生型PNPL3A ORF序列的THLE-3_PNPLA3KO细胞中。在本实例中，TREM含有具有AGG反密码子的脯氨酸同工受体，该AGG反密码子与CCT密码子碱基配对，即该TREM的序列为GGCUCGUUGGUCUAGGGGUAUGAUUCUCGCUUAGGGUGCGAGAGGUCCCGGGUUCAAAUCCCGGACGAGCCC(SEQ ID NO:462)。执行30分钟至6小时范围内的时程，其中包含长度为一个小时的间隔时间点。在各时间点，将细胞胰蛋白酶化、洗涤并裂解。通过Western印迹分析来分析细胞裂解物，并用针对脂联素蛋白的抗体探测印迹。还探测了总蛋白装载对照，诸如GAPDH、肌动蛋白或微管蛋白，作为装载对照。
本实例中描述的方法可以用于评价脂联素蛋白在含有rs738408ORF的细胞中的表达水平。
实例35：施用TREM以改变含有SMC的ORF的蛋白质翻译速率
本实例描述了施用TREM以改变含有SMC的ORF的蛋白质翻译速率。
为了监测TREM添加对翻译延伸速率的影响，使用一种体外翻译系统，在本实例中是来自普洛麦格公司(Promega)的RRL系统，其中报告基因(在本实例中是GFP)的荧光随时间的变化是翻译速率的替代指标。首先，产生了使用反义寡核苷酸耗尽内源tRNA的兔网织红细胞裂解物，该反义寡核苷酸靶向反密码子和可变环之间的序列(参见，例如，Cui等人,2018.Nucleic Acids Res[核酸研究].46(12):6387-6400)。在本实例中，除0.1-0.5ug/uL编码通过接头与GFP ORF融合的野生型TERT ORF的mRNA或编码通过接头与GFP ORF融合的rs2736098TERT ORF的mRNA之外，将TREM添加到体外翻译测定裂解物中，该TREM包含含有UGC反密码子的丙氨酸同工受体，该UGC反密码子与GCA密码子碱基配对，即该TREM的序列为GGGGAUGUAGCUCAGUGGUAGAGCGCAUGCUUUGCAUGUAUGAGGUCCCGGGUUCGAUCCCCGGCAUCUCCA(SEQID NO:463)。通过在37℃下使用λex485/λem528的酶标仪上的荧光增加监测GFP mRNA翻译的进程，其中数据点在1小时内每30秒收集一次。绘制荧光随时间的变化量以确定与添加和不添加TREM的rs2736098ORF相比野生型ORF的翻译延伸速率。本实例中描述的方法可以用于评价rs2736098ORF和野生型ORF在存在或不存在TREM的情况下的翻译速率。
实例36：确定调节与SMC互补的TREM改变了来源于含有SMC的ORF的蛋白质的功能
本实例描述了施用TREM以改变含有SMC的ORF的功能。
使用体外翻译(IVT)系统(诸如来自普洛麦格公司(Promega)的RRL系统)，野生型和含有SMC的mRNA在存在和不存在TREM的情况下翻译。在本实例中，含有SMC的基因是编码乙酰胆碱酯酶蛋白的AChE，并且TREM含有具有AGG反密码子的脯氨酸同工受体，该AGG反密码子与CCU密码子碱基配对，即该TREM的序列为GGCUCGUUGGUCUAGGGGUAUGAUCUCGCUUAGGGUGCGAGAGGUCCCGGGUUCAAAUCCCGGACGAGCCC(SEQ ID NO:464)。
为了判定添加TREM是否会改变含有SMC的蛋白质(在本实例中是乙酰胆碱酯酶蛋白)的功能活性，使用如下的功能测定，该功能测定使用DTNB来定量AChE水解乙酰硫胆碱产生的硫胆碱。简而言之，将翻译反应物与试剂盒AChE反应混合物一起在室温下孵育10-30分钟，之后使用DTNB加合物在OD 410nm下的吸收强度来测量形成的硫胆碱的量，该量与AChE活性成正比。本实例中描述的方法可以用于评价由rs7636 AChE mRNA或野生型AChE mRNA翻译产生的蛋白质的AChE活性。
实例37：确定调节与SMC互补的TREM改变了来源于含有SMC的ORF的蛋白质的定位
本实例描述了施用TREM以改变含有SMC的ORF的定位。
为了产生用于研究TREM施用对含有SMC的ORF的蛋白质定量的影响的系统，将含有标记有报告基因，诸如GFP或myc的CFTR rs1042077ORF序列的质粒转染到人肺上皮细胞系MRC-5中。作为对照，将含有标记有报告基因的野生型CFTR ORF序列的质粒同时转染到MRC-5细胞中。
为了判定TREM添加是否会改变CFTR的定位，将细胞接种在盖玻片上，并且24小时后用与CFTR SMC互补的TREM或对照TREM转染。在本实例中，与CFTR SMC互补的TREM包含含有CGU反密码子的苏氨酸同工受体，该反密码子与ACG密码子碱基配对，即该TREM的序列为GGCUCUGUGGCUUAGUUGGCUAAAGCGCCUGUCUCGUAAACAGGAGAUCCUGGGUUCGAAUCCCAGCGGGGCCU(SEQ ID NO:465)。对照TREM由扰乱序列或苏氨酸序列组成，其中TREM的5'末端已改变以防止负载。24小时后，将细胞固定，针对CFTR及其报告基因染色，并在显微镜下观察。本实例中描述的方法可以用于评价野生型CFTR和rs1042077CFTR的定位。
实例38：确定调节与SMC互补的TREM改变了从含有SMC的ORF翻译的蛋白质的折叠
本实例描述了施用TREM以改变含有SMC的ORF的折叠。
质粒产生和转染
为了鉴定引起蛋白质错误折叠的SMC，遵循制造商的说明和标准分子克隆技术合成含有SMC-ORF的蛋白质，在本实例中是rs7190458BCAR1ORF，并克隆到含有CMV启动子(或任何其他哺乳动物启动子)和纯化标签(在本实例中是FLAG标签(DYKDDDDK表位(SEQ IDNO:466)))的质粒中。此处使用pFLAG-CMV-1质粒。该质粒在人HeLa细胞系中转染。将在本实例中包含含有UUG反密码子的亮氨酸同工受体的TREM也转染到HeLa细胞中，该反密码子与CUU密码子碱基配对，即该TREM的序列为GGUAGCGUGGCCGAGCGGUCUAAGGCGCUGGAUUAAGGCUCCAGUCUCUUCGGAGGCGUGGGUUCGAAUCCCACCGCUGCCA(SEQ ID NO:467)。作为对照，用仅含有SMCBCAR1 ORF的质粒转染BCAR1 KO细胞，并分别用含有野生型BCAR1 ORF序列的质粒转染。
纯化
在优化的收获时间点，在本实例中是转染后72小时，裂解细胞，并以12,000x g离心10分钟。将上清液在重力流下装载到预先填充并平衡的抗flag填充M2-琼脂糖柱上。用10-20个柱体积的TBS(Tris HCl、NaCl)或用含盐缓冲液洗涤该柱。为了从珠粒洗脱FLAG标记的蛋白质，将珠粒与FLAG标记的肽一起孵育。使洗脱液在SDS-PAGE凝胶上运行以进行纯度质量控制。此纯化在存在和不存在TREM的情况下对用WT BCAR1 ORF和SMC BCAR1 ORF转染的细胞进行。
蛋白质折叠的初步检查
为了检查蛋白质折叠的影响，使用热熔法监测来源于WT和含有SMC的ORF的经纯化蛋白质的稳定性。在本实例中，使用具有荧光染料(Sypro Orange)的差分扫描荧光法(DSF)，该DSF测量嵌入剂染料与未折叠蛋白质的结合的变化。蛋白质折叠的改变引起热熔曲线变化。使用此方法，将添加和不添加TREM下来源于SMC ORF的蛋白质与对照野生型BCAR1比较。本实例中描述的方法可以用于评价来源于含有SMC的ORF的蛋白质的热熔曲线。
实例39：确定调节与SMC互补的TREM改变了由含有SMC的ORF翻译产生的细胞表型
本实例描述了施用TREM以改变含有SMC的ORF的细胞表型。
为了产生用于研究TREM施用对细胞过程(在本实例中，对细胞迁移)的影响的系统，将包含含有SMC的ORF(在本实例中是rs7190458BCAR1ORF序列)的质粒转染到人胰腺癌细胞系PANC-1中，其中已经使用CRISPR/Cas敲除BCAR1。作为对照，用含有WT BCAR1 ORF序列的质粒转染PANC-1BCAR1 KO细胞。
将在本实例中包含含有UUG反密码子的亮氨酸同工受体的TREM递送至PANC-1细胞中，该反密码子与CUU密码子碱基配对，即该TREM的序列为GGUAGCGUGGCCGAGCGGUCUAAGGCGCUGGAUUAAGGCUCCAGUCUCUUCGGAGGCGUGGGUUCGAAUCCCACCGCUGCCA(SEQ ID NO:467)。使用对照TREM的递送作为对照，该对照TREM含有扰乱序列或亮氨酸序列，其中TREM的5'末端已经改变以防止负载。使细胞在单层中生长至80％汇合，并用新的1ml移液管尖端划过孔中心。将细胞冲洗两次以去除浮动细胞，并补充培养基。48小时后，将细胞固定并用结晶紫染色。拍摄染色的单层，并定量间隙距离。本实例中描述的方法可以用于评价施用TREM的细胞的迁移表型。
实例40：调节TREM以改善由含有SMC的ORF翻译引起的疾病状态。
本实例描述了增加TREM水平以改善由含有SMC的ORF引起的疾病状态。
为了产生用于研究TREM施用对疾病状态(在本实例中，对乳腺癌发作)的影响的系统，将包含含有SMC的ORF(在本实例中是rs2229882MAP3K1ORF序列)的质粒转染到人非转化乳腺癌细胞系MCF10A中，其中已经使用CRISPR/Cas敲除MAP3K1。作为对照，用含有野生型MAP3K1 ORF序列的质粒转染MCF10A MAP3K1 KO细胞。
将在本实例中包含含有AGU反密码子的苏氨酸同工受体的TREM递送至MCF10A细胞中，该反密码子与ACU密码子碱基配对，即该TREM的序列为GGCGCCGUGGCUUAGUUGGUUAAAGCGCCUGUCUAGUAAACAGGAGAUCCUGGGUUCGAAUCCCAGCGGUGCCU(SEQ ID NO:468)。使用对照TREM的递送作为对照，该对照TREM含有扰乱序列或苏氨酸序列，其中TREM的5'末端已经改变以防止负载。通过使用针对ERK和JNK激酶的磷酸化状态的抗体进行Western印迹分析来监测细胞的MAPK信号传导增加。总蛋白质装载对照(诸如GAPDH、肌动蛋白或微管蛋白，以及未经修饰(即非磷酸化)的信号传导蛋白(即，使用ERK作为磷酸-ERK的对照))作为装载对照进行探测。还使用标准增殖和transwell侵袭测定来监测细胞的细胞增殖和侵袭。为了监测乳腺癌进展，将细胞皮下注射或注射到SCID小鼠的乳腺脂肪垫中，并且每天使用卡尺监测肿瘤体积以测量一种或多种肿瘤的长度、宽度和高度。本实例中描述的方法可以用于评价肿瘤表型。
序列表
<110> 旗舰创业股份有限公司（FLAGSHIP PIONEERING, INC.）
<120> TREM组合物用以调节tRNA池的用途
<130> F2099-7001WO
<140>
<141>
<150> 62/855,561
<151> 2019-05-31
<160> 468
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
gggggtatag ctcagtggta gagcgcgtgc ttagcatgca cgaggtcctg ggttcgatcc 60
ccagtacctc ca 72
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<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
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ggggaattag ctcaagtggt agagcgcttg cttagcacgc aagaggtagt gggatcgatg 60
cccacattct cca 73
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<212> DNA
<213> 智人
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ggggaattag ctcaaatggt agagcgctcg cttagcatgc gagaggtagc gggatcgatg 60
cccgcattct cca 73
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<212> DNA
<213> 智人
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ggggaattag ctcaagtggt agagcgcttg cttagcatgc aagaggtagt gggatcgatg 60
cccacattct cca 73
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<212> DNA
<213> 智人
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ggggaattag ctcaagcggt agagcgcttg cttagcatgc aagaggtagt gggatcgatg 60
cccacattct cca 73
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
ggggaattag ctcaagtggt agagcgcttg cttagcatgc aagaggtagt gggatcaatg 60
cccacattct cca 73
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<212> DNA
<213> 智人
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ggggaattag ctcaagtggt agagcgctcg cttagcatgc gagaggtagt gggatcgatg 60
cccgcattct cca 73
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<212> DNA
<213> 智人
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ggggaattag cccaagtggt agagcgcttg cttagcatgc aagaggtagt gggatcgatg 60
cccacattct cca 73
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<212> DNA
<213> 智人
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gggggtgtag ctcagtggta gagcgcgtgc ttagcatgca cgaggccccg ggttcaatcc 60
ccggcacctc ca 72
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<212> DNA
<213> 智人
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gggggtgtag ctcagtggta gagcgcgtgc ttagcatgta cgaggtcccg ggttcaatcc 60
ccggcacctc ca 72
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<212> DNA
<213> 智人
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ggggatgtag ctcagtggta gagcgcatgc ttagcatgca tgaggtcccg ggttcgatcc 60
ccagcatctc ca 72
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
gggggtgtag ctcagtggta gagcgcgtgc ttagcatgca cgaggccctg ggttcaatcc 60
ccagcacctc ca 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
gggggtatag ctcagcggta gagcgcgtgc ttagcatgca cgaggtcctg ggttcaatcc 60
ccaatacctc ca 72
<210> 14
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 14
gggggtgtag ctcagtggta gagcgcgtgc ttagcatgca cgaggccccg ggttcaatcc 60
ctggcacctc ca 72
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<212> DNA
<213> 智人
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gggggattag ctcaaatggt agagcgctcg cttagcatgc gagaggtagc gggatcgatg 60
cccgcatcct cca 73
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 16
ggggaattag ctcaggcggt agagcgctcg cttagcatgc gagaggtagc gggatcgacg 60
cccgcattct cca 73
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
ggggatgtag ctcagtggta gagcgcatgc ttcgcatgta tgaggtcccg ggttcgatcc 60
ccggcatctc ca 72
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 18
ggggatgtag ctcagtggta gagcgcatgc ttcgcatgta tgaggccccg ggttcgatcc 60
ccggcatctc ca 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 19
ggggatgtag ctcagtggta gagcgcgcgc ttcgcatgtg tgaggtcccg ggttcaatcc 60
ccggcatctc ca 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 20
gggggtgtag ctcagtggta gagcgcgtgc ttcgcatgta cgaggccccg ggttcgaccc 60
ccggctcctc ca 72
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 21
gggggtgtag ctcagtggta gagcgcatgc tttgcatgta tgaggtcccg ggttcgatcc 60
ccggcacctc ca 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 22
ggggatgtag ctcagtggta gagcgcatgc tttgcatgta tgaggtcccg ggttcgatcc 60
ccggcatctc ca 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 23
ggggatgtag ctcagtggta gagcgcatgc tttgcatgta tgaggccccg ggttcgatcc 60
ccggcatctc ca 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 24
ggggatgtag ctcagtggta gagcgcatgc tttgcacgta tgaggccccg ggttcaatcc 60
ccggcatctc ca 72
<210> 25
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 25
gggggtgtag ctcagtggta gagcgcatgc tttgcatgta tgaggcctcg ggttcgatcc 60
ccgacacctc ca 72
<210> 26
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 26
gggggtgtag ctcagtggta gagcacatgc tttgcatgtg tgaggccccg ggttcgatcc 60
ccggcacctc ca 72
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<211> 71
<212> DNA
<213> 智人
<400> 27
gggggtgtag ctcagtggta gagcgcatgc tttgcatgta tgaggcctcg gttcgatccc 60
cgacacctcc a 71
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<212> DNA
<213> 智人
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gggccagtgg cgcaatggat aacgcgtctg actacggatc agaagattcc aggttcgact 60
cctggctggc tcg 73
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<212> DNA
<213> 智人
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gggccagtgg cgcaatggat aacgcgtctg actacggatc agaagattct aggttcgact 60
cctggctggc tcg 73
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<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 30
ggccgcgtgg cctaatggat aaggcgtctg attccggatc agaagattga gggttcgagt 60
cccttcgtgg tcg 73
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<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 31
gacccagtgg cctaatggat aaggcatcag cctccggagc tggggattgt gggttcgagt 60
cccatctggg tcg 73
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<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 32
gccccagtgg cctaatggat aaggcactgg cctcctaagc cagggattgt gggttcgagt 60
cccacctggg gta 73
<210> 33
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 33
gccccagtgg cctaatggat aaggcactgg cctcctaagc cagggattgt gggttcgagt 60
cccacctggg gtg 73
<210> 34
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 34
gccccggtgg cctaatggat aaggcattgg cctcctaagc cagggattgt gggttcgagt 60
cccacccggg gta 73
<210> 35
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 35
gccccagtgg cctaatggat aaggcattgg cctcctaagc cagggattgt gggttcgagt 60
cccatctggg gtg 73
<210> 36
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 36
gccccagtgg cctgatggat aaggtactgg cctcctaagc cagggattgt gggttcgagt 60
tccacctggg gta 73
<210> 37
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 37
ggccgcgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcggatc agaagattgc aggttcgagt 60
cctgccgcgg tcg 73
<210> 38
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 38
gaccacgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcggatc agaagattga gggttcgaat 60
ccctccgtgg tta 73
<210> 39
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 39
gaccgcgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcggatc agaagattga gggttcgagt 60
cccttcgtgg tcg 73
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<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 40
gaccacgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcggatc agaagattga gggttcgaat 60
cccttcgtgg tta 73
<210> 41
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 41
gaccacgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcggatc agaagattga gggttcgaat 60
cccttcgtgg ttg 73
<210> 42
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 42
ggccgtgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcggatc aaaagattgc aggtttgagt 60
tctgccacgg tcg 73
<210> 43
<211> 85
<212> DNA
<213> 智人
<400> 43
ggctccgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttctagag gctgaaggca ttcaaaggtt 60
ccgggttcga gtcccggcgg agtcg 85
<210> 44
<211> 88
<212> DNA
<213> 智人
<400> 44
ggctctgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttctagtg acgaatagag caattcaaag 60
gttgtgggtt cgaatcccac cagagtcg 88
<210> 45
<211> 91
<212> DNA
<213> 智人
<400> 45
ggctctgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttctagct gagcctagtg tggtcattca 60
aaggttgtgg gttcgagtcc caccagagtc g 91
<210> 46
<211> 86
<212> DNA
<213> 智人
<400> 46
ggctctgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttctagat agttagagaa attcaaaggt 60
tgtgggttcg agtcccacca gagtcg 86
<210> 47
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 47
gtctctgtgg cgcaatggac gagcgcgctg gacttctaat ccagaggttc cgggttcgag 60
tcccggcaga gatg 74
<210> 48
<211> 87
<212> DNA
<213> 智人
<400> 48
ggctctgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttctagcc taaatcaaga gattcaaagg 60
ttgcgggttc gagtccctcc agagtcg 87
<210> 49
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 49
gtctctgtgg cgcaatcggt tagcgcgttc ggctgttaac cgaaaggttg gtggttcgat 60
cccacccagg gacg 74
<210> 50
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 50
gtctctgtgg cgcaatcggc tagcgcgttt ggctgttaac taaaaggttg gcggttcgaa 60
cccacccaga ggcg 74
<210> 51
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 51
gtctctgtgg tgcaatcggt tagcgcgttc cgctgttaac cgaaagcttg gtggttcgag 60
cccacccagg gatg 74
<210> 52
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 52
gtctctgtgg cgcaatcggc tagcgcgttt ggctgttaac taaaaagttg gtggttcgaa 60
cacacccaga ggcg 74
<210> 53
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 53
gtctctgtgg cgcaatcggt tagcgcgttc ggctgttaac cgaaaggttg gtggttcgag 60
cccacccagg gacg 74
<210> 54
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 54
gtctctgtgg cgcaatcggt tagcgcattc ggctgttaac cgaaaggttg gtggttcgag 60
cccacccagg gacg 74
<210> 55
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 55
gtctctgtgg cgcaatcggt tagcgcgttc ggctgttaac cgaaagattg gtggttcgag 60
cccacccagg gacg 74
<210> 56
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 56
gtctctgtgg cgcaatcggt tagcgcgttc ggctgttaac tgaaaggttg gtggttcgag 60
cccacccagg gacg 74
<210> 57
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 57
gtctctgtgg cgcaatgggt tagcgcgttc ggctgttaac cgaaaggttg gtggttcgag 60
cccatccagg gacg 74
<210> 58
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 58
gtctctgtgg cgtagtcggt tagcgcgttc ggctgttaac cgaaaagttg gtggttcgag 60
cccacccagg aacg 74
<210> 59
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 59
gtctctgtgg cgcaatcggc tagcgcgttt ggctgttaac taaaaggttg gtggttcgaa 60
cccacccaga ggcg 74
<210> 60
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 60
gtctctgtgg cgcaatcggt tagcgcgttc ggctgttaac tgaaaggtta gtggttcgag 60
cccacccggg gacg 74
<210> 61
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 61
tcctcgttag tatagtggtt agtatccccg cctgtcacgc gggagaccgg ggttcaattc 60
cccgacgggg ag 72
<210> 62
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 62
tcctcgttag tatagtggtg agtatccccg cctgtcacgc gggagaccgg ggttcgattc 60
cccgacgggg ag 72
<210> 63
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 63
tcctcgttag tatagtggtg agtgtccccg tctgtcacgc gggagaccgg ggttcgattc 60
cccgacgggg ag 72
<210> 64
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 64
gggggcatag ctcagtggta gagcatttga ctgcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60
caggtgcccc ct 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 65
gggggtatag ctcaggggta gagcatttga ctgcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60
caggtgcccc cc 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 66
gggggtatag cttagcggta gagcatttga ctgcagatca agaggtcccc ggttcaaatc 60
cgggtgcccc ct 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 67
gggggtatag cttaggggta gagcatttga ctgcagatca aaaggtccct ggttcaaatc 60
caggtgcccc tt 72
<210> 68
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 68
gggggtatag ctcaggggta gagcatttga ctgcagatca agaggtcccc agttcaaatc 60
tgggtgcccc ct 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 69
gggggtatag ctcaggggta gagcatttga ctgcagatca agaagtcccc ggttcaaatc 60
cgggtgcccc ct 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 70
gggggtatag ctcaggggta gagcatttga ctgcagatca agaggtctct ggttcaaatc 60
caggtgcccc ct 72
<210> 71
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 71
gggggtatag ctcaggggta gagcacttga ctgcagatca agaagtcctt ggttcaaatc 60
caggtgcccc ct 72
<210> 72
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 72
ggggatatag ctcaggggta gagcatttga ctgcagatca agaggtcccc ggttcaaatc 60
cgggtgcccc cc 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 73
gggggtatag ttcaggggta gagcatttga ctgcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60
caggtgcccc ct 72
<210> 74
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 74
gggggtatag ctcaggggta gagcatttga ctgcaaatca agaggtccct gattcaaatc 60
caggtgcccc ct 72
<210> 75
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 75
gggggtatag ctcagtggta gagcatttga ctgcagatca agaggtcccc ggttcaaatc 60
cgggtgcccc ct 72
<210> 76
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 76
gggcgtatag ctcaggggta gagcatttga ctgcagatca agaggtcccc agttcaaatc 60
tgggtgcccc ct 72
<210> 77
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 77
gggggtatag ctcacaggta gagcatttga ctgcagatca agaggtcccc ggttcaaatc 60
tgggtgcccc ct 72
<210> 78
<211> 70
<212> DNA
<213> 智人
<400> 78
gggcgtatag ctcaggggta gagcatttga ctgcagatca agaggtcccc agttcaaatc 60
tgggtgccca 70
<210> 79
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 79
gggggtatag ctcacaggta gagcatttga ctgcagatca agaggtcccc ggttcaaatc 60
cggttactcc ct 72
<210> 80
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 80
gggggtatag ctcaggggta gagcacttga ctgcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60
caggtgcccc ct 72
<210> 81
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 81
gggggtatag ctcagtggta gagcatttga ctgcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60
cgggtgcccc ct 72
<210> 82
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 82
gggggtatag ctcagtgggt agagcatttg actgcagatc aagaggtccc cggttcaaat 60
ccgggtgccc cct 73
<210> 83
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 83
gggggtgtag ctcagtggta gagcatttga ctgcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60
caggtgcccc ct 72
<210> 84
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 84
gggggtatag ctcaggtggt agagcatttg actgcagatc aagaggtccc cggttcaaat 60
ccgggtgccc cct 73
<210> 85
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 85
gggggtatag ctcaggggta gagcatttga ctgcagatca agaggtcccc ggttcaaatc 60
cgggtgcccc ct 72
<210> 86
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 86
gggggtatag ctcaggggta gagcatttga ctgcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60
caggtgcccc ct 72
<210> 87
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 87
ggttccatgg tgtaatggtt agcactctgg actctgaatc cagcgatccg agttcaaatc 60
tcggtggaac ct 72
<210> 88
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 88
ggttccatgg tgtaatggtt agcactctgg actctgaatc cagcgatccg agttcaagtc 60
tcggtggaac ct 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 89
ggttccatgg tgtaatggtg agcactctgg actctgaatc cagcgatccg agttcgagtc 60
tcggtggaac ct 72
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<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 90
ggttccatgg tgtaatggta agcactctgg actctgaatc cagcgatccg agttcgagtc 60
tcggtggaac ct 72
<210> 91
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 91
ggttccatgg tgtaatggtt agcactctgg actctgaatc cggtaatccg agttcaaatc 60
tcggtggaac ct 72
<210> 92
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 92
ggccccatgg tgtaatggtc agcactctgg actctgaatc cagcgatccg agttcaaatc 60
tcggtgggac cc 72
<210> 93
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 93
ggttccatgg tgtaatggta agcactctgg actctgaatc cagccatctg agttcgagtc 60
tctgtggaac ct 72
<210> 94
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 94
ggtcccatgg tgtaatggtt agcactctgg actttgaatc cagcgatccg agttcaaatc 60
tcggtgggac ct 72
<210> 95
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 95
ggtcccatgg tgtaatggtt agcactctgg actttgaatc cagcaatccg agttcgaatc 60
tcggtgggac ct 72
<210> 96
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 96
ggccccatgg tgtaatggtt agcactctgg actttgaatc cagcgatccg agttcaaatc 60
tcggtgggac ct 72
<210> 97
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 97
ggtcccatgg tgtaatggtt agcactctgg gctttgaatc cagcaatccg agttcgaatc 60
ttggtgggac ct 72
<210> 98
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 98
tccctggtgg tctagtggtt aggattcggc gctctcaccg ccgcggcccg ggttcgattc 60
ccggtcaggg aa 72
<210> 99
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 99
tccctggtgg tctagtggtt aggattcggc gctctcaccg ccgcggcccg ggttcgattc 60
ccggtcagga aa 72
<210> 100
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 100
tcccatatgg tctagcggtt aggattcctg gttttcaccc aggtggcccg ggttcgactc 60
ccggtatggg aa 72
<210> 101
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 101
tcccacatgg tctagcggtt aggattcctg gttttcaccc aggcggcccg ggttcgactc 60
ccggtgtggg aa 72
<210> 102
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 102
tccctggtgg tctagtggct aggattcggc gctttcaccg ccgcggcccg ggttcgattc 60
ccggccaggg aa 72
<210> 103
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 103
tccctggtgg tctagtggct aggattcggc gctttcaccg ccgcggcccg ggttcgattc 60
ccggtcaggg aa 72
<210> 104
<211> 71
<212> DNA
<213> 智人
<400> 104
gcattggtgg ttcagtggta gaattctcgc ctcccacgcg ggagacccgg gttcaattcc 60
cggccaatgc a 71
<210> 105
<211> 71
<212> DNA
<213> 智人
<400> 105
gcgccgctgg tgtagtggta tcatgcaaga ttcccattct tgcgacccgg gttcgattcc 60
cgggcggcgc a 71
<210> 106
<211> 71
<212> DNA
<213> 智人
<400> 106
gcattggtgg ttcaatggta gaattctcgc ctcccacgca ggagacccag gttcgattcc 60
tggccaatgc a 71
<210> 107
<211> 71
<212> DNA
<213> 智人
<400> 107
gcatgggtgg ttcagtggta gaattctcgc ctgccacgcg ggaggcccgg gttcgattcc 60
cggcccatgc a 71
<210> 108
<211> 71
<212> DNA
<213> 智人
<400> 108
gcattggtgg ttcagtggta gaattctcgc ctgccacgcg ggaggcccgg gttcgattcc 60
cggccaatgc a 71
<210> 109
<211> 71
<212> DNA
<213> 智人
<400> 109
gcattggtgg ttcagtggta gaattctcgc ctgccacgcg ggaggcccgg gtttgattcc 60
cggccagtgc a 71
<210> 110
<211> 71
<212> DNA
<213> 智人
<400> 110
gcataggtgg ttcagtggta gaattcttgc ctgccacgca ggaggcccag gtttgattcc 60
tggcccatgc a 71
<210> 111
<211> 71
<212> DNA
<213> 智人
<400> 111
gcattggtgg ttcagtggta gaattctcgc ctgccatgcg ggcggccggg cttcgattcc 60
tggccaatgc a 71
<210> 112
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 112
gcgttggtgg tatagtggtt agcatagctg ccttccaagc agttgacccg ggttcgattc 60
ccggccaacg ca 72
<210> 113
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 113
gcgttggtgg tatagtggtg agcatagctg ccttccaagc agttgacccg ggttcgattc 60
ccggccaacg ca 72
<210> 114
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 114
gcgttggtgg tatagtggta agcatagctg ccttccaagc agttgacccg ggttcgattc 60
ccggccaacg ca 72
<210> 115
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 115
gcgttggtgg tatagtggtg agcatagttg ccttccaagc agttgacccg ggctcgattc 60
ccgcccaacg ca 72
<210> 116
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 116
gccgtgatcg tatagtggtt agtactctgc gttgtggccg cagcaacctc ggttcgaatc 60
cgagtcacgg ca 72
<210> 117
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 117
gccatgatcg tatagtggtt agtactctgc gctgtggccg cagcaacctc ggttcgaatc 60
cgagtcacgg ca 72
<210> 118
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 118
ggccggttag ctcagttggt tagagcgtgg cgctaataac gccaaggtcg cgggttcgat 60
ccccgtacgg gcca 74
<210> 119
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 119
ggccggttag ctcagttggt tagagcgtgg tgctaataac gccaaggtcg cgggttcgat 60
ccccgtactg gcca 74
<210> 120
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 120
ggctggttag ctcagttggt tagagcgtgg tgctaataac gccaaggtcg cgggttcgat 60
ccccgtactg gcca 74
<210> 121
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 121
ggccggttag ctcagttggt tagagcgtgg tgctaataac gccaaggtcg cgggttcgaa 60
ccccgtacgg gcca 74
<210> 122
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 122
ggccggttag ctcagttggt tagagcgtgg tgctaataac gccaaggtcg cgggttcgat 60
ccccgtacgg gcca 74
<210> 123
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 123
ggccggttag ctcagttggt tagagcgtgg tgctaataac gctaaggtcg cgggttcgat 60
ccccgtactg gcca 74
<210> 124
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 124
ggccggttag ctcagttggt cagagcgtgg tgctaataac gccaaggtcg cgggttcgat 60
ccccgtacgg gcca 74
<210> 125
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 125
ggccggttag ctcagtcggc tagagcgtgg tgctaataac gccaaggtcg cgggttcgat 60
ccccgtacgg gcca 74
<210> 126
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 126
ggctggttag ttcagttggt tagagcgtgg tgctaataac gccaaggtcg tgggttcgat 60
ccccatatcg gcca 74
<210> 127
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 127
ggccggttag ctcagttggt aagagcgtgg tgctgataac accaaggtcg cgggctcgac 60
tcccgcaccg gcca 74
<210> 128
<211> 93
<212> DNA
<213> 智人
<400> 128
gctccagtgg cgcaatcggt tagcgcgcgg tacttatatg acagtgcgag cggagcaatg 60
ccgaggttgt gagttcgatc ctcacctgga gca 93
<210> 129
<211> 93
<212> DNA
<213> 智人
<400> 129
gctccagtgg cgcaatcggt tagcgcgcgg tacttataca gcagtacatg cagagcaatg 60
ccgaggttgt gagttcgagc ctcacctgga gca 93
<210> 130
<211> 94
<212> DNA
<213> 智人
<400> 130
gctccagtgg cgcaatcggt tagcgcgcgg tacttatatg gcagtatgtg tgcgagtgat 60
gccgaggttg tgagttcgag cctcacctgg agca 94
<210> 131
<211> 94
<212> DNA
<213> 智人
<400> 131
gctccagtgg cgcaatcggt tagcgcgcgg tacttataca acagtatatg tgcgggtgat 60
gccgaggttg tgagttcgag cctcacctgg agca 94
<210> 132
<211> 94
<212> DNA
<213> 智人
<400> 132
gctccagtgg cgcaatcggt tagcgcgcgg tacttataag acagtgcacc tgtgagcaat 60
gccgaggttg tgagttcaag cctcacctgg agca 94
<210> 133
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 133
ggtagcgtgg ccgagcggtc taaggcgctg gattaaggct ccagtctctt cggaggcgtg 60
ggttcgaatc ccaccgctgc ca 82
<210> 134
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 134
ggtagcgtgg ccgagcggtc taaggcgctg gattaaggct ccagtctctt cgggggcgtg 60
ggttcgaatc ccaccgctgc ca 82
<210> 135
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 135
ggtagcgtgg ccgagcggtc taaggcgctg gattaaggct ccagtctctt cgggggcgtg 60
ggttcaaatc ccaccgctgc ca 82
<210> 136
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 136
ggtagcgtgg ccgagtggtc taagacgctg gattaaggct ccagtctctt cgggggcgtg 60
ggtttgaatc ccaccgctgc ca 82
<210> 137
<211> 106
<212> DNA
<213> 智人
<400> 137
gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactcaagct aagcttcctc cgcggtgggg 60
attctggtct ccaatggagg cgtgggttcg aatcccactt ctgaca 106
<210> 138
<211> 105
<212> DNA
<213> 智人
<400> 138
gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactcaagct tggcttcctc gtgttgagga 60
ttctggtctc caatggaggc gtgggttcga atcccacttc tgaca 105
<210> 139
<211> 108
<212> DNA
<213> 智人
<400> 139
gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactcaagct tactgcttcc tgtgttcggg 60
tcttctggtc tccgtatgga ggcgtgggtt cgaatcccac ttctgaca 108
<210> 140
<211> 107
<212> DNA
<213> 智人
<400> 140
gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactcaagtt gctacttccc aggtttgggg 60
cttctggtct ccgcatggag gcgtgggttc gaatcccact tctgaca 107
<210> 141
<211> 106
<212> DNA
<213> 智人
<400> 141
gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactcaaggt aagcaccttg cctgcgggct 60
ttctggtctc cggatggagg cgtgggttcg aatcccactt ctgaca 106
<210> 142
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 142
gcctccttag tgcagtaggt agcgcatcag tctcaaaatc tgaatggtcc tgagttcaag 60
cctcagaggg ggca 74
<210> 143
<211> 84
<212> DNA
<213> 智人
<400> 143
gtcaggatgg ccgagcagtc ttaaggcgct gcgttcaaat cgcaccctcc gctggaggcg 60
tgggttcgaa tcccactttt gaca 84
<210> 144
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 144
gtcaggatgg ccgagcggtc taaggcgctg cgttcaggtc gcagtctccc ctggaggcgt 60
gggttcgaat cccactcctg aca 83
<210> 145
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 145
gtcaggatgg ccgagcggtc taaggcgctg cgttcaggtc gcagtctccc ctggaggcgt 60
gggttcgaat cccacttctg aca 83
<210> 146
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 146
accaggatgg ccgagtggtt aaggcgttgg acttaagatc caatggacat atgtccgcgt 60
gggttcgaac cccactcctg gta 83
<210> 147
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 147
accgggatgg ccgagtggtt aaggcgttgg acttaagatc caatgggctg gtgcccgcgt 60
gggttcgaac cccactctcg gta 83
<210> 148
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 148
accagaatgg ccgagtggtt aaggcgttgg acttaagatc caatggattc atatccgcgt 60
gggttcgaac cccacttctg gta 83
<210> 149
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 149
accgggatgg ctgagtggtt aaggcgttgg acttaagatc caatggacag gtgtccgcgt 60
gggttcgagc cccactcccg gta 83
<210> 150
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 150
ggtagcgtgg ccgagcggtc taaggcgctg gatttaggct ccagtctctt cggaggcgtg 60
ggttcgaatc ccaccgctgc ca 82
<210> 151
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 151
ggtagtgtgg ccgagcggtc taaggcgctg gatttaggct ccagtctctt cgggggcgtg 60
ggttcgaatc ccaccactgc ca 82
<210> 152
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 152
ggtagcgtgg ccgagtggtc taaggcgctg gatttaggct ccagtcattt cgatggcgtg 60
ggttcgaatc ccaccgctgc ca 82
<210> 153
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 153
gcccggctag ctcagtcggt agagcatggg actcttaatc ccagggtcgt gggttcgagc 60
cccacgttgg gcg 73
<210> 154
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 154
gcccagctag ctcagtcggt agagcataag actcttaatc tcagggttgt ggattcgtgc 60
cccatgctgg gtg 73
<210> 155
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 155
gcagctagct cagtcggtag agcatgagac tcttaatctc agggtcatgg gttcgtgccc 60
catgttgggt gcca 74
<210> 156
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 156
gcccggctag ctcagtcggt agagcatgag actcttaatc tcagggtcgt gggttcgagc 60
cccacgttgg gcg 73
<210> 157
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 157
gcccggctag ctcagtcggt agagcatgag acccttaatc tcagggtcgt gggttcgagc 60
cccacgttgg gcg 73
<210> 158
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 158
gcccggctag ctcagtcggt agagcatggg actcttaatc tcagggtcgt gggttcgagc 60
cccacgttgg gcg 73
<210> 159
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 159
gcccggctag ctcagtcgat agagcatgag actcttaatc tcagggtcgt gggttcgagc 60
cgcacgttgg gcg 73
<210> 160
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 160
gcccagctag ctcagtcggt agagcatgag actcttaatc tcagggtcat gggtttgagc 60
cccacgtttg gtg 73
<210> 161
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 161
gcctggctag ctcagtcggc aaagcatgag actcttaatc tcagggtcgt gggctcgagc 60
tccatgttgg gcg 73
<210> 162
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 162
gcccgactac ctcagtcggt ggagcatggg actcttcatc ccagggttgt gggttcgagc 60
cccacattgg gca 73
<210> 163
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 163
gcctggatag ctcagttggt agagcatcag acttttaatc tgagggtcca gggttcaagt 60
ccctgttcag gca 73
<210> 164
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 164
acccagatag ctcagtcagt agagcatcag acttttaatc tgagggtcca aggttcatgt 60
ccctttttgg gtg 73
<210> 165
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 165
gcctggatag ctcagttggt agagcatcag acttttaatc tgagggtcca gggttcaagt 60
ccctgttcag gcg 73
<210> 166
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 166
gcccggatag ctcagtcggt agagcatcag acttttaatc tgagggtcca gggttcaagt 60
ccctgttcgg gcg 73
<210> 167
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 167
gcctggatag ctcagtcggt agagcatcag acttttaatc tgagggtcca gggttcaagt 60
ccctgttcag gcg 73
<210> 168
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 168
gcccggatag ctcagtcggt agagcatcag acttttaatc tgagggtccg gggttcaagt 60
ccctgttcgg gcg 73
<210> 169
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 169
gcctgggtag ctcagtcggt agagcatcag acttttaatc tgagggtcca gggttcaagt 60
ccctgtccag gcg 73
<210> 170
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 170
gcctggatag ctcagttggt agaacatcag acttttaatc tgacggtgca gggttcaagt 60
ccctgttcag gcg 73
<210> 171
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 171
gcctcgttag cgcagtaggt agcgcgtcag tctcataatc tgaaggtcgt gagttcgatc 60
ctcacacggg gca 73
<210> 172
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 172
gccctcttag cgcagtgggc agcgcgtcag tctcataatc tgaaggtcct gagttcgagc 60
ctcagagagg gca 73
<210> 173
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 173
gcctccttag cgcagtaggc agcgcgtcag tctcataatc tgaaggtcct gagttcgaac 60
ctcagagggg gca 73
<210> 174
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 174
gccctcttag cgcagcgggc agcgcgtcag tctcataatc tgaaggtcct gagttcgagc 60
ctcagagagg gca 73
<210> 175
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 175
gccctcttag cgcagctggc agcgcgtcag tctcataatc tgaaggtcct gagttcaagc 60
ctcagagagg gca 73
<210> 176
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 176
gcctcgttag cgcagtaggc agcgcgtcag tctcataatc tgaaggtcgt gagttcgagc 60
ctcacacggg gca 73
<210> 177
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 177
gccctcttag tgcagctggc agcgcgtcag tttcataatc tgaaagtcct gagttcaagc 60
ctcagagagg gca 73
<210> 178
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 178
gccgaaatag ctcagttggg agagcgttag actgaagatc taaaggtccc tggttcgatc 60
ccgggtttcg gca 73
<210> 179
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 179
gccgaaatag ctcagttggg agagcgttag actgaagatc taaaggtccc tggttcaatc 60
ccgggtttcg gca 73
<210> 180
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 180
gccgagatag ctcagttggg agagcgttag actgaagatc taaaggtccc tggttcaatc 60
ccgggtttcg gca 73
<210> 181
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 181
gccgaaatag ctcagttggg agagcgttag accgaagatc ttaaaggtcc ctggttcaat 60
cccgggtttc ggca 74
<210> 182
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 182
gctgaaatag ctcagttggg agagcgttag actgaagatc ttaaagttcc ctggttcaac 60
cctgggtttc agcc 74
<210> 183
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 183
ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgc ttaggatgcg agaggtcccg ggttcaaatc 60
ccggacgagc cc 72
<210> 184
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 184
ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgc ttagggtgcg agaggtcccg ggttcaaatc 60
ccggacgagc cc 72
<210> 185
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 185
ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgc ttcgggtgcg agaggtcccg ggttcaaatc 60
ccggacgagc cc 72
<210> 186
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 186
ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgc ttcgggtgtg agaggtcccg ggttcaaatc 60
ccggacgagc cc 72
<210> 187
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 187
ggctcgttgg tctagtggta tgattctcgc tttgggtgcg agaggtcccg ggttcaaatc 60
ccggacgagc cc 72
<210> 188
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 188
ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgg tttgggtccg agaggtcccg ggttcaaatc 60
ccggacgagc cc 72
<210> 189
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 189
ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgc tttgggtgcg agaggtcccg ggttcaaatc 60
ccggacgagc cc 72
<210> 190
<211> 87
<212> DNA
<213> 智人
<400> 190
gcccggatga tcctcagtgg tctggggtgc aggcttcaaa cctgtagctg tctagcgaca 60
gagtggttca attccacctt tcgggcg 87
<210> 191
<211> 84
<212> DNA
<213> 智人
<400> 191
gctcggatga tcctcagtgg tctggggtgc aggcttcaaa cctgtagctg tctagtgaca 60
gagtggttca attccacctt tgta 84
<210> 192
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 192
gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actagaaatc cattggggtt tccccgcgca 60
ggttcgaatc ctgccgacta cg 82
<210> 193
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 193
gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actagaaatc cattggggtc tccccgcgca 60
ggttcgaatc ctgccgacta cg 82
<210> 194
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 194
gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actagaaatc cattggggtt tccccacgca 60
ggttcgaatc ctgccgacta cg 82
<210> 195
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 195
gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggtgatgg actagaaacc cattggggtc tccccgcgca 60
ggttcgaatc ctgccgacta cg 82
<210> 196
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 196
gctgtgatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actcgaaatc caatggggtc tccccgcgca 60
ggttcgaatc ctgctcacag cg 82
<210> 197
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 197
gctgtgatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actcgaaatc caatggggtc tccccgcgca 60
ggttcaaatc ctgctcacag cg 82
<210> 198
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 198
gctgtgatgg ccgagtggtt aaggtgttgg actcgaaatc caatgggggt tccccgcgca 60
ggttcaaatc ctgctcacag cg 82
<210> 199
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 199
gtcacggtgg ccgagtggtt aaggcgttgg actcgaaatc caatggggtt tccccgcaca 60
ggttcgaatc ctgttcgtga cg 82
<210> 200
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 200
gacgaggtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actgctaatc cattgtgctc tgcacgcgtg 60
ggttcgaatc ccaccctcgt cg 82
<210> 201
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 201
gacgaggtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actgctaatc cattgtgctc tgcacgcgtg 60
ggttcgaatc ccaccttcgt cg 82
<210> 202
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 202
gacgaggtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actgctaatc cattgtgctt tgcacgcgtg 60
ggttcgaatc ccatcctcgt cg 82
<210> 203
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 203
gacgaggtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actgctaatc cattgtgctc tgcacgcgtg 60
ggttcgaatc ccatcctcgt cg 82
<210> 204
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 204
gacgaggtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actgctaatc cattgtgctc tgcacacgtg 60
ggttcgaatc ccatcctcgt cg 82
<210> 205
<211> 84
<212> DNA
<213> 智人
<400> 205
ggagaggcct ggccgagtgg ttaaggcgat ggactgctaa tccattgtgc tctgcacgcg 60
tgggttcgaa tcccatcctc gtcg 84
<210> 206
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 206
gcagcgatgg ccgagtggtt aaggcgttgg acttgaaatc caatggggtc tccccgcgca 60
ggttcgaacc ctgctcgctg cg 82
<210> 207
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 207
gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg acttgaaatc cattggggtt tccccgcgca 60
ggttcgaatc ctgccgacta cg 82
<210> 208
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 208
gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg acttgaaatc cattggggtc tccccgcgca 60
ggttcgaatc ctgccgacta cg 82
<210> 209
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人
<400> 209
gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg acttgaaatc cattggggtt tccccgcgca 60
ggttcgaatc ctgtcggcta cg 82
<210> 210
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 210
ggcgccgtgg cttagttggt taaagcgcct gtctagtaaa caggagatcc tgggttcgaa 60
tcccagcggt gcct 74
<210> 211
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 211
ggctccgtgg cttagctggt taaagcgcct gtctagtaaa caggagatcc tgggttcgaa 60
tcccagcggg gcct 74
<210> 212
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 212
ggctccgtag cttagttggt taaagcgcct gtctagtaaa caggagatcc tgggttcgac 60
tcccagcggg gcct 74
<210> 213
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 213
ggcttcgtgg cttagctggt taaagcgcct gtctagtaaa caggagatcc tgggttcgaa 60
tcccagcgag gcct 74
<210> 214
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 214
ggcgccgtgg cttagctggt taaagcgcct gtctagtaaa caggagatcc tgggttcgaa 60
tcccagcggt gcct 74
<210> 215
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 215
ggccctgtgg cttagctggt caaagcgcct gtctagtaaa caggagatcc tgggttcgaa 60
tcccagcggg gcct 74
<210> 216
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 216
ggctctatgg cttagttggt taaagcgcct gtctcgtaaa caggagatcc tgggttcgac 60
tcccagtggg gcct 74
<210> 217
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 217
ggcgcggtgg ccaagtggta aggcgtcggt ctcgtaaacc gaagatcacg ggttcgaacc 60
ccgtccgtgc ct 72
<210> 218
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 218
ggctctgtgg cttagttggc taaagcgcct gtctcgtaaa caggagatcc tgggttcgaa 60
tcccagcggg gcct 74
<210> 219
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 219
ggcgcggtgg ccaagtggta aggcgtcggt ctcgtaaacc gaagatcgcg ggttcgaacc 60
ccgtccgtgc ct 72
<210> 220
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 220
ggccctgtag ctcagcggtt ggagcgctgg tctcgtaaac ctaggggtcg tgagttcaaa 60
tctcaccagg gcct 74
<210> 221
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 221
ggctctatgg cttagttggt taaagcgcct gtcttgtaaa caggagatcc tgggttcgaa 60
tcccagtaga gcct 74
<210> 222
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 222
ggctccatag ctcagtggtt agagcactgg tcttgtaaac caggggtcgc gagttcgatc 60
ctcgctgggg cct 73
<210> 223
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 223
ggctccatag ctcaggggtt agagcgctgg tcttgtaaac caggggtcgc gagttcaatt 60
ctcgctgggg cct 73
<210> 224
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 224
ggctccatag ctcaggggtt agagcactgg tcttgtaaac caggggtcgc gagttcaaat 60
ctcgctgggg cct 73
<210> 225
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 225
ggccctatag ctcaggggtt agagcactgg tcttgtaaac caggggtcgc gagttcaaat 60
ctcgctgggg cct 73
<210> 226
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 226
ggctccatag ctcaggggtt agagcactgg tcttgtaaac cagggtcgcg agttcaaatc 60
tcgctggggc ct 72
<210> 227
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 227
ggcctcgtgg cgcaacggta gcgcgtctga ctccagatca gaaggttgcg tgttcaaatc 60
acgtcggggt ca 72
<210> 228
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 228
gacctcgtgg cgcaatggta gcgcgtctga ctccagatca gaaggttgcg tgttcaagtc 60
acgtcggggt ca 72
<210> 229
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 229
gacctcgtgg cgcaacggta gcgcgtctga ctccagatca gaaggttgcg tgttcaaatc 60
acgtcggggt ca 72
<210> 230
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 230
gacctcgtgg cgcaacggta gcgcgtctga ctccagatca gaaggctgcg tgttcgaatc 60
acgtcggggt ca 72
<210> 231
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 231
gacctcgtgg cgcaacggca gcgcgtctga ctccagatca gaaggttgcg tgttcaaatc 60
acgtcggggt ca 72
<210> 232
<211> 93
<212> DNA
<213> 智人
<400> 232
ccttcaatag ttcagctggt agagcagagg actatagcta cttcctcagt aggagacgtc 60
cttaggttgc tggttcgatt ccagcttgaa gga 93
<210> 233
<211> 91
<212> DNA
<213> 智人
<400> 233
ccttcgatag ctcagttggt agagcggagg actgtagttg gctgtgtcct tagacatcct 60
taggtcgctg gttcgaatcc ggctcgaagg a 91
<210> 234
<211> 89
<212> DNA
<213> 智人
<400> 234
ccttcgatag ctcagttggt agagcggagg actgtagtgg atagggcgtg gcaatcctta 60
ggtcgctggt tcgattccgg ctcgaagga 89
<210> 235
<211> 89
<212> DNA
<213> 智人
<400> 235
ccttcgatag ctcagttggt agagcggagg actgtaggct cattaagcaa ggtatcctta 60
ggtcgctggt tcgaatccgg ctcggagga 89
<210> 236
<211> 94
<212> DNA
<213> 智人
<400> 236
ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actgtagatt gtatagacat ttgcggacat 60
ccttaggtcg ctggttcgat tccagctcga agga 94
<210> 237
<211> 93
<212> DNA
<213> 智人
<400> 237
ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actgtagcta cttcctcagc aggagacatc 60
cttaggtcgc tggttcgatt ccggctcgaa gga 93
<210> 238
<211> 89
<212> DNA
<213> 智人
<400> 238
ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actgtaggcg cgcgcccgtg gccatcctta 60
ggtcgctggt tcgattccgg ctcgaagga 89
<210> 239
<211> 94
<212> DNA
<213> 智人
<400> 239
ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actgtagcct gtagaaacat ttgtggacat 60
ccttaggtcg ctggttcgat tccggctcga agga 94
<210> 240
<211> 94
<212> DNA
<213> 智人
<400> 240
ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actgtagatt gtacagacat ttgcggacat 60
ccttaggtcg ctggttcgat tccggctcga agga 94
<210> 241
<211> 89
<212> DNA
<213> 智人
<400> 241
ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actgtagtac ttaatgtgtg gtcatcctta 60
ggtcgctggt tcgattccgg ctcgaagga 89
<210> 242
<211> 89
<212> DNA
<213> 智人
<400> 242
ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actgtagggg tttgaatgtg gtcatcctta 60
ggtcgctggt tcgaatccgg ctcggagga 89
<210> 243
<211> 94
<212> DNA
<213> 智人
<400> 243
ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actgtagact gcggaaacgt ttgtggacat 60
ccttaggtcg ctggttcaat tccggctcga agga 94
<210> 244
<211> 90
<212> DNA
<213> 智人
<400> 244
ctttcgatag ctcagttggt agagcggagg actgtaggtt cattaaacta aggcatcctt 60
aggtcgctgg ttcgaatccg gctcgaagga 90
<210> 245
<211> 88
<212> DNA
<213> 智人
<400> 245
tcttcaatag ctcagctggt agagcggagg actgtaggtg cacgcccgtg gccattctta 60
ggtgctggtt tgattccgac ttggagag 88
<210> 246
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 246
gtttccgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctaacacgc gaaaggtccc cggttcgaaa 60
ccgggcggaa aca 73
<210> 247
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 247
gtttccgtag tgtagtggtc atcacgttcg cctaacacgc gaaaggtccc cggttcgaaa 60
ccgggcggaa aca 73
<210> 248
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 248
gtttccgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctaacacgc gaaaggtccc tggatcaaaa 60
ccaggcggaa aca 73
<210> 249
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 249
gtttccgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctaacacgc gaaaggtccg cggttcgaaa 60
ccgggcggaa aca 73
<210> 250
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 250
gtttccgtag tgtagtggtt atcacgtttg cctaacacgc gaaaggtccc cggttcgaaa 60
ccgggcagaa aca 73
<210> 251
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 251
gggggtgtag ctcagtggta gagcgtatgc ttaacattca tgaggctctg ggttcgatcc 60
ccagcacttc ca 72
<210> 252
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 252
gtttccgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctcacacgc gaaaggtccc cggttcgaaa 60
ccgggcggaa aca 73
<210> 253
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 253
gcttctgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctcacacgc gaaaggtccc cggttcgaaa 60
ccgggcagaa gca 73
<210> 254
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 254
gtttccgtag tgtagcggtt atcacattcg cctcacacgc gaaaggtccc cggttcgatc 60
ccgggcggaa aca 73
<210> 255
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 255
gtttccgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctcacacgc gaaaggtccc cggttcgaaa 60
ctgggcggaa aca 73
<210> 256
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 256
gtttccgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctcacacgc gtaaaggtcc ccggttcgaa 60
accgggcgga aaca 74
<210> 257
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 257
gtttccgtag tggagtggtt atcacgttcg cctcacacgc gaaaggtccc cggtttgaaa 60
ccaggcggaa aca 73
<210> 258
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 258
ggttccatag tgtagtggtt atcacgtctg ctttacacgc agaaggtcct gggttcgagc 60
cccagtggaa cca 73
<210> 259
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 259
ggttccatag tgtagcggtt atcacgtctg ctttacacgc agaaggtcct gggttcgagc 60
cccagtggaa cca 73
<210> 260
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 260
ggttccatag tgtagtggtt atcacatctg ctttacacgc agaaggtcct gggttcaagc 60
cccagtggaa cca 73
<210> 261
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 261
gtttccgtgg tgtagtggtt atcacattcg ccttacacgc gaaaggtcct cgggtcgaaa 60
ccgagcggaa aca 73
<210> 262
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 262
agcagagtgg cgcagcggaa gcgtgctggg cccataaccc agaggtcgat ggatcgaaac 60
catcctctgc ta 72
<210> 263
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 263
agcagagtgg cgcagcggaa gcgtgctggg cccataaccc agaggtcgat ggatctaaac 60
catcctctgc ta 72
<210> 264
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 264
tccctggtgg tctagtggct aggattcggc gctttcaccg ccgcggcccg ggttcgattc 60
ccggtcaggg aat 73
<210> 265
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 265
gcgttggtgg tttagtggta gaattctcgc ctcccatgcg ggagacccgg gttcaattcc 60
cggccactgc ac 72
<210> 266
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 266
ggccttggtg gtgcagtggt agaattctcg cctcccacgt gggagacccg ggttcaattc 60
ccggccaatg ca 72
<210> 267
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 267
gtccctggtg gtctagtggc taggattcgg cgctttcacc gccgcggccc gggttcgatt 60
cccggccagg gaa 73
<210> 268
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 268
tgtctctgtg gcgcaatcgg ttagcgcgtt cggctgttaa ccgaaagatt ggtggttcga 60
gcccacccag ggacg 75
<210> 269
<211> 86
<212> DNA
<213> 智人
<400> 269
tggctccgtg gcgcaatgga tagcgcattg gacttctaga ggctgaaggc attcaaaggt 60
tccgggttcg agtcccggcg gagtcg 86
<210> 270
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 270
gcccggctag ctcagtcggt agagcatgag actcttaatc tcagggtcgt gggttcgagc 60
cccacgttgg gcgc 74
<210> 271
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 271
gccgtgatcg tatagtggtt agtactctgc gttgtggccg cagcaacctc ggttcgaatc 60
cgagtcacgg cag 73
<210> 272
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 272
gcgttggtgg tatagtggtg agcatagctg ccttccaagc agttgacccg ggttcgattc 60
ccggccaacg cag 73
<210> 273
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 273
tccctggtgg tctagtggtt aggattcggc gctctcaccg ccgcggcccg ggttcgattc 60
ccggtcaggg aaa 73
<210> 274
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 274
aggttccatg gtgtaatggt gagcactctg gactctgaat ccagcgatcc gagttcgagt 60
ctcggtggaa cct 73
<210> 275
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 275
tgtctctgtg gcgtagtcgg ttagcgcgtt cggctgttaa ccgaaaagtt ggtggttcga 60
gcccacccag gaacg 75
<210> 276
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 276
tgtctctgtg gcgcaatcgg ttagcgcgtt cggctgttaa ccgaaaggtt ggtggttcga 60
gcccacccag ggacg 75
<210> 277
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 277
gtctctgtgg cgcaatcggt tagcgcattc ggctgttaac cgaaaggttg gtggttcgag 60
cccacccagg gacgc 75
<210> 278
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 278
gtctctgtgg cgcaatgggt tagcgcgttc ggctgttaac cgaaaggttg gtggttcgag 60
cccatccagg gacgc 75
<210> 279
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 279
gcactggtgg ttcagtggta gaattctcgc ctcacacgcg ggacacccgg gttcaattcc 60
cggtcaaggc aa 72
<210> 280
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 280
gtttccgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctcacacgc gaaaggtccc cggttcgaaa 60
ctgggcggaa acag 74
<210> 281
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 281
gcactggtgg ttcagtggta gaattctcgc ctcccacgcg ggagacccgg gtttaattcc 60
cggtcaagat aa 72
<210> 282
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 282
gtttccgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctcacacgc gtaaaggtcc ccggttcgaa 60
accgggcgga aacat 75
<210> 283
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 283
tagcagagtg gcgcagcgga agcgtgctgg gcccataacc cagaggtcga tggatcgaaa 60
ccatcctctg cta 73
<210> 284
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 284
gtttccgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctcacacgc gaaaggtccc cggttcgaaa 60
ccgggcggaa acaa 74
<210> 285
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 285
tcctcgttag tatagtggtg agtatccccg cctgtcacgc gggagaccgg ggttcgattc 60
cccgacgggg agg 73
<210> 286
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 286
tgcatgggtg gttcagtggt agaattctcg cctgccacgc gggaggcccg ggttcgattc 60
ccggcccatg ca 72
<210> 287
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 287
tccctggtgg tctagtggtt aggattcggc gctctcaccg ccgcggcccg ggttcgattc 60
ccggtcaggg aag 73
<210> 288
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 288
atccttgtta ctatagtggt gagtatctct gcctgtcatg cgtgagagag ggggtcgatt 60
ccccgacggg gag 73
<210> 289
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 289
gcattggtgg ttcagtggta gaattctcgc ctgccacgcg ggaggcccgg gttcgattcc 60
cggccaatgc ac 72
<210> 290
<211> 84
<212> DNA
<213> 智人
<400> 290
gtcaggatgg ccgagcggtc taaggcgctg cgttcaggtc gcagtctccc ctggaggcgt 60
gggttcgaat cccactcctg acaa 84
<210> 291
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 291
cgcgttggtg gtatagtggt gagcatagct gccttccaag cagttgaccc gggttcgatt 60
cccggccaac gca 73
<210> 292
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 292
cgtctctgtg gcgcaatcgg ttagcgcgtt cggctgttaa ccgaaaggtt ggtggttcga 60
tcccacccag ggacg 75
<210> 293
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 293
cgcgttggtg gtgtagtggt gagcacagct gcctttcaag cagttaacgc gggttcgatt 60
cccgggtaac gaa 73
<210> 294
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 294
cggctcgttg gtctaggggt atgattctcg cttcgggtgc gagaggtccc gggttcaaat 60
cccggacgag ccc 73
<210> 295
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 295
ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgc ttagggtgcg agaggtcccg ggttcaaatc 60
ccggacgagc cct 73
<210> 296
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 296
cgcccggata gctcagtcgg tagagcatca gacttttaat ctgagggtcc agggttcaag 60
tccctgttcg ggcg 74
<210> 297
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 297
gcccggatag ctcagtcggt agagcatcag acttttaatc tgagggtcca gggttcaagt 60
ccctgttcgg gcgt 74
<210> 298
<211> 107
<212> DNA
<213> 智人
<400> 298
tgtcaggatg gccgagtggt ctaaggcgcc agactcaagg taagcacctt gcctgcgggc 60
tttctggtct ccggatggag gcgtgggttc gaatcccact tctgaca 107
<210> 299
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 299
ttccctggtg gtctagtggt taggattcgg cgctctcacc gccgcggccc gggttcgatt 60
cccggtcagg aaa 73
<210> 300
<211> 90
<212> DNA
<213> 智人
<400> 300
gccttcgata gctcagttgg tagagcggag gactgtagtg gatagggcgt ggcaatcctt 60
aggtcgctgg ttcgattccg gctcgaagga 90
<210> 301
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 301
cgggggatta gctcaaatgg tagagcgctc gcttagcatg cgagaggtag cgggatcgat 60
gcccgcatcc tcca 74
<210> 302
<211> 94
<212> DNA
<213> 智人
<400> 302
agctccagtg gcgcaatcgg ttagcgcgcg gtacttatac agcagtacat gcagagcaat 60
gccgaggttg tgagttcgag cctcacctgg agca 94
<210> 303
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 303
gcgccgctgg tgtagtggta tcatgcaaga ttcccattct tgcgacccgg gttcgattcc 60
cgggcggcgc at 72
<210> 304
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 304
tcccatatgg tctagcggtt aggattcctg gttttcaccc aggtggcccg ggttcgactc 60
ccggtatggg aac 73
<210> 305
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 305
gggggatgta gctcagtggt agagcgcgcg cttcgcatgt gtgaggtccc gggttcaatc 60
cccggcatct cca 73
<210> 306
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 306
gcattggtgg ttcagtggta gaattctcgc ctgccacgcg ggaggcccgg gttcgattcc 60
cggccaatgc aa 72
<210> 307
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 307
gggccagtgg cgcaatggat aacgcgtctg actacggatc agaagattct aggttcgact 60
cctggctggc tcgc 74
<210> 308
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 308
ggtttccgta gtgtagtggt tatcacgttc gcctaacacg cgaaaggtcc ccggttcgaa 60
accgggcgga aaca 74
<210> 309
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 309
agtttccgta gtgtagtggt tatcacgttc gcctaacacg cgaaaggtcc ccggttcgaa 60
accgggcgga aaca 74
<210> 310
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 310
aggtagcgtg gccgagcggt ctaaggcgct ggattaaggc tccagtctct tcgggggcgt 60
gggttcgaat cccaccgctg cca 83
<210> 311
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 311
gtttccgtag tgtagtggtc atcacgttcg cctaacacgc gaaaggtccc cggttcgaaa 60
ccgggcggaa acat 74
<210> 312
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 312
ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgc tttgggtgcg agaggtcccg ggttcaaatc 60
ccggacgagc cca 73
<210> 313
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 313
ggctccatag ctcaggggtt agagcactgg tcttgtaaac cagggtcgcg agttcaaatc 60
tcgctggggc ctg 73
<210> 314
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 314
tggggatgta gctcagtggt agagcgcatg ctttgcatgt atgaggcccc gggttcgatc 60
cccggcatct cca 73
<210> 315
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 315
cgcccggcta gctcagtcgg tagagcatga gactcttaat ctcagggtcg tgggttcgag 60
ccccacgttg ggcg 74
<210> 316
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 316
gtttccgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctaacacgc gaaaggtccc cggttcgaaa 60
ccgggcggaa acaa 74
<210> 317
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 317
gcccggctag ctcagtcggt agagcatgag actcttaatc tcagggtcgt gggttcgagc 60
cccacgttgg gcgt 74
<210> 318
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 318
gtttccgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctcacacgc gaaaggtccc cggttcgaaa 60
ccgggcggaa acac 74
<210> 319
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 319
cagcagagtg gcgcagcgga agcgtgctgg gcccataacc cagaggtcga tggatcgaaa 60
ccatcctctg cta 73
<210> 320
<211> 85
<212> DNA
<213> 智人
<400> 320
ggagaggcct ggccgagtgg ttaaggcgat ggactgctaa tccattgtgc tctgcacgcg 60
tgggttcgaa tcccatcctc gtcgc 85
<210> 321
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 321
ggccccatgg tgtaatggtt agcactctgg actttgaatc cagcgatccg agttcaaatc 60
tcggtgggac ctg 73
<210> 322
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 322
ggccccatgg tgtaatggtt agcactctgg actttgaatc cagcgatccg agttcaaatc 60
tcggtgggac cta 73
<210> 323
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 323
gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg acttgaaatc cattggggtc tccccgcgca 60
ggttcgaatc ctgccgacta cgg 83
<210> 324
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 324
agcagagtgg cgcagcggaa gcgtgctggg cccataaccc agaggtcgat ggatcgaaac 60
catcctctgc tat 73
<210> 325
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 325
ggaccacgtg gcctaatgga taaggcgtct gacttcggat cagaagattg agggttcgaa 60
tccctccgtg gtta 74
<210> 326
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 326
tgtagtcgtg gccgagtggt taaggcgatg gactagaaat ccattggggt ctccccgcgc 60
aggttcgaat cctgccgact acg 83
<210> 327
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 327
agcagagtgg cgcagcggaa gcgtgctggg cccataaccc agaggtcgat ggatcgaaac 60
catcctctgc tag 73
<210> 328
<211> 84
<212> DNA
<213> 智人
<400> 328
cgtcaggatg gccgagcggt ctaaggcgct gcgttcaggt cgcagtctcc cctggaggcg 60
tgggttcgaa tcccactcct gaca 84
<210> 329
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 329
ggctccgtgg cttagctggt taaagcgcct gtctagtaaa caggagatcc tgggttcgaa 60
tcccagcggg gcctg 75
<210> 330
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 330
agggccagtg gcgcaatgga taacgcgtct gactacggat cagaagattc caggttcgac 60
tcctggctgg ctcg 74
<210> 331
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 331
ggtttccgta gtgtagtggt tatcacgttc gcctcacacg cgaaaggtcc ccggttcgaa 60
accgggcgga aaca 74
<210> 332
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 332
aggggatgta gctcagtggt agagcgcatg cttcgcatgt atgaggtccc gggttcgatc 60
cccggcatct cca 73
<210> 333
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 333
tggccggtta gctcagttgg ttagagcgtg gtgctaataa cgccaaggtc gcgggttcga 60
tccccgtacg ggcca 75
<210> 334
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 334
cggctcgttg gtctaggggt atgattctcg cttagggtgc gagaggtccc gggttcaaat 60
cccggacgag ccc 73
<210> 335
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 335
agcccggcta gctcagtcgg tagagcatga gactcttaat ctcagggtcg tgggttcgag 60
ccccacgttg ggcg 74
<210> 336
<211> 92
<212> DNA
<213> 智人
<400> 336
tccttcgata gctcagttgg tagagcggag gactgtagtt ggctgtgtcc ttagacatcc 60
ttaggtcgct ggttcgaatc cggctcgaag ga 92
<210> 337
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 337
ggggaattag ctcaaatggt agagcgctcg cttagcatgc gagaggtagc gggatcgatg 60
cccgcattct ccag 74
<210> 338
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 338
cgccctctta gcgcagcggg cagcgcgtca gtctcataat ctgaaggtcc tgagttcgag 60
cctcagagag ggca 74
<210> 339
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 339
tgctccagtg gcgcaatcgg ttagcgcgcg gtacttatat ggcagtatgt gtgcgagtga 60
tgccgaggtt gtgagttcga gcctcacctg gagca 95
<210> 340
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 340
tgccgtgatc gtatagtggt tagtactctg cgttgtggcc gcagcaacct cggttcgaat 60
ccgagtcacg gca 73
<210> 341
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 341
ggccggttag ctcagttggt tagagcgtgg tgctaataac gccaaggtcg cgggttcgat 60
ccccgtacgg gccac 75
<210> 342
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 342
agtttccgta gtgtagtggt tatcacgttt gcctaacacg cgaaaggtcc ccggttcgaa 60
accgggcaga aaca 74
<210> 343
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 343
gcttctgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctcacacgc gaaaggtccc cggttcgaaa 60
ccgggcagaa gcaa 74
<210> 344
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 344
ttcctcgtta gtatagtggt gagtatcccc gcctgtcacg cgggagaccg gggttcgatt 60
ccccgacggg gag 73
<210> 345
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 345
gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg acttgaaatc cattggggtt tccccgcgca 60
ggttcgaatc ctgtcggcta cgg 83
<210> 346
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 346
aggttccatg gtgtaatggt tagcactctg gactctgaat ccagcgatcc gagttcaaat 60
ctcggtggaa cct 73
<210> 347
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 347
tcctcgttag tatagtggtg agtgtccccg tctgtcacgc gggagaccgg ggttcgattc 60
cccgacgggg aga 73
<210> 348
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 348
gtttccgtag tgtagtggtt atcacgttcg cctaacacgc gaaaggtccc tggatcaaaa 60
ccaggcggaa acaa 74
<210> 349
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 349
cggccggtta gctcagttgg ttagagcgtg gtgctaataa cgccaaggtc gcgggttcga 60
tccccgtact ggcca 75
<210> 350
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 350
ggccccatgg tgtaatggtc agcactctgg actctgaatc cagcgatccg agttcaaatc 60
tcggtgggac cca 73
<210> 351
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 351
ggccccatgg tgtaatggtt agcactctgg actttgaatc cagcgatccg agttcaaatc 60
tcggtgggac ctt 73
<210> 352
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 352
tgggggtgta gctcagtggt agagcgcgtg cttagcatgt acgaggtccc gggttcaatc 60
cccggcacct cca 73
<210> 353
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 353
ggggatgtag ctcagtggta gagcgcatgc ttagcatgca tgaggtcccg ggttcgatcc 60
ccagcatctc cag 73
<210> 354
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 354
agggggtgta gctcagtggt agagcgcgtg cttcgcatgt acgaggcccc gggttcgacc 60
cccggctcct cca 73
<210> 355
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 355
gggggtgtag ctcagtggta gagcgcgtgc ttagcatgca cgaggccccg ggttcaatcc 60
ccggcacctc cat 73
<210> 356
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 356
gggggtgtag ctcagtggta gagcgcgtgc ttagcatgca cgaggccccg ggttcaatcc 60
ccggcacctc cag 73
<210> 357
<211> 107
<212> DNA
<213> 智人
<400> 357
gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactcaagct aagcttcctc cgcggtgggg 60
attctggtct ccaatggagg cgtgggttcg aatcccactt ctgacac 107
<210> 358
<211> 106
<212> DNA
<213> 智人
<400> 358
tgtcaggatg gccgagtggt ctaaggcgcc agactcaagc ttggcttcct cgtgttgagg 60
attctggtct ccaatggagg cgtgggttcg aatcccactt ctgaca 106
<210> 359
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 359
ggttccatgg tgtaatggtt agcactctgg actctgaatc cagcgatccg agttcaaatc 60
tcggtggaac ctt 73
<210> 360
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 360
ggtagcgtgg ccgagcggtc taaggcgctg gattaaggct ccagtctctt cgggggcgtg 60
ggttcgaatc ccaccgctgc cag 83
<210> 361
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 361
tgcctcctta gcgcagtagg cagcgcgtca gtctcataat ctgaaggtcc tgagttcgaa 60
cctcagaggg ggca 74
<210> 362
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 362
agcccggata gctcagtcgg tagagcatca gacttttaat ctgagggtcc agggttcaag 60
tccctgttcg ggcg 74
<210> 363
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 363
gcctccttag cgcagtaggc agcgcgtcag tctcataatc tgaaggtcct gagttcgaac 60
ctcagagggg gcag 74
<210> 364
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 364
ttccctggtg gtctagtggt taggattcgg cgctctcacc gccgcggccc gggttcgatt 60
cccggtcagg gaa 73
<210> 365
<211> 84
<212> DNA
<213> 智人
<400> 365
caccaggatg gccgagtggt taaggcgttg gacttaagat ccaatggaca tatgtccgcg 60
tgggttcgaa ccccactcct ggta 84
<210> 366
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 366
tggctcgttg gtctaggggt atgattctcg cttagggtgc gagaggtccc gggttcaaat 60
cccggacgag ccc 73
<210> 367
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 367
agccccagtg gcctaatgga taaggcattg gcctcctaag ccagggattg tgggttcgag 60
tcccatctgg ggtg 74
<210> 368
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 368
ggggatatag ctcaggggta gagcatttga ctgcagatca agaggtcccc ggttcaaatc 60
cgggtgcccc ccc 73
<210> 369
<211> 94
<212> DNA
<213> 智人
<400> 369
cccttcgata gctcagctgg tagagcggag gactgtagct acttcctcag caggagacat 60
ccttaggtcg ctggttcgat tccggctcga agga 94
<210> 370
<211> 90
<212> DNA
<213> 智人
<400> 370
cccttcgata gctcagctgg tagagcggag gactgtaggc gcgcgcccgt ggccatcctt 60
aggtcgctgg ttcgattccg gctcgaagga 90
<210> 371
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 371
tgggggatta gctcaaatgg tagagcgctc gcttagcatg cgagaggtag cgggatcgat 60
gcccgcatcc tcca 74
<210> 372
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 372
gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actagaaatc cattggggtc tccccgcgca 60
ggttcgaatc ctgccgacta cgg 83
<210> 373
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 373
gcctcgttag cgcagtaggt agcgcgtcag tctcataatc tgaaggtcgt gagttcgatc 60
ctcacacggg gcac 74
<210> 374
<211> 92
<212> DNA
<213> 智人
<400> 374
ggctctgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttctagct gagcctagtg tggtcattca 60
aaggttgtgg gttcgagtcc caccagagtc ga 92
<210> 375
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 375
gtctctgtgg cgcaatcggt tagcgcgttc ggctgttaac cgaaaggttg gtggttcgag 60
cccacccagg gacgc 75
<210> 376
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 376
ggcagcgatg gccgagtggt taaggcgttg gacttgaaat ccaatggggt ctccccgcgc 60
aggttcgaac cctgctcgct gcg 83
<210> 377
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 377
ggttccatag tgtagtggtt atcacgtctg ctttacacgc agaaggtcct gggttcgagc 60
cccagtggaa ccat 74
<210> 378
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 378
ggttccatag tgtagcggtt atcacgtctg ctttacacgc agaaggtcct gggttcgagc 60
cccagtggaa ccac 74
<210> 379
<211> 87
<212> DNA
<213> 智人
<400> 379
tggctctgtg gcgcaatgga tagcgcattg gacttctaga tagttagaga aattcaaagg 60
ttgtgggttc gagtcccacc agagtcg 87
<210> 380
<211> 84
<212> DNA
<213> 智人
<400> 380
taccagaatg gccgagtggt taaggcgttg gacttaagat ccaatggatt catatccgcg 60
tgggttcgaa ccccacttct ggta 84
<210> 381
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 381
ggcccggata gctcagtcgg tagagcatca gacttttaat ctgagggtcc ggggttcaag 60
tccctgttcg ggcg 74
<210> 382
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 382
gccgaaatag ctcagttggg agagcgttag actgaagatc taaaggtccc tggttcgatc 60
ccgggtttcg gcag 74
<210> 383
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 383
gcccggatag ctcagtcggt agagcatcag acttttaatc tgagggtcca gggttcaagt 60
ccctgttcgg gcgg 74
<210> 384
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 384
gccgaaatag ctcagttggg agagcgttag actgaagatc taaaggtccc tggttcaatc 60
ccgggtttcg gcag 74
<210> 385
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 385
ggacgaggtg gccgagtggt taaggcgatg gactgctaat ccattgtgct ttgcacgcgt 60
gggttcgaat cccatcctcg tcg 83
<210> 386
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 386
ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgg tttgggtccg agaggtcccg ggttcaaatc 60
ccggacgagc ccc 73
<210> 387
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 387
agtcacggtg gccgagtggt taaggcgttg gactcgaaat ccaatggggt ttccccgcac 60
aggttcgaat cctgttcgtg acg 83
<210> 388
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 388
ctcctcgtta gtatagtggt tagtatcccc gcctgtcacg cgggagaccg gggttcaatt 60
ccccgacggg gag 73
<210> 389
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 389
ggacctcgtg gcgcaacggt agcgcgtctg actccagatc agaaggctgc gtgttcgaat 60
cacgtcgggg tca 73
<210> 390
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 390
ggggatgtag ctcagtggta gagcgcatgc tttgcatgta tgaggccccg ggttcgatcc 60
ccggcatctc cat 73
<210> 391
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 391
gccgaaatag ctcagttggg agagcgttag actgaagatc taaaggtccc tggttcgatc 60
ccgggtttcg gcac 74
<210> 392
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 392
aggggatgta gctcagtggt agagcgcatg ctttgcacgt atgaggcccc gggttcaatc 60
cccggcatct cca 73
<210> 393
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 393
gtctctgtgg cgcaatcggt tagcgcgttc ggctgttaac cgaaaggttg gtggttcgag 60
cccacccagg gacgg 75
<210> 394
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 394
tcccacatgg tctagcggtt aggattcctg gttttcaccc aggcggcccg ggttcgactc 60
ccggtgtggg aac 73
<210> 395
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 395
ggctccatag ctcaggggtt agagcgctgg tcttgtaaac caggggtcgc gagttcaatt 60
ctcgctgggg cctg 74
<210> 396
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 396
tggtagtgtg gccgagcggt ctaaggcgct ggatttaggc tccagtctct tcgggggcgt 60
gggttcgaat cccaccactg cca 83
<210> 397
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 397
ggctccatag ctcaggggtt agagcactgg tcttgtaaac caggggtcgc gagttcaaat 60
ctcgctgggg cctc 74
<210> 398
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 398
tggctcgttg gtctagtggt atgattctcg ctttgggtgc gagaggtccc gggttcaaat 60
cccggacgag ccc 73
<210> 399
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 399
ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actgtagatt gtacagacat ttgcggacat 60
ccttaggtcg ctggttcgat tccggctcga aggaa 95
<210> 400
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 400
aggccctata gctcaggggt tagagcactg gtcttgtaaa ccaggggtcg cgagttcaaa 60
tctcgctggg gcct 74
<210> 401
<211> 90
<212> DNA
<213> 智人
<400> 401
tccttcgata gctcagctgg tagagcggag gactgtagta cttaatgtgt ggtcatcctt 60
aggtcgctgg ttcgattccg gctcgaagga 90
<210> 402
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 402
tggctcgttg gtctaggggt atgattctcg ctttgggtgc gagaggtccc gggttcaaat 60
cccggacgag ccc 73
<210> 403
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 403
gcccggctag ctcagtcggt agagcatggg actcttaatc ccagggtcgt gggttcgagc 60
cccacgttgg gcgc 74
<210> 404
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 404
cggccggtta gctcagttgg ttagagcgtg gtgctaataa cgccaaggtc gcgggttcga 60
tccccgtacg ggcca 75
<210> 405
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 405
tcccacatgg tctagcggtt aggattcctg gttttcaccc aggcggcccg ggttcgactc 60
ccggtgtggg aat 73
<210> 406
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 406
gacgaggtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actgctaatc cattgtgctc tgcacgcgtg 60
ggttcgaatc ccatcctcgt cga 83
<210> 407
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 407
gccgtgatcg tatagtggtt agtactctgc gttgtggccg cagcaacctc ggttcgaatc 60
cgagtcacgg cat 73
<210> 408
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 408
cgccgtgatc gtatagtggt tagtactctg cgttgtggcc gcagcaacct cggttcgaat 60
ccgagtcacg gca 73
<210> 409
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 409
ggttccatgg tgtaatggtt agcactctgg actctgaatc cagcgatccg agttcaaatc 60
tcggtggaac ctg 73
<210> 410
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 410
tgcccggcta gctcagtcgg tagagcatgg gactcttaat cccagggtcg tgggttcgag 60
ccccacgttg ggcg 74
<210> 411
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 411
gggccgcgtg gcctaatgga taaggcgtct gacttcggat cagaagattg caggttcgag 60
tcctgccgcg gtcg 74
<210> 412
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 412
gcgccgctgg tgtagtggta tcatgcaaga ttcccattct tgcgacccgg gttcgattcc 60
cgggcggcgc ac 72
<210> 413
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 413
gggccgcgtg gcctaatgga taaggcgtct gattccggat cagaagattg agggttcgag 60
tcccttcgtg gtcg 74
<210> 414
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 414
cgccccggtg gcctaatgga taaggcattg gcctcctaag ccagggattg tgggttcgag 60
tcccacccgg ggta 74
<210> 415
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 415
gcccggctag ctcagtcggt agagcatgag acccttaatc tcagggtcgt gggttcgagc 60
cccacgttgg gcgt 74
<210> 416
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 416
aggcgcggtg gccaagtggt aaggcgtcgg tctcgtaaac cgaagatcac gggttcgaac 60
cccgtccgtg cct 73
<210> 417
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 417
ggtagcgtgg ccgagtggtc taaggcgctg gatttaggct ccagtcattt cgatggcgtg 60
ggttcgaatc ccaccgctgc cac 83
<210> 418
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 418
gggtagcgtg gccgagcggt ctaaggcgct ggattaaggc tccagtctct tcgggggcgt 60
gggttcgaat cccaccgctg cca 83
<210> 419
<211> 84
<212> DNA
<213> 智人
<400> 419
agtcaggatg gccgagcggt ctaaggcgct gcgttcaggt cgcagtctcc cctggaggcg 60
tgggttcgaa tcccacttct gaca 84
<210> 420
<211> 84
<212> DNA
<213> 智人
<400> 420
gtcaggatgg ccgagcggtc taaggcgctg cgttcaggtc gcagtctccc ctggaggcgt 60
gggttcgaat cccacttctg acag 84
<210> 421
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 421
gcctcgttag cgcagtaggc agcgcgtcag tctcataatc tgaaggtcgt gagttcgagc 60
ctcacacggg gcag 74
<210> 422
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 422
ggtagcgtgg ccgagcggtc taaggcgctg gatttaggct ccagtctctt cggaggcgtg 60
ggttcgaatc ccaccgctgc cag 83
<210> 423
<211> 89
<212> DNA
<213> 智人
<400> 423
tggctctgtg gcgcaatgga tagcgcattg gacttctagt gacgaataga gcaattcaaa 60
ggttgtgggt tcgaatccca ccagagtcg 89
<210> 424
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 424
cgcattggtg gttcagtggt agaattctcg cctgccacgc gggaggcccg ggttcgattc 60
ccggccaatg ca 72
<210> 425
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 425
gctgtgatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actcgaaatc caatggggtc tccccgcgca 60
ggttcgaatc ctgctcacag cgt 83
<210> 426
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 426
ggcgccgtgg cttagctggt taaagcgcct gtctagtaaa caggagatcc tgggttcgaa 60
tcccagcggt gcctg 75
<210> 427
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 427
cgacctcgtg gcgcaacggt agcgcgtctg actccagatc agaaggttgc gtgttcaaat 60
cacgtcgggg tca 73
<210> 428
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 428
agacgaggtg gccgagtggt taaggcgatg gactgctaat ccattgtgct ctgcacgcgt 60
gggttcgaat cccatcctcg tcg 83
<210> 429
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 429
cggcgccgtg gcttagttgg ttaaagcgcc tgtctagtaa acaggagatc ctgggttcga 60
atcccagcgg tgcct 75
<210> 430
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 430
ggcctcgtgg cgcaacggta gcgcgtctga ctccagatca gaaggttgcg tgttcaaatc 60
acgtcggggt caa 73
<210> 431
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 431
agcgttggtg gtatagtggt aagcatagct gccttccaag cagttgaccc gggttcgatt 60
cccggccaac gca 73
<210> 432
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 432
tcctcgttag tatagtggtg agtatccccg cctgtcacgc gggagaccgg ggttcgattc 60
cccgacgggg aga 73
<210> 433
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 433
ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgc ttcgggtgcg agaggtcccg ggttcaaatc 60
ccggacgagc cct 73
<210> 434
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 434
ggcgccgtgg cttagttggt taaagcgcct gtctagtaaa caggagatcc tgggttcgaa 60
tcccagcggt gcctt 75
<210> 435
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 435
gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actagaaatc cattggggtc tccccgcgca 60
ggttcgaatc ctgccgacta cgt 83
<210> 436
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 436
tgacctcgtg gcgcaatggt agcgcgtctg actccagatc agaaggttgc gtgttcaagt 60
cacgtcgggg tca 73
<210> 437
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 437
aggcgcggtg gccaagtggt aaggcgtcgg tctcgtaaac cgaagatcgc gggttcgaac 60
cccgtccgtg cct 73
<210> 438
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 438
agggggtata gctcagtggt agagcatttg actgcagatc aagaggtccc cggttcaaat 60
ccgggtgccc cct 73
<210> 439
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 439
gggggtatag ctcagtggta gagcatttga ctgcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60
cgggtgcccc ctc 73
<210> 440
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 440
gggggtatag ctcagtggta gagcatttga ctgcagatca agaggtcccc ggttcaaatc 60
cgggtgcccc ctc 73
<210> 441
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 441
aggtcccatg gtgtaatggt tagcactctg gactttgaat ccagcgatcc gagttcaaat 60
ctcggtggga cct 73
<210> 442
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 442
gacccagtgg cctaatggat aaggcatcag cctccggagc tggggattgt gggttcgagt 60
cccatctggg tcgc 74
<210> 443
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 443
agccccagtg gcctaatgga taaggcactg gcctcctaag ccagggattg tgggttcgag 60
tcccacctgg ggta 74
<210> 444
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 444
gccccagtgg cctaatggat aaggcactgg cctcctaagc cagggattgt gggttcgagt 60
cccacctggg gtgt 74
<210> 445
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 445
agaccgcgtg gcctaatgga taaggcgtct gacttcggat cagaagattg agggttcgag 60
tcccttcgtg gtcg 74
<210> 446
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 446
cgtctctgtg gcgcaatcgg ttagcgcgtt cggctgttaa ccgaaaggtt ggtggttcga 60
gcccacccag ggacg 75
<210> 447
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 447
ggcgttggtg gtatagtggt tagcatagct gccttccaag cagttgaccc gggttcgatt 60
cccggccaac gca 73
<210> 448
<211> 74
<212> DNA
<213> 智人
<400> 448
gtttccgtag tgtagcggtt atcacattcg cctcacacgc gaaaggtccc cggttcgatc 60
ccgggcggaa acag 74
<210> 449
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 449
tggcgccgtg gcttagttgg ttaaagcgcc tgtctagtaa acaggagatc ctgggttcga 60
atcccagcgg tgcct 75
<210> 450
<211> 94
<212> DNA
<213> 智人
<400> 450
gctccagtgg cgcaatcggt tagcgcgcgg tacttatatg acagtgcgag cggagcaatg 60
ccgaggttgt gagttcgatc ctcacctgga gcac 94
<210> 451
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 451
gcatgggtgg ttcagtggta gaattctcgc ctgccacgcg ggaggcccgg gttcgattcc 60
cggcccatgc ag 72
<210> 452
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成引物”
<400> 452
tgagttggca acctgtggta 20
<210> 453
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成引物”
<400> 453
ttgggtgtcc atgaaaatca 20
<210> 454
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成探针”
<400> 454
uagcagagga ugguuucgau ccauca 26
<210> 455
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成探针”
<400> 455
tagcagagga tggtttcgat ccatca 26
<210> 456
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成6xHis标签”
<400> 456
His His His His His His
1 5
<210> 457
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成探针”
<400> 457
ccaatggatt tctatccatc gccttaacca ctcggccacg actacaaaa 49
<210> 458
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成探针”
<400> 458
cagauuaaaa gucug 15
<210> 459
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 459
ggcucuaugg cuuaguuggu uaaagcgccu gucucguaaa caggagaucc uggguucgac 60
ucccaguggg gccucaa 77
<210> 460
<211> 84
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 460
gucaggaugg ccgagugguc uaaggcgcca gacucaaguu cuggucuccg uauggaggcg 60
uggguucgaa ucccacuucu gaca 84
<210> 461
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“未知序列的描述： 靶标序列”
<400> 461
cagtgtgtga agacggctgc 20
<210> 462
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成 寡核苷酸”
<400> 462
ggcucguugg ucuaggggua ugauucucgc uuagggugcg agaggucccg gguucaaauc 60
ccggacgagc cc 72
<210> 463
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 463
ggggauguag cucaguggua gagcgcaugc uuugcaugua ugaggucccg gguucgaucc 60
ccggcaucuc ca 72
<210> 464
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 464
ggcucguugg ucuaggggua ugaucucgcu uagggugcga gaggucccgg guucaaaucc 60
cggacgagcc c 71
<210> 465
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 465
ggcucugugg cuuaguuggc uaaagcgccu gucucguaaa caggagaucc uggguucgaa 60
ucccagcggg gccu 74
<210> 466
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 466
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 467
<211> 82
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 467
gguagcgugg ccgagcgguc uaaggcgcug gauuaaggcu ccagucucuu cggaggcgug 60
gguucgaauc ccaccgcugc ca 82
<210> 468
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 468
ggcgccgugg cuuaguuggu uaaagcgccu gucuaguaaa caggagaucc uggguucgaa 60
ucccagcggu gccu 74
Claims (71)
1.一种调节包含内源开放阅读框(ORF)的细胞中的tRNA池的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
任选地，获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如获得该细胞中(i)和(ii)的相对量的信息，其中(i)是tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子，并且(ii)是同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子；
使该细胞与包含TREM的组合物接触，其中该TREM具有与以下配对的反密码子：(a)该具有第一序列的密码子；或(b)不是该具有第一序列的密码子的密码子，其量和时间足以调节该细胞中该第一tRNA部分和该第二tRNA部分的相对量，
从而调节该细胞中的该tRNA池。
2.一种调节具有内源开放阅读框(ORF)的受试者中的tRNA池的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
任选地，获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如获得该受试者中(i)和(ii)的相对量的信息，其中(i)是tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子，并且(ii)是同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与该受试者中不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子；
使该受试者与包含TREM的组合物接触，其中该TREM具有与以下配对的反密码子：(a)该具有第一序列的密码子；或(b)不是该具有第一序列的密码子的密码子，其量和时间足以调节该受试者中该第一tRNA部分和该第二tRNA部分的相对量，
从而调节该受试者中的该tRNA池。
3.一种评价具有内源ORF的细胞中的tRNA池的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括获得，例如直接或间接获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如获得该细胞中(i)和(ii)的相对量的信息，其中(i)是tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子，并且(ii)是同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与该细胞中不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子，从而评价该细胞中的该tRNA池。
4.一种评价具有内源ORF的受试者中的tRNA池的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括获得，例如直接或间接获得(i)和(ii)中一个或两个的丰度的信息，例如获得该受试者中(i)和(ii)的相对量的信息，其中(i)是tRNA部分(第一tRNA部分)，该tRNA部分具有与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子，并且(ii)是同工受体tRNA部分(第二tRNA部分)，该同工受体tRNA部分具有与该细胞中不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子，从而评价该受试者中的该tRNA池。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，该方法包含获得(i)的信息。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，该方法包含获得(ii)的信息。
7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，该方法包含获得(i)和(ii)的信息。
8.如权利要求1-5或7中任一项所述的方法，其中获得(i)的信息包括获得(i)的丰度值，例如相对量。
9.如权利要求1-4或6-7中任一项所述的方法，其中获得(ii)的信息包括获得(ii)的丰度值，例如相对量。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中响应于所述值，该方法包括使该细胞或受试者与包含TREM的组合物接触，其中该TREM具有与以下配对的反密码子：(a)该具有第一序列的密码子；或(b)不是该具有第一序列的密码子的密码子，其量和时间足以调节该第一tRNA部分和该第二tRNA部分的相对量。
11.如权利要求1-2或5-10中任一项所述的方法，其中包含TREM的该组合物是包含TREM的药物组合物或包含TREM的GMP级组合物。
12.如权利要求1-2或5-11中任一项所述的方法，其中该TREM不包含与终止密码子配对的反密码子。
13.一种调节包含内源开放阅读框(ORF)的受试者或细胞中的tRNA池的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
提供包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有与该SMC配对的反密码子序列的同工受体tRNA部分(该TREM)；
使该受试者与包含该TREM的组合物接触，或在细胞的情况下，使该细胞与来自包含该TREM的组合物的TREM接触，其量和/或时间足以调节该受试者中或该细胞中的tRNA池，
从而调节该受试者或该细胞中的该tRNA池。
14.如权利要求13所述的方法，其中在与包含TREM的该组合物接触之前，该受试者或该细胞包含具有与该SMC配对的反密码子的第一tRNA部分(该第一tRNA部分)和具有与不是该SMC的密码子配对的反密码子的第二tRNA部分(该第二tRNA部分)。
15.一种治疗具有内源开放阅读框(ORF)的受试者的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
提供包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有以下的同工受体tRNA部分：与该ORF中该具有第一序列的密码子配对的反密码子；或与不是该具有第一序列的密码子的密码子配对的反密码子，
使该受试者与包含该TREM的组合物接触，其量和/或时间足以治疗该受试者，
从而治疗该受试者。
16.一种治疗具有内源ORF的受试者的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
提供包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有与该SMC配对的反密码子的同工受体tRNA部分(该TREM)；
使该受试者与包含TREM的该组合物接触，其量和时间足以治疗该受试者，
从而治疗该受试者。
17.一种治疗具有内源ORF的受试者的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
(i)获得，例如直接或间接获得该受试者的SMC状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中SMC的存在或不存在的量度，并且将该受试者鉴定为具有SMC；以及
(ii)响应于所述值，向该受试者施用包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有与该SMC配对的反密码子的同工受体tRNA部分，
从而治疗该受试者。
18.一种治疗具有内源ORF的受试者的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
(i)获得，例如直接或间接获得该受试者中该具有第一序列的密码子的状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中该具有第一序列的密码子的存在或不存在的量度；并且将该受试者鉴定为包含该具有第一序列的密码子；以及
(ii)响应于所述值，向该受试者施用包含TREM的组合物，其中该TREM包含具有与该具有第一序列的密码子配对的反密码子的同工受体tRNA部分，
从而治疗该受试者。
19.一种评价具有内源开放阅读框(ORF)的受试者的方法，该ORF包含具有第一序列的密码子，该方法包括：
获得，例如直接或间接获得该受试者中该具有第一序列的密码子的状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中该具有第一序列的密码子的存在或不存在的量度；以及
将该受试者鉴定为包含该具有第一序列的密码子，
从而评价该受试者。
20.一种评价具有内源ORF的受试者的方法，该ORF包含具有同义突变的密码子(同义突变密码子或SMC)，该方法包括：
获得，例如直接或间接获得该受试者的SMC状态的值，其中所述值包含来自该受试者的样品中SMC的存在或不存在的量度；以及
将该受试者鉴定为具有SMC，
从而评价该受试者。
21.如权利要求2-20中任一项所述的方法，其中该受试者具有或被鉴定为具有选自表1的障碍或症状。
22.如权利要求1或3-20中任一项所述的方法，其中该细胞与选自表1的障碍或症状相关。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中(a)该具有第一序列的ORF密码子；或(b)该SMC；在不存在与包含TREM的该组合物的接触的情况下与如下表型相关，例如不需要的表型，例如障碍或症状，例如选自表1的障碍或症状。
24.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍或症状选自表1中提供的疾病组，例如心血管、皮肤、内分泌、免疫学、神经学、肿瘤学、眼科或呼吸疾病。
25.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是心脏肥大。
26.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是冠状动脉疾病。
27.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是高血压。
28.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍或症状是肥胖相关的特征。
29.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是1型糖尿病。
30.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是2型糖尿病。
31.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是牛皮癣。
32.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是子宫内膜异位。
33.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是慢性炎症性疾病，例如强直性脊柱炎、克罗恩氏病、牛皮癣、原发性硬化性胆管炎、溃疡性结肠炎或基因多效性。
34.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是克罗恩氏病。
35.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是格雷夫氏病。
36.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是阿尔茨海默氏病，例如按年龄发作的阿尔茨海默氏病或家族性阿尔茨海默氏病。
37.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是重度抑郁障碍。
38.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是偏头痛。
39.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是帕金森氏病。
40.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是精神分裂症。
41.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍或症状是对化疗的不良反应，例如中性粒细胞减少或白细胞减少。
42.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是乳腺癌，例如早发性乳腺癌。
43.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是卵巢癌。
44.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是结直肠癌。
45.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是上皮性卵巢癌中的卡铂分布。
46.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是多发性骨髓瘤中的艰难梭菌感染。
47.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是子宫内膜癌，例如具有子宫内膜样组织学。
48.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是食管鳞状细胞癌。
49.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是胶质母细胞瘤。
50.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是肺癌。
51.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍或症状是巨噬细胞迁移抑制因子水平。
52.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是口腔癌和咽癌。
53.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是胰腺癌。
54.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是近视。
55.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是COPD。
56.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中该障碍是哮喘。
57.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该具有第一序列的ORF密码子或该SMC位于表1中提供的转录本中。
58.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该具有第一序列的ORF密码子或该SMC包含表1中提供的密码子，例如表1的“密码子从/到”栏中列出的密码子，例如表1中所述栏中列出的第二密码子。
59.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该第一tRNA部分包含内源tRNA和TREM。
60.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该第二tRNA部分包含内源tRNA和TREM。
61.如权利要求1-2或10-60中任一项所述的方法，其中包含TREM的该组合物通过本文所述的方法制备，例如使用合成方法(例如，使用固态合成或液相合成来合成)；使用体外转录(IVT)，或通过在细胞中表达编码TREM的载体。
62.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该ORF或该含有SMC的ORF编码多肽。
63.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该ORF或该含有SMC的ORF是染色体ORF或线粒体ORF。
64.如权利要求1-2或10-63中任一项所述的方法，其中包含TREM的该组合物是包含TREM的药物组合物。
65.如权利要求1-2或10-64中任一项所述的方法，其中包含TREM的该组合物包含药物赋形剂。
66.如权利要求1-2或10-65中任一项所述的方法，其中包含TREM的该组合物用递送剂，例如脂质体、聚合物(例如，聚合物缀合物)、颗粒、微球体、微颗粒或纳米颗粒施用。
67.如权利要求1-2或10-65中任一项所述的方法，其中包含TREM的该组合物在没有载剂的情况下施用，例如通过该TREM的裸递送。
68.如权利要求1-2或10-67中任一项所述的方法，其中该TREM包含同源衔接子功能，并且任选地其中该TREM介导在肽链的起始或延伸中与该TREM的反密码子天然相关的氨基酸的接受和掺入。
69.如权利要求1-2或10-68中任一项所述的方法，其中该TREM包含与表2中所列DNA序列编码的RNA至少80％相同的RNA序列，或者其片段或功能片段。
70.如权利要求1-2或10-69中任一项所述的方法，其中该TREM包含表2中所列DNA序列编码的RNA序列，或其片段。
71.如权利要求1-2或10-70中任一项所述的方法，其中该TREM包含与表2中所列DNA序列编码的RNA序列至少XX％相同的RNA序列，或其片段，其中XX选自80、85、90、95、96、97、98或99。
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