CN113874076A - 包括ttr向导rna和对rna引导的dna结合剂进行编码的多核苷酸的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于在TTR基因内编辑，例如引入双链断裂的组合物和方法。提供了用于治疗患有与运甲状腺素蛋白相关的淀粉样变性(ATTR)的受试者的组合物和方法。

Description

包括TTR向导RNA和对RNA引导的DNA结合剂进行编码的多核苷 酸的组合物和方法
本专利申请要求于2019年3月28日提交的美国临时申请62/825,637的优先权，所述美国临时申请的内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并且特此以全文引用的方式并入。创建于2020年3月24日的所述ASCII副本命名为2020-03-24_01155-0028-00PCT_ST25.txt，并且大小为451KB。
运甲状腺素蛋白(TTR)是一种由TTR基因产生的通常用于将视黄醇和甲状腺素转运到全身的蛋白质。TTR主要在肝脏中合成，其中小部分在脉络丛和视网膜中产生。TTR通常作为可溶性四聚体蛋白在血液中循环。
TTR的可能破坏四聚体稳定性的致病变体可以由TTR基因的突变等位基因编码。突变型TTR可能导致错误折叠的TTR，所述错误折叠的TTR可能产生淀粉样蛋白(即错误折叠的TTR蛋白的聚集体)。在一些情况下，TTR的致病变体可能导致淀粉样变性或由淀粉样蛋白积聚引起的疾病。例如，错误折叠的TTR单体可以在组织，如周围神经、心脏和胃肠道内聚合成淀粉样原纤维。淀粉样斑块也可以包括已经沉积在错误折叠的TTR上的野生型TTR。
也已经在60岁或以上的男性中观察到野生型TTR的错误折叠和沉积，并且所述错误折叠和沉积与心律问题、心力衰竭和腕管相关。
以TTR沉积为特征的淀粉样变性可以称为“ATTR”、“TTR相关淀粉样变性”、“TTR淀粉样变性”或“ATTR淀粉样变性”、“ATTR家族性淀粉样变性”(当与家族中的基因突变相关时)或“ATTRwt”或“野生型ATTR”(当由野生型TTR的错误折叠和沉积引起时)。
ATTR可以表现为广泛的症状，并且患有不同类别的ATTR的患者可能有不同的特性和预后。一些类别的ATTR包含家族性淀粉样多神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)和野生型TTR淀粉样变性(wt-TTR淀粉样变性)。FAP通常表现为感觉运动神经病变，而FAC和wt-TTR淀粉样变性通常表现为充血性心力衰竭。FAP和FAC通常与TTR基因中的基因突变相关，并且TTR基因中超过100个不同的突变与ATTR相关。相比之下，wt-TTR淀粉样变性与衰老相关，而与TTR中的基因突变无关。据估计，全世界大约有50,000名患者可能受到FAP和FAC的影响。
虽然TTR中超过100个突变与ATTR相关，但某些突变与神经病变和/或心肌病更密切地相关。例如，TTR的T60处的突变与心肌病和神经病变两者相关；V30处的突变与神经病变更相关；并且V122处的突变与心肌病更相关。
已经研究了一系列用于治疗ATTR的治疗方法，但是没有可以阻止疾病进展并提高生活质量的经批准的药物。虽然肝脏移植已经被研究用于治疗ATTR，但其使用正在下降，因为其涉及重大风险，并且在移植后疾病进展有时会继续。小分子稳定剂，如二氟尼柳和氯苯唑酸，似乎可减缓ATTR进展，但这些药剂并不能停止疾病进展。
目前也在研究使用小干扰RNA(siRNA)敲低、反义敲低或靶向淀粉样原纤维以进行破坏的单克隆抗体的方法，但是尽管短期抑制TTR表达的结果出了令人鼓舞的初步数据，但需要可以产生持久抑制TTR的治疗。
因此，提供了以下实施例。在一些实施例中，本发明提供了使用向导RNA与RNA引导的DNA结合剂(如CRISPR/Cas系统)大体上降低或敲除TTR基因的表达，由此大体上降低或消除与ATTR相关的TTR蛋白的产生的组合物和方法。通过改变TTR基因来大体上减少或消除与ATTR相关的TTR蛋白的产生可以是长期减少或消除。
发明内容
本文提供了以下实施例。
实施例1是一种组合物，其包括：
(i)核酸，所述核酸包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框，其中：
a.所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少93％同一性的序列；和/或
b.所述开放阅读框在其至少前50个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少93％的同一性，或者在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；和/或
c.所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表4中列出的密码子、表5的低A集合或表5的低A/U集合；和/或
d.所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的123％；和/或
e.所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％；以及
(ii)向导RNA或对向导RNA进行编码的载体，其中所述向导RNA包括选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的向导序列。
实施例2是一种对TTR基因进行修饰和/或在TTR基因内诱导双链断裂(DSB)的方法，所述方法包括向细胞递送组合物，其中所述组合物包括：
(i)核酸，所述核酸包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框，其中：
a.所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少93％同一性的序列；和/或
b.所述开放阅读框在其至少前50个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少93％的同一性，或者在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；和/或
c.所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表4中列出的密码子、表5的低A集合或表5的低A/U集合；和/或
d.所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的123％；和/或
e.所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％；以及
(ii)向导RNA或对向导RNA进行编码的载体，其中所述向导RNA包括选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的向导序列。
实施例3是一种降低TTR血清浓度、治疗与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)和/或减少或预防包括TTR的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用组合物，其中所述组合物包括：
(i)核酸，所述核酸包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框，其中：
a.所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少95％同一性的序列；和/或
b.所述开放阅读框在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；和/或
c.所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表4中列出的密码子、表5的低A集合或表5的低A/U集合；和/或
d.所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的150％；和/或
e.所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％；以及
(ii)向导RNA或对向导RNA进行编码的载体，其中所述向导RNA包括选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的向导序列，由此降低TTR血清浓度、治疗与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)和/或减少或预防包括TTR的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在所述受试者中累积。
实施例4是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述向导RNA包括选自SEQ ID NO:5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17、22、23、27、29、30、35、36、37、38、55、61、63、65、66、68或69的向导序列。
实施例5是根据实施例1或4所述的组合物，其用于在细胞或受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)。
实施例6是根据实施例1、4或5所述的组合物，其用于对细胞或受试者中的TTR基因进行修饰。
实施例7是根据实施例1、4、5或6所述的组合物，其用于治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)。
实施例8是根据实施例1、4、5、6或7所述的组合物，其用于降低受试者的TTR血清浓度。
实施例9是根据实施例1、4、5、6、7或8所述的组合物，其用于减少或预防淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积。
实施例10是根据实施例2到9中任一项所述的供使用的组合物或方法，其中所述方法包括通过输注施用所述组合物持续超过30分钟。
实施例11是根据实施例10所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物通过输注施用持续约45-75分钟、75-105分钟、105-135分钟、135-165分钟、165-195分钟、195-225分钟、225-255分钟、255-285分钟、285-315分钟、315-345分钟或345-375分钟。
实施例12是根据实施例10或11所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物通过输注施用持续约1.5-6小时。
实施例13是根据实施例10所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物通过输注施用持续约60分钟、约90分钟、约120分钟、约150分钟、约180分钟或约240分钟。
实施例14是根据实施例10所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物通过输注施用持续约120分钟。
实施例15是根据实施例2到14中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物降低血清TTR水平。
实施例16是根据实施例15所述的方法或供使用的组合物，其中与施用所述组合物之前的血清TTR水平相比，所述血清TTR水平降低了至少50％。
实施例17是根据实施例151所述的方法或供使用的组合物，其中与施用所述组合物之前的血清TTR水平相比，所述血清TTR水平降低了50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％、95-98％、98-99％或99-100％。
实施例18是根据实施例2到17中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物导致TTR基因的编辑。
实施例19是根据实施例18所述的方法或供使用的组合物，其中所述编辑被计算为被编辑的群体的百分比(编辑百分比)。
实施例20是根据实施例19所述的方法或供使用的组合物，其中所述编辑百分比介于群体的30与99％之间。
实施例21是根据实施例19所述的方法或供使用的组合物，所述编辑百分比介于群体的30％与35％之间、35与40％之间、40与45％之间、45与50％之间、50与55％之间、55与60％之间、60与65％之间、65与70％之间、70与75％之间、75与80％之间、80与85％之间、85与90％之间、90与95％之间或95与99％之间。
实施例22是根据实施例2到21中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物减少至少一个组织中的淀粉样沉积。
实施例23是根据实施例22所述的方法或供使用的组合物，其中所述至少一个组织包括以下中的一个或多个：胃、结肠、坐骨神经或背根神经节。
实施例24是根据实施例22或23所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物后8周测量淀粉样沉积。
实施例25是根据实施例22到24中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中将淀粉样沉积与阴性对照或在施用所述组合物之前测量的水平进行比较。
实施例26是根据实施例22到25中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在活检样品中和/或通过免疫染色测量淀粉样沉积。
实施例27是根据实施例22到26中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中淀粉样沉积减少30到35％、35到40％、40到45％、45到50％、50到55％、55到60％、60到65％、65到70％、70到75％、75到80％、80到85％、85到90％、90到95％或95到99％的在阴性对照中所见的淀粉样沉积。
实施例28是根据实施例22到27中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中淀粉样沉积减少30到35％、35到40％、40到45％、45到50％、50到55％、55到60％、60到65％、65到70％、70到75％、75到80％、80到85％、85到90％、90到95％或95到99％的在施用所述组合物之前所见的淀粉样沉积。
实施例29是根据实施例2到28中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至少两次。
实施例30是根据实施例29所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至少三次。
实施例31是根据实施例29所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至少四次。
实施例32是根据实施例29所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至多五次、六次、七次、八次、九次或十次。
实施例33是根据实施例29到32中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述施用或递送以1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天的间隔发生。
实施例34是根据实施例29到32中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述施用或递送以1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周的间隔发生。
实施例35是根据实施例29到32中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述施用或递送以1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月或15个月的间隔发生。
实施例36是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA包括crRNA，所述crRNA包括所述向导序列并且进一步包括SEQ ID NO:126的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:126的核苷酸在其3'端处跟随所述向导序列。
实施例37是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA是双向导(dgRNA)。
实施例38是根据实施例37所述的方法或组合物，其中所述双向导RNA包括：包括SEQ ID NO:126的核苷酸序列的crRNA，其中SEQ ID NO:126的核苷酸在其3'端处跟随所述向导序列；以及trRNA。
实施例39是根据实施例1到36中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA是单向导(sgRNA)。
实施例40是根据实施例39所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括具有SEQ IDNO:3的模式的向导序列。
实施例41是根据实施例39所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括SEQ ID NO:3的序列。
实施例42是根据实施例39到41中任一项所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列以及SEQ ID NO:126的核苷酸中的任一个。
实施例43是根据实施例39到42中任一项所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括与选自SEQ ID No:87-113、115-120和122-124的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的序列。
实施例44是根据实施例39所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括选自SEQ IDNo:87-113、115-120和122-124的序列。
实施例45是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA包括至少一个修饰。
实施例46是根据实施例45所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含经2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。
实施例47是根据实施例45或46所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。
实施例48是根据实施例45到47中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含经2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。
实施例49是根据实施例45到48中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在5'端处的前五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。
实施例50是根据实施例45到49中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在3'端处的后五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。
实施例51是根据实施例45到50中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含前四个核苷酸之间的PS键。
实施例52是根据实施例45到51中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含后四个核苷酸之间的PS键。
实施例53是根据实施例45到52中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在5'端处的前三个核苷酸处的经2'-O-Me修饰的核苷酸。
实施例54是根据实施例45到53中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在3'端处的后三个核苷酸处的经2'-O-Me修饰的核苷酸。
实施例55是根据实施例45到54中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA包括SEQ ID NO:3的经修饰的核苷酸。
实施例56是根据实施例1到55中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。
实施例57是根据实施例1到56中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA和所述包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框的核酸与脂质纳米颗粒(LNP)相关。
实施例58是根据实施例57所述的方法或组合物，其中所述LNP包括CCD脂质。
实施例59是根据实施例58所述的方法或组合物，其中所述CCD脂质是脂质A或脂质B，任选地其中所述CCD脂质是脂质A。
实施例60是根据实施例57到59中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括辅助脂质。
实施例61是根据实施例60所述的方法或组合物，其中所述辅助脂质是胆固醇。
实施例62是根据实施例57到61中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括隐形脂质(例如，PEG脂质)。
实施例63是根据实施例62所述的方法或组合物，其中所述隐形脂质是PEG2k-DMG。
实施例64是根据实施例57到63中任一项所述的方法或组合物，其中：
(i)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(ii)所述LNP包括约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约27-39.5mol％的辅助脂质；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述LNP组合物的N/P比率为约5-7(例如，约6)；
(iii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(iv)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(v)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(vi)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；约0-10mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(vii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；小于约1mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(viii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10，并且其中所述LNP组合物基本上不含或不含中性磷脂；或者
(ix)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-7。
实施例64a是根据实施例64所述的方法或组合物，其中所述PEG脂质的mol％为约3。
实施例64b是根据实施例64或64a所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为约50。
实施例64c是根据实施例64到64b中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为约55。
实施例64d是根据实施例64到64c中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为±3mol％。
实施例64e是根据实施例64到64d中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为±2mol％。
实施例64f是根据实施例64到64e中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为47-53mol％。
实施例64g是根据实施例64到64f中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为48-53mol％。
实施例64h是根据实施例64到64g中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质的mol％为53-57mol％。
实施例64i是根据实施例64到64h中任一项所述的方法或组合物，其中N/P比率为6±1。
实施例64j是根据实施例64到64i中任一项所述的方法或组合物，其中N/P比率为6±0.5。
实施例64k是根据实施例64到64j中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质是脂质A。
实施例64l是根据实施例64到64l中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质是脂质A的类似物。
实施例64m是根据实施例64l所述的方法或组合物，其中所述类似物是缩醛类似物。
实施例64n是根据实施例64m所述的方法或组合物，其中所述缩醛类似物是C4-C12缩醛类似物。
实施例64o是根据实施例64m所述的方法或组合物，其中所述缩醛类似物是C5-C12缩醛类似物。
实施例64p是根据实施例64m所述的方法或组合物，其中所述缩醛类似物是C5-C10缩醛类似物。
实施例64q是根据实施例64m所述的方法或组合物，其中所述缩醛类似物选自C4、C5、C6、C7、C9、C10、C11和C12类似物。
实施例64r是根据实施例64到64q中任一项所述的方法或组合物，其中所述辅助脂质是胆固醇。
实施例64s是根据实施例64到64r中任一项所述的方法或组合物，其中所述中性脂质是DSPC。
实施例64t是根据实施例64到64s中任一项所述的方法或组合物，其中所述中性脂质是DPPC。
实施例64u是根据实施例64到64t中任一项所述的方法或组合物，其中所述PEG脂质包括二肉豆蔻酰甘油(DMG)。
实施例64v是根据实施例64到64u中任一项所述的方法或组合物，其中所述PEG脂质包括PEG-2k。
实施例64w是根据实施例64到64v中任一项所述的方法或组合物，其中所述PEG脂质是PEG-DMG。
实施例64x是根据实施例64w所述的方法或组合物，其中所述PEG-DMG是PEG2k-DMG。
实施例64y是根据实施例64到64x中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP组合物基本上不含中性脂质。
实施例64z是根据实施例64y所述的方法或组合物，其中所述中性脂质是磷脂。
实施例65是根据实施例57到64z中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP组合物包括中性脂质，任选地其中所述中性脂质是DSPC。
实施例66是根据实施例64到65中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质以约50mol％存在。
实施例67是根据实施例64到66中任一项所述的方法或组合物，其中所述中性脂质以约9mol％存在。
实施例68是根据实施例62到67中任一项所述的方法或组合物，其中所述隐形脂质以约3mol％存在。
实施例69是根据实施例60到68中任一项所述的方法或组合物，其中所述辅助脂质以约38mol％存在。
实施例70是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP的N/P比率为约6。
实施例71是根据实施例70所述的方法或组合物，其中所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50mol％的胺脂质，如脂质A；约9mol％的中性脂质，如DSPC；约3mol％的隐形脂质，如PEG脂质，如PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，如胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。
实施例72是根据实施例64到71中任一项所述的方法或组合物，其中所述胺脂质是脂质A。
实施例73是根据实施例64到72中任一项所述的方法或组合物，其中所述中性脂质是DSPC。
实施例74是根据实施例62到73中任一项所述的方法或组合物，其中所述隐形脂质是PEG2k-DMG。
实施例75是根据实施例60到74中任一项所述的方法或组合物，其中所述辅助脂质是胆固醇。
实施例76是根据实施例70中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50mol％的脂质A；约9mol％的DSPC；约3mol％的PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。
实施例77是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是Cas切割酶。
实施例78是根据实施例77所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是Cas9。
实施例79是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是经修饰的。
实施例80是根据实施例79所述的方法或组合物，其中经修饰的RNA引导的DNA结合剂包括核定位信号(NLS)。
实施例81是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是来自II型CRISPR/Cas系统的Cas。
实施例82是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物是药物调配物并且进一步包括药学上可接受的载体。
实施例83是根据实施例2到82中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物减少或预防包括TTR的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维。
实施例84是根据实施例83所述的方法或供使用的组合物，其中所述淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在神经、心脏或胃肠道中。
实施例85是根据实施例2到84中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中非同源末端接合(NHEJ)导致在修复TTR基因中的DSB期间发生突变。
实施例86是根据实施例85所述的方法或供使用的组合物，其中NHEJ导致在修复TTR基因中的DSB期间缺失或插入核苷酸。
实施例87是根据实施例86所述的方法或供使用的组合物，其中所述核苷酸的缺失或插入在TTR基因中诱导移码或无义突变。
实施例88是根据实施例86所述的方法或供使用的组合物，其中在至少50％的肝脏细胞的TTR基因中诱导移码或无义突变。
实施例89是根据实施例88所述的方法或供使用的组合物，其中在50％-60％、60％-70％、70％或80％、80％-90％、90-95％、95％-99％或99％-100％的肝脏细胞的TTR基因中诱导移码或无义突变。
实施例90是根据实施例86到89中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在TTR基因中发生核苷酸的缺失或插入是在脱靶位点中发生核苷酸的缺失或插入的至少50倍或更多倍。
实施例91是根据实施例90所述的方法或供使用的组合物，其中在TTR基因中发生核苷酸的缺失或插入是在脱靶位点中发生核苷酸的缺失或插入的50倍到150倍、150倍到500倍、500倍到1500倍、1500倍到5000倍、5000倍到15000倍、15000倍到30000倍或30000倍到60000倍。
实施例92是根据实施例86到91中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中核苷酸的缺失或插入发生在原代人肝细胞中小于或等于3、2、1或0个脱靶位点处，任选地其中所述脱靶位点不发生在所述原代人肝细胞的基因组中的蛋白质编码区中。
实施例93是根据实施例92所述的方法或供使用的组合物，其中核苷酸的缺失或插入发生在原代人肝细胞中的多个脱靶位点处，在所述原代人肝细胞中的所述脱靶位点的数量小于在Cas9过表达细胞中发生核苷酸的缺失或插入的脱靶位点的数量，任选地其中所述脱靶位点不发生在所述原代人肝细胞的基因组中的蛋白质编码区中。
实施例94是根据实施例93所述的方法或供使用的组合物，其中所述Cas9过表达细胞是稳定表达Cas9的HEK293细胞。
实施例95是根据实施例92到94中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中通过分析来自用Cas9 mRNA和向导RNA体外转染的原代人肝细胞的基因组DNA来确定原代人肝细胞中的脱靶位点的数量，任选地其中所述脱靶位点不发生在所述原代人肝细胞的基因组中的蛋白质编码区中。
实施例96是根据实施例92到94中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中通过寡核苷酸插入测定确定原代人肝细胞中的脱靶位点的数量，所述寡核苷酸插入测定包括分析来自用Cas9 mRNA、向导RNA以及供体寡核苷酸体外转染的原代人肝细胞的基因组DNA，任选地其中所述脱靶位点不发生在所述原代人肝细胞的基因组中的蛋白质编码区中。
实施例97是根据实施例1到36或39到96中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA的序列是：
a)SEQ ID NO:92或104；
b)SEQ ID NO:87、89、96或113；
c)SEQ ID NO:100、102、106、111或112；或者
d)SEQ ID NO:88、90、91、93、94、95、97、101、103、108或109。
实施例98是根据实施例97所述的方法或组合物，其中所述向导RNA不在原代人肝细胞基因组中的蛋白质编码区中发生的脱靶位点处产生插入缺失。
实施例99是根据实施例2到98中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用所述组合物降低受试者的TTR的水平。
实施例100是根据实施例99所述的方法或供使用的组合物，其中所述TTR的水平降低至少50％。
实施例101是根据实施例100所述的方法或供使用的组合物，其中所述TTR的水平降低50％-60％、60％-70％、70％或80％、80％-90％、90-95％、95％-99％或99％-100％。
实施例102是根据实施例100或101所述的方法或供使用的组合物，其中在血清、血浆、血液、脑脊液或痰中测量所述TTR的水平。
实施例103是根据实施例100或101所述的方法或供使用的组合物，其中在肝脏、脉络丛和/或视网膜中测量所述TTR的水平。
实施例104是根据实施例99到103中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量所述TTR的水平。
实施例105是根据实施例2到104中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有ATTR。
实施例106是根据实施例2到105中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者是人。
实施例107是根据实施例105或106所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有ATTRwt。
实施例108是根据实施例105或106所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有遗传性ATTR。
实施例109是根据实施例2到106或108中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有ATTR家族史。
实施例110是根据实施例2到106或108到109中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有家族性淀粉样多神经病。
实施例111是根据实施例2到110中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者仅患有或主要患有ATTR的神经症状。
实施例112是根据实施例2到111中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有家族性淀粉样心肌病。
实施例113是根据实施例2到110或112中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者仅患有或主要患有ATTR的心脏症状。
实施例114是根据实施例2到113中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者表达具有V30突变的TTR。
实施例115是根据实施例114所述的方法或供使用的组合物，其中所述V30突变是V30A、V30G、V30L或V30M。
实施例116是根据实施例2到113中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者表达具有T60突变的TTR。
实施例117是根据实施例116所述的方法或供使用的组合物，其中所述T60突变是T60A。
实施例118是根据实施例2到113中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者表达具有V122突变的TTR。
实施例119是根据实施例118所述的方法或供使用的组合物，其中所述V122突变是V122A、V122I或V122(-)。
实施例120是根据实施例2到113中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者表达野生型TTR。
实施例121是根据实施例2到107或120中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者不表达具有V30、T60或V122突变的TTR。
实施例122是根据实施例2到107或120到121中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者不表达具有病理性突变的TTR。
实施例123是根据实施例122所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者对野生型TTR是纯合的。
实施例124是根据实施例2到123中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用后，所述受试者的感觉运动神经病变的症状变化得以改善、稳定或减缓。
实施例125是根据实施例124所述的方法或供使用的组合物，其中使用肌电图、神经传导测试或患者报告的结果来测量感觉神经病变变化的改善、稳定或减缓。
实施例126是根据实施例2到125中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者的充血性心力衰竭的症状变化得以改善、稳定或减缓。
实施例127是根据实施例126所述的方法或供使用的组合物，其中使用心脏生物标志物测试、肺功能测试、胸部X射线或心电图测量充血性心力衰竭变化的改善、稳定或减缓。
实施例128是根据实施例2到127中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物或药物调配物通过病毒载体施用。
实施例129是根据实施例2到127中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物或药物调配物通过脂质纳米颗粒施用。
实施例130是根据实施例2到129中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物或调配物之前测试所述受试者的TTR基因中的特异性突变。
实施例131是根据前述实施例中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:5、6、9、13、14、15、16、17、22、23、27、30、35、36、37、38、55、63、65、66、68或69。
实施例132是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:5。
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实施例134是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:7。
实施例135是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:8。
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实施例181是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:54。
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实施例190是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:63。
实施例191是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:64。
实施例192是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:65。
实施例193是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:66。
实施例194是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:67。
实施例195是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:68。
实施例196是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:69。
实施例197是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:70。
实施例198是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:71。
实施例199是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:72。
实施例200是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:74。
实施例201是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:75。
实施例202是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:76。
实施例203是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:77。
实施例204是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:78。
实施例205是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:80。
实施例206是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:81。
实施例207是根据实施例1到130中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:82。
实施例208是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框在其序列的至少前10％、12％、15％、20％、25％、30％或35％上与SEQ ID NO:311具有至少95％同一性。
实施例209是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
实施例210是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框中至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表4、表5或表7中列出的密码子。
实施例211是根据实施例210所述的组合物或方法，其中表4、表5或表7中列出的密码子是表4中列出的密码子。
实施例212是根据实施例210所述的组合物或方法，其中表4、表5或表7中列出的密码子是表5的低U密码子集合中的密码子。
实施例213是根据实施例210所述的组合物或方法，其中表4、表5或表7中列出的密码子是表5的低A密码子集合中的密码子。
实施例214是根据实施例210所述的组合物或方法，其中表4、表5或表7中列出的密码子是表5的低A/U密码子集合中的密码子。
实施例215是根据实施例210所述的组合物或方法，其中表4、表5或表7中列出的密码子是表7中列出的密码子。
实施例216是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的101％、102％、103％、105％、110％、115％、120％或123％。
实施例217是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的101％、102％、103％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％。
实施例218是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述核酸包括与SEQ ID NO:232、234、236、238、241或275-277中的任一个具有至少90％同一性的5'UTR。
实施例219是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述核酸包括与SEQ ID NO:233、235、237、239或240中的任一个具有至少90％同一性的3'UTR。
实施例220是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述核酸包括来自相同来源的5'UTR和3'UTR。
实施例221是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述核酸是包括选自帽0、帽1和帽2的5'帽的mRNA。
实施例222是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:377具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
实施例223是根据前述实施例中任一项所述的组合物或方法，其中所述核酸是mRNA，在所述mRNA中，至少10％的尿苷被经修饰的尿苷取代。
实施例224是根据实施例223所述的组合物或方法，其中所述经修饰的尿苷是以下中的一种或多种：N1-甲基假尿苷、假尿苷、5-甲氧基尿苷或5-碘尿苷。
实施例225是根据实施例223所述的组合物或方法，其中所述经修饰的尿苷是N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷中的一者或两者。
实施例226是根据实施例223所述的组合物或方法，其中所述经修饰的尿苷是N1-甲基假尿苷。
实施例227是根据实施例223所述的组合物或方法，其中所述经修饰的尿苷是5-甲氧基尿苷。
实施例228是根据实施例223到210中任一项所述的组合物或方法，其中所述mRNA中15％到45％的尿苷被所述经修饰的尿苷取代。
实施例229是根据实施例223到211中任一项所述的组合物或方法，其中所述mRNA中至少20％或至少30％的尿苷被所述经修饰的尿苷取代。
实施例230是根据实施例229所述的组合物或方法，其中所述mRNA中至少80％或至少90％的尿苷被所述经修饰的尿苷取代。
实施例231是根据实施例229所述的组合物或方法，其中所述mRNA中100％的尿苷被所述经修饰的尿苷取代。
实施例232是一种根据实施例1或4到231中任一项所述的组合物或调配物的用途，其用于制备用于治疗患有ATTR的人类受试者的药物。
附图说明
图1A-1B示出了来自两个供体的原代人肝细胞中的编辑％，如实例2中所述。
图2示出了原代cyno肝细胞中的编辑％，如实例2中所述。
图3A-C示出了将30'施用LNP与长期给药方案进行比较的非人类灵长类动物体内研究中的血清TTR水平(图3A)、肝脏TTR编辑(图3B)和循环ALT水平(图3C)。
具体实施方式
现在将详细参照本发明的某些实施例，在附图中展示所述实施例的实例。尽管将结合所展示的实施例描述本发明，但应当理解，其并不旨在将本发明限制于那些实施例。相反，本发明旨在覆盖可以包含在由所附权利要求书限定的本发明内的所有替代方案、修改和等效物。
在详细描述本发明的教导之前，应理解，本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为此类组合物或工艺步骤可以变化。应注意的是，除非上下文另外明确指示，否则如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a/an)”以及“所述(the)”均包含复数指代物。因此，例如，对“缀合物(conjugate)”的引用包含多个缀合物，并且对“单元(cell)”的引用包含多个单元等。
数值范围包含定义所述范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关的误差，测得值和可测量值被理解为近似值。而且，“包括(comprise或comprises或comprising)”、“含有(contain或contains或containing)”和“包含(include或includes或including)”的使用不旨在是限制性的。应当理解，上述的一般描述和详细描述两者均仅是示例性和解释性的，并且不限制本教导。
除非说明书中特别指出，否则说明书中叙述“包括”各个组分的实施例也被考虑是“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”；说明书中叙述“由各个组分组成”的实施例也被认为是“包括所述组分”或“基本上由所述组分组成”；并且说明书中叙述“基本上由各个组分组成”的实施例也被认为是“由所述组分组成”或“包括所述组分”(这种可互换性不适用于这些术语在权利要求书中的使用)。术语“或”以开放性意义使用，也就是说，相当于“和/或”，除非上下文另外明确指示。
本文所使用的章节标题仅仅是出于组织的目的并且不应被解释为以任何方式限制期望的主题。如果通过引用并入的任何材料与本说明书中限定的任何术语或本说明书的任何其它明确的内容矛盾，则以本说明书为准。虽然结合各个实施例对本发明教导进行了描述，但是本发明教导不旨在受限于这种实施例。相反，本发明教导涵盖各种替代方案、修改和等同物，如本领域的技术人员将理解的。
I.定义
除非另有说明，否则如本文中所使用的以下术语和短语旨在具有以下含义：
本文中使用“多核苷酸”和“核酸”指代包括核苷或核苷类似物的多聚体化合物，所述核苷或核苷类似物具有沿骨架连接在一起的含氮杂环碱基或碱基类似物，所述骨架包含常规RNA、DNA、混合的RNA-DNA和其类似物的聚合物。核酸“骨架”可以由多种连接构成，包含以下中的一个或多个：糖-磷酸二酯连接、肽-核酸键(“肽核酸”或PNA；PCT号：WO 95/32305)、硫代磷酸酯连接、甲基膦酸酯连接或其组合。核酸的糖部分可以是核糖、脱氧核糖，或具有取代(例如，2'甲氧基和/或2'卤化物取代)的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、C、T、U)，其类似物(例如，经修饰的尿苷，如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷等等)；肌苷；嘌呤或嘧啶的衍生物(例如，N4-甲基脱氧鸟苷、脱氮-或氮杂-嘌呤、脱氮-或氮杂-嘧啶、在5或6位置具有取代基的嘧啶碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)、在2、6或8位置具有取代基的嘌呤碱基、2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和O4-烷基-嘧啶；美国专利第5,378,825号和PCT第WO 93/13121号)。有关一般讨论，参见《核酸的生物化学(The Biochemistry of the Nucleic Acids)》5-36,Adams等人,编辑,第11版,1992。核酸可以包含一个或多个“无碱基”残基，其中骨架不包含聚合物的一个或多个位置的含氮碱基(美国专利第5,585,481号)。核酸可以仅包括常规的RNA或DNA糖、碱基和键，或可以包含常规的组分和取代(例如，具有2'甲氧基键的常规碱基，或含有常规碱基和一种或多种碱基类似物两者的聚合物)。核酸包含“锁定核酸”(LNA)，一种含有一种或多种LNA核苷酸单体的类似物，其中二环呋喃糖单元被锁定在模拟糖构型的RNA中，这增强了对互补RNA和DNA序列的杂交亲和力(Vester和Wengel,2004,《生物化学(Biochemistry)》43(42):13233-41)。RNA和DNA具有不同的糖部分并且可以通过其尿嘧啶或类似物在RNA中的存在以及其胸腺嘧啶或类似物在DNA中的存在进行区分。
如本文所使用的，“多肽”是指包括可以采用三维构象的氨基酸残基的多聚体化合物。多肽包含但不限于酶、酶前体蛋白、调节蛋白、结构蛋白、受体、核酸结合蛋白、抗体等。多肽可以但不一定包括翻译后修饰、非天然氨基酸、辅基等。
“向导RNA”、“gRNA”和“向导”在本文中可互换使用以指代crRNA(也被称为CRISPRRNA)或crRNA和trRNA的组合(也被称为tracrRNA)。crRNA和trRNA可以作为单个RNA分子(单向导RNA、sgRNA)或在两个单独的RNA分子(双向导RNA、dgRNA)中缔合。“向导RNA”或“gRNA”是指每种类型。trRNA可以是天然存在的序列，或与天然存在的序列相比具有修饰或变异的trRNA序列。向导RNA可以包含如本文所述的经修饰的RNA。
如本文所使用的，“向导序列”是指在向导RNA内与靶序列互补并且用作将向导RNA引导到靶序列以通过RNA引导的DNA结合剂进行结合或修饰(例如，切割)的序列。“向导序列”也可以被称为“靶向序列”或“间隔序列”。向导序列的长度可以是20个碱基对，例如，在酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(即Spy Cas9)和相关的Cas9同源物/直系同源物的情况下。较短或较长的序列还可以用作向导，例如，长度为15个、16个、17个、18个、19个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。在一些实施例中，向导序列和靶区可以100％互补或相同。在其它实施例中，向导序列和靶区可以含有至少一个错配。例如，向导序列和靶序列可以含有1个、2个、3个或4个错配，其中靶序列的总长度为至少17个、18个、19个、20个或更多个碱基对。在一些实施例中，向导序列和靶区可以含有1-4个错配，其中向导序列包括至少17个、18个、19个、20个或更多个核苷酸。在一些实施例中，向导序列和靶区可以含有1个、2个、3个或4个错配，其中向导序列包括20个核苷酸。
Cas蛋白的靶序列包含基因组DNA的正链和负链两者(也就是说，给定的序列和序列的反向互补物)，因为Cas蛋白的核酸底物是双链核酸。因此，在向导序列被称为“与靶序列互补”的情况下，应当理解，向导序列可以将向导RNA引导为与靶序列的反向互补物结合。因此，在一些实施例中，在向导序列结合靶序列的反向互补物的情况下，除了向导序列中的U代替T之外，向导序列与靶序列的某些核苷酸(例如，不包含PAM的靶序列)相同。
如本文所使用的，“RNA引导的DNA结合剂”意指具有RNA和DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或此类复合物的DNA结合亚基，其中DNA结合活性是序列特异性的并取决于RNA的序列。示例性RNA引导的DNA结合剂包含Cas切割酶/切口酶及其失活形式(“dCas DNA结合剂”)。如本文所使用的，“Cas核酸酶”，也称为“Cas蛋白”涵盖Cas切割酶、Cas切口酶和dCasDNA结合剂。Cas切割酶/切口酶和dCas DNA结合剂包含III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚基、I型CRISPR系统的级联复合物、其Cas3亚基和第2类Cas核酸酶。如本文所使用的，“第2类Cas核酸酶”是具有RNA引导的DNA结合活性的单链多肽，如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。第2类Cas核酸酶包含第2类Cas切割酶和第2类Cas切口酶(例如，H840A、D10A或N863A变体)，所述切割酶/切口酶进一步具有RNA引导的DNA切割酶/切口酶活性，以及第2类dCas DNA结合剂，其中切割酶/切口酶活性失活。第2类Cas核酸酶包含例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如，N692A、M694A、Q695A、H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如，K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1)(例如，K848A、K1003A、R1060A变体)蛋白和其修饰。Cpf1蛋白，Zetsche等人,《细胞(Cell)》,163:1-13(2015)，与Cas9同源并且含有RuvC样核酸酶结构域。Zetsche的Cpf1序列以全文引用的方式并入。参见例如Zetsche,表S1和S3。“Cas9”涵盖Spy Cas9、本文列出的Cas9变体以及其等效物。参见例如Makarova等人,《自然综述：微生物学(Nat RevMicrobiol)》,13(11):722-36(2015)；Shmakov等人,《分子细胞(Molecular Cell)》,60:385-397(2015)。
“经修饰的尿苷”在本文中用于指具有与尿苷相同的氢键受体以及与尿苷的一个或多个结构差异的除胸苷外的核苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是经取代的尿苷，即其中一个或多个非质子取代基(例如，烷氧基，如甲氧基)代替质子的尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是经取代的假尿苷，即其中一个或多个非质子取代基(例如，烷基，如甲基)代替质子的假尿苷，例如N1-甲基假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是经取代的尿苷、假尿苷或经取代的假尿苷中的任何一种。
如本文所使用的，“尿苷位置”是指多核苷酸中被尿苷或经修饰的尿苷占据的位置。因此，例如，其中“100％的尿苷位置是经修饰的尿苷”的多核苷酸在每个位置处都含有经修饰的尿苷，所述经修饰的尿苷将是相同序列的常规RNA中的尿苷(其中所有碱基均为标准A、U、C或G碱基)。除非另有说明，本公开中列出或随附的序列表或序列的多核苷酸序列中的U可以是尿苷或经修饰的尿苷。
如本文所使用的，如果第一序列与第二序列的比对表明第二序列的X％或更多的位置整体上与第一序列匹配，则第一序列被认为“包括与第二序列具有至少X％同一性的序列”。例如，序列AAGA包括与序列AAG具有100％同一性的序列，因为比对将给出100％同一性，因为存在与第二序列的所有三个位置的匹配。只要相关核苷酸(如胸苷、尿苷或经修饰的尿苷)具有相同的互补物(例如，胸苷、尿苷或经修饰的尿苷的全部的腺苷；另一个实例是胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶，两者均具有鸟苷或经修饰的鸟苷作为互补物)，RNA与DNA之间的差异(通常是尿苷代替胸苷或反之亦然)以及如经修饰的尿苷等核苷类似物的存在就不会对多核苷酸之间的同一性或互补性差异有贡献。因此，例如，序列5'-AXG(其中X为任何经修饰的尿苷，如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)被认为与AUG 100％相同，因为两者与同一序列(5'-CAU)完全互补。示例性的比对算法是本领域众所周知的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法和尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法。本领域的技术人员将理解，对于要比对的给定的序列对，适当的算法和参数设置选择是什么；对于长度通常类似并且氨基酸的预期同一性>50％或核苷酸的预期同一性>75％的序列，具有EBI在www.ebi.ac.uk网站服务器上提供的尼德曼-翁施算法的默认设置的尼德曼-翁施算法通常是适当的。
“mRNA”在本文中用于指代为RNA或经修饰的RNA的多核苷酸并且包括可以被翻译成多肽的开放阅读框(也就是说，可以充当用于由核糖体和氨基酰化的tRNA翻译的底物)。mRNA可以包括包含核糖残基或其类似物(例如，2'-甲氧基核糖残基)的磷酸糖骨架。在一些实施例中，核酸磷酸-糖骨架的糖基本上由核糖残基、2'-甲氧基核糖残基或其组合组成。一般来说，mRNA不含大量的胸苷残基(例如，0个残基或少于30、20、10、5、4、3或2个胸苷残基；或小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的胸苷含量)。mRNA可以在其尿苷位置中的一些或全部处含有经修饰的尿苷。
如本文所使用的，给定ORF的“最小尿苷含量”是ORF的尿苷含量，所述ORF(a)在每个位置处使用最小尿苷密码子并且(b)对与给定ORF相同的氨基酸序列进行编码。给定氨基酸的最小尿苷密码子是具有最少尿苷的密码子(通常为0或1，苯丙氨酸密码子除外，其中最小尿苷密码子具有2个尿苷)。为了评估最小尿苷含量，经修饰的尿苷残基被认为等同于尿苷。
如本文所使用的，给定ORF的“最小尿苷二核苷酸含量”是ORF的最低可能尿苷二核尿苷(UU)含量，所述ORF(a)在每个位置处使用最小尿苷密码子(如上所述)并且(b)对与给定ORF相同的氨基酸序列进行编码。尿苷二核苷酸(UU)含量可以用绝对项表示为ORF中UU二核苷酸的枚举，或者以比率为基础表示为尿苷二核苷酸的尿苷占据的位置百分比(例如，AUUAU的尿苷二核苷酸含量将为40％，因为尿苷二核苷酸的尿苷占据了5个位置中的2个位置)。为了评估最小尿苷二核苷酸含量，经修饰的尿苷残基被认为等同于尿苷。如本文所使用的，给定开放阅读框(ORF)的“最小腺嘌呤含量”是ORF的腺嘌呤含量，所述ORF(a)在每个位置处使用最小腺嘌呤密码子并且(b)对与给定ORF相同的氨基酸序列进行编码。给定氨基酸的最小腺嘌呤密码子是具有最少腺嘌呤的密码子(通常为0或1，赖氨酸和天冬酰胺密码子除外，其中最小腺嘌呤密码子具有2个腺嘌呤)。为了评估最小腺嘌呤含量，经修饰的腺嘌呤残基被认为等同于腺嘌呤。
如本文所使用的，给定开放阅读框(ORF)的“最小腺嘌呤二核苷酸含量”是ORF的最低可能腺嘌呤二核尿苷(AA)含量，所述ORF(a)在每个位置处使用最小腺嘌呤密码子(如上所述)并且(b)对与给定ORF相同的氨基酸序列进行编码。腺嘌呤二核苷酸(AA)含量可以用绝对项表示为ORF中AA二核苷酸的枚举，或者以比率为基础表示为腺嘌呤二核苷酸的腺嘌呤占据的位置百分比(例如，UAAUA的腺嘌呤二核苷酸含量将为40％，因为腺嘌呤二核苷酸的腺嘌呤占据了5个位置中的2个位置)。为了评估最小腺嘌呤二核苷酸含量，经修饰的腺嘌呤残基被认为等同于腺嘌呤。
如本文所使用的，“TTR”是指作为TTR基因的基因产物的运甲状腺素蛋白。
如本文所使用的，“淀粉样蛋白”是指通常可溶性的蛋白质或肽的异常聚集体。淀粉样蛋白是不溶性的，并且淀粉样蛋白可以在器官和组织中产生蛋白质沉积物。淀粉样蛋白中的蛋白质或肽可能错误折叠成允许许多蛋白质拷贝粘在一起以形成原纤维的形式。虽然一些形式的淀粉样蛋白在人体内可能具有正常功能，但如本文所使用的“淀粉样蛋白”是指蛋白质的异常或病理性聚集体。淀粉样蛋白可以包括单一蛋白质或肽(如TTR)，或者它们可以包括多种蛋白质或肽(如TTR和另外蛋白质)。
如本文所使用的，“淀粉样原纤维”是指抗降解的淀粉样蛋白的不溶性纤维。淀粉样原纤维可以基于特定蛋白质或肽以及所述淀粉样原纤维聚集的组织和细胞类型产生症状。
如本文所使用的，“淀粉样变性”是指以由淀粉样蛋白或淀粉样原纤维沉积引起的症状为特征的疾病。淀粉样变性可能影响许多器官，包含心脏、肾脏、肝脏、脾脏、神经系统和消化道。
如本文所使用的，“ATTR”、“TTR相关淀粉样变性”、“TTR淀粉样变性”、“ATTR淀粉样变性”或“与TTR相关的淀粉样变性”是指与TTR沉积相关的淀粉样变性。
如本文所使用的，“家族性淀粉样心肌病”或“FAC”是指主要以限制性心肌病为特征的遗传性运甲状腺素蛋白淀粉样变性(ATTR)。充血性心力衰竭在FAC中很常见。平均发病年龄为大约60-70岁，其中诊断后预计寿命为4-5年。
如本文所使用的，“家族性淀粉样多神经病”或“FAP”是指主要以感觉运动神经病变为特征的遗传性运甲状腺素蛋白淀粉样变性(ATTR)。自主神经病变在FAP中很常见。虽然神经病变是主要特征，但FAP的症状还可能包含恶病质、肾衰竭和心脏病。FAP的平均发病年龄为大约30-50岁，其中诊断后预计寿命为5-15年。
如本文所使用的，“野生型ATTR”和“ATTRwt”是指与病理性TTR突变，如T60A、V30M、V30A、V30G、V30L、V122I、V122A或V122(-)无关的ATTR。ATTRwt也被称为老年全身性淀粉样变性。发病通常发生在60岁或以上的男性中，其中最常见的症状是充血性心力衰竭和心律不齐，如心房颤动。另外的症状包含心脏功能不良的后果，如呼吸短促、疲劳、头晕、肿胀(尤其是腿部)、恶心、心绞痛、睡眠中断和体重减轻。腕管综合征的病史表明ATTRwt的风险增加，并且在一些情况下可能表明早期疾病。ATTRwt通常会随着时间的推移导致心脏功能下降，但与遗传性ATTR相比具有更好的预后，因为野生型TTR沉积物累积得更慢。现有治疗类似于其它形式的ATTR(除了肝脏移植之外)，并且通常涉及支持或改善心脏功能，范围为从利尿剂和限制性流体以及盐摄入到抗凝血剂，并且在严重的情况下，心脏移植。尽管如此，与FAC一样，ATTRwt可能导致心力衰竭死亡，有时在确诊后3-5年内死亡。
表1和整个申请中示出了可用于本文所述的向导RNA组合物和方法的向导序列。
如本文所使用的，“遗传性ATTR”是指与TTR基因序列中的突变相关的ATTR。与ATTR相关的TTR基因中的已知突变包含导致TTR被T60A、V30M、V30A、V30G、V30L、V122I、V122A或V122(-)取代的那些突变。
如本文所使用的，“插入缺失”是指由在靶核酸中的双链断裂(DSB)位点处插入或缺失的许多核苷酸组成的插入/缺失突变。
如本文所使用的，“敲低”是指特定基因产物(例如，蛋白质、mRNA或两者)表达的降低。可以通过检测组织或细胞群体(例如，在血清或细胞培养基中)分泌的蛋白质或通过检测来自所关注的组织或细胞群体的蛋白质的总细胞量来测量蛋白质的敲低。用于测量mRNA敲低的方法是已知的并且包含对从所关注的组织或细胞群体中分离的mRNA进行测序。在一些实施例中，“敲低”可以是指特定基因产物表达的一些丧失，例如转录的mRNA量的减少或细胞群体(包含体内群体，如组织中发现的那些群体)表达或分泌的蛋白质量的减少。
如本文所使用的，“突变型TTR”是指与TTR的野生型氨基酸序列相比，TTR的氨基酸序列发生变化的TTR的基因产物(即，TTR蛋白)。人野生型TTR序列可在NCBI Gene ID:7276；Ensembl:Ensembl:ENSG00000118271获得。与ATTR相关的TTR的突变体形式，例如在人中，包含T60A、V30M、V30A、V30G、V30L、V122I、V122A或V122(-)。
如本文所使用的，“核糖核蛋白”(RNP)或“RNP复合物”是指引导RNA以及RNA引导的DNA结合剂，如Cas核酸酶、例如Cas切割酶、Cas切口酶或dCas DNA结合剂(例如，Cas9)。在一些实施例中，向导RNA将如Cas9等RNA引导的DNA结合剂引导到靶序列，并且向导RNA与靶序列杂交并且所述试剂与靶序列结合；在试剂是切割酶或切口酶的情况下，结合之后可以是切割或切口。
如本文所使用的，“靶序列”是指靶基因中的与gRNA的向导序列互补的核酸序列。靶序列和向导序列的相互作用引导RNA引导的DNA结合剂在靶序列内结合并潜在地切口或切割(取决于试剂的活性)。
如本文所使用的，“治疗”是指针对受试者的疾病或病症的治疗剂的任何施用或应用，并且包含抑制疾病、阻止其发展、缓解疾病的一种或多种症状、治愈疾病或预防疾病的一种或多种症状的复发。例如，对ATTR的治疗可以包括减轻ATTR的症状。
如本文所使用的，术语“病理性突变”是指使基因产物(如TTR)更可能引起、促进、促成或未能抑制疾病(如ATTR)发展的突变。
如本文所使用的，术语“脂质纳米颗粒”(LNP)是指包括多个(即，多于一个)通过分子间作用力物理地相互关联的脂质分子的颗粒。所述LNP可以是例如微球(包含单层和多层囊泡，例如“脂质体”-层状相脂质双层，所述层状相脂质双层在一些实施例中基本上是球形的，并且在更具体的实施例中可以包括水核，例如包括RNA分子的很大一部分)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。也请参见例如WO 2017173054A1和WO 2019067992A1，其内容特此以全文引用的方式并入。本领域技术人员已知能够向受试者递送核苷酸的任何LNP可以与本文所述的向导RNA和对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸一起使用。
如本文所使用的，术语“供体寡核苷酸”或“供体模板”是指包含要插入到靶位点中(例如，基因组DNA的靶位点)的期望核酸序列的寡核苷酸。供体寡核苷酸可以是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。在一些实施例中，供体寡核苷酸可以通过使用LNP或转染与向导RNA和对RNA引导的DNA结合剂进行编码(例如，Cas9)的核酸序列一起递送。
如本文所使用的，术语“核定位信号”(NLS)或“核定位序列”是指诱导包括此类序列或与此类序列连接的分子转运到真核细胞的细胞核中的氨基酸序列。核定位信号可以形成待转运的分子的一部分。在一些实施例中，NLS可以通过共价键、氢键或离子相互作用连接到分子的其余部分。
如本文所使用的，短语“药学上可接受的”意指在制备通常无毒且在生物学上期望的并且在其它方面可用于药物用途的药物组合物中有用的。
如本文所使用的，“输注”是指一种或多种药剂的主动施用，输注时间例如介于大约30分钟与12小时之间。在一些实施例中，所述一种或多种药剂包括LNP，所述LNP例如包括对本文所述的RNA引导的DNA结合剂(如Cas9)进行编码的mRNA和本文所述的gRNA。
如本文所使用的，“输注预防”是指在治疗(例如，包括施用LNP)前向受试者施用的方案，所述治疗包括静脉内皮质类固醇(例如，地塞米松10mg或等效物)、解热剂(例如，口服对乙酰氨基酚或扑热息痛500mg)、静脉内H1阻断剂(例如，苯海拉明50mg或等效物)和静脉内H2阻断剂(例如，雷尼替丁50mg或等效物)中的一种或多种或全部。输注预防任选地与口服皮质类固醇(例如，地塞米松8mg或等效物)的提前施用相组合。在一些实施例中，口服皮质类固醇在治疗前8-24小时施用。在一些实施例中，在治疗前1-2小时施用静脉内皮质类固醇(例如，地塞米松10mg或等效物)、口服对乙酰氨基酚500mg、静脉内H1阻断剂(例如，苯海拉明50mg或等效物)、静脉内H2阻断剂(例如，雷尼替丁50mg或等效物)中的一种或多种或全部。在一些实施例中，H1阻断剂和/或H2阻断剂是口服施用的。
术语“约”或“大约”意指如本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受误差，这将部分取决于如何测量或确定值。
II.靶向TTR基因的方法和组合物
本文公开了用于在受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)、对细胞或受试者的TTR基因进行修饰、治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)、降低受试者的TTR血清浓度和/或减少或预防淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法以及相关组合物，包含用于此类方法中的组合物。一般而言，所公开的组合物包括靶向TTR的向导RNA以及包括对RNA引导的DNA结合剂(例如，CRISPR/Cas系统)进行编码的开放阅读框的核酸。用此类方法和组合物治疗的受试者可以具有野生型或非野生型TTR基因序列，例如患有ATTR的受试者，所述ATTR可以为ATTR wt或遗传性或家族性形式的ATTR。
在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续超过30分钟。在一些实施例中，所述组合物通过30分钟输注施用。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续超过60分钟。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续超过90分钟。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续超过120分钟、超过150分钟、超过180分钟、超过240分钟、超过300分钟或超过360分钟。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时或至少12小时。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续0.5-1.5小时、1.5-2.5小时、2.5-3.5小时、3.5-4.5小时、4.5-5.5小时、5.5-6.5小时、6.5-7.5小时、7.5-8.5小时、8.5-9.5小时、9.5-10.5小时、10.5-11.5小时或11.5-12.5小时。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续约60分钟、约90分钟、约120分钟、约150分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟或约360分钟。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续约45-75分钟、75-105分钟、105-135分钟、135-165分钟、165-195分钟、195-225分钟、225-255分钟、255-285分钟、285-315分钟、315-345分钟或345-375分钟。在一些实施例中，所述组合物通过输注施用持续约1.5-6小时。
A.向导RNA(gRNA)
在所公开的方法和组合物中使用的向导RNA包括靶向TTR基因的向导序列。表1中的SEQ ID No:5-82处示出了靶向TTR基因的示例性向导序列。
表1：TTR靶向的向导序列、命名法、染色体坐标和序列。
Figure BDA0003369221130000321
Figure BDA0003369221130000331
Figure BDA0003369221130000341
Figure BDA0003369221130000351
上述向导序列中的每个向导序列可以进一步包括另外的核苷酸以例如与在3'端处的向导序列之后的以下示例性核苷酸序列形成crRNA：GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ IDNO:126)。在sgRNA的情况下，上述向导序列可以进一步包括另外的核苷酸以例如与向导序列的3'端之后的以下示例性核苷酸序列形成sgRNA：在5'到3'朝向上的GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:125)。
在一些实施例中，所述sgRNA是经修饰的。在一些实施例中，所述sgRNA包括以下SEQ ID NO:3中所示的修饰模式，其中N是任何天然或非天然核苷酸，并且其中N的全部包括如本文所述的向导序列，并且经修饰的sgRNA包括以下序列：mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:3)，其中“N”可以是任何天然或非天然核苷酸。例如，本文涵盖的是SEQ ID NO:3，其中N被本文公开的任何向导序列替换。尽管用N取代了向导的核苷酸，但所述修饰仍如SEQ ID NO:3所示。也就是说，尽管向导的核苷酸置换“N”，但前三个核苷酸是经2'OMe修饰的，并且在第一核苷酸与第二核苷酸、第二核苷酸与第三核苷酸以及第三核苷酸与第四核苷酸之间存在硫代磷酸酯键。
在一些实施例中，涵盖表2中所述的任何一个序列。
表2：TTR靶向的sgRNA序列
Figure BDA0003369221130000361
Figure BDA0003369221130000371
Figure BDA0003369221130000381
Figure BDA0003369221130000391
Figure BDA0003369221130000401
*＝PS连接；“m”＝2'-O-Me核苷酸
表3提供了向导ID与对应sgRNA ID的比对映射以及与cyno基因组和cyno匹配的向导ID的同源性。
表3：TTR靶向的向导序列ID映射和Cyno同源性
Figure BDA0003369221130000411
Figure BDA0003369221130000421
在一些实施例中，所述gRNA包括向导序列，所述向导序列将RNA引导的DNA结合剂(其可以是核酸酶(例如，Cas核酸酶，如Cas9))引导到TTR中的靶DNA序列中。所述gRNA可以包括包含表1中示出的向导序列的crRNA。所述gRNA可以包括包含表1中示出的向导序列的17个、18个、19个或20个连续核苷酸的crRNA。在一些实施例中，所述gRNA包括包含与表1中示出的向导序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸具有约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的crRNA。在一些实施例中，所述gRNA包括包含与表1中示出的向导序列具有约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的crRNA。所述gRNA可以进一步包括trRNA。在本文描述的每个组合物和方法实施例中，crRNA和trRNA可以作为单个RNA(sgRNA)缔合，或可以位于单独的RNA(dgRNA)上。在sgRNA的上下文下，可以例如经磷酸二酯键或其它共价键共价连接crRNA组分和trRNA组分。
在本文所述的组合物、用途和方法实施例中的每个组合物、用途和方法实施例中，引导RNA可以包括两个RNA分子作为“双引导RNA”或“dgRNA”。dgRNA包括第一RNA分子和第二RNA分子，所述第一RNA分子包括包含例如表1中示出的引导序列的crRNA，所述第二RNA分子包括trRNA。第一RNA分子和第二RNA分子可以不共价连接，但可以经crRNA部分与trRNA部分之间的碱基配对形成RNA双链体。
在本文所述的组合物、用途和方法实施例中的每个组合物、用途和方法实施例中，引导RNA可以包括单个RNA分子作为“单引导RNA”或“sgRNA”。sgRNA可以包括包含表1中示出的与trRNA共价连接的引导序列的crRNA(或其一部分)。sgRNA可以包括表1中示出的引导序列的17个、18个、19个或20个连续核苷酸。在一些实施例中，crRNA和trRNA通过连接子共价连接。在一些实施例中，sgRNA通过crRNA部分与trRNA部分之间的碱基配对形成茎环结构。在一些实施例中，crRNA和trRNA通过一个或多个非磷酸二酯键的键共价连接。
在一些实施例中，trRNA可以包括源自天然存在的CRISPR/Cas系统的trRNA序列的全部或部分。在一些实施例中，trRNA包括截短的或经修饰的野生型trRNA。trRNA的长度取决于所使用的CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，trRNA包括或由5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或100个以上的核苷酸组成。在一些实施例中，trRNA可以包括某些次级结构，例如一个或多个发夹或茎环结构，或一个或多个凸起结构。
在一些实施例中，所述组合物包括一个或多个包括选自SEQ ID NO:5-82的向导RNA。
在一些实施例中，所述组合物包括gRNA，所述sgRNA包括与选自SEQ ID NO:5-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列。
在一些实施例中，所述组合物包括一个或多个向导RNA，所述一个或多个向导RNA包括选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列。在一些实施例中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA包括与选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列。在一些实施例中，选自SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17、22、23、27、29、30、35、36、37、38、55、61、63、65、66、68或69。在一些实施例中，选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:5、6、9、13、14、15、16、17、22、23、27、30、35、36、37、38、55、63、65、66、68或69。具体地，包括选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列的向导RNA可以是sgRNA。包括选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列的向导RNA可以是经化学修饰的sgRNA，如末端修饰的RNA。包括选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列的向导RNA可以是dgRNA，如经化学修饰的dgRNA。
在其它实施例中，所述组合物包括至少一个，例如至少两个包括选自SEQ ID NO:5-82的向导序列中的任何两个或更多个的向导序列的gRNA。在一些实施例中，所述组合物包括至少两个各自包括与SEQ ID NO:5-82的核酸中的任何核酸至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列的gRNA。
在其它实施例中，所述组合物包括至少一个，例如至少两个包括选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何两个或更多个的向导序列的gRNA。在一些实施例中，所述组合物包括至少两个各自包括与选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列中的任何序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的向导序列的gRNA。在一些实施例中，选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列包括选自SEQ ID NO:5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17、22、23、27、29、30、35、36、37、38、55、61、63、65、66、68或69的一个或两个序列。在一些实施例中，选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列包括选自SEQ ID NO:5、6、9、13、14、15、16、17、22、23、27、30、35、36、37、38、55、63、65、66、68或69的一个或两个序列。
在一些实施例中，所述gRNA是包括表2中所示的序列(SEQ ID No.87-124)中的任一个的sgRNA。在一些实施例中，所述gRNA是包括表2中所示的序列(SEQ ID No.87-124)中的任一个的sgRNA，但没有如所示出的修饰(即，未经修饰的SEQ ID No.87-124)。在一些实施例中，所述sgRNA包括与SEQ ID No.87-124的核酸中的任何核酸至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的序列。在一些实施例中，所述sgRNA包括与SEQ ID No.87-124的核酸中的任何核酸至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的序列，但没有如所示出的修饰(即，未经修饰的SEQ ID No.87-124)。在一些实施例中，在有或没有修饰的情况下，所述sgRNA包括表1中所示的代替表2的SEQ ID No:87-124处的sgRNA序列所示的向导序列的向导序列中的任何一个。
在一些实施例中，所述gRNA是包括SEQ ID No.87-113、115-120或122-124中的任一个的sgRNA。在一些实施例中，所述gRNA是包括SEQ ID No.87-113、115-120或122-124中的任一个的sgRNA，但没有如表2中所示的修饰(即，未经修饰的SEQ ID No.87-113、115-120或122-124)。在一些实施例中，所述gRNA是包括SEQ ID No.87-113、115-120或122-124中的任一个的sgRNA，但有至少一个化学修饰并且没有如表2中所示的修饰模式(即，经化学修饰的SEQ ID No.87-113、115-120或122-124)。经化学修饰的向导RNA可以包括如表2中所示的修饰中的一个或多个修饰。在一些实施例中，没有如表2中所示的修饰模式的经化学修饰的SEQ ID No.87-113、115-120或122-124包括5'和/或3'端修饰。在一些实施例中，所述sgRNA包括与SEQ ID No.87-113、115-120或122-124的核酸中的任何核酸至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的序列。在一些实施例中，所述sgRNA包括与SEQ ID No.87-113、115-120或122-124的核酸中的任何核酸至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的序列，但没有如所示出的修饰(即，未经修饰的SEQ ID No.87-113、115-120或122-124)。在一些实施例中，在有或没有修饰的情况下，所述sgRNA包括表1中所示的代替表2的SEQ ID No:87-113、115-120或122-124处的sgRNA序列中所示的向导序列的向导序列中的任何一个。
本文所提供的向导RNA可以用于识别(例如，杂交)TTR基因中的靶序列。例如，TTR靶序列可以被提供的包括引导RNA的Cas切割酶识别和切割。因此，可以由引导RNA将RNA引导的DNA结合剂(如Cas切割酶)引导到TTR基因的靶序列，其中向导RNA的向导序列与靶序列杂交，并且RNA引导的DNA结合剂(如Cas切割酶)切割靶序列。
在一些实施例中，基于TTR基因内的靶序列确定对所述一个或多个引导RNA的选择。
在不受任何特定理论束缚的情况下，基因的某些区中的突变(例如，由于作为核酸酶介导的DSB的结果而发生的插入缺失导致的移码突变)可能比基因的其它区中的突变更不耐受，因此DSB的位置是可能导致的蛋白质敲除的数量或类型的重要因素。在一些实施例中，与TTR内的靶序列互补或具有互补性的gRNA用于将RNA引导的DNA结合剂引导到TTR基因中的特定位置。在一些实施例中，gRNA被设计为具有与TTR的外显子1、外显子2、外显子3或外显子4中的靶序列互补或具有互补性的引导序列。
B.gRNA的修饰
在一些实施例中，所述gRNA是经化学修饰的。包括一个或多个经修饰的核苷或核苷酸的gRNA被称为“经修饰的”gRNA或“经化学修饰的”gRNA，以描述一个或多个非天然和/或天然存在的用于替代或除了规范的A、G、C和U残基之外的组分或构型。在一些实施例中，经修饰的gRNA是用非规范核苷或核苷酸合成的，这里称为“经修饰的”。经修饰的核苷和核苷酸可以包含以下中的一种或多种：(i)磷酸二酯骨架连接中的非连接磷酸氧中的一个或两个和/或连接磷酸氧中的一个或多个的改变，例如替代(示例性骨架修饰)；(ii)核糖成分(例如，核糖上的2'羟基)的改变，例如替代(示例性糖修饰)；(iii)用“脱磷”连接子大规模替代磷酸部分(示例性骨架修饰)；(iv)天然存在的核碱基(包含用非规范的核碱基进行)的修饰或替换(示例性碱基修饰)；(v)核糖磷酸骨架的替代或修饰(示例性骨架修饰)；(vi)寡核苷酸3'端或5'端的修饰，例如末端磷酸基的去除、修饰或替代或部分、帽或连接子的缀合(此类3'或5'帽修饰可以包括糖和/或骨架修饰)；以及(vii)糖的修饰或替代(示例性糖修饰)。
化学修饰(如以上列出的那些化学修饰)可以组合以提供包括可以具有两个、三个、四个或更多个修饰的核苷和核苷酸(统称为“残基”)的经修饰的gRNA。例如，经修饰的残基可以具有经修饰的糖和经修饰的核碱基。在一些实施例中，修饰gRNA的每个碱基，例如所有碱基都具有经修饰的磷酸基，如硫代磷酸酯基。在某些实施例中，gRNA分子的磷酸基中的所有或基本上所有的磷酸基都用硫代磷酸酯基替代。在一些实施例中，经修饰的gRNA包括RNA的5'端处或附近的至少一个经修饰的残基。在一些实施例中，经修饰的gRNA包括RNA的3'端处或附近的至少一个经修饰的残基。
在一些实施例中，gRNA包括一个、两个、三个或更多个经修饰的残基。在一些实施例中，经修饰的gRNA中的至少5％(例如，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％)的位置是经修饰的核苷或核苷酸。
未经修饰的核酸可能易于被例如细胞内核酸酶或在血清中发现的核酸酶降解。例如，核酸酶可以水解核酸磷酸二酯键。因此，在一方面，本文所述的gRNA可以含有一种或多种经修饰的核苷或核苷酸，例如以引入对细胞内或基于血清的核酸酶的稳定性。在一些实施例中，在被体内和体外两方面引入到细胞群体中，本文所述的经修饰的gRNA分子可以表现出降低的先天免疫应答。术语“先天免疫应答”包含对外源性核酸的细胞应答，所述外源性核酸包含单链核酸，所述细胞应答涉及细胞因子表达和释放的诱导，特别是干扰素和细胞死亡。
在骨架修饰的一些实施例中，经修饰的残基的磷酸基可以通过用不同的取代基替代氧中的一个或多个氧来修饰。进一步地，经修饰的残基(例如经修饰的核酸中存在的经修饰的残基)可以包含用本文所述的经修饰的磷酸基大规模替代未经修饰的磷酸部分。在一些实施例中，磷酸骨架的骨架修饰可以包含导致不带电荷的连接子或具有不对称电荷分布的带电荷的连接子的改变。
经修饰的磷酸基的实例包含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(borano phosphate ester)、氢磷酸酯、磷酰胺酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。未经修饰的磷酸基中的磷原子是非手性的。然而，用上述原子或原子基团中的一个替代非桥氧中的一个可以使磷原子手性。立构磷原子可以具有“R”构型(本文为Rp)或“S”构型(本文为Sp)。骨架还可以通过用氮(桥接的磷酰胺酯)、硫(桥接的硫代磷酸酯)和碳(桥接的亚甲基膦酸酯)替代桥氧(也就是说，连接磷酸酯和核苷的氧)来修饰。替换可以发生在连接氧处或连接氧中的两个连接氧处。
在某些骨架修饰中，磷酸基可以被不含磷的接头替代。在一些实施例中，带电荷的磷酸基可以被中性部分替代。可以替代磷酸基的部分的实例可以包含但不限于，例如甲基膦酸酯、羟氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷连接子、磺酸盐、磺酰胺、硫代甲缩醛化物、甲缩醛化物、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲亚氨基、亚甲基亚肼基(methylenehydrazo)、亚甲基二甲亚肼基(methylenedimethylhydrazo)和亚甲基氧甲亚氨基。
还可以构建模拟核酸的支架，其中磷酸连接子和核糖被耐核酸酶的核苷或核苷酸替代物替代。此类修饰可以包括骨架修饰和糖修饰。在一些实施例中，核碱基可以被替代骨架拴系。实例可以包含但不限于吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。
经修饰的核苷和经修饰的核苷酸可以包含对糖基的一个或多个修饰，也就是说，糖修饰。例如，2'羟基(OH)可以被修饰，例如被许多不同的“氧”或“脱氧”取代基替代。在一些实施例中，对2'羟基的修饰可以增强核酸的稳定性，因为羟基不再能去质子化以形成2'-醇盐离子。
2'羟基修饰的实例可以包含：烷氧基或芳氧基(OR，其中“R”可以是例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R可以是例如H或任选地经取代的烷基，并且n可以是0到20的整数(例如，0到4、0到8、0到10、0到16、1到4、1到8、1到10、1到16、1到20、2到4、2到8、2到10、2到16、2到20、4到8、4到10、4到16和4到20)。在一些实施例中，所述2'羟基修饰可以是2'-O-Me。在一些实施例中，所述2'羟基修饰可以是2'-氟修饰，所述修饰用氟化物替代2'羟基。在一些实施例中，所述2'羟基修饰可以包含“锁”核酸(LNA)，其中2'羟基可以例如通过C1-6亚烷基或C1-6杂亚烷基桥连接到同一核糖的4'碳，其中示例性桥可以包含亚甲基桥、丙烯桥、醚桥或氨基桥；邻氨基(其中氨基可以是例如NH2；烷氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)和氨基烷氧基、O(CH2)n-氨基(其中氨基可以是例如NH2；烷氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)。在一些实施例中，所述2'羟基修饰可以包含“解锁”核酸(UNA)，其中核糖环缺少C2'-C3'键。在一些实施例中，2'羟基修饰可以包含甲氧基乙基(MOE)，(OCH2CH2OCH3，例如PEG衍生物)。
“脱氧”2'修饰可以包含氢(即，脱氧核糖，例如部分dsRNA的突出部分)；卤素(例如，溴、氯、氟或碘)；氨基(其中氨基可以是例如NH2；烷氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-氨基(其中氨基可以是例如如本文所述的)、-NHC(O)R(其中R可以是例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氰基；巯基；烷基-硫代-烷基；硫代烷氧基；以及烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，其可以任选地例如被如本文所述的氨基取代。
糖修饰可以包括还可以含有具有与核糖中对应碳的立体化学构型相反的立体化学构型的一个或多个碳的糖基。因此，经修饰的核酸可以包含含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。经修饰的核酸还可以包含无碱基糖。这些无碱基糖也可以进一步在组成糖原子中的一个或多个糖原子处修饰。经修饰的核酸还可以包含一种或多种呈L形式的糖，例如，L-核苷。
本文所述的可以掺入经修饰的核酸中的经修饰的核苷和经修饰的核苷酸可以包含经修饰的碱基，也称为核碱基。核碱基的实例包含但不限于腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。这些核碱基可以被修饰或完全替代，以提供可以掺入经修饰的核酸中的经修饰的残基。核苷酸的核碱基可以独立地选自嘌呤、嘧啶、嘌呤类似物或嘧啶类似物。在一些实施例中，核碱基可以包含例如天然存在的和合成的碱基衍生物。
在采用双引导RNA的实施例中，crRNA和tracr RNA中的每一个都可以含有修饰。此类修饰可以在crRNA和/或tracr RNA的一端或两端处。在包括sgRNA的实施例中，可以化学修饰sgRNA的一端或两端处的一个或多个残基，或者可以化学修饰整个sgRNA。某些实施例包括5'端修饰。某些实施例包括3'端修饰。在某些实施例中，向导RNA分子的单链突出部中的核苷酸中的一个或多个或全部是脱氧核苷酸。
在一些实施例中，本文公开的向导RNA包括在于2016年12月8日提交的题为“经化学修饰的向导RNA(Chemically Modified Guide RNA)”的US 62/431,756中公开的修饰谱式之一，其内容特此以全文引用的方式并入。
在一些实施例中，本发明包括包含一个或多个修饰的gRNA。在一些实施例中，所述修饰包括经2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。在一些实施例中，所述修饰包括核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。
术语“mA”、“mC”、“mU”或“mG”可以用于表示已经用2'-O-Me修饰的核苷酸。
2'-O-甲基的修饰可以描绘如下：
Figure BDA0003369221130000491
已经被示出影响核苷酸糖环的另一个化学修饰是卤素取代。例如，核苷酸糖环上的2'-氟(2'-F)取代可以增加寡核苷酸结合亲和力和核酸酶稳定性。
在本申请中，术语“fA”、“fC”、“fU”或“fG”可以用于表示已经被2'-F取代的核苷酸。
2'-F的取代可以描绘如下：
Figure BDA0003369221130000492
硫代磷酸酯(PS)连接或键是指在磷酸二酯连接中，例如在核苷酸碱基之间的键中，硫取代一个非桥连磷酸氧的键。当硫代磷酸酯用于产生寡核苷酸时，经修饰的寡核苷酸也可以被称为硫寡核苷酸。
“*”可以用于描绘PS修饰。在本申请中，术语A*、C*、U*或G*可以用于表示通过PS键与下一个(例如，3')核苷酸连接的核苷酸。
在本申请中，术语“mA*”、“mC*”、“mU*”或“mG*”可以用于表示已经被2'-O-Me取代并通过PS键与下一个(例如，3')核苷酸连接的核苷酸。
下图示出了S-取代为非桥连磷酸氧，从而生成代替磷酸二酯键的PS键：
Figure BDA0003369221130000501
无碱基核苷酸是指缺少含氮碱基的那些核苷酸。下图描述了无碱基(也被称为无嘌呤)位点缺少碱基的寡核苷酸：
Figure BDA0003369221130000502
反向碱基是指具有从正常的5'到3'连接开始(也就是说，5'到5'连接或3'到3'连接)反向的连接的那些反向碱基。例如：
Figure BDA0003369221130000511
无碱基核苷酸可以与反向连接进行连接。例如，无碱基核苷酸可以通过5'到5'连接与末端5'核苷酸连接，或者无碱基核苷酸可以通过3'到3'连接与末端3'核苷酸连接。末端5'或3'核苷酸处的反向无碱基核苷酸也可以被称为反向无碱基端帽。
在一些实施例中，修饰5'端处的前三个、四个或五个核苷酸中的一个或多个核苷酸，以及3'端处的最后三个、四个或五个核苷酸中的一个或多个核苷酸。在一些实施例中，修饰是2'-O-Me、2'-F、反向无碱基核苷酸、PS键或本领域公知的用于增加稳定性和/或性能的其它核苷酸修饰。
在一些实施例中，5'端处的前四个核苷酸和3'端处的最后四个核苷酸用硫代磷酸酯(PS)键连接。
在一些实施例中，5'端处的前三个核苷酸以及3'端处的最后三个核苷酸包括经2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。在一些实施例中，5'端处的前三个核苷酸和3'端处的最后三个核苷酸包括经2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。在一些实施例中，5'端处的前三个核苷酸和3'端处的最后三个核苷酸包括反向的无碱基核苷酸。
在一些实施例中，所述向导RNA包括经修饰的sgRNA。在一些实施例中，所述sgRNA包括SEQ ID NO:3中所示的修饰模式，其中N是任何天然或非天然核苷酸，并且其中N的全部包括将核酸酶引导到靶序列的向导序列。
在一些实施例中，所述向导RNA包括SEQ ID No:87-124中的任何一个所示的gRNA。在一些实施例中，所述向导RNA包括包含SEQ ID No:5-82的向导序列以及SEQ ID No:125的核苷酸中的任一个的sgRNA，其中SEQ ID No:125的核苷酸位于向导序列的3'端上，并且其中所述向导序列可以如SEQ ID No:3所示进行修饰。
在一些实施例中，所述向导RNA包括包含选自SEQ ID No:5-72、74-78和80-82的向导序列以及SEQ ID No:125的核苷酸的sgRNA，其中SEQ ID No:125的核苷酸位于向导序列的3'端上，并且其中所述向导序列可以如SEQ ID No:3所示进行修饰。
C.包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框的核酸
包括对本文所公开的RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)进行编码的ORF的任何核酸可以与本文所公开的任何gRNA组合在组合物或方法中。在本文所述的任何实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框的核酸可以是mRNA。
1.腺嘌呤含量低的ORF
在一些实施例中，对RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)进行编码的ORF的腺嘌呤含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤含量到所述最小腺嘌呤含量的约150％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量等于所述ORF的最小腺嘌呤含量。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约150％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约145％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约140％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约135％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约130％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约125％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约120％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约115％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约110％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约105％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约104％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约103％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约102％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约101％。
在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量到所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的200％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约195％、190％、185％、180％、175％、170％、165％、160％、155％、150％、145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约200％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约195％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约190％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约185％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约180％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约175％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约170％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约165％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约160％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约155％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约150％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约145％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约140％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约135％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约130％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约125％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约120％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约115％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约110％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约105％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约104％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约103％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约102％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量的约101％。
在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量到腺嘌呤二核苷酸含量，所述腺嘌呤二核苷酸含量为对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行编码的参考序列的最大腺嘌呤二核苷酸含量的90％或更低。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行的参考序列的最大腺嘌呤二核苷酸含量的约85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量的范围为0个腺嘌呤三核苷酸到1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个或50个腺嘌呤三核苷酸(其中腺嘌呤的较长运行按其内独特的三个腺嘌呤片段的数量计数，例如，一个腺嘌呤四核苷酸含有两个腺嘌呤三核苷酸，一个腺嘌呤五核苷酸含有三个腺嘌呤三核苷酸等)。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量的范围为0％腺嘌呤三核苷酸到0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％腺嘌呤三核苷酸，其中腺嘌呤三核苷酸的含量百分比被计算为形成腺嘌呤三核苷酸的一部分(或腺嘌呤的较长运行)的腺嘌呤在序列中占据的位置的百分比，使得序列UUUAAA和UUUUAAAA各自将具有50％的腺嘌呤三核苷酸含量。例如，在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于2％。例如，在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于1.5％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于1％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.9％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.8％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.7％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.6％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.5％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.4％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.3％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.2％。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.1％。在一些实施例中，提供了一种核酸，所述核酸对包括不含腺嘌呤三核苷酸的ORF的RNA引导的DNA结合剂进行编码。
在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤三核苷酸含量到腺嘌呤三核苷酸含量，所述腺嘌呤三核苷酸含量为对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行编码的参考序列的最大腺嘌呤三核苷酸含量的90％或更低。在一些实施例中，所述ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行的参考序列的最大腺嘌呤三核苷酸含量的约85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
给定ORF可以降低腺嘌呤含量或腺嘌呤二核苷酸含量或腺嘌呤三核苷酸含量，例如通过在所述ORF的足够部分中使用最小腺嘌呤密码子。例如，RNA引导的DNA结合剂的氨基酸序列可以通过将氨基酸转化为密码子而反向翻译成ORF序列，其中所述ORF中的一些或全部使用如下所示的示例性最小腺嘌呤密码子。在一些实施例中，所述ORF中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子是表4中列出的密码子。
表4.示例性最小腺嘌呤密码子
氨基酸 最小腺嘌呤密码子
A 丙氨酸 GCU或GCC或GCG
G 甘氨酸 GGU或GGC或GGG
V 缬氨酸 GUC或GUU或GUG
D 天冬氨酸 GAC或GAU
E 谷氨酸 GAG
I 异亮氨酸 AUC或AUU
T 苏氨酸 ACU或ACC或ACG
N 天冬酰胺 AAC或AAU
K 赖氨酸 AAG
S 丝氨酸 UCU或UCC或UCG
R 精氨酸 CGU或CGC或CGG
L 亮氨酸 CUG或CUC或CUU
P 脯氨酸 CCG或CCU或CCC
H 组氨酸 CAC或CAU
Q 谷氨酰胺 CAG
F 苯丙氨酸 UUC或UUU
Y 酪氨酸 UAC或UAU
C 半胱氨酸 UGC或UGU
W 色氨酸 UGG
M 甲硫氨酸 AUG
在一些实施例中，提供了对RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)进行编码的核酸，所述核酸包括由密码子集合组成的ORF，所述密码子集合中至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子是表4中列出的密码子。在一些实施例中，所述ORF具有最小核苷酸均聚物，例如相同核苷酸的重复串。例如，在一些实施例中，当从表4中列出的密码子中选择最小尿苷密码子时，通过选择减少核苷酸均聚物的数量和长度的最小腺嘌呤密码子来构建核酸，例如选择GCG而不是GCC用于丙氨酸或选择GGC而不是GGG用于甘氨酸。
在任何前述实施例中，所述核酸可以是mRNA。
2.增加翻译和/或对应于高表达tRNA的密码子；示例性密码子集合
在一些实施例中，所述核酸包括ORF，所述ORF具有增加在哺乳动物(如人类)中的翻译的密码子。在另外的实施例中，所述核酸包括ORF，所述ORF具有增加在哺乳动物(例如，人类)的器官(如肝脏)中的翻译的密码子。在另外的实施例中，所述核酸包括ORF，所述ORF具有增加在哺乳动物(例如，人类)的细胞类型(如肝细胞)中的翻译的密码子。可以相对于所述ORF的野生型序列的翻译程度或相对于密码子分布与所述ORF源自的生物体或在氨基酸水平上含有最类似ORF的生物体的密码子分布相匹配的ORF来确定哺乳动物、细胞类型、哺乳动物器官、人类、人类器官等中翻译的增加，如酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌(S.aureus)或另一个原核生物(视原核生物源自的Cas核酸酶的情况而定)，如以下描述的来自其它原核生物的Cas核酸酶。可替代地，在一些实施例中，相对于在其它所有相等的具有SEQ ID NO:205的序列中的翻译(包含任何适用的点突变、异源结构域等)的ORF来确定Cas9序列在哺乳动物、细胞类型、哺乳动物器官、人类、人类器官等中翻译的增加。可用于增加人类(包含人类肝脏和人类肝细胞)表达的密码子可以是与人类肝脏/肝细胞中高表达的tRNA相对应的密码子，这在Dittmar KA,《公共科学图书馆遗传学(PLos Genetics)》2(12):e221(2006)中有所讨论。在一些实施例中，ORF中至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是与哺乳动物(如人类)中高表达的tRNA(例如，每个氨基酸的最高表达的tRNA)相对应的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是与哺乳动物器官(如人类器官)中高表达的tRNA(例如，每个氨基酸的最高表达的tRNA)相对应的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是与哺乳动物肝脏(如人类肝脏)中高表达的tRNA(例如，每个氨基酸的最高表达的tRNA)相对应的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是与哺乳动物肝细胞(如人类肝细胞)中高表达的tRNA(例如，每个氨基酸的最高表达的tRNA)相对应的密码子。
可替代地，通常可以使用与生物体(例如，人类)中高表达的tRNA相对应的密码子。
上述密码子选择方法中的任何一种方法都可以与上面所示的最小腺嘌呤密码子组合，例如，从表4的密码子开始，并且然后在多于一个选项可用的情况下，使用对应于更高表达的tRNA的密码子，无论是在生物体(例如，人类)中，还是在所关注的器官或细胞类型(如肝脏或肝细胞)中(例如，人类肝脏或人类肝细胞)。
在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是来自表5中所示的密码子集合(例如，低U、低A或低A/U密码子集合)的密码子。低A和低A/U集合中的密码子使用使指定核苷酸最小化的密码子，同时还使用对应于高表达的tRNA的密码子，其中多于一个选项是可用的。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是来自表5中所示的低U密码子集合的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是来自表5中所示的低A密码子集合的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子是来自表5中所示的低A/U密码子集合的密码子。
表5.示例性密码子集合：
氨基酸 低U 低A 低A/U
Gly GGC GGC GGC
Glu GAG GAG GAG
Asp GAC GAC GAC
Val GTG GTG GTG
Ala GCC GCC GCC
Arg AGA CGG CGG
Ser AGC TCC AGC
Lys AAG AAG AAG
Asn AAC AAC AAC
Met ATG ATG ATG
Ile ATC ATC ATC
Thr ACC ACC ACC
Trp TGG TGG TGG
Cys TGC TGC TGC
Tyr TAC TAC TAC
Leu CTG CTG CTG
Phe TTC TTC TTC
Gln CAG CAG CAG
His CAC CAC CAC
3.示例性序列
在一些实施例中，对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF包括与SEQ ID NO:311具有至少93％同一性的序列；和/或所述ORF在其至少前50个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少93％的同一性，或者在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；和/或所述ORF由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表4或5中列出的密码子；和/或所述ORF的腺嘌呤含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤含量到所述最小腺嘌呤含量的123％；和/或所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量到所述最小腺嘌呤二核苷酸含量的150％。
在一些实施例中，对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF包括与SEQ ID NO:377具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
在一些实施例中，对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF包括与SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述mRNA包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF，其中RNA引导的DNA结合剂包括与SEQ ID NO:203、213、268或386-396中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述ORF的腺嘌呤含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤含量到所述最小腺嘌呤含量的150％，和/或所述ORF的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤二核苷酸含量到所述最小腺嘌呤二核苷酸含量的150％。在一些实施例中，经编码的RNA引导的DNA结合剂包括与SEQ ID NO:203、213、268或386-396中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述ORF的尿苷含量的范围为所述ORF的最小尿苷含量到所述最小尿苷含量的150％，和/或所述ORF的尿苷二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量到所述最小尿苷二核苷酸含量的150％。在一些此类实施例中，腺嘌呤核苷酸含量和尿苷核苷酸含量两者均小于或等于其相应最小值的150％。在一些实施例中，腺嘌呤二核苷酸含量和尿苷二核苷酸含量两者均小于或等于其相应最小值的150％。在一些实施例中，上述同一性水平中的任一个为至少95％、至少98％、至少99％或100％。
在一些实施例中，对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个具有至少90％同一性。前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸是从起始密码子(通常是ATG)的第一个核苷酸开始测量的，使得A是核苷酸1，T是核苷酸2等。在一些实施例中，所述开放阅读框在其序列的至少前10％、12％、15％、20％、25％、30％或35％上与SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个具有至少90％同一性。所述ORF的序列长度是从起始密码子开始到终止密码子结束的核苷酸的数量，并且其序列的前10％、12％、15％、20％、25％、30％或35％对应于从起始密码子的第一个核苷酸开始的核苷酸数量，所述核苷酸数量构成总序列长度的指定百分比。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:243具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:243(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:244具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:244(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:256具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:256(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:257具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:257(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:258具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:258(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:259具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:259(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:260具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:260(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:261具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:261(即SEQ ID NO:204)的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:376具有至少90％同一性的序列，任选地其中SEQ ID NO:376的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的替代性ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:377具有至少90％同一性的序列，任选地其中SEQ ID NO:377的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的替代性ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:378具有至少90％同一性的序列，任选地其中SEQ ID NO:378的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的替代性ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:379具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:379的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:380具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:380的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:381具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:381的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:382具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:382的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:383具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:383的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:384具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:384的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸包括与SEQID NO:385具有至少90％同一性的序列，其中SEQ ID NO:385的ORF被SEQ ID NO:311-313、328、329、346-348、355、356、363或364中的任一个的ORF取代。
在一些实施例中，与SEQ ID NO 243、244、256-261或376-385的任选地经取代的序列的同一性程度为至少95％。在一些实施例中，与SEQ ID NO 243、244、256-261或376-385的任选地经取代的序列的同一性程度为至少98％。在一些实施例中，与SEQ ID NO 243、244、256-261或176-385的任选地经取代的序列的同一性程度为至少99％。在一些实施例中，与SEQ ID NO 243、244、256-261或376-385的任选地经取代的序列的同一性程度为100％。
4.核酸、mRNA和ORF的另外特征
本文所述的任何另外特征可以在可行的程度上与上述任何实施例组合。
a)低尿苷含量
在一些实施例中，对RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)进行编码的ORF的尿苷含量的范围为所述ORF的最小尿苷含量到所述ORF的最小尿苷含量的约150％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量等于所述ORF的最小尿苷含量。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约150％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约145％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约140％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约135％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约130％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约125％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约120％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约115％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约110％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约105％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约104％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约103％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约102％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约101％。
在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量到所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的200％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约195％、190％、185％、180％、175％、170％、165％、160％、155％、150％、145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约200％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约195％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约190％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约185％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约180％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约175％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约170％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约165％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约160％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约155％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约150％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约145％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约140％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约135％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约130％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约125％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约120％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约115％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约110％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约105％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约104％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约103％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约102％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量的约101％。
在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量的范围为所述ORF的最小尿苷二核苷酸含量到尿苷二核苷酸含量，所述尿苷二核苷酸含量为对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行编码的参考序列的最大尿苷二核苷酸含量的90％或更低。在一些实施例中，所述ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行编码的参考序列的最大尿苷二核苷酸含量的约85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量的范围为0个尿苷三核苷酸到1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个或50个尿苷三核苷酸(其中尿苷的较长运行按其内独特的三个尿苷片段的数量计数，例如，一个尿苷四核苷酸含有两个尿苷三核苷酸，一个尿苷五核苷酸含有三个尿苷三核苷酸等)。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量的范围为0％尿苷三核苷酸到0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％尿苷三核苷酸，其中尿苷三核苷酸的含量百分比被计算为形成尿苷三核苷酸的一部分(或尿苷的较长运行)的尿苷在序列中占据的位置的百分比，使得序列UUUAAA和UUUUAAAA各自将具有50％的尿苷三核苷酸含量。例如，在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于2％。例如，在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于1.5％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于1％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.9％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.8％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.7％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.6％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.5％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.4％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.3％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.2％。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.1％。在一些实施例中，所述ORF不含尿苷三核苷酸。
在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量的范围为所述ORF的最小尿苷三核苷酸含量到尿苷三核苷酸含量，所述尿苷三核苷酸含量为对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行编码的参考序列的最大尿苷三核苷酸含量的90％或更低。在一些实施例中，所述ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于对与所讨论的mRNA相同的蛋白质进行编码的参考序列的最大尿苷三核苷酸含量的约85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
给定ORF可以降低尿苷含量或尿苷二核苷酸含量或尿苷三核苷酸含量，例如通过在所述ORF的足够部分中使用最小尿苷密码子。例如，RNA引导的DNA结合剂的氨基酸序列可以通过将氨基酸转化为密码子而反向翻译成ORF序列，其中所述ORF中的一些或全部使用如下所示的示例性最小尿苷密码子。在一些实施例中，所述ORF中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子是表6中列出的密码子。
表6.示例性最小尿苷密码子
Figure BDA0003369221130000641
Figure BDA0003369221130000651
在一些实施例中，所述ORF由密码子的集合组成，其中至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子是表6中列出的密码子。
b)低腺嘌呤和尿苷含量
在可行的范围内，本文所述的关于低腺嘌呤含量的任何特征可以与本文所述的关于低尿苷含量的任何特征组合。例如，可以提供对RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)进行编码的核酸(例如mRNA)，所述核酸包括ORF，所述ORF的尿苷含量的范围为所述ORF的最小尿苷含量到所述ORF的最小尿苷含量的约150％(例如，所述ORF的尿苷含量小于或等于所述ORF的最小尿苷含量的约145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％)，并且所述ORF的腺嘌呤含量的范围为所述ORF的最小腺嘌呤含量到所述ORF的最小腺嘌呤含量的约150％(例如，小于或等于所述ORF的最小腺嘌呤含量的约145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％)。尿苷和腺嘌呤二核苷酸也是如此。类似地，所述ORF中尿苷核苷酸和腺嘌呤二核苷酸的含量可以如上所述。类似地，所述ORF中尿苷二核苷酸和腺嘌呤核苷酸的含量可以如上所述。
给定ORF可以降低尿苷和腺嘌呤核苷酸和/或二核苷酸含量，例如通过在所述ORF的足够部分中使用最小尿苷和腺嘌呤密码子。例如，RNA引导的DNA结合剂的氨基酸序列可以通过将氨基酸转化为密码子而反向翻译成ORF序列，其中所述ORF中的一些或全部使用如下所示的示例性最小尿苷和腺嘌呤密码子。在一些实施例中，所述ORF中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子是表7中列出的密码子。
表7.示例性最小尿苷和腺嘌呤密码子
Figure BDA0003369221130000652
Figure BDA0003369221130000661
在一些实施例中，所述ORF由密码子的集合组成，其中至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子是表7中列出的密码子。从表7中可以看出，三个所列丝氨酸密码子中的每一个都含有一个A或一个U。在一些实施例中，通过使用丝氨酸的AGC密码子来优先化尿苷最小化。在一些实施例中，通过使用丝氨酸的UCC和/或UCG密码子来优先化腺嘌呤最小化。
c)经编码的RNA引导的DNA结合剂
在一些实施例中，所述RNA引导的DNA结合剂是第2类Cas核酸酶。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂具有也可以被称为双链核酸内切酶活性的切割酶活性。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA结合剂包括Cas核酸酶，如第2类Cas核酸酶(其可以是例如II、V或VI型Cas核酸酶)。第2类Cas核酸酶包含例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2和C2c3蛋白及其修饰。Cas9核酸酶的实例包含酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌和其它原核生物的II型CRISPR系统(参见例如，下一段中的列表)及其经修饰(例如，工程化或突变型)型式中的那些实例。参见，例如US 2016/0312198 A1；US 2016/0312199 A1。Cas核酸酶的其它实例包含III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物或其Cas10、Csm1或Cmr2亚基；以及I型CRISPR系统的级联复合物或其Cas3亚基。在一些实施例中，Cas核酸酶可以来自IIA型、IIB型或IIC型系统。关于各种CRISPR系统和Cas核酸酶的讨论，参见例如Makarova等人,《自然综述：微生物学》9:467-477(2011)；Makarova等人,《自然综述：微生物学》,13:722-36(2015)；Shmakov等人,《分子细胞》,60:385-397(2015)。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA结合剂是Cas切割酶，例如Cas9切割酶。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA结合剂是Cas切口酶，例如Cas9切口酶。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA结合剂是酿脓链球菌Cas9核酸酶，例如切割酶。
Cas核酸酶可以源自的非限制性示例性物种包含酿脓链球菌、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌、无害利斯特菌(Listeria innocua)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西丝菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、γ-变形杆菌(Gammaproteobacterium)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、绿产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、链孢囊菌、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、硒化芽孢杆菌(Bacillusselenitireducens)、戟叶鹅绒藤微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、单胞菌(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)、聚球藻(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobiumarabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptorbecscii)、金矿菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、丙酸降解菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcuswatsoni)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、最大节螺藻(Arthrospira maxima)、节旋藻(Arthrospirasp.)、林氏藻(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻(Oscillatoria sp.)、移动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟球菌(Neisseriacinerea)、拉里弯曲杆菌(Campylobacter lari)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006和深海单细胞蓝细菌(Acaryochloris marina)。
在一些实施例中，Cas核酸酶是来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自嗜热链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自脑膜炎奈瑟氏球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自新凶手弗朗西丝菌的Cpf1核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌的Cpf1核酸酶在一些实施例中，Cas核酸酶是来自毛螺菌科细菌ND2006的Cpf1核酸酶。在另外的实施例中，Cas核酸酶是来自以下的Cpf1核酸酶：土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、毛螺菌科细菌、解蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrioproteoclasticus)、异域菌门细菌(Peregrinibacteria bacterium)、俭菌超门细菌(Parcubacteria bacterium)、丙酸氧化菌(Smithella)、氨基酸球菌(Acidaminococcus)、候选白蚁甲烷枝原体(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)、良吉氏钩端螺旋体(Leptospirainadai)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)、解糖胨普雷沃菌(Prevotelladisiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)。在某些实施例中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌属或毛螺菌科的Cpf1核酸酶。
野生型Cas9有两个核酸酶结构域：RuvC和HNH。RuvC结构域切割非靶DNA链，并且HNH结构域切割靶DNA链。在一些实施例中，Cas9核酸酶包括多于一个RuvC结构域和/或多于一个HNH结构域。在一些实施例中，Cas9核酸酶是野生型Cas9。在一些实施例中，Cas9能够在靶DNA中诱导双链断裂。在某些实施例中，Cas核酸酶可以切割dsDNA，所述Cas核酸酶可以切割一条dsDNA链，或者所述Cas核酸酶可能不具有DNA切割酶或切口酶活性。示例性Cas9氨基酸序列被提供为SEQ ID NO:203。包含起始密码子和终止密码子的示例性Cas9 mRNA ORF序列被提供为SEQ ID NO:311。适于包含在融合蛋白中的示例性Cas9 mRNA编码序列被提供为SEQ ID NO:346。
在一些实施例中，使用嵌合型Cas核酸酶，其中蛋白质的一个结构域或区被不同蛋白质的部分替代。在一些实施例中，Cas核酸酶结构域可以被来自如Fok1等不同核酸酶的结构域替代。在一些实施例中，Cas核酸酶可以是经修饰的核酸酶。
在其它实施例中，Cas核酸酶可以来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，Cas核酸酶可以是I型CRISPR/Cas系统的级联复合物的组分。在一些实施例中，Cas核酸酶可以是Cas3蛋白。在一些实施例中，Cas核酸酶可以来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，Cas核酸酶可以具有RNA切割活性。
d)异源功能性结构域；核定位信号
在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)包括一个或多个异源功能性结构域(例如，是或包括融合多肽)。
在一些实施例中，异源功能性结构域可以促进RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)转运到细胞核中。例如，异源功能性结构域可以是核定位信号(NLS)。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与1-10个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与1-5个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与一个NLS融合。当使用一个NLS时，NLS可以连接在RNA引导的DNA结合剂序列的N端或C端处。在一些实施例中，所述RNA引导的DNA结合剂可以在C末端与至少一个NLS融合。NLS还可以插在RNA引导的DNA结合剂序列中。在其它实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与多于一个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与2个、3个、4个或5个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与两个NLS融合。在某些情况下，所述两个NLS可以是相同的(例如，两个SV40 NLS)或不同的。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂与羧基端处连接的两个SV40 NLS序列融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与两个NLS融合，一个在N端处连接并且一个在C端处连接。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与3个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以不与NLS融合。在一些实施例中，NLS可以是单分序列，例如SV40 NLS、PKKKRKV(SEQ ID NO:278)或PKKKRRV(SEQ ID NO:290)。在一些实施例中，NLS可以是二分序列，如核质蛋白的NLS，KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:291)。在一些实施例中，所述NLS序列可以包括LAAKRSRTT(SEQ ID NO:279)、QAAKRSRTT(SEQ ID NO:280)、PAPAKRERTT(SEQ ID NO:281)、QAAKRPRTT(SEQ ID NO:282)、RAAKRPRTT(SEQ ID NO:283)、AAAKRSWSMAA(SEQ ID NO:284)、AAAKRVWSMAF(SEQ ID NO:285)、AAAKRSWSMAF(SEQ IDNO:286)、AAAKRKYFAA(SEQ ID NO:287)、RAAKRKAFAA(SEQ ID NO:288)或RAAKRKYFAV(SEQID NO:289)。在具体实施例中，单个PKKKRKV(SEQ ID NO:278)NLS可以在RNA引导的DNA结合剂的C端处连接。在融合位点处任选地包含一个或多个连接子。在一些实施例中，根据前述实施例中任一项所述的一个或多个NLS与一个或多个另外的异源功能性结构域(如下文所述的任何异源功能性结构域)组合存在于RNA引导的DNA结合剂中。NLS的示例性编码序列被提供为SEQ ID NO:292-304。
在一些实施例中，异源功能性结构域能够修饰RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)的细胞内半衰期。在一些实施例中，可以增加RNA引导的DNA结合剂的半衰期。在一些实施例中，可以减少RNA引导的DNA结合剂的半衰期。在一些实施例中，异源功能性结构域能够增加RNA引导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施例中，异源功能性结构域能够减少RNA引导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施例中，异源功能性结构域可以充当蛋白质降解的信号肽。在一些实施例中，蛋白质降解可以由蛋白水解酶介导，所述蛋白水解酶例如蛋白酶体、溶酶体蛋白酶或钙蛋白酶。在一些实施例中，异源功能性结构域可以包括PEST序列。在一些实施例中，可以通过添加泛素或多泛素链来修饰RNA引导的DNA结合剂。在一些实施例中，泛素可以是泛素样蛋白(UBL)。泛素样蛋白的非限制性实例包含小泛素样修饰物(SUMO)、泛素交叉反应型蛋白(UCRP，也称为干扰素刺激基因-15(ISG15))、泛素相关修饰物-1(URM1)、神经元前体细胞表达的发育下调蛋白-8(NEDD8，在酿酒酵母中也称为Rub1)、人白细胞抗原F相关(FAT10)、自噬-8(ATG8)和-12(ATG12)、Fau泛素样蛋白(FUB1)、膜锚定UBL(MUB)、泛素折叠修饰物-1(UFM1)和泛素样蛋白-5(UBL5)。
在一些实施例中，异源功能性结构域可以是标志物结构域。标志物结构域的非限制性实例包含荧光蛋白、纯化标签、表位标签和报告基因序列。在一些实施例中，标志物结构域可以是荧光蛋白。合适的荧光蛋白的非限制性实例包含绿色荧光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、祖母绿、Azami绿、单体Azami绿、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白(例如，YFP、EYFP、柠檬黄、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、蓝色荧光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、石青、mKalamal、GFPuv、天蓝色、T-天蓝色(T-sapphire))、青色荧光蛋白(例如，ECFP、蔚蓝色(Cerulean)、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-青色)、红色荧光蛋白(例如，mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-表达、DsRed2、DsRed-单体、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)和橙色荧光蛋白(例如，mOrange、mKO、Kusabira-橙色、单体Kusabira-橙色、mTangerine、tdTomato)或任何其它合适的荧光蛋白。在其它实施例中，标志物结构域可以是纯化标签和/或表位标签。非限制性示例性标签包含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(TRX)、poly(NANP)、串联亲和纯化(TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基载体蛋白(BCCP)、多His和钙调蛋白。非限制性示例性报告基因包含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸苷酶、荧光素酶或荧光蛋白。
在另外的实施例中，异源功能性结构域可以将RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9核酸酶，如酿脓链球菌Cas9)靶向特定细胞器、细胞类型、组织或器官。在一些实施例中，异源功能性结构域可以将RNA引导的DNA结合剂靶向线粒体。
在另外的实施例中，异源功能性结构域可以是效应结构域。当将RNA引导的DNA结合剂引导到其靶序列时，例如，当通过gRNA将Cas核酸酶引导到靶序列时，效应结构域可以修饰或影响靶序列。在一些实施例中，效应结构域可以选自核酸结合结构域、核酸酶结构域(例如，非Cas核酸酶结构域)、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录阻遏物结构域。在一些实施例中，异源功能性结构域是核酸酶，如FokI核酸酶。参见例如美国专利第9,023,649号。在一些实施例中，异源功能性结构域是转录活化剂或阻遏物。参见例如Qi等人,“改变CRISPR用途作为用于基因表达的序列特异性控制的RNA引导的平台(RepurposingCRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of geneexpression)”，《细胞》152:1173-83(2013)；Perez-Pinera等人,“通过基于CRISPR-Cas9的转录因子的RNA引导的基因激活(RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-basedtranscription factors)”《自然方法(Nat.Methods)》10:973-6(2013)；Mali等人,“用于靶特异性筛选的CAS9转录激活因子和用于合作基因组工程的配对切口酶(CAS9transcriptional activators for target specificity screening and pairednickases for cooperative genome engineering)”,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》31:833-8(2013)；Gilbert等人,“真核生物中CRISPR介导的模块化RNA引导的转录调节(CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription ineukaryotes)”,《细胞》154:442-51(2013)。如此，RNA引导的DNA结合剂基本上成为可以使用向导RNA引导以结合期望的靶序列的转录因子。在某些实施例中，DNA修饰结构域是甲基化结构域，如去甲基化或甲基转移酶结构域。在某些实施例中，效应子结构域是DNA修饰结构域，如碱基编辑结构域。在具体实施例中，所述DNA修饰结构域是将特定修饰引入到DNA中的核酸编辑结构域，例如脱氨酶结构域。参见例如WO 2015/089406；US 2016/0304846。WO2015/089406和US 2016/0304846中描述的核酸编辑结构域、脱氨酶结构域和Cas9变体特此通过引用并入。
e)UTR；Kozak序列
在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括5'UTR、3'UTR或5'和3'UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括至少一个来自羟基类固醇17-β脱氢酶4(HSD17B4或HSD)的UTR，例如来自HSD的5'UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括至少一个来自珠蛋白mRNA(例如，人α珠蛋白(HBA)mRNA、人β珠蛋白(HBB)mRNA或非洲爪蟾β珠蛋白(XBG)mRNA)的UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括来自珠蛋白mRNA(如HBA、HBB或XBG)的5'UTR、3'UTR或5'和3'UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括来自牛生长激素、巨细胞病毒(CMV)、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG的5'UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括来自牛生长激素、巨细胞病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG的3'UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括来自牛生长激素、巨细胞病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB、XBG、热休克蛋白90(Hsp90)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β肌动蛋白、α微管蛋白、肿瘤蛋白(p53)或表皮生长因子受体(EGFR)的5'和3'UTR。
在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括来自相同来源(例如组成性表达的mRNA，如肌动蛋白、白蛋白或珠蛋白，如HBA、HBB或XBG)的5'和3'UTR。
在一些实施例中，本文公开的核酸包括与SEQ ID NO:232、234、236、238、241或275-277中的任一个具有至少90％同一性的5'UTR。在一些实施例中，本文公开的核酸包括与SEQ ID NO:233、235、237、239或240中的任一个具有至少90％同一性的3'UTR。在一些实施例中，上述同一性水平中的任一个为至少95％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施例中，本文公开的核酸包括具有SEQ ID NO:232、234、236、238或241中的任一个的序列的5'UTR。在一些实施例中，本文公开的核酸包括具有SEQ ID NO:233、235、237、239或240中的任一个的序列的3'UTR。
在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)不包括5'UTR，例如，在5'帽与起始密码子之间不存在另外的核苷酸。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括在5'帽与起始密码子之间的Kozak序列(如下所述)，但是不具有任何另外的5'UTR。在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)不包括3'UTR，例如，在终止密码子与poly-A尾之间不存在另外的核苷酸。
在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包括Kozak序列。Kozak序列可能影响翻译起始和从核酸翻译的多肽的总产率。Kozak序列包含可以作为起始密码子的甲硫氨酸密码子。最小Kozak序列为NNNRUGN，其中以下中的至少一项为真：第一个N是A或G，并且第二个N是G。在核苷酸序列的上下文中，R表示嘌呤(A或G)。在一些实施例中，Kozak序列为RNNRUGN、NNNRUGG、RNNRUGG、RNNAUGN、NNNAUGG或RNNAUGG。在一些实施例中，Kozak序列是具有零个错配或具有最多一个或两个错配到小写位置的rccRUGg。在一些实施例中，Kozak序列是具有零个错配或具有最多一个或两个错配到小写位置的rccAUGg。在一些实施例中，Kozak序列是具有零个错配或具有最多一个、两个或三个错配到小写位置的gccRccAUGG(SEQ ID NO:305的核苷酸4-13)。在一些实施例中，Kozak序列是具有零个错配或具有最多一个、两个、三个或四个错配到小写位置的gccAccAUG。在一些实施例中，Kozak序列是GCCACCAUG。在一些实施例中，Kozak序列是具有零个错配或具有最多一个、两个、三个或四个错配到小写位置的gccgccRccAUGG(SEQ ID NO:305)。
f)Poly-A尾
在一些实施例中，所述多核苷酸(例如，mRNA)进一步包括多腺苷酸化(poly-A)尾。在一些情况下，poly-A尾在poly-A尾内的一个或多个位置处被一个或多个非腺嘌呤核苷酸“锚定”所“中断”。poly-A尾可以包括至少8个连续的腺嘌呤核苷酸，但也包括一个或多个非腺嘌呤核苷酸。如本文所使用的，“非腺嘌呤核苷酸”指代不包括腺嘌呤的任何天然或非天然核苷酸。鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸是示例性非腺嘌呤核苷酸。因此，本文所述的多核苷酸(例如，mRNA)上的poly-A尾可以包括位于对RNA引导的DNA结合剂和所关注的序列进行编码的核苷酸的3'处的连续腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，mRNA上的poly-A尾包括位于对RNA引导的DNA结合剂或所关注的序列进行编码的核苷酸的3'处的非连续腺嘌呤核苷酸，其中非腺嘌呤核苷酸以规则或不规则间隔开的间隔中断腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，poly-A尾在用于对mRNA进行体外转录的质粒中编码并成为转录物的一部分。在质粒中编码的poly-A序列，即poly-A序列中连续腺嘌呤核苷酸的数量可能不准确，例如，质粒中的100个poly-A序列可能不会导致转录的mRNA中精确的100个poly-A序列。在一些实施例中，poly-A尾不在质粒中编码，而是通过PCR加尾或酶加尾(例如，使用大肠杆菌(E.coli)poly(A)聚合酶)添加。
在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸被定位成中断连续腺嘌呤核苷酸，使得poly(A)结合蛋白可以与一段连续的腺嘌呤核苷酸结合。在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8个、9个、10个、11个或12个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-100个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，所述非腺嘌呤核苷酸在一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个腺嘌呤核苷酸之后，并且随后是至少8个连续腺嘌呤核苷酸。
本公开的poly-A尾可以包括一个连续腺嘌呤核苷酸序列，随后是一个或多个非腺嘌呤核苷酸，任选地随后是另外的腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，poly-A尾包括或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一段连续的2-10个非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，所述非腺嘌呤核苷酸位于至少8个、9个、10个、11个或12个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些情况下，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个连续腺嘌呤核苷酸之后。
在一些实施例中，所述非腺嘌呤核苷酸为鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些情况下，所述非腺嘌呤核苷酸是鸟嘌呤核苷酸。在一些实施例中，所述非腺嘌呤核苷酸是胞嘧啶核苷酸。在一些实施例中，所述非腺嘌呤核苷酸是胸腺嘧啶核苷酸。在一些情况下，当存在多于一个非腺嘌呤核苷酸时，所述非腺嘌呤核苷酸可以选自：a)鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸；b)鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸；c)胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸；或d)鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸。包括非腺嘌呤核苷酸的示例性poly-A尾被提供为SEQ ID NO:262。
g)经修饰的核苷酸
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸在一些或所有尿苷位置处包括经修饰的尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是在5位置处例如用卤素或C1-C3烷氧基修饰的尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是在1位置处例如用C1-C3烷基修饰的假尿苷。经修饰的尿苷可以是例如假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或其组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是5-甲氧基尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是5-碘尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是N1-甲基假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷和N1-甲基假尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是N1-甲基假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是5-碘尿苷和N1-甲基假尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷和5-碘尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是5-碘尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。
在一些实施例中，所述核酸中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的尿苷位置是经修饰的尿苷。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是经修饰的尿苷，例如，5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷、N1-甲基假尿苷、假尿苷或其组合。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是5-甲氧基尿苷。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是假尿苷。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是N1-甲基假尿苷。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是5-碘尿苷。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是5-甲氧基尿苷，并且其余是N1-甲基假尿苷。在一些实施例中，所述核酸中10％-25％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％、85-95％或90-100％的尿苷位置是5-碘尿苷，并且其余是N1-甲基假尿苷。
h)5'帽
在一些实施例中，包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的ORF的核酸(例如，mRNA)包括5'帽，如帽0、帽1或帽2。5'帽通常是通过5'-三磷酸与核酸的5'到3'链的第一核苷酸(也就是说，第一帽近端核苷酸)的5'位置连接的7-甲基鸟嘌呤核糖核苷酸(其可以被进一步修饰，如下文例如关于ARCA所讨论的)。在帽0中，mRNA的第一帽近端核苷酸和第二帽近端核苷酸的核糖两者均包括2'-羟基。在帽1中，mRNA的第一转录核苷酸和第二转录核苷酸的核糖分别包括2'-甲氧基和2'-羟基。在帽2中，mRNA的第一帽近端核苷酸和第二帽近端核苷酸的核糖两者均包括2'-甲氧基。参见例如Katibah等人,(2014)《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》111(33):12025-30；Abbas等人,(2017)《美国国家科学院院刊》114(11):E2106-E2115。大多数内源性高等真核mRNA(包含哺乳动物核酸，如人核酸)包括帽1或帽2。帽0和其它不同于帽1和帽2的帽结构在如人等哺乳动物中可能是免疫原性的，因为先天免疫系统的组分(如IFIT-1和IFIT-5)将其识别为“非自身”，这可能导致包含I型干扰素的细胞因子水平升高。先天免疫系统的组分(如IFIT-1和IFIT-5)还可以与eIF4E竞争与除了帽1或帽2之外的帽结合核酸，从而潜在地抑制mRNA的翻译。
帽可以共转录地包含在RNA中。例如，ARCA(抗反向帽类似物；赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，目录号：AM8045)是包括与可以在开始时在体外掺入转录物中的鸟嘌呤核糖核苷酸的5'位置连接的7-甲基鸟嘌呤3'-甲氧基-5'-三磷酸的帽类似物。ARCA产生帽0帽，其中第一个帽近端核苷酸的2'位置是羟基。参见例如，Stepinski等人,(2001)“含有新颖“抗反向”帽类似物7-甲基(3'-O-甲基)GpppG和7-甲基(3'脱氧)GpppG的mRNA的合成和性质(Synthesis and properties of mRNAs containing the novel'anti-reverse'cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG)”,RNA 7:1486-1495。ARCA结构如下所示。
Figure BDA0003369221130000761
CleanCapTM AG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；TriLink生物技术有限公司(TriLinkBiotechnologies),目录号：N-7113或CleanCapTM GG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG；TriLink生物技术有限公司,目录号：N-7133可以用于共转录地提供帽1结构。CleanCapTM AG和CleanCapTM GG的3'-O-甲基化型式还可以分别从TriLink生物技术有限公司，目录号N-7413和N-7433获得。CleanCapTM AG结构如下所示。CleanCapTM结构有时在本文中使用上面列出的目录号的最后三位数字来表示(例如，“CleanCapTM 113”代表TriLink生物技术有限公司，目录号：N-7113)。
Figure BDA0003369221130000762
可替代地，可以在转录后向RNA添加帽。例如，牛痘封端酶可商购(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，目录号：M2080S)并且具有由其D1亚基提供的RNA三磷酸酶和尿苷转移酶活性及其D12亚基提供的鸟嘌呤甲基转移酶。如此，所述牛痘封端酶可以在存在S-腺苷甲硫氨酸和GTP的情况下向RNA添加7-甲基鸟嘌呤，以提供帽0。参见例如：Guo,P.和Moss,B.(1990)《美国国家科学院院刊》，87,4023-4027；Mao,X.和Shuman,S.(1994)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》269,24472-24479。有关帽和封端方法的另外讨论，参见例如WO2017/053297和Ishikawa等人,《核酸研讨会系列(Nucl.Acid.Symp.Ser.)》(2009)第53期,129-130。
D.测定RNA的功效
在一些实施例中，当与其它组分(例如，对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸，如本文所述的任何组分)一起递送时测定gRNA的功效。在一些实施例中，测定了gRNA和对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸的组合的功效。
如本文所述，使用本文公开的RNA引导的DNA核酸酶和向导RNA可能导致DNA中的双链断裂，这可以在通过细胞机制进行修复时产生插入/缺失(插入缺失)突变形式的错误。许多由于插入缺失造成的突变改变开放阅读框或引入提前终止密码子，并且因此产生非功能性蛋白。
在一些实施例中，基于体外模型测定特定gRNA或组合的功效。在一些实施例中，所述体外模型是HEK293细胞。在一些实施例中，所述体外模型是HUH7人肝癌细胞。在一些实施例中，体外模型是HepG2细胞。在一些实施例中，体外模型是原代人肝细胞。在一些实施例中，体外模型是原代食蟹猴肝细胞。关于使用原代人肝细胞，可以使用可商购的原代人肝细胞以在实验之间提供更大的一致性。在一些实施例中，例如通过分析来自用Cas9 mRNA和引导RNA在体外转染的原代人肝细胞的基因组DNA来测定缺失或插入在体外模型中(例如，在原代人肝细胞中)发生的脱靶位点的数量。在一些实施例中，此类测定包括分析来自用Cas9mRNA、引导RNA和供体寡核苷酸在体外转染的原代人肝细胞的基因组DNA。以下工作实例中提供了用于此类测定的示例性程序。
在一些实施例中，对于gRNA选择过程，跨多个体外细胞模型测定特定gRNA或组合的功效。在一些实施例中，执行数据与所选gRNA的细胞系比较。在一些实施例中，执行跨多个细胞模型中的交叉筛选。
在一些实施例中，基于体内模型测定特定gRNA或组合的功效。在一些实施例中，体内模型是啮齿动物模型。在一些实施例中，啮齿动物模型是表达人TTR基因的小鼠，所述人TTR基因可以是突变人TTR基因。在一些实施例中，体内模型是非人灵长类动物，例如食蟹猴。
在一些实施例中，向导RNA或组合的功效是通过TTR的编辑百分比来测量的。在一些实施例中，将TTR的编辑百分比与实现TTR蛋白的敲低所必需的编辑百分比进行比较，例如，在体外模型的情况下在细胞培养基中或在体内模型的情况下在血清或组织中。
在一些实施例中，通过靶细胞类型的基因组内的脱靶序列处的插入缺失的数量和/或频率测量向导RNA或组合的功效。在一些实施例中，提供了在细胞群体中和/或相对于靶位点处插入缺失产生的频率以非常低的频率(例如，<5％)在脱靶位点处产生插入缺失的有效的向导RNA和组合。因此，本公开提供了在靶细胞类型(例如，肝细胞)中不表现出脱靶插入缺失形成或在细胞群体中和/或相对于靶位点处插入缺失产生的频率产生<5％的脱靶插入缺失形成的频率的引导RNA。在一些实施例中，本公开提供了在靶细胞类型(例如，肝细胞)中不表现出任何脱靶插入缺失形成的向导RNA和组合。在一些实施例中，提供了在例如通过本文所述的一种或多种方法评估的少于5个脱靶位点处产生插入缺失的向导RNA和组合。在一些实施例中，提供了在例如通过本文所述的一种或多种方法评估的少于或等于4个、3个、2个或1个脱靶位点处产生插入缺失的向导RNA和组合。在一些实施例中，一个或多个脱靶位点不出现在靶细胞(例如，肝细胞)基因组中的蛋白质编码区中。
在一些实施例中，检测基因编辑事件(如在靶DNA中形成插入/缺失(“插入缺失”)突变和同源性定向修复(HDR)事件)利用使用标记引物进行的线性扩增并使标记的扩增产物分离(本文此后称为“LAM-PCR”，或“线性扩增(LA)”方法)，如WO2018/067447或Schmidt等人,《自然方法》4:1051-1057(2007)中所述。
在一些实施例中，检测基因编辑事件，如在靶DNA中形成插入/缺失(“插入缺失”)突变和同源性定向修复(HDR)事件，进一步包括对线性扩增的产物或进一步扩增的产物进行测序。测序可以包括本领域技术人员已知的任何方法，包含下一代测序以及将线性扩增产物或进一步扩增的产物克隆到质粒中并对质粒或质粒的一部分进行测序。示例性下一代测序方法在例如Shendure等人,《自然(Nature)》26:1135-1145(2008)中进行了讨论。在其它方面，检测基因编辑事件，如在靶DNA中形成插入/缺失(“插入缺失”)突变和同源性定向修复(HDR)事件，进一步包括对线性扩增的产物或进一步扩增的产物执行数字PCR(dPCR)或液滴数字PCR(ddPCR)，或者使线性扩增的产物或进一步扩增的产物与被设计成鉴别包括HDR模板序列的DNA的核酸探针接触，并检测已与线性扩增的产物或进一步扩增的产物结合的探针。在一些实施例中，所述方法进一步包括测定HDR模板在靶DNA中的位置。
在某些实施例中，所述方法进一步包括测定靶DNA中插入位点的序列，其中所述插入位点是HDR模板并入到靶DNA中的位置，并且其中所述插入位点可以包含一些靶DNA序列和一些HDR模板序列。
在一些实施例中，向导RNA或组合的功效是通过TTR的分泌来测量的。在一些实施例中，使用利用细胞培养基或血清的酶联免疫吸附测定(ELISA)测定测量TTR的分泌。在一些实施例中，在用于测量编辑的相同体外或体内系统或模型中测量TTR的分泌。在一些实施例中，在原代人肝细胞中测量TTR的分泌。在一些实施例中，在HUH7细胞中测量TTR的分泌。在一些实施例中，在HepG2细胞中测量TTR的分泌。
本领域技术人员通常已知ELISA测定，并且可以设计用于测定血清TTR水平。在一个示例性实施例中，收集血液并分离血清。可以使用小鼠前白蛋白(运甲状腺素蛋白)ELISA试剂盒(奥维亚系统生物公司(Aviva Systems Biology)，目录OKIA00111)或用于测量人TTR的类似试剂盒来测定总TTR血清水平。如果没有可用的试剂盒，则可以使用预先涂有对正在测量的TTR具有特异性的捕获抗体的板来开发ELISA。接下来将板在室温下温育一段时间，之后进行洗涤。添加酶-抗TTR抗体缀合物并温育。去除未结合的抗体缀合物并洗涤板，之后添加与酶反应的显色底物溶液。在对所使用的酶和底物具有特异性的吸光度下在适当的读板仪上读取所述板。
在一些实施例中，细胞(包含来自组织的细胞)中的TTR的量测量gRNA或组合的功效。在一些实施例中，使用蛋白质印迹测量细胞中的TTR的量。在一些实施例中，所使用的细胞是HUH7细胞。在一些实施例中，所使用的细胞是原代人肝细胞。在一些实施例中，所使用的细胞是从动物获得的原代细胞。在一些实施例中，将TTR的量与甘油醛3-磷酸脱氢酶GAPDH(管家基因)的量进行比较以控制细胞数量的变化。
III.LNP调配物和ATTR的治疗
在一些实施例中，提供了一种在TTR基因内诱导双链断裂(DSB)的方法，所述方法包括施用包括如本文所述的向导RNA的组合物，所述向导RNA例如包括SEQ ID No:5-82的任何一个或多个向导序列或SEQ ID No:87-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，施用包括SEQ ID No:5-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA以在TTR基因中诱导DSB。所述向导RNA与本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶，例如Cas9)进行编码的核酸(例如，mRNA)或载体一起施用。所述RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种在TTR基因内诱导双链断裂(DSB)的方法，所述方法包括施用包括向导RNA(如经化学修饰的向导RNA)的组合物，所述向导RNA包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的任何一个或多个向导序列或SEQ ID No:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，施用SEQ ID No:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个或包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA以在TTR基因中诱导DSB。所述向导RNA与本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶，例如Cas9)进行编码的核酸或载体一起施用。所述RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种对TTR基因进行修饰的方法，所述方法包括施用包括如本文所述的向导RNA的组合物，所述向导RNA例如包括SEQ ID No:5-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID No:87-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，施用包括SEQ ID No:5-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQ ID No:87-124的sgRNA中的任何一个或多个以对TTR基因进行修饰。所述向导RNA与本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶，例如Cas9)进行编码的核酸或载体一起施用。所述RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种对TTR基因进行修饰的方法，所述方法包括施用包括向导RNA的组合物，所述向导RNA包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID No:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQ ID No:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个以对TTR基因进行修饰。所述向导RNA与本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶，例如Cas9)进行编码的核酸或载体一起施用。所述RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种治疗ATTR的方法，所述方法包括施用包括如本文所述的向导RNA的组合物，所述向导RNA例如包括SEQ ID NO:5-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID No:87-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，施用包括SEQ IDNO:5-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQ ID No:87-124的sgRNA中的任何一个或多个以治疗ATTR。所述向导RNA与本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶，例如Cas9)进行编码的核酸或载体一起施用。所述RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种治疗ATTR的方法，所述方法包括施用包括向导RNA的组合物，所述向导RNA包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID No:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQID No:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个以治疗ATTR。所述向导RNA与本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶，例如Cas9)进行编码的核酸或载体一起施用。所述RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种降低TTR血清浓度的方法，所述方法包括施用如本文所述的向导RNA，所述向导RNA例如包括SEQ ID NO:5-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID No:87-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:5-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQ ID No:87-124的sgRNA中的任何一个或多个以减少或预防TTR在淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积。所述gRNA与本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶，例如Cas9)进行编码的核酸或载体一起施用。所述RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种降低TTR血清浓度的方法，所述方法包括施用如本文所述的向导RNA，所述向导RNA例如包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID No:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQ ID No:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个以减少或预防TTR在淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积。所述gRNA与本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶，例如Cas9)进行编码的核酸或载体一起施用。所述RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种减少或预防TTR在受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积的方法，所述方法包括施用包括如本文所述的向导RNA的组合物，所述向导RNA例如包括SEQ ID NO:5-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID No:87-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，提供了一种减少或预防TTR在受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积的方法，所述方法包括施用包括SEQ ID NO:87-113的sgRNA中的任何一个或多个的组合物。在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:5-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQ ID No:87-124的sgRNA中的任何一个或多个以减少或预防TTR在淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积。所述gRNA与本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶，例如Cas9)进行编码的核酸或载体一起施用。所述RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，提供了一种减少或预防TTR在受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积的方法，所述方法包括施用包括如本文所述的向导RNA的组合物，所述向导RNA例如包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个或SEQ ID No:87-124的sgRNA中的任何一个或多个。在一些实施例中，提供了一种减少或预防TTR在受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积的方法，所述方法包括施用包括SEQ ID No:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个的组合物。在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列中的任何一个或多个的gRNA或者SEQ ID No:87-113、115-120和122-124的sgRNA中的任何一个或多个以减少或预防TTR在淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积。所述gRNA与本文所述的对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶，例如Cas9)进行编码的核酸或载体一起施用。所述RNA引导的DNA核酸酶可以是酿脓链球菌Cas9。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，包括表1的向导序列的gRNA或来自表2中的一个或多个sgRNA与RNA引导的DNA核酸酶(如从核酸翻译的Cas核酸酶)一起诱导DSB，并且修复期间的非同源端接合(NHEJ)导致TTR基因中的突变。在一些实施例中，NHEJ导致核苷酸的缺失或插入，这在TTR基因中诱导移码或无义突变。
在一些实施例中，施用向导RNA和对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸(例如，本文提供的组合物中)降低受试者的TTR的水平(例如，血清水平)，并且因此预防TTR在淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积和聚集。
在一些实施例中，减少或预防TTR在受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积包括减少或预防TTR在受试者的一个或多个组织(如胃、结肠或神经组织)中沉积。在一些实施例中，神经组织包括坐骨神经或背根神经节。在一些实施例中，在胃、结肠、背根神经节和坐骨神经中的两个、三个或四个中的TTR沉积减少。给定组织中的沉积水平可以使用活检样本(例如使用免疫染色)测定。在一些实施例中，基于降低血清TTR水平持续一段时间来推断减少或预防TTR在受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积和/或减少或预防TTR沉积。如在实例中所讨论的，已经发现，根据本文所提供的方法和用途降低血清TTR水平可能导致从组织(如上文和实例中所讨论的组织)中清除沉积的TTR，例如，如在施用所述组合物后8周测量的。
在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述受试者是人。在一些实施例中，所述受试者是牛、猪、猴、羊、狗、猫、鱼或家禽。
在一些实施例中，提供了如本文所述的一个或多个例如包括(例如，在本文所提供的组合物中的)表1中的向导序列中的任何一个或多个或来自表2的一个或多个sgRNA的向导RNA和本文所述的对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸(例如，mRNA)的用途，其用于制备用于治疗患有ATTR的人类受试者的药物。所述RNA引导的DNA核酸酶可以是Cas9，例如酿脓链球菌Cas9。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。
在一些实施例中，包括向导RNA和核酸的组合物是静脉内施用的。在一些实施例中，将包括向导RNA和核酸的组合物施用于肝循环中。
在一些实施例中，单次施用包括本文提供的向导RNA和核酸的组合物足以敲低突变型蛋白的表达。在一些实施例中，单次施用包括本文提供的向导RNA和核酸的组合物足以敲除突变型蛋白在细胞群体中的表达。在其它实施例中，多于一次施用包括本文提供的向导RNA和核酸的组合物可能有益于通过累积效应使编辑最大化。例如，本文提供的组合物可以施用2次、3次、4次、5次或更多次，如2次。施用可以间隔范围为例如1天到2年，如1到7天、7到14天、14天到30天、30天到60天、60天到120天、120天到183天、183天到274天、274天到366天或366天到2年的时间段。
在一些实施例中，以范围为0.01到10mg/kg(mpk)，例如0.01到0.1mpk、0.1到0.3mpk、0.3到0.5mpk、0.5到1mpk、1到2mpk、2到3mpk、3到5mpk、5到10mpk或0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、3、5或10mpk的有效量施用组合物。在一些实施例中，以2-4mg/kg，如2.5-3.5mg/kg的量施用组合物。在一些实施例中，以约3mg/kg的量施用组合物。
在一些实施例中，在递送后1年、2年、3年、4年、5年或10年看到用本发明的组合物治疗的功效。在一些实施例中，通过测量治疗前后TTR的血清水平来评估用本发明的组合物治疗的功效。在一些实施例中，在1周、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月或11个月时看到通过降低TTR的血清水平评估的用组合物治疗的功效。
在一些实施例中，治疗减缓或停止疾病进展。
在一些实施例中，治疗减缓或停止FAP的进展。在一些实施例中，治疗使感觉运动神经病变或自主神经病变的症状变化改善、稳定或减缓。
在一些实施例中，治疗使FAC的症状变化改善、稳定或减缓。在一些实施例中，治疗使限制性心肌病或充血性心力衰竭的症状变化改善、稳定或减缓。
在一些实施例中，治疗功效是通过增加受试者的存活时间来测量的。
在一些实施例中，治疗功效是通过感觉运动或自主神经病变的症状进展的改善或减缓来测量的。在一些实施例中，治疗功效是通过移动身体部位或感觉任何身体部位的能力的增加或降低的减缓来测量的。在一些实施例中，治疗功效是通过以下能力的改善或降低的减缓来测量的：吞咽；呼吸；使用手臂、手、腿或脚；或行走；在一些实施例中，治疗功效是通过神经痛的改善或进展的减缓来测量的。在一些实施例中，神经痛的特征在于疼痛、灼伤、刺痛或异常感觉。在一些实施例中，治疗功效是通过体位性低血压、头晕、胃肠动力障碍、膀胱功能障碍或性功能障碍的改善或增加的减缓来测量的。在一些实施例中，治疗功效是通过虚弱的改善或进展的减缓来测量的。在一些实施例中，治疗功效是通过使用肌电图、神经传导测试或患者报告的结果来测量的。
在一些实施例中，治疗功效是通过充血性心力衰竭或CHF的症状的改善或进展的减缓来测量的。在一些实施例中，治疗功效是通过呼吸短促、呼吸困难、疲劳或脚踝、脚、腿、腹部或颈部静脉的肿胀的减少或增加的减缓来测量的。在一些实施例中，治疗功效是通过体内积液的改善或进展的减缓来测量的，这可以通过如体重增加、尿频或夜间咳嗽等量度来评估。在一些实施例中，治疗功效是使用心脏生物标志物测试(如B型利钠肽[BNP]或N端前b型利钠肽[NT-proBNP])、肺功能测试、胸部X光片或心电图来测量的。
A.组合疗法
在一些实施例中，本发明包括包含施用如本文所述的例如包括表1中公开的向导序列中的任何一个或多个的gRNA中的任何一个或表2中的sgRNA中的任何一个或多个以及如本文所述的对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸(例如，在本文提供的组合物中)(如本文所述的对酿脓链球菌Cas9进行编码的核酸(例如，mRNA))或载体的组合疗法连同适于缓解ATTR的症状的额外疗法。在特定实施例中，所述向导RNA是经化学修饰的。在一些实施例中，所述向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸在本文所述的LNP中施用，如包括CCD脂质(例如，胺脂质，如脂质A)、辅助脂质(例如，胆固醇)、隐形脂质(例如PEG脂质，如PEG2k-DMG)以及任选地中性脂质(例如，DSPC)的LNP。
在一些实施例中，ATTR的额外疗法是对感觉运动或自主神经病变的治疗。在一些实施例中，对感觉运动或自主神经病变的治疗是非甾体抗炎药、抗抑郁药、抗惊厥药、抗心律失常药或麻醉剂。在一些实施例中，抗抑郁药是三环剂或血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂。在一些实施例中，抗抑郁药是阿米替林、度洛西汀或文拉法辛。在一些实施例中，抗惊厥剂是加巴喷丁、普瑞巴林、托吡酯或卡马西平。在一些实施例中，对感觉运动神经病变的额外治疗是经皮电神经刺激。
在一些实施例中，ATTR的额外疗法是对限制性心肌病或充血性心力衰竭(CHF)的治疗。在一些实施例中，对CHF的治疗是ACE抑制剂、醛固酮拮抗剂、血管紧张素受体阻断剂、β阻断剂、地高辛、利尿剂或硝酸异山梨酯/盐酸肼苯哒嗪。在一些实施例中，所述ACE抑制剂是依那普利、卡托普利、雷米普利、培哚普利、咪达普利或喹那普利。在一些实施例中，所述醛固酮拮抗剂是依普利酮或螺内酯。在一些实施例中，所述血管紧张素受体阻断剂是阿齐沙坦、卡沙坦、依普沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦、替米沙坦或缬沙坦。在一些实施例中，所述β受体阻断剂是醋丁洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、奈比洛尔或普萘洛尔。在一些实施例中，所述利尿剂是氯噻嗪、氯噻酮、氢氯噻嗪、吲达帕胺、美托拉宗、布美他尼、呋塞米、托拉塞米、阿米洛利或氨苯喋啶。
在一些实施例中，所述组合疗法包括施用包括表1中所公开的向导序列中的任何一个或多个的gRNA中的任何一个或表2中的sgRNA中的任何一个或多个以及对RNA引导的DNA结合剂(例如，在本文所提供的组合物中)进行编码的核酸连同靶向TTR或突变型TTR的siRNA。在一些实施例中，所述siRNA是能够进一步减少或消除野生型或突变型TTR表达的任何siRNA。在一些实施例中，所述siRNA是药物帕替西朗(Patisiran)(ALN-TTR02)或ALN-TTRsc02。在一些实施例中，在包括表1中所公开的向导序列中的任何一个或多个的gRNA中的任何一个或表2中的sgRNA中的任何一个或多个(例如，在本文所提供的组合物中)之后施用siRNA。在一些实施例中，在用本文提供的gRNA组合物中的任何组合物治疗后，定期施用siRNA。
在一些实施例中，所述组合疗法包括施用包括本文所述的例如在表1中所公开的向导序列中的任何一个或多个的gRNA中的任何一个或表2中的sgRNA中的任何一个或多个以及对本文所述的RNA引导的DNA结合剂(例如，在本文所提供的组合物中)进行编码的核酸连同靶向TTR或突变型TTR的反义核苷酸。在一些实施例中，所述反义核苷酸是能够进一步减少或消除野生型或突变型TTR表达的任何反义核苷酸。在一些实施例中，所述反义核苷酸是药物Inotersen(IONS-TTRRx)。在一些实施例中，在包括表1中所公开的向导序列中的任何一个或多个的gRNA中的任何一个或表2中的sgRNA中的任何一个或多个以及对RNA引导的DNA结合剂(例如，在本文所提供的组合物中)进行编码的核酸之后施用所述反义核苷酸。在一些实施例中，在用本文提供的gRNA组合物中的任何gRNA组合物治疗后，定期施用反义核苷酸。
在一些实施例中，所述组合疗法包括施用包括表1中所公开的向导序列中的任何一个或多个的gRNA中的任何一个或表2中的sgRNA中的任何一个或多个以及对RNA引导的DNA结合剂(例如，在本文所提供的组合物中)进行编码的核酸连同促进正确折叠的四聚体形式的TTR的动力学稳定的小分子稳定剂。在一些实施例中，所述小分子稳定剂是药物塔发米蒂斯(tafamidis)
Figure BDA0003369221130000871
或二氟尼柳。在一些实施例中，所述小分子稳定剂是在包括表1中所公开的向导序列中的任何一个或多个的gRNA中的任何一个或表2中的sgRNA中的任何一个或多个(例如，在本文所提供的组合物中)之后施用的。在一些实施例中，在用本文所提供的任何组合物治疗后，定期施用小分子稳定剂。
在上述任一实施例中，表1中所公开的向导序列可以选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82，和/或表2中的sgRNA可以选自SEQ ID No:87-113、115-120和122-124，和/或向导RNA可以是经化学修饰的向导RNA。
在一些实施例中，本文所述的方法包括输注预防。在一些实施例中，在基因编辑组合物之前向受试者施用输注预防。在一些实施例中，在施用核酸组合物之前8-24小时或1-2小时向受试者施用输注预防。在一些实施例中，输注预防包括皮质类固醇。在一些实施例中，所述输注预防包括以下中的一种或多种或全部：皮质类固醇、解热剂(例如，可以减轻疼痛和发烧和/或抑制COX酶和/或前列腺素的口服对乙酰氨基酚(也称为扑热息痛))、H1阻断剂或H2阻断剂。在一些实施例中，所述输注预防包括静脉内皮质类固醇(例如地塞米松8-12mg，如10mg或等效物)和解热剂(例如，口服对乙酰氨基酚或扑热息痛500mg)。在一些实施例中，所述H1阻断剂(例如，苯海拉明50mg或等效物)和/或H2阻断剂(例如，雷尼替丁50mg或等效物)是口服施用的。在一些实施例中，所述H1阻断剂(例如，苯海拉明50mg或等效物)和/或H2阻断剂(例如，雷尼替丁50mg或等效物)是静脉内施用的。在一些实施例中，在输注核酸组合物之前1-2小时静脉内施用输注预防。在一些实施例中，静脉内H1阻断剂和/或静脉内H2阻断剂被口服等效物取代。所述输注预防可以起到减少与施用核酸组合物相关的不良反应的作用。在一些实施例中，在施用核酸组合物之前，将所述输注预防作为所需的术前用药施用。可以独立控制施用皮质类固醇、输注预防以及本文所述的含向导RNA的组合物的剂量、频率和方式。
所公开的方法中使用的皮质类固醇可以根据本领域已知的方案(例如，美国FDA批准的方案)施用。在例如包括向人类受试者施用或用于人类受试者中的一些实施例中，所述皮质类固醇可以以范围为约0.75mg到约25mg的量施用。在例如包括向人类受试者施用或用于人类受试者中的一些实施例中，所述皮质类固醇可以以范围为约0.01-0.5mg/kg(如0.1-0.40mg/kg或0.25-0.40mg/kg)的量施用。
在一些实施例中，所述皮质类固醇在本文所述的含向导RNA的组合物之前施用。在一些实施例中，所述皮质类固醇在本文所述的含向导RNA的组合物之后施用。在一些实施例中，所述皮质类固醇与本文所述的含向导RNA的组合物同时施用。在一些实施例中，在施用含向导RNA的组合物之前或之后施用多个剂量的皮质类固醇。在一些实施例中，在施用所述皮质类固醇之前或之后施用多个剂量的含向导RNA的组合物。在一些实施例中，施用多个剂量的皮质类固醇和多个剂量的含向导RNA的组合物。
如果合适的话，一定剂量的皮质类固醇可以作为至少两个亚剂量以适当的间隔分开施用。在一些实施例中，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之前施用所述皮质类固醇至少两次。在一些实施例中，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之后施用一定剂量的皮质类固醇至少两次。在一些实施例中，以1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时；1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天；3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周的间隔；或以由前述值中的任何两个值界定的范围内的时间量施用皮质类固醇(例如，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之前、同时和/或之后)。在一些实施例中，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之前，以1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时；1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天；3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周的间隔；或以由前述值中的任何两个值界定的范围内的时间量施用皮质类固醇。在一些实施例中，在施用本文所述的含向导RNA的组合物之后，以1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、18小时；1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天；3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周的间隔；或以由前述值中的任何两个值界定的范围内的时间量施用皮质类固醇。
在一些实施例中，所述皮质类固醇被施用至少两次。在一些实施例中，所述皮质类固醇被施用至少三次。在一些实施例中，所述皮质类固醇被施用至少四次。在一些实施例中，所述皮质类固醇被施用至多五次、六次、七次、八次、九次或十次。第一剂量可以是口服的，而第二或后续剂量可以通过肠胃外施用，例如输注。可替代地，第一剂量可以是肠胃外施用，而第二或后续剂量可以通过口服施用。
在一些实施例中，在静脉内施用本文所述的含向导RNA的组合物之前口服施用所述皮质类固醇。在一些实施例中，在静脉内施用本文所述的含向导RNA的组合物时或之后口服施用所述皮质类固醇。
在一些实施例中，皮质类固醇是地塞米松。在一些实施例中，在输注核酸组合物之前1-2小时静脉内施用地塞米松。在一些实施例中，在输注核酸组合物之前1-2小时以8-12mg(如10mg)的量静脉内施用地塞米松。在一些实施例中，在输注核酸组合物之前8到24小时口服施用地塞米松。在一些实施例中，在输注核酸组合物之前8到24小时以8-12mg(如8mg)的量口服施用地塞米松。在一些实施例中，在输注核酸组合物之前8到24小时以8-12mg(如8mg)的量口服施用地塞米松，并且在输注核酸组合物之前1-2小时以8-12mg(如10mg)的量静脉内施用地塞米松。
B.核酸组合物的递送
在一些实施例中，本文所述的包括gRNA和本文所述的将RNA引导的DNA结合剂编码为RNA或编码在一个或多个载体上的核酸的核酸组合物在脂质纳米颗粒中调配或通过脂质纳米颗粒施用；参见例如标题为“用于CRISPR/CAS组分的脂质纳米颗粒调配物(LIPIDNANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS)”的WO 2017173054A1和标题为“调配物(FORMULATIONS)”的WO 2019067992A1，其内容特此以全文引用的方式并入。本领域技术人员已知能够向受试者递送核苷酸的任何脂质纳米颗粒(LNP)可以与本文所述的向导RNA和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸一起使用。
本文公开了用于RNA的LNP调配物的各个实施例，包含CRISPR/Cas货物。此类LNP调配物可以包含：(i)CCD脂质，如胺脂质；(ii)中性脂质；(iii)辅助脂质；以及(iv)隐形脂质，如PEG脂质。LNP调配物的一些实施例包含“胺脂质”以及辅助脂质、中性脂质和隐形脂质(如PEG脂质)。在一些实施例中，所述LNP调配物包含少于1％的中性磷脂。在一些实施例中，所述LNP调配物包含少于0.5％的中性磷脂。“脂质纳米颗粒”意指包括多个(即，多于一个)通过分子间作用力物理地相互关联的脂质分子的颗粒。
CCD脂质
用于向肝脏细胞递送CRISPR/Cas mRNA和向导RNA组分的脂质组合物包括CCD脂质。
在一些实施例中，CCD脂质是脂质A，所述脂质A为十八烷基-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称为(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。脂质A可以描述为：
Figure BDA0003369221130000901
可以根据WO2015/095340(例如，第84-86页)合成脂质A。
在一些实施例中，CCD脂质为脂质B，所述脂质B为((5-((二甲基氨基)甲基)-1,3-亚苯基)双(氧基))双(辛烷-8,1-二基)双(癸酸酯)，也被称为((5-((二甲基氨基)甲基)-1,3-亚苯基)双(氧基))双(辛烷-8,1-二基)双(癸酸酯)。脂质B可以描述为：
Figure BDA0003369221130000902
可以根据WO2014/136086(例如，第107-09页)合成脂质B。
在一些实施例中，CCD脂质为脂质C，所述脂质C为2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八烷基-9,12-二烯酸酯)。脂质C可以描述为：
Figure BDA0003369221130000903
在一些实施例中，CCD脂质为脂质D，所述脂质D为3-辛基十一烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯。
脂质D可以描述为：
Figure BDA0003369221130000911
可以根据WO2015/095340合成脂质C和脂质D。
CCD脂质也可以是脂质A、脂质B、脂质C或脂质D的等效物。在某些实施例中，CCD脂质是脂质A的等效物、脂质B的等效物、脂质C的等效物或脂质D的等效物。
胺脂质
在一些实施例中，用于递送生物活性剂的LNP组合物包括“胺脂质”，所述胺脂质被定义为脂质A、脂质B、脂质C、脂质D或脂质A的等效物(包含脂质A的缩醛类似物)、脂质B的等效物、脂质C的等效物和脂质D的等效物。
在一些实施例中，胺脂质是脂质A，所述脂质A为十八烷基-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称为(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。脂质A可以描述为：
Figure BDA0003369221130000912
可以根据WO2015/095340(例如，第84-86页)合成脂质A。在某些实施例中，所述胺脂质是脂质A的等效物。
在某些实施例中，胺脂质是脂质A的类似物。在某些实施例中，脂质A类似物是脂质A的缩醛类似物。在特定的LNP组合物中，所述缩醛类似物是C4-C12缩醛类似物。在一些实施例中，所述缩醛类似物是C5-C12缩醛类似物。在另外的实施例中，所述缩醛类似物是C5-C10缩醛类似物。在另外的实施例中，所述缩醛类似物选自C4、C5、C6、C7、C9、C10、C11和C12缩醛类似物。
适用于在本文所述的LNP中使用的胺脂质在体内是可生物降解的并且适于将生物活性剂(如RNA)递送到细胞。所述胺脂质具有低毒性(例如，以大于或等于10mg/kg的RNA货物的量在动物模型中可耐受，而无副作用)。在某些实施例中，包括胺脂质的LNP包含其中至少75％的胺脂质在8、10、12、24或48小时内或3、4、5、6、7或10天内从血浆中清除的LNP。在某些实施例中，包括胺脂质的LNP包含其中至少50％的mRNA或gRNA在8、10、12、24或48小时内或3、4、5、6、7或10天内从血浆中清除的LNP。在某些实施例中，包括胺脂质的LNP包含其中至少50％的LNP在8、10、12、24或48小时内或3、4、5、6、7或10天内从血浆中清除的LNP，例如通过测量脂质(例如，胺脂质)、RNA(例如，mRNA)或另一组分。在某些实施例中，测量LNP的脂质包封相对于游离脂质、RNA或核酸组分。
脂质清除率可以按文献所述进行测量。参见Maier,M.A.等人,“可生物降解的脂质使得能够快速消除脂质纳米颗粒以用于RNAi治疗剂的系统性递送(Biodegradable LipidsEnabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAiTherapeutics),”《分子疗法(Mol.Ther.)》2013,21(8),1570-78(“Maier”)。例如，在Maier中，含有荧光素酶靶向性siRNA的LNP-siRNA系统以0.3mg/kg通过侧尾静脉以静脉内团注注射的方式施用于六到八周大的雄性C57Bl/6小鼠。在给药后0.083小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、96小时和168小时采集血液、肝脏和脾脏样品。在组织采集前向小鼠灌注生理盐水，并处理血液样品以获得血浆。所有样品均通过LC-MS进行处理和分析。此外，Maier描述了评估LNP-siRNA调配物施用后毒性的程序。例如，以0、1、3、5和10mg/kg(5只动物/组)通过单次静脉内团注注射向雄性斯普拉-道来氏大鼠(Sprague-Dawley rat)施用剂量体积为5mL/kg的荧光素酶靶向性siRNA。24小时后，从有意识的动物的颈静脉抽取约1mL血液并分离血清。在给药后72小时，对所有动物实施安乐死以进行尸检。执行对临床体征、体重、血清化学、器官重量和组织病理学的评估。尽管Maier描述了用于评估siRNA LNP调配物的方法，但这些方法可以用于评估本公开的LNP组合物的清除率、药代动力学和施用毒性。
所述胺脂质可能导致清除率增加。在一些实施例中，所述清除率是脂质清除率，例如从血液、血清或血浆中清除脂质的速率。在一些实施例中，所述清除率是RNA清除率，例如从血液、血清或血浆中清除mRNA或gRNA的速率。在一些实施例中，所述清除率是从血液、血清或血浆中清除LNP的速率。在一些实施例中，所述清除率是从组织(如肝脏组织或脾脏组织)中清除LNP的速率。在某些实施例中，高清除率导致没有实质性不良影响的安全特性。所述胺脂质可以减少循环和组织中LNP的累积。在一些实施例中，循环和组织中LNP累积的减少导致没有实质性不良影响的安全特性。
本公开的胺脂质是可电离的(例如，可以形成盐)，这取决于它们所处介质的pH值。例如，在微酸介质中，所述胺脂质可能被质子化并且因此带正电荷。相反，在弱碱性介质中，例如在pH为大约7.35的血液中，所述胺脂质可能不会被质子化并且因此不带电荷。在一些实施例中，本公开的胺脂质可以在至少约9的pH下质子化。在一些实施例中，本公开的胺脂质可以在至少约9的pH下质子化。在一些实施例中，本公开的胺脂质可以在至少约10的pH下质子化。
胺脂质主要质子化时的pH值与其固有的pKa有关。在一些实施例中，本公开的胺脂质各自pKa的范围独立地为约5.1到约7.4。在一些实施例中，本公开的胺脂质各自pKa的范围独立地为约5.5到约6.6。在一些实施例中，本公开的胺脂质各自pKa的范围独立地为约5.6到约6.4。在一些实施例中，本公开的胺脂质各自pKa的范围独立地为约5.8到约6.2。例如，本公开的胺脂质各自pKa的范围独立地为约5.8到约6.5。胺脂质的pKa可以是调配LNP的重要考虑因素，因为已经发现范围为约5.1到约7.4的pKa的阳离子脂质可以有效地在体内递送货物，例如递送到肝脏。此外，已经发现，范围为约5.3到约6.4的pKa的阳离子脂质可以有效地在体内递送，例如递送到肿瘤。参见例如WO 2014/136086。
另外的脂质
适用于本公开的脂质组合物的“中性脂质”包含例如多种中性、不带电荷或两性离子脂质。适用于本公开的中性磷脂的实例包含但不限于5-十七烷基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-二二十碳烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺和其组合。在一个实施例中，中性磷脂可以选自由二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)组成的组。在另一个实施例中，中性磷脂可以是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。在另一个实施例中，中性磷脂可以是二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。
“辅助脂质”包含类固醇、甾醇和烷基间苯二酚。适用于本公开的辅助脂质包含但不限于胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。在一个实施例中，所述辅助脂质可以是胆固醇。在一个实施例中，辅助脂质可以是胆固醇半琥珀酸酯。
“隐形脂质”是改变纳米颗粒在体内(例如在血液中)存在的时间长度的脂质。隐形脂质可以通过例如减少颗粒聚集和控制粒度来帮助调配过程。本文所使用的隐形脂质可以调节LNP的药代动力学性质。适用于本公开的脂质组合物的隐形脂质包含但不限于具有连接到脂质部分的亲水性头基的隐形脂质。可以在Romberg等人,《药学研究(PharmaceuticalResearch)》,第25卷第1期,2008,第55-71页以及Hoekstra等人,《生物化学与生物物理学学报(Biochimica et Biophysica Acta)》1660(2004)41-52中找到适用于本公开的脂质组合物的隐形脂质以及关于此类脂质的生物化学的信息。例如，在WO 2006/007712中公开了另外的合适的PEG脂质。
在一个实施例中，所述隐形脂质的亲水性头基包括选自基于PEG的聚合物的聚合物部分。隐形脂质可以包括脂质部分。在一些实施例中，所述隐形脂质是PEG脂质。PEG脂质可以通过例如减少颗粒聚集和控制粒径来帮助调配过程。本文所使用的PEG脂质可以调节LNP的药代动力学性质。通常，PEG脂质包括脂质部分和基于PEG的聚合物部分。
在一个实施例中，隐形脂质包括选自以下的聚合物部分：基于PEG(有时称为聚(环氧乙烷))的聚合物、聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚氨基酸和聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]。
在一个实施例中，所述PEG脂质包括基于PEG(有时称为聚(环氧乙烷))的聚合物部分。
所述PEG脂质进一步包括脂质部分。在一些实施例中，脂质部分可以源自二酰基甘油或二烷基甘酰胺，其包含包括二烷基甘油或二烷基甘酰胺基团的那些，所述二烷基甘油或二烷基甘酰胺基团具有独立地包括约C4到约C40个饱和或不饱和碳原子的烷基链长度，其中链可以包括一个或多个官能团，例如酰胺或酯。在一些实施例中，烷基链长度包括约C10到C20。二酰基甘油或二烷基甘酰胺基团可以进一步包括一个或多个经取代的烷基。链长度可以是对称的或不对称的。
除非另有说明，本文所使用的，术语“PEG”意指任何聚乙二醇或其它聚亚烷基醚聚合物。在一个实施例中，PEG是乙二醇或环氧乙烷的任选地经取代的线性或支化聚合物。在一个实施例中，PEG是未经取代的。在一个实施例中，所述PEG例如被一个或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基或芳基取代。在一个实施例中，所述术语包含PEG共聚物，如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯(参见例如J.Milton Harris,聚(乙二醇)化学：生物技术和生物医学应用(Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical and biomedical applications)(1992))；在另一个实施例中，所述术语不包含PEG共聚物。在一个实施例中，所述PEG的分子量为约130到约50,000，在子实施例中为约150到约30,000，在子实施例中为约150到约20,000，在子实施例中为约150到约15,000，在子实施例中为约150到约10,000，在子实施例中为约150到约6,000，在子实施例中为约150到约5,000，在子实施例中为约150到约4,000，在子实施例中为约150到约3,000，在子实施例中为约300到约3,000，在子实施例中为约1,000到约3,000，并且在子实施例中为约1,500到约2,500。
在某些实施例中，所述PEG(其例如与脂质部分或脂质，如隐形脂质缀合)是“PEG-2K”，也称为“PEG 2000”，所述PEG的平均分子量为约2,000道尔顿。PEG-2K在本文中由下式(I)表示，其中n为45，这意味着数均聚合度包括约45个亚基
Figure BDA0003369221130000951
然而，可以使用本领域已知的其它PEG实施例，包含例如其中数均聚合度包括约23个亚基(n＝23)和/或68个亚基(n＝68)的那些实施例。在一些实施例中，n可以在约30到约60的范围内。在一些实施例中，n可以在约35到约55的范围内。在一些实施例中，n可以在约40到约50的范围内。在一些实施例中，n可以在约42到约48的范围内。在一些实施例中，n可以为45。在一些实施例中，R可以选自H、经取代的烷基和未经取代的烷基。在一些实施例中，R可以是未经取代的烷基。在一些实施例中，R可以是甲基。
在本文所述的任一实施例中，所述PEG脂质可以选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二豆蔻酰甘油(PEG-DMG)(来自日本东京NOF的目录号GM-020)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)(日本东京NOF的目录号DSPE-020CN)、PEG-二月桂酰甘氨酰胺、PEG-二肉豆蔻酰甘氨酰胺、PEG-二棕榈甘氨酰胺和PEG-二硬脂酰甘氨酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺-3',6'-二氧杂辛酰]氨甲酰-[Ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二十四碳烯氧基苄基-[Ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DMG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSPE)(来自美国阿拉巴马州阿拉巴斯特AvantiPolar Lipids公司(Avanti Polar Lipids,Alabaster,Alabama,USA)的目录号880120C)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020，日本东京NOF)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)和1,2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSA)。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-DMG。在一些实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-DSG。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-DSPE。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-DMA。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-C-DMA。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是在WO2016/010840(第[00240]段到[00244]段)中公开的化合物S027。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-DSA。在一个实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-C11。在一些实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-C14。在一些实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-C16。在一些实施例中，所述PEG脂质可以是PEG2k-C18。
LNP调配物
LNP可以含有：(i)用于包封和用于内体逃逸的胺脂质；(ii)用于稳定的中性脂质；(iii)也用于稳定的辅助脂质；以及(iv)隐形脂质，如PEG脂质。所述中性脂质可以省略。
在一些实施例中，LNP组合物可以包括RNA组分，所述RNA组分包含以下中的一种或多种：RNA引导的DNA结合剂、Cas核酸酶mRNA、第2类Cas核酸酶mRNA、Cas9 mRNA和gRNA。在一些实施例中，LNP组合物包含对第2类Cas核酸酶进行编码的mRNA和作为RNA组分的gRNA。在某些实施例中，LNP组合物可以包括RNA组分、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和隐形脂质。在某些LNP组合物中，所述辅助脂质是胆固醇。在其它组合物中，所述中性脂质是DSPC。在另外的实施例中，所述隐形脂质是PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施例中，所述LNP组合物包括脂质A或脂质A的等效物；辅助脂质；中性脂质；隐形脂质；以及向导RNA。在某些组合物中，所述胺脂质是脂质A。在某些组合物中，所述胺脂质是脂质A或其缩醛类似物；所述辅助脂质是胆固醇；所述中性脂质是DSPC；并且所述隐形脂质是PEG2k-DMG。
在某些实施例中，根据调配物中的组分脂质的相应摩尔比描述脂质组合物。本公开的实施例提供根据调配物中的组分脂质的相应摩尔比描述的脂质组合物。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约30mol％到约60mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约40mol％到约60mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约45mol％到约60mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约50mol％到约60mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约55mol％到约60mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约50mol％到约55mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约50mol％。在一个实施例中，所述胺脂质的mol％可以为约55mol％。在一些实施例中，LNP批次的胺脂质mol％将为目标mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施例中，LNP批次的胺脂质mol％将为目标mol％的±4mol％、±3mol％、±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±0.5mol％或±0.25mol％。所有mol％数均作为所述LNP组合物的脂质组分的分数给出。在某些实施例中，胺脂质mol％的LNP批次间可变性将小于15％、小于10％或小于5％。
在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约5mol％到约15mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约7mol％到约12mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约0mol％到约5mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约0mol％到约10mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约5mol％到约10mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约8mol％到约10mol％。
在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约5mol％、约6mol％、约7mol％、约8mol％、约9mol％、约10mol％、约11mol％、约12mol％、约13mol％、约14mol％或约15mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约9mol％。
在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约1mol％到约5mol％。在一个实施例中，所述中性脂质的mol％可以为约0.1mol％到约1mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(如中性磷脂)的mol％可以为约0.1mol％、约0.2mol％、约0.5mol％,1mol％、约1.5mol％、约2mol％、约2.5mol％、约3mol％、约3.5mol％、约4mol％、约4.5mol％或约5mol％。
在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以小于约1mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以小于约0.5mol％。在一个实施例中，所述中性脂质(例如，中性磷脂)的mol％可以为约0mol％、约0.1mol％、约0.2mol％、约0.3mol％、约0.4mol％、约0.5mol％、约0.6mol％、约0.7mol％、约0.8mol％、约0.9mol％或约1mol％。在一些实施例中，本文公开的调配物不含中性脂质(即，0mol％中性脂质)。在一些实施例中，本文公开的调配物基本上不含中性脂质(即，约0mol％中性脂质)。在一些实施例中，本文公开的调配物不含中性磷脂(即，0mol％中性磷脂)。在一些实施例中，本文公开的调配物基本上不含中性磷脂(即，约0mol％中性磷脂)。
在一些实施例中，LNP批次的中性脂质mol％将为目标中性脂质mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施例中，LNP批次间可变性将小于15％、小于10％或小于5％。
在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％可以为约20mol％到约60mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％可以为约25mol％到约55mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％可以为约25mol％到约50mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％可以为约25mol％到约40mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％可以为约30mol％到约50mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％可以为约30mol％到约40mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％基于胺脂质、中性脂质和PEG脂质浓度进行调节以使脂质组分达到100mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％基于胺脂质和PEG脂质浓度进行调节以使脂质组分达到100mol％。在一个实施例中，所述辅助脂质的mol％基于胺脂质和PEG脂质浓度进行调节以使脂质组分达到至少99mol％。在一些实施例中，LNP批次的辅助mol％将为目标mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施例中，LNP批次间可变性将小于15％、小于10％或小于5％。
在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约1mol％到约10mol％。在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约2mol％到约10mol％。在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约2mol％到约8mol％。在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约2mol％到约4mol％。在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约2.5mol％到约4mol％。在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约3mol％。在一个实施例中，所述PEG脂质的mol％可以为约2.5mol％。在一些实施例中，LNP批次的PEG脂质mol％将为目标PEG脂质mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施例中，LNP批次间可变性将小于15％、小于10％或小于5％。
在某些实施例中，货物包含对RNA引导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶、第2类Cas核酸酶或Cas9)进行编码的核酸和gRNA或对gRNA进行编码的核酸或mRNA和gRNA的组合。在一个实施例中，LNP组合物可以包括脂质A或其等效物。在一些方面，所述胺脂质是脂质A。在一些方面，所述胺脂质是脂质A等效物，例如脂质A的类似物。在某些方面，所述胺脂质是脂质A的缩醛类似物。在各个实施例中，所述LNP组合物包括胺脂质、中性脂质、辅助脂质和PEG脂质。在某些实施例中，所述辅助脂质是胆固醇。在某些实施例中，所述中性脂质是DSPC。在特定实施例中，PEG脂质是PEG2k-DMG。在一些实施例中，LNP组合物可以包括脂质A、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在一些实施例中，LNP组合物包括胺脂质、DSPC、胆固醇和PEG脂质。在一些实施例中，LNP组合物包括包含DMG的PEG脂质。在某些实施例中，所述胺脂质选自脂质A和脂质A的等效物，包含脂质A的缩醛类似物。在另外的实施例中，LNP组合物包括脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。
在各个实施例中，LNP组合物包括胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在各个实施例中，LNP组合物包括胺脂质、辅助脂质、中性磷脂和PEG脂质。在各个实施例中，LNP组合物包括由以下组成的脂质组分：胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在各个实施例中，LNP组合物包括胺脂质、辅助脂质和PEG脂质。在某些实施例中，LNP组合物不包括中性脂质，如中性磷脂。在各个实施例中，LNP组合物包括由胺脂质、辅助脂质和PEG脂质组成的脂质组分。在某些实施例中，所述中性脂质选自以下中的一种或多种：DSPC、DPPC、DAPC、DMPC、DOPC、DOPE和DSPE。在某些实施例中，所述中性脂质是DSPC。在某些实施例中，所述中性脂质是DPPC。在某些实施例中，所述中性脂质是DAPC。在某些实施例中，所述中性脂质是DMPC。在某些实施例中，所述中性脂质是DOPC。在某些实施例中，所述中性脂质是DOPE。在某些实施例中，所述中性脂质是DSPE。在某些实施例中，所述辅助脂质是胆固醇。在特定实施例中，所述PEG脂质是PEG2k-DMG。在一些实施例中，LNP组合物可以包括脂质A、辅助脂质和PEG脂质。在一些实施例中，LNP组合物可以包括由脂质A、辅助脂质和PEG脂质组成的脂质组分。在一些实施例中，LNP组合物包括胺脂质、胆固醇和PEG脂质。在一些实施例中，LNP组合物包括由胺脂质、胆固醇和PEG脂质组成的脂质组分。在一些实施例中，LNP组合物包括包含DMG的PEG脂质。在某些实施例中，所述胺脂质选自脂质A和脂质A的等效物，包含脂质A的缩醛类似物。在某些实施例中，所述胺脂质是脂质A的C5-C12或C4-C12缩醛类似物。在另外的实施例中，LNP组合物包括脂质A、胆固醇和PEG2k-DMG。
本公开的实施例还提供了根据胺脂质的带正电荷的胺基团(N)与待包封的核酸的带负电荷的磷酸酯基团(P)之间的摩尔比描述的脂质组合物。这可以由等式N/P在数学上表示。在一些实施例中，LNP组合物可以包括包含胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的脂质组分；以及核酸组分，其中所述N/P比率为约3到10。在一些实施例中，LNP组合物可以包括包含胺脂质、辅助脂质和PEG脂质的脂质组分；以及核酸组分，其中所述N/P比率为约3到10。在一些实施例中，LNP组合物可以包括：脂质组分，所述脂质组分包括胺脂质、辅助脂质、中性脂质和辅助脂质；以及RNA组分，其中所述N/P比率为约3到10。在一些实施例中，LNP组合物可以包括包含胺脂质、辅助脂质和PEG脂质的脂质组分；以及RNA组分，其中所述N/P比率为约3到10。在一个实施例中，所述N/P比率可以为约5到7。在一个实施例中，所述N/P比率可以为约3到7。在一个实施例中，所述N/P比率可以为约4.5到8。在一个实施例中，所述N/P比率可以为约6。在一个实施例中，所述N/P比率可以为约6±1。在一个实施例中，所述N/P比率可以为约6±0.5。在一些实施例中，所述N/P比率将为目标N/P比率的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施例中，LNP批次间可变性将小于15％、小于10％或小于5％。
在一些实施例中，所述RNA组分可以包括核酸(如本文公开的例如对本文所述的Cas核酸酶(如本文所述的Cas9 mRNA)进行编码的核酸)和本文所述的gRNA。在一些实施例中，所述RNA组分包括本文所述的Cas核酸酶mRNA和本文所述的gRNA。在一些实施例中，所述RNA组分包括本文所述的第2类Cas核酸酶mRNA和本文所述的gRNA。在上述任一实施例中，所述gRNA可以是本文所述的sgRNA，如本文所述的经化学修饰的sgRNA。
在某些实施例中，LNP组合物可以包括如上文所讨论的RNA组分、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在某些LNP组合物中，所述辅助脂质是胆固醇；所述中性脂质是DSPC；和/或所述PEG脂质是PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在特定组合物中，所述胺脂质选自脂质A和其等效物，如脂质A的缩醛类似物。在一个实施例中，所述LNP组合物的脂质组分由以下组成：胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在一个实施例中，所述LNP组合物的脂质组分由胺脂质、辅助脂质和PEG脂质组成。在包括对Cas核酸酶进行编码的mRNA以及gRNA的某些组合物中，所述辅助脂质是胆固醇。在包括对Cas核酸酶进行编码的mRNA以及gRNA的一些组合物中，所述中性脂质是DSPC。包括对Cas核酸酶进行编码的mRNA以及gRNA的某些组合物包括小于约1mol％的中性脂质，例如中性磷脂。包括对Cas核酸酶进行编码的mRNA以及gRNA的某些组合物包括小于约0.5mol％的中性脂质，例如中性磷脂。在某些组合物中，所述LNP不包括中性脂质，例如中性磷脂。在包括对Cas核酸酶进行编码的mRNA以及gRNA的另外实施例中，所述PEG脂质是PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施例中，所述胺脂质选自脂质A和其等效物(如脂质A的缩醛类似物)。
在某些实施例中，所述LNP组合物包含本文所述的Cas核酸酶mRNA(如第2类CasmRNA)和本文所述的至少一个gRNA。在某些实施例中，所述LNP组合物包含的gRNA与Cas核酸酶mRNA(如第2类Cas核酸酶mRNA)的比率为约25:1到约1:25。在某些实施例中，所述LNP调配物包含的gRNA与Cas核酸酶mRNA(如第2类Cas核酸酶mRNA)的比率为约10:1到约1:10。在某些实施例中，所述LNP调配物包含的gRNA与Cas核酸酶mRNA(如第2类Cas核酸酶mRNA)的比率为约8:1到约1:8。如本文所测量的，所述比率是按重量计算的。在一些实施例中，所述LNP调配物包含的gRNA与Cas核酸酶mRNA(如第2类Cas mRNA)的比率为约5:1到约1:5。在一些实施例中，比率范围为约3:1到1:3、约2:1到1:2、约5:1到1:2、约5:1到1:1、约3:1到1:2、约3:1到1:1、约3:1、约2:1到1:1。在一些实施例中，gRNA与mRNA的比率为约3:1或约2:1。在一些实施例中，gRNA与Cas核酸酶mRNA(如第2类Cas核酸酶)的比率为约1:1。比率可以为25:1、10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、1:10或1:25。
在一些实施例中，LNP通过将RNA水溶液与基于有机溶剂的脂质溶液(例如，100％乙醇)混合而形成。合适的溶液或溶剂包含或可能含有：水、PBS、Tris缓冲液、NaCl、柠檬酸盐缓冲液、乙醇、氯仿、二乙醚、环己烷、四氢呋喃、甲醇、异丙醇。可以使用药学上可接受的缓冲液，例如用于体内施用LNP。在某些实施例中，缓冲液用于将包括LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 6.5。在某些实施例中，缓冲液用于将包括LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 7.0。在某些实施例中，所述组合物的pH的范围为约7.2到约7.7。在另外的实施例中，所述组合物的pH的范围为约7.3到约7.7或约7.4到约7.6。在另外的实施例中，所述组合物的pH为约7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7。可以使用微型pH探针测量组合物的pH。在某些实施例中，所述组合物中包含冷冻保护剂。冷冻保护剂的非限制性实例包含蔗糖、海藻糖、甘油、DMSO和乙二醇。示例性组合物可以包含高达10％的冷冻保护剂，例如蔗糖。在某些实施例中，所述LNP组合物可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％的冷冻保护剂。在某些实施例中，所述LNP组合物可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％的蔗糖。在一些实施例中，所述LNP组合物可以包含缓冲液。在一些实施例中，所述缓冲液可以包括磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液以及其混合物。在某些示例性实施例中，所述缓冲液包括NaCl。在某些实施例中，省略了NaCl。NaCl的示例性量可以在约20mM到约45mM的范围内。NaCl的示例性量可以在约40mM到约50mM的范围内。在一些实施例中，NaCl的量为约45mM。在一些实施例中，所述缓冲液是Tris缓冲液。Tris的示例性量可以在约20mM到约60mM的范围内。Tris的示例性量可以在约40mM到约60mM的范围内。在一些实施例中，Tris的量为约50mM。在一些实施例中，所述缓冲液包括NaCl和Tris。所述LNP组合物的某些示例性实施例含有含5％蔗糖和45mM NaCl的Tris缓冲液。在其它示例性实施例中，组合物含有在pH 7.5下量为约5％w/v的蔗糖、约45mM NaCl和约50mM Tris。盐、缓冲液和冷冻保护剂的量可以改变，使得维持整体调配物的渗透压。例如，最终渗透压可以维持在450mOsm/L以下。在另外的实施例中，渗透压介于350与250mOsm/L之间。某些实施例具有300+/-20mOsm/L的最终渗透压。
在一些实施例中，使用微流体混合、T混合或交叉混合。在某些方面，流速、结尺寸、结几何形状、结形状、管直径、溶液和/或RNA和脂质浓度可以变化。LNP或LNP组合物可以被浓缩或纯化，例如通过透析、切向流过滤或色谱法。例如，所述LNP可以以悬浮液、乳液或冻干粉的形式储存。在一些实施例中，所述LNP组合物储存在2-8℃下，在某些方面，所述LNP组合物储存在室温下。在另外的实施例中，LNP组合物被冷冻储存，例如储存在-20℃或-80℃下。在其它实施例中，LNP组合物储存在范围为约0℃到约-80℃的温度下。冷冻的LNP组合物可以在使用前解冻，例如在冰上、在室温下或在25℃下解冻。
所述LNP可以是例如微球(包含单层和多层囊泡，例如“脂质体”-层状相脂质双层，所述层状相脂质双层在一些实施例中基本上是球形的，并且在更具体的实施例中可以包括水核，例如包括RNA分子的很大一部分)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。
此外，所述LNP组合物是可生物降解的，因为它们在治疗有效剂量下不会在体内累积到细胞毒性水平。在一些实施例中，所述LNP组合物不会引起在治疗剂量水平下导致实质性不良反应的先天免疫应答。在一些实施例中，本文所提供的LNP组合物在治疗剂量水平下不会引起毒性。
在一些实施例中，pdi的范围可以为约0.005到约0.75。在一些实施例中，pdi的范围可以为约0.01到约0.5。在一些实施例中，pdi的范围可以为约零到约0.4。在一些实施例中，pdi的范围可以为约零到约0.35。在一些实施例中，pdi的范围可以为约零到约0.35。在一些实施例中，pdi的范围可以为约零到约0.3。在一些实施例中，pdi的范围可以为约零到约0.25。在一些实施例中，pdi的范围可以为约零到约0.2。在一些实施例中，pdi可以小于约0.08、0.1、0.15、0.2或0.4。
本文公开的LNP的尺寸(例如，Z-平均直径)为约1到约250nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约10到约200nm。在另外的实施例中，所述LNP的尺寸为约20到约150nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约50到约150nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约50到约100nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约50到约120nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约60到约100nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约75到约150nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约75到约120nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为约75到约100nm。除非另有说明，本文所指的所有尺寸均为完全形成的纳米颗粒的平均尺寸(直径)，如通过在Malvern Zetasizer上的动态光散射测量的。纳米颗粒样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，使得计数率为大约200-400kcps。数据表示为强度量度的加权平均值(Z-平均直径)。
在一些实施例中，所述LNP以范围为约50％到约100％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约50％到约70％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约70％到约90％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约90％到约100％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约75％到约95％的平均包封效率形成。
在一些实施例中，所述LNP以范围为约1.00E+05g/mol到约1.00E+10g/mol的平均分子量形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约5.00E+05g/mol到约7.00E+07g/mol的平均分子量形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约1.00E+06g/mol到约1.00E+10g/mol的平均分子量形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约1.00E+07g/mol到约1.00E+09g/mol的平均分子量形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为约5.00E+06g/mol到约5.00E+09g/mol的平均分子量形成。
在一些实施例中，多分散性(Mw/Mn；加权平均摩尔质量(Mw)与数均摩尔质量(Mn)的比率))的范围可以为约1.000到约2.000。在一些实施例中，Mw/Mn的范围可以为约1.00到约1.500。在一些实施例中，Mw/Mn的范围可以为约1.020到约1.400。在一些实施例中，Mw/Mn的范围可以为约1.010到约1.100。在一些实施例中，Mw/Mn的范围可以为约1.100到约1.350。
动态光散射(“DLS”)可以用于表征本公开的LNP的多分散性指数(“pdi”)和尺寸。DLS测量使样品经受光源产生的光散射。如根据DLS测量结果测定的，PDI代表群体中粒径(围绕平均粒径)的分布，其中完全均匀群体的PDI为零。在一些实施例中，pdi的范围可以为0.005到0.75。在一些实施例中，pdi的范围可以为0.01到0.5。在一些实施例中，pdi的范围可以为0.02到0.4。在一些实施例中，pdi的范围可以为0.03到0.35。在一些实施例中，pdi的范围可以为0.1到0.35。
在一些实施例中，本文公开的LNP的尺寸为1到250nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为10到200nm。在另外的实施例中，所述LNP的尺寸为20到150nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为50到150nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为50到100nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为50到120nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为75到150nm。在一些实施例中，所述LNP的尺寸为30到200nm。除非另有说明，本文所指的所有尺寸均为完全形成的纳米颗粒的平均尺寸(直径)，如通过在Malvern Zetasizer上的动态光散射测量的。纳米颗粒样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，使得计数率为大约200-400kcts。数据表示为强度量度的加权平均值。在一些实施例中，所述LNP以范围为50％到100％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为50％到70％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为70％到90％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为90％到100％的平均包封效率形成。在一些实施例中，所述LNP以范围为75％到95％的平均包封效率形成。
在一些实施例中，与本文公开的gRNA和对本文公开的RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9、Spy Cas9)进行编码的核酸(例如，mRNA)相关联的LNP用于制备用于治疗ATTR的药物。在一些实施例中，与本文公开的gRNA和对本文公开的RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9、SpyCas9)进行编码的核酸(例如，mRNA)相关联的LNP用于制备用于减少或预防TTR在患有ATTR的受试者的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积和聚集的药物。在一些实施例中，与本文公开的gRNA和对本文公开的RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9、Spy Cas9)进行编码的核酸(例如，mRNA)相关联的LNP用于制备用于减少血清TTR浓度的药物。在一些实施例中，与本文公开的gRNA和对本文公开的RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9、Spy Cas9)进行编码的核酸(例如，mRNA)相关联的LNP用于治疗受试者(如哺乳动物，例如灵长类动物，如人)的ATTR。在一些实施例中，与本文公开的gRNA和对本文公开的RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9、SpyCas9)进行编码的核酸(例如，mRNA)相关联的LNP用于减少或预防TTR在患有ATTR的受试者(如哺乳动物，例如灵长类动物，如人)的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维中累积和聚集。在一些实施例中，与本文公开的gRNA和对本文公开的RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9、Spy Cas9)进行编码的核酸(例如，mRNA)相关联的LNP用于降低受试者(如哺乳动物，例如灵长类动物，如人)的血清TTR浓度。
电穿孔也是众所周知的用于递送货物的方法，并且可以使用任何电穿孔方法来递送本文公开的gRNA中的任何一种。在一些实施例中，电穿孔可以用于递送本文公开的gRNA中的任何一个和RNA引导的DNA核酸酶(如Cas9)或对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas9)进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明包括一种用于将本文公开的gRNA中的任何一个和对本文公开的RNA引导的DNA结合剂(例如Cas9、Spy Cas9)进行编码的核酸(例如mRNA)递送到体外细胞的方法，其中gRNA和核酸与LNP相关联。
在某些实施例中，本发明包括对包括本文描述的向导序列中的任何一个或多个的向导RNA中的任何一个进行编码的DNA或RNA载体。在一些实施例中，除了引导RNA序列，载体还进一步包括不对引导RNA进行编码的核酸。不对引导RNA进行编码的核酸包含但不限于启动子、增强子、调节序列和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸，所述核酸酶可以是如Cas9等核酸酶。在一些实施例中，载体包括对crRNA、trRNA或crRNA和trRNA进行编码的一个或多个核苷酸序列。在一些实施例中，所述载体包括对sgRNA进行编码的一个或多个核苷酸序列和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸，所述核酸酶可以是Cas核酸酶，如Cas9或Cpf1。在一些实施例中，所述载体包括对crRNA进行编码的一个或多个核苷酸序列、trRNA以及对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸，所述核酸酶可以是Cas蛋白，如Cas9。在一个实施例中，Cas9来自酿脓链球菌(即，Spy Cas9)。在一些实施例中，对crRNA、trRNA或crRNA和trRNA(其可以是sgRNA)进行编码的核苷酸序列包括或由两侧是来自天然存在的CRISPR/Cas系统的重复序列的全部或部分的引导序列组成。包括或由crRNA、trRNA或crRNA和trRNA组成的核酸可以进一步包括载体序列，其中载体序列包括或由与crRNA、trRNA或crRNA和trRNA一起的非天然发现的核酸组成。
在一些实施例中，所述crRNA和所述trRNA由一个载体内的非连续核酸编码。在一些实施例中，所述crRNA和所述trRNA可以由连续核酸编码。在一些实施例中，所述crRNA和所述trRNA由单个核酸的相反链编码。在一些实施例中，所述crRNA和所述trRNA由单个核酸的相同链编码。
在一些实施例中，所述载体可以是圆形的。在其它实施例中，所述载体可以是线性的。在一些实施例中，所述载体可以被包裹在脂质纳米颗粒、脂质体、非脂质纳米颗粒或病毒衣壳中。非限制性示例性载体包含质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体、微染色体、转座子、病毒载体和表达载体。
在一些实施例中，所述载体可以是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体可以从其野生型对应物进行基因修饰。例如，所述病毒载体可以包括一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代以促进克隆或使得所述载体的一个或多个特性被改变。此类特性可以包含包装能力、转导效率、免疫原性、基因组整合、复制、转录和翻译。在一些实施例中，可以使病毒基因组的一部分缺失，使得病毒能够包装具有更大尺寸的外源序列。在一些实施例中，所述病毒载体可以具有增强的转导效率。在一些实施例中，由病毒在宿主中诱导的免疫应答可以被降低。在一些实施例中，促进病毒序列整合到宿主基因组中的病毒基因(如整合酶)可能发生突变，使得病毒变得非整合。在一些实施例中，所述病毒载体可以是复制缺陷型的。在一些实施例中，所述病毒载体可以包括外源转录或翻译控制序列以驱动所述载体上编码序列的表达。在一些实施例中，病毒可以是辅助依赖性的。例如，病毒可能需要一种或多种辅助病毒来供应使载体扩增和将载体包装到病毒颗粒中所需的病毒组分(例如，病毒蛋白)。在此类情况下，一种或多种辅助组分(包含一个或多个对病毒组分进行编码的载体)可以与本文所述的载体系统一起被引入到宿主细胞中。在其它实施例中，病毒可以是无辅助的。例如，病毒可能能够在没有任何辅助病毒的情况下扩增和包装所述载体。在一些实施例中，本文所述的载体系统还可以对病毒扩增和包装所需的病毒组分进行编码。
非限制性示例性病毒载体包含腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、腺病毒载体、辅助依赖性腺病毒载体(HDAd)、单纯疱疹病毒(HSV-1)载体、噬菌体T4、杆状病毒载体和逆转录病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体可以是AAV载体。在一些实施例中，所述病毒载体是AAV2、AAV3、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAVrh10或AAVLK03。在其它实施例中，所述病毒载体可以是慢病毒载体。
在一些实施例中，所述慢病毒可以是非整合的。在一些实施例中，所述病毒载体可以是腺病毒载体。在一些实施例中，所述腺病毒可以是高克隆能力或“无肠”腺病毒，其中除5'和3'反向末端重复序列(ITR)和包装信号(“I”)之外的所有编码病毒区都从病毒中缺失，以提高其包装能力。在又其它实施例中，所述病毒载体可以是HSV-1载体。在一些实施例中，基于HSV-1的载体是辅助依赖性的，并且在其它实施例中其是辅助非依赖性的。例如，仅保留包装序列的扩增子载体需要具有用于包装的结构组分的辅助病毒，而去除非必需病毒功能的30kb-缺失HSV-1载体则不需要辅助病毒。在另外的实施例中，所述病毒载体可以是噬菌体T4。在一些实施例中，当病毒头部被清空时，所述噬菌体T4可能能够包装任何线性或圆形DNA或RNA分子。在另外的实施例中，所述病毒载体可以是杆状病毒载体。在又另外的实施例中，所述病毒载体可以是逆转录病毒载体。在使用具有较小克隆能力的AAV或慢病毒载体的实施例中，可能需要使用多于一种载体来递送本文公开的载体系统的所有组分。例如，一个AAV载体可能含有对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶)进行编码的序列，而第二个AAV载体可能含有一个或多个向导序列。
在一些实施例中，所述载体可能能够驱动一个或多个编码序列在细胞中的表达。在一些实施例中，所述细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。在一些实施例中，所述细胞可以是真核细胞，例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述真核细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述真核细胞可以是啮齿动物细胞。在一些实施例中，所述真核细胞可以是人细胞。驱动在不同类型的细胞中表达的合适启动子是本领域已知的。在一些实施例中，所述启动子可以是野生型的。在其它实施例中，所述启动子可以被修饰以进行更有效或更高效的表达。在又其它实施例中，所述启动子可以被截短但仍保留其功能。例如，所述启动子可以具有适合于将所述载体适当包装到病毒中的正常大小或减小的大小。
在一些实施例中，所述载体可以包括对RNA引导的DNA核酸酶(如本文所述的核酸酶)进行编码的核苷酸序列。在一些实施例中，由所述载体编码的核酸酶可以是Cas蛋白。在一些实施例中，所述载体系统可以包括对核酸酶进行编码的核苷酸序列的一个拷贝。在其它实施例中，所述载体系统可以包括对核酸酶进行编码的核苷酸序列的多于一个拷贝。在一些实施例中，对核酸酶进行编码的核苷酸序列可以可操作地连接到至少一个转录或翻译控制序列。在一些实施例中，对核酸酶进行编码的核苷酸序列可以可操作地连接到至少一个启动子。
在一些实施例中，所述启动子可以是组成型的、诱导型的或组织特异型的。在一些情况下，所述启动子可以是组成型启动子。非限制性示例性组成型启动子包含巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、猿猴病毒(SV40)启动子、腺病毒主要晚期(MLP)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、延伸因子-α(EF1a)启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、其功能片段或上述任何一种的组合。在一些实施例中，所述启动子可以是CMV启动子。在一些实施例中，所述启动子可以是截短的CMV启动子。在其它实施例中，所述启动子可以是EF1a启动子。在一些实施例中，所述启动子可以是诱导型启动子。非限制性示例性诱导型启动子包含可通过热休克、光、化学品、肽、金属、类固醇、抗生素或酒精诱导的启动子。在一些实施例中，所述诱导型启动子可以是具有低基础(非诱导)表达水平的启动子，例如
Figure BDA0003369221130001071
启动子(Clontech)。
在一些实施例中，所述启动子可以是组织特异型启动子，例如对在肝脏中表达具有特异性的启动子。
所述载体可以进一步包括对本文所述的向导RNA进行编码的核苷酸序列。在一些实施例中，所述载体包括所述向导RNA的一个拷贝。在一些实施例中，所述载体包括所述向导RNA的多于一个拷贝。在具有多于一个向导RNA的实施例中，所述向导RNA可以是不同的，使得所述向导RNA靶向不同的靶序列，或者可以是相同，因为所述向导RNA靶向相同的靶序列。在所述载体包括多于一个向导RNA的一些实施例中，每个向导RNA可以具有其它不同的特性，如在具有RNA引导的DNA核酸酶的复合物(如Cas RNP复合物)内的活性或稳定性。在一些实施例中，对向导RNA进行编码的核苷酸序列可以可操作地连接到至少一个转录或翻译控制序列，如启动子、3'UTR或5'UTR。在一个实施例中，所述启动子可以是tRNA启动子(例如，tRNALys3)或tRNA嵌合体。参见Mefferd等人,《RNA》2015 21:1683-9；Scherer等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》2007 35:2620-2628。在一些实施例中，所述启动子可以由RNA聚合酶III(Pol III)识别。Pol III启动子的非限制性实例包含U6和H1启动子。在一些实施例中，对所述向导RNA进行编码的核苷酸序列可以可操作地连接到小鼠或人U6启动子。在其它实施例中，对所述向导RNA进行编码的核苷酸序列可以可操作地连接到小鼠或人H1启动子。在具有多于一个向导RNA的实施例中，用于驱动表达的启动子可以相同或不同。在一些实施例中，对向导RNA的crRNA进行编码的核苷酸和对向导RNA的trRNA进行编码的核苷酸可以提供在同一载体上。在一些实施例中，对crRNA进行编码的核苷酸和对trRNA进行编码的核苷酸可以由相同的启动子驱动。在一些实施例中，所述crRNA和所述trRNA可以转录成单一转录物。例如，所述crRNA和所述trRNA可以由单一转录物加工以形成双分子向导RNA。可替代地，所述crRNA和trRNA可以转录成单分子向导RNA(sgRNA)。在其它实施例中，所述crRNA和所述trRNA可以由其在同一载体上的对应启动子驱动。在又其它实施例中，所述crRNA和所述trRNA可以由不同的载体编码。
在一些实施例中，对所述向导RNA进行编码的核苷酸序列可以位于包括对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶)进行编码的核苷酸序列的相同载体上。在一些实施例中，所述向导RNA和所述RNA引导的DNA核酸酶(如Cas蛋白)的表达可以由其自身对应的启动子驱动。在一些实施例中，所述向导RNA的表达可以由驱动RNA引导的DNA核酸酶(如Cas蛋白)表达的相同启动子驱动。在一些实施例中，所述向导RNA和所述RNA引导的DNA核酸酶(如Cas蛋白转录物)可以包含在单个转录物内。例如，所述向导RNA可以在RNA引导的DNA核酸酶(如Cas蛋白转录物)的非翻译区(UTR)内。在一些实施例中，所述向导RNA可以在转录物的5'UTR内。在其它实施例中，所述向导RNA可以在转录物的3'UTR内。在一些实施例中，转录物的细胞内半衰期可以通过在其3'UTR内含有向导RNA并由此缩短其3'UTR的长度来减少。在另外实施例中，所述向导RNA可以在转录物的内含子内。在一些实施例中，可以在向导RNA所在的内含子处添加合适的剪接位点，使得所述向导RNA从转录物中正确剪接出来。在一些实施例中，来自同一载体的RNA引导的DNA核酸酶(如Cas蛋白)和向导RNA在时间上紧密地表达可以促进更有效地形成CRISPR RNP复合物。
在一些实施例中，所述组合物包括载体系统。在一些实施例中，所述载体系统可以包括一个单一载体。在其它实施例中，所述载体系统可以包括两个载体。在另外的实施例中，所述载体系统可以包括三个载体。当不同的向导RNA用于多路复用时，或者当所述向导RNA的多个拷贝被使用时，所述载体系统可以包括多于三个载体。
在一些实施例中，所述载体系统可以包括诱导型启动子，以仅在将其递送到靶细胞后才开始表达。非限制性示例性诱导型启动子包含可通过热休克、光、化学品、肽、金属、类固醇、抗生素或酒精诱导的启动子。在一些实施例中，所述诱导型启动子可以是具有低基础(非诱导)表达水平的启动子，例如
Figure BDA0003369221130001091
启动子(Clontech)。
在另外的实施例中，所述载体系统可以包括组织特异型启动子，以仅在将其递送到特定组织中之后才开始表达。
所述载体可以通过脂质体、纳米颗粒、外来体或囊泡递送。所述载体也可以通过脂质纳米颗粒(LNP)递送；参见例如于2017年10月5日公开的标题为“用于CRISPR/CAS组分的脂质纳米颗粒调配物(LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CASCOMPONENTS)”的WO2017/173054以及于2019年4月4日公开的标题为“调配物(FORMULATIONS)”的WO 2019067992A1，其各自的内容特此以全文引用的方式并入。本文所述的任何LNP和LNP调配物都适于单独或与cas核酸酶或对cas核酸酶进行编码的核酸一起递送向导序列。在一些实施例中，涵盖一种LNP组合物，其包括：RNA组分和脂质组分，其中所述脂质组分包括胺脂质、中性脂质、辅助脂质和隐形脂质；并且其中所述N/P比率为约1-10。
在一些情况下，所述脂质组分包括脂质A或其缩醛类似物、胆固醇、DSPC和PEG-DMG；并且其中所述N/P比率为约1-10。在一些实施例中，所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质；约5-15mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的PEG脂质，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10。在一些实施例中，所述脂质组分包括约50-60mol％的胺脂质；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的PEG脂质，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-8。在一些情况，所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质；约5-15mol％的DSPC；以及约2.5-4mol％的PEG脂质，其中所述脂质组分的剩余部分是胆固醇，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-8。在一些情况，所述脂质组分包括：48-53mol％的脂质A；约8-10mol％的DSPC；以及约1.5-10mol％的PEG脂质，其中所述脂质组分的剩余部分是胆固醇，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为3-8±0.2。
在一些实施例中，所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：约50mol％的胺脂质，如脂质A；约9mol％的中性脂质，如DSPC；约3mol％的隐形脂质，如PEG脂质，如PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，如胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。在一些实施例中，所述胺脂质是脂质A。在一些实施例中，所述中性脂质是DSPC。在一些实施例中，所述隐形脂质是PEG脂质。在一些实施例中，所述隐形脂质是PEG2k-DMG。在一些实施例中，所述辅助脂质是胆固醇。在一些实施例中，所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50mol％的脂质A；约9mol％的DSPC；约3mol％的PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。
在一些实施例中，可以全身递送所述载体。在一些实施例中，所述载体可以被递送到肝循环中。
本说明书和示例性实施例不应视为是限制性的。出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另外说明，否则在所有情况下，应将表示数量、百分比或比例的所有数字以及在说明书和权利要求书中使用的其它数值理解为由术语“约”修饰(如果尚未对其进行修改)。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求中列出的数字参数是近似值，所述近似值可以根据试图获得的期望特性而变化。至少，并且并非试图将等效原则的应用限制于权利要求的范围，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数量并且通过应用常规的舍入技术来解释。
注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”以及任何词语的任何单数使用包含复数指示物，除非明确和确切地限于一个指示物。如本文所使用的，术语“包含(include)”和其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中列举的项目并不排除可以被替代或添加到所列项目的其它相似项目。
实例
提供以下实例以说明某些公开的实施例，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
通用试剂和方法
除非另有说明，mRNA是使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶通过体外转录物(IVT)合成的。转录通常由包括T7启动子、本文公开的转录物序列(如SEQ ID NO:243(其对SEQ ID NO:204的RNA ORF进行编码))和编码在质粒中的poly-A尾(SEQ ID NO:263)的构建体执行。
对于所有方法，通过测量260nm(纳米滴(Nanodrop))处的吸光度来测定转录物浓度，并通过借助于生物分析仪(安捷伦(Agilent))的毛细管电泳来分析转录物。
LNP调配物
将脂质组分溶解在100％乙醇中，其中脂质组分摩尔比如下所述。将经化学修饰的sgRNA和Cas9 mRNA组合并溶解在pH为5.0的25mM柠檬酸盐、100mM NaCl中，从而导致总RNA货物的浓度为约0.45mg/mL。调配的LNP的N/P比率为约6，其中经化学修饰的sgRNA:Cas9mRNA的比率为1:2w/w，如下所述。除非另有说明，用50％脂质A、9％DSPC、38％胆固醇和3％PEG2k-DMG调配LNP。
所述LNP是通过将乙醇中的脂质与两个体积的RNA溶液和一个体积的水的冲击射流混合而形成的。通过混合交叉将乙醇中的脂质与所述两个体积的RNA溶液混合。通过内联三通将第四水流与交叉的出口流混合。(参见例如WO 2016010840，图2)在混合过程中，使用不同的流速维持水与有机溶剂的2:1比率。将LNP在室温下保持1小时，并用水进一步稀释(大约1:1v/v)在平板盒(赛多利斯(Sartorius)，100kD MWCO)上使用切向流过滤将经稀释的LNP浓缩，并且然后通过渗滤将缓冲液交换到pH为7.5的50mM Tris、45mM NaCl、5％(w/v)蔗糖(TSS)中。然后使用0.2μm无菌过滤器过滤所得混合物。将最终LNP储存在4℃或-80℃下直到进一步使用。
LNP组合物分析
动态光散射(“DLS”)用于表征本公开的LNP的多分散性指数(“pdi”)和尺寸。DLS测量使样品经受光源产生的光散射。如根据DLS测量结果测定的，PDI代表群体中粒径(围绕平均粒径)的分布，其中完全均匀群体的PDI为零。
电泳光散射用于表征所述LNP在特定pH值下的表面电荷。表面电荷或ζ电位是LNP悬浮液中颗粒之间静电排斥/吸引力的量值。
非对称流场流动分级-多角度光散射(AF4-MALS)用于通过流体动力学半径分离组合物中的颗粒，并且然后测量碎裂颗粒的分子量、流体动力学半径和均方根半径。这允许能够评估分子量和尺寸分布以及次级特性，如Burchard-Stockmeyer图(随时间推移变化的均方根(“rms”)半径与流体动力学半径之比表明颗粒的内部核密度)和rms构象图(rms半径对数对分子量对数，其中所得线性拟合的斜率给出一定程度的紧密度对伸长率)。
纳米颗粒跟踪分析(NTA，Malvern Nanosight)可以用于测定颗粒大小分布以及颗粒浓度。适当地稀释LNP样品并将其注射到显微镜载玻片上。当颗粒缓慢地注入视野时，相机会记录所散射的光。在捕捉到影片后，纳米颗粒跟踪分析通过跟踪像素和计算扩散系数来处理影片。此扩散系数可以转化为颗粒的流体动力学半径。仪器还对在分析中计数的单独颗粒的数量进行计数以给出颗粒浓度。
低温电子显微镜(“cryo-EM”)可以用于测定LNP的粒径、形态和结构特性。
LNP的脂质组成分析可以通过液相色谱法，随后是带电气溶胶检测(LC-CAD)测定。此分析可以提供实际脂质含量与理论脂质含量的比较。
分析LNP组合物的平均粒径、多分散性指数(pdi)、总RNA含量、RNA的包封效率和ζ电位。LNP组合物可以进一步通过脂质分析、AF4-MALS、NTA和/或cryo-EM表征。使用MalvernZetasizer DLS仪器通过动态光散射(DLS)测量平均粒径和多分散性。LNP样品在通过DLS测量之前用PBS缓冲液稀释。Z-平均直径(即平均粒径的基于强度的测量结果)与数均直径和pdi一起报告。Malvern Zetasizer仪器也用于测量所述LNP的ζ电位。测量前，将样品在pH为7.4的0.1×PBS中按1:17(50μL至800μL)稀释。
基于荧光的测定(
Figure BDA0003369221130001121
赛默飞世尔科技公司)用于测定总RNA浓度和游离RNA。包封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。用含有0.2％Triton-X 100的1×TE缓冲液适当稀释LNP样品，以测定总RNA，或者用1×TE缓冲液稀释以测定游离RNA。通过利用用于制备组合物的起始RNA溶液制备标准曲线，并在1×TE缓冲液+/-0.2％Triton-X 100中稀释。然后将稀释的
Figure BDA0003369221130001122
染料(根据制造商的说明)添加到标准品和样品中的每一个中，并允许在室温下在无光的情况下温育大约10分钟。使用SpectraMax M5酶标仪(分子装置)读取样品，其中激发、自动截止和发射波长分别设置为488nm、515nm和525nm。根据适当的标准曲线测定总RNA和游离RNA。
包封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。相同的程序可以用于测定基于DNA的货物组分的包封效率。在基于荧光的测定中，对于单链DNA，可以使用Oligreen染料，对于双链DNA，可以使用Picogreen染料。可替代地，所述总RNA浓度可以通过反相离子配对(RP-IP)HPLC方法测定。Triton X-100用于分裂所述LNP，从而释放所述RNA。然后通过RP-IP HPLC色谱法将RNA与脂质组分分离，并使用260nm处的UV吸光度对标准曲线进行定量。
AF4-MALS用于查看分子量和尺寸分布以及从这些计算得出的次级统计数据。适当稀释LNP，并且使用HPLC自动进样器注入到AF4分离通道中，在所述通道中聚焦所述LNP，并且然后通过通道交叉流的指数梯度进行洗脱。所有流体均由HPLC泵和Wyatt Eclipse仪器驱动。从AF4通道洗脱的颗粒流经紫外检测器、多角度光散射检测器、准弹性光散射检测器和示差折光率检测器。通过使用Debeye模型处理原始数据，以根据检测器信号测定分子量和rms半径。
LNP中的脂质组分通过与带电气溶胶检测器(CAD)耦合的HPLC进行定量分析。4种脂质组分的色谱分离是通过反相HPLC实现的。CAD是一种基于质量的破坏性检测器，所述检测器可以检测所有非挥发性化合物，并且无论分析物结构如何，信号都是一致的。
Cas9 mRNA和gRNA货物
Cas9 mRNA货物是通过体外转录制备的。使用如下方法，使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶通过体外转录产生加帽和聚腺苷酸化的Cas9 mRNA。通过在以下条件下与XbaI在37℃下温育持续2小时使含有T7启动子和90-100nt poly(A/T)区的质粒DNA线性化：200ng/μL质粒，2U/μL XbaI(NEB)以及1×反应缓冲液。通过在65℃下加热反应持续20分钟使XbaI失活。线性化的质粒从酶和缓冲液中纯化。产生经Cas9修饰的mRNA的IVT反应通过在以下条件下在37℃下温育持续1.5-4小时进行：50ng/μL线性化质粒；GTP、ATP、CTP和N1-甲基假-UTP(Trilink)中的每一种各2-5mM；10-25mM ARCA(Trilink)；5U/μL T7 RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠类RNase抑制剂(NEB)；0.004U/μL无机大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；以及1×反应缓冲液。添加TURBO DNase(赛默飞世尔科技公司)到最终浓度为0.01U/μL，并且使反应温育另外的30分钟以去除DNA模板。Cas9 mRNA使用TFF和/或含有LiCl沉淀的方法进行纯化。
以下实例中的sgRNA是通过已知方法使用亚磷酰胺化学合成的。
Cas9 mRNA和向导RNA通过LNP在体外递送
将原代人肝脏肝细胞(PHH)(Gibco(吉博公司))和原代食蟹猴肝脏肝细胞(PCH)(InVitro Admet Laborotories)解冻并重新悬浮于具有补充剂的肝细胞解冻培养基中(吉博公司，目录CM7500)中，随后进行离心。丢弃上清液，并且将沉淀的细胞重新悬浮于肝细胞平板接种培养基加补充剂包(英杰公司(Invitrogen)，目录A1217601和CM3000)中。对细胞进行计数并以33,000个细胞/孔的PCH密度和50,000个细胞/孔的PMH密度平板接种于生物涂层胶原蛋白I涂覆的96孔板(赛默飞世尔科技公司，877272)上。使平板接种的细胞在37℃和5％CO2气氛下在组织温育箱中沉淀和粘附持续5小时。在温育后，检查细胞的单层形成，并用肝细胞培养基(英杰公司，目录A1217601和CM4000)洗涤一次。
用LNP处理PHH和PCH，如下文进一步描述的。在用LNP处理之前，将细胞在37℃、5％CO2下温育24小时。在37℃下在含有3％食蟹猴血清或3％胎牛血清的培养基中温育LNP持续5分钟，并且以本文进一步提供的量向细胞施用。
基因组DNA分离
在处理后72小时采集经处理的细胞。根据制造商的方案，使用50μL/孔快速提取DNA提取溶液(Epicentre，目录QE09050)从96孔板中的每个孔中裂解细胞。如本文所述，使所有DNA样品经受PCR和后续NGS分析。
NGS测序
简而言之，为了定量地测定基因组中靶位置的编辑效率，分离基因组DNA并利用深度测序来鉴别通过基因编辑引入的插入和缺失的存在。
在靶位点(例如，TTR)周围设计PCR引物，并扩增所关注的基因组区。根据制造商的方案(Illumina)执行另外的PCR以添加所需的化学物质进行测序。在Illumina MiSeq仪器上对扩增子进行测序。在消除具有低质量评分的读段后，将读段与适当参考基因组(例如，hg38、macFas5)进行比对。将含有读段的所得文件映射到参考基因组(BAM文件)，其中选择与所关注的靶区重叠的读段，并且计算野生型读段数相对于含有插入、取代或缺失的读段数。
将编辑百分比(例如，“编辑效率编辑百分比”)定义为具有插入或缺失的序列读段的总数占序列读段的总数(包含野生型)。
实例1-在原代肝细胞中LNP递送Cas9 mRNA的剂量反应
在原代cyno肝细胞(PCH)和原代人肝细胞(PHH)中体外评估各种向导序列和mRNA组合的功效。如上所述平板接种PHH和PCH细胞，并且然后分别用如表8和9中所述的不同剂量的LNP进行处理。LNP含有G000502(SEQ ID No:114)以及mRNA000001(SEQ ID No:1)或mRNA000042(SEQ ID No:377)作为mRNA。72小时后裂解细胞，并通过NGS测定编辑％。每个条件一式三份地进行测定，并且表8和表9示出了编辑％的平均值和标准偏差。
表8.在PHH中使用LNP递送进行体外编辑
向导ID mRNA ID 剂量Cas9 mRNA(ng) 平均编辑％ SD
G000502 mRNA01 50 46.1 3.97
G000502 mRNA01 10 32.37 2.64
G000502 mRNA01 5 24.87 0.06
G000502 mRNA01 1 5.2 0.75
G000502 mRNA01 0.01 0.43 0.12
G000502 mRNA01 0 0.23 0.15
G000502 mRNA42 50 42.27 1.8
G000502 mRNA42 10 41.67 0.81
G000502 mRNA42 5 32.7 2.93
G000502 mRNA42 1 10.13 1.62
G000502 mRNA42 0.01 0.8 0
G000502 mRNA42 0 0.13 0.06
表9.在PCH中使用LNP递送进行体外编辑
向导ID mRNA ID 剂量Cas9 mRNA(ng) 平均插入缺失％ SD
G000502 mRNA01 50 71.8 1.99
G000502 mRNA01 10 33.23 2.32
G000502 mRNA01 5 15.23 1.36
G000502 mRNA01 1 1.27 0.12
G000502 mRNA01 0.01 0.1 0
G000502 mRNA01 0 0.1 0
G000502 mRNA42 50 82.8 1.77
G000502 mRNA42 10 59.5 1.1
G000502 mRNA42 5 38.37 1
G000502 mRNA42 1 5.6 0.4
G000502 mRNA42 0.01 0.3 0.1
G000502 mRNA42 0 0.1 0
实例2-在原代肝细胞中LNP递送Cas9 mRNA的剂量反应
在PCH和PHH细胞中体外评估各种向导序列和mRNA组合。如上所述平板接种来自两个供体的PHH细胞和PCH细胞，并分别用如表10和11中所述的多个剂量的LNP进行处理。LNP含有Cas9 mRNA000042(SEQ ID No:377)和4个单向导RNA中的一个。向导G000480和G000486(SEQ ID No:87和93)完全靶向人TTR基因。向导G000502(SEQ ID No:114)以靶区中的单个错配靶向人TTR基因。G000739(SEQ ID No:2)为阴性对照。72小时后裂解细胞，并通过NGS测定编辑％。每个条件一式三份地进行测定。表10和图1示出了PHH细胞中的编辑结果％。表11和图2示出了PCH细胞中的编辑结果％。
表10-PHH细胞中的体外编辑
Figure BDA0003369221130001151
Figure BDA0003369221130001161
表11-PCH细胞中的体外编辑
向导 向导浓度(nM) 平均编辑％ 标准偏差
G000480 15.51724 8.87 1.29
G000480 5.172414 4.43 0.71
G000480 1.724138 0.80 0.20
G000480 0.574713 0.23 0.12
G000480 0.191571 0.23 0.06
G000480 0.063857 0.10 0.00
G000480 0.021286 0.10 0.00
G000480 0.007095 0.10 0.00
G000486 15.51724 73.10 2.00
G000486 5.172414 58.27 0.47
G000486 1.724138 23.23 1.40
G000486 0.574713 5.93 0.25
G000486 0.191571 1.43 0.21
G000486 0.063857 0.53 0.15
G000486 0.021286 0.40 0.17
G000486 0.007095 0.47 0.12
G000502 15.51724 88.10 0.53
G000502 5.172414 83.53 0.55
G000502 1.724138 73.07 2.68
G000502 0.574713 47.87 1.38
G000502 0.191571 18.37 0.86
G000502 0.063857 4.80 0.26
G000502 0.021286 1.27 0.50
G000502 0.007095 0.57 0.12
G000739 15.51724 0.10 0.00
G000739 5.172414 0.13 0.06
G000739 1.724138 0.13 0.06
G000739 0.574713 0.10 0.00
G000739 0.191571 0.10 0.00
G000739 0.063857 0.10 0.00
G000739 0.021286 0.10 0.00
G000739 0.007095 0.10 0.00
实例3-另外的mRNA的表征
此实例的材料和方法如于2018年9月28日提交的国际专利申请第PCT/US2018/053439号中所述。使用不同密码子方案的Cas9序列被设计用于测试经改进的蛋白质表达。每个序列被设计成使用不同的密码子集合对SEQ ID No:203的Cas9氨基酸进行编码。在每个开放阅读框序列中，使用单个密码子对每个氨基酸进行编码。基于NCBI-GenBank FlatFile Release 160.0(Nakamura等人,(2000)《核酸研究》28,292；Benson等人,(2006)《核酸研究》34(数据库专刊)D16-20)，序列基于在智人的完整蛋白质编码基因中出现的密码子的频率以及密码子中特定核苷酸的丰度而变化。基于表5中所示的密码子方案，构建了对SEQID NO:203的Cas9蛋白进行编码的若干个不同的Cas9开放阅读框(SEQ ID No:252、311和312)。这些被并入到也含有HSD 5'UTR(SEQ ID NO:241)、白蛋白3'UTR、T7启动子和polyA尾的构建体中。含有白蛋白3'UTR和polyA尾的示例性序列是SEQ ID NO:253，其中3'UTR和polyA尾跟随HSD 5'UTR和SEQ ID NO:252的ORF。
使用100％的N1-甲基假尿苷代替尿苷，通过IVT产生针对每个构建体的信使RNA。使用LipofectamineTMMessengerMAXTM转染试剂(赛默飞世尔科技公司)，用800ng的每种Cas9 mRNA转染HepG2细胞。六小时转染后，通过冻融裂解细胞并通过离心清除。通过ELISA测定确定Cas9蛋白水平。简而言之，总蛋白质浓度通过二辛可宁酸测定确定。根据制造商的方案，使用Cas9小鼠抗体(傲锐东源公司(Origene)，目录CF811179)作为捕获抗体并且使用Cas9(7A9-3A3)小鼠mAb(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology)，目录14697)作为检测抗体来制备MSD GOLD 96孔链霉亲和素SECTOR板(美索规模发现公司(MesoScale Diagnostics)，目录L15SA-1)。重组Cas9蛋白用作稀释剂39(美索规模发现公司)中的校准标准品，所述校准标准品具有1X HaltTM不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(赛默飞世尔科技公司，目录78437)。使用Meso Quickplex SQ120仪器(美索规模发现公司)读取ELISA板，并且使用Discovery Workbench 4.0软件包(美索规模发现公司)分析数据。
通过将mRNA与靶向运甲状腺素蛋白(TTR)的向导(G502；SEQ ID NO:114)一起转染到HepG2细胞中并测量编辑百分比来在体外评估编辑效率。在3ng-100ng的mRNA浓度下评估包括表12中所指定的SEQ ID No的Cas9 mRNA。未经处理的细胞未示出可测量的编辑。表12示出了不同的密码子集合对Cas9蛋白表达和体外编辑的影响。
表12.具有不同密码子集合的ORF的体外编辑和表达
Figure BDA0003369221130001181
为了测定密码子方案在体内的有效性，当使用表4中所述的密码子方案由对Cas9进行编码的mRNA在体内表达时，测量Cas9蛋白表达。如表26中所指定的信使RNA被调配为具有靶向TTR的向导RNA(G282；SEQ ID NO:242)的LNP。所述LNP使用错流程序组装，并且分别含有50％的脂质A、9％的DSPC、38％的胆固醇和3％的PEG2k-DMG，摩尔比为50:38:9:3，并且N:P比率为6.0。使用Amicon PD-10过滤器(通用电气医疗集团(GE Healthcare))纯化LNP，并以0.32mg/ml的浓度(LNP浓度)使用。以1mpk向CD-1雌性小鼠(每组n＝5只)静脉内给药。给药后3小时，处死动物，收集肝脏并测量肝脏中的Cas9表达。使用上述美索规模发现公司ELISA测定测量肝脏中的Cas9蛋白表达。使用1×完整蛋白酶抑制剂片剂(罗氏公司(Roche))，目录11836170001)通过珠磨机使大约40-50mg肝脏组织在RIPA缓冲液(Boston生物产物BP-115)中均质化。表13示出了Cas9在肝脏中的表达结果。低A和低A/U密码子方案(SEQ ID NO:311和312的ORF)的mRNA示出了被测ORF的最高Cas9表达。阴性对照的Cas9蛋白表达低于定量下限(LLOQ)。
表13
Figure BDA0003369221130001191
为了测定密码子方案在体内的有效性，使用不同的密码子方案从对Cas9进行编码的mRNA中在体内测量基因组编辑。如表27中所指定的信使RNA被调配为具有靶向TTR的向导RNA(G282；SEQ ID NO:242)的LNP。所述LNP使用错流程序组装，并且分别含有50％的脂质A、9％的DSPC、38％的胆固醇和3％的PEG2k-DMG，摩尔比为50:38:9:3，并且N:P比率为6.0。使用Amicon PD-10过滤器(通用电气医疗集团)纯化LNP，并以0.05mg/ml的浓度(LNP浓度)使用。以0.1mpk向CD-1雌性小鼠(每组n＝5只，除用SEQ ID NO:252处理的组n＝4只之外)静脉内给药。给药后6天，处死动物，收集血液和肝脏，并测量血清TTR和肝脏编辑。表14示出了体内编辑结果和血清TTR水平。
表14
Figure BDA0003369221130001192
Figure BDA0003369221130001201
为了测定密码子方案在不同mRNA浓度下的功效，进行了体内剂量反应实验。如表15中所指定的信使RNA被调配为具有靶向TTR的向导RNA(G282；SEQ ID NO:242)的LNP。所述LNP使用错流方法组装，并且含有50％的脂质A、9％的DSPC、38％的胆固醇和3％的PEG2k-DMG。使用Amicon PD-10过滤器(通用电气医疗集团)纯化LNP，并以0.7mg/ml的浓度(LNP浓度)使用。CD-1雌性小鼠(每组n＝5只)以0.03、0.1或0.3mpk静脉内给药。给药后7天，处死动物，收集血液和肝脏，并测量血清TTR和肝脏编辑。表14示出了体内编辑结果和血清TTR水平。
表15
Figure BDA0003369221130001202
为了测定具有不同UTR的密码子方案的有效性，在施用对Cas9进行编码的mRNA后在体内测量基因组编辑。如表15中所指定的信使RNA被调配为具有靶向TTR的向导RNA(G282；SEQ ID NO:242)的LNP。所述LNP使用错流程序组装，并且分别含有50％的脂质A、9％的DSPC、38％的胆固醇和3％的PEG2k-DMG，摩尔比为50:38:9:3，并且N:P比率为6.0。使用Amicon PD-10过滤器(通用电气医疗集团(GE Healthcare))纯化LNP，并以0.05mg/ml的浓度(LNP浓度)使用。以0.1mpk向CD-1雌性小鼠(每组n＝5只；对于SEQ ID No:243编辑，n＝4只)静脉内给药。给药后6天，处死动物，收集血液和肝脏，并测量血清TTR和肝脏编辑。表16示出了体内编辑和血清TTR结果。
表16
Figure BDA0003369221130001203
Figure BDA0003369221130001211
实例4-在食蟹猴中通过30分钟和2小时静脉内输注施用的多剂量LNP研究
在LNP或媒剂对照施用之前至少1小时，通过静脉内团注注射以2mg/kg向队列中的n＝3只雄性食蟹猴施用地塞米松(Dex)。每个队列接受不同剂量的LNP以为每个NHP提供3mg/kg或6mg/kg(RNA)。表17中示出了给药组。两个队列接受3mg/kg的LNP剂量以比较输注时间。调配物含有Cas9 mRNA(包括SEQ ID No.377)和向导RNA(gRNA)G000502(SEQ IDNo.114)，gRNA:mRNA的重量比为1:2。接受3mg/kg LNP剂量(总RNA含量)的队列通过30分钟或120分钟静脉内输注施用。所有其它具有不同剂量的LNP(以mg/kg为单位，总RNA含量)的队列均通过120分钟静脉内输注施用。
表17：输注研究给药组
组号 测试材料 剂量水平(mg/kg) 输注时间(分钟) 动物数量
1 TSS对照 0 120 3
2 Cyn-LNP0837 3.0 120 3
3 Cyn-LNP0837 3.0 30 3
4 Cyn-LNP0837 6.0 120 3
表18：编辑％和血清TTR
组号 肝脏编辑(％) TTR减少％
1 0.0(0.0，0.0，0.0) -28(-34，-23，-27)
2 63.3(50.8，69.0，69.9) 85(66，95，94)
3 63.3(65.0，66.0，58.8) 88(90，89,86)
4 74.5(75.3，74.6，73.6) 96(97，96，95)
在给药后第29天，在肌内注射氯胺酮/甲苯噻嗪的情况下，使用16号SuperCore活检针，通过靶向肝脏右叶/侧的单次超声引导的经皮穿刺活检来收集肝脏样本。每只动物收集1.0cm3到1.5cm3的总肝脏活检样本。每个活检样本在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下。如前所述，通过NGS测序对肝脏样本进行编辑分析。肝脏编辑的结果证明了高达约70％的编辑。使用所描述的LNP治疗预处理的皮质类固醇具有良好的耐受性。
表19：丙氨酸转氨酶(ALT)水平
Figure BDA0003369221130001212
Figure BDA0003369221130001221
对肝脏样本进行活检并分析编辑数据百分比、血清TTR数据和丙氨酸转氨酶(ALT)水平，如分别在表18和图3A-B以及表19和图3C中所见的。肝脏编辑和血清TTR数据的结果表明，3mg/kg剂量(30分钟输注时间)和3mg/kg剂量(120分钟输注时间)之间的功效没有显著差异。然而，大于30'输注时间施用表明ALT(一种肝脏损伤生物标志物)水平较低。在3mg/kg剂量(30分钟输注时间)下观察到的ALT水平较高，这表明潜在的肝脏应激。
实例4的材料和方法.使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶，通过体外转录(IVT)合成mRNA。转录通常由包括T7启动子(SEQ ID NO:231)、本文公开的转录物序列，如SEQ ID NO:377(其对SEQ ID NO:311的RNA ORF进行编码)和在质粒中编码的poly-A尾(SEQID NO:263)的构建体执行。
对于所有方法，通过测量260nm(纳米滴)处的吸光度来测定转录物浓度，并通过借助于生物分析仪(安捷伦)的毛细管电泳来分析转录物。
LNP调配物
将脂质组分溶解在100％乙醇中，其中脂质组分摩尔比如下所述。将经化学修饰的sgRNA和Cas9 mRNA组合并溶解在pH为5.0的25mM柠檬酸盐、100mM NaCl中，从而导致总RNA货物的浓度为约1.5mg/mL。调配的LNP的N/P比率为约6，其中经化学修饰的sgRNA:Cas9mRNA的比率为1:2w/w，如下所述。LNP由50％的脂质A、9％的DSPC、38％的胆固醇和3％的PEG2k-DMG调配而成，并且通过如实例1中所述的错流技术形成LNP。在混合过程中，使用不同的流速维持水与有机溶剂的2:1比率。使用切向流过滤浓缩经稀释的LNP，并且然后在过滤和储存之前通过渗滤交换缓冲液。
Cas9 mRNA和gRNA货物
使用实例1中所述的方法，使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶，通过体外转录产生加帽和聚腺苷酸化的Cas9 mRNA。
基因组DNA分离
根据制造商的方案，使用50μL/孔BuccalAmp DNA提取溶液(Epicentre，目录QE09050)从肝脏样本中提取基因组DNA。如本文所述，使所有DNA样品经受PCR和后续NGS分析。
NGS测序
简而言之，为了定量地测定基因组中靶位置的编辑效率，分离基因组DNA并利用深度测序来鉴别通过基因编辑引入的插入和缺失的存在。
在靶位点(例如，TTR)周围设计PCR引物，并扩增所关注的基因组区。引物序列如下所示。根据制造商的方案(Illumina)执行另外的PCR以添加所需的化学物质进行测序。在Illumina MiSeq仪器上对扩增子进行测序。在消除具有低质量评分的读段后，将读段与cyno参考基因组(例如，macFas5)进行比对。将含有读段的所得文件映射到参考基因组(BAM文件)，其中选择与所关注的靶区重叠的读段，并且计算野生型读段数相对于含有插入、取代或缺失的读段数。
将编辑百分比(例如，“编辑效率编辑百分比”)定义为具有插入或缺失的序列读段的总数占序列读段的总数(包含野生型)。
序列表
以下序列表提供了本文公开的序列列表。应理解的是，如果DNA序列(包括Ts)是相对于RNA引用的，那么Ts应被Us替换(可以根据上下文修改或不修改)，反之亦然。
Figure BDA0003369221130001231
Figure BDA0003369221130001241
Figure BDA0003369221130001251
Figure BDA0003369221130001261
Figure BDA0003369221130001271
Figure BDA0003369221130001281
Figure BDA0003369221130001291
Figure BDA0003369221130001301
Figure BDA0003369221130001311
Figure BDA0003369221130001321
Figure BDA0003369221130001331
Figure BDA0003369221130001341
Figure BDA0003369221130001351
Figure BDA0003369221130001361
Figure BDA0003369221130001371
Figure BDA0003369221130001381
Figure BDA0003369221130001391
Figure BDA0003369221130001401
Figure BDA0003369221130001411
Figure BDA0003369221130001421
Figure BDA0003369221130001431
Figure BDA0003369221130001441
Figure BDA0003369221130001451
Figure BDA0003369221130001461
Figure BDA0003369221130001471
Figure BDA0003369221130001481
Figure BDA0003369221130001491
Figure BDA0003369221130001501
Figure BDA0003369221130001511
Figure BDA0003369221130001521
Figure BDA0003369221130001531
Figure BDA0003369221130001541
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*＝PS连接；“m”＝2'-O-Me核苷酸。
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Claims (59)

1.一种组合物，其包括：
(i)核酸，所述核酸包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框，其中：
a.所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少93％同一性的序列；和/或
b.所述开放阅读框在其至少前50个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少93％的同一性，或者在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；和/或
c.所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表4中列出的密码子、表5的低A集合或表5的低A/U集合；和/或
d.所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的123％；和/或
e.所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％；以及
(ii)向导RNA或对向导RNA进行编码的载体，其中所述向导RNA包括选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列。
2.一种对TTR基因进行修饰和/或在TTR基因内诱导双链断裂(DSB)的方法，所述方法包括向细胞递送组合物，其中所述组合物包括：
(i)核酸，所述核酸包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框，其中：
a.所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少93％同一性的序列；和/或
b.所述开放阅读框在其至少前50个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少93％的同一性，或者在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；和/或
c.所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表4中列出的密码子、表5的低A集合或表5的低A/U集合；和/或
d.所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的123％；和/或
e.所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％；以及
(ii)向导RNA或对向导RNA进行编码的载体，其中所述向导RNA包括选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列。
3.一种降低TTR血清浓度、治疗与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)和/或减少或预防包括TTR的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用组合物，其中所述组合物包括：
(i)核酸，所述核酸包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框，其中：
a.所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少95％同一性的序列；和/或
b.所述开放阅读框在其至少前30个、50个、70个、100个、150个、200个、250个或300个核苷酸上与SEQ ID NO:311具有至少95％的同一性；和/或
c.所述开放阅读框由密码子集合组成，所述密码子集合中的至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表4中列出的密码子、表5的低A集合或表5的低A/U集合；和/或
d.所述开放阅读框的腺嘌呤含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤含量到所述最低腺嘌呤含量的150％；和/或
e.所述开放阅读框的腺嘌呤二核苷酸含量的范围为所述开放阅读框的最低腺嘌呤二核苷酸含量到所述最低腺嘌呤二核苷酸含量的150％；以及
(ii)向导RNA或对向导RNA进行编码的载体，其中所述向导RNA包括选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的向导序列，由此降低TTR血清浓度、治疗与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)和/或减少或预防包括TTR的淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在所述受试者中累积。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的组合物或方法，其中所述向导RNA包括选自SEQID NO:5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17、22、23、27、29、30、35、36、37、38、55、61、63、65、66、68或69的向导序列。
5.根据权利要求1或4所述的组合物，其用于在细胞或受试者的TTR基因内诱导双链断裂(DSB)、对细胞或受试者的TTR基因进行修饰、治疗受试者的与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)、降低受试者的TTR血清浓度或减少或预防淀粉样蛋白或淀粉样原纤维在受试者中累积。
6.根据权利要求2到5中任一项所述的供使用的组合物或方法，其中所述方法包括通过输注施用所述组合物持续超过30分钟，如约45-75分钟、75-105分钟、105-135分钟、135-165分钟、165-195分钟、195-225分钟、225-255分钟、255-285分钟、285-315分钟、315-345分钟、345-375分钟，持续约1.5-6小时，持续约60分钟、约90分钟、约120分钟、约150分钟、约180分钟或约240分钟。
7.根据权利要求2到6中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物降低血清TTR水平，如与施用所述组合物之前的血清TTR水平相比降低至少50％，或者与施用所述组合物之前的血清TTR水平相比降低50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％、95-98％、98-99％或99-100％。
8.根据权利要求2到7中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物导致TTR基因的编辑，任选地其中所述编辑被计算为被编辑的群体的百分比(编辑百分比)，进一步任选地其中所述编辑百分比介于群体的30与99％之间，如介于群体的30与35％之间、35与40％之间、40与45％之间、45与50％之间、50与55％之间、55与60％之间、60与65％之间、65与70％之间、70与75％之间、75与80％之间、80与85％之间、85与90％之间、90与95％之间或95与99％之间。
9.根据权利要求2到8中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物减少至少一个组织中的淀粉样沉积，任选地其中所述至少一个组织包括以下中的一个或多个：胃、结肠、坐骨神经或背根神经节。
10.根据权利要求9所述的方法或供使用的组合物，其中在施用所述组合物后8周测量淀粉样沉积。
11.根据权利要求9到10中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中淀粉样沉积减少30到35％、35到40％、40到45％、45到50％、50到55％、55到60％、60到65％、65到70％、70到75％、75到80％、80到85％、85到90％、90到95％或95到99％的在施用所述组合物之前所见的淀粉样沉积。
12.根据权利要求2到11中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物被施用或递送至少两次。
13.根据权利要求12所述的方法或供使用的组合物，其中所述施用或递送以1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天的间隔或以1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周的间隔或以1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月或15个月的间隔发生。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA包括crRNA，所述crRNA包括所述向导序列并且进一步包括SEQ ID NO:126的核苷酸序列，其中SEQ IDNO:126的核苷酸在其3'端处跟随所述向导序列。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA是单引导(sgRNA)。
16.根据权利要求15所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括具有SEQ ID NO:3的模式的向导序列。
17.根据权利要求15或16所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括SEQ ID NO:3的序列。
18.根据权利要求15到17中任一项所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括SEQ IDNO:5-72、74-78和80-82的向导序列以及SEQ ID NO:126的核苷酸中的任一个。
19.根据权利要求15到17中任一项所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括与选自SEQ ID No:87-113、115-120和122-124的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的序列。
20.根据权利要求19所述的方法或组合物，其中所述sgRNA包括选自SEQ ID No:87-113、115-120和122-124的序列。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA包括至少一个修饰。
22.根据权利要求21所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含经2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸、核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键或经2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。
23.根据权利要求21到22中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在5'端处的前五个核苷酸中的一个或多个处和/或在3'端处的后五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。
24.根据权利要求21到23中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含前四个核苷酸之间和/或后四个核苷酸之间的PS键。
25.根据权利要求21到24中任一项所述的方法或组合物，其中所述至少一个修饰包含在5'端处的前三个核苷酸处的经2'-O-Me修饰的核苷酸和/或在3'端处的后三个核苷酸处的经2'-O-Me修饰的核苷酸。
26.根据权利要求21到25中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA包括SEQ IDNO:3的经修饰的核苷酸。
27.根据权利要求1到26中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA和所述包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的开放阅读框的核酸与脂质纳米颗粒(LNP)相关。
28.根据权利要求27所述的方法或组合物，其中所述LNP包括CCD脂质，任选地其中所述CCD脂质是脂质A或脂质B，进一步任选地其中所述CCD脂质是脂质A。
29.根据权利要求27到28中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括辅助脂质，任选地其中所述辅助脂质是胆固醇。
30.根据权利要求27到29中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括隐形脂质(例如，PEG脂质)，任选地其中所述隐形脂质是PEG2k-DMG。
31.根据权利要求27到30中任一项所述的方法或组合物，其中：
(i)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(ii)所述LNP包括约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约27-39.5mol％的辅助脂质；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述LNP组合物的N/P比率为约5-7(例如，约6)；
(iii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(iv)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(v)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约5-15mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约6；
(vi)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；约0-10mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(vii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；小于约1mol％的中性脂质；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10；
(viii)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约40-60mol％的胺脂质，如脂质A；以及约1.5-10mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-10，并且其中所述LNP组合物基本上不含或不含中性磷脂；或者
(ix)所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50-60mol％的胺脂质，如脂质A；约8-10mol％的中性脂质；以及约2.5-4mol％的隐形脂质(例如，PEG脂质)，其中所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，并且其中所述LNP组合物的N/P比率为约3-7。
32.根据权利要求26到31中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP的N/P比率为约6。
33.根据权利要求26到32所述的方法或组合物，其中所述LNP包括中性脂质，任选地其中所述中性脂质是DSPC。
34.根据权利要求32中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50mol％的胺脂质，如脂质A；约9mol％的中性脂质，如DSPC；约3mol％的隐形脂质，如PEG脂质，如PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是辅助脂质，如胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。
35.根据权利要求32中任一项所述的方法或组合物，其中所述LNP包括脂质组分，并且所述脂质组分包括：约50mol％的脂质A；约9mol％的DSPC；约3mol％的PEG2k-DMG，并且所述脂质组分的剩余部分是胆固醇，其中所述LNP组合物的N/P比率为约6。
36.根据权利要求1到35中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是Cas切割酶。
37.根据权利要求36所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是Cas9。
38.根据权利要求1到37中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是经修饰的，任选地其中经修饰的RNA引导的DNA结合剂包括核定位信号(NLS)。
39.根据权利要求1到38中任一项所述的方法或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是来自II型CRISPR/Cas系统的Cas。
40.根据权利要求1到39中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物是药物调配物并且进一步包括药学上可接受的载体。
41.根据权利要求40所述的方法或供使用的组合物，其中非同源末端接合(NHEJ)导致在修复TTR基因中的DSB期间发生在TTR基因中诱导移码或无义突变的突变。
42.根据权利要求41所述的方法或供使用的组合物，其中在至少50％的肝脏细胞的TTR基因中诱导移码或无义突变。
43.根据权利要求41到42中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中在TTR基因中发生核苷酸的缺失或插入是在脱靶位点中发生核苷酸的缺失或插入的至少50倍或更多倍。
44.根据权利要求1到43中任一项所述的方法或组合物，其中所述向导RNA的序列是：
a)SEQ ID NO:92或104；
b)SEQ ID NO:87、89、96或113；
c)SEQ ID NO:100、102、106、111或112；或者
d)SEQ ID NO:88、90、91、93、94、95、97、101、103、108或109，
任选地其中所述向导RNA不在原代人肝细胞基因组中的蛋白质编码区中发生的脱靶位点处产生插入缺失。
45.根据权利要求2到44中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用所述组合物降低所述受试者的TTR水平。
46.根据权利要求2到45中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有ATTR，如ATTRwt或遗传性ATTR。
47.根据权利要求2到46中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者是人。
48.根据权利要求2到47中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者患有家族性淀粉样多神经病、仅患有或主要患有ATTR的神经症状、家族性淀粉样心肌病或仅患有或主要患有ATTR的心脏症状。
49.根据权利要求2到48中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者表达具有V30突变，如V30A、V30G、V30L或V30M的TTR；所述受试者表达具有T60突变，如T60A的TTR；所述受试者表达具有V122突变，如V122A、V122I或V122(-)的TTR；或者所述受试者表达野生型TTR。
50.根据权利要求2到49中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用后，所述受试者的感觉运动神经病变的症状变化得以改善、稳定或减缓，和/或所述受试者的充血性心力衰竭的症状变化得以改善、稳定或减缓。
51.根据权利要求2到50中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物或药物调配物通过病毒载体施用。
52.根据权利要求2到50中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述组合物或药物调配物通过脂质纳米颗粒施用。
53.根据前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5-72、74-78和80-82的序列是SEQ ID NO:5、6、9、13、14、15、16、17、22、23、27、30、35、36、37、38、55、63、65、66、68或69。
54.根据权利要求1到53中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:311具有至少94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
55.根据权利要求1到54中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框中至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的密码子是表4、表5或表7中列出的密码子。
56.根据权利要求1到55中任一项所述的组合物或方法，其中所述开放阅读框包括与SEQ ID NO:377具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
57.根据权利要求1到56中任一项所述的组合物或方法，其中所述核酸是mRNA，在所述mRNA中，至少10％的尿苷被经修饰的尿苷取代。
58.根据权利要求57所述的组合物或方法，其中：所述经修饰的尿苷是以下中的一种或多种：N1-甲基假尿苷、假尿苷、5-甲氧基尿苷或5-碘尿苷。
59.一种根据权利要求1或4到58中任一项所述的组合物或调配物的用途，其用于制备用于治疗患有ATTR的人类受试者的药物。
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